KR101308685B1 - 막 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포를 포함한 체시료의 분석 방법을 제공하며 상기 방법은 상기 시료를 세포 용해를 일으키게 하는 조건하에서, 특히 세제의 사용에 의해서, 처리하는 단계, 및 상기 처리된 용해된 시료를 핵산 분자의 절단하는 단계를 제공한다. 본 발명은 또한 막 분석 방법의 수행 능력을 증가시키는데 있어서 핵산 절단 조건의 용도, 이러한 분석을 실행하는 장치, 및 분석에 사용되는 키트를 제공한다.

Description

막 분석 방법{Membrane Assay Method}
본 발명은 체시료에 시행되는 분석의 정확성, 신뢰성, 및/또는 속도를 증진시키기 위한 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 크기가 작은(예를 들면1 μm 미만)의 막 또는 필터를 사용하여, 특히 세포 또는 세포파편이 포함된 시료에 시행되는 고속 분석법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 향상된 용해(예를 들면 계면활성제 용해) 매개 막-농도 분석법 및 이에 해당되는 분석용 키트 및 장치에 관한 것이다.
신속한 진단 방법들이 POC 진단(point of care, 예를 들어, 전문 의료인과의 면담에서)에서의 적용 또는 소형 또는 신속-선회 의료 검진 실험실에서의 적용이 점점 중요해지고 있다. 이러한 시험들은, 특히 POC 진단용 시험, 최소한 하나의 장치를, 예를 들면 시료(들) 및 시료와 장치의 일부와의 특별한 상호작용을 허용하는 용액 및/또는 다른 시약을 포함하는 일회용 튜브, 막대, 카트리지, 로터 등, 사용한다. 비교적으로 공극 크기가 작은, 0.2-5 μm의 막은, 예를 들면 니트로셀루로즈, 신속진단분석(예를 들면 면역분석)에 일반적으로 사용되는 성분이다. 이러한 막은 고형 상태의 분석으로 사용될 수 있으며, 또한 미세한 입자와 침전된 생물학적 물질을 분리하는데 사용될 수 있다.
세포를 함유한 시료로부터 성분들의 신속한 분석법에는 예를 들면, 혈액에 포함된 혈장 단백질의 분석에 사용되는 두 가지 방법이 있다; 한가지는 용액(예를 들면 혈장)으로부터 세포들을 분리하거나 막을 통과하도록 세포를 파괴시킬 수 있다. 분리 방법에서, 세포들은 분석하기 이전에 분리과정에서 제거되거나, 또는 시험 장치 자체에 필터를 사용하여 제거된다. 세포 파괴방법에서는, 세포(예를 들면 혈 세포)막은 조각으로 쪼개지고 예를 들면 세제의 사용으로 용해되어 막의 미세 공극을 통과할 수 있게 된다.
신속 시험은 특별히 POC 진단시 또는 유선형으로 작업하는 실험실의 경우에 있어서는 일반적으로는 짧은 단계(바람직하게는 간단한)로 한정되어야 하고 단지 몇 분간의 시간만이 소요되어야 한다. 이러한 방법은 개별의 세포분리 단계는 비실용적임을 의미하며, 용액(예를 들면 혈장)의 분리는 장치 내에서 일체된 부분에서 수행되거나, 또는 시료가 필터 막의 미세 공극을 통과하도록 세포벽과 핵막을 붕괴/용해하는 세제와 같이 용해제 또는 용해조건을 사용하여야 한다. 특히 정량분석을 하기 위한 막 체계에서는, 이러한 체계에서 유효한 혈구의 분리를 디자인하는 작업이 어렵기 때문에 용해방법이 유리한 방법이다.
POC 진단에서의 사용의 분석에서 검진 속도, 민감성 및 정확도는 고도로 요망되는 요소들이다, 그러나 분석의 전 후 관계에 있어서, 때로는 한 성분(예를 들면 속도)에 있어서 만족한 결과를 얻기 위하여 다른 한 성분(예를 들면 민감성)에서 가능한 개선을 희생시켜야 하는 "한 쪽을 취하면 다른 쪽을 희생하여야 하는 이율 배반적인 관계(trade-off)"를 필요로 한다. 이러한 특성들이 함께 발전되어질 수 있음으로 인하여 균형이 전체적으로 고도의 수준으로 될 수 있는 방법을 제공하는 것은 높은 가치가 있다.
면역농축 분석으로도 사용되는 막 유동 분석 체계는, 항체, 수용체, 항체 조각 등과 같은 결합 부분에 접착된 일반적으로 0.45μm의 작은 공극 크기의 막을 사용한다. 이러한 체계는 막의 공극 크기이거나 그 이상의 세포파편과 같은 비록 작은 수의 입자일지라도 막을 통과하는 유동액의 효율을 저하시키기 때문에 입자가 없는 시료를 요구한다. 최악의 경우 막을 통과하는 유액의 흐름이 완전히 정지될 수 있다. 심지어 작은 막의 막힘 일지라도 유동 문제를 발생시킬 수 있으며 및/또는 분석의 신뢰성을 저하 시킬 수 있다. 막 유동 분석체제의 개발시, 분석이 이루어지고 있는 동안 막의 유동 특성과 공극 크기의 변화 없이 세포를 함유한 시료가 막을 통과하도록 하는 것이 중요한 논점이다.
위 사항에 부가하여, 헤마토크리트 보정(haematocrit correction)은 용해(특히 세제용해) 방법의 적용에 의해서 제기될 수 있는 전혈에 대한 정량 분석에 있어 서 또 다른 문제이다. 특히 세포 용해 방법의 적용시, 용해물의 단순한 헤모글로빈 측정은 헤마토크리트 보정의 가능성을 제공한다.
전혈 또는 세포를 함유한 시료의 용해시 (특히 세제매개 용해시), 주 목표는 세포벽과 핵막을 파손시켜 장치를 특히 필터 또는 막을 통과 할 수 있도록 하는 것이다.
예를 들면, 세제가 세포막을 공략하여 마이셀들과 단백질-세제 복합물을 발생시킨다. 마이셀의 크기는 일반적으로 0.45μm의 공극 크기의 막을 통과하기에 충분하도록 작다. 유사하게 카오트로프 용해제는 세포막으로 지지되는 단백질의 구조를 파괴시킨다.
막 형태의 분석에서 (예를 들면 세제) 용해 방법이 상당히 유리함에도 불구하고, 실질적으로 이 방법이 산업적으로, 특별히 자동 분석 체계에서 거의 적용이 되지 못하고 있다. 이러한 원인 중에서 한 가지가 세포막이 마이셀로 완전히 용해가 기대되는 경우에도 막의 막힘과 유동 제한 현상이 발생하기 때문이라 할 수 있다. 이전에는 용해분석법에서 막 운송의 제한적 원인은 시료의 세포 주위 또는 세포 내에서의 막의 파손으로 생각되었기 때문에 이러한 현상은 인위적인 것으로 간단히 처리해 버리거나 단순히 이해되지 못하였다. 혈액시료, 예를 들면, 세포 막 또는 백혈구 핵막의 불충분한 용해는 이전에는 막 막힘의 주요 원인이라고 생각하 였다.
본 발명가는, 이 전의 용해된 세포 시료의 작용의 이해와는 대조적으로, 예기치 않게 극미량이라 할 지라도 세포의 핵산, 특히 DNA가 세포막의 막힘에 가장 큰 영향을 미치고 높은 배경 분석 신호임을 확인하였다.
한 측면에서, 본 발명은 세포를 포함하는 체시료의 분석 방법을 제공하며, 상기한 분석 방법은 세포의 용해를 발생시키는 조건하에서 상기 시료를 처리하는 단계: 및 상기 생성된 용해 시료가 핵산 분자 특히 DNA 분자가 절단되도록 처리하는 단계를 포함한다. 바람직한 세포 용해를 발생시키는 조건은 세제와 같은 세포 용해제의 첨가를 포함한다. 바람직한 방법은 막 분석법이며, 더 바람직한 방법은 아래에 설명한 것과 같이 "막 포착" 분석법이다. 상기 방법은 선택적으로 바람직하게는, 상기 시료내의 하나 이상의 성분 또는 잠재적인 성분에 대한 시료를 분석하는 단계(예를 들면 막을 통과하는 시료부분 또는 바람직하게는 막에 의하여 또는 막에 남아있는 시료부분), 및/또는 선택적으로 바람직하게는 분석된 값과 세포를 함유한 체시료 내의 분석된 성분의 정성, 반-정량, 정량값과의 관계를 해석하는 단계, 및/또는 선택적으로 바람직하게는 분석된 성분과 적어도 하나 이상의 의학적 또는 생물학적 조건과의 관계를 해석하는 단계를 포함한다(그 결과로 시료의 막 통과).
