KR101233739B1 - L-글루탐산 생산 미생물 및 l-글루탐산의 제조방법 - Google Patents
L-글루탐산 생산 미생물 및 l-글루탐산의 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101233739B1 KR101233739B1 KR1020097025199A KR20097025199A KR101233739B1 KR 101233739 B1 KR101233739 B1 KR 101233739B1 KR 1020097025199 A KR1020097025199 A KR 1020097025199A KR 20097025199 A KR20097025199 A KR 20097025199A KR 101233739 B1 KR101233739 B1 KR 101233739B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ala
- thr
- leu
- glu
- val
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/345—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Brevibacterium (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
yggB 유전자를 이용하여 변형시켜 비변형 균주와 비교하여 L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네형 세균을, 배지 또는 세균 세포내에 L-글루탐산이 축적되도록 배지에서 배양하고, 배지 또는 세포로부터 L-글루탐산을 수거한다.
yggB 유전자, L-글루탐산, 코리네형 세균, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제
Description
본 발명은 L-글루탐산 생산 미생물 및 당해 미생물을 이용하여 L-글루탐산을 제조하는 방법에 관한 것이다. L-글루탐산은 식품 산업에서 예를 들면, 조미료 생산용 원료로서 널리 사용된다.
L-글루탐산은 통상적으로 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 세균과 같이 L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 사용한 발효 방법에 의해 산업적 규모로 제조되어 왔다. 이 목적을 위해 천연으로부터 분리된 균주 또는 그것의 인공 돌연변이체를 사용해 왔다.
일반적으로, 코리네형 세균의 야생형 균주는 과량의 비오틴이 존재하는 경우에 L-글루탐산을 생산하지 않는다. 따라서, 코리네형 세균에 의한 L-글루탐산의 생산은 일반적으로 비오틴이 제한된 조건하에서 이루어지거나, 배양 배지에 계면활성제 또는 페니실린을 첨가하여 이루어진다[참조 문헌: Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61(7), p1109-1112]. 반면에, 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산할 수 있는 돌연변이 균주가 L-글루탐산 생산에 사용된다. 이러한 균주에는 계면활성제-온도-민감성 균주 (WO99/02692), 페니실린-민감성 균주 (JP-A-55-0124492), 및 리소자임-민감성 균주 (WO00/14241)가 포함된다. 그러나 이와 같은 돌연변이 균주는 지방산 또는 세포벽 합성의 감소를 종종 나타낼 수 있고, 균주의 충분한 성장을 유지하는 동시에 이러한 균주를 이용하여 L-글루탐산을 생산함에 있어서 어려움이 있었다.
한편, 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하기 위해 α-케토글루타르산 데하이드로게나제(α-KGDH)를 암호화하는 유전자가 파괴된 유전자 변형된 균주를 사용해왔다 (WO95/34672). 그러나 α-KGDH 유전자에 결함이 있는 균주는 TCA 사이클이 중간에서 차단되어 성장이 느리고, L-글루탐산 생산에 필요한 충분한 양의 세포를 수득하기 어렵다.
코리네형 세균의 yggB 유전자는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 yggB 유전자의 동족체이고[참조: FEMS Microbiol Lett. 2003, 218(2), p305-309, Mol Microbiol. 2004, 54(2), p420-438], 기계적감각 통로의 일종인 것으로 보고되어 있다[참조: EMBO J. 1999, 18(7):1730-7]. 그러나 그것이 L-글루탐산 생산에 미치는 영향은 보고되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 개선시키는 새로운 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 이 목적을 달성하기 위해 광범위한 연구를 수행하였고, 야생형 yggB 유전자의 발현을 향상시킴으로써 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 개선시킬 수 있음을 밝혔다. 또한, 보통의 L-글루탐산 생산 조건에서뿐만 아니라 과량의 비오틴의 존재하에서도 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 개선시키는 돌연변이형 yggB 유전자를 수득하였고, 그것에 의하여 본 발명이 이루어졌다.
본 발명의 목적은 균주의 L-글루탐산 생산능이 비변형 균주에 비해 향상되도록 yggB 유전자를 이용하여 변형시킨, L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 yggB 유전자가,
(a) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건(stringent condition)하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA,
(c) 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번을 포함하는 DNA,
(d) 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA,
(e) 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번을 포함하는 DNA,
(f) 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA,
(g) 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번을 포함하는 DNA, 및
(h) 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 yggB 유전자가,
(A) 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 및
(B) 당해 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 아미노산 서열내의 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 비변형 균주에 비해 yggB 유전자의 발현이 향상되도록 변형된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 yggB 유전자의 카피 수를 증가시키거나 yggB 유전자의 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 yggB 유전자의 발현이 향상된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시킴으로써 변형된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 서열번호 6, 68, 84 또는 85의 아미노산 419번 내지 533번, 또는 서열번호 62의 아미노산 419번 내지 529번을 암호화하는 영역에 돌연변이가 있는 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이가 상기 영역의 결실인, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이가 삽입 서열 또는 트랜스포존(transposon)의 상기 영역으로의 삽입인, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 상기 영역에 있는 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 아미노산 서열에서 424번 위치의 프롤린 및/또는 437번 위치의 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 yggB 단백질의 막관통 암호화 영역에 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 막관통 암호화 영역이 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 아미노산 1번 내지 23번, 아미노산 25번 내지 47번, 아미노산 62번 내지 84번, 아미노산 86번 내지 108번, 및 아미노산 110번 내지 132번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 프레임 이동(frame-shift)을 야기하지 않으면서 상기 돌연변이가 도입된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85에 제시된 아미노산 서열에서 100번 위치의 알라닌 및/또는 111번 위치의 알라닌을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 14번 위치의 류신과 15번 위치의 트립토판 사이에 적어도 1개의 아미노산을 삽입시키는 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시킴으로써 상기 균주의 L-글루탐산 유사체에 대한 내성이 증가된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자를 불활성화시키기 위해 상기 코리네형 세균이 추가로 변형된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 상기 유전자가 symA 유전자이고, 상기 symA 유전자가,
(a) 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균에서 상기 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성을 저하시키기 위해 상기 코리네형 세균이 추가로 변형된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 코리네형 세균이 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속에 속하는 세균인, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 배지 또는 세포 안에 L-글루탐산을 축적하기 위해 상기한 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 배지 또는 세포로부터 L-글루탐산을 수거하는 단계를 포함하는, L-글루탐산의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은,
(a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(b) 서열번호 8과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴을 함유하는 조건하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(d) 서열번호 20과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(e) 서열번호 22의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(f) 서열번호 22와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(g) 서열번호 24의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(h) 서열번호 24와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자 가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(i) 서열번호 64의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(j) 서열번호 64와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(k) 서열번호 70의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(l) 서열번호 70과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(m) 서열번호 74의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(n) 서열번호 74와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 돌연변이형 yggB 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자에 결함이 있는 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하고, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주로서 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 시험관내에서 무작위로 돌연변이를 도입시킨 yggB 유전자가 도입된 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하고, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주로서 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 염색체상에 무작위로 전위요소(transposable element)가 도입된 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하고, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주로서 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 L-글루탐산 유사체를 함유하는 배지에 코리네형 세균을 접종하고, 상기 배지에서 성장하는 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주가 상기한 코리네형 세균인, 상기한 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 과량의 비오틴을 함유하는 배지가 30㎍/l 이상의 비오틴을 함유하는 배지인, 상기한 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
<1> 본 발명의 코리네형 세균
본 발명의 코리네형 세균은 L-글루탐산 생산능을 가지며, 비변형 균주와 비교하여 L-글루탐산 생산능이 향상되도록 yggB 유전자를 이용하여 변형되었다.
