KR101270088B1 - 바실러스 세레우스에 항균력을 갖는 식물유래 천연항균 조성물 - Google Patents

바실러스 세레우스에 항균력을 갖는 식물유래 천연항균 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식중독 균에 항균력을 갖는 식물유래 천연항균 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 홍지네고사리(Dryopteris erythrosora Kuntze) 또는 좀보리사초(Carex pumila Thunb) 추출물을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스에 대한 천연항균 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 천연항균 조성물은 바실러스 세레우스에 대해 효과적인 항균활성을 갖으며, 상기 두 추출물을 조합하여 함유하는 조성물의 경우에는 각 추출물을 단독으로 사용하는 경우보다 더 높은 항균활성을 나타낸다. 따라서 본 발명의 천연항균 조성물을 이용하면 적은 양으로도 식중독 균을 효과적으로 저해시킬 수 있을 뿐만 아니라, 식품의 안전성 확보에도 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

바실러스 세레우스에 항균력을 갖는 식물유래 천연항균 조성물 {Naturally occurring antimicrobial composites originated from plants against Bacillus cereus}
본 발명은 식중독 균에 항균력을 갖는 식물유래 천연항균 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 홍지네고사리(Dryopteris erythrosora Kuntze) 또는 좀보리사초(Carex pumila Thunb) 추출물을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스에 대한 천연항균 조성물에 관한 것이다.
식중독은 “식품의 섭취로 인하여 인체에 유해한 미생물 또는 유독물질에 의하여 발생하였거나 발생한 것으로 판단되는 감염성 또는 독소형 질환”이라고 정의되며 [http://fm.kfda.go.kr], 흔히 대사장애, 알러지, 특이체질질환, 미생물 감염증, 독소중독증으로 분류된다. 그러므로 식품이나 식품가공환경에서 식중독세균을 효과적으로 살균시키는 일은 매우 중요하다.
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 포자를 형성하는 대표적인 식중독 세균이며, 질병방생 메커니즘에 따라서 구토(emetic disease)를 유발하는 균, 설사(diarrheal disease)를 유발하는 균 또는 구토와 설사(emetic and diarrheal disease)를 모두 유발하는 균으로 나뉜다. 특히, 바실러스 세레우스(B. cereus) O38-2는 구토와 설사 모두 유발하는 맹독성 식중독 균으로 알려져 있다. 이 균은 환경에 두루 분포되어 있어서, 식물을 원재료로 하는 음식이나, 고기류, 유제품, 쌀, 파스타 등에서 서식할 수 있다. 또한 환경스트레스에 대한 저항성이 강한 내성포자를 형성할 수 있기 때문에, 저온살균처리가 된 식품에서 생육하여 식중독을 일으키기도 한다. 미국에서 연간 약 84,000건의 식중독이 바실러스 세레우스에 의해 발생한다고 보고되고 있으며, 우리나라에서는 2002년부터 2010년 4월까지 27건의 집단식중독과 793명의 환자가 보고되었다. 특히 2008년에는 14건의 집단식중독 발생건수와 376명의 환자가 보고되어, 역대 보고된 중에 가장 많은 발생건수와 환자수를 보였다. 바실러스 세레우스의 감염으로 발생되는 식중독 환자수는 보고된 환자수와 비교하여 약 10 ~ 20 배 이상 많이 발생되는 것으로 알려져 있다.
이에, 화학적으로 합성한 항균제를 사용하여 식중독균을 제어하려는 시도는 많이 이루어져 왔지만, 이러한 합성보존료를 식품에 직접 첨가하기 위해서는 위해평가 과정을 거쳐서 인체에 독성이 없다는 사실이 증명되어야 하고, 일반적으로 소비자들이 합성보존료가 포함된 식품을 선호하지 않는 성향을 보이기 때문에 사용에 많은 제한이 따른다. 이러한 이유로 천연물질 소재의 항균제를 개발하려는 연구가 최근 많이 진행되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 식물 유래의 추출물을 선별하여 바실러스 세레우스에 처리하는 경우, 상기 균에 대한 효과적인 항균효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 식중독 균인 바실러스 세레우스에 효과적인 항균활성을 갖는 식물유래 천연항균 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 천연항균 물질인 홍지네고사리(Dryopteris erythrosora Kuntze) 추출물 또는 좀보리사초(Carex pumila Thunb) 추출물을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 천연항균 조성물을 제공한다.
