CN109913447A - 游离dna提取富集试剂盒及游离dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种游离DNA提取富集试剂盒，包括样本裂解液、结合液、一次洗涤液、二次洗涤液、洗脱液和纳米磁珠，样本裂解液包括无核酸酶水、试剂A和试剂B，试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中至少一种，试剂B为Tween20、Triton‑X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中至少一种；结合液中除样本裂解液的成份外还包括试剂C，试剂C为异丙醇和无水乙醇中至少一种；一次洗涤液成份与结合液相同；二次洗涤液为无核酸酶水、摩尔浓度为0.1‑1M氯化钠溶液、Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种；洗脱液为无核酸酶水，Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种。本发明还公开了一种游离DNA提取方法。本发明解决了现有技术中有机溶剂有一定毒性的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及DNA检测领域，具体涉及一种游离DNA提取富集试剂盒及游离DNA提取方法。
背景技术
核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是一类带有遗传信息的生物大分子。血中游离DNA(cell free DNA,cfDNA)简称循环脱氧核糖核酸，是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA；研究发现，游离DNA也含有非常重要的遗传信息。近年来，游离DNA研究成为基因组分子诊断研究的一个热门领域，目前已被临床逐渐运用到了从肿瘤的最初诊断到治疗、发展的各个阶段，包括：早期筛查，评估肿瘤的异质性，转移复发风险和预后评估、实时监控治疗反应和耐药，肿瘤分期分级和指导治疗方案选择等。
cfDNA在血循环中的含量很低，且极易被丰度较高的非cfDNA污染和稀释，尤其是早期癌症患者。而且，原发性脑瘤患者的cfDNA可能由于血脑屏障的阻隔作用难以在外周血中被检测到，这给cfDNA的检测带来了极大挑战。使用cfDNA进行检测的第一步就是要对人类血清血浆中的cfDNA进行提取纯化，提取产物的质量直接影响到后续检测结果的准确性和可靠性。而游离DNA的片段小、在血清和血浆中含量低等特性给cfDNA提取的得率提出了更高的要求。目前核酸提取方法主要有酚/氯仿抽提、离心柱法和磁珠法。酚/氯仿抽提因大量使用有毒溶剂，对操作者毒性较大，操作步骤繁琐，难于实现自动化操作。离心柱法因其游离核酸提取效率低、成本高，且需要高速离心机，也难于实现自动化，均不能广泛适用于大规模的临床检测。近年发展起来的磁珠法提取核酸技术，其采用超顺磁性纳米颗粒，利用在高盐条件低pH下吸附核酸，然后在低盐高pH下分离核酸的原理进行样本核酸的分离纯化，因其只需要在磁场作用下就高效简易地将核酸分离纯化出来，故其能实现高通量自动化标准化操作。
目前市场上游离DNA提取富集试剂盒中的溶液是根据不同的提取方法相应设计，比如基于酚/氯仿抽提的试剂盒，大多通过酚、氯仿和异戊醇来变性蛋白质使其沉降，并使液体分层，再用乙醇等沉淀离心，达到提取目的；但上述有机溶剂有一定的毒性，不利于技术人员操作。而离心柱法和磁珠法则多采用高盐低pH的原理制备结合液，使得核酸在该条件下与离心柱的硅胶膜或磁珠相结合；再采用低盐高pH的条件制备洗脱液，便于核酸洗脱。这一原理虽广泛应用于核酸的提取，但并不完全适用于游离核酸的提取，主要体现在：1.游离核酸的片段长度相对于基因组核酸短，游离DNA主峰长度在170bp左右,游离RNA小于1000nt，在一般高盐溶液中难以与磁珠高效结合；2.游离核酸的含量少，残留的杂质和盐将会严重影响后续测量和下游应用。