CN108753939B

CN108753939B - 一种检测全基因组的单链dna损伤的方法

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Publication number: CN108753939B
Application number: CN201810561048.8A
Authority: CN
Inventors: 菲利普·卡帕诺夫; 曹慧芬; 英格丽·劳伦娜·萨拉·加西亚
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2038-06-01
Also published as: CN108753939A

Abstract

本发明公开了一种检测全基因组范围的单链DNA损伤的综合性方法。其包括1)使用交联剂进行交联以捕获内源性的单链断裂；2)把染色质碎片化；3)经过核酸酶灭活后，细胞核进一步进行蛋白酶K处理以及交联逆转，分离获得基因组DNA；4)对纯化后的核酸片段进行加尾等步骤。本发明的检测精度至核酸水平。

Description

一种检测全基因组的单链DNA损伤的方法

技术领域

本发明涉及一种检测全基因组的单链DNA损伤(Single Strand Breaks，SSBs)的方法。

背景技术

DNA损伤被认为是癌症与衰老相关疾病的主要原因，与人类健康息息相关。DNA损伤有多种类型，其中单链断裂是最为普遍的一种。这些损伤表现为氧自由基位点的DNA损伤，该损伤在切除DNA修复通路以及相关中间产物如拓扑异构酶等过程中起调节作用。SSBs可通过复制叉停滞或者崩塌进一步恶化成更为严重的双链断裂(double strand breaks，DSBs)。SSBs本身就是细胞中的一个主要问题，它们可以抑制RNA

聚合酶的合成，甚至在一些情况下可以导致细胞凋亡。目前已有详细的SSBs修复通路，贯穿由发现到开始修复的每个步骤，更是体现DNA损伤的重要性。这些细胞通路的缺陷可导致细胞对基因毒性应急反应、胚胎致死以及一系列神经退行性疾病更敏感。

对SSB修复机制的详细步骤的需求与日俱增，然而与之形成鲜明对比的，是定位核苷酸的层面上的、全局的、精确无偏的内源性SSBs方法的严重缺失。相比之下，一系列综合性用于定位DSBs的方法已经较为成熟，例如BLESS[9],BLISS[10]等等其他。据了解，目前只有一个方法可以找到对应内源性SSBs，主要依靠SSB的3’-OH标记，引导DNA聚合酶I进行切口平移反应，用生物素化的核苷酸标记下游DNA。已标记的DNA经过纯化后，直接进行二代测序。然而，这个方法的主要缺点在于反应的产物是一段DNA区域，很有可能从原SSB位置中延伸出去几千个碱基，从而无法精确的从核酸层面上鉴定损伤位置。另外一方面，胡教授等人研发了一种有趣的在全基因组水平定位切除修复过程中的初级短的切除所导致的DNA断裂的方法，从核酸层面上精确的找到SSB。但是这个方法无法提供由其他机制产生的SSB的信息，因此无法综合反映SSBs。

参考文献：

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综上所述可知，绝大部分的不同细胞类型和不同条件下的SSBs的基因组图谱仍然未知。因此，急需从全基因组角度出发，研发一种高分辨率的精确的方法检测不同生理或者环境条件的应答后的SSBs的分布规律以及动态变化。

