KR101315483B1 - 항생제 및 라이소포스파티딜콜린을 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제를 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항생제를 개체에 투여하는 단계, 및 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료 방법, 및 상기 라이스포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제가 별개의 용기에 담겨져 있는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트에 관한 것이다.

Description

항생제 및 라이소포스파티딜콜린을 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물{A composition comprising antibiotics and lysophosphatidylcholine for enhancing immune or treating bacterial infection}
본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제를 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항생제를 개체에 투여하는 단계, 및 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료 방법, 및 상기 라이스포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제가 별개의 용기에 담겨져 있는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트에 관한 것이다.
세균성 감염 질환은 세균이 혈액, 체액 및 조직 내에 출현하여 서식하기 시작하면서 발병하는 질환으로서, 항생제 저항 미생물의 증가와 더불어 새로운 항생제의 개발 부족으로 인하여 인간에게 큰 위협이 되고 있다. 세균성 감염 질환에는 복막염, 폐렴, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 신장염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염 및 패혈증 등이 있다. 이러한 세균성 감염 질환은, 감염에 대하여 면역계가 제대로 반응하지 못하는 호중구 감소를 동반한 발열 상태 및 면역계의 억제 시에 (예, AIDS와 같이 면역결핍성 질환이나 면역억제제를 투여중인 환자에서) 감염에 대하여 호중구의 감소 없이, 발열이 동반된다. 최근 항생제에 대한 내성균의 발현 증대로 인하여, 세균성 감염 질환의 치료에 어려움이 증대되고 있다.
특히 패혈증은 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 상태를 말한다. 미국에서만 패혈증으로 1년에 200,000명이 넘는 사람이 사망하고 있으며 (Hoyert et al. Deaths: final data for 1997. Natl. Vital Stat. Rep. 47, 1-104, 1999), 패혈증은 내부 면역의 결함 및 과도한 림프구 아폽토시스에 의해 면역 기능을 손상시킨다고 알려져 있다. 면역억제는 결과적으로 패혈증에 의한 사망에 중요한 인자로서 여겨져 왔으며, 고용량의 화학치료 또는 방사선치료에 의한 면역기능의 결함으로부터의 회복은 중요한 임상적 문제로서 남아있다. 패혈증 환자에 있어서 인터페론-감마(IFN-γ)와 함께 대식세포의 활성화는 패혈증 환자에 유용한 효과를 가지며, 패혈증이 유발된 실험동물에서 호중성 백혈구 이상의 억제 및 림프구 아폽토시스의 억제 또한 패혈증 동물에 유용한 효과를 가진다고 알려져 왔다 (Yan et al., Therapeutic effects of lysophosphatidylcholine in experimental sepsis. Nat. Med. 10, 161-167, 2004).
한편, 라이소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine, LPC)은 산화된 저-밀도 지질 단백질의 주요 구성요소로, in vitro에서 단핵구, 대식세포, T 림프구 및 호중성 백혈구를 포함하는 다양한 면역 세포의 촉진 효과를 가지며, 패혈증 치료에 유용한 것으로 알려져 있다 (Yan et al., Therapeutic effects of lysophosphatidylcholine in experimental sepsis. Nat. Med. 10, 161-167, 2004). 이는 시험관 내의 단핵세포에서 IL-1β의 생산을 증가시키고 (Liu-Wu, Y., Hurt-Camejo, E. ＆ Wiklund, O. Lysophosphatidylcholine induces the production of IL-1beta by human monocytes. Atherosclerosis 137, 351-7.(1998)), 또한 시험관 내의 중성구에서 수퍼옥사이드 음이온 발생을 증가시킨다는 보고가 있다 (Savage, J.E., Theron, A.J.＆ Anderson, R. Activation of neutrophil membrane-associated oxidative metabolism by ultraviolet radiation. J Invest Dermatol 101, 532-6. (1993)). 비록, LPC는 패혈증에서 유리한 효과를 보여왔지만 (Yan et al., Therapeutic effects of lysophosphatidylcholine in experimental sepsis. Nat. Med. 10, 161-167, 2004), 직접적인 항균 활성을 나타내지 않기 때문에 대량의 감염에서 낮은 효율을 보이는 문제점이 있어 왔다. 이에 이러한 낮은 효율을 개선하기 위한 방법의 개발이 면역 증강 및 세균성 감염 질환의 치료에 있어서 중요한 문제가 되어 왔다.
이러한 배경하에 본 발명자들은 대량 감염에서 LPC의 치료 효과를 극대화하기 위한 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 라이소포스파티딜콜린 및 항생제를 포함한 조성물이 항생제 또는 라이소파티딜콜린을 단독으로 투여하는 경우보다 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료에 뛰어난 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제를 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 항생제를 개체에 투여하는 단계; 및 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제가 별개의 용기에 담겨져 있는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제를 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체"는 일반적으로 포스포리파제 효소활성에 의한 포스파티딜콜린의 부분적 가수분해의 결과로 하나의 지방산 그룹을 제거한 포스파티딜콜린의 유사체를 의미하며, 본 발명에서는 항생제와 병용하였을 때 면역 증강을 통하여 세균성 감염 질환 치료효과를 가지는 한 라이소포스파티딜콜린 및 그 유사체를 제한 없이 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 라이소포스파티딜콜린은 하기 화학식 1로 표시되는 라이소포스파티딜콜린 또는 하기 화학식 2로 표시되는 라이소포스파티딜콜린의 에테르 유사체이다.
화학식 1
Figure 112011048030900-pat00001
상기 식에서, R1은 C4 -30의 알킬이거나 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C4-30의 알케닐이고,
화학식 2
Figure 112011048030900-pat00002
상기 식에서, R2는 C4 -30의 알킬이거나 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C4-30의 알케닐이다.
보다 바람직하게, 상기 화학식 1의 화합물은 L-α-라이소포스파티딜콜린, 스테아로일(L-α-Lysophosphatidylcholine, Stearoyl; Lysolecithin, stearoyl); L-α-라이소포스파티딜콜린, 팔미토일(L-α-Lysophosphatidylcholine, Palmitoyl; Lysolecithin, palmitoyl); DL-α-라이소포스파티딜콜린, 팔미토일(DL-α-Lysophosphatidylcholine, Palmitoyl); 및 L-α-라이소포스파티딜콜린, 올레오일(L-α-Lysophosphatidylcholine, Oleoyl; Lysolecithin, oleoyl)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나이다.
또한 보다 바람직하게, 상기 화학식 2의 화합물은 L-α-라이소포스파티딜콜린, γ-O-알크-1-에닐 (L-α-Lysophosphatidylcholine, γ-O-Alk-1-Enyl; Lysophosphatidalcholine); L-α-라이소포스파티딜콜린, γ-O-알킬(L-α-Lysophosphatidylcholine, γ-O-Alkyl; Lyso-platelet activating factor); DL-α-라이소포스파티딜콜린, γ-O-헥사데실(DL-α-Lysophosphatidylcholine, γ-O-Hexadecyl; rac-Lyso-platelet activating factor); 및 L-α-라이소포스파티딜콜린, γ-O-헥사데실(L-α-Lysophosphatidylcholine, γ-O-Hexadecyl; Lyso-platelet activating factor; Lyso-PAF-C 16)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나이다.
라이소포스파티딜콜린 및 그 유사체는 포유동물의 체내에 내재성 물질이므로 안전성은 입증된 것과 다름없다.
바람직하게 상기 라이소포스파티딜콜린은 이성질체 (isomer)를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 라이소포스타딜콜린의 이성질체 및 항생제의 병용 투여가 단독 투여보다 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료효과가 우수함을 확인하였다 (표 4 및 5).
본 발명에서 용어, "항생제"는 미생물이 생산하는 대사산물로 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질로서, 원래 자연계에 있던 항생물질로 만든 것과 화학적으로 합성된 것을 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체와 병용 투여되어, 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체의 기존의 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료효과를 극대화할 수 있는 항생제는 제한 없이 포함되나, 바람직하게는 카바페넴계 (carbapenem) 항생제, 세팔로스포린계 (cephalosporin) 항생제, 당펩타이드계 (glycopeptide) 항생제, 페니실린계 항생제, 퀴놀론계 (quinolone) 항생제, 세린 프로테아제계 (serine protease) 항생제, 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제, 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제, 살균계 (bacteriostatic) 항생제, 및 상기 항생제의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 카바페넴계 항생제는 도리페넴(Doripenem)이고, 상기 세팔로스포린계 항생제는 세프트리악손 나트륨(Ceftriaxone sodium)이며, 상기 당펩타이드계 항생제는 염산반코마이신(Vancomycin hydrochloride)이고, 상기 페니실린계 항생제는 벤질페니실린 칼륨(Potassium benzylpenicillin)이며, 상기 퀴놀론계 항생제는 DW286(7-[3-(aminomethyl)-4-(methoxyimino)-3-methyltetrahydro-1H-1-pyrrolyl]-1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-1, 4-dihydro[1,8]naphthyridine-3-carboxylic acid hydrochloric acid salt) 또는 시프로플록사신염산염수화물(Ciprofloxacin hydrochloride hydrate)이고, 상기 세린 프로테아제계 항생제는 드로트레코진 알파(활성화된)( Drotrecogin alfa (activated))이며, 상기 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제는 콜리스틴 (colistin)이고, 상기 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제는 토브라마이신 (tobramycin)이며, 상기 살균계 (bacteriostatic) 항생제는 푸시딘산 (fusidic acid)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, “DW286”은 “DW286aa”와 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 DW286과 라이소포스파티딜콜린의 중량비는 1:2의 중량비인 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 항생제와 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체의 병용투여에 의해 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료에 상승적 효과를 나타내는 조성물에 관한 것으로, 상승적 효과 (synergistic effect)란 둘 이상의 성분이 배합되어 사용될 때, 단일 성분투여시 발휘되는 효과의 합보다 높은 효과 또는 예측되지 않던 상이한 효과를 발휘하는 것을 의미하는 것이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, LPC 및 DW286의 병용 투여에 의한 면역 증강 및 세균성 감염 질환의 치료효과를 확인하기 위해, Mix군 (LPC: DW286 2:1)과, LPC-DW286군 (LPC 사전 투여 후 DW286 투여군), DW286-LPC군 (DW286 사전 투여 후 LPC 투여군), LPC 단독 투여군 및 DW286 단독 투여군을 CPA-CLP 유발된 패혈증 마우스 및 CPA- 처리된 면역억제 및/또는 변이된 마우스에서 평가하였다. 그 결과, 항생제 및 LPC 병용투여군인 Mix군, LPC-DW286군, 및 DW286-LPC군에서 단독 투여군에 비해 상승된 면역 증강효과 및 세균성 감염 치료효과를 관찰할 수 있었으며, 가장 바람직하게는 DW286-LPC군 (DW286 사전 투여 후 LPC 투여군)에서 가장 높은 면역 증강효과 및 세균성 감염 치료효과를 관찰하였다 (표 13). 아울러, DW286이외에 시프로플록사신염산염수화물, 벤질페니실린 칼륨, 세프트리악손 나트륨, 도리페넴, 염산반코마이신 또는 드로트레코진 알파(활성화된), 콜리스틴, 토브라마이신, 푸시딘산 각각을 LPC와 병용 투여한 경우, LPC 단독 투여군에 비해 상승된 면역 증강효과 및 세균성 감염 치료효과를 확인하였다 (표 6 내지 표 11).
