KR101253399B1 - 아포지단백질 ａ－ｉ 및 그 변이체를 포함한 재조합 고밀도지단백질을 이용한 라파마이신 제형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아포지단백질 변이체를 포함한 재조합 고밀도지단백질을 이용한 라파마이신 제형에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아포지단백질 변이체 V156K를 포함한 재조합 고밀도지단백질을 이용하여 라파마이신의 용해도를 개선시키고 노화 억제 및 동맥경화 억제와 같은 의학적 용도를 향상시킨 라파마이신 제형에 관한 것이다.

Description

아포지단백질 Ａ－Ｉ 및 그 변이체를 포함한 재조합 고밀도지단백질을 이용한 라파마이신 제형{Rapamycin formulation encapsulated in reconstituted high-density lipoprotein containing V156K-apoA-I}
본 발명은 아포지단백질 A-I 및 변이체 V156K를 포함한 재조합 고밀도지단백질을 이용하여 라파마이신의 용해도를 개선시키고 노화 억제 및 동맥경화 억제와 같은 의학적 용도를 향상시킨 라파마이신 제형에 관한 것이다.
라파마이신은 분자량이 913.6 Da이고, 화학식이 C51H79NO13인 31-원 마크로라이드(macrolide) 락톤으로서, 용액에서 라파마이신은 피페콜산 아미드 결합의 주변에 있는 장애 회전에 기인하여 4:1(클로로포름 용액 중)의 비율로 구조적인 트랜스-이성체, 시스-이성체를 형성한다. 라파마이신은 물, 지방족 탄화수소 및 디에틸에테르에 거의 용해되지 않는 반면에, 알코올, 할로겐화 탄화수소 및 디메틸설폭사이드에 용해될 수 있다. 라파마이신은 용액 상태에서 37℃에서 혈장과 저-pH 및 중성-pH 완충액에서 불안정하며, 반감기가 10시간 미만으로 분해된다.
특히, 라파마이신은 항진균, 항암, 면역억제 활성 등 다양한 생리활성을 나타낼 뿐 아니라, 최근 수명 연장 약제로서 보고된 바 있으며, 의료기기 예를들어 스텐트 코팅제로서도 유용하게 사용될 수 있다.
그러나, 라파마이신은 낮은 생체 이용율과 용해도를 갖는 단점이 있어 이러한 단점을 개선하기 위하여 수많은 라파마이신 유도체가 합성되어 왔다. 예를들어, 카르복실산 에스테르 (PCT 공개 WO 92/05179), 카르바메이트 (미국특허 제 5,118,678 호), 카보네이트 (미국특허 제 5,260,300 호), 아미드 에스테르 (미국특허 제 5,118,678 호), 불소화 에스테르 (미국특허 제 5,100,883 호), 아세탈 (미국특허 제 5,151,413 호), 실릴 에테르 (미국특허 제 5,120,842호), 이중고리 유도체 (미국특허 제 5,120,725 호), 라파마이신 이량체 (미국특허 제 5,120,727 호) 그리고 O-아릴, O-알킬, O-알케닐 그리고 O-알키닐 유도체 (미국특허 제 5,258,389 호) 등을 포함하며, 각종 라파마이신 약물 전구체가 또한 개발되어 왔다(미국특허 제 5,672,605 호, 제 5,583,139 호, 제 5,527,907 호, 제 5,457,111 호, 제 5,955,100 호, 제6,146,658 호, 및 제 5,935,995 호).
그러나, 아직까지 라파마이신의 용해도를 증진시켜 생체이용율을 개선한 약제의 개발에는 한계가 있으므로, 라파마이신의 용해도를 개선할 수 있는 약제의 개발이 여전히 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자는 라파마이신의 용해도 개선을 위해 연구 노력한 결과, 라파마이신을 아포지단백질 변이체 V156K를 포함한 재조합 고밀도지단백질을 이용하여 캡슐화함으로써 라파마이신의 용해도를 개선시키고 노화 억제 및 동맥경화 억제와 같은 의학적 용도를 향상시킬 수 있다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 라파마이신의 용해도를 개선시키고 노화 억제 및 동맥경화 억제와 같은 의학적 용도를 향상시킬 수 있는 신규 라파마이신 제형 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 고밀도지단백질 총 100 중량부에 대하여, 라파마이신 0.1 내지 10 중량부를 포함하며, 상기 재조합 고밀도지단백질이 아포지단백질(apoA-I)의 156번 위치 아미노산이 라이신으로 치환된 아포지단백질 변이체 V156K를 포함하는 것을 특징으로 하는 라파마이신 제형을 제공한다.