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种游离DNA提取富集试剂盒及游离DNA的提取方法，旨在解决的现有的游离核酸提取法中，有机溶剂有一定毒性的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种游离DNA提取富集试剂盒，其包括样本裂解液、结合液、一次洗涤液、二次洗涤液、洗脱液和纳米磁珠，所述样本裂解液成份包括无核酸酶水、试剂A和试剂B，所述试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种，所述试剂B为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中的至少一种；所述结合液中除样本裂解液的成份外还包括试剂C，所述试剂C为异丙醇和无水乙醇中的至少一种；所述一次洗涤液的成份与结合液相同；所述二次洗涤液为无核酸酶水、摩尔浓度为0.1-1M氯化钠溶液、Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种；所述洗脱液为无核酸酶水，Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种。
优选地，所述样本裂解液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为2-6M的试剂A与质量浓度为5％-20％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节制成。
优选地，所述结合液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为1-6M的试剂A与质量浓度为5％-20％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA调节并与15％-55％体积的试剂C混合制成。
优选地，所述一次洗涤液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为0.5-4M的试剂A与质量浓度为0.5％-10％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节并与15％-55％体积的试剂C混合制成。
优选地，所述纳米磁珠其磁核为铁钴镍合金Fe-Co-NiOX，粒径分布在300-400nm之间。
优选地，所述磁核的表层由内到外依次至少包覆有碳层和无机二氧化硅层，且在最外层共价接枝有聚乙二醇。
本发明还提供一种游离DNA的提取方法，其前述的游离DNA提取富集试剂盒完成，所述方法包括以下步骤：
按照先添加蛋白酶K，然后添加样本，最后加入裂解液的顺序，在离心管中依次添加各个组分，震荡混匀各组分并孵育，以进行样品裂解；
将纳米磁珠和结合液按比例配制成纳米磁珠结合液；
将制备好的纳米磁珠结合溶液加入样本中，震荡混匀后静置，并弃掉上清；
使用一次洗涤液清洗游离DNA；
使用二次洗涤工作液清洗游离DNA；所述二次洗涤工作液由二次洗涤液用无水乙醇稀释得到；
加入洗脱液，震荡以使纳米磁珠重悬，并进一步震荡以使纳米磁珠上的游离DNA洗脱。
优选地，所述按照先添加蛋白酶K，然后添加样本，最后加入裂解液的顺序，依次添加各个组分，震荡混匀各组分，并孵育进行样品裂解的步骤中包括：
在15毫升的大离心管中依次添加质量浓度为20毫克/毫升的蛋白酶80微升、血浆样本4毫升和样本裂解液400微升；
震荡大离心管以混匀其中各组分，并将大离心管置于60℃环境中孵育20分钟；
孵育结束后，将大离心管平衡至室温。
优选地，所述将制备好的纳米磁珠结合溶液加入样本中，震荡混匀后静置，并弃掉上清的步骤中包括：
将制备好的纳米磁珠结合溶液加入大离心管的血浆样本中并震荡混匀；
摇晃离心管以促进游离DNA与纳米磁珠的结合；
将上述大离心管置于磁力架上静置至管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
优选地，所述使用一次洗涤液清洗游离DNA的步骤中包括：
将大离心管从所述磁力架上取下，加入1毫升洗涤液，并涡旋震荡以重悬纳米磁珠；
将已重悬的纳米磁珠溶液转移入一个1.5毫升离心管；
将所述1.5毫升离心管置于磁力架上至管内磁珠聚集于管壁；
利用1.5毫升离心管内的上清液来润洗所述大离心管的管壁和管盖，将残余磁珠的润洗液转移回所述1.5毫升离心管；
将所述1.5毫升离心管置于磁力架上静置至管内溶液澄清且磁珠聚于管壁；
弃掉上清；
将1.5毫升离心管从磁力架上取下，加入1毫升洗涤液并涡旋震荡该1.5毫升离心管30秒；
将1.5毫升离心管于台式离心机中快速离心，将粘壁的残液甩至管底，并将该离心管置于磁力架上静置至管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