구체적으로, 마우스 모델의 사망수 측정 결과 DW286-LPC군에서 높은 생존비율을 관찰하였으며 (표 12 및 13), 장기 중량(가슴색 및 비장)의 변화를 관찰한 결과 DW286-LPC 군은 CPA 투여에 의해 유발되는 임파 장기 중량의 감소를 효과적으로 억제하는 것으로 관찰하였다 (표 15). 나아가, 혈액 백혈구 수의 변화를 관찰한 결과, 유의성 있는 백혈구 수의 증가는 DW286-LPC 투여군에 국한됨을 발견하였으며 (표 16), 백혈구의 분별 counts의 변화 또한 LPC 단독 투여보다 DW286-LPC투여군에서 더 우수한 효과를 관찰하였다 (표 16). 림프구 세포의 감소 및 현저한 비장위축과 관련한 변화 측정 결과, DW286-LPC군은 다른 군 (도 7 및 8)에 비하여 림프구 세포의 감소 및 비장 위축에 대하여 높은 억제 경향을 보임을 관찰하였다 (표 18). 또한, 가슴샘 및 비장의 면역조직화학 관찰 결과, CPA에 의해 현저한 비장 및 가슴샘 내 CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF-α+ 세포의 감소가 초래되었으나, LPC 및 DW286-LPC 병용투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 이들 세포의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며, LPC 단독 투여보다 DW286-LPC 투여군에서 더 우수한 효과가 인정됨을 관찰하였다 (표 19). 따라서 본 발명의 병용제제 조성물은 면역 증강에 의해 세균성 감염 질환 치료에 효과가 있음을 알 수 있다.
본 발명의 "세균성 감염 질환"은 면역 증강에 의해 치료될 수 있는 모든 세균성 감염 질환을 포함하며, 감염을 통한 면역계가 제대로 반응하지 못하는 호중구 감소를 동반한 발열 상태, 및 면역계가 억제된 후 감염된 질병인 호중구의 감소가 없어도 AIDS와 같이 면역결핍성 질환이나 면역억제제를 투여중인 환자에서 발열이 동반하거나, 항생제에 대한 내성 등 다양한 질환을 의미하며, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 복막염, 폐렴, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 신장염, 심장염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 또는 패혈증 등을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 CLP(Cecal Ligation and Puncture)를 수행하여 복막염을 유발하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 CLP 및 CPA (Cyclophosphamide·H2O)를 처리한 모델을 이용하여 본 발명의 병용제제 조성물의 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 효과를 확인하였다. CPA는 면역계의 면역반응을 억제하는 물질이므로, 본 발명의 조성물이 면역반응이 억제된 질환에서도 효과가 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 "면역"이란 동물 체내에 존재하는 자기방어 체계로서, 외부로부터 침입해 오는 각종 물질이나 생명체를 자기자신과 구별해내어 이 침입자를 제거하는 생물학적 현상이다.
본 발명에서 용어 "면역 증강"이란 숙주의 특이 또는 비특이, 세포성 및 체액성 면역반응을 상승시키는 것을 말한다. 본 발명의 조성물은 면역이 억제된 상태에서도 항생제와 LPC 또는 이의 유사체의 병용 투여를 통하여 면역 증강 효과를 나타내며, 이러한 면역 증강을 통해 종국적으로 세균성 감염 질환의 치료에 유용하다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 인체 또는 수의용으로 제형화될 수 있다.
경구 투여용의 약제학적 조성물은 별개의 단위, 예를 들면, 캅셀제 또는 정제; 산제 또는 과립제; 용제, 시럽 또는 현탁제 (수성 또는 비-수성 액상물 중; 식용 발포제 또는 휩(whip); 또는 에멀션)로 제시될 수 있다.
정제 또는 경질 젤라틴 캅셀제에 적합한 부형제로는 락토스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 스테아르산 또는 이의 염이 있다. 연질 젤라틴 캅셀제에 사용하기 적합한 부형제로는 예를 들어, 식물성 오일, 왁스, 지방, 반-고형물 또는 액상 폴리올 등이 있다. 용제 및 시럽제를 제조하기 위해 사용될 수 있는 부형제로는 예를 들어, 물, 폴리올 및 당이 있다. 현탁제를 제조하기 위해, 오일(예: 식물성 오일)을 사용하여 수중유 또는 유중수 현탁제를 제공할 수 있다. 경피 투여용으로 적응시킨 약제학적 조성물은 장시간 동안 수용자의 표피와 친밀하게 접촉될 수 있도록 하기 위한 별개의 패치로서 제시될 수 있다.
비경구 투여용의 약제학적 조성물에는 산화방지제, 완충제, 정균제(bacteriostat) 및 용질(수용자의 혈액과 실질적으로 등 장성인)을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용제; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁제가 포함된다. 주사용 용제에 사용될 수 있는 부형제에는 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일이 포함된다. 이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가 만을 요구하는 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 항생제를 개체에 투여하는 단계; 및 (b) 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 항생제를 투여하는 (a) 단계, 및 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 투여하는 (b) 단계는 각각의 항생제의 종류에 따라 동시, 순차적 또는 역순으로 수행될 수 있으며, DW286의 경우에는 가장 바람직하게는 (a) 단계 후에 (b) 단계를 수행할 수 있다. 이와 같은 (a) 단계 및 (b) 단계는 각 항생제에 따라 바람직한 시간 간격을 가질 수 있다.
라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체 및 세균성 감염 질환은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명은 Mix군 (LPC: DW286 =2:1)과, LPC-DW286군 (LPC 사전 투여 후 DW286 투여군), DW286-LPC군 (DW286 사전 투여 후 LPC 투여군), LPC 단독 투여군 및 DW286 단독 투여군을 CPA-CLP 유발된 패혈증 마우스 및 CPA-처리 면역억제 및/또는 변이된 마우스에서 평가한 결과, 항생제 및 LPC 병용투여군에서 단독 투여군에 비해 상승된 면역 증강효과 및 세균성 감염 치료효과를 관찰할 수 있었으며, 가장 바람직하게는 LPC 사전 투여 후 DW286 투여군인 LPC-DW286군 보다 DW286 사전 투여 후 LPC 투여군인 DW286-LPC군에서 가장 높은 면역 증강효과 및 세균성 감염 치료효과를 관찰하였다.
본 발명에서 용어, "개체"는 세균성 감염 질환에 걸렸거나 세균성 감염 질환에 걸릴 위험이 있는 인간과 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유동물을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항생제 및 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 포함하는 조성물을 개체에게 투여함으로써, 면역을 증강하거나 세균성 감염 질환을 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제가 별개의 용기에 담겨져 있는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트를 제공한다.
라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체 및 세균성 감염 질환은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 목적상 상기 키트에는 적량의 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제가 별개의 용기에 담겨져 있으며, 약학적으로 허용가능한 담체, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 상기 설명서는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료를 위한 항생제, 및 LPC 또는 이의 유사체의 혼합 방법, 항생제 투여 후 LPC 또는 이의 유사체의 투여 순서, 또는 LPC 또는 이의 유사체의 투여 후 항생제 투여 순서가 기재된 것일 수 있다.
본 발명에 따라 항생제와 함께 리소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 병용투여하면 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료 효과면에서 상승효과를 발휘한다. 또한 감염을 통한 면역계가 억제된 질환 및 면역계가 억제된 후 감염된 질병의 치료에 유용하게 이용될 수 있어서, 기존의 항생제 또는 리소포스파티딜콜린의 치료 효과를 개선시킬 수 있다.
도 1은 CPA-CLP로 유도된 모델의 LPC 투여 군과 투여 순서를 간략히 나타낸도이다.
도 2는 CPA-CLP로 유도된 모델의 LPC 이성질체 및 항생제의 투여 군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 3은 CPA-CLP로 유도된 모델에서 LPC와 시프로틀록사신염산염수화물, 벤질페니실린칼륨 및 세프트리악손 나트륨의 투여 군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 4는 CPA-CLP로 유도된 모델의 LPC와 도리페넴, 염산반코마이신, DW286aa, 드로트레코진 알파(활성화된)의 투여 군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 5는 CPA-CLP로 유도된 모델의 LPC와 콜리스틴, 토브라마이신, 푸시딘산의 투여 군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 6은 CPA-CLP로 유도된 모델 및 CPA 유발 면역억제 모델에서 LPC와 DW286aa의 투여 군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 7은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g) 군에서 가슴샘의 조직병리학적 프로파일을 나타낸 것이다. CPA control에서는 가슴샘 피질 내 림프구 세포의 감소를 탐지하였다. 그러나 이러한 위축성의 변화는 LPC, LPC-DW286 및 DW286-LPC군의 처리에 의해 효과적으로 억제되었으며, 다른 군에 비해 DW286-LPC군에서 가장 높은 억제 경향을 나타내었다.