发明内容

本发明提供一种通过三代单分子测序(single molecule sequencing,SMS)检测不同条件下的SSBs基因图谱。

本发明提供了一种检测全基因组的SSBs的方法，其克服了背景技术中的方法所存在的不足。

本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：

一种检测全基因组的SSBs的方法，它包括如下步骤：

1)使用交联剂进行交联以捕获到内源性的单链断裂；

2)使用核酸酶把染色质碎片化，得到的3’-磷酸盐端无法用于TdT加尾的基质；

3)经过核酸酶灭活后，细胞核进一步进行蛋白酶K处理，进行解交联，分离出基因组DNA，并用TdT进行加PolyA尾；

4)已加尾的基因组DNA直接用于SMS，无需另外的纯化步骤；采用三代测序仪平台测序，获得单链DNA损伤位点。

在本发明的实施例中，步骤1)中，所述的交联剂包括甲醛。

在本发明的实施例中，步骤1)中，采用的甲醛的浓度范围为0.5％-2％。

在本发明的实施例中，步骤1)中，交联时间为5-15min。

在本发明的实施例中，碎片化采用核酸酶。

在本发明的实施例中，步骤5)中，所用的核酸酶为MNase。

作为优选，步骤3)中，解交联为了分离出基因组DNA。

作为优选，步骤4)中，首先，通过上述Helisphere程序包，对长度(≥25碱基)和测序质量上过滤获得原始SMS reads。第二，剩余的数据通过indexDPgenomic软件比对到GRCh37/hg19人类基因组。唯一比对或者多位点比对结果的reads将被保留。第三，比对至(人类)参考基因组中富含PolyA的Reads将被去除。由单链比对结果可推断对应损伤链的序列，SSB单链富集polyA区域可由单链富集polyT区域体现。5’上游序列20碱基中T’部分的比对结果>40％从后续分析中去除。

本发明技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1、本发明能够综合性的从核酸层面的精确地检测全基因组的SSBs。

2.本发明方法可以精确到核酸水平的全面鉴定基因组中所有SSBs，其包含以下特点：

1)可检测各种不同机制产生的SSBs

2)适用于各类生物，不仅仅是人类

3)适用于各种环境、不同疾病或者发育条件下产生的SSBs

4)适用于不同的细胞系或者组织

本发明方法可检测到3’-OH端的损伤，但是可以类推，其他类型的损伤也可以通过本方法(适当变动)检测。例如，3’-P端(-PO4磷酸基团中的P)通过磷酸酶或者多核苷酸激酶处理后转化为3’-OH端，从而进行检测。

2)可推断，除了MNase外，也可采用其他的碎片化方法，只要碎片化后的3’端无法加尾。

3)该方法取决于通过使用TdT向3'OH添加polyA尾来捕获天然单链DNA断裂。但是，可能会使用其他方式添加尾巴，例如使用连接酶。

4)只要损伤可以与其相对应的序列衔接

5)除了甲醛之外，也可使用其他交联介质

6)分析方法可在细节上各不相同：例如除了indexDPgenomic外，还可以其它的比对软件。

3.研究表明识别SSBs的基因组模式及其在不同组织与条件下的SSBs热点(富集区)具有重要的意义。各种的DNA损伤为探索新的潜在的生物标记物与新的药物作用靶点提供新的研究思路。除此之外，本发明方法还可以用于不同的发育阶段或者不同环境、年龄、遗传背景下发生在脑部以及其他组织中的SSBs的图谱的比较研究，与此同时，还可以研究不同物种的SSBs图谱的比较，例如人类与其他灵长类或者哺乳动物。通过本方法研究SSBs可为之前不可预见的DNA损伤区域提供新的研究视角，而这是现有技术无法实现的。

附图和附表说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1.SSB-SMS方法概述。从交联的细胞中分离细胞核并进行MNase酶切。然后分离碎片化的DNA，用TdT加尾，用寡核苷酸(dT)捕获并进行SMS。

图2.SSB-SMS方法验证。(A)从用指定药物处理48小时的细胞中分离的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳分析，然后用MNase酶切(右)或不酶切(左)。未被酶切的凝胶底部的信号代表残留的降解RNA。(B)通过使用抗切割的PARP抗体的流式细胞仪测定凋亡细胞的比例(Y轴，上图)以及不同处理中组(Y轴，下图)中的DNA断裂数目。X轴为药物处理时间(小时)。

图3.基于流式细胞分选仪测定的6小时处理条件下K562细胞的凋亡比例。根据来自AnnexinV-FITC染色(X轴)的荧光信号强度检测凋亡细胞，阈值由细竖线表示，Y轴代表来自PI染色的荧光信号强度。

