KR20050122729A

KR20050122729A - 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제

Info

Publication number: KR20050122729A
Application number: KR1020040048354A
Authority: KR
Inventors: 조경현; 한종민; 정태숙; 이우송
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2005-12-29
Also published as: KR100560102B1; US20050287636A1; US7273849B2

Abstract

본 발명은 프로아포리포단백질 A-1 변이체와, 이를 포함하는 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아포리포단백질(apoA-I)의 아미노산 말단에 Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln을 포함하는 프로아포리포단백질(proapo A-I)에서 apo A-I의 154번, 155번, 156번, 157번 또는 158번 위치에 변이를 함유한 proapo A-I의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터를 형질도입한 형질전환체 및 상기 변이체를 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제에 관한 것이다.

Description

프로아포리포단백질 Ａ－Ⅰ 변이체와, 이를 포함하는 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제{Prophylactic and therapeutic agents containing point mutants of proapolipoprotein A-I for anti-atherosclerosis and anti-hyperlipidemia}

본 발명은 프로아포리포단백질 A-1 변이체와, 이를 포함하는 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아포리포단백질(apoA-I)의 아미노산 말단에 Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln을 포함하는 프로아포리포단백질(proapo A-I, 258개 아미노산으로 구성)에서 apoA-I의 154번, 155번, 156번, 157번 또는 158번 위치에 변이를 함유한 proapo A-I의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터를 형질도입한 형질전환체 및 상기 변이체를 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제에 관한 것이다.

고밀도지질단백질(HDL)의 주된 기능은 혈액내의 지질과 결합하여 중성지방, 콜레스테롤 등의 운반체가 되며, 주변세포에서 사용하고 남은 잉여 콜레스테롤의 배설을 촉진하고, 효소를 활성화시키고, 저밀도지질단백질의 산화를 억제하여 죽상반(atherosclerotic plaque)의 형성을 억제하는 등의 작용으로 심장순환기 질환에 매우 저항성이 있다[Nofer 등, 2002, Atherosclerosis 161:1-16].

이러한 HDL의 긍정적인 기능은 아포리포단백질 A-I(apo A-I)에 의해서 지배되며, apo A-I은 HDL을 구성하는 아포리포단백질들의 70%를 차지하는 주된 단백질이고, 혈중 apo A-I의 농도가 낮거나, apo A-I의 구조와 기능에 이상이 생길 경우 HDL의 긍정적인 기능에 장애가 발생하며 이는 곧 심혈질환의 발생으로 연결됨이 많은 임상적 보고를 통해 잘 알려져 있다[Segrest 등, 2000, Curr. Opin. Lipidol. 11:105-115].

심혈관 질환의 대표격인 동맥경화증은 전 세계적으로 산업화된 국가에서 가장 흔한 사망원인으로 알려져 있다. 이 질환의 직접적인 원인은 혈관벽에 콜레스테롤이 침착되어 세포의 괴사물과 콜레스테롤이 덩어리화 되어 고착된 플라크(plaque)가 형성되고 이로 인해 동맥경화증을 일으켜 심근경색, 스트로크(stroke) 등의 발작위험을 증가시키기 때문이다.

고밀도지질단백질(HDL)과 고지혈증 혹은 동맥경화질병의 유병율은 반비례관계에 있음은 지난 수 십 년간 잘 알려져 있고, 항-고지혈증, 항-동맥경화 효과는 HDL의 주성분인 apo A-I이 말초조직으로부터 간으로의 소위 콜레스테롤의 역전달 경로(reverse cholesterol transport, RCT)를 촉진하기 때문인 것으로 받아들여진다[Stein 등, 1999, Atherosclerosis 144:285-301; Spady, 1999, Circulation 100:576-578; Franceschini 등, 1991, Atherosclerosis 88:99-107; Rothblat 등, 1999, J. Lipid Res. 40:781-796].

apo A-I은 분자량 28 kDa의 243개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드 사슬이며 11개의 아미노산 혹은 22개의 아미노산으로 이루어진 8개의 반복단위 도메인을 가지고 HDL을 이루는 2차 구조의 알파-헬릭스의 비율이 60 ∼ 75%에 달하며 3차 구조의 변성(denaturation)과 재생(renaturation)이 용이한 단백질이다.

최근까지 동맥경화증을 방지하고 플라크 퇴행에 치료적인 역할을 하는 apo A-I과 변이체 및 HDL의 연구결과가 발표되었고[Koizumi 등, 1988, J. Lipid Res. 29:1405-1415; Gordon & Rifkind, 1989, N. Engl. J. Med. 321:1311-1316; Gordon 등, 1989, Circulation 79:8-15; Chiesa & Sirtori, 2003, Ann. Med. 35:267-273], HDL의 중요성은 지속적으로 언급되어졌다[Miller, 1987, Am. Heart J. 113:589-597; Cheung 등, 1991, J. Lipid Res. 32:383-394; Fruchart & Ailhaud, 1992, Clin. Chem. 38:793-797].

apo A-I의 역할에 대한 직접적인 설명은 유전자변이 동물실험을 통해 알 수 있다. 고지방식이 다이어트 유도 아테롬성 경화증에 걸린 생쥐에 옮겨진 apo A-I 인간유전자의 발현은 대동맥 질병의 진행을 감소시켰다[Rubin 등, 1991, Nature 353:265-267]. 또한, apo A-I 트랜스 유전자는 apoE 결핍 생쥐와 apo(a) 유전자변이 생쥐의 아테롬성 경화증을 억제시켰고[Paszty 등, 1994, J. Clin. Invest. 94:899-903; Plump 등, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9607-9611; Liu 등, 1994, J. Lipid Res. 35:2263-2267; Shah 등, 1998, Circulation 97:780-785; Shah 등, 2001, Circulation 103:3047-3050], 특히 Shah 등[1998, Circulation 97:780-785; 2001, Circulation 103:3047-3050)의 연구결과에서는 apo E-결핍 생쥐모델을 이용하여 apo A-I Milano가 동맥병변을 크게 줄이고 병변의 지질 및 대식세포의 비율을 40% 이상 감소시켰음을 보여주었다.

apo A-I과 재조합된 apoA-I를 활용한 임상 연구는 UCB Belgium [Pharmaprojects, Oct. 27, 1995; IMS R&D Focus, June 30, 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2:261-265); M. Eriksson at Congress, "The Role of HDL in Disease Prevention," Nov. 7-9, 1996, Fort Worth; Lacko & Miller, 1997, J. Lipid. Res. 38:1267-1273; 국제공개 특허 W094/13819]과 Bio-Tech [Pharmaprojects, April 7, 1989]에 의해 시작되어졌다.

최근 Pfizer사와 합병을 마친 Esperion Therapeutics사가 개발한 ETC-216 (apoA-I Milano HDL 제재)은 123명의 심혈관질환을 갖고 있는 환자들을 대상으로, 진행중인 동맥경화 플라크가 HDL의 정맥주사로 인해, 단기간에 감소하는 효과를 발표하여 HDL의 효능을 입증시킨 바 있고[Nissen 등, 2003, JAMA 290:2292-2300], 이와 유사한 실험결과[Nissen 등, 2004, JAMA 291:1071-1080]를 통해 HDL이 갖고 있는 약리성 및 잠재적인 상품가치를 더욱 높여주었다.

이와 같이 현재까지 외국의 제약회사를 중심으로 apo A-I과 그 변이체에 대한 연구가 고지혈증 및 동맥경화 치료에 목표를 두고 진행 중에 있다[표 1].