분석 장치에서 막의 막힘의 원인이 지질의 불충분한 용해성이라기 보다는 핵산이라는 본 발명가의 주장은 작은 공극 크기의 막을 통한 흐름의 증가와 이러한 막이 시료내의 성분을 농축할 때 사용되는 경우 배경신호의 감소에 대한 필요성을 모두 요구한다. 따라서 향상된 흐름은 보다 빠른 분석을 수행할 수 있도록 하고 및/또는 같은 시간에 더 많은 양의 시료를 수행할 수 있도록 하며, 이로 인해 많은 량으로부터 분석 대상물의 농축과 이에 따라 수반되는 감수성과 정확성의 향상을 얻을 수 있다.
또 한 측면에서, 본 발명은 또한 용해된 세포를 포함하는 체시료가 공극의 크기가 10μm 미만의 막을 통과하는 단계를 포함하는 분석법에서 핵산 절단 조건의 사용을 제공한다. 이러한 용도는 분석의 수행 능력을 증진시키며 하나 이상의 형태가 적용되거나, 특성의 전체적인 균형에서 향상될 것이라고 볼 수 있다. 바람직하게는 상기 용도는 막 농도분석에서 막을 통과하는 유동액의 흐름을 증진시키고, 및/또는 막에서 배경신호를 감소시키고, 및/또는 분석 속도를 증가시키는데 있다.
또 한 측면에서, 본 발명은 세포를 포함하는 체액을 수용하는 챔버 및 공극의 크기가 10 μm 미만의 적어도 하나의 막을 포함하는 분석장치를 제공하며 상기 분석장치는 사용시 핵산 절단 조건을 제공한다. 바람직하게는 상기 장치는 아래 기재된 바와 같이 적어도 하나의 핵산 절단용 화학적 및/또는 생물학적 수단을 포함한다. 핵산 절단 조건은 상기 장치의 사용에 의해 제공될 것이다.
또 한 측면에서, 본 발명은 세포를 포함한 생물학적 유체의 분석용 키트를 제공하며, 상기 키트는 약 10 μm 미만의 공극 크기의 막을 포함하는 장치: 및 최소한 하나의 핵산 절단용 화학적 및/또는 생물학적 수단을 포함한다. 선택적으로 바람직하게는 상기 키트는 상기 시료의 성분 또는 잠재 성분을 분석하기 위한 하나 이상의 시약 및/또는 세제와 같은 하나 이상의 세포용해용 수단을 포함한다. 보다 선택적으로 바람직하게는 상기 키트는 상기 세포의 용해(예를 들어, 세제-매개 용해)단계, 해리된 핵산 분자의 절단단계, 결과 시료의 적어도 일부분이 막을 통과하는 단계를 포함하는 방법의 사용설명서를 포함한다. 가장 바람직하게는 상기 방법은 본 발명에 기재된 방법이다.
핵산 사슬의 절단을 야기시키는 조건들은 본 발명에서 기재된 것처럼 물리적 조건(예를 들면 진동, 혼합, 와동 등), 방사선적 조건(자외선, 엑스레이 또는 감마레이 조사와 같은 전자기방사선 처리), 화학적 조건(수소이온 농도 조절 및/또는 산화환원 조건) 및/또는 생물학적 조건(효소의 처리 및/또는 뉴클레아제와 같은 핵산 용해성 특성을 지닌 내인성 효소의 활성도)일 수 있다. 핵산 절단을 발생시키는 바람직한 조건들은 방사선적, 화학적 그리고 생물학적 조건이며, 특히 최소한 하나를 첨가하여 처리 하든가 및/또는 내인성 효소로 처리하는 조건이다.
본 발명의 발명가는 세제로 용해시킨 세포가 포함된 시료(특히 혈액)의 막의 유동을 포함하는 분석에서 막의 막힘의 원인을 심도 있게 시험하였다. 당해 기술분야의 숙련된 자와 같이, 본 발명가는 막 유동은 세제에 의하여 전형적으로 매개된 마이셀로 막의 변형에 의하여 조절된다는 가정에서 발명을 착수하였다. 놀랍게도 본 발명가는 시료내의, 특히 생혈시료내의, 아주 작은 양의 DNA가 현저한 물리적 효과 특히 막의 막힘에 영향을 미치는 사실을 인지하게 되었다.
정상적인 체의 혈액은 1000개의 적혈구 세포에 대해 하나의 백혈구를 포함하고 있다. 적혈구는 핵이나 DNA를 함유하고 있지 않은 반면 백혈구는 핵이 있고 DNA를 함유하고 있다. 전형적인 포유동물의 세포는 다른 구성원소들과 함께 70%의 수분, 3%의 인지질, 1,1%의 RNA 및 0.25%의 DNA를 포함한다. 전형적인 포유류의 세포막은 약 50%의 인지질과 50%의 피막과 결합된 단백질을 함유하고 있다. 이것은 세포막은 0.8%의 DNA와 비교하여 약 20%의 건조 중량의 포유류 세포를 구성함을 의미한다. 백혈구 세포만 본다면, 피막:DNA의 중량비는 약 25:1이다. DNA가 아닌 피막을 가진 적혈구를 본다면 모든 혈구세포의 피막:DNA의 중량비는 약 1000:1이다.
최초에 분석은 높은 응력이 적용하여 수동으로 시행되었다. 이러한 분석은 막 막힘 또는 높은 배경 신호에 대해 문제가 없었다. 수동 분석시, 혈액은 손가락으로부터 채취되고 이어서 세제 디옥시콜레이트가 함유된 용액에 희석하여 수초간 격렬한 교반에 의하여 용해시켰다. 용해된 혈액은 다음 단계에서 항체를 코팅시킨 막을 통과시킨 후 분석할 시료를 얻었다. 금-컨쥬게이팅 된 항체의 첨가와 세척용액에 의하여, 금 입자에서 발생되는 적색신호를 측정하였다.
이어서 발명가는 위에서 간략히 서술한 수동으로 작동되는 분석에 대한 자동버젼을 개발하였다. 이 분석 장치에서 혈액은 장치에 포함된 펌프에 의하여 희석 용액과 함께 부드럽게 혼합되었다. 이 장치로 혈액세포를 분석한 경우, 몇몇 시료들에 있어서는 니트로셀루로즈 막에서 비 정상적인 유동 현상을 보여주었다. 어떤 경우에는 유동은 느리고 몇몇의 경우에 있어서 막을 통과하는 액상 유동이 완전히 정지되었다. 희석 용액이 대단히 많은 숫자의 적혈구 세포들을 함유하는(혈구 원심분리 80%) 혈액 시료를 완전히 용해하는데 필요로 하는 세제보다 더 많은 세제가 포함되어 있다는 것을 보여주었다. 감소된 유동속도를 가진 혈액 시료들은 지속적으로 동일한 참조 시료에서 유래한 혈장을 사용한 분석물의 농도는 극히 과대하게 평가되었었다.
인체 게놈 DNA는 대단히 길어서 길이가 5cm까지에 해당되며 이 가닥은 전단력에 취약하다, 수동으로 준비한 시료에서 진동은 DNA를 붕괴시킨다고 추측된 반면에, 장치에서의 혈액 시료는 희석 용액과 함께 매우 부드럽게 혼합되고, DNA 구조가 보존되어 DNA가 막을 막을 수 있었다. 본 발명가는 매우 부드럽게 시료를 혼합하여 수동으로 시료를 준비하였고 막의 막힘을 발견하였다. 유사하게 장치에서 진행하기 이전에 시료를 격렬하게 진동시킨 경우 막의 막힘이 없이 정상적인 유동율을 나타내었고, 정확한 혈장 분석물의 농도를 얻을 수 있었다. 백혈구 세포(DNA를 포함하는)의 비율이 높은 시료는 정상적인 시료이거나 적혈구(DNA가 포함되지 않은) 세포의 비율이 높은 시료 보다 막의 막힘을 보여주었다.