本发明中，采用无核酸酶水、异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠或高氯酸钠Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂等环保材料作为主要溶液，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害减少到最少，完全符合现代环保理念，能更好地满足临床使用条件。这些溶液于磁珠周围营造出特定化学环境，使得磁珠选择性高效吸附血清或血浆中游离DNA。具体效果如下：1、所有试剂无毒安全，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害减少到最少。2、裂解结合液一种溶液即可达到良好的裂解、变性和促进核酸富集的作用，大部分样品无需额外使用蛋白酶K和样本裂解液。3、针对低浓度、小片段的游离核酸富集效率高，无需引入Carrier RNA等外源干扰。4、所有结合、洗涤和洗脱过程均在常温下进行，耗时短，操作简单。
附图说明
图1为本发明一实施例中游离DNA提取富集试剂盒的操作流程示意图；
图2A展示了使用本发明的游离DNA提取富集试剂盒抽提血浆中cfDNA和其他同类主流抽提试剂抽提游离DNA的结果；
图2B展示了使用本发明的游离DNA提取富集试剂盒抽提尿液中cfDNA和其他同类主流抽提试剂抽提游离DNA的结果；
图3A展示了使用游离DNA提取富集试剂盒抽提血浆中的cfDNA，通过荧光定量PCR检测β-球蛋白的水平，得到的扩增曲线和CT值的结果；
图3B展示了上述荧光定量PCR 3复孔扩增曲线对应的CT值；
图4A展示了使用本发明游离DNA提取富集试剂盒抽提DNA的验证结果；
图4B展示了使用安捷伦2100生物分析仪分析不同实验批次间的抽提产物的结果；
图4C展示了血清中人工合成并含有突变的EGFR片段的标准品经由游离DNA提取富集试剂盒抽提产物经过荧光定量PCR探针法检测c.2573T>G(L858R)突变水平，得到的扩增曲线；
图4D展示了图4C所示荧光定量PCR 3复孔扩增曲线对应的CT值。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的实施例，实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同标号表示相同的元件或具有相同功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为解决上述技术问题，本发明提出一种游离DNA提取富集试剂盒。该游离DNA提取富集试剂盒包括样本裂解液、结合液、一次洗涤液、二次洗涤液、洗脱液和纳米磁珠。其中，样本裂解液成份包括无核酸酶水、试剂A和试剂B，所述试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种；试剂B为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中的至少一种；结合液中除样本裂解液的成份外还包括试剂C，试剂C为异丙醇和无水乙醇中的至少一种；
本发明实施例中，试剂A(异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中至少一种)为强离子性离液盐，可使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀；试剂B(Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型中至少一种)为非离子表面活性剂，可破坏裂解核酸/蛋白复合物，使DNA释放出；试剂C(异丙醇和无水乙醇中至少一种)为DNA沉淀剂。
研究表明，在强离子性离液盐(异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠等)的作用下，可通过作用于蛋白质、多糖和磷脂等，破坏细胞完整结构；同时，该类盐可以使磁珠及其硅层吸附DNA的能力可以大大增强。其机理可能为：①高浓度离液盐可以降低磁珠材料表面电荷，从而减少磁珠表面和带负电荷的DNA间的静电斥力；②高浓度盐可通过形成水合离子降低水的活性，使DNA和磁珠表面脱水，促使DNA聚合到磁珠表面；③高浓度离液盐可破坏氢键，使双链DNA转变为单链DNA，单链DNA暴露出来的自由碱基与磁珠表面硅层形成氢键，促进DNA的进一步吸附。作为强离子性离液盐，盐酸胍、碘化钠、高氯酸钠等盐在较高浓度时，可使变性的蛋白质和变性DNA表现出比其正确折叠或天然构象时更高的热动力学稳定性，继而可促进DNA与磁珠的可逆性结合。同时，异硫氰酸胍除据上述功能，还可作为高效的促溶剂，具有较强蛋白变性和降解、抑制核酸酶从而减少提取过程中核酸降解的作用。