도 8은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g)군에서 비장의 조직병리학적 프로파일을 나타낸 것이다. CPA control에서는 현저한 비장의 위축 및 림프구 세포의 감소를 탐지하였다. 그러나 이러한 위축성의 변화는 LPC, LPC-DW286 및 DW286-LPC군의 처리에 의해 효과적으로 억제되었으며, 다른 군에 비해 DW286-LPC군에서 가장 높은 억제 경향을 나타내었다.
도 9는 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g)군에서 비장 내 CD3+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 비장의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286 군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히 LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 10은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g)군에서 비장 내 CD4+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 비장의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286 군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히 LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 11은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g)군에서 비장 내 CD8+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 비장의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286 군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히 LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 12는 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g)군에서 비장 내 TNF-α 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 비장의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나. 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286 군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히 LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 13은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC, Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g)군에서 가슴샘 내 CD3+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 가슴샘의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286 군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히 LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 14는 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g)군에서 가슴샘 내 CD4+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 가슴샘의 CD4+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나. 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286 군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히 LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 15는 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g)군에서 가슴샘 내 CD8+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 가슴샘의 CD8+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나 이러한 감소는 CPA control과 비교하여 DW286 군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히 LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 16은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control(b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f), 및 DW285(g)군에서 가슴샘 내 TNF-α 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 가슴샘의 TNF-α 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나 이러한 감소는 CPA control과 비교하여 DW286 군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히 LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 재료 및 실험 동물의 준비
DW286([7-[3-(aminomethyl)-4-(methoxyimino)-3-methyltetrahydro-1H-1-pyrrolyl]-1 cyclopropyl-6 fluoro-4-oxo-1, 4-dihydro[1,8]naphthyridine-3-carboxylic acid hydrochloric acid salt], Lpt, 20021)는 동화약품 (Anyang, Korea)에 의해 합성된 신규한 플로로-나프티리딘 항생제이며, LPC (리소포스파티딜콜린; 18:0 94%, GmbH PHISPHOLIPID, 독일)를 사용하였다. LPC의 이성질체(isomer)인 1-올레일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-Oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine, 1-Oleoyl; 18:1 LPC) 및 시프로플록사신염산염수화물(Ciprofloxacin hydrochloride hydrate, Cipro,), 벤질페니실린 칼륨(Potassium benzylpenicillin, Peni), 세프트리악손 나트륨(Ceftriaxone sodium, Ceft), 도리페넴(Doripenem, Dori), 염산반코마이신(Vancomycin hydrochloride, Vanco) 또는 드로트레코진 알파(활성화된)(Drotrecogin alfa (activated), Xigris), 콜리스틴 (colistin), 토브라마이신 (tobramycin), 푸시딘산 (fusidic acid, fusidin)는 각각 시그마 등으로부터 구입하였다. LPC, DW286, 시프로플록사신염산염수화물, 벤질페니실린 칼륨, 세프트리악손 나트륨, 도리페넴, 염산반코마이신 또는 드로트레코진 알파(활성화된)는 데시케이터에 보관되어 빛과 습기에 의한 변성으로부터 보호하였다.
ICR 마우스 (수령 후 6-주, SLC, Japan)를 7일 또는 8일의 적응기간을 거친 후에 사용하였다. 동물은 폴리카보네이트 우리 당 5 또는 4 마리를 온도 (20℃-25℃), 습도 (40%- 45%)가 조절된 방에 배정하였다. 명기 : 암기 사이클은 12 시간: 12 시간이며, 먹이 (삼양, Korea) 및 물은 접근하기 쉽게 제공하였다. 실험은 CPA-CLP 및 CPA로 유발된 면역억제 마우스모델군으로 나누었다. 모든 실험 동물은 'Guide for the Care' 및 'Use of Laboratory Animals by Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Science, National Research Council, USA on 1996, Washington D.C.'에 의해 처리하였다.
실시예 2: 실험 동물 모델의 준비
2-1. CPA -유도된 면역억제 마우스 모델의 준비
수술 3일 및 1일 전에 각각 150mg/kg 및 110mg/kg 의 CPA(Cyclophosphamide·H2O, Sigma, USA)를 생리 식염수에 녹여 10㎖/kg의 농도로 단회 복강 주사하여 면역 억제를 유발시켰다. INTACT control군에서는 CPA 대신 동일한 양의 생리식염수를 동일한 방법으로 투여하였다.
CPA는 널리 사용되는 항-종양제이며, 단독으로 사용하거나 다른 생산물과 결합하여 사용한다. CPA의 처리는 조혈 및 림프성의 조직에 심각한 손상을 주므로, 항종양제로서 사용되거나 골수 내 이식전처리요법(transplantation conditioning regimes)으로 사용하여 높은 백혈구 감소증을 초래한다. 핵산의 알킬화를 가능하게 하는 많은 활성 대사 산물의 생성을 이끄는 마이크로좀 효소에 의한 생체 내 변화 후까지 CPA는 스스로 생물학적 비활성화된다고 알려져 있으며, 자유 라디칼의 생성과 DNA의 알킬화를 통해 염색체를 손상시켜 돌연변이를 유발한다. CPA 유도 면역억제 및/또는 돌연변이된 마우스 모델은 항-돌연변이 효과 또는 바람직한 면역조절 효과를 탐지하기 위한 가치 있는 동물 모델이다. 더욱이, CPA 처리에 의한 면역억제 및 백혈구감소증을 유발함으로써 가슴샘 및 지라의 T 세포, 특히 CD4 및 CD8은 TNF-α 양성 세포를 포함하는 다양한 시토카인의 감소와 함께, 크게 감소한다.
2-2. CPA - CLP 모델의 준비
면역억제제로 잘 알려진 CPA를 다균성 감염을 증폭시키기 위해 CLP 실시 3 및 1 일 전에 각각 150mg/kg과 110mg/kg의 CPA(Sigma, USA)를 생리 식염수에 녹여 10ml/kg의 농도로 단 회 복강 주사하여 면역억제를 유발시켰다. 이와 같이, CPA 처리 후 CLP를 실시하면 세균의 대량 감염 모델로서 사용할 수 있다. CLP를 위해 마우스를 케타민염산염(Ketamine hydrochloride, ICN Biochemicals Inc., USA) 및 자일라진염산염(Xylazine hydrochloride, Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan)의 마취 하에 개복하여 맹장을 노출하고, 노출된 맹장은 회맹판(Ileocecal valve) 바로 아래를 이중 결찰한 다음 22-게이지 주사침을 이용하여 2회 관통시킨 다음 일반적인 방법에 준하여 복강을 폐쇄하였다. INTACT 및 CPA control군에서는 맹장 노출 후 다시 복강을 폐쇄하였으며, INTACT control 군에서는 CPA 대신 동일한 양의 생리식염수를 동일한 방법으로 투여하였다.
CLP 모델은 인간의 급성 복막염을 가장 가깝게 모방한 것으로 패혈증과 가장 임상적으로 연관된 동물모델이고 항-패혈증 효과를 탐지하기 위한 가치 있는 동물모델로 여겨져 왔다 (Urbaschek 및 Urbaschek, 1987; Yan et al., 2004; Ghiselli et al., 2006; Wirtz et al., 2006). CLP 모델은 인간의 복부 패혈증의 임상 과정을 더 가깝게 반영한 것으로, 내인성의 세균 병소는(septic focus) 전신성염증반응증후군과 함께 다균성 감염을 초래한다 (Wichterman et al., 1980; Zantl et al., 1998; Maier et al. 2000; Emmanuilidis et al., 2001).
실시예 3: 실험방법
3-1. CPA -유발 면역억제 마우스 모델
면역억제를 유발시키기 위해, 150mg/kg과 110mg/kg의 CPA를 생리 식염수에 녹여 CLP 수술 3 및 1일 전 또는 최초 투여시에 단회 복강 내로 투여하였다. INTACT control 군에서는, CPA 대신 동일한 양의 생리식염수를 동일한 방법으로 투여하였다.
3-2. CLP 수술
마우스는 케타민(Ketamine) 및 자일라진(Xylazine)에 의해 마취 하에 개복하여 맹장을 노출하고, 노출된 맹장은 회맹판(Ileocecal valve) 바로 아래를 이중 결찰한 다음 22-게이지 주사침을 이용하여 2회 관통시킨 후 일반적인 방법에 준하여 복강을 폐쇄하였다. INTACT 및 CPA control 군에서는 맹장 노출 후 다시 복강을 폐쇄하였으며, INTACT control 군에서는 CPA 대신 동일한 양의 생리식염수를 동일한 방법으로 투여하였다. CLP는 CPA의 두번째 투여 후 하루 후에 수행하였다.
3-3. 사망 수, 생존 수 및 몸중량의 측정
CPA-CLP모델에서, 몸중량, 생존수 및 사망 수는 5일 동안 하루에 한번 씩 automatic electronic balances(Sartorius Co., Ltd., USA)로 측정하였으며, CPA-처리 모델에서는 2일 동안 하루에 한번 씩 측정하였다. 증체량은 다음과 같이 계산한다.
증체량 (g)
CPA-CLP model: 희생당시 몸중량 - CLP시 몸중량 (5 days)
CPA-treat model: 희생당시 몸중량 - 최초 투여시 몸중량(2 days)
3-4. 장기 중량의 측정
CPA-처리 모델의 희생시에 비장 및 가슴샘의 습중량(wet-weight)을 절대중량으로 측정하고 그 후 상대적 장기 중량(몸중량의 %)를 하기 식에 의해 계산한다.
상대적 장기 중량= [(절대적 장기 중량 / 희생 당시 개별적 몸중량) × 100]
3-5. 혈액 수집 및 WBC 계산
혈액은 CPA-처리 모델의 대정맥으로부터 수집하고 총 혈액 백혈구 수는 카운팅 챔버를 이용하여 계산하였으며, 희석 피펫(diluting pipette)과 희석 용액으로서 Turk 용액을 사용하여 계산하였다. 모든 숫자는 ×103/mm3 으로 계산하였다. 더욱이, 김자액으로 염색된 도말 혈액 샘플 내에서 산호성백혈구, 호중성 백혈구, 단핵 백혈구 및 호염기성 백혈구의 세포수를 총 100 백혈구 중에서 계산하였다.