图4.基于流式细胞分选仪测定的12小时处理条件下K562细胞的凋亡比例。根据来自AnnexinV-FITC染色(X轴)的荧光信号强度检测凋亡细胞，阈值由细竖线表示，Y轴代表来自PI染色的荧光信号强度。

图5.基于流式细胞分选仪测定的24小时处理条件下K562细胞的凋亡比例。根据来自AnnexinV-FITC染色(X轴)的荧光信号强度检测凋亡细胞，阈值由细竖线表示，Y轴代表来自PI染色的荧光信号强度。

图6.基于流式细胞分选仪测定的36小时处理条件下K562细胞的凋亡比例。根据来自AnnexinV-FITC染色(X轴)的荧光信号强度检测凋亡细胞，阈值由细竖线表示，Y轴代表来自PI染色的荧光信号强度。

图7.基于流式细胞分选仪测定的48小时处理条件下K562细胞的凋亡比例。根据来自AnnexinV-FITC染色(X轴)的荧光信号强度检测凋亡细胞，阈值由细竖线表示，Y轴代表来自PI染色的荧光信号强度。

表1.每个人类K562样本的SMS总的序列数目和不同过滤阶段的序列数目的概括

表2.每个样品种凋亡细胞的比例。

表3.未加PolyA尾的reads的比例

具体实施方式

在室温下，3×10⁶个细胞在2ml的含1％甲醛的生长培养基中进行交联反应10分钟，随后加入甘氨酸(赛默飞科技)到终浓度为1.375M，在室温下孵育5分钟中断交联反应。

收集细胞并于1500g、4℃离心10分钟，使用预冷的1×PBS洗涤细胞。向交联细胞中加入含有5mM PIPES(pH8),3mM KCL,0.5％NP-40(Amresco)的裂解液，置于冰上10分钟裂解细胞以得到细胞核，然后1000g、4℃离心10分钟；移除上清液，加入500ul预冷的1X MNase缓冲液(NEB)，1000g、4℃离心10分钟使细胞核沉淀。移除上清液，使用50ul含有100μg/ml BSA的预冷1X MNase buffer重悬，然后加入300-1200units的MNase(NEB)和200units的RNAseIf(NEB)冰上放置30分钟消化细胞核。

将消化后的样品纯化并进行琼脂糖凝胶电泳，以确保DNA的主要长度在150-500bp(Figure 2)。加入5.6μl的0.5M EDTA停止消化，并加入150μl的核裂解缓冲液(10mM EDTA,1％SDS,10mM Tris-HCl pH 8)，混匀，室温放置五分钟；加入1μl的20μg/ml蛋白酶K(Roche)，55℃孵育1h，65℃孵育1h。加入0.3M KCl使DNA沉淀，然后加入预冷的异丙醇-80℃放置30分钟；12000g、4℃离心15分钟；使用预冷的70％乙醇洗涤沉淀颗粒，然后进行真空干燥。使用40ul超纯使DNA溶解，加入2×SPRI磁珠，室温孵育15分钟；使用磁力架吸附磁珠，然后用200μl 70％的酒精洗涤两次,放置于室温温45分钟风干，最后将样品溶于40ul的超纯水中。使用Qubit 3.0fluorometer和“dsDNA HS Assay”试剂盒(Thermo FisherScientific)测定DNA浓度。

使用TdT对纯化后的100ngDNA片段进行polyA加尾。将100ngDNA，2μl 10X TdTbuffer,2μl 2.5mM CoCl2and water混匀，使总体积为19ul，放置于95℃5分钟，完成后快速拿出置于冰上；加入TdT(5units；NEB)、2μl of 1mM dATP使总体积为22ul，37℃孵育30分钟；加入2μl 1mM ddTTP锁定游离的3'-OH末端，37℃孵育30分钟，70℃10分钟灭活TdT.之后，如前所述，将2.5μl含有～10.4ng基因组DNA的已加尾样品直接用于SeqLL，LLCfacility(Woburn，MA，USA)外包的的单分子测序。