이때, 라파마이신을 상기 함량범위를 벗어나 과량 함유하는 경우 용해도 부족 및 라파마이신 침전 문제가 야기될 수 있는 반면, 소량 함유하는 경우 라파마이신 함량 부족 및 효과 부족 등의 문제가 야기될 수 있다.
상기 재조합 고밀도지단백질은 아포지단백질 변이체 V156K, 인지질, 콜레스테롤 및 소듐 콜레이트를 포함할 수 있으며, 상기 재조합 고밀도지단백질은 아포지단백질 변이체 V156K 0.1~2.0: 인지질 90~100: 콜레스테롤 1~10: 쇼듐 콜레이트 120~180의 몰비로 포함하는 것이 바람직하다.
이때, 아포지단백질 변이체 V156K을 상기 함량범위를 벗어나 함유하게 되면 단백질 침전 문제가 야기될 수 있으며, 인지질과 콜레스테롤을 상기 함량범위를 벗어나 함유하게 되면 고밀도 지단백질의 형성 장애 문제가 야기될 수 있으며, 소듐 콜레이트를 상기 함량범위를 벗어나 함유하게 되면 지단백질 형성 장애 문제가 야기될 수 있다.
상기 라파마이신은 아포지단백질 변이체 V156K 총 100 중량부에 대하여 0.1 내지 20 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 이때, 라파마이신을 상기 함량범위를 벗어나 과량 함유하는 경우 단백질 침전 및 지단백질 형성 장애 문제가 야기될 수 있는 반면, 소량 함유하는 경우 라파마이신 함량 부족 및 유효성 감소 문제가 야기될 수 있다.
본 발명에 따른 라파마이신 제형은 용해도와 생체이용율이 낮은 라파마이신의 용해도를 개선하였고, 특히 노화 억제 및 동맥경화 억제 효과를 향상시킴으로써 유용한 라파마이신 제형으로 확인되었다.
상기 라파마이신 제형은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화될 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다. 캡슐 제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.
또한, 상기 라파마이신 제형은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 근육내, 경피, 폐속, 피하, 피내, 경막내로 뺨, 항문, 질, 결막 또는 비강 내 조직을 통해 또는 종양 조직과 같은 조직 내로 접종하거나 또는 이식방식에 의할 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 재조합 고밀도지단백질을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화 할 수 있다.
또한, 노화 억제 또는 동맥경화 억제와 같은 의학적 용도를 위한 라파마이신 제형의 투여 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 15 ~ 45 mg/일이고, 바람직하기로는 45 ~ 80 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 ~ 수회, 바람직하기로는 하루 2 ~ 3 회 분할 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 아포지단백질(apoA-I)의 156번 위치 아미노산이 라이신으로 치환된 아포지단백질 변이체 V156K를 준비하는 단계; 상기 아포지단백질 변이체 V156K와 인지질, 콜레스테롤 및 소듐 콜레이트를 혼합하여 재조합 고밀도지단백질을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 고밀도지단백질에 라파마이신을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 라파마이신 제형의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 라파마이신 제형은 아포지단백질 변이체 V156K를 포함한 재조합 고밀도지단백질을 이용하여 라파마이신을 캡슐화 함으로써 낮은 용해도와 생체이용율을 갖는 라파마이신의 용해도를 개선시키고 노화 억제 및 동맥경화 억제와 같은 의학적 용도를 향상시킬 수 있다.