3-6. 골수 소핵 다염적혈구의 변화
CPA-처리 모델의 골수표본은 다음과 같이 만들어졌다. 요컨대, 골수세포는 비활성화된 우 태아 혈청 3ml 내의 대퇴골로부터 수집하였으며(GIBCO BRL, USA), 원심분리하고, 슬라이드에 도말하였다. 표본은 건조시키고, absolute methanol에 담가 고정하였다 (10-20분 동안). 고정된 슬라이드는 하기와 같은 방법으로 염색하였다.
메이-그룬왈드 염색 (May-Grunwald stain) 3분
메이-그룬왈드 염색(May-Grunwald stain) (1:1 diluted) 2분
김자 염색 (1:6 diluted) 10분
슬라이드는 무작위적으로 코드되고 두명의 다른 전문가에 의해 1000배 확대하에 관찰하였다. PCE (다염적혈구, Polychromatic erythrocyte)의 직경의 1/5 에서 1/20의 범위 사이즈의 작고 둥글거나 타원형의 몸체는 소핵 다염 적혈구수로서 계수하였다. 결과는 1000 PCE 내의 MNPCE (소핵 다염적혈구, PCE with one or more nuclei)의 수로서 표현하였다. MNPC±S.D.의 평균 숫자를 계산하였다. 더욱이, PCE/(PCE+NCE) 비율은 세포독성 가능성을 탐지하기 위해 500 적혈구를 계산하였다.
3-7. 조직병리학
기관의 중량를 측정한 후에, 가슴샘과 비장을 샘플화하였다. 샘플 조직은 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였다. 파라핀으로 포매시킨 후, 3-4 μm 표본을 준비하였다. 대표적인 부분은 광학 현미경 검사를 위해 헤마톡실린과 에오신(H&E, Hematoxylin & Eosin Stain)으로 염색하였다. 그 후 개별적인 기관의 조직병리학적 프로파일을 관찰하였다.
조직형태계측법-자동화된 이미지 분석을 사용하여(Analysis Image Processing; SIS, Germany) 비장에서의 백색 수질의 수 (N) / 조직병리학 표본(×50)으로 비장 내 백색 수질(white pulps)의 수를 계산했다. 또한, 가슴샘 피질의 위축성의(atrophic)변화 /총 관찰된 가슴샘의 수를 계산하였다.
3-8. 면역화학조직법( IHC )
탈 파라핀화한 후에, CD3 항원 결정기 검색은 10mM Tris- 1mM EDTA 버퍼 (pH 9.0)에서 수행하였으며, 1mM EDTA Buffer (pH 8.0) 및 TNF-α in 10mM Citrate Buffer (pH 6.0)에서 CD4 및 CD8 검색을 상기 방법과 동일하게 수행하였다. 본 실험에 사용된 1차 항 혈청은 하기 표 1과 같다.
Figure 112011048030900-pat00003
예열수를 버퍼를 포함하는 염색 접시에 온도가 95-100℃에 이를 때까지 bath한 후 염색 접시를 실온에 두고 슬라이드를 20분 동안 식혔다. 항원 결정기 검색 후에, 표본은 하기와 같은 단계에 의해 면역 염색하였다.
우선, 절편을 실온에서 내성의 페록시다제 활성을 차단하기 위해 메탄올 및 0.3% H2O2에서 30분 동안 배양한 후, 0.01M phosphate buffered saline (PBS; pH 7.2)에서 3회 세척하였다. 다음으로 항습기에서 절편을 normal horse serum blocking solution에서 1시간 동안 실온에서 배양하여 면역글로불린의 비특이적 결합을 막았다 (Vector Lab. Inc., CA, USA. Dilution 1:100). 그 후 0.01M PBS에서 3회 세척한 후, 4℃ 항습기에서 4가지 유형의 1차 항혈청과 함께 12시간 동안 절편을 배양하였다. 그 후, 0.01M PBS 에서 3회 세척하였다. 절편을 biotin이 부착된 만능 이차항체와 함께 항습기에서 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 그 후 0.01M PBS에서 3회 세척하였다. 절편을 ABC 시약(Vectastain Elite ABC Kit, Vector Lab. Inc., CA, USA. Dilution 1:50)과 함께 항습기에서 1시간 동안 실온에서 배양한 후 0.01M PBS 에서 3회 세척하였다. 표본을 Peroxidae substrate kit (Vector Lab. Inc., CA)에서 실온에서 30초 동안 배양하였다. 그 후 0.01M PBS 로 3회 세척하였다. Mayer's hematoxylin용액으로 대조염색한 후 흐르는 수돗물에서 30분 동안 세척하였다. 95% 에탄올을 통해 2분, 100% 에탄올에서 3시간 동안 건조시킨 후 자일렌에서 2시간 동안 세척하였다. 그 후 permanent mounting medium이 있는 Coverslip 및 광학현미경 하에서 관찰하였다(Zeiss, Germany).
조직형태계측법- 1000개의 비장 또는 가슴샘 세포 중에서, 각 면역반응세포(CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF-α+)의 수(N)/1000 개의 비장세포 또는 가슴샘 세포를자동화된 이미지 분석을 통해 관찰하였다. 가슴샘에서, 피질과 수질에서 분리하여 계산을 수행하였다.
3-9. 통계분석
평균 및 표준편차(평균± S.D.)를 계산하였다. 통계학적 분석은 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test (MW test) with SPSS for Windows (Release 6.1.3., SPSS Inc., USA)를 사용하여 수행하였다. CPA-처리 모델에서 INTACT 및 CPA 대조군, CPA 대조군 및 테스트군 사이의 차이에 대한 테스트 물질의 효율의 이해를 돕기 위해 아래 식을 사용하였다:
INTACT control에 대한 변화율 (%) = [((CPA control의 데이터-INTACT control의 데이터)/INTACT control의 데이터) × 100]
CPA control에 대한 변화율 (%) = [((테스트 군의 데이터-CPA control의 데이터)/CPA control의 데이터) × 100]
실시예 4: CPA - CLP 로 유도된 모델에서 LPC 농도의 생존에 미치는 영향 분석
CPA (Cyclophosphamide)로 면역억제를 유발시킨 다음, CLP(Cecal ligation 및 puncture)로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여, LPC의 투여 용량별 약효를 확인하고자 하였다. 5 용량 (1, 2.5, 5, 10 및 20mg/kg)의 LPC를 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후부터 12시간 간격으로 4 회 피하 투여한 다음, 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. LPC는 5% human albumin (녹십자, Korea)에 용해 시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였다. 이와 같은 투여 군과 투여 순서는 도 1에 간단히 나타냈다.
구체적으로 ICR 마우스 (6 주령 수컷, SLC, Japan)를 총 7개 군 (군 당 10마리)인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham 수술 매체 투여군), CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군), CPA-CLP 후 LPC 1mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC 2.5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC 10mg/kg 투여군 및 CPA-CLP 후 LPC 20mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 12시간 4 회 피하투여로 5% 인혈청 알부민을 매체로 사용하여 10ml/kg으로 투여하였다. 즉, 5 용량의 LPC를 CLP 수술 6시간 후부터 12시간 간격으로 총 4 회 경부 피하에 투여하였다. LPC는 5% 인혈청 알부민 (녹십자, Korea)에 용해시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였으며, Sham 및 CLP 대조군에서는 10ml/kg의 5% 인혈청 알부민 만을 동일한 간격으로 피하 투여하였다. 투여 후, 사망률 및 체중의 변화를 상기 실시예 3-3의 방법으로 관찰하였다.
Figure 112011048030900-pat00004
Figure 112011048030900-pat00005
그 결과, 상기 표 2 및 3에서 알 수 있듯이, 모든 CPA 대조군 마우스는 관찰 기관인 7일 동안 생존하였으나, CLP 대조군에서는 CLP 2 일 이내에 10 마리 중 10 마리가 사망하여 100%의 사망률을 나타내었고, LPC 1 및 2.5mg/kg 투여군에서는 각각 CLP 4 및 5 일 이내에 모든 실험동물이 사망하였으며, LPC 5, 10 및 20mg/kg 투여군에서는 CLP 수술 7일 후 모든 실험동물이 사망하였다 (표 2). 한편 LPC 1mg/kg 투여군의 모든 실험동물이 사망한 CLP 수술 4일 후 LPC 2.5, 5, 10 및 20mg/kg 투여군의 생존율은 각각 10, 30, 50 및 40%로 인정되었다 (표 3).
모든 CPA-CLP 수술군에서는 사망 직전 CPA 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 나타내었으나, 모든 LPC 투여군에서는 CPA-CLP 투여군과 비교하여 의미 있는 체중의 변화는 인정되지 않았다.
이와 같은 패혈증에 있어서 가장 중요시되고 있는 지표로 알려진 생존시간의 증가가 CPA-CLP 마우스에서 모든 5 용량의 LPC의 투여에 의해 현저히 증가되었으므로, LPC는 패혈증 환자의 생존 시간을 높일 수 있음을 뒷받침한다. 아울러, LPC 1, 2.5, 5 및 10mg/kg 투여군에서는 투여용량 의존적인 생존 시간 연장효과가 인정되었으나, 20mg/kg 투여군에서는 10mg/kg 투여군과 유사하거나 비교적 낮은 효과가 인정되어, LPC의 CPA-CLP 모델에서의 최소 유효용량은 1mg/kg 전후로 판단되며, 최적 유효용량은 10mg/kg 으로 관찰되었다.
실시예 5: CPA - CLP 로 유도된 모델에서 LPC 의 이성질체 ( isomer )의 투여가 생존에 미치는 영향분석
CPA로 면역억제를 유발시킨 다음, CLP로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여, LPC와 Xigris, LPA, 18:1 LPC, 18:0 LPC 및 DW286aa의 약효를 비교하고자 하였다. 5mg/kg의 LPC, LPA, 18:1 LPC, 18:0 LPC, 0.4 및 2mg/kg의 Xigris, 10 및 20mg/kg의 DW286AA 를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여한 다음, 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. 모든 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였다. 이와 같은 투여 순서와 투여 군은 도 2에 간단히 나타냈다.