본 발명에서, 코리네형 세균의 예에는 통상의 코리네형 세균이 포함되며, 또한 코리네박테리움 세균에 매우 가까운 브레비박테리움 세균뿐만 아니라, 브레비박테리움 속으로 분류되었지만 현재는 코리네박테리움 속으로 분류된 세균[참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)]이 포함된다. 이러한 코리네형 세균의 예에는 다음이 포함된다:
코리네박테리움 아세토아시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카놀리티컴(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴리엄(Corynebacterium lilium)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes; 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens))
코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)
브레비박테리움 이마리오필럼(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum; 브레비박테리움 글루타미컴(Brevibacterium glutamicum))
브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카롤리티컴(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오제니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
브레비박테리움 암모니아제네스(Brevibacterium ammoniagenes)
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리넘(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum)
코리네형 세균의 구체적 예는 다음과 같다.
코리네박테리움 아세토액시도필럼 ATCC13870
코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC15806
코리네박테리움 알카놀리티컴 ATCC21511
코리네박테리움 칼루내 ATCC15991
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
코리네박테리움 릴리엄 ATCC15990
코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965
코리네박테리움 서모아미노제네스 AJ12340(FERM BP-1539)
코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC13868
브레비박테리움 디바리카텀 ATCC14020
브레비박테리움 플라붐 ATCC13826,
브레비박테리움 플라붐(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC14067,
브레비박테리움 플라붐 AJ12418(FERM BP-2205)
브레비박테리움 이마리오필럼 ATCC14068
브레비박테리움 락토퍼멘텀(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC13869
브레비박테리움 로세움 ATCC 13825
브레비박테리움 사카롤리티컴 ATCC14066
브레비박테리움 티오제니탈리스 ATCC19240
브레비박테리움 암모니아제네스 ATCC6871, ATCC6872
브레비박테리움 알붐 ATCC15111
브레비박테리움 세리넘 ATCC15112
마이크로박테리움 암모니아필럼 ATCC15354
이러한 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC, 주소: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)으로부터 입수할 수 있다. 즉, 각 균주는 ATCC의 카탈로그에 열거된 고유의 등록 번호가 부여되어 있다. 균주는 이 등록 번호를 이용하여 주문할 수 있다. AJ12340 균주는 부다페스트 조약하에 1989년 10월 27일자로 국제 통상부 장관 산하 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)[현재는 독립행정법인 산업 기술종합연구소 특허생물기탁센터(International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 쓰쿠바 센트랄 6, 305-5466]에 기탁되었고 수탁번호 FERM BP-1539를 부여받았다. AJ12418 균주는 부다페스트 조약하에 1989년 1월 5일자로 국제 통상부 장관 산하 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되었고 수탁번호 FERM BP-2205를 부여받았다.
본 발명에서 코리네형 세균은 L-글루탐산 생산능을 갖는다. "L-글루탐산 생산능"은 본 발명의 코리네형 세균을 배지에서 배양하는 경우에 배지에 충분한 양의 L-글루탐산을 축적시키는 능력을 의미한다. L-글루탐산 생산능은 본 발명의 코리네형 세균의 모균주의 성질일 수 있는데, 이는 대부분의 야생형 코리네형 세균 균주가 하기하는 L-글루탐산 생산 조건하에서 L-글루탐산을 생산하기 때문이다. 하지만 L-글루탐산 생산능은 하기와 같이 돌연변이, 유전자 재조합 기술 등에 의해 부여되거나 향상될 수 있다. 또한, L-글루탐산 생산능은 yggB 유전자의 발현을 향상시킴으로써 부여될 수 있다.
"코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능이 향상되었다"는 어구는 본 발명의 코리네형 세균이 비변형 균주와 비교하여 향상된 L-글루탐산 생산능을 갖는다는 것을 의미한다. 비변형 균주의 예에는 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032, 13869, 14067, 및 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965가 포함된다. 비변형 균주는 야생형 균주와 동일한 수준으로 야생형 yggB 유전자를 발현하는 균주 또는 yggB 유전자의 암호화 영역내로 돌연변이가 도입되지 않은 균주를 포함할 수도 있다.
L-글루탐산 생산능을 부여하는 방법의 예에는 L-글루탐산 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 향상시키는 것이 포함된다. L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소의 예에는 글루타메이트 데하이드로게나제, 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신테타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 시트레이트 신타제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 피루베이트 카복실라제, 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 포스포에놀피루베이트 신타제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 프럭토즈 비스포스페이트 알돌라제, 포스포프럭토키나제 및 글루코즈 포스페이트 이소머라제가 포함된다.
이러한 유전자의 발현은 하기하는 yggB 유전자의 발현을 향상시키는 방법과 동일한 방법으로 향상시킬 수 있다.
시트레이트 신타제 유전자, 이소시트레이트 데하이드로게나제 유전자, 피루베이트 데하이드로게나제 유전자 및/또는 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자의 발현이 향상되도록 변형된 미생물의 예에는 국제 공보 제WO00/18935호 및 일본 공개특허공보 제2000-232890A호(유럽 특허 제1010755A호)에 개시된 미생물이 포함된다.
L-글루탐산 생산능을 부여하는 변형에는 L-글루탐산 이외의 화합물을 합성하는 반응 및 L-글루탐산 생합성 경로로부터 분지된 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하 또는 제거하는 방법이 포함된다. 이러한 효소의 예에는 이소시트레이트 리아 제, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제, 아세틸 포스페이트 트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 아세틸 포르메이트 트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제 및 글루타메이트 데카복실라제가 포함된다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 저하된 균주의 예에는 다음의 균주가 포함된다.
브레비박테리움 락토퍼멘텀 △S 균주(WO95/34672)
브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ12821 균주(FERM BP-4172; FR9401748)
브레비박테리움 플라붐 AJ12822 균주(FERM BP-4173; FR9401748)
브레비박테리움 글루타미컴 AJ12823 균주(FERM BP-4174; FR9401748)
상기한 효소의 활성을 저하시키거나 제거하기 위해서, 효소 활성의 저하 또는 감소를 유발하는 돌연변이 또는 결실을 염색체상에 있는 효소의 유전자내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 염색체상의 효소를 암호화하는 유전자를 파괴하거나 유전자의 프로모터 및/또는 샤인 달가노(SD) 서열과 같은 발현 조절 서열을 변형시켜 달성할 수 있다. 또한, 이러한 효소의 활성은, 아미노산 치환을 유발하는 미스센스 돌연변이, 종결 코돈을 생성하는 넌센스 돌연변이, 또는 암호화 영역내로 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드를 부가하거나 결실시키는 프레임 이동 돌연변이를 도입시키거나, 또는 유전자의 부분 또는 전체를 결실시킴으로써, 저하시키거나 제거할 수 있다[참조: Journal of biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)]. 예를 들면, 이러한 효소의 활성은, 암호화 영역이 결실되어 돌연변이 효소를 암호화하는 유전자를 작제하여 염색체상의 유전자를 수득된 유전자로 상동성 재조합에 의해 대 체시키거나, 트랜스포존 또는 IS 인자를 이러한 유전자내로 도입시킴으로써, 저하시키거나 제거할 수 있다.
예를 들면, 상기 효소의 활성을 저하시키거나 제거하는 돌연변이는 유전자 재조합에 의해 다음과 같이 도입시킬 수 있다. 즉, 정상적인 효소가 생산되지 않도록 표적 유전자의 서열의 부분을 변형시킴으로써 돌연변이형 유전자를 작제하고, 돌연변이형 유전자를 사용하여 코리네형 세균을 형질전환시켜 염색체상의 표적 유전자와 재조합이 유발되도록 함에 의해, 염색체상의 표적 유전자를 돌연변이형 유전자로 대체시킬 수 있다. 이와 같이 상동성 재조합을 이용한 유전자 대체에 의해 유전자를 파괴하는 방법은 이미 보고되어 있고, 선형 DNA를 이용하는 방법 또는 온도 민감성 복제 오리진을 포함하는 플라스미드를 이용하는 방법을 포함한다(미국 특허 제6,303,383호 또는 일본 공개특허 공보 제05-007491호). 코리네형 세균에 대한 온도 민감성 플라스미드의 예에는 p48K 및 pSFKT2(미국 특허 제6303383호), pHSC4(프랑스 공개특허 공보 제2667875호(1992) 및 일본 공개특허 공보 제5-7491A호) 등이 포함된다. 코리네형 세균내에서 이러한 플라스미드는 적어도 25℃의 온도에서는 자발적으로 복제할 수 있지만, 37℃의 온도에서는 자발적으로 복제할 수 없다. pHSC4를 보유한 AJ12571 균주는 부다페스트 조약하에 1991년 8월 26일자로 국제 통상부 장관 산하 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현재는 독립행정법인 산업 기술종합연구소 특허생물기탁센터, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 쓰쿠바 센트랄 6, 305-5466)에 기탁되었고 수탁번호 FERM BP-3524를 부여받았다.