도 1의 A는 재조합 고밀도지단백질을 Native 상태에서의 전기영동 결과이고, B는 재조합 고밀도지단백질 입자 내에의 apoA-I 분자 수를 측정한 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 라파마이신 제형의 환원 능력 효과를 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 라파마이신 제형의 LDL 산화 억제효과를 그래프로 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 라파마이신 제형의 LDL 산화 억제효과를 아가로오스 전기영동으로 나타낸 것이고
도 5는 본 발명에 따른 라파마이신 제형의 CETP 억제 효과를 나타낸 것이고,
도 6 및 도 7은 본 발명에 따른 라파마이신 제형의 항노화 효과를 나타낸 것이다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 라파마이신을 함유한 재조합 HDL(rHDL) 제조
1. WT apoA-I 및 V156K-apoA-I 준비
pET30a(+) 발현벡터와 BL21(DE3) 숙주를 이용하여 대장균 발현시스템에서 WT apoA-I(서열번호 1) 및 V156K-apoA-I(서열번호 2)을 발현시켰다. 그후, 종래 알려진 방법(European Journal of Clinical Investigation, 36: 875-882, 2006)에 따라 순도가 최소 95% 이상이 되도록 Ni2+-컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
2. 라파마이신을 함유한 rHDL 제조
소듐 콜레이트 투석법(J Lipid Res, 46: 589-596, 2005)을 이용하여 라파마이신을 함유한 재조합고밀도지단백질 (reconstituted high-density lipoprotein) rHDL을 제조하였다. 이때, POPC(Pamitoyloleoyl phosphatidylcholine): 콜레스테롤: WT apoA-I 또는 V156K-apoA-I 중 어느 하나의 apoA-I: 소듐 콜레이트의 초기 몰비를 95:5:1:150으로 하였다. 상기 rHDL에 다양한 농도의 라파마이신을 용해시켜 라파마이신 용해도를 최적화 할 수 있는 최적 농도가 1ml의 rHDL 중 0.1mg의 라파마이신과 1mg의 apoA-I을 함유하는 것임을 확인하였다.
0.09mg/ml 라파마이신은 WT 또는 V156K (1mg/ml of protein) 중 어느 하나를 포함한 rHDL에서 잘 용해되었다.
3. 라파마이신을 함유한 rHDL 특성
본 발명자의 선행논문 (J Lipid Res, 46: 589-596, 2005)에 따라 8-25% 폴리아크릴아마이드 구배 겔 전기영동(PAGGE, Pharmacia Phast system)을 이용하여 입자 분포를 검토하였고, 이때 표준 구형 단백질과 비교하였다.
그 결과, 도 1과 같이 라파마이신을 함유한 V156K-rHDL의 주 밴드는 약 101Å의 입자크기를 나타내며, 이는 98Å의 입자크기를 갖는 라파마이신을 함유한 WT-rHDL (WT-rapa-rHDL)보다 약간 큰 반면, 라파마이신을 함유하지 않은 V156K-rHDL은 약 99Å의 작은 입자크기를 나타내었다. 또, WT-rapa-rHDL과 비교하여 약 140Å의 새로운 큰 밴드를 V156K-rHDL에서 관찰할 수 있었기 때문에 V156K-rHDL은 라파마이신을 캡슐화할 수 있는 능력이 더 뛰어난 것으로 확인되었다.
라파마이신 존재 하에서 rHDL 입자 당 apoA-I 분자 수를 BS3 (bis-sulfosuccinimidyl suberate)과의 가교를 이용하여 분석하였다(J Lipid Res, 46: 589-596, 2005). 이때, BS3과의 가교에 의해 형성된 반응 산물을 8-25% 구배 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
그 결과, 라파마이신을 함유한 각각의 rHDL은 입자 당 4개의 apoA-I를 포함하지만 라파마이신을 함유하지 않은 rHDL에서는 2 또는 3개의 apoA-I를 포함하였다. 이로부터 라파마이신의 용해를 위해 더 많은 수의 apoA-I가 필요함을 알 수 있었다.
