ES2655193T3 - Composición que contiene antibióticos y lisofosfatidilcolina para el estímulo de la inmunidad o el tratamiento de infecciones bacterianas - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica que contiene, como principios activos, (i) lisofosfatidilcolina o un compuesto representado por la Fórmula Química 2: **(Ver fórmula)** en la que, R2 es alquilo C4-30 o alquenilo C4-30 que tiene uno o más dobles enlaces; y (ii) un antibiótico seleccionado entre el grupo que consiste en DW286 (sal de ácido clorhídrico del ácido 7-[3- (aminometil)-4-(metoxiimino)-3-metil-tetrahidro-1H-1-pirrolil]-1-ciclopropil-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihidro[1,8]naftiridina- 3-carboxílico), hidrato de clorhidrato de ciprofloxacino, ceftriaxona de sodio, doripenem, clorhidrato de vancomicina, tobramicina y ácido fusídico; para su uso en la potenciación de la inmunidad o el tratamiento de infecciones bacterianas.
Description
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La FIG. 11 muestra cambios en células esplénica CD8+ en los grupos de control INTACTO (A), control de CPA (b), LPC (c), Mezcla (d), DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f) y DW285 (g) en el modelo tratado con CPA. Se detectaron disminuciones dramáticas en células esplénicas CD3+ en el grupo de control de CPA en comparación con el grupo de control INTACTO. Sin embargo, estas disminuciones se inhibieron eficazmente en todos los grupos de dosificación en comparación con el grupo de control de CPA excepto para el grupo DW286, respectivamente. Especialmente, se detectaron efectos similares o ligeramente más favorables en el grupo DW286-LPC en comparación con el grupo de LPC. La FIG. 12 muestra cambios en células TNF-α esplénicas en los grupos de control INTACTO (A), control de CPA (b), LPC (c), Mezcla (d), DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f) y DW285 (g) en el modelo tratado con CPA. Se detectaron disminuciones dramáticas en células esplénicas CD3+ en el grupo de control de CPA en comparación con el grupo de control INTACTO. Sin embargo, estas disminuciones se inhibieron eficazmente en todos los grupos de dosificación en comparación con el grupo de control de CPA excepto para el grupo DW286, respectivamente. Especialmente, se detectaron efectos similares o ligeramente más favorables en el grupo DW286-LPC en comparación con el grupo de LPC. La FIG. 13 muestra cambios en células tímicas CD3+ en los grupos de control INTACTO (A), control de CPA (b), LPC (c), Mezcla (d), DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f) y DW285 (g) en el modelo tratado con CPA. Se detectaron disminuciones dramáticas en células tímicas CD3+ en el grupo de control de CPA en comparación con el grupo de control INTACTO. Sin embargo, estas disminuciones se inhibieron eficazmente en todos los grupos de dosificación en comparación con el grupo de control de CPA excepto para el grupo DW286, respectivamente. Especialmente, se detectaron efectos similares o ligeramente más favorables en el grupo DW286-LPC en comparación con el grupo de LPC. La FIG. 14 muestra cambios en células tímicas CD4+ en los grupos de control INTACTO (A), control de CPA (b), LPC (c), Mezcla (d), DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f) y DW285 (g) en el modelo tratado con CPA. Se detectaron disminuciones dramáticas en células tímicas CD4+ en el grupo de control de CPA en comparación con el grupo de control INTACTO. Sin embargo, estas disminuciones se inhibieron eficazmente en todos los grupos de dosificación en comparación con el grupo de control de CPA excepto para el grupo DW286, respectivamente. Especialmente, se detectaron efectos similares o ligeramente más favorables en el grupo DW286-LPC en comparación con el grupo de LPC. La FIG. 15 muestra cambios en células tímicas CD8+ en los grupos de control INTACTO (A), control de CPA (b), LPC (c), Mezcla (d), DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f) y DW285 (g) en el modelo tratado con CPA. Se detectaron disminuciones dramáticas en células tímicas CD8+ en el grupo de control de CPA en comparación con el grupo de control INTACTO. Sin embargo, estas disminuciones se inhibieron eficazmente en todos los grupos de dosificación en comparación con el grupo de control de CPA excepto para el grupo DW286, respectivamente. Especialmente, se detectaron efectos similares o ligeramente más favorables en el grupo DW286-LPC en comparación con el grupo de LPC. La FIG. 16 muestra cambios en células tímicas TNF-α en los grupos de control INTACTO (A), control de CPA (b), LPC (c), Mezcla (d), DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f) y DW285 (g) en el modelo tratado con CPA. Se detectaron disminuciones dramáticas en células tímicas TNF-α en el grupo de control de CPA en comparación con el grupo de control INTACTO. Sin embargo, estas disminuciones se inhibieron eficazmente en todos los grupos de dosificación en comparación con el grupo de control de CPA excepto para el grupo DW286, respectivamente. Especialmente, se detectaron efectos similares o ligeramente más favorables en el grupo DW286-LPC en comparación con el grupo de LPC.