이러한 관측은 백혈구의 핵에 포함된 DNA가 유동 문제의 원인이라는 본 발명가의 가정을 지지하였다. 이것은 또한 화학적 특별히 생물학적 핵산을 분해방법에 의해 입증되었다. 이 실험에서 막의 막힘 원인에 추가적으로 긴사슬을 가진 핵산은 막의 유동 분석에서 매우 높은 배경 신호를 제공하고, 이로 인해 잘못된 결과 또는 단순히 부정확한 결과를 초래함을 제시하였다.
본 발명의 분석 방법에서 세포가 포함된 시료는 적합한 조건하의 처리에 의하여 세포막과 핵막을 파괴하도록 용해되었다. 바람직한 한 실시예에 있어서, 시료는 세포와 피막을 용해하고 핵산 분자를 절단하기 위하여 최소한 하나의 세제와 처리되었다.
여기에서 기술하는 "세제"는 세포 막의 인지질이 작은 공극 크기의 막 (여기에서 설명한 것처럼)을 통과할 수 있는 마이셀 및/또는 소포 같은 작은 구조로 전환되는 것을 촉진시키는 것이 가능한 어떠한 양 친매성 분자일 수 있다. 적합한 세제로서 음이온, 양이온, 양성이온 및 비이온성인 계면활성제, 특히 음이온 계면활성제를 포함할 수 있다. 구체적인 예로 소듐 콜레이트, 소듐 디옥시콜레이트(DOC)를 포함하는 콜레이트 세제; 트리톤, 트윈, 게나폴, 루브롤, 테지트. 브리즈 그리고 루브롤과 같은 세제의 시리즈인 폴리옥시에틸렌, 그리고 소듐 도데실실슬페이드(SDS), 도데실-베타-D-말토시드 그리고 옥틸-베타-D-글루코시드, N-라우로일 사르코신 소듐 염, 라우릴 디메틸 아민-옥시드(LDAO), 세틸트리메틸암모늄브로미드(CTAB) 그리고 비스(2-에틸헥실)슬포수시네이트 소듐염을 포함하는 다른 세제를 포함한다. 비록 소듐염들은 언급하였지만, 명백히 포타슘, 마그네슘 등과 같이 다른 금속염도 동일한 효과를 가져다 준다. 가장 바람직한 세제는 소듐 디옥시콜레이트이다.
세제의 사용이 본 발명에서 세포의 용해방법으로 바람직하게 적용되지만, 본 발명은 저장성 용해 또는 고장성 용해, 카이오트로픽 용해 등을 포함하는 여러 가지 다른 세포 용해 방법에도 동일하게 적합하다. 이러한 방법에 적합한 약품은 본 기술분의 당업자에게 잘 알려져 있으며 탈 이온수(저장성 용해용): 고장성 용해용 소듐, 마그네슘 그리고 포타슘 염(예를 들면 염화 나트륨, 염화 칼륨)등을 포함하는 염과 같은 긴장성 조절제: 및 클로로포름, 페놀, 또는 구아니디움 이소치오시아네이트(GuSCN) 또는 뇨산을 포함하는 카이오트로픽 염과 같은 카이오트로픽 약품을 포함한다.
여기에서 사용되고 있는 "핵산"이란 용어는 리보뉴클레인산(RNA) 및/또는 디옥시뉴클레인산(DNA)의 거대한 분자 사슬을 의미하고, 둘 다 순수한 형태이며 자연상태에서 일반적으로 폴리펩프티드/단백질과 같은 거대분자를 포함하는 다른 분자와 복합형일 수 있다. 특히 포유류 시료의 게놈 DNA는 일반적으로 뉴클레오솜과 결합부위와의 복합체로 존재하며 결합 부위는 크로마틴 또는 유사 단백질과 같은 다른 성분과의 결합형태로 존재할 수 있다. 여기에서의 핵산은 DNA, 특히 게놈 DNA가 바람직하다.
본 발명의 모든 측면에서, 핵산을 절단하는 적합한 조건은 상기에서 기술한 바와 같이 전형적으로 물리적, 방사선적, 화학적 및/또는 생물학적 조건이다. 바람직한 조건은 화학적 및/또는 생물학적으로 핵산 사슬을 절단시키는 조건이다. DNA의 화학적 절단은 잘 알려진 에폭시드, 이민, 활성화 시클로프로판, 헤테로사이클릭 N-옥시드, 퀴닌 등과 같은 DNA 파괴 약품에 의하여 초래되어질 수 있다. 이러한 "화학적 뉴클레라제"는 산화 경로를 통하여 DNA를 절단하는 산화환원활성 배위 착물이 바람직하다. 바람직한 예로 페난트롤린 구리(copper phenanthroline), 산화제, 디아조니움 염들, 금속 복합제를 사용한 광학적 절단 및 철/EDTA 시스템을 포함한다.
핵산 절단의 "생물학적" 방법은 일반적으로 온화한 조건하에서 어떤 적합한 뉴클레아제와 함께 수행될 수 있다. 본 발명에 적합한 뉴클레아제는 핵산의 하부 단위인 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소이다. 다양한 활성, 금속 의존성 및 특이성의 여러 가지 형태의 뉴클레아제는 유전자 조작 실험에서 DNA 조각을 생성시키는데 일반적으로 사용되는 "제한적 효소"를 포함하여 알려져 있다. 그 예로 마그네슘과 칼슘과 같은 이온에 의존하는 뉴클레아제를 포함한다. 마그네슘 의존성 뉴클레아제처럼, 칼슘 의존성 뉴클레아제는 본 발명에서 사용되는 바람직한 그룹이다. 이러한 뉴클레아제 중 어떤 것도 핵산 사슬이 적합한 길이의 조각들로 절단은 일반적으로 시료가 막을 제한을 받지 않고 통과하기에 충족되어서 적합하다.
뉴클레아제의 일반적인 예는 구균 뉴클레아제(micrococcal nuclease, S7 뉴클레아제), Si 뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제(Mung Bean Nuclease), 디엔아제 1(DNase 1), 뉴클레아제 BAL 31 벤조나제TM을 포함한다. 특히 적합한 뉴클레아제는 구균 뉴클레아제(micrococcal nuclease, 구균 피로게네스(micrococcus pyrogenes)에서 유래되어 구균 뉴클레아제라고도 함)가 바람직하며, 이는 11μm 직경 뉴클레오솜 사이 결합부위에서 선택적으로 DNA를 절단시키는 칼슘 의존형 엔도 뉴클레아제 이다. 절단되지 않은 고점도 DNA 용액의 점셩의 감소로 인해 DNA 분해가 일어난다.
아래의 실시예에 있어서, 0.1-0.5 U/ml 구균 뉴클레아제가 1 mM 염화칼슘 용액과 함께 세제에 용해된 혈액시료에 첨가되고 막 유동 통과 분석 전에 30초 동안 배양되었다. 용액의 유동율 및 분석 결과는 높은 백혈구의 숫자의(35 x109/L) 혈액 시료 에서도 정상적이었다. Ca2+의 탈락은 뉴클레아제를 첨가하지 않은 대조군처럼 동일하게 느린 유동과 거짓-높은 분석 측정을 제공하였다.
뉴클레아제와 같은 대부분의 생물학적 물질은 수용액에서는 본질적으로 불안정하다. 따라서 본 방명의 장치 및/또는 키트의 일부로서 뉴클레아제가 장기 보관될 수 있도록 안정화 된다면 유리할 것이다. 본 발명의 한 실시예에서 뉴클레아제들은 건조된 상태로 공급되고, 따라서 효소도 진단 분석장치 또는 키트에 결합되기 전에 건조된다.
뉴클레아제의 바람직한 건조 방법은 표준 동결 건조 방법을 적용하는 것이다. 그러나 예를 들면 분무식 건조방법 또는 진공 건조방법 같은 시약을 건조하기 위한 다른 방법들도 본 기술분야의 당업자에 의하여 쉽게 적용될 수 있다.