[표 1]

현재까지의 apo A-I 변이체 관련 특허

특허	변이체	내 용
US 5,876,968(Pharmacia &Upjohn AB)	아포리포단백질 A-I-Milano 으로 명명된 apoA-I의 변이체 (R173C, MILANO)	이를 함유하는 의약은 혈전증을 예방하는데 이용될 수 있으며 이들은 모노머의 전구약물로서 이용될 수도 있다. apo-A-I-Milano의 존재로 인해 혈장 반감기가 연장된 것 같다고 추정. 구체적 증거 제시 없음
US 5,643,757(Americancyanamid Co)		인간의 아포리포단백질 A-I을 E. coli를 통해 제조하는 방법이 제시
US 5,990,081(Pharmacia &Upjohn AB)		아포리포단백질 A 또는 아포리포단백질 E의 치료학적 유효량을 투여함으로써 동맥경화증 또는 심혈관 질환을 치료하는 방법이 설명
WO 96/37608(RHONE POULENC RORER SA 등)	151번 위치에 시스테인을 갖는 아포리포단백질 A-I의 변이체 (R151C, PARIS)	아미노산 서열에 시스테인 잔기가 존재함으로 해서 모노머들 사이에 디설파이드 결합을 통해 다이머가 형성.
WO 90/12879(Sirtori Cesare등)	(R173C, MILANO)	효모에서 apo-I과 apo A-IM의 제조와 동맥경화증 및 심혈관 질환 치료용의 약으로서의 용도에 관해서 설명
WO 94/13819(Pharmacia &Upjohn AB)	(R173C, MILANO)	E. coli에서 apo A-I과 apo A-IM의 제조와 동맥경화증 및 심혈관 질환 치료용의 약으로서의 용도에 관해서 설명

상기와 같은 선행특허에서와 같은 apo A-I 변이체는 자연에서 발견된 변이체이고, apo A-I은 발현과정에서 발현호스트 내에서 불안정한 구조를 가지거나 단백질의 부러짐 현상 때문에 수율이 낮은 문제점이 제기되어 왔다.

한편, 본 발명에서와 같이 프로아포리포단백질 A-I(proapo A-I)에 관한 연구는 최근에 시작되었으며, 발현과정에서 단백질의 구조적 안정성이 우수하면서도, apo A-I의 기능에는 차이가 없다.

이에, 본 발명자들은 기존의 자연에서 얻은 아포리포단백질 변이체가 아닌 프로아포리포단백질의 6번 헬릭스 구조(143 ∼ 164번 아미노산)를 분석하여 특정 아미노산으로 치환하여 단백질 돌연변이주(변이체)를 제작하였고, 이 변이체가 기존 변이체 보다 우수한 약효를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 아포리포단백질(apoA-I)의 아미노산 말단에 Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln을 포함하는 프로아포리포단백질(proapo A-I)에서 apo A-I의 154번, 155번, 156번, 157번 또는 158번 위치에 변이를 함유하는 것을 특징으로 하는 프로아포리포단백질 변이체를 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 변이체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 형질도입한 형질전환체를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 변이체를 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 동백경화증 예방 및 치료제를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 아포리포단백질(apo A-I)의 아미노산 말단에 Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln을 포함하는 프로아포리포단백질(proapo A-I)에서 apo A-I의 154번, 155번, 156번, 157번 또는 158번 위치에 변이를 함유하는 것을 특징으로 하는 프로아포리포단백질 변이체를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 아포리포단백질(apo A-I)의 아미노산 말단에 Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln을 포함하는 프로아포리포단백질(proapo A-I)에서 apo A-I의 154번, 155번, 156번, 157번 또는 158번 위치에 변이를 함유한 proapo A-I의 변이체은 기존에 보고된 많은 논문이나 특허에서 제시하고 있는 것처럼 자연에서 발견된 apo A-I 단백질 변이체가 아니라, apo A-I의 6번 헬릭스(143 ∼ 164 번 아미노산) 구조를 분석하여 얻어낸 것이다.

특히, 본 발명에서 생산한 5종의 변이체 중 V156K와 A158E는 WT(wildtype)과 기존의 apo A-I Milano (R173C) 보다 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료에 우수한 활성을 나타내었다.

또한, 본 발명은 proapo A-I 변이체를 코딩하는 cDNA, 이를 포함하는 벡터 및 이 벡터를 형질도입한 형질전환체을 포함한다.

본 발명에 따른 proapo A-I 변이체가 TBARS(thiobarbituric acid reactive substances) 방법에 의해 LDL(저밀도 지질단백질)의 항산화 활성을 실험한 결과, 5종의 변이체 중 V156K와 A158E가 우수한 항산화 활성을 나타내었고, 콜레스테롤을 간세포로 전달하는 능력을 공초점 형광주사현미경, 형광측정기 및 섬광계수기로 측정한 결과, 5종의 변이체 중 V156K와 A158E가 우수한 전달 활성을 보여주었다.

따라서, 본 발명에 따른 proapo A-I 변이체를 직접 사용하거나, 이들을 유효성분으로 함유하는 재조합 고밀도지단백질의 형태로, 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 또는 치료제로 사용될 수 있다.

상기 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 또는 치료제는 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 상기 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 또는 치료제는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 근육 냉, 경피적, 폐속, 피하, 피내, 경막내로 뺨, 항문, 질, 결막 또는 비강 내조직을 통해 또는 종양 조직과 같은 조직 내로 접종하거나 또는 이식방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 proapoA-I 변이체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

또한, 상기 유효성분의 투여 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 15 ∼ 45 mg/일이고, 바람직하기로는 45 ∼ 80 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 ∼ 수회, 바람직하기로는 하루 2 ∼ 3 회 분할 투여할 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: proapo A-I의 유전자 서열

243개의 아미노산을 가지는 apo A-I 단백질(서열번호 1, 243 aa)[도 1]은 발현 수율이 낮고, 분리과정에서 안정하지 않으므로, WT(Wildtype) apo A-I의 아미노말단에 15개의 아미노산(Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln-서열을 포함)을 더 가지는 WT proapo A-I 유전자(서열번호 2, 258 aa)[도 1]를 pET30[Novagen 사] 발현벡터에 클로닝하여 사람 apo A-I의 발현벡터(pET30a-proapoA-I)를 구축하였다[Cho and Jonas, 2000, J. Biol. Chem. 275: 26821-26827]. 상기 벡터로부터 생산되는 proapo A-I는 아미노말단에 (His)₆-tag (5 kDa)을 가지므로 전체 단백질 크기는 SDS-PAGE 상에서 32 ∼ 33 kDa에 해당한다.

실시예 2: proapo A-I 주형 DNA 클로닝

본 발명에서 제시하는 WT proapoA-I cDNA는 (His)6-tag을 아미노 말단에 가지며 벡터 pET30(Novagen, WI)에 클로닝되어 있다. 이때 벡터의 크기가 6.2 kb 정도로서, 변이체를 코딩하는 cDNA 생산을 위한 PCR에 주형으로 사용하기에 부적절하므로, Kpn I과 Hind III 제한효소를 처리하여 proapo A-I cDNA (795 bp) 삽입물[도 2, 서열번호 3]만을 잘라내어, pBlue ScriptII SK(+)[Stratagene 사]에 삽입하여 PCR에 사용할 주형 DNA를 클로닝하였다. 이렇게 제작된 벡터 pBlue ScriptII SK-proapo A-I[도 3]가 대장균 DH5@에 도입되어 형질전환된 대장균 DH5@/pBlue ScriptII SK-proapo A-I를 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2004년 6월 7일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCTC 10651BP를 부여받았다.

실시예 3 : proapo A-I 변이체의 생산 및 발현 벡터 구축

본 발명에서 제시하고 있는 5종의 proapo A-I 변이체(A154E, H155E, V156K, D157K, A158E)를 생산하기 위하여 Pfu DNA 중합효소를 이용한 PCR 반응으로 변이체cDNA를 생산하였다. 이때 상기 실시예 2에서 분리한 pBlue ScriptII SK-proapo A-I을 주형 DNA로 사용하고 다음 표 2와 같이 합성한 각 프라이머와 킷트[QuickChange site directed mutagenesis kit, Stratagene]를 사용하여 변이체 cDNA들을 생산하였다.