구체적으로, ICR 마우스 (6 주령 수컷, SLC, Japan)를 총 10개 군 (군 당 10마리)인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham 수술 매체 투여군), CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군), CPA-CLP 후 LPC 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Xigris 0.4mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Xigris 2mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPA 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 18:1 LPC 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 18:0 LPC 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 DW286AA 10mg/kg 투여군 및 CPA-CLP 후 DW286AA 20mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 멸균 생리식염수를 매체로 사용하여 CLP 수술 6시간 후 10ml/kg으로 단회 정맥 투여하였다. 즉, 5mg/kg의 LPC, LPA, 18:1 LPC, 18:0 LPC, 0.4 및 2mg/kg의 Xigris, 10 및 20mg/kg의 DW286AA 를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여하였다. 모든 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였으며, Sham 및 CLP 대조군에서는 10ml/kg의 멸균 생리식염수 만을 단회 정맥 투여하였다. 투여 후, 사망률 및 체중의 변화를 상기 실시예 3-3의 방법으로 관찰하였다.
Figure 112011048030900-pat00006
Figure 112011048030900-pat00007
그 결과, 상기 표 4 및 5에서 알 수 있듯이 모든 CPA 대조군 마우스는 관찰 기관인 10일 동안 생존하였으나, CLP 대조군에서는 CLP 2 일 이내에 10 마리 중 10 마리가 사망하여 100%의 사망률을 나타내었고, LPC 5mg/kg, Xigris 0.4 및 2 mg/kg, 18:0 LPC 5mg/kg 투여군에서는 CLP 8 일 이내에 모든 실험동물이 사망하였으며, LPA 5mg/kg투여군에서는 CLP 수술 3일 후 모든 실험동물이 사망하였다 (표 4). 한편 18:1 LPC 5mg/kg 투여군에서는 모든 실험동물이 CLP 수술 2일 후 사망하였으며, DW286AA 10 및 20mg/kg 투여군에서는 각각 CLP 수술 10일 후에도 각각 3 마리의 생존례 (3/10; 30%)가 인정되었다 (표 5).
모든 CPA-CLP 수술군에서는 사망 직전 CPA 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 나타내었으며, LPC 5mg/kg, DW286aa 10 및 20mg/kg 투여군에서 각각 CLP 수술 1일 후 CPA-CLP 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 인정된 이외에, 모든 투여군에서는 CPA-CLP 투여군과 비교하여 의미 있는 체중의 변화는 인정되지 않았다.
이러한 결과들은, LPC, Xigris, 18:0 LPC 및 DW286aa는 패혈증 환자의 생존 시간을 높일 수 있다는 것을 뒷받침하며, 특히 DW286aa 10 및 20mg/kg 투여군에서 현저한 생존시간 및 생존률의 증가를 나타낸다. LPC 5mg/kg 투여군은 Xigris 2mg/kg 투여군보다 더 우수한 효과가 인정되었고, 18:0 LPC는 18:1 LPC보다 우수한 효과를 나타내어, 동일한 용량의 LPC와 유사한 효과를 나타내어 LPC 뿐만 아니라, LPC의 이성질체도 면역증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 효과가 있을 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.
실시예 6: CPA - CLP 로 유도된 모델에서 LPC 와 기존 항생제 ( 시프로플록사신 염산염수화물 ( Cipro ), 벤질페니실린칼륨 ( Peni ) 및 세프트리악손 나트륨 ( Ceft ))와의 단독 및 병용투여가 생존에 미치는 영향 분석
CPA로 면역억제를 유발시킨 다음, CLP로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여, LPC와 Cipro (Ciprofloxacin hydrochloride hydrate), Peni (Potassium benzylpenicillin) 및 Ceft (Ceftriaxone sodium)의 병용 효과를 비교하고자 하였다. LPC (5mg/kg), Cipro (20mg/kg), Peni (60mg/kg), Ceft (25mg/kg), LPC+Cipro (5+20mg/kg), LPC+Peni (5+60mg/kg) 및 LPC+Ceft (5+25mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단 회 정맥 투여한 다음, 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. 또한 DW286aa (5mg/kg)을 대조약물로 사용하였으며, 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해 시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였고, 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC (0.5mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 이와 같은 투여 순서와 투여 군은 도 3에 간단히 나타냈다.
구체적으로, ICR 마우스 (6 주령 수컷, SLC, Japan)를 총 10개 군 (군 당 10마리)인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham 수술 매체 투여군), CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군), CPA-CLP 후 LPC 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 DW286aa 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Cipro 20mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Peni 60mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Ceft 25mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+Cipro 5+20mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+Peni 5+60mg/kg 투여군 및 CPA-CLP 후 LPC+Ceft 5+25mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 멸균 생리식염수를 매체로 사용하여 CLP 수술 6시간 후 10ml/kg으로 단회 정맥 투여하였다. 즉, LPC (5mg/kg), DW286aa (5mg/kg), Cipro (20mg/kg), Peni (60mg/kg), Ceft (25mg/kg), LPC+Cipro (5+20mg/kg), LPC+Peni (5+60mg/kg) 및 LPC+Ceft (5+25mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여하였다. 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해 시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였고, 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC (0.5mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 투여 후, 사망률 및 체중의 변화를 상기 실시예 3-3의 방법으로 관찰하였다.
Figure 112011048030900-pat00008
Figure 112011048030900-pat00009
그 결과, 상기 표 6 및 7에서 알 수 있듯이 모든 CPA 대조군 마우스는 관찰 기관인 3일 동안 생존하였으나, CLP 대조군 및 Peni 투여군에서는 CLP 2일 이내에 10 마리 중 10 마리가 사망하여, 100%의 사망률을 나타내었고, LPC, Cipro, Ceft 및 LPC+Peni 투여군에서는 CLP 3일 이내에 모든 실험동물이 사망하였다. 그러나, LPC 단독 또는 각 항생제 단독보다, LPC와의 병용군인 LPC+Cipro, LPC+Peni, LPC+Ceft군에서는 사망율이 줄어들거나 사망시간이 지연되었다 (표 6). 한편 LPC+Ceft 및 DW286aa 투여군에서는 CLP 수술 3일 후에도 각각 3 (3/10; 30%) 및 7 (7/10; 70%) 마리의 생존례가 인정되었다 (표 7).
모든 CPA-CLP 수술군에서는 CLP 수술 1일 후부터 CPA 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 나타내었으며, LPC 투여군에서 CLP 수술 1일 후 CPA-CLP 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 체중의 감소를 나타낸 이외에, 모든 투여군에서는 CPA-CLP 투여군과 비교하여 의미 있는 체중의 변화는 인정되지 않았다.
이러한 LPC 및 각각의 항생제의 단일 투여군에 비해 LPC+Cipro, LPC+Peni 및 LPC+Ceft 투여군에서 인정된 생존률의 증가를 나타내는 결과들은 LPC와 항생제의 병용에 의해 이들의 효과가 증가되는 것을 뒷받침하는 것으로 본 발명의 병용 제제가 면역증강 및 세균성 감염 질환의 치료 효과가 있음을 시사하는 것이다.
실시예 7: CPA - CLP 로 유도된 모델에서 LPC 와 기존 항생제 ( 도리페넴 (Dori), 염산반코마이신 ( Vanco )), 신규 항생제 ( DW286aa ), 패혈증 치료제 ( 드로트 레코진 알파(활성화된) ( Xigris ))와의 단독 및 병용투여가 생존에 미치는 영향 분석
CPA로 면역억제를 유발시킨 다음, CLP로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여, LPC, Dori (Doripenem), Vanco (Vancomycin hydrochloride) 및 Xigris (Drotrecogin alfa (activated)의 병용 효과를 비교하고자 하였다. LPC (5mg/kg), DW286aa (5mg/kg), Dori (200mg/kg), Vanco (10mg/kg), Xigris (2mg/kg), LPC+DW286aa (5+5mg/kg), LPC+Dori (5+200mg/kg), LPC+Vanco (5+10mg/kg) 및 LPC+Xigris (5+2mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여한 다음, 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였고, 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC (0.5mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 이와 같은 투여 순서와 투여 군은 도 4에 간단히 나타냈다.
구체적으로, ICR 마우스 (6 주령 수컷, SLC, Japan)를 총 11개 군 (군 당 10마리)인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham 수술 매체 투여군), CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군), CPA-CLP 후 LPC 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 DW286aa 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Dori 200mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Vanco 10mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Xigris 2mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+DW286aa 5+5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+Dori 5+200mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+Vanco 5+10mg/kg 투여군 및 CPA-CLP 후 LPC+Xigris 5+2mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 멸균 생리식염수를 매체로 사용하여 CLP 수술 6시간 후 10ml/kg으로 단회 정맥 투여하였다. 즉, LPC (5mg/kg), DW286aa (5mg/kg), Dori (200mg/kg), Vanco (10mg/kg), Xigris (2mg/kg), LPC+DW286aa (5+5mg/kg), LPC+Dori (5+200mg/kg), LPC+Vanco (5+10mg/kg) 및 LPC+Xigris (5+2mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여하였다. 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였고, 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC (0.5mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 투여 후, 사망률 및 체중의 변화를 상기 실시예 3-3의 방법으로 관찰하였다.
Figure 112011048030900-pat00010
Figure 112011048030900-pat00011
그 결과, 상기 표 8 및 9에서 알 수 있듯이 모든 CPA 대조군 마우스는 관찰 기관인 3일 동안 생존하였으나, CLP 대조군에서는 CLP 2일 이내에 10 마리 중 10 마리가 사망하여, 100%의 사망률을 나타내었고, Vanco 투여군에서는 각 CLP 3일 이내에 모든 실험동물이 사망하였으며, LPC, Dori 및 Xigris 투여군에서는 CLP 3일 이내에 각각 9, 8, 10 마리 씩 실험동물이 사망하였다. 그러나, LPC 단독 또는 DW286aa, Dori, Vanco 및 Xigris 단독보다 LPC와의 병용 군인 LPC+Dori, LPC+Vanco, LPC+Xigris군에서 사망률이 줄어들거나 사망시간이 지연되었다 (표 8). 한편 DW286aa, LPC+DW286aa, LPC+Dori, LPC+Vanco 및 LPC+Xigris 투여군에서는 CLP 수술 3일 후에도 각각 4 (4/10; 40%), 9 (9/10; 90%), 5 (5/10; 50%), 4 (4/10; 40%) 및 3 (3/10; 30%) 마리의 생존례가 인정되었다 (표 9).