한 실시예에서, 뉴클레아제는 단일한 분석 단위로 건조되고, 예를 들면 챔버 또는 용기의 내부 표면의 적어도 일부분과 같은 반응조에서 건조된다. 바람직한 한 실시예에서, 뉴클레아제는 적어도 하나의 건조된(예를 들면 동결 건조된) 입자시약(예를 들면 구슬 또는 구형)으로 제공된다. 구형의 동결 건조된 입자에 대하여서는 프리스 등(Price et al.)에 의하여 잘 알려져 있다(미국 특허 제 3,655,838호). 기재된 구형의 구슬은 면역학적 반응을 위한 물질을 포함하고 있으며, 이는 리오스페레(lyosphere)라고 일반적으로 불린다. 특정 재료로 되어있는 리오스페레는 예를 들면 미국 특허 제3,932,943호에 의해 알려지고, 이렇게 알려진 방법들은 본 발명의 뉴클레아제의 사용에 본 기술분야의 당업자에 의해 쉽게 응용될 수 있다. 리오스페레의 제조에 관하여 Wiseman, William Howard, 1958년 1월, Institute of Paper Cemistry "박사 논문" 및 미국 특허 제 3,655,838호를 참조하라. 이들 각 문헌은 본 명세서 내에 전체로 참조로서 삽입되어 있다.
탈수 방법, 예를 들면 동결 건조 방법이 적용될 경우, 표준 항냉동방지제, 동결건조보호제 및/또는 재수화성 향상제들이 건조된 시약들의 특성을 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 전형적인 작용제는 염류, 당류 특히 트레할로즈(trehalose), 유당, 서당(sucrose), 프롤린(praline), 만니톨, 라피노즈(raffinose) 그리고 소듐 락테이트를 포함한다. 그 중 트레할로즈가 특히 효과적이다.
본 발명의 방법은 시료의 한가지 성분 또는 잠재적 성분을 용해시키고 처리시킨(핵산 사슬을 붕괴) 시료를 분석하는 단계를 부가적으로 포함한다. 분석에 적당한 성분은 작은 분자(예를 들면 아미노산), 비타민, 올리고- 및 폴리-펩티드(항체, 단백질, 단백질 복합체를 포함), 펩티드 및 비펩티드 호르몬 및 많은 다른 성분을 포함하는 광범위한 생물학적 마크(marker)를 포함한다. 분석은 일반적으로 세제-매개된 세포 용해 분석이므로, 수용체와 같이 막과 결합된 성분도 또한 분석된다. 혈장내 단백질, 비타민, 아미노산 및/또는 보조인자에 대한 분석이 본 발명의 방법에 의해 특히 강화되었다. 구체적인 예로 탄소(C)-반응 단백질(CRP), 코발라민, 트란스코발라민(특별히 홀로 트란스코발라민(holo transcobalamin), 호모시스테인, 폴레이트, 폴레이트 수용체 및 그들의 조합물들을 포함한다. CRP와 같은 급성기 지표가 특히 적합하였다.
선택적 그러나 바람직한 시료의 성분을 분석하는 단계는 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 체계 중에서 어떤 것이라도 실시될 수 있다. 그러나 본 발명에서 특히 유리한 점은 막 분석 특히 막 농축분석에 의한 시료 성분의 분석이다. 이러한 형태의 분석에서 항체, 수용체 또는 항체의 조각들, 단사슬 복합체 또는 유도체(예를 들면 단 사슬 항체)와 같은 특이적 결합 리간드가 막에 고정되고, 분석 대상물을 포착하고 농축한다. 이렇게 포착된 분석 대상물은 직접 검출되거나, 또는 훨씬 더 보편적으로 신호형성부분에 결합되는(특이성 또는 비특이성) 결합제(항체와 같은)에 의하여 결합되어질 수 있다. 이러한 신호형성부분은 방사성, 색채, 형광, 화학적- 또는 생화학적-발광을 가질 수 있거나, 또는 검출 가능한 신호를 생성하도록 기질과 반응 또는 가공 가능할 수 있다. 분석은 일반적으로 검출가능한 신호를 검출하는 단계 및 선택적으로 이것을 미리 지정한 수치 또는 원래 시료에서 원하는 성분들의 농도를 측정하기(정성적으로, 반 정량적으로, 정량 분석 방법) 위한 표준과 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 체계는 세포를 포함하는 체시료(선호적으로 생혈 시료)를 세제(예를 들면 DOC) 그리고 생물학적 또는 화학적 "뉴클레아제"(구균 뉴클레아제와 같이)와 어떤 필요한 금속들 또는 보조인자(예를 들면 Mg2+ 또는 Ca2+)의 존재하에서 접촉하는 단계를 포함한다. 결과 시료는 고정된 시료의 성분(예를 들면 CRP와 같은)에 대해서 특이적으로 결합하는 리간드(항체와 같은)를 가지고 공극의 크기가 10μm미만, 특히 2μm 미만(예를 들어, 약 0.45μm)인 막과 접촉한다. 일단 시료가 막을 통과 하면, 막과 지지물은 시료 성분이 신호생성부분(예를 들면 금 복합체)에 결합하도록 다시 결합제(예를 들면 항체와 같이)와 처리된다. 신호생성부분은 세포를 함유하는 시료에서 성분의 농도를 수치로 또는 표시로(예를 들면 농도가 낮은지, 정상인지, 조금 상승되었는지 또는 많이 상승되었는지 등의 조합) 검출(예를 들면 색도 분포도)된다. 이러한 분석은 총 세포수 또는 특정 세포형태의 세포수를 측정하는 단계 및 선택적으로 측정된 수치를 상기 세포수에 의해 또는 대해 보정하는 단계를 추가적으로 포함한다. 예를 들면 적혈구 수치(혈구 원심분리기) 및 필요하다면 보정을 표준 방법을 이용한 헤모글로빈의 색도 분포도를 이용하여 혈액 시료에 응용할 수 있다.
본 발명의 어떤 방법에 있어서, 핵산 절단은 시료가 분리 막과 접촉하기 이전에 수행되는 것이 바람직하나 시료가 분리 막에 접촉한 후에도 수행될 수 있다.
후자의 경우, 시료를 막에 적용한 후 전형적으로 적합한 화학적 또는 생물학적 작용제(여기에서 논의 하였던)를 첨가함으로써 핵산이 막에서 절단된다. 이와 달리, 절단 작용제는 막에(on), 내에(in), 주위에(around) 및/또는 근처에(near) 첨가될 수 있다. 작용제는 건조된 코팅 형태 이거나 입자형태일 수 있다.
명백한 것은, 시료에 포함된 하나 이상의 성분을 하나 이상의 막 및/또는 하나 이상의 고정된 특정 결합제에 의하여 분석될 수 있다. 단, 다른 성분들의 신호는 특수 분리(서로 다른 막 또는 멤브레인 지역에 존재하는)에 의하여 또는 차이점과 분리가능한 신호들(예를 들면 서로 다른 여기 및/또는 방출 파장을 가지는 두개의 플루오로포레제(fluorophores))에 의하여 검출될 수 있다.
시료에서 최소한 한 가지 성분을 분석한다면, 생성된 정성 또는 반-정량 수치는 선택적으로 특정 생물학적 상태 또는 질병과 관련되어질 수 있거나, 또는 질병 또는 생물학적 상태의 진단에 있어서 가중치 또는 기여 인자로써 사용할 수 있다. 예를 들면, 높은 수치의 CRP는 급성 염증, 염증성 류마티스 및/또는 이러한 상태의 치료의 필요성 또는 효과와 관련되어질 수 있다.
본 발명은 세제 용해된 세포를 함유하는 시료가 공극 크기가 10 μm 또는 그 이하(바람직하기로는 2 μm 또는 그 이하)인 막을 통과하는 단계를 포함하는 분석 방법에 있어서 막의 막힘을 감소하기 위하여 핵산 절단 조건을 적용하는 것을 제공한다. 일반적으로, 두 가지의 서로 관련된 개선이 용이하고 한가지 또는 양자가 어떤 특정 분석에서도 중요한 역할을 할 수 있다. 필수 적으로, 핵산 분열은 막의 막힘을 감소시키고 이러한 향상은 두 가지의 중요한 결과를 나타낸다; 막을 통과하는 유동액의 흐름이 상승되고, 및/또는 시료로부터 성분의 비특이적 포착이 감소된다. 이들 각각은 또한 추가적 장점을 가지는데, 향상된 흐름은 신속하고/하거나 신뢰할 수 있는 분석을 제공하고 감소된 비 특이성 결합은 낮은 배경 신호를 허용하고, 보다 높은 민감성 및 분석에 있어서 더 큰 차이점을 제공하는 것이다. 명백하게, 본 발명에서 사용되는 "사용(적용)"은 여기에서 기재한 어떤 방법에서도 적용되고 여기에 기재한 어떤 화학적 또는 생물학적 시약들 또는 다른 기술들을 핵산 절단 조건을 얻기 위하여 사용할 수 있다. 뉴클레아제-매개 절단은 바람직하다.