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 포자를 형성하는 대표적인 식중독 세균이며, 질병방생 메커니즘에 따라서 구토(emetic disease)를 유발하는 균, 설사(diarrheal disease)를 유발하는 균 또는 구토와 설사(emetic and diarrheal disease)를 모두 유발하는 균으로 나뉜다. 이러한 바실러스 세레우스의 활성을 본 발명의 천연항균 조성물을 이용하여 억제시킨다면 식중독을 예방할 수 있을 뿐만 아니라, 식품의 안정성 확보에도 크게 기여할 것으로 사료된다.
본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 홍지네고사리 추출물과 좀보리사초 추출물은 바실러스 세레우스 균에 대해 농도 의존적으로 항균효과를 나타낸다. 즉, 도 1에 보이는 바와 같이, 각 추출물을 50 mg/ml 농도로 처리하는 경우에 저해환의 크기가 가장 크게 관찰되었다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물 또는 좀보리사초 추추물은 종래 알려진 어떠한 추출방법으로 추출될 수도 있으나, 바람직하게는 물 또는 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트 등의 극성용매와 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매와 같은 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
구체적으로 본 발명의 실시예에서는, 상온에서 건조시킨 식물 원료를 메탄올로 50 ℃에서 추출한 후, 감압ㆍ농축하여 추출물을 얻은 후, DMSO와 멸균시킨 3차 증류수를 혼합한 용매에 용해시켜 사용하였다.
본 발명의 상기 천연항균 조성물은 홍지네고사리 추출물 및 좀보리사초 추출물을 조합하여 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 두 추출물을 조합하여 함유한 천연항균 조성물은 바실러스 세레우스에 대해 각 추출물을 단독으로 사용하였을 때보다 상승적인 항균활성을 보였다. 구체적으로 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 홍지네고사리 추출물과 좀보리사초 추출물을 혼합하여 처리하는 경우 단독으로 처리한 경우보다 저해환의 크기가 크게 측정되었을 뿐 아니라, 부분 억제 농도(fractional inhibiting concentration; FIC)도 0.5 이하로 측정되어 상승 효과(synergistic effect)를 확인하였다. 이에 따라, 항균활성에 대해 시너지 효과를 나타내는 두 천연 추출물을 혼합하여 사용하면 적은 양으로도 큰 항균효과를 볼 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물 및 좀보리사초 추출물은 1 : 64 내지 64 : 1의 중량% 혼합비로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에서는 홍지네고사리 추출물 및 좀보리사초 추출물을 1 : 1의 중량%로 혼합하여 사용하였다.
본 발명의 용어 “항균(antibacterial)”이란 세균(bacteria) 등의 병원성 미생물 또는 위해 미생물의 성장을 저해하는 것뿐만 아니라, 이의 생존을 저해하여 살균하는 것을 포함한다.
본 발명의 용어 “천연항균 물질”이란 화학적 합성품 이외의 식품첨가물 중 항균효과가 있어서 보존료의 소재로 인정되거나 보존향상제 제제의 소재로 인정되는 물질을 말한다. 이러한 천연항균 물질은 식용 가능한 식물의 추출물로 제조된 것이므로, 기존의 화학적으로 합성하여 제조한 항균물질의 단점을 극복할 수 있으며, 항균물질에 대한 소비자의 반감을 감소시킬 뿐만 아니라, 폭넓게 활용하여 식품의 안전성을 확보하는데 기여할 수 있다.
본 발명자들은 96 종의 천연 추출물을 대상으로 다양한 미생물에 대한 항균활성을 시험 하였는바, 천연 추출물의 종류에 따라 서로 다른 미생물에 대한 항균활성을 나타냄을 확인하고, 식중독 균인 바실러스 세레우스에 대해 특이적으로 높은 항균 활성을 갖는 홍지네고사리 추출물과 좀보리사초 추출물을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 천연항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 식품 보존제를 제공한다. 본 발명에 따른 상기 천연항균 조성물은 식품의 부패의 원인이 되는 위해 미생물 또는 식품에서 번식하여 식중독을 일으키는 세균에 대한 항균력을 가지고 있으므로, 식품 보존제 조성물의 유효성분으로 이용가능하다.
상기 보존제 조성물은 세균, 곰팡이 및 효모 등의 위해 미생물 또는 부패 미생물의 증식을 억제하거나 살균하여, 위해 미생물 또는 부패 미생물에 의해 감염되거나 부패될 수 있는 보존대상의 변질, 산패 또는 부패를 방지하고 보존대상의 상태를 유지하기 위해 사용되는 물질을 의미하며, 바람직하게는 식품, 사료, 화장품, 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 사용될 수 있는 것을 의미한다. 상기 보존제 조성물 중, 식품에 사용되는 조성물을 식품 보존제 조성물이라 한다.