모든 CPA-CLP 수술군에서는 CLP 수술 1일 후부터 CPA 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 나타내었으나, 모든 약물 투여군에서는 CPA-CLP 투여군과 비교하여 의미 있는 체중의 변화는 인정되지 않았다.
이와 같은 LPC 및 각각의 단일 투여군에 비해 LPC+DW286aa, LPC+Dori, LPC+Vanco 및 LPC+Xigris 투여군에서 인정된 생존률 및 생존 기간의 증가에 관한 결과는 LPC와 병용에 의해 이들의 효과가 증가되어 본 발명의 병용 제제의 면역증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 효과를 뒷받침하는 것이다.
실시예 8: CPA - CLP 로 유도된 모델에서 LPC 와 항생제 (콜리스틴 ( colistin ), 토브라마이신 ( Tobra ), 푸시딘산 ( fusidin ))와의 단독 및 병용투여가 생존에 미치 는 영향 분석
CPA로 면역억제를 유발시킨 다음, CLP로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여, LPC와 Colistin, Tobra (Tobramycin) 및 Fusidin (fusidic acide sodium) 의 병용 효과를 비교하고자 하였다. LPC (5mg/kg), colistin (5mg/kg), tobramycin (4mg/kg), fusidin (80mg/kg), LPC+colistin (5+5mg/kg), LPC+tobramycin (5+4mg/kg) 및 LPC+fusidin (5+80mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단 회 정맥 투여한 다음, 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. 또한 DW286aa (5mg/kg)을 대조약물로 사용하였으며, 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해 시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였고, 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC (0.5mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 이와 같은 투여 순서와 투여 군은 도 5에 간단히 나타냈다.
구체적으로, ICR 마우스 (6 주령 수컷, SLC, Japan)를 총 10개 군인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham 수술 매체 투여군), CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군), CPA-CLP 후 DW286aa 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 colistin 5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 tobramycin 4mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 fusidin 80mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+colistin 5+5mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+tobramycin 5+4mg/kg 투여군 및 CPA-CLP 후 LPC+fusidin 5+80mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 멸균 생리식염수를 매체로 사용하여 CLP 수술 6시간 후 10ml/kg으로 단회 정맥 투여하였다. 즉, LPC (5mg/kg), DW286aa (5mg/kg), colistin (5mg/kg), tobramycin (4mg/kg), fusdin (80mg/kg), LPC+colistin (5+5mg/kg), LPC+tobramycin (5+4mg/kg) 및 LPC+fusidin (5+80mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여하였다. 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10ml/kg으로 각각 투여하였고, 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC (0.5mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 투여 후, 사망률 및 체중의 변화를 상기 실시예 3-3의 방법으로 관찰하였다.
Figure 112011048030900-pat00012
Figure 112011048030900-pat00013
그 결과, 상기 표 10 및 11에서 알 수 있듯이 모든 CPA 대조군 마우스는 관찰 기관인 3일 동안 생존하였으나, CLP 대조군에서는 CLP 2일 이내에 10 마리 중 10 마리가 사망하여, 100%의 사망률을 나타내었고, LPC, Fusidin, colistin 및 tobramycin 단독 투여군에서는 CLP 3일 이내에 각각 9, 8, 9 및 8마리의 동물이 사망하였다. 그러나, LPC와 colistin, tobramycin 및 fusidin 병합 투여군에서는 사망률이 줄어들거나 사망시간이 지연되었다 (표 10). 한편 DW286aa, LPC+colistin, LPC+tobramycin 및 LPC+fusidin 투여군에서는 CLP 수술 3일 후에도 각각 8 (8/10; 80%), 4 (4/10; 40%), 5(5/10; 50%) 및 5 (5/10; 50%) 마리의 생존례가 인정되었다 (표 11). 모든 CPA-CLP 수술군에서는 CLP 수술 1일 후부터 CPA 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 나타내었으나, 모든 약물 투여군에서는 CPA-CLP 투여군과 비교하여 의미 있는 체중의 변화는 인정되지 않았다.
이와 같은 LPC 및 각각의 단일 투여군에 비해 LPC+colistin, LPC+ tobramycin 및 LPC+fusidin 투여군에서 인정된 생존률 및 생존 기간의 증가에 관한 결과는 LPC와 병용에 의해 이들의 효과가 증가되어 본 발명의 병용 제제의 면역증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 효과를 뒷받침하는 것이다.
실시예 9: LPC 와 신규 퀴놀린계 항생제인 DW286aa 와의 병용이 생존에 미치는 영향 분석
패혈증에 대한 새로운 치료제 개발 과정 중 LPC 및 DW286a의 최적 병용 투여방법을 찾기 위하여, CPA-CLP 및 CPA로 유발된 면역억제 마우스를 이용하여 평가하였다. CPA-CLP 마우스 및 CPA 유발 면역억제 마우스에 LPC 및 DW286a를 단독, 혼합 (LPC:DW286a 2:1), LPC 선 투여 후 (2회) DW286a 후 투여 (2회), DW286a 선 투여 후 LPC 후 투여 후 사망률, 가슴샘 및 비장 중량, 혈중 백혈구 수, 가슴샘 및 비장내 CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF-α+ 세포의 수적변화를 골수 내 소핵 다염적혈구수의 변화와 함께 평가하였다.
총 8 또는 9군 (매체 대조군 포함)으로 군 당 수컷 각각 9마리를 INTACT CONTROL: 정상 매체 대조군(매체: 5% 인혈청 알부민), CPA CONTROL: CPA 유발 면역억제 매체 대조군, CPA-CLP CONTROL: CPA 및 CLP 실시 매체 대조군, LPC: LPC 1mg/kg 투여군, Mix: LPC-DW286a (2:1) 복합조성 0.75mg/kg 투여군, DW286-LPC: DW286 0.5mg/kg 2회 선 투여 후 LPC 1mg/kg 2회 투여군, LPC-DW286: LPC 1mg/kg 2회 선 투여 후 DW286a 0.5mg/kg 2회 투여군, DW286: DW286a 0.5mg/kg 투여군으로 나누었다. 이와 같은 투여 순서와 투여 군은 도 6에 간단히 나타냈다. 적정량의 후보 물질들을 5% 인혈청 알부민에 용해시켜 10ml/kg의 농도로, 수술 6시간 후 또는 CPA투여 종료 24시간 후부터 12시간 간격으로 총 4회 피하주사로 투여하였다. INTACT, CPA 또는 CPA-CLP CONTROL 군에서는 동일한 양의 5% 인혈청 알부민을 동일한 방법으로 투여하였다.
9-1. LPC 및 DW286aa 의 투여 순서에 따른 사망수 및 몸 중량 평가
상기 실시예 3-3의 방법으로 사망수, 생존 수 및 몸 중량을 평가하였다. 그 결과, INTACT 및 CPA CONTROL군에서는 관찰 기간 동안 사망례가 전혀 인정되지 않았으나, CPA-CLP CONTROL군에서는 CLP 1일 및 2일 후에 각각 6 및 3례의 사망례가 인정되어 CLP 2일 후에 모든 실험동물 (9/9, 100%)이 사망하였다 (표 12). 한편 LPC, LPC-DW286 및 DW286군에서는 CLP 4일 후 모든 실험동물이 사망하였고, Mix 및 DW286-LPC 군에서는 CLP 5일 후 모든 실험동물이 사망하였으며, Mix 군에 비해 DW286-LPC 군에서 더 높은 초기 생존율이 인정되었다 (표 12).
Figure 112011048030900-pat00014
CLP 수술 1일 후, CPA 및 CLP 처리군에서 유의적인(p<0.01 or p<0.05) 몸중량의 감소가 INTACT control과 비교하여 탐지되었다. 그러나 모든 테스트군은 본 발명의 CPA 또는 CPA-CLP controls과 비교하여 몸중량의 의미 있는 변화가 관찰되지 않았다 (표 12). 투여기간 동안의 증체량은 CPA control군의 경우, INTACT control에 비해 -3.95%의 변화를 나타내었으며, LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 투여군에서는 CPA control에 비해 각각 -12.35, -17.65, 2.16, -8.82 및 -1.37%의 변화를 나타내었다.
모든 CPA 투여군에서 인정된 체중 감소는 CPA의 직접적인 독성 증상으로 인한 것으로 판단되며, LPC 및 DW286는 CPA 투여에 의해 유발되는 체중 감소를 억제하지 못하는 것으로 관찰되었다.
한편 시험물질 투여 후 초래된 경미한 증체량의 감소는 피하주사에 따른 자극 등에 의한 이차적 소견으로 판단된다.
또한, LPC 및 DW286aa의 단독 투여시에도 CPA-CLP에 의한 사망례를 현저히 감소시키는 것으로 관찰되었으나, 각각의 단독 투여보다는 혼합조성 및 DW286aa 선투여 후 LPC를 투여한 DW286-LPC 군에서 더 우수한 생존율을 나타내었으며, 특히 Mix 보다 DW286-LPC 군에서 더 높은 초기 생존율을 나타내어 (표 13), 패혈증 치료시 DW286aa 선 투여 후 LPC를 투여하는 것이 더 우수한 치료 효과를 나타낼 것으로 기대할 수 있다.
Figure 112011048030900-pat00015
9-2. CPA -처리 모델의 몸중량의 변화
모든 CPA 처리군은 INTACT control과 비교하여 유의적인 몸중량 감소를 보였다 (p<0.01). 본 발명의 CPA controls 군과 비교하여 모든 테스트군에서 몸중량의 의미 없는 변화가 감지되었다. 더욱이, CPA control을 포함하는 모든 테스트군에서 희생물에 최초의 투여 후 유사한 몸중량 증가를 관찰하였다 (표 14).