Modo de realización de la invención
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle con referencia a ejemplos. Estos ejemplos son solo para ilustrar la presente invención más específicamente y será evidente para los expertos en la materia que el alcance de la presente invención no está limitado por estos ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de materiales y animales experimentales
El DW286 (sal de ácido clorhídrico del ácido [7-[3-(aminometil)-4-(metoxiimino)-3-metiltetrahidro-1H-1-pirrolil]-1ciclopropil-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihidro[1,8]naftiridina-3-carboxílico], Lpt, 20021) es un antibiótico de fluoro-naftiridina novedoso sintetizado por Dong Wha Pharm. Inc. (Anayang, Corea). Se usó lisofosfatidilcolina (LPC; 18:0,94 %, GmbH PHOSPHOLIPID, Alemania). Se adquirieron isómeros de LPC, es decir, 1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3fosfocolina (1-oleoil; 18:1 LPC), hidrato de clorhidrato de ciprofloxacino (Cipro), bencilpenicilina de potasio (Peni), ceftriaxona de sodio (Ceft), doripenem (Dori), clorhidrato de vancomicina (Vanco), drotrecogina alfa (activada) (Xigris), colistina, tobramicina y ácido fusídico (Fusidin) respectivamente de Sigma, etc. Se almacenaron LPC, DW286, hidrato de clorhidrato de ciprofloxacino, bencilpenicilina de potasio, ceftriaxona de sodio, doripenem, clorhidrato de vancomicina y drotrecogina alfa (activada) en un desecador para la protección de la degeneración por la luz y la humedad.
Se usaron ratones ICR (6 semanas de edad, SLC, Japón) después de la aclimatación durante 7 u 8 días. Los animales se asignaron cinco o cuatro por jaula de policarbonato en una sala con temperatura (20-25 ºC) y humedad
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3-3. Medición del peso corporal y de las mortalidades
En el modelo CPA-CLP, el peso corporal y las mortalidades se midieron una vez al día durante 5 días con balanzas electrónicas automáticas (Sartorius Co., Ltd., EE.UU.), una vez al día durante 2 días en el modelo tratado con CPA. Todos los animales se mantuvieron en ayunas durante la noche en la dosificación de CPA, la CLP o la dosificación inicial para reducir las diferencias en la alimentación. Además, se calcularon ganancias de peso corporal como se indica a continuación:
Ecuación 1. Ganancias de peso corporal (g) Modelo CPA-CLP: Peso corporal en el sacrificio – en la CLP (5 días) Modelo tratado con CPA: Peso corporal en el sacrificio – en la dosificación inicial (2 días)
3-4. Medición del peso de los órganos
En el sacrificio del modelo tratado con CPA, se midieron los pesos en húmedo del bazo y el timo y se consideraron como el peso absoluto y después se calculó el peso relativo de los órganos (% de peso corporal) como se indica a continuación:
Ecuación 2. Pesos relativos de los órganos = [(Pesos absolutos de los órganos / Peso corporal en el sacrificio individual) × 100]
3-5. Recogida de sangre y recuentos de WBC
Se recogió sangre en el sacrificio del modelo tratado con CPA de la vena cava y se calcularon los números totales de leucocitos en sangre usando una cámara de recuento, pipeta de dilución y solución de Turk como solución de dilución. Todos los números se calcularon como ×103/mm3. Además, se calcularon los números de células de linfocitos, eosinófilos, neutrófilos, monocitos y basófilos entre 100 leucocitos totales en muestras de sangre de frotis teñidas con Giemsa.