상기 식품 보존제는 식품의 변질, 산패 또는 부패를 방지하기 위해 첨가되는 물질을 의미하며, 이는 미생물의 성장을 억제함과 동시에 식품의 맛, 향 등 경시변화를 제어할 수 있어야 한다. 따라서, 상기 식품 보존제는 본 발명의 천연항균 조성물을 전체 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 99.9 중량부 또는 0.1 내지 50 중량부 포함할 수 있다. 또한 상기 식품 보존제는 본 발명의 천연항균 조성물 외에 보존제 조성물에 포함되는 통상의 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대 식품류의 보존성을 증가시키기 위한 목적으로 식품학적으로 허용되는 용매 또는 희석제를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 천연항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 식중독 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 식중독이란 자연독이나 유해물질이 함유된 음식물을 섭취함으로써 생기는 급성 또는 만성적인 질환으로, 주로 발열, 설사 및 복통 등의 증세를 수반한다. 상기 식중독은 원인물질에 따라 세균성 식중독, 화학성 식중독, 자연독 식중독 및 미생물 독성대사물질에 의한 식중독으로 구분할 수 있으며, 상기 세균성 식중독을 일으키는 대표적인 세균이 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)이다.
본 발명의 식중독 치료 또는 예방용 조성물이 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서 본 발명의 천연항균 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인살 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 식중독 치료 또는 예방용 조성물은 단독으로 또는 식중독 원인균에 의한 감염의 치료제로서의 효능 증진을 위해 다른 약학적 활성성분과 조합하여 투여될 수 있다. 이 경우 상기 조성물 내 본 발명의 천연항균 조성물의 함량은 0.001 내지 99 중량 %로 포함할 수 있다. 상기 천연항균 조성물의 함량이 0.001 중량% 미만일 경우에는 효과적인 효능을 위해 다량의 투여가 필요할 수 있으며, 99 중량%를 초과하는 경우에는 사용량에 비해 효능이 일정할 수 있어 비경제적일 수 있다. 또한 사용방법 및 사용목적에 따라 본 발명의 천연항균 조성물의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 주사제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 건강상태, 질병 증상의 정도, 음식, 투여시간, 투여방법 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 당 0.01 ~ 100 mg이 투여될 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 천연항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 식중독 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 천연항균 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 기능성 식품 등이 있으며, 상기 식중독 예방 또는 개선용 식품 조성물은 상기 천연항균 조성물 이외에 특수영양식품(조제유류, 영ㆍ유아식), 식품가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류, 건강보조식품, 조미식품, 소스류, 과자류, 유가공품, 기타 가공식품, 절임식품, 음료, 천연조미료를 포함할 수 있다.
상기 기능성 식품이란, 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 시능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한 상기 식중독 예방 또는 개선용 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착생제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 이들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 천연항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 세정제 조성물을 제공한다.
상기 세정제는 의류용 세제, 식기 세척제, 식품 세정제, 가전제품 세척제 일 수 있으며, 상기 천연항균 조성물은 천연 성분으로 인체에 유해하지 않으므로 바람직하게 주방용품 또는 식품세척 등을 포함하는 각종 생활용품의 세척이나 항균성 부여를 목적으로 사용할 수 있다.
상기 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택된 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 세정제 등 다른 유효성분이나 색소, 계면활성제, 방부제 등의 첨가제와 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 분말화, 과립화, 정제화 또는 액상화하여 제조될 수 있다. 또한 상기 세정제 중 본 발명의 천연항균 조성물의 사용량은 사용목적과 적용형태, 적용부위, 적용대상물품 등에 따라 적절히 사용될 수 있으며, 예컨대 전체 조성물 기준으로 0.01 내지 50 중량부를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서 본 발명의 천연항균 조성물은 인체에 유해하지 아니하므로, 그 제품의 특성상 적용목적을 달성할 수 있는 경우라면 다양한 양으로 적용가능하다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 천연항균 물질을 이용하여 식중독 균에 대해 항균효과를 갖는 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에 따른 홍지네고사리 추출물 또는 좀보리사초 추출물을 함유하는 조성물이 바실러스 세레우스에 대해 효과적인 항균활성을 갖는 것을 확인하였으며, 상기 두 추출물을 조합하여 함유하는 조성물의 경우 각 추출물을 단독으로 사용하는 경우보다 더 높은 항균활성을 나타내었다. 따라서 본 발명의 천연항균 조성물을 이용하면 적은 양으로도 식중독 균을 효과적으로 저해시킬 수 있을 뿐만 아니라, 식품의 안전성 확보에도 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 각 추출물의 농도별 저해환의 크기를 측정한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 식물 추출물 시료의 제조
1-1. 식물 추출물의 제조
본 발명에 사용된 식물 추출물은 한국생명공학원 한국식물추출물은행(http://extract.pdrc.re.kr)에서 추출한 시료를 분양받아 사용하였다. 분양받은 식물 추출물의 추출방법은 다음과 같다.