여기에서 언급되는 "막"은 10 μm 이하, 바람직하기로는 5 μm 이하(예를 들어 1 μm 이하), 보다 바람직하기로는 0.5 μm 이하의 공극 크기를 가진 다공성의 막이다. 약 0.45 μm의 공극 크기의 막이 특히 바람직하다. 비록 충분한 유동과 적합한 성분들이 막을 통과하는데 대한 요구에 의하여 막의 최소한 크기가 한정되지만, 최소한 공극 크기는 전형적으로 적어도 50 μm, 바람직하게는 적어도 100 μm, 더욱 바람직하게는 적어도 200 μm이다. 막의 재료는 적합한 시료가 통과하기에 안정한 물질이면 어떠한 물질도 가능하고, 일반적으로 수용성 기반이나 적합하도록 첨가된 용매를 포함할 수 있다. 니트로셀루즈 막은 특히 바람직하며, 유리, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 플루오로폴리머(예를 들면 PTFE 또는 PTFE 블랜드 또는 코폴리머), 폴리아미드 및 블랜드 그리고 그의 코폴리머이다. 니트로 셀루로즈가 가장 바람직하다.
시료는 본 발명의 모든 측면에서, 세포를 포함하는 시료 또는 이로부터 유래된 시료를 의미한다. 세포를 포함하는 시료는 어떤 형태의 조직이며 어떤 형태의 세포를 포함할 수 있다. 그러나 가장 일반적인 것으로 액상 시료이고, 혈액과 정액은 바람직한 세포 함유 액상 시료이다. 저장특성을 향상 및/또는 응고를 감소시키기 위하여 첨가제를 첨가한 또는 첨가하지 않은 전혈은 바람직한 세포 함유 시료이며, 여기에 예로 사용되고 있다. 명백히 이런 혈액시료들은 분석을 이행하기 위하여 필요에 따라 처리되어진다 (예를 들면 분석용 자유결합 성분 또는 추출 competing 분석물), 그러나 가능하다면, 요구되는 시간과 취급을 최소화 하기 위하여 모든 단계가 장치 내에서 실시되어야 한다.
본 발명의 장치는 최소한 하나의 세포 함유 체시료(또는 선택적으로 그러나 덜 바람직하기로는 세제 용해된 세포 함유 시료)를 받아들일 수 있는 챔버를 포함하며 여기에 기술한 것처럼 최소한 하나의 막을 포함한다. 상기 장치에는 세포를 용해하기 위하여 선택적으로 세제와 같은 최소한 하나의 용해제가 미리 첨가 될 수 있고, 이러한 용해제가 첨가될 수 있는 챔버를 포함할 수 있다. 세포 용해(cell lysis)는 막 통과하기 전에 실시될 수 있으며 상기 장치는 핵산 절단이 선택적으로 또는 바람직하게는 세포 용해 동안에 또는 즉시 일어나도록 핵산 절단의 조건을 제공한다.
상기 장치는 바람직하기로는 상기에서 기재한 것처럼 핵산 절단을 야기하도록 최소한 하나의 생물학적 또는 화학적 작용제를 포함할 수 있고, 또는 이러한 작용제가 첨가되는 것을 받아들이는 챔버를 포함할 수 있다. 상기 장치는 또한 바람직하기로는 시료의 적어도 하나의 성분을 농축하기 위하여 특정 결합제, 농축된 성분에 부착하도록 제2의 (특이성 또는 비특이성) 결합제, 및 원하는 성분의 존재, 비존재 또는 농도에 따라 신호를 발생하도록 적어도 하나의 신호생성부분을 포함할 수 있다. 이러한 모든 것이 여기에 기재되어 있고 생물학적 분석에서 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 상기 장치에 포함된 상기 막은 바람직하게는 시료의 적어도 하나의 성분 또는 가능한 성분에 대해 적어도 하나의 특이성 결합 리간드가 고정되도록 돕는다. 적합한 결합제들은 여기에 설명된다. 이와 달리, 특이성 결합 리간드는 구슬 또는 불용성 입자와 같은 지지체에 고정되어 막의 작용에 의하여 유지될 수 있다.
한 바람직한 장치는 혈액 시료를 수용하는 챔버: 세제(예를 들면 DOC), 뉴클레아제(예를 들면 구균 뉴클레아제(micrococcal nuclease)) 그리고 어떤 금속 또는 보조인자(예를 들면 Ca2+)들을 포함하는 희석제를 수요하는 챔버; 10 μm이하, 바람직하기로는 2 μm 이하(예를 들면 약 0.45 μm)의 공극 크기를 가지며, 그 위에 최소한 하나의 분석물질(예를 들면 CRP, holoTC, SAH)을 위한 특이적 결합 리간드 (예를 들면 항체 또는 파편, 이것으로부터 조성 되거나 유리된 것)가 고정된 막; 및 최소한 하나의 부가적인 결합제와 선택적으로 신호생성부분을 포함하는 용액을 수용하는 챔버를 포함한다. 상기 장치는 부가적으로 신호생성부분으로부터 생성된 신호를 처리하고 원하는 성분의 존재, 비존재, 또는 농도에 상응하는 (직접 또는 간접적으로)구역, 큐베트 또는 창을 포함할 수 있다.
관련된 보다 바람직한 장치에 있어서, 상기 장치는 혈액 시료를 수용할 수 있는 챔버, 세제를 포함하거나 수용하기에 적합한 챔버, 및 알려진 방법에 의하여 또는 여기에서 설명한 방법으로 건조된 뉴클레아제를 포함하는 챔버를 포함한다. 이 챔버들은 세 개의 분리되어 있을 수도 있고, 바람직하게는 하나의 또는 두 개의 챔버로 되어있을 수도 있으며, 예를 들면 세제를 포함하는 챔버와 건조된 뉴클레아제를 포함하는 제 2의 챔버로 될 수 있다. 상기 장치는 위에서 설명한 것처럼 다른 특징을 포함할 수 있다.
다수의 포멧은 튜브, 로토, 카트리지, 바이알, 슬라이드, 막대기 등을 포함하는 본 발명에서 장치에 적합하다. 다수의 이러한 포멧은 잘 알려져 있으나, 포멧의 특성은 장치의 필수적인 특성이 제공된다면 중요한 요인은 아니다. 로토와 카트리지 포멧은 용액이 장치를 통과하는 것을 증진시키는 압력을 제공하기 때문에 매우 바람직하다. 본 발명의 어떤 장치도 장치의 작동시 생성되는 신호를 처리하기 위한 구역, 큐베트 또는 창을 포함 할 수 있다.
본 발명의 키트는 주로 최소한 하나의 본 발명의 장치를 포함하며, 최소한, 키트는 막 및 핵산 절단 수단(예를 들면 여기에서 설명한 것들을 포함하는 화학적 또는 생물학적 작용제와 같은)을 포함한다. 전형적으로, 여기에 설명된 어떤 방법에서 키트를 적용하기 위하여 작용제 및/또는 사용 설명서처럼, 세포 용해 세제와 피막지방이 마이셀/소포로 전환되는 것이 제공될 것이다.
본 발명에서 키트와 장치는 자동분석 장치내 또는 자동분석 장치와 함께 사용되기에 적합하다. 가장 적합하기로는 "POC 진단" 자동분석 장치일 것이다.