[표 2]

상기 표 2에서 보는 바와 같이 프라이머들은 36-mer들로 제작되었고, PCR 반응 후 Dpn I을 PCR 생성물에 처리하여 모든 주형 DNA(parental DNA)를 제거하고, 생산된 유전자 클론 중에서 정확한 변이체를 제한효소 처리로 일차적으로 선별하였다. 이때 특정한 제한 시퀀스를 각 프라이머 마다 포함되도록 다음 표 3에 표시한 바와 같이 디자인하였다. 이는 모든 PCR 생성물들을 DNA 시퀀싱으로 확인하는데 드는 경제적, 시간적 비용을 최소화할 수 있는 방안이다.

다음 표 3은 제한효소 처리로 proapo A-I 변이체의 생산을 확인한 것으로, 동그라미는 해당 제한 효소가 작용함을 뜻하고, 가위표는 작용하지 않음을 뜻한다. 또한, 예상되는 절단 단편의 크기와 전기영동상의 밴드 크기를 대조하여 변이체 생산을 위한 돌연변이가 잘 일어났는지를 판단하였다.

[표 3]

위와 같이 PCR 반응으로 클로닝된 apo A-I 변이체 DNA의 크기는 약 0.8 kb이었고, A154E, D157K 그리고 A158E에 대한 정확한 변이체를 선발하기 위해 제한효소를 Afl III, H155E인 경우 Pvu I 그리고 V156K에 대해서는 Sma I 제한효소를 사용하여 각각의 변이체들을 선별, 확인하였다[표 3, 도 4 참조]. 도 4에서 보는 바와 같이 각 생산된 클론들에 대해 표 3에서 예시한 제한효소처리로 정확히 형성된 변이체들을 선별하였다. A154E (A), D157K (D) 그리고 A158E (E)인 경우 Afl III 처리로 2962 bp와 746 bp의 band가 관찰되었다. H155E (B)에서는 Pvu I 제한효소에 의해 3개 (2011, 1046, 651 bp)의 밴드가 확인되어 변이체임을 알 수 있었고, V156K 변이체 (C)는 Sma I 처리로 2개 (3405, 303 bp)의 밴드를 확인할 수 있었다.

제한효소 처리로 일차 선별된 변이체 클론들을 DNA 시퀀싱을 통해 정확한 변이체 위치 확인 및 완벽한 전장(full-length) cDNA 서열을 확인하였으며, 확인된 변이체들은 WT apo A-I과 같이 벡터 pET30a(+)에 서브클로닝하였고, 대장균(BL21) 컴피턴트 셀(competent cell)에 형질도입하여 카나마이신(Kanamycin)-LB 배지에서 콜로니를 선별하고, Kpn I 과 Hind III로 처리하여 도 4에서 보는 바와 같이 삽입물 유전자의 존재를 확인하였다.

실시예 4: 대장균으로부터 WT와 변이체들의 발현 및 생산

실시예 3과 같은 유전자 조작을 통해 확보된 각 변이주 cDNA 들을 DNA 시퀀싱으로 변이 아미노산 부분과 전체 아미노산 서열을 확인하였다. 확인된 변이체 cDNA들을 다시 pET30a (+) 벡터에 클로닝하여 Kpn I 과 Hind III로 처리하여 삽입물 DNA의 크기를 확인하였다[도 5]. 대장균 BL21 발현 호스트에 각각의 발현벡터를 온도 충격을 주어 형질전환을 통해 주입하였다.

형질전환된 대장균 BL21/pET30-V156K-proapo A-I를 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2004년 6월 7일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCTC 10652BP를 부여받았다.

또한, 형질전환된 대장균 BL21/pET30-A158E-proapo A-I를 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2004년 6월 7일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCTC 10653BP를 부여받았다.

형질전환된 대장균 BL21/pET30a-proapoA-I 변이체 클론을 250 ㎖ LB-카나마이신에서 배양하여 일정한 셀 농도에 도달하면 (OD₆₀₀≥0.7), 최종농도 1 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 처리하여 단백질 생산을 유도하고 변이체에 따라 단백질의 발현량이 가장 많은 배양시간을 조사하여(1 ∼ 4시간) 배양하였다. 이 후 배양액을 원심분리(6,000 ×g)하여 세포 펠렛(cell pellet)을 모두 회수하고, 초음파 파쇄(sonication)를 통해 세포막을 부수어 전체 단백질을 노출시킨 후 6 M Gnd-HCl이 포함된 4 ℃ 완충용액에서 18시간 이상 용출 (solubilization)하였고, 이들 단백질 용액을 Ni-NTA(Qiagen) 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 apoA-I 변이체만을 분리하였다. Ni²⁺-컬럼을 통해 용출된 단백질을 TBS 완충용액(10 mM Tris/140 mM NaCl/1 mM EDTA, pH 8.0)로 투석하여 이미다졸을 제거하고, 단백질 정량을 실시한 결과 모든 변이체 발현과 분리에서 약 5 ∼ 10 mg 정도의 단백질을 얻을 수 있었다. 이들은 전기영동(12% SDS-PAGE)으로 비교해 본 결과 도 6에서 보는 바와 같이, 95% 이상의 순도를 보이며 모두 28 kDa의 단백질과 5 kDa의 his-tag이 결합되어 분자량 33 kDa의 단백질 밴드를 보여 주었다 (lane 1과 6).

상기와 같이 합성된 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 19 내지 23으로 나타내었다.

서열번호 19는 Poly(His)₆-proapo A-I-A154E: apo A-I의 154번 아미노산(Ala)이 글루탐산으로 치환되었다.

서열번호 20은 Poly(His)₆-proapo A-I-H155E: apo A-I의 155번 아미노산(His)이 글루탐산으로 치환되었다

서열번호 21은 Poly(His)₆-proapo A-I-V156K: apo A-I의 156번 아미노산(Val)이 라이신으로 치환되었다.

서열번호 22는 Poly(His)₆-proapo A-I-D157K: apo A-I의 157번 아미노산(Asp)이 라이신으로 치환되었다.

서열번호 23은 Poly(His)₆-proapo A-I-A158E: apo A-I의 158번 아미노산(Ala)이 글루탐산으로 치환되었다.

실시예 5: proapo A-I-변이체들의 인지질재합성 및 his tag 절단

5 kDa의 크기를 가지는 poly(his)₆-tag을 제거하기 위한 엔테로키나아제[Roche 사]의 처리 시에 나타날 수 있는 비특이적인 단백질 절단을 방지하고 원래형태의 proapo A-I을 보호하기 위하여 다음과 같이 이들을 rHDL로 합성하였다. 난황인지질(egg phosphatidylcholine)과 콜레스테롤을 (인지질:콜레스테롤:proapo A-I=95:5:1, 몰비)로 혼합한 후 , 질소가스 하에서 완전 건조시키고 TBS 완충용액에서 리포솜을 형성시키고, 소디움 콜레이트(sodium cholate, 30 mg/ml)와 각 단백질을 넣어 1시간동안 4 ℃에서 배양하고 24시간동안 TBS 완충용액에 대하여 투석하면서 rHDL의 형성을 유도하였다. 형성된 rHDL 혼합물에 엔테로키나아제를 처리하여(1/1200, wt/wt), 실온에서 배양하였다. 적절한 반응조건과 시간을 조사하기 위해, 반응이 진행되는 동안 0, 12, 24, 36 및 43 시간까지의 반응물을 취하여 SDS-PAGE로 분석한 결과, 도 6과 같이 시간에 따라 His-tag만 선택적으로 제거되며, 43시간까지 28 kDa의 proapoA-I 단백질들이 늘어남을 알 수 있었다

실시예 6: proapo A-I-변이체로부터 지질의 제거 및 단백질 분리

엔테로키나아제 처리 후 지질을 제거하기 위해 에탄올과 디에틸에테르 혼합용액(3/2, v/v)을 단백질수용액에 5배 부피로 넣어 1시간동안 교반하는 것을 2회 이상 반복하고, 헥산과 이소프로판올 혼합용액(3/2, v/v)에 의해 인지질만을 제거하고, 상기와 같이 his-tag이 제거된 28 kDa의 proapo A-I 들을 5 kDa 의 His-tag과 33 kDa의 His-tag을 포함하는 단백질들로부터 분리하기 위하여, Ni²⁺-NTA-컬럼 크로마토그래피를 한번 더 사용하여 proapo A-I 변이체 단백질들을 분리하였다. 분리된 단백질들을 SDS-PAGE 하여, 도 7과 같은 전기영동 사진을 얻었다.