本发明实施例中，一次洗涤液的成份可与结合液相同。本发明实施例中一次洗涤液也包括无核酸酶水、试剂A、试剂B和试剂C，只是比例不同。具体的，在一较佳实施例中，一次洗涤液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为0.5-4M的试剂A与质量浓度为0.5％-10％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节并与15％-55％体积的试剂C混合制成。
本发明实施例中，所述二次洗涤液为无核酸酶水、摩尔浓度为0.1-1M氯化钠溶液、Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种；洗脱液为无核酸酶水，Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种。
本发明实施例中，样本裂解液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为2-6M的试剂A与质量浓度为5％-20％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节制成。
结合液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为1-6M的试剂A与质量浓度为5％-20％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA调节并与15％-55％体积的试剂C混合制成。本发明实施例中，可采用磁核为铁钴镍合金Fe-Co-NiOX的纳米磁珠，粒径分布在500-600nm之间，还可在磁核的表层由内到外依次至少包覆有碳层和无机二氧化硅层，且在最外层共价接枝有聚乙二醇。
本发明实施例中，游离DNA提取富集试剂盒溶液的制备可包括样本裂解液配制、裂解/结合液配制、一次洗涤液配制、二次洗涤液配制、洗涤液配制等步骤，具体步骤流程如下：
1、样本裂解液的配制。裂解液配置方法为：取一定量无核酸酶水，加入2-6M试剂A与5％-20％(w/v)试剂B，避光条件下不断搅拌至溶解，用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节pH值为4-6。所述试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种，所述试剂B为tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中的至少一种。
2、裂解/结合液的配制。裂解结合液配置方法为：取一定量无核酸酶水，加入1-6M试剂A，5％-20％(w/v)试剂B，在避光条件下不断搅拌至溶解后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节pH值为4-6，并与15％-55％体积的试剂C混合均匀。所述试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种；所述试剂B为tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中的至少一种；所述试剂C为异丙醇和无水乙醇中的至少一种。
3、一次洗涤液的配制。洗涤液配置方法为：取一定量无核酸酶水，加入0.5-4M试剂A，0.5％-10％(w/v)试剂B，在避光条件下不断搅拌至溶解后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节pH值为4-6，并与15％-55％体积的试剂C混合均匀。所述试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种；所述试剂B为tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中的至少一种；所述试剂C为异丙醇和无水乙醇中的至少一种。
4、二次洗涤液的配制。二次洗涤液为无核酸酶水、0.1-1M氯化钠溶液，Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种。
5、洗脱液的配制。洗脱液为无核酸酶水、Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种。