Figure 112011048030900-pat00016
9-3. CPA -처리 모델의 장기 중량의 변화
상기 실시예 3-4의 방법으로 장기 중량을 측정하였다. 그 결과, INTACT control과 비교하여 CPA control에서 상대적이고 절대적인 비장 및 가슴샘의 중량의 감소를 관찰하였다. 그러나, 유의적이지 않은 가슴샘 중량의 증가를 LPC, Mix 및 DW286에서 관찰하였으며, 유의적인 비장 중량의 증가를(p<0.01) CPA control과 비교하여 LPC, Mix 및 DW286-LPC 에서 각각 관찰하였다 (표 15).
Figure 112011048030900-pat00017
절대 및 상대 가슴샘 중량은, CPA control에서 INTACT control과 비교하여 각각 -55.74 및 -52.62% 변화였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286군에서 절대적인 가슴샘 중량은 13.31, 10.24, 7.17, 2.39 및 -2.73% 변화되었고 상대적인 가슴샘 중량은 CPA control과 비교하여 각각 7.56, 13.74, 9.51, 5.47 및 -3.12% 변화하였다. 그러나 유의성 있는 증가는 모든 투여군에서 인정되지 않았다.
절대적이고 상대적인 비장의 중량은, CPA control 에서 INTACT control과 비교하여 -63.38 및 -60.63% 변화를 나타내었다. 절대적인 비장의 중량은 LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286에서 35.62, 28.77, 31.28, 11.87 및 -7.08%,로 변화되었으며 상대적인 비장의 중량은 CPA control과 비교하여 각각 40.69, 32.54, 32.96, 14.38 및 -7.46% 변화를 나타내었다.
모든 CPA 투여군에서 인정된 비장 및 가슴샘의 중량 감소는 림프구의 감소에 따른 변화로 생각되며, LPC 및 DW286-LPC 병용투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 임파 장기 중량의 감소를 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며, LPC 단독 투여보다 Mix 및 LPC-DW286투여군에서 유사하거나 비교적 낮은 감소 억제 효과가 인정되었다.
9-4. CPA -처리 모델에서 총 혈액 WBC 수의 변화
상기 실시예 3-5의 방법으로 혈액 수집 및 WBC를 계산하였다. 그 결과, INTACT control에 비해 모든 CPA 유발 군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 총백혈구 수의 감소 인정되었으나, CPA control 에 비해 DW286 투여군을 제외한 모든 투여군에서 현저한 총 백혈구 수의 증가가 인정되었으나, 유의성 있는 (p<0.01) 증가는 DW286-LPC 투여군에 국한되어 인정되었다 (표 16).
Figure 112011048030900-pat00018
CPA control에서 혈액 총 WBC 숫자는 INTACT control과 비교하여 -91.58% 변화를 보였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 군에서 CPA control과 비교하여 각각 25.00, 32.74, 61.31, 19.64 및 -11.31% 변화하였다.
즉, CPA 투여시 일반적으로 현저한 백혈구 감소가 초래되는 것으로 알려져 있는데, 본 실험의 결과 LPC는 CPA 투여에 의해 유발되는 백혈구의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며, LPC 단독 투여보다 DW286-LPC투여군에서 더 우수한 효과가 인정됨을 확인하였다. 즉, 병용 제제의 경우 DW286 선 투여가 효과가 좋다는 것을 알 수 있었다.
9-5. CPA - treated model 에서 WBC 의 분별 counts 의 변화
분별 count 결과 CPA에 의한 백혈구의 감소는 주로 림프구 감소에 의한 변화로 관찰되었으며, 상대적으로 중성호성 백혈구 및 단핵구 비율의 증가가 초래된 것으로 관찰되었다 (표 16). 한편 본 실험의 결과 LPC및 DW286-LPC 병용투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 백혈구의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며, LPC 단독 투여보다 DW286-LPC 투여군에서 더 우수한 효과가 인정되었다.
CPA control에서의 림프구, 중성호성백혈구 및 단핵구의 비율은 INTACT control과 비교하여 각각 -72.47, 88.11 및 456.43% 변화하였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286군에서 림프구의 비율은 268.78, 244.85, 290.37, 204.01 및 -23.56%로 변화하였으며, 중성호성백혈구의 비율은 -51.07, -46.05, -50.01, -18.81 및 -1.09%의 변화를 나타내었고, 단핵구의 비율은 CPA control과 비교하여 -85.27, -82.32, -91.16, -86.45 및 13.43%의 변화를 나타내었다.
9-6. CPA - treated model 에서 골수 MNPCEs 의 변화
상기 실시예 3-6의 방법으로 골수 소핵 다염적혈구 변화를 관찰하였다. 그 결과, CPA는 돌연변이 발생률을 높이는 물질로 알려져 있으며, 골수 내의 소핵 다염적혈구를 현저히 증가시키는 것으로 알려져 있다. INTACT control과 비교하여 CPA control에서는 소핵 다염적혈구(MNPCEs)는 유의적으로 증가하고 (p<0.01) PCE/(PCE+NCE)는 감소하였다. 모든 투여군에서 CPA control에 비해 의미 있는 소핵다염적혈수 및 PCE 비율의 변화는 인정되지 않았다 (표 17) .
Figure 112011048030900-pat00019
CPA control에서 골수 소핵 다염적혈구 및 다염적혈구의 비율은 INTACT control과 비교하여 1512.50 및 -60.38% 변화하였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 군에서 MNPCE 수는 -14.34, -0.78, -12.02, -5.43 및 -10.85%의 변화를 나타내었으며, 다염적혈구의 비율(PCE/(PCE+NCE))은 각각 CPA control과 비교하여 -12.98, 6.14, -11.80, -1.49 및 -14.79%로 변화를 나타내었다.
이와 같은 결과는 LPC 및 DW286 단독 투여와 병용 투여 모두 CPA에 의해 골수내 소핵 다염적혈구세포의 증가에 별다른 영향을 미치지 않는 것을 뒷받침하는 것이다. 다염적혈구의 비율은 실험물질의 골수 내 세포 독성을 평가하는 항목으로 본 실험의 결과 모든 CPA 투여군에서는 현저한 PCE 비율의 감소가 초래되었으며, 이러한 PCE 비율의 감소는 CPA의 과량 투여에 의한 것으로 판단된다.
9-7. CPA -처리 모델에서 가슴샘과 비장의 조직병리적 변화
상기 실시예 3-7의 방법으로 조직병리적 변화를 관찰하였다. 그 결과, 가슴샘 피질에서 림프구 세포의 감소 및 현저한 비장 위축이 CPA control에서 탐지되었다. 그러나 이러한 위축성의 변화는 LPC, LPC-DW286 및 DW286-LPC의 처리에 의해 효과적으로 억제되었으며, DW286-LPC 군은 다른 군에 비하여 가장 높은 억제 경향을 보였다 (도 7 및 8). 조직형태계측법에서, 비장에서의 백색 수질의 수는 (p<0.01) INTACT control과 비교하여 CPA control에서 유의성 있게 감소되었으나, DW286 단독 투여군을 제외한 모든 투여군에서 유의적으로 증가하였다. 더욱이, 가슴샘 피질에서의 림프성 세포의 감소는 역시 DW286군을 제외한 CPA control과 비교하여 모든 투여군에서 현저히 억제되었다 (표 18).
Figure 112011048030900-pat00020
비장 내 백색 수질의 수는 CPA control에서 INTACT control과 비교하여 -66.67%의 변화를 보였다. 그들은 LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 군에서는 CPA control과 비교하여 101.79, 71.43, 105.36, 101.79 및 -1.79% 의 변화를 나타내었다.
가슴샘 피질 위축 빈도(가슴샘 피질에서의 림프성 세포의 감소 현상)는 INTACT control, CPA control, LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 군에서 0, 100, 88.89, 88.89, 66.67, 77.78 및 100%로 각각 관찰하였다.
본 실험의 결과 LPC및 DW286-LPC 병용투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 임파 장기 내 림프구의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며, LPC 단독 투여보다 DW286-LPC 투여군에서 더 우수한 효과가 인정되었다.
9-8. CPA -처리 모델에서 가슴샘 및 비장의 면역조직화학분석
상기 실시예 3-8의 방법으로 면역조직화학 분석을 수행하였다. 그 결과, 비장의 CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF-α+ 세포의 유의적인 감소(p<0.01)는 INTACT control과 비교하여 CPA control에서 관찰되었으며, CD3+ 및 TNF-α+ 세포의 유의적인 감소는 가슴샘의 피질 및 수질에서 각각 관찰되었다. 그러나 이러한 세포는 DW286 군를 제외한 모든 투여 군에서 CPA control에 비해 유의성 있게 증가하였다. 특히 LPC 단독 투여군보다 DW286-LPC 군에서 유사하거나 더 우수한 감소 억제효과가 인정되었다(표 19 및 도 9 내지 16).
Figure 112011048030900-pat00021
비장 내 CPA control군에서 CD3+, CD4+ 및 CD8+ cells의 수는 INTACT control과 비교하여 -68.32, -83.15 및 -73.26%의 변화를 보였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 군의 CD3+ 세포의 수는 18.29, 77.26, 99.32, 81.03 및 -14.02% 변화하였으며, CD4+ 세포의 수는 136.54, 99.76, 135.58, 79.81 및 -10.82% 변화하였으며, CD8+ 세포는 CPA control과 비교하여 72.89, 48.81, 109.33, 38.83 및 -10.63% 변화하였다.
가슴샘 피질 내 CPA control 군에서 CD3+, CD4+ 및 CD8+ 세포의 수는 INTACT control과 비교하여 -75.41, 64.29 및 28.57% 변화하였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 군의 CD3+ 세포의 수는 328.69, 216.61, 323.44, 279.91 및 -9.16% 변화하였으며, CD8+ 세포의 수는 CPA control의 수와 비교하여 11.11, 33.33, -7.41, 11.11 및 33.33% 변화하였다.