실시예 7: proapo A-I-변이체의 교차결합(crosslinking) 및 다량화 패턴 분석

WT proapo A-I은 분자간 상호작용과 자가 결합(self-association) 경향이 우수하여 크로스링커(crosslinker)에 의하여 쉽게 교차결합된다. 각 변이체들을 각 농도별로 (0.05, 0.1, 1, 2 ㎎/㎖) 11.4 Å의 길이를 갖는 BS3(Bis-sulfosuccinimidyl suberate)와 반응시키고, 생성물을 8 ∼ 25% SDS-PAGE (Pharmacia Phast System)로 전개하여 이량체(dimer), 삼량체(trimer), 사량체(tetramer)의 자가 결합능을 비교한 결과는 도 8과 같다.

대부분의 WT proapo A-I과 변이체들이 지질로 유리된 상태에서 단량체 (monomer)가 우세하고, 이량체(dimer), 삼량체(trimer), 사량체의 다량화(multimerization) 경향을 보이는데 비해, 놀랍게도 V156K는 90% 이상이 단량체로만 존재하고 삼량체와 사량체는 검출되지 않았다. 또한, A158E는 단량체가 매우 적고, 이량체의 비율이 80% 이상 대부분을 차지하였다. 이는 V156K (lane 4)는 교차결합반응에 참가하지 않는 경향이 뚜렷하며, 반대로 A158E (lane 6)는 대부분의 분자들이 교차결합에 참여함을 의미한다.

실시예 8: proapo A-I-변이체들의 LDL에 대한 항산화 활성 분석

LDL의 산화를 억제하는 것은 동맥경화 치료와 예방의 근본적인 치료책이 된다고 보고되고 있는 바, 원심분리를 통해 순수하게 분리된 LDL(0.12 mg/ml)에 산화제인 구리(Cu²⁺) 이온을 최종 5 μM 되게 첨가하여 산화를 유도하면서 산화억제제로 본 발명에서 제안하고 있는 proapo A-I과 그 변이체 단백질들을 각각 첨가하여 일정시간동안 TBA(thiobarbituric acid) 반응시키고, 반응 후 생성되는 말론다이알데하이드(MDA)의 양을 정량하여 산화억제제로서의 능력을 조사하였다. 반응에 사용된 LDL은 0.19 μM이었고, 산화억제제의 양성대조군으로, 시판되는 항산화제인 프로부콜(probucol)을 4 μM을 사용하였다. 반응 혼합물은 10 ㎕의 LDL과 CuSO₄농도에 맞는 적당량의 proapo A-I-변이체, 그리고 PBS(phosphate buffer saline)으로 최종 250 ㎕의 부피가 되었다. 이 후 4시간 동안 37 ℃에서 반응시키고, 20% TCA(trichloroacetic acid)를 첨가하여 반응을 멈추었다. TCA 처리 후, 0.67% TBA를 1 ㎖ 첨가하고 완전히 혼합 후 95 ℃에서 15분 동안 열을 가하였다. 이때 산화물의 생성으로 반응혼합물의 색에 변화가 생기게 된다. 원심분리를 이용하여 혼합물을 침강시키고 나면 상등액에 생성된 MDA의 값을 분광광도계(Agilent Technologies, Germany)로 측정하여 항산화 활성정도를 분석할 수 있다.

그 결과 본 발명에서 제안하고 있는 WT proapo A-I과 그 변이체들이 최종농도 290 pM이 첨가된 조건에서 좋은 항산화 활성을 보였고, 145 pM이 첨가된 조건에서는 WT이나 다른 변이체에 비해 V156K와 A158E는 월등한 항산화능력을 보여 주었다. 이들의 항산화 능력은 최종농도 29 pM이 첨가된 조건에서는 대부분 상실되었다[도 9].

도 9의 TBARS 방법에 의한 항산화 결과를 검증하기 위해 반응 후의 LDL 반응물 일부를 취하여 0.7% 아가로오스 겔을 사용하여 전기영동하였다. 산화가 많이 진행된 LDL일수록 겔 상에서 더 빨리 아래로 이동하는 원리를 이용하여 반응 전의 LDL(native LDL)과 반응 후의 LDL을 동시에 전기영동한 결과, 290 pM의 단백질들이 첨가되었던 LDL들은 거의 반응 전의 LDL(native LDL)과 같은 위치에서 존재하고, 오히려 양성대조군(4 μM probucol)이 첨가된 LDL보다 더 위쪽에 단백질 밴드가 위치하는 것으로 보아, 산화가 더욱 일어나지 않았음을 알 수 있었다. 145 pM의 V156K 혹은 A158E가 첨가된 LDL들이 반응 전의 LDL(native LDL)과 같은 위치에 존재하는 것으로 보아 TBARS의 결과와 같이, WT이나 다른 변이체보다 더 강력한 LDL-항산화 능력을 가짐을 확인할 수 있었다[도 10].

상기 결과들을 다시 확인하기 위해 구리이온(최종 5 μM)을 첨가하여 LDL의 산화를 유도하면서 생성되는 산화물인 컨쥬게이트된 다이엔(conjugated diene)의 농도를 최종농도 145 pM이 첨가된 WT과 변이체들간에 비교하였다. 생성되는 컨쥬게이트된 다이엔의 양은 자외선 234 nm에서의 흡광도를 비교하여 정량하였다. 도 11에서 보는 바와 같이, V156K와 A158E는 컨쥬게이트된 다이엔의 생성을 완전히 저해하며, 양성대조군(10 μM probucol) 보다 더 우수한 LDL-저해활성을 보여주었다. H155E 혹은 D157K는 WT 보다 열등한 LDL-항산화 활성을 보였으며, 양성대조군보다 더 열등하였다.