먼저, 식물 재료를 부위별로 구분한 후, 실온에서 약 5 일간 건조시킨다. 이후 상기 건조된 식물을 분쇄하고, 메탄올(methanol)로 50 ℃에서 추출하였다. 이를 시료를 튜브(tube)에 용액 분주한 후, 45 ℃에서 감압ㆍ농축하여 최종 추출물을 얻어내었으며, 저온보관하였다. 상기 감압하에서 건조된 상태의 최종 식물 추출물은 튜브당 20 mg(±0.2 이내)의 용량으로 공급된다.
1-2. 식물 추출물 시료의 제조
상기에서 획득한 각 추출물의 20 mg을 2:8 비율의 DMSO(dimethyl sulfoxide, ≥ 99.9%, A.C.S. reagent, Sigma-Aldirich, Co., St. Louis, MO, USA)와 멸균한 3차 증류수를 용매로 사용하여 용해시켰다. 50 mg/ml 시료는 획득한 추출물 20 mg에 총 용매 0.4 ml을 넣어 용해하였으며, 20 mg/ml 시료는 총 용매 1 ml을 넣어 용해하였다. 그리고 10 mg/ml 시료는 20 mg/ml 시료를 용매에 희석하여 제조하였다. 이후 용매에 용해시킨 추출물들은 96-웰 플레이트(30096, SPL Life Sciences Co. Ltd, Seoul, Republic of Korea)에 사용할 양 만큼 덜어서 -30 ℃에 냉동 보관하였다.
실시예 2. 항균 효능 평가(Well diffusion assay)
상기 실시예 1에서 제조한 농도별(50 mg/ml, 20 mg/ml 및 10 mg/ml) 추출물 시료를 이용하여 바실러스 세레우스에 대한 항균효과를 well diffusion test로 측정하였다.
먼저, 테스트에 사용할 Tryptic Soy Agar(TSA, BBL, Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) 300 ml를 제조사의 지침에 따라 제조하고, 121 ℃에서 15 분간 고압 멸균시킨 후, 항온조(water bath)를 이용하여 온도를 45 ℃로 유지시켰다. 상기 45 ℃로 유지된 액체상태의 TSA에 바실러스 세레우스를 접종하여 배지 17 ml당 균의 개체수가 107 CFU가 되도록 하였다. 균이 접종된 배지를 12 개의 페트리 디쉬(petri dish)에 17 ml씩 분주하였다. 균이 접종된 배지가 분주된 페트리 디쉬를 실온에서 약 15 분간 유지하여 배지가 굳도록 하였다. 배지가 굳은 후, 멸균상태의 6 mm biopsy punch(Stiefel Biopsy Punch Size: 6mm, Stiefel Laboratories, Inc., FL, USA)를 사용하여 8 개의 웰(well)을 만든 후, 각 페트리 디쉬마다 8종씩 12 개의 페트리 디쉬에 총 96종의 추출물들을 50 μl씩 분주하였다. 추출물 분주를 완료한 후, 30 ℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 저해환의 유무와 크기를 측정하였다. 96종의 추출물 중, 가장 효과가 좋은 2종의 추출물에 대한 측정 결과는 도 1에 나타내었다. 이때 저해환의 지름은 웰(well)의 지름인 6 mm을 제외한 순수 저해환의 크기이다.
도 1에 보이는 바와 같이, 추출물의 농도에 따라 저해환의 크기가 다르게 측정되었으며, 농도가 높을수록 저해환의 크기가 커지는 것을 알 수 있다.
실시예 3. 추출물의 최소저해농도( MIC ) 및 최소치사농도 ( MLC ) 측정
최소저해농도(MIC)와 최소치사농도(MLC)를 결정하기 위해, Broth dilution method를 사용하였다.