本发明的游离核酸提取富集试剂盒包括样本裂解液、裂解/结合液、一次洗涤液、二次洗涤液、洗脱液和纳米磁珠。纳米磁珠的保存条件是2-8℃冷藏，其它溶液室温，避光保存。使用前，将二次洗涤液按照1:4的比例与无水乙醇混合。纳米磁珠溶液为棕色溶液，使用纳米磁珠溶液之前，请先平衡至室温，然后涡旋震荡使纳米磁珠重悬混匀。其他溶液在室温状态下(15-30℃)应为无色澄清液体。如观察到沉淀物，应将试剂置于37℃加热直至沉淀溶解。
本发明还提供一种游离DNA的提取方法，其前述的游离DNA提取富集试剂盒完成，所述方法包括以下步骤：
步骤S10，按照先添加蛋白酶K，然后添加样本，最后加入裂解液的顺序，在离心管中依次添加各个组分，震荡混匀各组分并孵育，以进行样品裂解；
步骤S20，将纳米磁珠和结合液按比例配制成纳米磁珠结合液；
步骤S30，将制备好的纳米磁珠结合溶液加入样本中，震荡混匀后静置，并弃掉上清；
步骤S40，使用一次洗涤液清洗游离DNA；
步骤S50，使用二次洗涤工作液清洗游离DNA；所述二次洗涤工作液由二次洗涤液用无水乙醇稀释得到；
步骤S60，加入洗脱液，震荡以使纳米磁珠重悬，并进一步震荡以使纳米磁珠上的游离DNA洗脱。
本发明实施例中，利用前述游离DNA提取富集试剂盒提取DNA的使用方法包括以下样本裂解、使用纳米磁珠吸附游离DNA、使用洗涤液清洗游离DNA、二次洗涤游离DNA及从纳米磁珠上洗脱游离DNA几个步骤，具体的，各步骤详细操作流程如下：
A.样本裂解
1.依照试剂盒操作说明所示，于15毫升的大离心管中依次添加各个组分：蛋白酶(20毫克/毫升)80微升；血浆样本4毫升；样本裂解液400微升。注意：避免将蛋白酶K直接与样本裂解液混合。
2.涡旋震荡，以混匀上述大离心管中各组分，并于60℃孵育20分钟。
3.孵育结束后，将该含有血浆的大离心管平衡至室温。
B.使用纳米磁珠吸附游离DNA
4.依照试剂盒操作说明所示制备纳米磁珠结合溶液并混匀(注意：使用磁珠试剂前，请先平衡至室温，然后涡旋震荡该试剂使之重悬混匀)：游离DNA裂解/结合液5毫升；纳米磁珠60微升。
5.将制备好的纳米磁珠结合溶液加入大离心管的血浆样本中，涡旋震荡或颠倒10次以上混匀(注意：避免过度震荡，防止产生大量泡沫)。
6.中高速摇晃离心管10分钟，以促进游离DNA与纳米磁珠的结合。
7.将上述大离心管置于磁力架上静置5分钟，或待管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
8.小心弃掉上清(可使用移液枪移走上清，或是在磁力架上小心倾倒掉上清)。
C.使用洗涤液清洗游离DNA
9.将上述大离心管从磁力架上取下，加入1毫升洗涤液，并涡旋震荡以重悬纳米磁珠。
10.将已重悬的纳米磁珠溶液转移入一个新1.5毫升离心管，并暂时保留上一步所用的大离心管(该步骤考虑管中可能有残余磁珠，以待清洗)。
11.将该1.5毫升离心管置于磁力架上静置1分钟，待管内磁珠聚集于管壁。
12.利用1.5毫升离心管内的上清液来润洗上一步所用的大离心管的管壁和盖子，将残余磁珠的润洗液转移回该1.5毫升离心管，继而弃掉上一步所用大离心管。
13.将上述1.5毫升离心管置于磁力架上静置2分钟，待管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
14.用移液枪小心弃掉上清。
15.将1.5毫升离心管从磁力架上取下，加入1毫升洗涤液并涡旋震荡30秒。
16.将1.5毫升离心管于台式离心机中快速离心，将粘壁的残液甩至管底，将该离心管置于磁力架上静置2分钟，待管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
17.用移液枪小心弃掉上清。
D.二次洗涤游离DNA
18.将二次洗涤液预先以1:4的体积比用无水乙醇稀释。处理每个样品需要至少2毫升制备好的二次洗涤工作液(20％二次洗涤液)。
19.将1.5毫升离心管从磁力架上取下，加入1毫升已经制备好的二次洗涤工作液，并涡旋震荡30秒。
20.将1.5毫升离心管于台式离心机中快速离心，将粘壁的残液甩至管底，并将该离心管置于磁力架上静置2分钟，待管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
21.用移液枪小心弃掉上清。
22.重复19-21步操作，对磁珠进行二次洗涤。
23.将1.5毫升离心管从磁力架上取下,将1.5毫升离心管于台式离心机中快速离心，将粘壁的残液甩至管底。之后将1.5毫升离心管置于磁力架上，待管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