실시예 9: 원편광 이색성 분광법을 이용한 proapo A-I-변이체들의 단백질 2차 구조 분석

WT proapo A-I과 proapo A-I-변이체들의 알파-헬릭스(α-helix) 조성을 측정하여 2차 구조를 분석하는 방법으로, 원편광 이색성 분광법(circular dichroism spectroscopy)을 분석하였고, J-700 분광편광기[Jasco, Tokyo, Japan]를 사용하였다. proapo A-I-변이체들의 헬리시티 정도는 0.1 cm의 패스렝스(pathlength)를 가지는 석영 원편광 이색성 큐벳(cuvette)을 이용하여 1.0 nm의 밴드폭, 4 초간의 응답 시간으로 250 ∼ 190 nm의 범위내의 스펙트럼을 스캔한 후 222 nm에서의 타원율(ellipticity)을 구하고 각 단백질의 평균 아미노산 분자량을 계산하여 알파-헬릭스의 양을 결정하였다[Chen 등, 1972, Biochemistry 11:4120-4131]. 단백질들 간의 자가 결합(self-association)을 막기 위해, 0.07 mg/㎖로 단백질들을 희석하고, 재조합 rHDL은 0.1 mg/㎖로 희석하여 사용하였다. 모든 스캔은 4번씩 실시하고 여기서 얻은 평균치로 알파-헬리시티 비율을 계산하였다. 그 결과로 도 12와 같은 스펙트럼을 얻었으며, 지질 유리상태(lipid-free)와 지질 결합상태(lipid-bound) 모두에서 모든 단백질들이 208과 222 nm에서 최저값을 보이는 전형적인 알파-헬릭스 단백질의 패턴을 보여주었다. 또한, 지질이 결합된 상태가 되면서 더 낮은 타원율을 보여 지질과의 결합을 통해 알파-헬릭스의 함량이 증가함을 알 수 있었다. 지질 유리상태에서 특이할 만한 점은 V156K와 A158E의 타원율이 WT 보다 알파-헬릭시티가 낮은 것으로 나타났고, A154E와 H155E, D157K는 WT 보다 높은 것으로 나타났다. 지질 결합상태에서는 V156K만 WT 보다 높은 타원율을 보였고, A154E, H155E, D157K와 A158E는 WT 보다 낮은 타원율을 보였다. 이 결과는 알파-헬릭스의 함량을 계산한 결과에 사용되어 각 단백질별로 다음 표 4와 같은 알파-헬릭시티를 보여주었다. 지질 유리상태에서 WT이 54 ±4%의 알파-헬릭시티를 보일 때 V156K와 A158E는 각각 40 ±3%와 49 ±3%를 보여 WT 보다 더 낮은 값을 보였고, A154E, H155E, D157K는 WT 보다 높은 알파-헬릭시티를 보였다. 그 중에서도 D157K는 63 ±5%로 가장 높은 알파-헬릭시티를 보였다. 지질 결합상태에서, WT, A154E, D157K는 74 ∼ 76% 내외로 유사한 값을 보였으나, V156K와 A158E는 65% 내외의 낮은 값을 보여 지질 결합과정에서 알파-헬릭시티가 증가하는 경향이 WT의 증가량만큼 크지 않음을 시사한다.

[표 4]

지질 유리상태 또는 지질 결합상태에서 원편광 이색성 분광과 형광 측정 및 겔 전기영동과 전자현미경 관찰을 통한 rHDL의 크기 비교.

주) 1. EM: 전자현미경; GGE: 겔 전기영동; WMF, 최대 형광 파장

2. NA: not applicable; -, not determined

3. 상기 표의 모든 POPC-rHDL은 POPC : 콜레스테롤 : proapo A-I의 분자비 95:5:1을 사용하여 소디움 콜레이트 투석방법[Matz and Jonas, 1982, J. Biol. Chem. 257:4535-4540]으로 합성하였다.

실시예 10 POPC-rHDL의 입자 크기 측정

팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC) 재조합 rHDL의 내부 디스크의 형태를 관찰하기 위해 이전에 보고 된 방법[Minnich 등 1992, J. Biol. Chem. 267:16553-16560; Gorshkova 등 2002, Biochemistry, 41:10529-10539]을 사용하여 전자현미경 관찰을 실시하였다. 각각의 proapo A-I-변이체 rHDL은 증류수를 사용하여 0.5 mg/ml의 최종농도를 맞춘 후, 포름바 카본(Formvar carbon) 코팅이 되어있는 구리 그리드(copper grid) 위에 떨어뜨렸다. 완전히 마른 그리드를 소디움 포스포텅스테이트(sodium phosphotungstate)로 네거티브 염색을 실시한 후 필립스 CM20 전자현미경[Philips Electron Optics, Eindhoven, The Netherlands]을 사용하여 관찰하고 촬영하여 180,000배의 배율에서 비교하였다.

실시예 11: 형광을 이용한 proapo A-I-변이체들의 트립토판 형광활성 분석

WT proapo A-I과 본 발명에 따른 구조물인 변이체들 내에 존재하는 트립토판 잔기(tryptophan residues)의 최대 형광 파장(wavelengths of maximum fluorescence, WMF)을 측정하기 위해 LS50B 분광형광기[Perkin-Elmer, Norwalk, CT]를 사용하였다. 각 샘플은 0.07 ∼ 0.1 mg/ml의 농도에서, 1 cm의 패스렝스, 석영 수프라실 큐벳(Fisher Scientific, Pittsburg, PA)을 이용하여 수행하였다. 기록한 데이터는 4번의 스캔을 평균하여 구하였고 윈랩(winLab) 소프트웨어 펙키지 4.00 (Perkin-Elmer)으로 분석하였다. 단백질 시료에 존재하는 타이로신 형광의 활성화를 피하기 위해 295 nm에서 활성을 시켰고(Ex=295 nm), 305 ∼ 400 nm의 파장에서 방출 스펙트럼(Emission spectrum)을 측정하였다. 모든 스펙트럼은 상온에서 기록하였다. 그 결과는 상기 표 4와 같이, 지질 유리상태에서 WT와 대부분의 변이체들은 336 ∼ 338 nm의 WMF를 보이는데 비해, A158E 변이체는 340 nm의 WMF를 보여주었다. 이는 A158E가 갖는 단백질 구조의 차이로 인해 다른 변이주단백질 혹은 WT 보다 Trp 잔기가 더욱 수용액상으로 노출되었음을 나타내는 것으로 해석된다. POPC-rHDL로 합성된 상태에서 WT proapo A-I은 지질 결합상태가 되면서 WMF가 지질 결합상태 보다 2 ∼ 3 nm 감소하는 경향을 보이는데, WT과 다른 변이체들은 334 ∼ 336 nm의 WMF를 보여주었다. 그러나, V156K와 A158E는 337 nm의 WMF 파장을 보였는데, 이는 이들 단백질들이 지질과 결합하는 과정을 거치면서도 내부 Trp의 노출정도가 변화하지 않았음을 시사한다. 따라서, V156K와 A158E는 지질 결합과정에서 단백질의 3차원구조 변화의 차이가, 다른 변이체들에 비해 적었음을 시사한다. 이 결과는 실시예 9에서 설명한 바와 같이 V156K와 A158E는 지질 결합과정에서 알파-헬릭시티가 증가하는 경향이 WT의 증가량만큼 크지 않았던 결과와 잘 일치한다.

실시예 12: proapo A-I-변이체들의 DMPC 인지질 결합 능력 비교

디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC)을 이용하여 proapo A-I 변이체들이 지질과 결합하는 능력을 관찰할 수 있다. 본 실험의 진행은 Pownall 등[1978, Biochemistry 17:1183-1188]의 방법을 일부 변형시켜 수행하였다. 건조한 분말 DMPC를 pH 8.0의 TBS(10 mM Tris-HCl, 160 mM NaCl, 1 mM EDTA) 완충용액에 최종 농도 3.5 mg/ml로 녹여 다층판 리포좀(multilamellar liposomes)을 만들었다. 반응에 참여하는 단백질의 최종 농도는 0.15 mg/ml이고, DMPC와 단백질의 비율을 2:1(w/w)로, 총 반응혼합물의 양은 0.76 ml로 한정하였다. 반응물을 잘 혼합한 후 UV-Visible 분광광도계[Agilent Technologies, Waldbronn, Germany]를 사용하여 24.5 ℃에서 325 nm의 흡광도로 매 2분마다 값을 읽어 시간이 경과함에 따라 단백질에 의해 DMPC 인지질의 혼탁도(turbidity)가 감소하는 경향을 비교하였다.