3-6. Preparación de médula ósea y recodificación de micronúcleos
Se hicieron preparaciones de médula ósea de modelo tratado con CPA de acuerdo con Schimid [1975]. En resumen, se recogieron células de médula ósea del fémur mencionado anteriormente en 3 ml de suero bovino fetal inactivado (GIBCO BRL, EE.UU.), se centrifugaron y se extendieron sobre el portaobjetos. Las preparaciones se secaron y se fijaron por inmersión en metanol absoluto (durante 10 ~ 20 minutos). Los portaobjetos fijados se tiñeron como se
- indica a continuación:
- Tinción de May-Grunwald Tinción de May-Grunwald (diluida 1:1) Tinción de Giemsa (diluida 1:6)
- 3 min 2 min 10 min
Los portaobjetos se codificaron aleatoriamente y se examinaron con aumento x 1000 por dos expertos diferentes. Se contaron cuerpos pequeños redondos o en forma de óvalo, cuyo tamaño varía de aproximadamente 1/5 a 1/20 del diámetro de PCE, como micronúcleos. Se prestó atención a discriminar los micronúcleos de los artefactos. Los resultados se expresaron como el número de MNPCE en 1000 PCE. Se calculó el número medio de MNPCE ± DT para cada grupo de tratamiento. Además, también se calculó la relación PCE/(PCE + eritrocitos normocromáticos (NCE) mediante el recuento de 500 eritrocitos para detectar la posibilidad de citotoxicidad [Heddle et al., 1984].
3-7. Histopatología
Después de la medición del peso de los órganos, se muestrearon el timo y el bazo. Los órganos muestreados se fijaron en formol tamponado neutral al 10 %. Después de la inclusión en parafina, se prepararon secciones de 34 µm. Se tiñeron secciones representativas con hematoxilina y eosina (H & E) para el examen microscópico óptico. Después de eso se observaron los perfiles histológicos de órganos individuales.
Histomorfometría -Los números de pulpas blancas en el bazo se calcularon como N/secciones histológicas (x 50) usando análisis automatizado de imágenes (analySIS Image Processing; SIS, Alemania). Además, también se calcularon los números de cambios atróficos en la corteza tímica/número observado total de timo.
3-8. Inmunohistoquímica (IHQ)
Después de quitar la parafina, se realizaron recuperaciones de epítopos de CD3 en Tampón de Tris 10 mM EDTA 1 mM (pH 9,0), CD4 y CD8 en Tampón de EDTA 1 mM (pH 8,0) y TNF-α en Tampón de Citrato 10 mM (pH 6,0) como métodos anteriores. Los anticuerpos primarios utilizados en la invención fueron los de la siguiente tabla.
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[Tabla 1]
- Anti-suero
- Código Proveedor Tasa de dilución
- Anticuerpo monoclonal anti-CD3 (17A2) de ratón
- CBL-1317 Chemicon Inc., CA, EE.UU. 1:100
- Anticuerpo monoclonal anti-CD4 (GK1.5) de ratón
- CBL-13583 Chemicon Inc., CA, EE.UU. 1:100
- Anticuerpo monoclonal anti-CD8 (Ly-2) de ratón
- CBL-1318 Chemicon Inc., CA, EE.UU. 1:100
- Anticuerpo policlonal anti-TNF-a
- HP8001 HyCult biotechnology b.v., Países Bajos. 1:100
- * Todos los antisueros se generaron en rata.