고압 멸균 처리한 Tryptic Soy Broth(TSB, BBL)에 각각의 적당량의 추출물(홍지네고사리 및 좀보리사초 추출물)을 섞어 추출물의 농도가 4 mg/ml이 되도록 혼합액을 만들었다. 상기와 같이 제조된 추출물 혼합액을 TSB를 이용하여 1/2씩 희석한 다수의 혼합액을 준비하였다. 상기 추출물 혼합액에 약 107 CFU/ml로 희석된 바실러스 세레우스 균주를 20 μl씩 접종하여 각 튜브 속의 균 개체수가 105 CFU/ml가 되게 하였다. 균접종을 마친 튜브들을 30 ℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 육안으로 관찰하여 균이 자라지 않은 최소농도를 최소저해농도(MIC)로 설정하였다. 그리고, 균이 자라지 않은 튜브들을 TSA에 두 번씩 streaking하여 30 ℃ 배양기에서 24 시간 배양한 후, 단일 콜로니가 자라지 않은 최소농도를 최소치사농도(MLC)로 설정하였다. 측정 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
측정 결과, 홍지네고사리와 좀보리사초 모두 0.0625 mg/ml의 낮은 최소저해농도(MIC)를 보여, 바실러스 세레우스에 대한 항균 효과가 우수함을 확인하였으며, 최소치사농도(MLC)는 최소저해농도보다 높은 4 mg/ml의 수준을 보였다.
[표 1. 추출물의 MIC 및 MLC]
Figure 112010047788223-pat00001

실시예 4. 천연 항균제 배합물의 항균시너지 확인
4-1. Well diffusion assay
상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 천연 항균제 배합물(홍지네고사리 및 좀보리사초 혼합 추출물)의 저해환의 크기를 측정하여 비교하였다. 측정 실험 시료는 각 추출물을 농도별(20 mg/ml, 10 mg/ml)로 제조한 시료 및 각각의 20 mg/ml로 제조한 두 추출물을 1:1로 혼합하여 제조한 혼합 추출물 시료(홍지네고사리 10 mg/ml, 좀보리사초 10 mg/ml)를 이용하였다. 각 시료는 동일량인 50 μl씩 분주하였다. 측정 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
측정 결과, 추출물을 단독으로 처리하였을 때보다 두 추출물을 조합하여 처리하는 경우 저해환의 크기가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 상기 두 추출물의 조합에 따른 시너지 효과가 있음을 알 수 있다.
[표 2. 혼합 추출물에 따른 저해환의 크기 측정 결과]
Figure 112010047788223-pat00002

4-2. Checkerboard assay
천연 항균제 배합물의 항균활성을 확인하기 위해 Checkerboard assay를 사용하였다.
96-웰 플레이트의 1 ~ 7 행에 MIC의 2배 농도부터 MIC의 1/32배 농도가 되도록 희석한 홍지네고사리 추출물을 50 μl씩 넣었다. 그리고, 1 ~ 7 열에는 MIC의 2배 농도부터 MIC의 1/32배 농도가 되도록 희석한 좀보리사초 추출물을 50 μl씩 넣었다. 다양한 농도의 조합을 포함한 각 웰에 106 CFU/ml의 바실러스 세레우스를 100 μl씩 넣어 105 CFU/well이 되도록 하였다. 상기 플레이트를 30 ℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 육안으로 관찰하여 균의 성장이 억제되는 최저농도의 배양비율을 판별하였다. 가장 효율적으로 나타난 배합 농도의 결과를 하기 수학식에 대입하여 부분 억제 농도(fractional inhibiting concentration; FIC)를 계산하였다. FIC 지수가 0.5보다 작거나 같으면 상승 효과(synergistic effect), 0.5와 1 사이면 부가 효과(additive effect), 1과 4 사이면 무관함(indifferent), 4 이상이면 상쇄 효과(antagonistic effect)가 있는 것으로 판단하였다. 측정 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
측정 결과, 홍지네고사리 추출물과 좀보리사초 추출물을 혼합하여 처리하는 경우, 단독으로 추출물을 처리하였을 때보다 FIC 지수가 감소되었으며, FIC 지수(0.2656)가 0.5보다 작은 값을 보이는 것으로 보아, 두 추출물의 조합이 시너지 효과가 있음을 알 수 있다.
<수학식 1>
Figure 112010047788223-pat00003

[표 3. 혼합 추출물의 항균력]
Figure 112010047788223-pat00004

Claims (8)

  1. 홍지네고사리(Dryopteris erythrosora Kuntze) 추출물 및 좀보리사초(Carex pumila Thunb) 추출물을 조합하여 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 천연항균 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 홍지네고사리(Dryopteris erythrosora Kuntze) 추출물 및 좀보리사초(Carex pumila Thunb) 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알콜, 에틸아세테이트, 헥산 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 천연항균 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물 및 좀보리사초 추출물을 1 : 64 내지 64 : 1의 중량% 혼합비로 함유하는 것을 특징으로 하는 천연항균 조성물.
  5. 제 1항에 따른 천연항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 식품 보존제.
  6. 제 1항에 따른 천연항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 식중독 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 따른 천연항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 식중독 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제 1항에 따른 천연항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 세정제 조성물.
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