24.用移液枪小心弃掉1.5毫升管底部残存液体。
25.将1.5毫升离心管置于磁力架上，开盖3分钟室温晾干(注意：若环境湿度较大，则可适当延长干燥时间，确保乙醇完全挥发，但无需过度干燥磁珠)。
E.从纳米磁珠上洗脱游离DNA
26.将1.5毫升离心管从磁力架上取下，依照试剂盒操作说明所示加入80微升游离DNA洗脱液。
27.在涡旋上充分震荡1.5毫升离心管以使纳米磁珠重悬，并进一步震荡5分钟以使纳米磁珠上的游离DNA洗脱下来。
28.将1.5毫升离心管于台式离心机中快速离心，将粘壁残液甩至管底。并将该离心管置于磁力架上，待管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
29.使用不沾粘、不含有DNase和RNase的常规离心管收集含有游离DNA的上清洗脱液。
30.收获的游离DNA产物样品短期可置于4℃冷藏，长期保存需置于-20℃冷冻。
31.如果需要对游离DNA样品做定性定量分析,推荐使用Agilent所属设备及试剂(Bioanalyzer 2100以及配套试剂High Sensitivity DNA Analysis Kit)，以确保对样本足够低的检测限(5pg/微升)。
本发明的游离DNA提取富集试剂盒对人类血浆或尿液来源的自然条件下的游离DNA的卓越的抽提能力，以下是验证方式及验证结论：
1、通过2000g、4℃离心10分钟将无细胞血浆从人全血样本中分离出来，并进一步通过16000g、4℃离心10分钟去除细胞碎片等杂质得清洁血浆。取4毫升该血浆用本发明的游离DNA提取富集试剂盒抽提游离DNA，同时用其他同类主流抽提试剂抽提游离DNA。使用安捷伦2100生物分析仪分析抽提产物。
图2A展示了使用本发明的游离DNA提取富集试剂盒抽提血浆中cfDNA(曲线①)和其他同类主流抽提试剂抽提游离DNA(曲线②)的结果。本发明试剂所抽提血浆中cfDNA(曲线①)160bp-180bp片段主峰位(左边箭头指示)平均浓度为285pg/μL，300bp-600bp片段伴峰位(右边箭头指示)平均浓度为66pg/μL；右边箭头显示其他同类主流抽提试剂所抽提血浆中cfDNA(曲线②)160bp-180bp片段主峰位(左边箭头指示)平均浓度为192pg/μL，300bp-600bp片段主峰位(右边箭头指示)平均浓度为19pg/μL。
2、通过16000g、4℃离心10分钟获得无细胞尿液20毫升，用本发明的游离DNA提取富集试剂盒抽提游离DNA，同时用其他同类主流抽提试剂抽提游离DNA。使用安捷伦2100生物分析仪分析抽提产物。
图2B展示了使用本发明的游离DNA提取富集试剂盒抽提尿液中cfDNA(曲线①)和其他同类主流抽提试剂抽提游离DNA(曲线②)的结果。本发明试剂所抽提血浆中cfDNA(曲线①)160bp-180bp片段主峰位(左边箭头指示)平均浓度为341pg/uL，300bp-600bp片段伴峰位(右边箭头指示)平均浓度为59pg/μL；右边箭头显示其他同类主流抽提试剂所抽提血浆中cfDNA(曲线②)160bp-180bp片段主峰位(左边箭头指示)平均浓度为185pg/uL，300bp-600bp片段主峰位(右边箭头指示)平均浓度为23pg/uL。
从图2A和图2B可看出，本发明游离DNA提取富集试剂盒在血浆和尿液两种生物样本中都展示出卓越的抽提能力。本发明试剂所抽提血浆中cfDNA与其他同类主流抽提试剂所抽提血浆中cfDNA比较(图2A)，160bp-180bp片段主峰位平均浓度高0.48倍，300bp-600bp片段伴峰位(右边箭头指示)平均浓度高2.48倍；本发明试剂所抽提尿液中cfDNA与其他同类主流抽提试剂所抽提尿液中cfDNA比较(图2B)，160bp-180bp片段主峰位平均浓度高0.85倍，300bp-600bp片段伴峰位(右边箭头指示)平均浓度高1.57倍。
游离DNA提取富集试剂盒的高抽提效率，以最大程度保证下游操作的质量，分离提取的游离DNA可直接应用于下游的各类分子生物学检测，如测序以及各种PCR。图3A和3B展示了使用游离DNA提取富集试剂盒抽提血浆中的cfDNA，通过荧光定量PCR检测β-球蛋白的水平，得到的扩增曲线和CT值的结果。图3A展示了将血液样本使用游离DNA提取富集试剂盒抽提，抽提产物设置3复孔，经过荧光定量PCR检测β-球蛋白的水平，扩增曲线重合；图3B展示了上述荧光定量PCR 3复孔扩增曲线对应的CT值，理论标准差σ值＜0.05，具有统计学意义。
二)游离DNA提取富集试剂盒对50-3000bp范围的DNA片段的抽提效率。