El baño de agua con una placa de tinción, que contenía un tampón, se precalentó hasta que la temperatura alcanzó 95-100 ºC. La placa de tinción se colocó a temperatura ambiente y los portaobjetos se enfriaron durante 20 minutos. 5 Después de las recuperaciones de epítopo, las secciones se inmunotiñeron como en las siguientes etapas.
En primer lugar, las secciones se incubaron con metanol y H2O2 al 0,3 % durante 30 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena a temperatura ambiente y después se aclararon tres veces en solución salina tamponada con fosfato 0,01 M (PBS; pH 7,2) 3 veces. Después, las secciones se incubaron con la solución de bloqueo de suero de 10 caballo normal (Vector Lab. Inc., CA, EE.UU., dilución 1:100) durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara de humedad, para bloquear la unión no específica de la inmunoglobulina y, después, se aclararon tres veces en PBS 0,01 M. Las secciones se incubaron con cuatro tipos de antisueros primarios durante 12 horas a 4 ºC en una cámara de humedad y, después, se aclararon tres veces en PBS 0,01 M. Las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios biotinilados universales durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara de humedad y, después, se 15 aclararon tres veces en PBS 0,01 M. Las secciones se incubaron con reactivos ABC (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Lab. Inc., CA, EE.UU. Dilución 1:50) durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara de humedad y, después, se aclararon tres veces en PBS 0,01 M. Las secciones se incubaron en el kit de sustrato de peroxidasa (Vector Lab. Inc., CA) durante 30 segundos a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces en PBS 0,01 M. Las secciones se contratiñeron con una solución de hematoxilina de Mayer y después se aclararon en agua 20 corriente durante 30 minutos. Las secciones se deshidrataron a través de etanol al 95 % durante 2 min y etanol al 100 % durante 3 horas y después se aclararon en xileno durante 2 horas. Después de eso, las secciones se observaron usando un cubreobjetos con medio de montaje permanente bajo el microscopio óptico (Zeiss, Alemania).
Histomorfometría - Entre 1000 células esplénicas o tímicas, se observaron los números (N) de células
25 inmunorreactivas (CD3+, CD4+, CD8+ y TNF-α+) como N/1000 esplenocitos o timocitos usando análisis automatizado de imágenes. En el timo, los recuentos se realizaron tanto en la corteza como en la médula por separado.
3-9. Análisis estadísticos
30 Se calcularon medias y desviaciones típicas (media ± D.T.). Se realizaron análisis estadísticos usando un ensayo U de Mann-Whitney-W de Suma de Intervalos de Wilcoxon (ensayo MW) con SPSS para Windows (versión 6.1.3., SPSS Inc., EE.UU.). Para ayudar a la comprensión de la eficacia de los materiales de ensayo sobre las diferencias entre los controles intactos y de CPA, y los grupos de control de CPA y de ensayo en modelo tratado con CPA como
35 se indica a continuación:
Ecuación 3. Cambios en porcentaje frente a control intacto (%) = [((Datos de control de CPA – Datos de control intacto) / Datos de control intacto) × 100
40 Ecuación 4. Cambio en porcentaje frente a control de CPA (%) = [((Datos de grupos de ensayo – Datos de control de CPA) / Datos de control de CPA) × 100
Ejemplo 4: Efectos de las concentraciones de LPC sobre las supervivencias en modelo de ratón inducido por CPA-CLP
45 Se investigaron las eficacias en función de dosis diferentes de LPC mediante el uso de ratones inmunosuprimidos inducidos por CPA y después ratones con sepsis inducida por CLP. A los ratones inmunosuprimidos inducidos por CPA y los ratones con sepsis inducida por CLP se les dosificaron por vía subcutánea cinco dosis de LPC (1, 2,5, 5, 10 y 20 mg/kg), 4 veces en intervalos de 12 h a partir de 6 horas después de la CLP, respectivamente. Después, se
50 observaron los cambios en el peso corporal y la mortalidad. Se disolvió LPC en albúmina humana al 5 % (Green Cross, COREA) y se dosificó a 10 ml/kg (de peso corporal) para cada uno. Los órdenes de dosificación y los grupos de dosificación se representaron esquemáticamente en la FIG. 1.