상기한 상동성 재조합을 이용한 유전자 대체에 의해 유전자를 파괴하는 방법은 코리네형 세균내에서 복제 불가능한 플라스미드를 이용하여 수행될 수도 있다. 바람직하게는 코리네형 세균내에서 복제 불가능하며 에스케리키아 세균내에서 복제 가능한 플라스미드가 사용된다. 이러한 플라스미드의 예에는 pHSG299(Takara Bio) 및 pHSG399(Takara Bio)가 포함된다.
상기한 효소 중의 하나를 암호화하는 염색체상의 유전자는, 예를 들면 sacB를 이용한 상동성 재조합에 의해 결실형 유전자로 대체될 수 있다[참조: Schafer, A. et al., Gene 145 (1994) 69-73]. sacB 유전자는 레반 슈크라제를 암호화하며, 염색체상의 표적 유전자가 돌연변이 유전자로 대체되고 벡터 부분이 염색체로부터 제거된 균주를 효율적으로 선별하기 위해 사용된다(WO2005/113745 및 WO2005/113744).
먼저, 결실형(돌연변이) 유전자, sacB 유전자, 및 클로람페니콜-내성 유전자와 같은 선별 마커를 온도 민감성 복제 오리진을 포함하는 플라스미드에 삽입하여 재조합 플라스미드를 작제한다. 이어서 플라스미드를 코리네형 세균의 숙주 균주에 도입시킨다. 레반 슈크라제가 코리네형 세균에서 발현되는 경우, 슈크로즈가 전환되어 레반이 생성되고 레반은 세균에게 치명적이므로 슈크로즈를 함유하는 배지에서 세균이 성장하지 못한다. 따라서, 슈크로즈를 함유한 플레이트에서 배양함으로써, 플라스미드에 있는 돌연변이 유전자와 염색체상의 유전자 간에 대체가 일어나고 플라스미드의 다른 부분이 세포로부터 제거된 균주를 선별할 수 있다.
sacB 유전자의 예에는 다음이 포함된다:
바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) : sacB GenBank 승인번호 X02730 (서열번호 11)
바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens) : sacB GenBank 승인번호 X52988
지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) : sacB Genbank 승인번호 L33402
바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) : surB GenBank 승인번호 U34874
락토바실러스 산프란시스켄시스(Lactobacillus sanfranciscensis) : frfA GenBank 승인번호 AJ508391
아세토박터 자일리너스(Acetobacter xylinus) : lsxA GenBank 승인번호 AB034152
글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus) : lsdA GenBank 승인번호 L41732
형질전환체 균주를 온도 민감성 복제 오리진이 작용하는 온도(예:25℃)에서 배양하여 플라스미드가 도입된 균주를 수득한다. 이어서, 형질전환체를 온도 민감성 복제 오리진이 작용하지 않는 고온(예:34℃)에서 배양하여 온도 민감성 플라스미드를 제거하고 카나마이신과 같은 항생제를 함유한 플레이트 배지에 도말한다. 플라스미드가 제거된 균주는 이러한 항생제를 함유한 플레이트에서 성장할 수 없지만, 염색체상의 유전자가 돌연변이 유전자로 대체된 소수 균주는 성장하여 콜로니로서 나타날 수 있다.
돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 DNA가 염색체 DNA내로 통합된 균주의 경우, 재조합 DNA는 본래 염색체상에 존재하는 유전자와 재조합을 일으키고, 염색체상의 유전자와 돌연변이 유전자가 융합된 유전자가 염색체내로 삽입되어 재조합 DNA의 다른 부분(벡터 절편, 온도 민감성 복제 오리진 및 항생제 내성 마커)이 융합 유전자들 사이에 존재한다. 이어서, 염색체 DNA상에 돌연변이 유전자만을 남기기 위해서, 염색체 DNA로부터 1카피의 유전자를 벡터 절편(온도 민감성 복제 오리진 및 항생제 내성 마커를 포함)과 함께 제거한다. 이 경우, 정상 유전자가 염색체 DNA상에 남고 돌연변이 유전자가 염색체 DNA로부터 제거되거나, 반대로 돌연변이 유전자가 염색체 DNA에 남고 정상 유전자가 염색체 DNA로부터 제거된다. 두 경우에, 온도 민감성 복제 오리진이 작용할 수 있는 온도에서 코리네형 세균이 배양되면, 제거된 DNA는 코리네형 세균의 세포내에 남는다. 이어서, 온도 민감성 복제 오리진이 작용할 수 없는 온도에서 코리네형 세균을 배양함으로써, 플라스미드에 있는 유전자를 플라스미드와 함께 세포로부터 제거한다. sacB 유전자를 이용하는 경우, 슈크로즈를 함유한 배지에서 코리네형 세균을 배양함으로써, 플라스미드가 제거된 균주를 효율적으로 수득할 수 있다. 플라스미드가 제거된 균주로부터 돌연변이가 표적 유전자로 도입된 균주를 선별함으로써, 표적 유전자가 돌연변이형 또는 결실형 유전자로 대체된 균주를 수득할 수 있다.
L-글루탐산 생산능은 또한 유기산 유사체, 호흡 억제제, 또는 슈퍼옥사이드 발생제에 대해 내성이 있는 균주를 스크리닝하거나 세포벽 합성 억제제에 민감한 균주를 스크리닝함으로써 부여될 수 있다. 이러한 방법의 예에는 모노플루오로아세 테이트에 대한 내성의 부여(JP50-113209A), 아데닌 또는 티민에 대한 내성의 부여(JP57-065198A), 말론산에 대한 내성의 부여(JP52-038088A), 우레아제 활성 저하(JP52-038088A), 벤조피론 또는 나프토퀴논에 대한 내성의 부여(JP56-1889A), HOQNO에 대한 내성의 부여(JP56-140895A), α-케토말론산에 대한 내성의 부여(JP57-2689A), 구아니딘에 대한 내성의 부여(JP56-35981A), 다우노마이신에 대한 내성의 부여(JP58-158192A), 및 페니실린에 대한 민감성의 부여(JP04-88994A)가 포함된다.
이러한 세균의 구체적 예에는 다음의 균주가 포함된다:
브레비박테리움 플라붐 AJ3949(FERM BP-2632; JP50-113209A)
코리네박테리움 글루타미컴 AJ11628(FERM P-5736; JP57-065198A)
브레비박테리움 플라붐 AJ11355(FERM P-5007; JP56-1889A)
코리네박테리움 글루타미컴 AJ11368(FERM P-5020; JP56-1889A)
브레비박테리움 플라붐 AJ11217(FERM P-4318; JP57-2689A)
코리네박테리움 글루타미컴 AJ11218(FERM P-4319; JP57-2689A)
브레비박테리움 플라붐 AJ11564(FERM P-5472; JP56-140895A)
브레비박테리움 플라붐 AJ11439(FERM P-5136; JP56-35981A)
코리네박테리움 글루타미컴 H7684(FERM BP-3004; JP04-88994A)
브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ11426(FERM P5123 JP56-048890A)
코리네박테리움 글루타미컴 AJ11440(FERM P5137 JP56-048890A)
브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ11796(FERM P6402 JP58-158192A)
본 발명의 코리네형 세균은 L-글루탐산 생산능을 갖는 상기 코리네형 세균을 yggB 유전자를 이용하여 변형시켜 L-글루탐산 생산능이 보다 향상되도록 함으로써 수득할 수 있다. 또한, yggB 유전자를 이용하여 먼저 변형시키고 추가적인 변형을 수행하여 L-글루탐산 생산능을 부여하거나 향상시킬 수 있다.
yggB 유전자를 이용한 변형에는, 제한되지 않지만, 코리네형 세균에서 yggB 유전자의 발현을 향상시키는 방법 및 돌연변이를 코리네형 세균의 yggB 유전자내로 도입시키는 방법이 포함된다.