한 바람직한 키트는 혈액 시료를 확보하기 위한 선택적 수단: 상기 혈액 시료를 수용하기 위한 용기 및 세제(예를 들면 DOC), 뉴클레아제(예를 들면 구균 뉴클레아제), 어떤 금속 또는 보조인자(예를 들면 Ca2+) 및 선택적 완충용액을 포함하는 희석액; 2 μm 이하(예를 들면 약 0.45 μm)의 공극을 가지고 막과 그 위에 최소한 하나의 분석대상 물질(예를 들면 CRP, holoTC, SAH)에 대한 특이적 결합하는 리간드(예를 들면 항체 또는 조각, 그것으로부터 제조되거나 유리된 것)가 고정된 막; 및 최소한 하나의 부가적인 결합제와 선택적으로 표시생성일부분을 포함하는 용액을 수용할 수 있는 용기 또는 챔버를 포함한다. 상기 키트는 선택적으로 부가적으로 사용설명서, 분석 결과의 평가 및/또는 상기 결과의 생물학적 조건에 대한 관계를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 키트는 혈액 시료를 확보하기 위한 선택적 수단: 상기 혈액 시료를 수용하기 위한 용기 및 세제(예를 들면 DOC)를 포함하는 희석액을 포함한다. 키트에서 용기, 또는 제 2의 용기는 또한 건조 형태의 뉴클레아제 (예를 들면 구균 뉴클레아제), 및 필요한 어떤 금속 또는 보조인자(예를 들면 Ca2+)를 포함할 수 있다. 용기는 또한 2 μm 이하(예를 들면 약 0.45 μm)의 공극을 가지고 막과 그 위에 최소한 하나의 분석대상 물질(예를 들면 CRP, holoTC, SAH)에 대한 특이적 결합하는 리간드(예를 들면 항체 또는 조각, 그것으로부터 제조되거나 유리된 것)가 고정된 막; 및 최소한 하나의 부가적인 결합제와 선택적으로 표시생성일부분을 포함하는 용액을 수용할 수 있는 용기 또는 챔버를 포함할 수 있다. 상기 키트는 선택적으로 부가적으로 사용설명서, 분석 결과의 평가 및/또는 상기 결과의 생물학적 조건에 대한 관계를 포함하고, 또한 선택적으로 건조 또는 용액의 형태의 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 설명되고 이에 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1
건강한 사람으로부터 제공받은 전혈을 밀도구배 매체, 폴리몰프프레프TM (PolymorphprepTM, 액시스-실드 피오시 에이에스(Axis-Shield PoC AS), 오슬로, 노르웨이),를 이용하여 제조업체에서 서술한 방법으로 원심 분리하였다. 총 백혈구 세포 및 적형구 세포들은 두 개의 구획으로 나누어 수집하였다. 백혈구 세포의 수를 계산하였다. 백혈구 세포들은 백혈구 세포의 수가 7 x 109 /L에서 30 x 109 /L까지 증가되도록 전혈에 첨가되었다. 12.5 μl로의 백혈구 보강시킨 혈액은 1mM 염화칼슘을 함유한 1ml의 희석용액(소듐 디옥시콜레이트 완충용액)에 첨가 되었다. 상기 용액은 두 개의 500 μl로 나누어 분주되고, 그 들 중 하나에 2.5 μl(0.25U) 미크로코크스 뉴클레아제가 연속하여 첨가되었다. 50 μl 대조군 용액과 뉴클레아제를 함유한 용액의 분주는 0.45 μm의 공극크기의 니트로셀루로즈 막을 포함하는 장치(니코카드(NycoCard) 테스트 장치)를 통한 막 유동에 적용되었다. 분주는 뉴클레아제를 첨가한 후 0초, 60초, 120초로 적용되었다. 혈액세포 용액이 유동 방식 막에 적셔 졌을 때, 50 μl의 금-컨쥬게이팅된 항체가 첨가되고 이어서 50 μl의 세척 용액이 첨가 되었다. 막 결합된 항체와 상기 컨쥬게이팅된 항체들은 서로 다른 단백질들에 대응함을 보여주고 이는 샌드위치를 형성하지 않고, 실험 결과는 금-컨쥬게이팅된 항체가 막에 대해 비특이성 결합을 하는 것을 보여주고 있다. 막에 보류되는 적색을 가진 항체는 광학적 리를렉토메타(reflectometer, 니코카드 리더(NycoCard Reader))를 사용하여 측정하였다. 상기 기구는 색의 밀도를 막 상에서 포획된 금-표시된 항체의 양에 비례하는 K/S단위로 표현되었다. 백색 막은 K/S치수가 약 0.05이고 반면에 대단히 밀도 있고 짙은 적색은 K/S치수가 약 5를 나타낸다.
X초 경과 후의 K/S
시간(초) 0 60 120
대조군 0.71 0.89 1.24
뉴클레아제 0.151 0.123 0.136
상기 표에서 대조군은 배양 시간이 경과함에 따라 높은 비특이성 배경이 증가함을 나타내고 한편 심지어 30초 보다 짧은 배양시간의 첫 분주에서도 배경이 정상적인 낮은 수치로 내려감(혈장을 기초로 분석한 치수만큼 낮은)을 보여준다.
실시예 2
본 실험에서 실시예 1의 밀도 구배 매체 원심분리의 적용없이 전혈의 백혈구를 증가시켰다. 건강한 제공자로부터 제공 받은 전혈은 15분 동안 2500 x g에서 원심 분리하였다. 혈장은 피펫으로 제거하고 이어서 연막과 적혈구 분획의 일부분을 피펫으로 제거하였다. 연막 분획(fraction)이 포함된 적혈구는 백혈구로 충당되었다. 끝으로 순수한 적혈구는 튜브의 밑 부분에서 채취되었다. 백혈구 강화된 분획(fraction)과 적혈구 분획은 혈장에 첨가되어 생혈처럼 동일한 혈구 분리용 원심분리기에 적용되고 백혈구는 세 개의 분획 모두에서 산출되었다.
헤모글로빈은 증류수로 200배 희석 시키고 575 μm의 파장에서 시마쯔 스펙트로포토메터기를 사용하여 분광 광도를 측정하였다.
O.D.575 nm 백혈구/L
전혈 0.672 7.5x 109
백혈구 농축 0.657 34x 109
적혈구 0.690 0
상기 세 분획(fraction)은 지금부터 C(전혈), W(백혈구 농축혈) 그리고 R(적혈구 분획)로 명한다.
5 μl의 C, W 및 R은 각각 400 μl의 희석용액과 부드럽게 혼합하고, 50 μl씩 각각의 용액은 니코카드 테스트 장치에 적용되었고, 50 μl의 금-컨쥬게이팅 된 항체와 50 μl의 세척 용액에 적용되었다. 실시예 1에서 전술한 것처럼 컨쥬게이팅된 항체와 막에 결합된 항체들은 서로 다른 단백질에 대응되었다. 이는 본 실험은 단지 비특이성 배경임을 보여주고 있다. C, W 및 R 용해된 희석액은 이때 10초간 격렬히 교반시킨 후 각각 50μl의 시료를 상기 기재된 바와 같이 막 시험 장치에서 테스트하였다. 상기 컨쥬게이팅된 배경은 니코카드 리더를 사용한 두 가지 시리즈에서 측정되었다.
K/S K/S 교반시킨 시료
C 0.136 0.097
W 0.422 0.112
R 0.088 0.094
상기 표는 비특이성 배경이 순수한 적혈구 분획(R)과 비교할 때 W의 경우에 있어서 상당히 상승되었고 C는 조금 상승되었다. 교반을 시킨 경우 C와 W의 배경은 R과 동일 수준으로 감소되었다.
5 μl의 C, W 및 R은 다음 실험에서 1 mM의 염화칼슘과 0.4 U의 구균 뉴클레아제가 포함된 400μl의 희석 용액과 부드럽게 혼합되었고, 상기의 방법으로 시험 장치에서 테스트하였다.
K/S
C 0.12
W 0.108
R 0.094
시료의 뉴클레아제 분해는 배경을 "교번 수준"으로 감소되었음을 상기 표에서 보여준다. 동일하게 유리한 낮은 배경이 전단력에 의하여 또는 DNA의 효소적 분해에 의하여 DNA가 파손됨으로써 얻어졌다. 뉴클레아제로 분해된 시료의 교반은 배경을 그 이상 더 감소시키지 않았다(미도시).