<실시예 2> 항산화 활성 검토
1. 철이온 환원능력 검토
혈장의 철 이온 환원 능력(FRAP)은 Benzie 및 Strain(Anal Biochem, 239: 70-6, 1996)에 의해 제안된 방법으로 결정되었다. 즉, FRAP 시약은 0.2M 아세테이트 완충액(pH 3.6) 25mL, 10mM 2,4,6-트리피리딜-s-트리아진(TPTZ) 2.5mL 및 20mM FeCl3·6H2O 2.5mL를 혼합하여 준비하였다. rHDL의 항산화 활성은 생성되는 2가 철 이온에 의해 유도되는 흡광도의 증가를 측정함으로써 결정하였다. 준비된 FRAP 시약(300㎕)을 동량 희석된 rHDL(2mg/ml, 10㎕)과 혼합한 후, DU800 분광분석기(Beckman Coulter)를 이용하여 25℃에서 10분 간격으로 매 20초마다 593nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 이때, DU800 분광분석기는 MultiTemp III thermocirculator를 구비한 것을 사용하였다.
그 결과, 도 2와 같이 라파마이신을 함유하지 않은 V156K-rHDL와 WT-rHDL은 약 4배 정도 항산화 능력이 증가한 반면, V156K-rapa-rHDL과 WT-rapa-rHDL은 각각 10배 및 6배 정도 철이온 환원능력이 증가하였다.
2. 구리-매개 LDL 산화 억제 활성 검토
구리-매개 LDL 산화에 대한 항산화 활성을 검토하기 위하여, 300㎍의 LDL을 10μM CuSO4 존재 하에서 라파마이신을 함유한 각각의 rHDL(최종농도, 10㎍/ml)와 2시간동안 반응시켰다. 반응시, 형성된 공역 디엔의 양을 24.5℃, 234nm의 흡광도에서 DU800 분광분석기를 이용하여 관찰하였다. 이때, DU800 분광분석기는 MultiTemp III thermocirculator를 구비한 것을 사용하였다. 공역 디엔 수준은 분자흡광계수(apoA-I ε280=1.13M-1cm-1)를 이용하여 분광광도계로 측정한 A280에 대한 A234의 비로서 표현하였다.
그 결과, 도 3과 같이 반응시간 80분까지 모든 rHDL들이 우수한 산화억제 활성을 보여주었으며, 150분까지의 반응시간 동안, 라파마이신이 있는 경우와 없는 경우 모두 V156K-rHDL들이 WT-rHDL들에 비해 더욱 우수한 산화억제 활성을 보여주었다.
반응 후 LDL 등의 산화 정도를 비교하기 위해 아가로오스 겔 전기영동을 실시한 결과, 도 4와 같이 농도 의존적으로 rHDL들이 처리된 LDL들이 느린 이동성을 보여 우수한 항산화 효과를 보여주었고 그중에서도 V156K-rapa-rHDL의 항산화 효과가 증가하였다. 같은 농도라도 라파마이신만 단독으로 처리한 경우보다 rHDL에 녹여서 처리한 경우에 월등한 항산화 효과를 보여주었다.
<실시예 3> 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CETP) 분석
apoA-I 함유 rHDL 및 콜레스테릴 올레이트를 흔적량의 [3H]-콜레스테릴 올레이트(TRK886, apoA-I의 3.5μCi/mg; GE Healthcare)를 이용하여 Cho et al.(Biochim Biophys Acta, 1391: 133-44, 1998)에 의해 제안된 방법에 따라 합성하였다. CE-수용체로부터 분리를 촉진하기 위하여, rHDL을 CNBr-활성화된 Sepharose 4B 수지(Amersham Biosciences)를 이용하여 고정하였다. CE-전달 반응은 300㎕의 반응혼합물에서 수행되었다. 상기 반응혼합물은 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CETP)-공여체 원으로서 방사능 동위원소가 표지된 [3H]-CE-rHDL-아가로오스 (0.05ml)를, 콜레스테릴(CE)-수용체 원으로서 인간 LDL(0.05㎕, 0.25mg/mL)를 함유하였다. 37℃에서 반응 후, 4℃에서 3분 동안 원심분리(10,000g)하여 반응을 정지시켰다. 상등액(150㎕)을 신틸레이션 카운팅하여 rHDL에서 LDL로의 [3H]-CE 전달 퍼센트를 산출하였다.
그 결과, 도 5와 같이 라파마이신 자체는 적절한 CETP 억제 활성을 나타내지 않았지만, V156K-rapa-rHDL (3.5μM 단백질)은 10μM 라파마이신에서 29% CETP 억제 활성을 나타낸 반면, WT-rapa-rHDL (3.5μM 단백질)은 적절한 CETP 억제 활성을 나타내지 않았다.