<I> yggB 유전자 발현의 향상
yggB 유전자는 "mscS"로도 언급되는 일종의 기계적감각 통로를 암호화한다[참조: FEMS Microbiol Lett. 2003 Jan 28;218(2):305-9].
코리네형 세균에서의 yggB 유전자 발현 향상은 비변형 균주와 비교하여 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능 개선을 유도한다. 즉, 야생형 균주와 같은 비변형 균주와 비교하여 yggB 유전자의 발현이 증가하도록 코리네형 세균 균주가 변형된 경우, 비변형 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적 또는 더 높은 속도의 L-글루탐산의 생산을 야기한다.
yggB 유전자의 발현 향상이, 비변형 균주와 비교하여 2% 초과(소모된 당에 대한 수율), 보다 바람직하게는 4% 초과, 보다 바람직하게는 6% 초과의 L-글루탐산의 생산량의 증가를 야기하는 것이 바람직하다. 또한, 세균 세포의 구성을 위해 사용되는 탄소를 제외한 탄소(당)에 대한 L-글루탐산의 수율은 yggB 유전자의 발현을 향상시킴으로써 증가될 수 있다.
yggB 유전자의 발현이 향상되지 않은 비변형 균주와 비교하여 yggB 유전자의 발현 수준이 증가하는 한 이의 발현 수준이 임의의 수준일 수 있지만, 비변형 균주와 비교하여 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상, 보다 바람직하게는 3배 이상으로 발현이 증가한다. yggB 유전자의 mRNA의 양을 측정함으로써 yggB 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. 발현 수준을 측정하는 방법에는 노던 하이브리드화 및 RT-PCR이 있다[참조: Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)]. 대조군으로서 사용될 수 있는 야생형 코리네형 세균의 예에는 코레네박테리움 글루타미컴(브레비박테리움 락토퍼멘텀) ATCC13869, ATCC13032, ATCC14067 및 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965 균주가 포함된다.
yggB 유전자를 이용하여 변형된 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능은, L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 및/또는 과량의 비오틴의 존재하에서 비변형 균주와 비교하여 향상될 수 있다. 여기서, "L-글루탐산을 생산하는 조건"에는 탄소원, 질소원, 무기 염, 및 아미노산 및 비타민과 같은 미량의 유기 영양소(필요한 경우에)를 함유한 통상적인 배지에 L-글루탐산 생산을 유도하는 물질이 첨가된 경우, 및 이러한 통상적인 배지에서 L-글루탐산 생산을 억제하는 물질의 양이 제한된 경우가 포함된다. L-글루탐산 생산을 유도하는 물질에는 페니실린 및 Tween 40 (등록 상표)과 같은 포화 지방산을 포함하는 계면활성제가 포함된다. L-글루탐산 생산을 억제하는 물질에는 비오틴이 포함된다[참조: Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press 1986]. 배지내의 페니실린의 농도는 바람직하게는 0.1U/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.2U/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.4U/ml 이상이다. 배지내의 계면활성제의 농도는 바람직하게는 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1g/L 이상, 보다 바람직하게는 2g/L 이상이다. 배지에 첨가되는 비오틴의 농도는 L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 바람직하게는 15㎍/L 미만, 보다 바람직하게는 10㎍/L 미만, 보다 바람직하게는 5㎍/L 미만이다. L-글루탐산을 생산하는 조건은 비오틴을 전혀 함유하지 않을 수 있다.
반면에, 과량의 비오틴을 함유하는 조건은 비오틴을 30㎍/L 이상, 보다 바람직하게는 40㎍/L 이상, 보다 바람직하게는 50㎍/L 이상 함유하는 조건일 수 있다.
코리네형 세균의 yggB 유전자의 예에는 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA, 서열번호 62의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA, 서열번호 68의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA, 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA가 포함된다. 코리네형 세균의 yggB 유전자의 구체적 예에는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 및 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 및 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번이 포함된다. 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번의 뉴클레오타이드 서열은 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032의 yggB 유전자이고, GenBank 승인번호 NC_003450의 게놈 서열에 있는 뉴클레오타이드 1336092번 내지 1337693번에 상응하며, NCgl1221(NP_600492. Reports small-conductance mechanosensitive channel...[gi:19552490])로서 등록되어있다. 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번의 뉴클레오타이드 서열은 코리네박테리움 글루타미 컴 ATCC13869의 yggB 유전자이다. 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번의 뉴클레오타이드 서열은 코리네박테리움 글루타미컴(브레비박테리움 플라붐) ATCC14067의 yggB 유전자이다. 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번의 뉴클레오타이드 서열은 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965의 yggB 유전자이다. 또한, yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 종 및 균주마다 상이할 수 있기 때문에, 본 발명에서 사용되는 yggB 유전자는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번의 뉴클레오타이드 서열의 변이체일 수 있다. 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번의 뉴클레오타이드 서열을 사용하기 위해 yggB 유전자의 변이체를, 예를 들면, BLAST(//blast.genome.jp/)에 의해 검색할 수 있다. yggB 유전자의 변이체에는 서열번호 75 및 76의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 수득된 유전자가 포함된다. yggB 유전자는 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시킬 수 있는한 다른 미생물로부터 유래한 유전자일 수 있다. yggB 유전자는 하기의 돌연변이형 yggB일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 yggB 유전자는 서열번호 6, 62, 68, 또는 84에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자에 제한되지 않고, 코리네형 세균내로 유전자가 도입되는 경우 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 능력을 계속 유지하는 동시에, 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된, 서열번호 6, 62, 68, 또는 84의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수도 있다. 여기서 언급된 "수개"의 아미노산 잔기의 수는 3차원 구조에서의 위치 또는 단백질의 아미노산 잔기의 유형에 따라 다를 수 있지만, 바람직하게는 2 내지 20개, 보다 바람직하게 는 2 내지 10개, 특히 바람직하게는 2 내지 5개이다. yggB 유전자는 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 능력을 유지하는 동시에, 서열번호 6, 62, 68, 84, 또는 85에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상 상동성인 단백질을 암호화하는 것이 바람직하다. 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 아미노산 서열 간의 상동성은 카를린(Karlin)과 알트슐(Altschul)이 개발한 BLAST[참조: Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] 및 피어슨(Pearson)이 개발한 FASTA[참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]를 포함한 알고리듬에 의해 측정할 수 있다. BLASTN 및 BLASTP를 포함한 상동성 검색 프로그램은 알고리듬에 기반하여 개발되어 왔다(//www.ncbi.nlm.nih.gov에서 사용 가능).
상기한 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 방향족 아미노산의 경우, 보존적 치환은 phe, trp, 및 tyr 서로 간의 치환을 포함한다. 소수성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 leu, ile, 및 val 서로 간의 치환을 포함한다. 극성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 gln 및 asn 서로 간의 치환을 포함한다. 염기성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 arg, lys, 및 his 서로 간의 치환을 포함한다. 산성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 asp 및 glu 서로 간의 치환이다. 하이드록실 그룹 함유 아미노산의 경우, 보존적 치환은 ser 및 thr 서로 간의 치환이다. 보존적 치환은 또한 Ala에서 Ser 또는 Thr으로의 치환, Arg에서 Gln, His 또는 Lys으로의 치환, Asn에서 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp에서 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys에서 Ser 또는 Ala으로의 치환, Gln에서 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg 으로의 치환, Glu에서 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly에서 Pro으로의 치환, His에서 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr으로의 치환, Ile에서 Leu, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Leu에서 Ile, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Lys에서 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg으로의 치환, Met에서 Ile, Leu, Val 또는 Phe으로의 치환, Phe에서 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu으로의 치환, Ser에서 Thr 또는 Ala으로의 치환, Thr에서 Ser 또는 Ala으로의 치환, Trp에서 Phe 또는 Tyr으로의 치환, Tyr에서 His, Phe 또는 Trp으로의 치환, 및 Val에서 Met, Ile 또는 Leu으로의 치환을 포함한다.