실시예 1과 2는 어떻게 세제 용해된 전혈의 뉴클레아제 분해가 막 유동 테스트 장치에서 비특이성 배경을 혈장 기반된 분석에서 얻을 수 있는 배경과 동일하게 낮은 수준으로 감소시키는지를 보여주고 있다. 다음의 두 실시예는 실시예 1과 2에서 설명한 수동으로 작업한 테스트 장치에서와 같이 막 유동 시스템과 동일한 기초를 둔 자동분석기에서 희석되고 용해된 시료의 CRP(탄소 반응 단백질)를 분석할 때 뉴클레아제 처리 효과를 보여주고 있다.
이 분석기는 막대기로부터 채취한 소량의 전혈(1.5 μl)에 희석 용액(200 μl)을 대단히 온화한 방법으로 혼합하였음을 명심하여야 한다. 다르게 언급하자면, 용해된 백혈구의 핵으로부터의 DNA를 붕괴하고자 하는 전단력은 없거나 거의 없었다.
실시예 3
실시예 2에서 설명한 혈액 시료 C, W 및 R은 자동 분석기를 이용하여 분석되었다. 전혈은 일반 희석액으로 용해하든가 또는 5 mM의 염화칼슘과 0.2 U의 구균 뉴클레아제를 포함한 희석액에 용해하였다.
대조군 희석액 희석액 + 뉴클레아제
CRP, mg/L HCT, % CRP, mg/L HCT, %
혈장 0.93 1.37
C 2.49 42.7 1.59 43.6
W 8.8 45.0 2.70 45.0
R 1.72 43.6 1.93 46.4
혈액 시료에서 CRP 농도는 약 1 mg/L(혈장을 기준하여 측정)임을 상기 표에서 보여주고 있다. 이것은 건강한 체의 전형적인 수치이다. 생혈을 사용시, 헤모글로빈의 적색으로 인하여 배경이 조금 상승된 것을 알 수 있다. 이것은 시료 R(백혈구가 없는 적혈구 경우)의 CRP-수치는 기본 라인 이거나 CRP의 표적 수치임을 의미한다. 대조군 희석액으로부터 확보된 결과를 보면, CRP 결과는 정상적인 전혈에 대해서 45% 증가되었고 백혈구를 보충시킨 시료에 대해서는 512%가 증가된 것을 나타내고 있다. 뉴클레아제를 함유한 희석액을 사용한 경우, 전혈의 경우 CRP의 증가를 나타내지 않았고 백혈구를 보충시킨 시료에서는 40%의 증가를 관찰할 수 있었다. 결론적으로 일반 희석액이 시료 W(높은 백혈구 수)의 희석액으로 사용 되었을 때, CRP는 상당히 과대 평가되었다. 뉴클레아제를 사용하였을 때도 이 시료는 조금 과대 평가되었다. 이 실험에서 고 농도의 뉴클레아제가 사용되었다는 것을 나타내고 있다. HCT(혈구 원심 분리기)를 이용한 측정에서 3 가지 시료에 대해서 유사하게 나타났다.
실시예 4
CRP의 저혈장농도, 중간혈장농도, 고혈장농도의 세가지 혈액 시료를 기구를 이용하여 분석하였다. 모든 세 시료 모두 높은 백혈구 수치를 나타냈다. 정상 세포수는 약 7 x 109이다.
시료 CRP, mg/L 백혈구 수
1 1.3 29.6 x 10
2 17.2 23.5 x 10
3 136.8 26.6 x 10
시료들은 일반 희석액 또는 5 mM의 염화칼슘과 0.5 U의 미크로코크스 뉴클레아제를 함유한 희석액을 사용하여 분석되었다. 실시예 3의 결과를 기초로 하여 이 실험에서는 뉴클레아제의 농도가 0.2에서(실시예 3) 0.5U로 상승하였다. 변이계수(CV)도 실시예 4 내지 6을 기준으로 병행하여 측정되었다. 실시예 1에서는 극히 낮은 CPR 수치가 극히 낮아 CV를 산출하지 못하였다.
대조군 희석액 희석액 + 뉴클레아제
시료 CRP CV CRP CV
1
 혈장 1.3 1.5
혈액 23.7 2.6
2
 혈장 17.2 19.5
혈액 31.8 10.2 16.3 1.7
3
 혈장 136.8 137.3
혈액 160 10.1 123.7 3.0
상기 표에서 보는 바와 같이 3가지 혈액 시료의 CRP-농도가 일반 희석액이 사용되었을 때 과대 평가되었다. CRP의 농도가 낮을 수록, 혈액을 사용하였을 때의 측정과 혈장을 사용하였을 때의 측정 사이의 차이는 더 나빴다. 혈장을 사용한 측정이 옳은 수치로 하였다. 낮은 CRP 농도를 포함하는 시료의 경우 특히 그 차이는 심각하였다. 시료 1은 1800%, 시료 2는 185%, 시료 3은 117%로 과대 평가되었다. 3가지 시료 모두 동일하게 고정된 비특이성 배경 분포를 가정한다면 이러한 현상은 예상될 수 있는 바이다. 뉴클레아제를 함유한 희석액의 시용 시, 상황은 달라졌다. 전혈의 측정은 3가지 시료에 대해서 모두 혈장의 수치와 유사하였다. 더욱이 CV 측정에서 뉴클레아제가 희석액에 포함되었을 때 수치가 상당히 낮았다.
결론적으로 용해된 혈액시료의 뉴클레아제 매개된 DNA-분해는 CRP-자동분석기에서 현저히 질이 향상되었음을 보여주었다.
실시예 5
건강한 제공자로부터 제공된 전혈은 실시예 2에 기술한 것과 같이 처리 되었다.
전혈(C), 백혈구 보강된 혈(W), 적혈구(R)는 혈구 원심 분리에서 동일한 결과를 보여주었다. 백혈구의 수는 각각 5.9 x 109, 16.9 x 109, 그리고 0 x 109 이였다. 25 μl의 "혈" 시료가 2 mM의 염화마그네슘을 함유한 400 μl의 완충세제 용액에 1U의 뉴클레아제와 함께 또는 뉴클레아제 없이 첨가되었다. 혈액은 용해용액과 함께 전단력을 최소화 하기 위하여 대단히 온화하게 혼합되었다. 이 용액의 50 μl는 막 유동 장치에(막 표면적 9.4 mm2)에 첨가하고 유동시간을 측정하였다. 막은 항-CRP 항체로 코팅되었다. 이어서 50 μl의 금-컨쥬게이팅 된 항-CRP 항체가 첨가되고 이어서 50 μl의 세척 용액이 첨가되었다.
막의 색채는 리를렉트메타(니코 카드 리더)를 사용하여 최종적으로 측정되었다. 이 실험에서 막의 적색 색채가 실제 CRP-신호와 비특이성 배경 신호 보다 많거나 또는 더 작은 양으로 표현된다.
시료 유동 시간(초) 색채(K/S)
C 38 0.81
C + 뉴클레아제 22 0.313
W 188 Nd**
W + 뉴클레아제 23 0.310
R 25 0.27
R + 뉴클레아제 23 0.306
혈 장* 24 0.322
*15 μl의 혈장이 혈액 시료의 혈장과 동일한 양을 제공하기 위하여 사용하였다.
** 컨쥬게이팅 된 시료는 클로깅(clogging)으로 인해 막을 통과하지 못하였다. 색채는 짙은 적색이었다.
전혈(C)은 뉴클레아제 처리된 시료와 비교하여 유동시간이 현저하게 증가되었음을 상기 표에서 보여주고 있다. 시료 W에서는 유동시간이 8배로 급격하게 증가 되었고 용액의 유동은 금-컨쥬게이팅된 시료의 적용 시 완전히 정지되었다. 모든 시료들은 뉴클레아제가 첨가 되었을 때 약 23초의 동일하게 양호한 유동 시간을 보여주었다. 이것은 혈장의 유동과 뉴클레아제를 적용하지 않은 적혈구 분획의 유동과 동일하였다. 신호와 관련하여, 뉴클레아제를 첨가하지 않은 전혈은 CRP의 상당한 과대 평가를 보여주었으며, 시료 W의 경우, DNA 매개된 막의 클러킹(clogging)으로 인해 완전히 정지되었다.