Específicamente, se dividieron ratones ICR (6 semanas de edad, SLC, Japón) en siete grupos (diez ratones por 55 grupo), grupo de control de CPA (grupo de dosificación de vehículo operado por CLP simulada tratado con CPA), grupo de control de CPA-CLP (grupo de dosificación de vehículo operado por CLP tratado con CPA), grupo de
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Como se ha descrito anteriormente, el tiempo de supervivencia, que se considera el índice más importante en la sepsis, aumentó significativamente en las cinco dosis de LPC en ratones de CPA-CLP. En consecuencia, puede observarse que la LPC puede aumentar los tiempos de supervivencia de los pacientes con sepsis. Adicionalmente, los grupos de dosificación de LPC de 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg y 10 mg/kg mostraron efectos de prolongación de tiempos de supervivencia de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, el grupo de dosificación de LPC de 20 mg/kg mostró efectos similares o relativamente más bajos en comparación con el grupo de dosificación de LPC de 10 mg/kg. En consecuencia, en el modelo de CPA-CLP, se determinó que la dosis eficaz mínima de LPC era de aproximadamente 1 mg/kg y se observó que la dosis eficaz óptima de LPC era de 10 mg/kg.
Ejemplo 5: Efectos de isómeros de LPC sobre las supervivencias en modelo en ratón inducido por CPA-CLP
Las eficacias de LPC, Xigris, LPA, LPC 18:1, LPC 18:0 y DW286AA se compararon mediante el uso de ratones inmunosuprimidos inducidos por CPA y después en ratones con sepsis inducida por CLP. A los ratones con sepsis por CPA-CLP se les dosificó individualmente por vía intravenosa LPC, LPA, LPC 18:1 y LPC 18:0 (5 mg/kg para cada uno), Xigris (0,4 y 2 mg/kg) y DW286AA (10 y 20 mg/kg), 6 horas después de la CLP, respectivamente. Después, se observaron los cambios en el peso corporal y la mortalidad. Todos los materiales de ensayo se disolvieron en solución salina fisiológica estéril y se dosificaron a 10 ml/kg (de peso corporal) para cada uno. Los órdenes de dosificación y los grupos de dosificación se representaron esquemáticamente en la FIG. 2.
Específicamente, se dividieron ratones ICR (6 semanas de edad, SLC, Japón) en diez grupos (diez ratones por grupo), grupo de control de CPA (grupo de dosificación de vehículo operado por CLP simulada tratado con CPA), grupo de control de CPA-CLP (grupo de dosificación de vehículo operado por CLP tratado con CPA), grupo de dosificación de LPC de 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de Xigris de 0,4 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de Xigris de 2 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de LPA de 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de LPC 18:1 de 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de LPC 18:0 de 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de DW286AA de 10 mg/kg después de CPA-CLP y grupo de dosificación de DW286AA de 20 mg/kg después de CPA-CLP. Los materiales de ensayo se dosificaron individualmente por vía intravenosa a 10 ml/kg (de peso corporal), 6 horas después de la CLP, mediante el uso de solución salina fisiológica estéril como vehículo. Es decir, a los ratones con sepsis por CPA-CLP se les dosificaron individualmente por vía intravenosa 5 mg/kg de LPC, LPA, LPC 18:1 y LPC 18:0, 0,4 y 2 mg/kg de Xigris y 10 y 20 mg/kg de DW286AA, 6 horas después de la CLP, respectivamente. Todos los materiales de ensayo se disolvieron en solución salina estéril y se dosificaron a 10 ml/kg (de peso corporal) para cada uno. En los grupos de control de CLP y simulado, se dosificaron por vía intravenosa 10 ml/kg de solamente solución salina fisiológica estéril por vía intravenosa individualmente. Después de la dosificación, se observaron los cambios de peso corporal y la mortalidad mediante el procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 3-3.