가슴샘 수질 내 CPA control 군에서 CD3+, CD4+ 및 CD8+세포의 수는 INTACT control과 비교하여 -90.00, -8.33 및 28.57%의 변화를 나타내었다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 군에서 CD3+ 세포의 수는 2466.67, 500.00, 2366.67, 2466.67 및 -33.33%로 변화하였으며, CD4+ 세포의 수는 CPA control과 비교하여 -9.09, -18.18, -13.64, 4.55 및 27.27%변화하였다. CD8+ 세포의 수는 CPA control과 비교하여 -5.56, -11.11, -5.56, -16.67 및 -22.22% 변화하였다.
비장, 가슴샘 피질 및 수질 내 CPA control에서 TNF-α+ 세포는 INTACT control과 비교하여 -51.73, -51.06 및 -155.56%의 변화를 보였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 군에서 비장의 TNF-α+ 세포는 36.75, 12.89, 34.84, 27.68 및 -13.84% 변화하였으며, 가슴샘 피질내 TNF-α+ 세포는 65.22, 30.43, 60.87, 30.43 및 -13.04% 변화하였으며, 가슴샘 수질내 TNF-α+ 세포는 CPA control과 비교하여 133.33, 0.00, 0.00, 133.33 및 0.00% 변화를 나타내었다.
즉, CPA에 의해 현저한 비장 및 가슴샘 내 CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF-α+ 세포의 감소가 초래되었으나, LPC 및 DW286-LPC 병용투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 이들 세포의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며, LPC 단독 투여보다 DW286-LPC투여군에서 더 우수한 효과가 인정되었다.
LPC 단독 및 LPC와 DW286의 병용 투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 면역억제 및 CPA-CLP에 의해 초래되는 패혈증에 의한 사망례를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며, 특히 DW286 선 투여 후 LPC를 투여하는 경우(DW286-LPC)이 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 관찰하였다.
상기와 같은 결과들은, 본 발명의 LPC가 다양한 항생제와 병용 투여시 기존의 LPC 보다 현저한 면역 증강 효과 또는 세균성 감염 질환을 효율적으로 치료한다는 것을 뒷받침하는 것이다.

Claims (15)

  1. 라이소포스파티딜콜린 또는 하기 화학식 2로 표시되는 라이소포스파티딜콜린의 유사체, 및 항생제를 포함하는 면역반응이 억제된 상태에서의 면역 증강용, 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물.
    화학식 2
    Figure 112013003414303-pat00040

    상기 식에서, R2는 C4-30의 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 라이소포스파티딜콜린은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 조성물.
    화학식 1
    Figure 112013003414303-pat00022

    상기 식에서, R1은 C4-30의 알킬이거나 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C4-30의 알케닐이다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 L-α-라이소포스파티딜콜린, 스테아로일; L-α-라이소포스파티딜콜린, 팔미토일; DL-α-라이소포스파티딜콜린, 팔미토일; 및 L-α-라이소포스파티딜콜린, 올레오일로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물은 L-α-라이소포스파티딜콜린, γ-O-알킬; DL-α-라이소포스파티딜콜린, γ-O-헥사데실; 및 L-α-라이소포스파티딜콜린, γ-O-헥사데실으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 라이소포스파티딜콜린은 이성질체를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항생제는 카바페넴계 (carbapenem) 항생제, 세팔로스포린계 (cephalosporin) 항생제, 당펩타이드계 (glycopeptide) 항생제, 페니실린계 항생제, 퀴놀론계 (quinolone) 항생제, 세린 프로테아제계 (serine protease) 항생제, 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제, 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제, 살균계 (bacteriostatic) 항생제, 및 상기 항생제의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 카바페넴계 항생제는 도리페넴(Doripenem)이고, 상기 세팔로스포린계 항생제는 세프트리악손 나트륨(Ceftriaxone sodium)이며, 상기 당펩타이드계 항생제는 염산반코마이신(Vancomycin hydrochloride)이고, 상기 페니실린계 항생제는 벤질페니실린 칼륨(Potassium benzylpenicillin)이며, 상기 퀴놀론계 항생제는 DW286(7-[3-(aminomethyl)-4-(methoxyimino)-3-methyltetrahydro-1H-1-pyrrolyl]-1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-1, 4-dihydro[1,8]naphthyridine-3-carboxylic acid hydrochloric acid salt) 또는 시프로플록사신염산염수화물(Ciprofloxacin hydrochloride hydrate)이고, 상기 세린 프로테아제계 항생제는 드로트레코진 알파(활성화된)(Drotrecogin alfa (activated))이며, 상기 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제는 콜리스틴 (colistin)이고, 상기 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제는 토브라마이신 (tobramycin)이며, 상기 살균계 (bacteriostatic) 항생제는 푸시딘산 (fusidic acid)인 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세균성 감염 질환은 복막염, 폐렴, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 신장염, 심장염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 또는 패혈증인 조성물.
  9. (a) 항생제를 개체에 투여하는 단계; 및
    (b) 라이소포스파티딜콜린 또는 하기 화학식 2로 표시되는 라이소포스파티딜콜린의 유사체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 면역반응이 억제된 상태에서의 면역 증강, 또는 세균성 감염 질환 치료 방법.
    화학식 2
    Figure 112013003414303-pat00041

    상기 식에서, R2는 C4-30의 알킬이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (a) 및 (b) 단계는 동시에, 순차적으로, 또는 역순으로 수행되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 항생제는 카바페넴계 (carbapenem) 항생제, 세팔로스포린계 (cephalosporin) 항생제, 당펩타이드계 (glycopeptide) 항생제, 페니실린계 항생제, 퀴놀론계 (quinolone) 항생제, 세린 프로테아제계 (serine protease) 항생제, 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제, 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제, 살균계 (bacteriostatic) 항생제, 및 상기 항생제의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 카바페넴계 항생제는 도리페넴(Doripenem)이고, 상기 세팔로스포린계 항생제는 세프트리악손 나트륨(Ceftriaxone sodium)이며, 상기 당펩타이드계 항생제는 염산반코마이신(Vancomycin hydrochloride)이고, 상기 페니실린계 항생제는 벤질페니실린 칼륨(Potassium benzylpenicillin)이며, 상기 퀴놀론계 항생제는 DW286(7-[3-(aminomethyl)-4-(methoxyimino)-3-methyltetrahydro-1H-1-pyrrolyl]-1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-1, 4-dihydro[1,8]naphthyridine-3-carboxylic acid hydrochloric acid salt) 또는 시프로플록사신염산염수화물(Ciprofloxacin hydrochloride hydrate)이고, 상기 세린 프로테아제계 항생제는 드로트레코진 알파(활성화된)( Drotrecogin alfa (activated))이며, 상기 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제는 콜리스틴 (colistin)이고, 상기 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제는 토브라마이신 (tobramycin)이며, 상기 살균계 (bacteriostatic) 항생제는 푸시딘산 (fusidic acid)인 것인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 세균성 감염 질환은 복막염, 폐렴, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 신장염, 심장염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 또는 패혈증인 것인 방법.
  14. 라이소포스파티딜콜린 또는 하기 화학식 2로 표시되는 라이소포스파티딜콜린의 유사체, 및 항생제가 별개의 용기에 담겨져 있는 면역반응이 억제된 상태에서의 면역 증강, 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트.
    화학식 2
    Figure 112013003414303-pat00042

    상기 식에서, R2는 C4-30의 알킬이다.
  15. 제14항에 있어서, 항생제 및 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체의 혼합 방법, 항생제 투여 후 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체의 투여 순서, 또는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체의 투여 후 항생제 투여 순서가 기재된 설명서가 추가로 포함된 키트.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101951933B1 (ko) * 2013-03-12 2019-02-25 주식회사 아리바이오 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유도체를 포함하는 지질나노물질 및 이의 제조방법
CN105764917B (zh) * 2013-09-26 2021-10-08 新加坡国立大学 利用溶血磷脂酰胆碱支架的组合物和方法
LT6177B (lt) 2014-10-10 2015-07-27 Uab "Biocentras" Fermentų kompleksų išskyrimas iš steptomyces gougerotii 101, daugiafermentinių biopreparatų ruošimas bei taikymas
EP3684180A4 (en) * 2017-09-21 2021-07-07 The Scripps Research Institute NEW THERAPIES FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF CHRONIC RHINOSINUSITIS

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR920000322A (ko) * 1990-06-20 1992-01-29 아이젠브루크, 라피체 세팔로스포린 및 크산틴 유도체를 함유하는 약제학적 복합제 및 이의 용도
KR20040017613A (ko) * 2002-08-22 2004-02-27 주식회사 바이오시너젠 라이소포스파티딜콜린 또는 그 유사체를 포함하는 선천성면역 증강 조성물
KR20090122357A (ko) * 2007-03-23 2009-11-27 바실리어 파마슈티카 아게 세균 감염 치료용 조합 약제
KR20100120368A (ko) * 2009-05-06 2010-11-16 충남대학교산학협력단 도코사헥사에노일 리소포스파티딜콜린을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6165997A (en) * 1997-11-20 2000-12-26 Statens Serum Institut Phospholipids having antimicrobial activity with or without the presence of antimicrobials
CN1564696A (zh) * 2001-10-05 2005-01-12 宾西法尼亚大学托管人 治疗和预防全身炎性反应综合症/败血症的药物组成和方法
JP4320262B2 (ja) * 2002-03-25 2009-08-26 バイオシナジェン インコーポレイテッド Ｇ２ａ受容体に特異的な作用剤リガンドの新規な治療用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR920000322A (ko) * 1990-06-20 1992-01-29 아이젠브루크, 라피체 세팔로스포린 및 크산틴 유도체를 함유하는 약제학적 복합제 및 이의 용도
KR20040017613A (ko) * 2002-08-22 2004-02-27 주식회사 바이오시너젠 라이소포스파티딜콜린 또는 그 유사체를 포함하는 선천성면역 증강 조성물
KR20090122357A (ko) * 2007-03-23 2009-11-27 바실리어 파마슈티카 아게 세균 감염 치료용 조합 약제
KR20100120368A (ko) * 2009-05-06 2010-11-16 충남대학교산학협력단 도코사헥사에노일 리소포스파티딜콜린을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물

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