도 13에서와 같이, A158E는 가장 낮은 DMPC 결합능력을 보여주었는데(반감기 T_1/2=26 ±2 분), 이는 알라닌 158번이 인지질 결합에 중요하게 관여함을 시사한다. A154E-변이체는 WT 보다 더 향상된 인지질 결합능력을 보여주었고(T_1/2= 5 ±2 분), H155E, V156K, D157K는 WT proapo A-I 수준 (T_1/2=12 ±2 분)의 인지질 결합능력을 보여주었다.

실시예 13: Wildtype proapo A-I과 그 변이체를 이용한 재조합 고밀도지단백질 (reconstituted HDL) 합성

생산된 WT proapo A-I과 그 변이체들을 각각 인지질인 POPC (palmitoyloleoylphosphatidylcholine)와 콜레스테롤과 함께 혼합하여 소디움 콜레이트 투석방법[Matz and Jonas, 1982, J. Biol. Chem. 257: 4535-4540]으로 rHDL을 재합성하였다. 재합성에 사용한 인지질, 콜레스테롤과 변이체의 분자 비율은 95:5:1 또는 40:0:1 (몰비)이었다. 합성된 rHDL들을 nondenaturating 8 ∼ 25% 폴리아크릴아마이드 구배 겔에서 전기영동한 결과, 도 14의 A와 같이 95:5:1을 사용한 합성에서는 대부분 97 Å의 크기를 가지는 rHDL이 우세하게 합성되었지만, V156K-변이체와 A158E-변이체는 120 Å 이상의 증가된 크기의 rHDL로 만들어 졌다. 도 14의 B에서와 같이, 40:0:1을 사용한 합성비에서는 97, 78, 83, 76, 93, 115 Å 등의 단백질별로 다양한 rHDL이 재합성되었다.

실시예 14: proapo A-I-변이체-rHDL의 교차결합 및 다량화 경향 분석

실시예 12에서 합성된 rHDL 들의 내부에 몇 분자의 proapo A-I이 존재하는지 조사하기 위하여 실시예 7에서와 같은 방법으로 각 rHDL들을 대상으로 BS₃을 이용한 교차결합을 실시하였다. 완성된 재조합 rHDL에 포함되어 있는 proapo A-I 변이체의 양과 proapo A-I-변이체들의 자가연합 성질을 측정하기 위해 Staros[1982, Biochemistry 21:3950-3955]의 방법에 따라 1 mg의 각 단백질들과 BS₃을 이용한 교차결합을 실시하였다. 교차결합 반응물의 분석은 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.

그 결과 도 15와 같이 A158E를 제외한 변이체들과 WT proapo A-I은 이량체의 분자량을 우세하게 보이므로 두 분자의 proapo A-I이 rHDL을 구성하는 것으로 파악되지만, A158E는 95:5:1의 합성비율에서 사량체의 분자량을 보임으로써 네분자의 proapo A-I이 rHDL을 구성하는 것으로 파악된다. 40:0:1의 합성 비율을 사용 했을 때, 특이할만한 점은 V156K-rHDL은 모든 proapo A-I 분자가 이량체화되는 크로스링킹 반응에 참여한다는 것이다. 또한, 이때에도 A158E-rHDL은 이량체, 삼량체, 사량체의 분자량 밴드를 보여줌으로써 다른 변이체나 WT 보다 더 많은 proapo A-I 분자가 rHDL의 형성에 참여함을 보여주었다.

실시예 15: proapo A-I-변이체-rHDL의 LCAT 활성화 능력 비교

apo A-I의 중요한 기능중의 하나는 HDL에 부착되어 있는 효소중의 하나인 LCAT(레시틴:콜레스테롤 아실트란스퍼레이즈)을 활성화시키는 것이다. 본 발명에서 제안하고 있는 proapo A-I 변이체들과 WT를 대상으로 실시예 13에서와 같은 방법으로 95:5:1의 인지질:콜레스테롤: proapo A-I의 분자비율을 사용하여 합성하였고, 다만 반응후의 생성물인 콜레스테롤 에스테르를 쉽게 검출하기 위해, 방사능동위원소가 표지된 콜레스테롤을 정상적인 콜레스테롤 분자에 비해 100:1의 비율로 소량 첨가하여 사용하였다.

방사능 동위원소가 표지된 콜레스테롤을 함유하는 각 POPC-rHDL을 기질로 하고, 초원심분리를 통해 지질단백질을 제거한 혈청(LPDS, d<1.21 bottom fraction)을 LCAT 효소원으로 이용하였다. 0.5 ㎖의 총 반응 혼합물은 방사능표지 콜레스테롤(1 mCi of [¹⁴C]/69 mg cholesterol/1.0 mg of apoA-I)을 가지고 있는 POPC-재조합 rHDL(POPC:cholesterol:proapoA-I, 95:5:1)과 4%의 지방산이 제거된 소 혈청 알부민, 4 mM의 베타-머캅토에탄올로 구성되어 있다. 반응은 25 ㎕의 LPDS(5.4 mg/ml)를 첨가하고, 37 ℃에서 1시간동안 진행하였다. 또한, POPC-rHDL의 농도는 각 proapo A-I의 농도를 1.0 ×10^-6 에서 2.5 ×10^-7 M 까지 다양하게 사용하였다. 반응 후 전체 반응물을 클로로포름:메탄올(2:1, v/v)을 첨가하여, 콜레스테롤을 추출하고, TLC(Thin layer chromatography) 을 이용하여 기질인 콜레스테롤과 생성물인 콜레스테롤 에스터를 분리하고, 분리된 각 기질과 반응물의 방사능량을 신틸레이션 카운팅(scintillation counting)으로 측정하여 효소활성도를 계산하였다..

표 5와 도 16에서 보듯이 V156K-rHDL과 A158E-rHDL은 WT proapo A-I-rHDL에 비해 2% 미만의 낮은 활성만을 보였는데, LCAT의 활성화 능력이 거의 상실된 것으로 나타났다. A154E와 H155E 변이체들은 WT와 유사한 수준의 활성을 보였으며, D157K는 WT에 비해 40% 정도의 활성을 보였다. 대략적인 활성도(Vmax)와 기질 친화도(Km)는 표 5에 표시하였다.

apo A-I Milano의 mimetic peptide는 LCAT을 전혀 활성화시키지 못하는 것으로 보고되었다[Jia et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 297: 206-213]. 따라서, LCAT을 활성화시키지 못하는 것이 apo A-I milano와 유사하며, 동맥경화 치료에 도움이 될 수 있다고 사료된다.