특히, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 다음의 아미노산은 치환 또는 결실될 수 있다. 코리네형 세균 가운데 보존된 YggB 단백질의 아미노산 서열, 즉 보존서열은 서열번호 85에 제시되어 있다. 서열번호 85에 제시된 Xaa 잔기는 치환 또는 결실될 수 있다.
48번 위치의 Glu (바람직하게는 Arg으로 치환된다)
275번 위치의 Asp (바람직하게는 Ser으로 치환된다)
298번 위치의 Glu (바람직하게는 Ala으로 치환된다)
343번 위치의 Ala (바람직하게는 Val으로 치환된다)
396번 위치의 Phe (바람직하게는 Ile으로 치환된다)
438번 위치의 Ser (바람직하게는 Gly으로 치환된다)
445번 위치의 Val (바람직하게는 Ala으로 치환된다)
454번 위치의 Ala (바람직하게는 Val으로 치환된다)
457번 위치의 Pro (바람직하게는 Ser으로 치환된다)
474번 위치의 Ser (바람직하게는 Asp로 치환된다)
517번 위치의 Val (바람직하게는 결실된다)
518번 위치의 Glu (바람직하게는 결실된다)
519번 위치의 Ala (바람직하게는 결실된다)
520번 위치의 Pro (바람직하게는 결실된다)
상기한 yggB 유전자 동족체는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 또는 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번의 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써, 예를 들면 암호화된 단백질의 특이적인 위치에서 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가가 일어나도록 하는 부위-특이적 돌연변이유발 기술로 수득할 수 있다. 또한, 이러한 유전자는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리를 하여 수득할 수 있다. 돌연변이 처리의 예에는, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 또는 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자를 시험관내에서 하이드록실아민으로 처리하여, 미생물, 예를 들면 에스케리키아 세균을 처리하고, 유전자에 자외선을 조사하거나 유전자에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 EMS(에틸 메탄설포네이트)와 같이 돌연변이 처리에서 일반적으로 사용되는 돌연변이유발제를 처리하는 방법이 포함된다. 상기한 아미노산 잔기의 치 환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위 등에 대한 돌연변이에는 yggB 유전자를 보유한 미생물 종에서의 차이 및 개체의 차이(돌연변이체 또는 변이체)로부터 초래되는 자연발생 돌연변이도 포함된다. 이러한 유전자가 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시킬 수 있는지의 여부는, 예를 들면 유전자를 야생형 코리네형 세균에서 발현시키고, 수득된 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능이 야생형 균주와 같은 비변형 균주에 비해 향상되는지 측정함으로써 확인될 수 있다.
yggB 유전자는, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 또는 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 이들 가운데 어떤 뉴클레오타이드로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화 할 수 있고, 코리네형 세균내로 도입되는 경우 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시킬 수 있는 DNA일 수도 있다.
본원에서 사용되는 "엄중한 조건"이란 소위 특이적인 하이브리드는 형성되고 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 엄중한 조건의 예에는, 고도로 상동성인 DNA가 서로 하이브리드화 하는 조건, 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상 상동성인 DNA는 서로 하이브리드화하고, 70% 미만의 상동성인 DNA는 서로 하이브리드화하지 않는 조건, 및 서던 하이브리드화의 전형적 세척과 염 농도에서, 즉 60℃에서 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 68 ℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 바람직하게는 2 내지 3회 세척하에 DNA가 서로 하이브리드화하는 조건이 포함된다.
yggB 유전자의 상보적인 부분 서열이 프로브로서 사용될 수도 있다. 이러한 프로브는 당업자에게 공지된 방법으로 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 고안된 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR에 의해 제조될 수 있다. 약 300 bp의 길이를 갖는 DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우, 하이브리드화 이후의 세척 조건은 50℃에서 2×SSC, 0.1% SDS로서 예시될 수 있다. 서열번호 75 및 76에 제시된 올리고뉴클레오타이드는 상기 프로브를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
또한, yggB 유전자는 <II> 내지 <IV>에 하기하는 돌연변이형 yggB 유전자일 수 있다.
상기한 yggB 유전자의 발현 향상은, 플라스미드, 또는 상동성 재조합, 접합, 전위 등을 이용한 형질전환을 사용함으로써, yggB 유전자의 카피 수를 증가시키거나, yggB 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키거나, yggB 유전자의 발현을 증가시키는 조절인자를 암호화하는 유전자를 증폭시키거나, yggB 유전자의 발현을 감소시키는 조절인자를 암호화하는 유전자를 파괴 또는 약화시킴으로써 달성될 수 있다.
예를 들면, 재조합 DNA는, yggB 유전자를 포함하는 유전자 단편을 벡터, 바람직하게는 코리네형 세균내에서 복제할 수 있는 다중 카피 벡터에 연결시키고, 수득된 벡터를 L-글루탐산을 생산하는 코리네형 세균내로 도입시킴으로써 제조될 수 있다.
yggB 유전자의 카피 수는 다수의 yggB 유전자 카피를 미생물의 염색체 DNA내 로 통합시킴으로써 증가될 수도 있다. 다수의 yggB 유전자 카피를 미생물의 염색체 DNA내로 통합시키기 위해서, 염색체 DNA상에 다중 카피로 존재하는 서열을 표적하여 상동성 재조합을 수행할 수 있다. 트랜스포존의 말단에 있는 반복 DNA 및 역위 반복체가 사용될 수 있다. 또한, 일본 공개특허 공보 제2-109985A호에 게시된 바와 같이, yggB 유전자를 트랜스포존내로 혼입시키고, 다수의 유전자 카피가 염색체 DNA내로 통합되도록 전달하는 것도 가능하다. yggB 유전자의 부분 서열을 갖는 프로브를 사용한 서던 하이브리드화로 yggB 유전자를 염색체내로 통합시킬 수 있다.
이하, yggB 유전자의 발현이 향상되도록 변형된 코리네형 세균을 작제하는 방법의 예를 제시할 것이다. 이 방법은 문헌[참조: Molecular cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)]에 기술된 바와 같은 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다.
먼저, 코리네형 세균의 염색체 DNA로부터 yggB 유전자를 클로닝한다. 염색체 DNA를 코리네형 미생물로부터, 예를 들면 사이토(Saito)와 미우라(Miura)의 방법[참조: H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifukan, 1992)]에 의해 제조할 수 있다. PCR을 위해 서열번호 75 및 76에 제시된 것과 같은 올리고뉴클레오타이드가 프라이머로서 사용될 수 있다.
이어서, 증폭된 yggB 유전자를 코리네형 세균에서 작용할 수 있는 벡터 DNA에 연결시켜 재조합 DNA를 제조한다. 플라스미드를 작제하기 위해 바람직하게는 에 스케리키아 콜라이 및 코리네형 세균에서 자발적으로 복제할 수 있는 벡터가 사용된다. 코리네형 세균에서 자발적으로 복제할 수 있는 벡터의 예에는 pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58-77895A), pVK7 (US2003-0175912), 및 pSFK6 (JP2000-262288A), pCRY30 (JP3-210184A), pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, pCRY3KX (JP2-72876A 및 미국 특허 제5,185,262호), pCRY2, 및 pCRY3 (JP1-191686), 및 pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (JP58-192600A), pCG1 (JP57-134500A), pCG2 (JP58-35197), pCG4, pCG11 (S57-183799)가 포함된다. 에스케리키아 콜라이에서 자발적으로 복제할 수 있는 벡터의 예에는 pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG 및 pACYC는 Takara Bio로부터 입수할 수 있다), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW는 Nippon Gene으로부터 입수할 수 있다), pTrc99A [참조: Amann et al., Gene 69:301-315(1988)]등이 포함된다.
yggB 유전자를 상기한 벡터에 연결시켜 재조합 DNA를 제조하기 위해서, yggB 유전자를 포함하는 벡터 및 단편을 제한효소로 분해시키고, 일반적으로 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 서로 연결시킨다.