<실시예 4> 세포 노화 억제 분석
프라이머리 사람 피부 섬유아세포(HDFs)를 Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) 배지를 사용하여 100 mm 배양접시에 1 × 105 cells의 농도로 5% CO2-humidified incubator에서 배양하였다. 계대 배양이 80 내지 90% 컨플루언트할 때 트립신 처리하고 집단배가(PD) 수를 본 발명자의 선행 문헌(J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 2010; 65(6): 600-610)에 따라 모니터링하였다. 실험을 위해, 6계대의 세포(PD<24)를 계대배양하여 충분한 수의 세포를 준비하였다.
노화 정도는 종래 알려진 방법(Proc Natl Acad Sci USA 92 (1995) 9363-9367)에 따라 세포 노화 연관 갈락토시다아제(SA-β-gal) 활성을 비교하여 평가하였다. 즉, 세포를 PBS에 용해된 3% 파라포름알데히드에서 5분 동안 고정시키고, PBS에서 3회 세정하며, SA-β-gal 염색 용액(40 mM 시트르산/포스페이트 [pH 6.0], 5 mM 포타슘 페로시아나이드, 5 mM 포타슘 페리시아나이드, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 1mg/mL 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-X-갈락토시다아제)에서 37℃, 16시간 동안 배양하였다. 위상차현미경 하에서 파란색으로 염색된 노화된 세포의 퍼센트를 측정하였다. 염색 후, 세포 크기는 Image Proplus 소프트웨어(version 4.5.1.22; Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA)를 이용한 컴퓨터-보조 형태계측기에 의해 무질서하게 선택된 동일 세포 수로부터 정량하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7과 같이 동일 계대수에서 V156K-rHDL과 비교하여 WT-rHDL 처리군이 더많은 SA-β-gal 양성세포를 나타내었다. 계대 17에서 WT-rHDL과 V156K-rHDL은 각각 70% 및 49%의 SA-β-gal 양성세포를 나타내었다. 그러나, 최종 1μM의 라파마이신 존재 하에서 WT-rapa-rHDL과 V156-rapa-rHDL은 각각 52% 및 29%의 염색된 세포를 나타내었다. V156K-rapa-rHDL 처리군은 라파마이신 단독 처리군에 비해 SA-β-gal 염색된 세포의 수가 훨씬 적게 나타났다. 따라서, V156K과 라파마이신 간의 상승적인 항노화 효과를 기대할 수 있었다.
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Claims (6)

  1. 재조합 고밀도지단백질 총 100 중량부에 대하여, 라파마이신 0.1 내지 10 중량부를 포함하며, 상기 재조합 고밀도지단백질이 아포지단백질(apoA-I)의 156번 위치 아미노산이 라이신으로 치환된 아포지단백질 변이체 V156K를 포함하는 것을 특징으로 하는 라파마이신 제형.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 고밀도지단백질은 아포지단백질 변이체 V156K, 인지질, 콜레스테롤 및 소듐 콜레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 라파마이신 제형.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 재조합 고밀도지단백질은 아포지단백질 변이체 V156K 0.1~2.0: 인지질 90~100: 콜레스테롤 1~10: 쇼듐 콜레이트 120~180의 몰비로 포함하는 것을 특징으로 하는 라파마이신 제형.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 라파마이신은 아포지단백질 변이체 V156K 총 100 중량부에 대하여 0.1 내지 20 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 라파마이신 제형.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 라파마이신 제형은 노화를 방지하거나, 동맥경화를 개선할 수 있는 것을 특징으로 하는 라파마이신 제형.
  6. 아포지단백질(apoA-I)의 156번 위치 아미노산이 라이신으로 치환된 아포지단백질 변이체 V156K를 준비하는 단계;
    상기 아포지단백질 변이체 V156K와 인지질, 콜레스테롤 및 소듐 콜레이트를 혼합하여 재조합 고밀도지단백질을 제조하는 단계; 및
    상기 재조합 고밀도지단백질에 라파마이신을 첨가하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 라파마이신 제형의 제조방법.
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