실시예 16: proapo A-I-변이체-rHDL들의 간세포로 콜레스테롤을 전달하는 능력 비교

콜레스테롤 역수송경로(Reverse cholesterol transport pathway)에서 HDL의 주요한 기능중의 하나는 주변 세포(peripheral cells)가 사용하고 남은 잉여 콜레스테롤을 간조직으로 수송, 전달하는 것이고, 간 조직 표면에서 콜레스테롤을 인식하는 수용체인 스캐벤저 리셉터(scavenger receptor, B-I)를 통해, 간세포 내부로 유입되고 분해대사과정을 거칠 수 있다. 본 발명에서 제안하고 있는 apo A-I 변이체들을 실시예 13에서와 같이 rHDL의 형태로 인지질:콜레스테롤:apo A-I의 분자비율을 95:5:1로 합성하되, 형광을 띠는 콜레스테롤인 NBD-콜레스테롤을 100:1의 비율로 첨가하였다. 따라서, rHDL들의 콜레스테롤이 띠는 형광을 추적함으로써 세포내로 콜레스테롤이 전달되는 효율을 비교할 수 있다. 간세포주인 HepG2에 동일한 양의 rHDL을 처리하여, 18 ∼ 24시간 동안 배양한 후, PBS로 3회 세척한 후 세포내로 유입된 콜레스테롤의 양을 공촛점 형광주사현미경(confocal fluorescence scanning microscope)을 사용하여 관찰한 결과는 도 17과 같이 V156K-rHDL이 간세포 속으로 콜레스테롤을 전달하는 능력이 가장 뛰어나며, A158E-rHDL도 WT-rHDL보다 더 우수한 전달능력을 보여주었다. 또한 V156K는 apo A-I Milano 보다 더 우수한 활성을 보여주었다. 도면 17의 상단사진은 NBD-콜레스테롤을 검출하기 위해 형광필터(Ex=488 nm, Em=540)를 이용하여 촬영한 사진이며, 하단 사진은 세포의 윤곽을 보기 위해 광학 DIC 이미지로 촬영한 사진이다. 세포의 수와 윤곽이 동일함에도 불구하고, rHDL의 종류에 따라 콜레스테롤이 유입되는 정도가 다름을 잘 보여주고 있다. 이 결과를 확인하기 위해 세포주가 붙어있는 플레이트 바닥 전체의 형광을 PBS로 세척한 후, 형광검출장치[Victor2 optical microplate reader, Perkin Elmer]를 사용하여(Ex=460 nm, Em=534 nm) 세포전체에 유입된 형광의 양을 비교한 결과, 도 18과 같이 3시간째부터 18시간까지 V156K-rHDL의 콜레스테롤 전달능력이 WT에 비해 4배 이상으로 가장 우수하고, A158E-rHDL가 두 번째로 우수하여 WT에 비해 2배 이상의 전달능력을 보여주었다. 이는 공초점 형광주사현미경의 관찰결과와 잘 일치하였다. R173C-apo A-I (apoA-I Milano)는 배양 시작부터 6시간까지는 세포 내로 콜레스테롤의 유입이 WT이나 A158E-rHDL 보다 우수하나, 12 시간째부터 감소하여 18 시간까지는 A158E-rHDL 보다 낮은 전달활성을 보였다. 따라서, 본 발명에서 제안하고 있는 V156K-propao A-I-rHDL과 A158E-proapo A-I-rHDL은 타발명에서 제안하고 있는 R173C-apo A-I 보다 우수한 콜레스테롤 전달활성을 보이고 있다.

이 결과를 다시 확인하기 위해 방사능동위원소가 표지된 콜레스테롤인 [¹⁴C]-콜레스테롤을 포함하는 rHDL(1 mg/ml of apoA-I)을 실시예 13에서와 같이 각 변이체 별로 만들어, 건강하게 배양되고 있는 HepG2 세포 (1 ml 배지, 6-well plate) 에 처리하였다. 처리 직후 18시간까지 일정 시간간격으로 세포를 회수하여 배지를 버리고, 회수된 세포들을 알칼리 분해하여 세포막을 깨고, 교반하여 모든 세포질이 노출되도록 한 후 신틸레이션 카운팅으로 방사능량을 측정하여, 같은 농도의 rHDL이 처리되었을 때 proapo A-I 변이체별로 세포 내로 전달되는 콜레스테롤의 양을 비교하였다. 그 결과는 도 16 및 도 17과 같이 18시간 동안 V156K와 A158E의 rHDL들이 WT에 비해 30% 이상 콜레스테롤을 더욱 많이 전달함을 알 수 있었다. 이 결과는 도 18의 결과와 일치하며, V156K와 A158E의 rHDL들이 혈중 콜레스테롤을 스캐벤저 리셉터 B-I를 통해 간세포로 제거하는 능력이 WT이나 R173C-apo A-I(apo A-I Milano)보다 더욱 우수함을 시사하는 증거이다.

또한, apo A-I의 중요한 기능인 힌지 도메인 무브먼트(hinge domain movement)와 LCAT-활성화, 그리고 rHDL의 입자구조 유지에 중요한 역할을 하는 6번 헬릭스(143 ∼ 164 amino acid) 도메인을 Protean 5.0.7 소프트웨어(DNASTAR, USA)로 분석하였다. 이 분석을 통해 본 발명에서 생산된 변이체들의 도메인 내에서의 역할을 평가할 수 있는데, 도 19에서 보는 바와 같이, apo A-I의 6번 헬릭스 도메인을 헬릭스 축의 위에서 내려다보면, 비극성 아미노산(소수성 아미노산)과 극성 아미노산(친수성 아미노산)의 분포가 대칭을 이루는 전형적인 양극성 헬릭스(amphiphatic helix)를 보여주고 있다. 점선으로 표시한 바와 같은 소수성 잔기영역과 친수성 잔기영역의 대칭의 지점에 존재하는 소수성의 Val156번과 Ala158번을 각각 (+) 전하와 (-) 전하의 아미노산으로 치환하여 양극성 헬릭스의 배열을 방해하였을 때의 효과를 보고자 하였다. 이들 아미노산들을 전하가 강한 아미노산으로 치환하면 V156K 혹은 A158E와 같이 암피필리시티(amphiphillicity) 가 붕괴되고, V156K의 경우 149번 Arg과 156번 Lys의 정전기적 반발, A158E의 경우 147번 Glu와 158번 Glu와의 정전기적 반발로 도메인의 구조적 변화가 야기될 것으로 예측된다.

그 결과, 상기의 구조로 인하여 proapo A-I-V156K와 proapo A-I-A158E가 WT에 비해 우수한 약리적 효과들, 예를 들면, 월등한 LDL-항산화 활성(실시예 8), 증가된 rHDL의 크기(실시예 13), 상실된 LCAT 활성화 능력 (실시예 15), 향상된 콜레스테롤 전달 능력(간세포로의 전달, 실시예 16) 등을 가진다.

실시예 17: 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 proapo A-I 변이체를 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/kg/1 ㎖의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 500 mg/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

제제예 1: 주사제의 제조

주사제(2 ㎖ 기준):

proapo A-I 변이체 100 mg

소디움 클로라이드 18 mg

벤질 알콜 45 mg

주사용 증류수 2 ㎖

proapo A-I 변이체를 상기에 기재된 바와 같은 용제에 녹인 다음 멤브레인 필터를 사용하여 투명하게 될 때까지 여과하였다. 여과 후 용액을 앰플에 충진한 다음 고압증기멸균에 의해 완전 멸균하였다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 proapo A-I 변이체는 WT에 비해서 월등한 LDL-항산화 활성을 보여주었고, 콜레스테롤을 간세포로 전달하는 능력이 기존의 apoA-I-R173C 보다도 더욱 우수하여 고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제로서 매우 유용하리라 기대된다.

도 1은 proapo A-I 및 apo A-I의 아미노산 서열을 나타낸 것이다[밑줄친 부분은 apoA-I를 나타낸 것이다].

도 2는 proapo A-I의 염기서열을 나타낸 것이다

도 3의 A는 proapo A-I의 생산을 위한 벡터 pBlue ScriptII-SK-proapo A-I의 개열지도를 나타내고, B는 구축된 벡터 pBlue ScriptII-SK-proapo A-I과 삽입물(wild type proapoA-I) cDNA 밴드를 나타낸 것이다[M: 1 kb plus DNA ladder marker), 1 및 2: Kpn I 과 Hind III로 처리된 pBlue ScriptII-proapo A-I].

도 4는 적절한 제한효소 처리로 proapo A-I 변이체의 선발을 확인한 것이다[A: A154E, B: H155E, C: V156K, D: D157K, E: A158E].

도 5는 proapo A-I 변이체들을 발현벡터 pET30a에 클로닝한 것이다.[벡터의 크기: 5.6 kb, 삽입물의 크기: 0.8 kb; 1: A154E, 2: H155E, 3: V156K, 4: A158E].