상기한 재조합 플라스미드를 통상적인 형질전환 방법으로 숙주 코리네형 세균내로 도입시킨다. 형질전환 방법의 예에는, 에스케리키아 콜라이 K-12에 대해 보고된 바 있는 방법인, 수용 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], 및 바실러스 섭틸리스에 대해 보고된 바 있는 방법인, 성장기에 있는 세포로부터 컴피턴트 세포를 제조하여 DNA로 형질전환시키는 방법[참조: Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1997)] 등이 포함된다. 이러한 방법 외에도, 바실러스 섭틸리스, 방선균 및 효모에 적용할 수 있는 것으로 보고된 바 있는 방법인, 재조합 DNA를 원형질체- 또는 스페로플라스트-유사 수용 세포내로 도입시키는 방법[참조: Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)]을 사용할 수 있다. 또한, 전기 펄스 방법(일본 공개특허 공보 제2-207791A호)을 사용하여 미생물의 형질전환을 수행할 수도 있다.
yggB 유전자의 카피 수는 다수의 유전자 카피를 코리네형 세균의 염색체 DNA내로 통합시킴으로써 증가될 수도 있다. 다수의 yggB 유전자 카피를 코리네형 세균의 염색체 DNA내로 통합시키기 위해서, 염색체 DNA상에 다수의 카피로 존재하는 서열을 표적하여 상동성 재조합을 수행할 수 있다. 트랜스포존의 말단에 있는 반복 DNA 및 역위 반복체가, 염색체 DNA상에 다수의 카피로 존재하는 서열로서 사용될 수 있다. 또한, 유럽 특허 제0332488B호 및 문헌[참조: Vertes, A.A., Asai, Y., Inui, M., Kobayashi, M., Kurusu, Y. and Yukawa, H. :Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)]에 게시된 바와 같이, yggB 유전자를 트랜스포존내로 혼입시키고, 다수의 유전자 카피가 염색체 DNA내로 통합되도록 전달하는 것도 가능하다.
또한, Mu 파아지(유럽 특허 제0332488B) 또는 접합 방법[참조: Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84-7]을 사용하여 yggB 유전자를 숙주 염색체내로 혼입시킬 수도 있다. 또한, yggB 유전자의 카피 수는 하기하는 인공 트랜스포 존을 사용함으로써 증가될 수도 있다.
또한, 숙주 코리네형 세균내에서 복제할 수 없는 복제 오리진을 갖는 플라스미드 또는 숙주 코리네형 세균내에서 복제할 수 없는 복제 오리진을 갖고 접합에 의해 전달될 수 있는 플라스미드에 yggB 유전자를 삽입함으로써, 염색체상에서 yggB 유전자를 증폭시킬 수도 있다. 이러한 플라스미드의 예에는 pSUP301[참조: Simo et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 및 pK19mob[참조: Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pGEM-T(Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO[참조: Shuman (1994) Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A 5487993], pCR(R)Blunt(Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1[참조: Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516], 및 pBGS8[참조: Spratt et al., 1986, Gene, 41:337-342]이 포함된다. yggB 유전자를 갖는 플라스미드를 접합 또는 형질전환에 의해 코리네형 세균내로 전달한다. 유전자 전달을 접합에 의해, 예를 들면 문헌[참조: Schaefer et al. Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기술된 방법에 의해 수행할 수도 있다. 유전자 전달을 형질전환에 의해, 예를 들면 문헌[Theirbach et al. Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1998)], 문헌[Dunican and Shivinan, Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)], 및 문헌[Tauch et al. FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기술된 방법에 의해 수행할 수도 있다.
yggB 유전자의 발현 향상은, 염색체 DNA 또는 플라스미드상에 있는, yggB 유전자의 프로모터를 포함하는, 발현 조절 서열을 보다 강한 것으로 대체함으로써, 오퍼레이터(operator) 및/또는 리프레서(repressor)와 같이 yggB 유전자의 발현 조절에 관계된 요소를 변형시킴으로써, 또는 yggB 유전자의 종결 코돈 하류에 강한 터미네이터(terminator)를 융합시킴으로써[참조: Hamilton et al.; Journal of Bacterology 171:4617-4622] 달성될 수도 있다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, PL 프로모터, PS2 프로모터[참조: Appl Environ Microbiol. 2003 Jan;69(1):358-66; Mol Microbiol. 1993 Jul;9(1):97-109; WO93/03158] 등이 강한 프로모터로서 알려져 있다. 프로모터의 세기를 평가하는 방법 및 강한 프로모터의 예는 문헌[참조: Goldstein et al. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annul. Rev., 1995, 1, 105-128]에 게시되어 있다. 또한, 프로모터를 보다 강하게 하기 위해서, 수개의 뉴클레오타이드 치환을 yggB 유전자의 프로모터 영역내로 도입시키는 것도 가능하다(WO00/18935). 예를 들면, "-35 영역"을 "TTGACA" 또는 "TTGCCA"로 치환시키거나, "-10 영역"을 "TATAAT" 또는 "TATAAC"로 치환시킬 수 있다. 또한, 특히 개시 코돈의 바로 수개의 뉴클레오타이드 상류에 있는, 리보솜 결합 부위(RBS)와 해독 개시 코돈 사이의 스페이서 서열이 해독 효율에 큰 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 서열을 변형시킬 수 있다. yggB 유전자의 "발현 조절 서열"은 yggB 유전자의 발현량에 영향을 주는 영역을 의미하며, 그것의 예에는 yggB 유전자의 상류 영역이 포함된다. yggB 유전자 발현을 향상시키기 위한 변형에 적합한 상류 영역에는 yggB 유전자의 해독 개시 코돈의 상 류 영역(예를 들면, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1436번의 상류 영역)이 포함되고, 그것의 바람직한 예에는 해독 개시 코돈의 적어도 500bp 상류 영역이 포함되며, 그것의 보다 바람직한 예에는 해독 개시 코돈의 적어도 300bp 상류 영역이 포함된다.
발현 조절 서열의 대체는, 예를 들면 상기한 온도 민감성 플라스미드를 사용함으로써 달성될 수도 있다.
발현 조절 서열의 변형으로 yggB 유전자의 카피 수가 증가될 수도 있다.
<II> 돌연변이형 yggB 유전자의 도입
yggB 유전자를 이용한 변형으로 돌연변이형 yggB 유전자가 코리네형 세균내로 도입될 수 있다. 돌연변이형 yggB 유전자의 도입에는, 염색체상의 yggB 유전자내로 돌연변이의 도입, 돌연변이형 yggB 유전자를 포함하는 플라스미드의 도입, 및 염색체상의 yggB 유전자의 돌연변이형 yggB 유전자로의 대체가 포함된다.
본 발명에서, "돌연변이형 yggB 유전자"는 코리네형 세균내로 도입되는 경우 과량의 비오틴의 존재하에서 yggB 유전자가 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키게 하는 암호화 영역내에 돌연변이를 포함하는 yggB 유전자를 의미한다. 돌연변이형 yggB 유전자는, 코리네형 세균내로 도입되는 경우 과량의 비오틴의 존재하에서뿐만 아니라 L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 유전자일 수도 있다.
"과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능이 향상된다"라는 어구는, 코리네형 세균의 비변형 균주가 실질적으로 L-글루탐산을 생산할 수 없는 농도의 비오틴을 함유하는 배지에서, 예를 들면 30㎍/L 이상의 비오틴을 함유하는 배지에서, 본 발명의 코리네형 세균을 배양하는 경우에, 배지에 비변형 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적을 야기하거나, 또는 비변형 균주보다 더 높은 속도로 L-글루탐산을 생산하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자를 수득하는 방법 및 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시키는 방법의 예를 기술할 것이다. 그러나 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자를 수득하는 방법 및 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시키는 방법은 이러한 예들로 제한되지 않는다.
(II-1) odhA 유전자에 결함이 있는 균주를 사용하는 방법
본 발명의 발명자들은 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제의 E1o 서브유닛을 암호화하는 유전자가 파괴된, odhA(sucA) 유전자-파괴된 균주를 이용함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 효율적으로 수득할 수 있음을 밝혔다.