为了验证50-3000bp范围的DNA片段的抽提得率，将梯状条带DNA ladder加入血清中，并用本发明的游离DNA提取富集试剂盒抽提DNA。使用安捷伦2100生物分析仪分析抽提产物并与DNA ladder原液对比。
验证血清中DNA抽提得率的步骤：
预备4毫升牛血清(FBS，赛默飞公司)，按照提取富集操作步骤进行蛋白酶K处理。
将20微升梯状条带DNA ladder(50-3000bp，Sigma Aldrich公司)添加至80微升TE缓冲液进行稀释，涡旋混合均匀。
蛋白酶K处理样品后，将50微升稀释后的DNA ladder添加至血清中；剩余50微升稀释后的DNA ladder用作参考原液(建议在添加DNA ladder之前先对血清进行蛋白酶K处理。因为外源性的DNA ladder在血清中会被降解，若不进行蛋白酶K处理会导致DNA ladder抽提得率降低)。
按照游离DNA提取富集试剂盒说明书剩余步骤进行抽提。在洗脱步骤，用50微升洗脱液进行洗脱，得到50微升产物。
使用安捷伦2100生物分析仪和高灵敏DNA分析试剂盒计算不同片段大小DNA的得率，分析和比较血清DNA抽提产物和参考原液的结果。计算DNA产量时，使用安捷伦2100生物分析仪检测抽提的DNA浓度，由于洗脱液和稀释原液都是50微升，两者浓度的比较实际也反应了DNA总量的比较。
图4A展示了使用本发明游离DNA提取富集试剂盒抽提DNA的验证结果：将梯状条带DNA ladder加入血清中，并用本发明的游离DNA提取富集试剂盒抽提DNA。使用安捷伦2100生物分析仪分析抽提产物(曲线①)并与梯状条带DNA ladder原液对比(曲线②)。安捷伦2100生物分析仪分析抽提产物(曲线①)曲线50bp–3000bp范围的DNA片段平均浓度为1854pg/μL，梯状条带DNA ladder原液(曲线②)曲线50bp-3000bp范围的DNA片段平均浓度为1893pg/μL，比较得本发明游离DNA提取富集试剂盒呈现超过95％的抽提效率。
三)本发明游离DNA提取富集试剂盒呈现高度可重复的DNA抽提效果。
将梯状条带DNA ladder稀释于血清中，并用本发明的游离DNA提取富集试剂盒抽提。使用安捷伦2100生物分析仪分析不同实验批次间的抽提产物，体现出游离DNA提取富集试剂盒在不同实验间高度的一致性和可重复性。
图4B展示了使用安捷伦2100生物分析仪分析不同实验批次间的抽提产物的结果。本发明游离DNA提取富集试剂盒呈现高度可重复的DNA抽提效果。具体的，安捷伦2100生物分析仪分析抽提产物与梯状条带DNA ladder原液曲线基本重合，分析抽提产物曲线50bp–3000bp范围的DNA片段平均浓度为1867pg/μL，梯状条带DNA ladder原液曲线50bp–3000bp范围的DNA片段平均浓度为1865pg/μL，不同批次间试剂盒抽提得率理论标准差σ值＜0.001，统计学无差异。
四)本发明游离DNA提取富集试剂盒对突变DNA片段卓越的富集分离能力(图4C和4D)。将人工合成的约170bp并含有c.2573T>G(L858R)突变的EGFR片段作为标准品，用本发明的游离DNA提取富集试剂盒提取，并最终洗脱入与原片段标准品同样体积的洗脱液。同时对样品以及标准品进行荧光定量PCR检测。图4C展示了血清中人工合成并含有突变的EGFR片段的标准品经由游离DNA提取富集试剂盒抽提，抽提产物设置3复孔，经过荧光定量PCR探针法检测c.2573T>G(L858R)突变水平，扩增曲线重合；图4D展示了上述荧光定量PCR 3复孔扩增曲线对应的CT值，理论标准差σ值＜0.05，具有统计学意义。
以上的仅为本发明的部分或优选实施例，无论是文字还是附图都不能因此限制本发明保护的范围，凡是在与本发明一个整体的构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明保护的范围内。
Claims (10)
1.一种游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，包括样本裂解液、结合液、一次洗涤液、二次洗涤液、洗脱液和纳米磁珠，所述样本裂解液成份包括无核酸酶水、试剂A和试剂B，所述试剂A为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种，所述试剂B为Tween20、Triton-X100、SDS、NP40和聚氧乙烯型非离子表面活性剂中的至少一种；所述结合液中除样本裂解液的成份外还包括试剂C，所述试剂C为异丙醇和无水乙醇中的至少一种；所述一次洗涤液的成份与结合液相同；所述二次洗涤液为无核酸酶水、摩尔浓度为0.1-1M氯化钠溶液、Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种；所述洗脱液为无核酸酶水，Tris缓冲液或者TE缓冲液中的一种。