뉴클레아제를 처리한 경우, 세 가지 시료 모두 혈장의 경우 얻은 신호(0.322)와 근접한 약 0.31의 유사한 CRP-신호를 보여주었고, 이 수치는 표적 수치라고 간주될 것이다. 이러한 낮은 신호는 CRP 수치 0을 함유한 시료에서 얻은 배경 수치를 나타내는, 무관의 항체(0.093)로 코팅된 막에서 얻은 색채보다는 훨씬 위였다. 그러므로 수치는 낮으나, 0.31의 명백한 신호이며, 건강한 혈액 제공자의 낮은 CRP 수치와 동일하다.
실시예 6
낮은 농도의 혈액 시료를 분석할 경우, 낮은 농도에 대해 부분적으로 보완하고 읽을 수 있는 신호를 얻기 위하여 가능한 충분한 혈액량을 처리하기에 유리하다. 본 실험은 세제 매개된 혈액 용해물에 대해 0.45 μm의 니트로셀루로즈 막(유동면적 9.4 mm2)을 통과할 수 있는 최대의 혈액량을 측정하도록 설계 되었다.
본 실험에서 사용된 혈액의 양이 많기 때문에, 세제의 결핍이 저조한 유동의 원인이 아님을 확신하기 위하여 고농도의 세제가 사용되었다.
건강한 제공자로부터 제공받은 혈액(백혈구 숫자가 6.5 x109/L)은 실내 온도에서 30초 동안 1 U의 뉴클레아제와 함께 또는 없이 완충 세제액으로 희석되었다(배양된 량 200 μl). 1.5-25 μl의 전혈을 포함하는 100 μl의 상기 용액은 유동 장치에 첨가되었고 50 μl의 금-컨쥬게이팅 된 항-CRP 항체와 50 μl의 세척액을 이어서 첨가하였다. 총 분석 시간(시료의 적용시점에서 세척액 적용까지)이 측정되었다.
처리된 혈액량(μl) 총 분석시간(초)
25 Nd*
25 + 뉴클레아제 189
12.5 672
12.5 + 뉴클레아제 142
6.25 291
6.25 + 뉴클레아제 128
3.1 264
3.1 + 뉴클레아제 128
1.5 150
1.5 + 뉴클레아제 120
*시료 적용시 막 막힘
상기 표에서 DNA의 뉴클레아제의 분해는 모든 적하된 혈액량에서 유동이 향상된 결과를 보여준다. 분석시간을 보면, 뉴클레아제 분해와 함께 12.5 μl의 혈액량의 분석시간은 뉴클레아제의 분해없는 1.5 μl의 혈액량의 분석시간과 동일하였고 이는 8배에 해당한다.
다른 각도에서 보면, 4분 이내가 되도록 신속한 테스트의 분석시간이 요구된다면, 상기 시스템은 뉴클레아제 분해와 함께 25 μl의 혈액량과 뉴클레아제 분해 없는 1.5 μl의 혈액량의 시료가 허용되어 지며, 16.7배에 해당한다. 넓게 말하면, 뉴클레아제 매개된 DNA의 분해는 면역 농축 시험 장치에 있어서 최소한 10배의 더 많은 혈액을 처리하는 것이다.
실시예 7 - 뉴클레아제의 동결건조 과정:
벤조나제TM은 12% 트레하로즈(Trehalose), 0.1% 비에스에이(BSA), ImM MgC12, 25mM 트리스-pH 7.4를 함유한 완충용액에서 40 U/ml의 농도에서 제조하였다. 벤조나제TM 용액의 분주는 이미 알려진 방법으로 동결되고 섭씨 -30도에서 동결건조 되었다.
실시예 8 - 동결 건조된 뉴클레아제의 사용:
동결 건조된 벤조나제TM 구슬(실시예 7에서 제조한 것처럼)가 아피니온TM(AfinionTM) 분석기 CRP 카트리지에 첨가하였고 백혈구 세포가 증가된 혈액시료를 아피니온TM(AfinionTM) 분석기를 사용하여 처리하였다. 벤조나제TM의 상대적 활성도가 정상적인 CRP수치를 적용하여 산출되었고, 퍼센트로 나타내었다.
아피니온TM(AfinionTM) CRP 분석에 의한 뉴클레아제의 상대적 활성도:
A. 상승된 백혈구 세포를 포함하는 혈액시료를 분석하기 전에 벤조나제TM를 40 U/ml의 아피니온TM(AfinionTM) CRP 용해 완충용액에 다양한 시간 동안 18시간까지 섭씨 22도에서 재현탁시켰다.
시 간 5분 60분 120분 18시간
상대적 활성도 100% 104% 94% 61%
벤조나제TM은 수용성 현탁액에서 1일 이내에서는 안정성이 유지됨을 보여주었다. 120분이 지나면서 활성도의 감소를 확인할 수 있었다.
B. 상승된 백혈구 세포를 포함하는 혈액시료를 분석하기 전에, 상기에서 기재한 바와 같이 실시예 7에서 제조되고 아피니온TM(AfinionTM) CRP 카트리지에 첨가된 동결 건조된 벤조나제TM 구슬은 섭씨4, 22, 37도에서 다양한 시간동안 2달까지 배양되었다.
온 도 일 0 1 개월 2 개월
섭씨4도 100 99 96
섭씨 22도 100 100 105
섭씨 37도 100 98 99
벤조나제TM은 몇 달 동안 동결되어 동결 건조된 구슬로써 안정함을 보여준다.

Claims (19)

  1. 전혈 시료(whole blood sample)를 세포 용해를 일으키게 하는 조건하에서 처리하는 단계; 및
    이에 따라 생성된 용해 시료를 핵산 분자의 절단을 일으키는 조건으로 수행하는 단계
    를 포함하는 전혈 시료에 포함된 탄소(C)-반응 단백질(CRP), 코발라민, 트란스코발라민, 홀로트란스코발라민, 호모시스테인, 폴레이트 및 그들의 조합의 분석을 위한, 공극의 크기가 10 μm 미만이고 분석대상 물질에 특이적인 리간드가 그 위에 고정된 막 분석(membrane assay) 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 핵산 분자의 절단은 물리적 조건, 방사선적(radiative) 조건, 화학적 조건 또는 생물학적 조건 중 적어도 하나에 의하여 제공되는 것인 분석 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 생물학적 조건은 구균(micrococcal) 뉴클레아제, S1 뉴클레아제, 녹두(Mung Bean) 뉴클레아제, DNase I, 뉴클레아제 BAL 31 및 벤조나제TM (BenzonaseTM) 중에서 선택되는 생물학적 시약에 의하여 제공되는 것인 분석 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 세포 용해는 세제(detergent) 용해, 저장성(hypotonic) 용해, 고장성(hypertonic) 용해 또는 카트로픽(chatrophic) 용해인 것인 분석 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 용해는 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양성이온성(zwitterionic) 계면활성제 및 비이온성 계면활성제 중에서 선택되는 세제에 의하여 제공되는 것인 분석 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 전혈 시료(whole blood sample)를 수용하기 위한 챔버(chamber) 및 공극 크기가 10 μm 미만이고, 그 위에 분석대상 물질에 특이적인 리간드가 고정된 1개 이상의 막을 포함하고, 핵산 절단 조건을 일으키는 화학적 또는 생물학적 시약 중 적어도 하나를 함유하는 탄소(C)-반응 단백질(CRP), 코발라민, 트란스코발라민, 홀로트란스코발라민, 호모시스테인, 폴레이트 및 그들의 조합의 분석을 위한 분석 장치.
  14. 제13항에 있어서, 상기 장치는 뉴클레아제를 함유하는 것인 분석 장치.
  15. 삭제
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 장치는 세제를 함유하는 것인 분석 장치.
  17. 공극 크기가 10 μm 미만이고, 분석대상 물질에 특이적인 리간드가 그 위에 고정된 막과, 핵산 절단을 위한 한 가지 이상의 화학적 또는 생물학적 수단 중 적어도 하나를 포함하는 전혈의 탄소(C)-반응 단백질(CRP), 코발라민, 트란스코발라민, 홀로트란스코발라민, 호모시스테인, 폴레이트 및 그들의 조합의 분석을 위한 키트.
  18. 삭제
  19. 제17항에 있어서, 제13항 또는 제14항에 기재된 장치를 포함하는 키트.
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