[Tabla 4] Efectos de LPC, isómeros de LPC, Xygris y DW286aa sobre las mortalidades en el modelo en ratón de sepsis por CPA-CLP (SEP009)
- Mortalidades
- Controles LPC LPC 18:0 LPC 18:1 LPA Xigris DW286aa
- CPA
- CPA + CLP 5 mpk 5 mpk 5 mpk 5 mpk 0,4 mpk 2 mpk 10 mpk 20 mpk
- 1º Tratamiento con CPA
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 2º Tratamiento con CPA
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- En la CLP (día 0)
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Día 1
- 0 4 1 0 0 0 3 0 1 0
- Día 2
- 0 6 3 6 10 9 4 5 2 1
- Día 3
- 0 0 1 0 0 1 2 1 0 1
- Día 4
- 0 0 1 1 0 0 0 3 0 0
- Día 5
- 0 0 2 1 0 0 0 0 0 0
- Día 6
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
- Día 7
- 0 0 1 1 0 0 0 0 2 1
- Día 8
- 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0
- Día 9
- 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
- Día 10
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
- Total
- 0 10 10 10 10 10 10 10 7 7
13
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30
35
40
45
50
Se detectaron disminuciones significativas en el peso corporal a partir del día 1 después de la CLP en todos los grupos tratados con CPA-CLP en comparación con el grupo control de CPA. Se detectaron disminuciones significativas (p < 0,05) en el peso corporal 1 día después de la CLP en el grupo de dosificación de LPC en comparación con el grupo control de CPA-CLP. Sin embargo, no se detectaron cambios significativos en el peso corporal en todos los grupos de dosificación en comparación con el grupo de control de CPA-CLP.
Los aumentos en la tasa de supervivencia en los grupos de dosificación de LPC + Cipro, LPC + Peni y LPC + Ceft en comparación con el grupo de la LPC sola y cada uno de los grupos de antibióticos solos. Este resultado significa que sus efectos aumentaron mediante las combinaciones de LPC y antibióticos y, por tanto, apoya que los agentes combinados de la presente invención pueden tener efectos superiores en la potenciación de la inmunidad y el tratamiento de infecciones bacterianas.
Ejemplo 7: Efectos de la LPC y los antibióticos solos o en combinación sobre las supervivencias en modelo en ratón inducido por CPA-CLP
Se compararon las eficacias de la LPC en combinación con doripenem (Dori), clorhidrato de vancomicina (Vanco) y drotrecogina alfa (activada) (Xigris) mediante el uso de ratones inmunosuprimidos inducidos por CPA y, después, ratones con sepsis inducida por CLP. Los ratones con sepsis inducida por CPA-CLP se dosificaron individualmente por vía intravenosa con LPC (5 mg/kg), DW286AA (5 mg/kg), Dori (200 mg/kg), Vanco (10 mg/kg), Xigris (2 mg/kg), LPC + DW286AA (5 + 5 mg/kg), LPC + Dori (5 + 200 mg/kg), LPC + Vanco (5 + 10 mg/kg) y LPC + Xigris (5 + 2 mg/kg), 6 horas después de la CLP, respectivamente. Después, se observaron los cambios en el peso corporal y la mortalidad. Todos los materiales de ensayo se disolvieron en solución salina fisiológica estéril y después se dosificaron a 10 ml/kg (de peso corporal) para cada uno. En todos los grupos de composición, se disolvieron dosis apropiadas de materiales directamente en una solución disuelta en LPC (0,5 mg/ml) y después se dosificaron, respectivamente. Los órdenes de dosificación y los grupos de dosificación se representaron esquemáticamente en la FIG. 4.