2.根据权利要求1所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述样本裂解液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为2-6M的试剂A与质量浓度为5％-20％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节制成。
3.根据权利要求1所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述结合液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为1-6M的试剂A与质量浓度为5％-20％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA调节并与15％-55％体积的试剂C混合制成。
4.根据权利要求1所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述一次洗涤液的pH值为4-6；由无核酸酶水、摩尔浓度为0.5-4M的试剂A与质量浓度为0.5％-10％的试剂B，在避光条件下搅拌至溶解、然后用tris缓冲液或tris-EDTA溶液调节并与15％-55％体积的试剂C混合制成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述纳米磁珠其磁核为铁钴镍合金Fe-Co-NiOX，粒径分布在300-400nm之间。
6.根据权利要求5所述的游离DNA提取富集试剂盒，其特征在于，所述磁核的表层由内到外依次至少包覆有碳层和无机二氧化硅层，且在最外层共价接枝有聚乙二醇。
7.一种游离DNA的提取方法，其特征在于，利用权利要求1至6中任一项所述的游离DNA提取富集试剂盒完成，所述方法包括以下步骤：
按照先添加蛋白酶K，然后添加样本，最后加入裂解液的顺序，在离心管中依次添加各个组分，震荡混匀各组分并孵育，以进行样品裂解；
将纳米磁珠和结合液按比例配制成纳米磁珠结合液；
将制备好的纳米磁珠结合溶液加入样本中，震荡混匀后静置，并弃掉上清；
使用一次洗涤液清洗游离DNA；
使用二次洗涤工作液清洗游离DNA；所述二次洗涤工作液由二次洗涤液用无水乙醇稀释得到；
加入洗脱液，震荡以使纳米磁珠重悬，并进一步震荡以使纳米磁珠上的游离DNA洗脱。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述按照先添加蛋白酶K，然后添加样本，最后加入裂解液的顺序，依次添加各个组分，震荡混匀各组分，并孵育进行样品裂解的步骤中包括：
在15毫升的大离心管中依次添加质量浓度为20毫克/毫升的蛋白酶80微升、血浆样本4毫升和样本裂解液400微升；
震荡大离心管以混匀其中各组分，并将大离心管置于60℃环境中孵育20分钟；
孵育结束后，将大离心管平衡至室温。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将制备好的纳米磁珠结合溶液加入样本中，震荡混匀后静置，并弃掉上清的步骤中包括：
将制备好的纳米磁珠结合溶液加入大离心管的血浆样本中并震荡混匀；
摇晃离心管以促进游离DNA与纳米磁珠的结合；
将上述大离心管置于磁力架上静置至管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述使用一次洗涤液清洗游离DNA的步骤中包括：
将大离心管从所述磁力架上取下，加入1毫升洗涤液，并涡旋震荡以重悬纳米磁珠；
将已重悬的纳米磁珠溶液转移入一个1.5毫升离心管；
将所述1.5毫升离心管置于磁力架上至管内磁珠聚集于管壁；
利用1.5毫升离心管内的上清液来润洗所述大离心管的管壁和管盖，将残余磁珠的润洗液转移回所述1.5毫升离心管；
将所述1.5毫升离心管置于磁力架上静置至管内溶液澄清且磁珠聚于管壁；
弃掉上清；
将1.5毫升离心管从磁力架上取下，加入1毫升洗涤液并涡旋震荡该1.5毫升离心管30秒；
将1.5毫升离心管于台式离心机中快速离心，将粘壁的残液甩至管底，并将该离心管置于磁力架上静置至管内溶液澄清且磁珠聚于管壁。
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