본 발명에서, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(α-KGDH) 활성은 석시닐-CoA를 생성시키는 α-케토글루타르산(2-옥소글루타르산)의 산화성 탈카복실화 반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 이 반응은 세 종류의 효소, 즉 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(E1o EC1.2.4.2), 디하이드로리포아미드-S-석시닐트랜스퍼라제(E2o) 및 디하이드로리포아미드 데하이드로게나제(E3)에 의해 촉매된다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제는 옥소글루타레이트 데하이드로게나제(석시닐-트랜스퍼라제) 또는 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제로도 지칭된다. α-KGDH의 활성은 문헌[참조: Shiio et al. Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44(8), 1897-1904, 1980]의 방법으로 측정할 수 있다.
코리네형 세균의 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제의 E1o 서브유닛을 암호화하는 유전자(odhA)의 뉴클레오타이드 서열은 이미 동정되었다[참조: Microbiology 142, 3347-3354, (1996), Genbank 승인번호 D84102]. odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 43의 뉴클레오타이드 443번 내지 4213번에 제시되어 있고, odhA 유전자의 아미노산 서열은 서열번호 44에 제시되어 있다.
odhA 유전자-파괴된 균주는, 예를 들면 상기한 sacB 유전자를 사용하는 방법으로 수득할 수 있다. 먼저, 서열번호 1 및 2에 제시된 것과 같은 odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 고안된 프라이머, 및 주형으로서 ATCC13869 균주와 같은 코리네형 세균의 염색체 DNA를 이용하여 PCR로 odhA 유전자의 내부서열을 증폭시킨다. odhA 유전자가 파괴된 플라스미드를 작제하기 위해 odhA 유전자의 내부단편을 플라스미드내로 삽입한다. 유전자를 파괴하기 위해 사용되는 플라스미드에는 코리네형 세균에 대한 온도 민감성 플라스미드(JP-A-05-00791), 및 실시예 1에 기술된 sacB 유전자를 포함하는 자살벡터인 pBS3가 포함된다.
수득된 플라스미드를, 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산의 축적을 야기할 수 없는 균주, 예를 들면 야생형 씨. 글루타미컴 ATCC13869, ATCC13032 균주내로 전기 펄스 방법(JP-A-2-207791)에 의해 도입시킨다. 플라스미드상의 돌연변이형 odhA 유전자와 염색체 odhA 유전자 사이에 상동성 재조합이 일어난 단일교차 재조합체를 수득한다. 온도 민감성 플라스미드를 사용하는 경우, 플라스미드가 복제할 수 없는 온도에서 단일교차 재조합체를 수득한다. 균주가 단일교차 재조합체인 지의 여부는, 예를 들면 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오타이드를 이용함으로써 확인할 수 있다.
이렇게 수득된 odhA 유전자가 파괴된 균주를 당을 함유하는 배지에서 분리한다. 분리 공정에서, 높은 빈도로 자발적 돌연변이가 염색체상의 yggB 유전자내로 도입된다. 이어서, 과량의 비오틴을 함유하는 배지에서 균주를 배양함으로써, 분리된 균주의 L-글루탐산 생산능을 평가한다. 예를 들면, 후보 균주를 20ml의 배양 배지(30g/l 글루코즈, 15g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l 비타민 B1, 300㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(총 질소), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 1g의 열-멸균된 탄산칼슘을 부가하고 진탕하면서 균주를 배양한다. 당이 완전히 소비된 후, 축적된 L-글루탐산의 양을 측정한다. L-글루탐산을 생산하는 균주, 예를 들면 50% 이상(당에 대한 수율)의 L-글루탐산을 생산하는 균주를 선별하고, 선별된 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 yggB 유전자내로 돌연변이가 도입된 균주를 수득한다.
돌연변이형 yggB 유전자만을 보유한 균주를 작제하기 위해서, 플라스미드에 의해 피괴된 염색체상의 odhA 유전자를 야생형 odhA 유전자로 대체하는 것이 바람직하다. odhA 유전자에 결함이 있는 균주는 당이 없는 배지에서 상당히 느리게 성장한다. 하지만 odhA 유전자가 야생형 유전자로 복귀되면 당이 없는 배지, 예를 들면 CM2B 배지(10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl, 10㎍/l 비오틴, 20g/l 한천, KOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정함)에서 균주가 잘 성장할 수 있다. 따라서, odhA 유전자-파괴된 균주를 CM2B 플레이트에 도말하여, 성장이 개선된 균주를 선별한다. 이렇게 출현한 성장이 개선된 균주를 CM2B 플레이트에서 정제하고, 균주가 야생형 odhA 유전자를 포함하는지의 여부는, 잔존하는 벡터의 부재에 기반하여 항생제에 대한 균주의 민감성을 검사하여 평가할 수 있다. 또한, odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정할 수도 있다.
또한, 돌연변이형 yggB 유전자를 odhA-yggB 이중 돌연변이 균주로부터 클로닝하고, 야생형 균주내로 도입시킬 수도 있다. 예를 들면, 주형으로서 이중 돌연변이 균주의 염색체 DNA를 사용하고 서열번호 9 및 10에 제시된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 증폭시킬 수 있다. pHSC4(JP-A-05-007491) 또는 실시예 1에 기술된 자살벡터인 pBS3와 같이 코리네형 세균에 대한 온도 민감성 플라스미드에 증폭된 생성물을 삽입하여, 염색체상의 야생형 yggB 유전자를 돌연변이형 yggB 유전자로 대체시킨다. 돌연변이가 염색체상의 yggB 유전자내로 도입되었는지의 여부는 염색체상의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 확인할 수 있다.
(II-2) 전위요소를 사용하는 방법
코리네형 세균의 전위요소를 이용하여, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균을 스크리닝할 수도 있다. 전위요소에는 삽입서열(IS) 및 인공 트랜스포존이 포함될 수 있다. 돌연변이형 yggB 유전자는, 암호화 영역내로 우연히 삽입된 IS 및/또는 트랜스포존을 갖는 유전자, 또는 인공 트랜스포존을 사용하여 인공적으 로 수득한 유전자일 수 있다. 전위요소가 삽입된 균주는, 예를 들면 L-글루탐산 유사체에 대한 민감성의 감소에 기초하여 선별할 수 있다. L-글루탐산 유사체로서 4-플루오로글루탐산이 사용될 수 있다. 또한, 항생제-내성 유전자를 포함하는 인공 트랜스포존으로 항생제-내성 균주를 무작위로 선별하고, 항생제-내성 균주의 yggB 유전자의 길이를 PCR로 확인함으로써, 전위요소가 삽입된 균주를 선별할 수 있다.
코리네형 세균내로 IS를 도입시키기 위해 일본 공개특허 공보 제9-070291호에 기술된 방법을 사용할 수도 있다. IS의 양측면에 역위 반복체(IR) 사이에 끼어있는 트랜스포사제의 구조 유전자 및 마커 유전자를 포함한 인공 트랜스포존을 사용할 수도 있다. 이 경우, 트랜스포사제의 구조 유전자는 마커 유전자 및 IS와 함께 동일한 플라스미드에 존재하거나 별개의 플라스미드에 존재할 수 있다. 또한, 숙주 코리네형 세균의 염색체상에 존재하는 트랜스포존의 기능을 사용할 수도 있다. 코리네형 세균으로부터 유래한 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 예를 GenBank 승인번호로 제시하였다.