首先，通过上述Helisphere程序包，对长度(≥25碱基)和测序质量上过滤获得原始SMS reads。第二，剩余的数据通过indexDPgenomic软件比对到GRCh37/hg19人类基因组。唯一比对或者多位点比对结果的reads将被保留。第三，比对至(人类)参考基因组中富含PolyA的Reads将被去除。由单链比对结果可推断对应损伤链的序列，SSB单链富集polyA区域可由单链富集polyT区域体现。5’上游序列20碱基中T’部分的比对结果>40％从后续分析中去除。若使用其他加尾方法，此步骤可改进。例如，损伤随机连接序列，那就无需过滤相邻内源性富集polyA区域的比对结果。第四，由于Helicos SMS测序需要fill-n-lock步骤，即在polyA尾巴之后的首个碱基用于假设模板，因此不做测序。每个后过滤比对结果的5’位置延伸一个碱基。SSB的位置对应于每一个比对结果的5‘末端的位置。

验证实验

用H₂O₂处理细胞诱导DNA产生SSBs,其频率远远高于DSBs20。因此，首先，通过检测经过H₂O₂处理过的K562人类白血病细胞中的HMW DNA断裂的图谱，从而验证SSB-SMS。如表1生物学重复结果所示，经H₂O₂处理与未经过H₂O₂处理的K562细胞的SSB-SMS的图谱显示在唯一比对上SMS的测序片段呈稳定增长，比例是279,064vs 488,462(1.8倍的增长)。活性氧主要产生带3’-p(3’-磷酸盐)的DNA断裂，随后，在SSB修复酶的作用下，由3’-p端转化为3’-OH端。这些结果表明，SSB-SMS不仅可以检测到以3’-OH端的断裂，而且还可以检测到由细胞内DNA修复机制转化为3’-OH端的DNA断裂。

还可以进一步通过研究由细胞凋亡DNA断裂早期产生的SSBs图谱验证本方法的有效性。细胞凋亡DNA断裂早期阶段包括高分子量(high-molecular weight，HMW)和低分子量(low-molecular weight，LMW)DNA片段产生的两个阶段。在第一个HMW步骤中，DNA被切成50-300kb的片段，随后在第二个LMW步骤分解成200bp寡核苷酸片段。目前，已经有研究绘制了第二个步骤中产生的DSBs(double strand breaks)的基因组图谱，然而在第一个HMW步骤中DNA断裂点的基因组图谱仍未知。实际上，之前的研究已证实了SSBs在细胞凋亡DNA断裂的HMW步骤的重要作用。由于DNA断裂数目应该与细胞凋亡数目正相关，因此，细胞凋亡DNA断裂的第一个步骤代表了验证本方法的重要***，这一点如上上述，我们已阐明过。

K562细胞经过5种抗癌药物的处理，如依托泊苷(拓扑异构酶2抑制剂)、SN-38(拓扑异构酶1抑制剂)、罗米地辛(组蛋白脱乙酰基酶类的抑制剂)、伊马替尼(K562中致癌基因BCR-ABL的抑制剂)、talazoparib(PARP抑制剂)，并且在DMSO下放置6、12、24(伊马替尼除外)、36以及48小时。每种药物处理的各个时间节点SSB的基因图谱情况如表1所示。通过荧光激活细胞分选方法用膜联蛋白染色或者抗体对裂解蛋白(未显示)观察细胞凋亡情况。在36以及48小时之后，我们观察到凋亡细胞中的标记物增长(如图2B&3-7，表2)，并且根据琼脂糖胶显示大多数DNA仍然处于HMW(如图2A)。

和预期一致，凋亡细胞的比例与过滤后的序列片段之间的皮尔逊相关系数是0.83，在36与48小时药物处理的时间节点上的序列片段数量呈显著上升，刚好与这些样品中凋亡细胞的比例上升一致(如图2B&3-7，表1&2)。并且，在抗体对裂解蛋白实验中我们得到类似的结果(数据结果在此未显示)。而且，只有0.33％已检测到的双链DNA断裂(doublestrand breaks)，这一比例和之前报道的SSBs数目大概是DSBs的100-1000倍一致。