Específicamente, se dividieron ratones ICR (6 semanas de edad, SLC, Japón) en 11 grupos (diez ratones por grupo), grupo de control de CPA (grupo de dosificación de vehículo operado por CLP simulada tratado con CPA), grupo de control de CPA-CLP (grupo de dosificación de vehículo operado por CLP tratado con CPA), grupo de dosificación de LPC de 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de DW286AA de 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de Dori de 200 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de Vanco de 10 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de Xigris de 2 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de LPC + DW286AA de 5 + 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de LPC + Dori de 5 + 200 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de LPC + Vanco de 5 + 10 mg/kg después de CPA-CLP y grupo de dosificación de LPC + Xigris de 5 + 2 mg/kg después de CPA-CLP. Los materiales de ensayo se dosificaron individualmente por vía intravenosa a 10 ml/kg (de peso corporal), 6 horas después de la CLP, respectivamente, mediante el uso de solución salina fisiológica estéril como vehículo. Es decir, se dosificaron ratones con sepsis por CPA-CLP individualmente por vía intravenosa con LPC (5 mg/kg), DW286AA (5 mg/kg), Dori (200 mg/kg), Vanco (10 mg/kg), Xigris (2 mg/kg), LPC + DW286AA (5 + 5 mg/kg), LPC + Dori (5 + 200 mg/kg), LPC
+ Vanco (5 + 10 mg/kg) y LPC + Xigris (5 + 2 mg/kg), 6 horas después de la CLP, respectivamente. Todos los materiales de ensayo se disolvieron en solución salina fisiológica estéril y después se dosificaron a 10 ml/kg (de peso corporal) para cada uno. En todos los grupos de composición, se disolvieron dosis apropiadas de materiales directamente en una solución disuelta en LPC (0,5 mg/ml) y después se dosificaron, respectivamente. Después de la dosificación, se observaron los cambios de peso corporal y la mortalidad mediante el procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 3-3.
[Tabla 8] Efectos de la combinación de LPC y antibióticos sobre las mortalidades en modelo en ratón de sepsis por CPA-CLP (SEP012)
- Mortalidades
- Controles LPC DW286aa Dori Vanco Xigris LPC + 286aa LPC + Dori LPC + Vanco LPC + Xigris
- CPA
- CPA + CLP 5 mpk 5 mpk 200 mpk 10 mpk 25 mpk 5 + 5 mpk 5 + 200 mpk 5 + 10 mpk 5 + 2 mpk
- 1º
- Tratamiento
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- con CPA
-
imagen11 imagen12 imagen13 imagen14 imagen15 imagen16 imagen17 imagen18 imagen19 imagen20 imagen21
- 2º
- Tratamiento
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- con CPA
-
imagen22 imagen23 imagen24 imagen25 imagen26 imagen27 imagen28 imagen29 imagen30 imagen31 imagen32
- En la CLP (día 0)
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Día 1
- 0 5 1 0 0 0 0 0 0 0 0
- Día 2
- 0 5 6 3 5 7 7 0 3 4 3
16
Específicamente, se dividieron ratones ICR (6 semanas de edad, SLC, Japón) en 10 grupos, grupo de control de CPA (grupo de dosificación de vehículo operado por CLP simulada tratado con CPA), grupo de dosificación de DW286AA de 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de LPC de 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de colistina de 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de tobramicina de 5 4 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de fusidin de 80 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de LPC + colistina