도 6은 융합단백질(33 kDa)로부터 Poly(His)6-tag을 제거하기 위하여 엔테로키나아제를 처리한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 순수 분리된 proapo A-I과 변이체를 20% SDS-PAGE로 확인한 것이다.

도 8은 지질 유리상태에서 교차결합 반응 후의 proapo A-I과 변이체를 나타낸 것이다.

도 9는 TBARS(thiobarbituric acid reactive substances) 방법에 의한 proapo A-I과 그 변이체들의 LDL-항산화 활성을 확인한 것이다.

도 10은 아가로오스 겔 전기영동에 의한 proapo A-I과 그 변이체들의 LDL-항산화 활성 비교한 것이다.

도 11은 컨쥬게이트된 다이엔(Conjugated diene) 형성 모니터링을 통한 proapo A-I과 그 변이체들의 LDL-항산화 활성 비교를 나타낸 것이다.

도 12는 proapo A-I과 그 변이체의 알파-헬릭스 비율 측정을 위한 원편광 이색성 분광법을 통한 측정값을 나타낸 것이다.

도 13은 proapo A-I과 그 변이체들이 인지질막(dimyristoyl phosphatidyl choline, DMPC)과 반응하는 능력을 나타낸 것이다.

도 14는 Proapo A-I 또는 그 변이체들을 POPC를 사용하여 rHDL로 재합성한 것이다[A: POPC:콜레스테롤:proapo A-I = 95:5:1, B: POPC:콜레스테롤:proapo A-I = 40:0:1].

도 15는 POPC-rHDL 상태에서 교차결합 반응을 통한 다량화 경향 분석한 것이다.

도 16은 POPC-rHDL 상태에서 proapo A-I과 그 변이체들의 LCAT 활성능을 비교한 것이다.

도 17은 POPC-rHDL 상태에서 proapo A-I과 변이체(V156K, A158E)가 콜레스테롤을 간세포(Hep G2)로 전달하는 능력을 형광표지된 콜레스테롤을 공초점형광주사현미경(confocal microscopy)으로 측정한 것이다.

도 18은 POPC-rHDL 상태에서 Proapo A-I과 변이체(V156K, A158E)가 콜레스테롤을 간세포(Hep G2)로 전달하는 능력을 형광표지된 콜레스테롤을 형광측정기 (Victor2 optical microplate reader)로 측정한 것이다.

도 19는 POPC-rHDL 상태에서 Proapo A-I과 변이체(V156K, A158E)가 콜레스테롤을 간세포(Hep G2)로 전달하는 능력을 방사능 동위원소로 표지된 콜레스테롤을 섬광계수기(scintillation counter)로 측정한 것이다.

도 20은 apo A-I의 6번 헬릭스 도메인을 분석한 것이다.

<110> Korea Research Institutes of Bioscience and Biotechnology <120> Prophylactic and therapeutic agents containing point mutants of proapolipoprotein A-I for anti-atherosclerosis and anti-hyperlipidemia <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 1 5 10 15 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 20 25 30 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 35 40 45 Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 50 55 60 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 85 90 95 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met 100 105 110 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 130 135 140 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala 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gcgcgcagag 420 ctgcaggagg gcgcgcgcca gaagctgcac gagctgcaag agaagctgag cccactgggc 480 gaggagatgc gcgaccgcgc gcgcgcacac gtgaaggcgc tccggacgca tctggccccc 540 tacagcgacg agctgcgcca gcgcttggcc gcgcgccttg aggctctcaa ggagaacggc 600 ggcgccaggc tagccgagta ccacgccaag gccaccgagc atctgagcac gctcagcgag 660 aaggccaagc ccgcgctcga ggacctccgc caaggcctgc tgcccgtgct ggagagcttc 720 aaggtcagct tcctgagcgc tctcgaggag tacactaaga agctcaacac ccag 774 <210> 18 <211> 774 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> proapoA-I-A158E <400> 18 gccatggccc atttctggca gcaagctcca cgtccaccga cacccgatga acccccccag 60 agcccctggg atcgagtgaa ggacctggcc actgtgtacg tggatgtgct caaagacagc 120 ggcagagact atgtgtccca gtttgaaggc tccgccttgg gaaaacagct aaacctaaaa 180 cttctagaca actgggacag cgtgacctcc accttcagca agctgcgcga acagctcggc 240 cctgtgaccc aggaattctg ggataacctg gaaaaggaga cagagggcct gaggcaggag 300 atgagcaagg atctggagga ggtgaaggcc aaggtgcagc cctacctgga cgacttccag 360 aagaagtggc aggaggagat ggagctctac cgccagaagg tggagccgct gcgcgcagag 420 ctgcaggagg gcgcgcgcca gaagctgcac gagctgcaag agaagctgag cccactgggc 480 gaggagatgc gcgaccgcgc gcgcgcacac gtggacgaac tccggacgca cctggccccc 540 tacagcgacg agctgcgcca gcgcttggcc gcgcgccttg aggctctcaa ggagaacggc 600 ggcgccaggc tagccgagta ccacgccaag gccaccgagc atctgagcac gctcagcgag 660 aaggccaagc ccgcgctcga ggacctccgc caaggcctgc tgcccgtgct ggagagcttc 720 aaggtcagct tcctgagcgc tctcgaggag tacactaaga agctcaacac ccag 774 <210> 19 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proapoA-I-A154E <400> 19 Ala Met Ala His Phe Trp Gln Gln Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Asp 1 5 10 15 Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Glu His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 20 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proapoA-I-H155E <400> 20 Ala Met Ala His Phe Trp Gln Gln Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Asp 1 5 10 15 Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala Glu Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 21 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proapoA-I-V156K <400> 21 Ala Met Ala His Phe Trp Gln Gln Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Asp 1 5 10 15 Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Lys Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 22 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proapoA-I-D157K <400> 22 Ala Met Ala His Phe Trp Gln Gln Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Asp 1 5 10 15 Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Lys Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 23 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proapoA-I-A158E <400> 23 Ala Met Ala His Phe Trp Gln Gln Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Asp 1 5 10 15 Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser 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Claims

아포리포단백질(apo A-I)의 아미노산 말단에 Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln을 포함하는 프로아포리포단백질(proapo A-I)에서 apo A-I의 154번, 155번, 156번, 157번 또는 158번 위치에 변이를 함유하는 것을 특징으로 하는 프로아포리포단백질 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 proapo A-I-A154E(서열번호 19), proapo A-I-H155E(서열번호 20), proapo A-I-V156K(서열번호 21), proapo A-I-D157K(서열번호 22) 또는 proapo A-I-A158E(서열번호 23)인 것을 특징으로 하는 프로아포리포단백질 변이체.
아포리포단백질(apo A-I)의 아미노산 말단에 Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln을 포함하는 프로아포리포단백질(proapo A-I)에서 apo A-I의 apoA-I의 154번, 155번, 156번, 157번 또는 158번 위치에 변이를 함유하는 단백질 변이체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 cDNA.
제 3 항에 있어서, 상기 cDNA는 서열번호 14 내지 18 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 cDNA.
청구항 3의 cDNA을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
청구항 5의 재조합 벡터를 형질도입하여 얻은 것을 특징으로 하는 인간 이외의 형질전환체.
제 6 항에 있어서, 상기 형질전환체는 형질전환된 대장균 BL21/pET30-V156K- proapo A I(KCTC 10652BP) 또는 형질전환된 대장균 BL21/pET30-A158E-proapo A -I(KCTC 10653BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
청구항 1 또는 2의 프로아포리포단백질 변이체를 유효성분으로 함유하는 고지혈증 예방 및 치료제.
청구항 1 또는 2의 프로아포리포단백질 변이체를 유효성분으로 함유하는 동맥경화증 예방 및 치료제.