除了polyA加尾的样品之外，我们也进行了未加尾的对照组实验：MNase-DNA片段在流动槽中杂交并测序(未加polyA)。对照组应产生一定量的短读序列，这是由于基因组内polyA富集的序列与流动槽中的oligo(dT)结合，并测序而产生。通过过滤比对到基因组中polyA富集区域中的短读序列，结果显示，过滤后，未加polyA的对照组中只剩下2％-3％的序列片段，而加polyA的实验组中却有20-60+％，中位数为42.7％的短读序列(表1)。此外，未加尾的对照组中过滤后的序列片段的数量只是加尾样品中过滤后的短读序列的0.2％-3.4％(表3)。由此可见，加尾样品中大部分过滤后保留下来的序列片段是以TdT加尾的3’-OH端。

SMS过程产生了相对短的序列片段(平均长度32个碱基，长度在25到57个碱基范围内)，与长序列片段相比，短序列与基因序列错误匹配的机率更高。我们通过计算序列片段与Y染色体比对的比例来预估这个问题的影响的概率。来自女性志愿者的K562细胞的基因组中没有Y染色体。染色体Y中非重复序列部分占人类基因组序列的～2.7％，染色体Y中SSBs的平均比例是0.02％(范围值0.008-0.05％，如表1)。这就意味这总体来说本研究中SSBs中的错误匹配的序列片段<1％。

图1.本方法的概述。从交联细胞中分离出细胞核，进一步进行MNase。碎片化的DNA分离，TdT加尾，通过表面寡核苷酸捕获进行测序。

图2A.通过MNase进行DNA片段化。细胞经特定药物处理然后通过MNase酶切(右边)与未酶切(左边)48小时后分离出基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析。未被酶切的凝胶底部的信号代表剩余降解的RNA。

Claims

1.一种检测全基因组的单链DNA损伤的方法，它包括如下步骤：

1）使用交联剂进行交联以捕获内源性的单链断裂,所述的交联剂为甲醛，采用的甲醛的浓度范围为0.5%-2%；

2）把染色质碎片化，使3’-OH缺失的片段无法用TdT加尾；碎片化采用核酸酶MNase；

3）经过核酸酶灭活后，细胞核进一步进行蛋白酶K处理以及交联逆转，分离获得基因组DNA；

4）对纯化后的核酸片段用TdT进行polyA加尾，加尾后的基因组DNA直接用于SMS；采用三代测序仪平台测序，获得单链DNA损伤位点。

2.根据权利要求1所述的一种检测全基因组的单链DNA损伤的方法，其特征在于：步骤1）中，交联时间为5-15min。

3.根据权利要求1所述的一种检测全基因组的单链DNA损伤的方法，其特征在于，步骤2）中，核酸酶处理直接在交联细胞分离出的细胞核上进行，直到大部分的基因组DNA在150-500个碱基对范围内。

4.根据权利要求1所述的一种检测全基因组的单链DNA损伤的方法，其特征在于：步骤3）中，交联逆转，使得蛋白和DNA分离，并去除里面的RNA。

5.根据权利要求1所述的一种检测全基因组的单链DNA损伤的方法，其特征在于：步骤4）中，还包括如下步骤：首先，通过Helisphere程序包，过滤出长度≥25碱基的高测序质量的SMS reads；第二，剩余的数据通过indexDPgenomic软件比对到GRCh37/hg19人类基因组；唯一比对或者多位点比对结果的reads将被保留；

第三，比对至参考基因组中富含PolyA的Reads被去除；由单链比对结果推断对应损伤链的序列，SSB单链富集polyA区域由单链富集polyT区域体现；5’上游序列20碱基中T’部分的比对结果>40%从后续分析中去除。