de 5 + 5 mg/kg después de CPA-CLP, grupo de dosificación de LPC + tobramicina de 5 + 4 mg/kg después de CPA-CLP y grupo de dosificación de LPC + fusidin de 5 + 80 mg/kg después de CPA-CLP. Se dosificaron materiales de ensayo individualmente por vía intravenosa a 10 ml/kg (de peso corporal), 6 horas después de CLP, respectivamente, mediante el uso de solución salina fisiológica estéril como vehículo. Es decir, se 10 dosificaron ratones con sepsis por CPA-CLP individualmente por vía intravenosa con LPC (5 mg/kg), DW286AA (5 mg/kg), colistina (5 mg/kg), tobramicina (4 mg/kg), fusidin (80 mg/kg), LPC + colistina (5 + 5 mg/kg), LPC + tobramicina (5 + 4 mg/kg) y LPC + fusidin (5 + 80 mg/kg), 6 horas después de CLP, respectivamente. Todos los materiales de ensayo se disolvieron en solución salina fisiológica estéril y después se dosificaron a 10 ml/kg (de peso corporal) para cada uno. En todos los grupos de composición, se disolvieron dosis apropiadas de materiales
15 directamente en una solución disuelta en LPC (0,5 mg/ml) y después se dosificaron, respectivamente. Después de la dosificación, se observaron los cambios de peso corporal y la mortalidad mediante el procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 3-3.
[Tabla 10] Efectos de la combinación de LPC y antibióticos sobre las mortalidades en modelo en ratón de sepsis por CPA-CLP 20 (SEP013)
- Mortalidades
- Controles LPC DW286aa Colistina Tobra Fusidin LPC + Colistina LPC + Tobra LPC + Fusidin
- CPA
- CPA + CLP 5 mpk 5 mpk 5 mpk 4 mpk 80 mpk 5 + 5 mpk 5 + 4 mpk 5 + 80 mpk
- 1º Tratamiento con CPA
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 2º Tratamiento con CPA
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- En la CLP (día 0)
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- Día 1
- 0 4 2 0 1 2 2 0 1 1
- Día 2
- 0 6 5 0 5 5 5 5 3 4
- Día 3
- 0 0 2 2 2 1 1 1 1 0
- Total
- 0 10 9 2 9 8 8 6 5 5
[Tabla 11] Efectos de la combinación de LPC y antibióticos sobre las supervivencias (%) en modelo en ratón de sepsis por CPA-CLP (SEP013)
- Supervivencias
- Controles LPC DW286aa Colistina Tobra Fusidin LPC + Colistina LPC + Tobra LPC + Fusidin
- CPA
- CPA + CLP 5 mpk 5 mpk 5 mpk 4 mpk 80 mpk 5 + 5 mpk 5 + 4 mpk 5 + 80 mpk
- 1º Tratamiento con CPA
- 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
- 2º Tratamiento con CPA
- 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
- En la CLP (día 0)
- 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
- Día 1
- 100 60 80 100 90 80 80 100 90 90
- Día 2
- 100 0 30 100 40 30 30 50 60 50
- Día 3
- 100 0 10 80 20 20 20 40 50 50
- Total
- 100 0 10 80 20 20 20 40 50 50
25 Como resultado, como puede observarse a partir de las Tablas 10 y 11 anteriores, todos los ratones del grupo de control de CPA sobrevivieron durante el periodo de observación, 3 días. Sin embargo, en el grupo de control de CLP, 10 de los 10 animales murieron 2 días después de la CLP, mostrando de este modo un 100 % de mortalidad. En los grupos de LPC, Fusidin, colistina y tobramicina solos, 9, 8, 9 y 8 animales murieron 3 días después de la
30 CLP, respectivamente. Sin embargo, las tasas de supervivencia se redujeron o los tiempos de muerte se retrasaron en los grupos de LPC en combinación con colistina, tobramicina y fusidin (Tabla 10). Mientras tanto, en los grupos
18
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-
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