1. NCgl0179 Cgl0182; 트랜스포사제
2. NCgl0235 Cgl0238; 추정되는 트랜스포사제
3. NCgl0348 Cgl0355; 추정되는 트랜스포사제
4. NCgl0688 Cgl0718; 추정되는 트랜스포사제
5. NCgl0919 Cgl0959; 트랜스포사제
6. NCgl0993 Cgl1037; 트랜스포사제
7. NCgl1021 Cgl1066; 트랜스포사제
8. NCgl1464 Cgl1521; 추정되는 트랜스포사제
9. NCgl1496 Cgl1557; 트랜스포사제
10. NCgl1662 Cgl1733; 추정되는 트랜스포사제
11. NCgl1664 Cgl1734; 트랜스포사제
12. NCgl2131 Cgl2212; 트랜스포사제
13. NCgl2284 Cgl2367; 트랜스포사제
14. NCgl2392 Cgl2479; 추정되는 트랜스포사제
15. NCgl2418 Cgl2504; 추정되는 트랜스포사제
16. NCgl2420 Cgl2506; 추정되는 트랜스포사제
17. NCgl2460 Cgl2548; 예측된 트랜스포사제
18. NCgl2542 Cgl2631; 예측된 트랜스포사제
19. NCgl2665 Cgl2761; 추정되는 트랜스포사제
20. NCgl2748 Cgl2845; 추정되는 트랜스포사제
21. NCgl2850 Cgl2951; 예측된 트랜스포사제
IS 또는 인공 트랜스포존은 적당한 벡터, 예를 들면 코리네형 세균에서 복제할 수 있는 플라스미드를 사용하여, 코리네형 세균내로 도입시킬 수 있다. 플라스미드의 구체적 예에는 pHM1519[참조: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)], pAM330[참조: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)], 및 약물 내성 유전자를 보유하도록 이러한 플라스미드를 변형시킴으로써 수득된 플라스미드가 포함된다. 또한, 염색체상의 IS 또는 인공 트랜스포존을 효율적으로 증폭시키기 위해 상기 (1)에 기술된 바와 같은 온도 민감성 복제 오리진을 갖는 플라스미드가 바람직하게 사용된다(일본 공개특허 공보 제5-7491호 참조). 이러한 스크리닝에 사용되는 모균주는 바람직하게는 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산의 축적을 야기할 수 없는 균주, 예를 들면 씨. 글루타미컴의 야생형 균주인 ATCC13869 균주이다.
IS 또는 인공 트랜스포존을 보유하는 플라스미드를 코리네형 세균내로 도입시키는 방법으로서, 원형질체 방법[참조: Gene, 39, 281-286 (1985)], 전기천공 방법[참조: Bio/Technology, 7, 1067-1070 (1989)]과 같은 통상적으로 사용되는 방법 등이 사용될 수 있다.
온도 민감성 플라스미드가 보유하는 IS 또는 인공 트랜스포존의 코리내형 세균내로의 도입은, 플라스미드로 코리네형 세균을 형질전환시키고, 플라스미드가 복제하여 IS 또는 인공 트랜스포존이 세포당 수십 내지 수백 카피로 증폭되고 염색체상으로 IS 또는 인공 트랜스포존을 도입시킬 수 있게 하는 25℃에서 형질전환체를 배양하고, 이어서 과량의 플라스미드를 제거하기 위해 34℃에서 세포를 배양함으로써 수행할 수 있다. 또한, IS 또는 인공 트랜스포존만의 DNA 단편, 또는 코리네형 세균에서 복제할 수 없는 플라스미드 벡터(예를 들면, 에스케리키아 콜라이에서 복제할 수 있는 플라스미드 벡터)가, IS 또는 인공 트랜스포존을 코리네형 세균의 염색체내로 도입시키기 위해 사용될 수 있다[참조: 일본 공개특허 공보 제7-107976호, Vertes, A.A., Asai, Y., Inui, M., Kobayashi, M., Kurusu, Y. and Yukawa, H.: Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)].
L-글루탐산의 축적을 야기하는 균주를 선별하기 위해서, 염색체상에 IS 또는 인공 트랜스포존이 있는 균주를 과량의 비오틴을 함유하는 배지에서 배양한다. 이 균주의 염색체상의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균을 수득할 수 있다.
(II-3) 시험관내에서 yggB 유전자내로 돌연변이를 무작위로 도입시키는 방법
또한, 시험관내에서 yggB 유전자내로 돌연변이를 무작위로 도입시키고, 돌연변이 유전자를 코리네형 세균내로 도입시키고, 돌연변이형 yggB 유전자가 존재하여 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 균주를 스크리닝함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 수득할 수 있다. 스크리닝에 유용한 모균주는 바람직하게는 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산의 축적을 야기할 수 없는 균주, 예를 들면 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13869 균주, ATCC13032 균주, ATCC14067 균주, 및 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965 균주이다.
돌연변이형 yggB 유전자를 스크리닝하기 위해서 yggB에 결함이 있는 균주가 바람직하게 사용된다. sacB 유전자를 사용하는 상기한 방법과 유사한 방법에 의해, yggB 유전자-파괴된 균주를 작제할 수 있다. 예를 들면, yggB 유전자의 N-말단 단편을 제조하기 위해서, 서열번호 39 및 40에 제시된 프라이머 및 주형으로서 씨. 글루타미컴 ATCC13869의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 41 및 42의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 서열번호 40 및 41은 서로 상보적이다. 이어서, yggB 유전자의 내부서열이 결실된 단편을 제조하기 위해서, 주형으로서 등몰량의 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 39 및 42의 합성 DNA를 사 용하여 PCR을 수행한다.
수득된 PCR 단편을, 유전자 파괴를 위한 플라스미드, 예를 들면 레반 슈크라제 유전자를 보유한 pBS4S내로 삽입한다. yggB 유전자-파괴된 균주를 작제하기 위해서, 수득된 플라스미드를 코리네형 세균, 예를 들면 씨. 글루타미컴 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시킨다.
이어서, 예를 들면, 다음과 같이 yggB 유전자의 시험관내 돌연변이유발을 수행할 수 있다. 먼저, 코리네형 세균에서 복제할 수 있는 플라스미드내로 yggB를 클로닝한다. 수득된 yggB 유전자를 보유하는 플라스미드 약 10㎍을, 돌연변이유발제를 함유하는 완충액, 예를 들면 400mM 하이드록실아민 및 1mM EDTA (pH 6.0)를 함유하는 500mM 인산염 완충액에 용해시키고, yggB 유전자내로 돌연변이를 도입시키기 위해서 75℃에서 60 내지 90분 동안 가열한다. 돌연변이유발 후, SUPREC-02 (Takara Bio INC.) 등으로 플라스미드를 탈염시키고, 이어서 ATCC13869 △yggB 균주내로 도입시키고, 항생제를 함유하는 배지에서 형질전환체를 스크리닝한다. 대조군으로서, 돌연변이가 유발되지 않은, yggB 유전자 보유 플라스미드를 ATCC13869 △yggB 균주내로 도입시킨다. 출현한 형질전환체를 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하고, 진탕하면서 배양하고나서, 축적된 L-글루탐산의 농도를 측정한다. 야생형 yggB 유전자를 보유하는 플라스미드가 도입된 균주를 배양하는 배지에서는 실질적으로 L-글루탐산이 축적되지 않는 반면, 돌연변이형 yggB 유전자를 보유하는 플라스미드가 도입된 균주를 배양하는 배지에서는 상당한 양의 L-글루탐산이 축적된다. 균주가 돌연변이형 yggB 유전자를 보유하는지의 여부는 균주로부터 플라스미 드를 추출하고 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 확인할 수 있다.
또한, 오류 유발(error prone) PCR, DNA 셔플링, 및 StEP-PCR[참조: Firth AE, Patrick WM; Bioinformatics. 2005 Jun 2; Statistics of protein library construction]과 같은 방법에 의해 yggB 유전자내로 돌연변이를 인공적으로 도입시킴으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 수득할 수 있다.
염색체상의 yggB 유전자내로 돌연변이를 도입시키는 방법에는, 상기한 방법 외에도, 코리네형 세균에 X-선 또는 자외선을 조사하거나 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘과 같은 돌연변이유발제를 처리하고 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 균주를 선별하는 방법이 포함된다. 돌연변이형 yggB 유전자가 도입되었는지의 여부는 염색체상의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 확인할 수 있다.
(II-4) L-글루탐산 유사체-내성 균주를 스크리닝하는 방법
야생형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균을 L-글루탐산 유사체를 함유하는 배지에서 배양하고, 배지에서 성장할 수 있는 L-글루탐산 유사체-내성 균주를 선별함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 수득할 수 있다. 이 방법에서 사용되는 모균주는 바람직하게는 상기한 코리네형 세균의 야생형 균주이고, 야생형 yggB 유전자를 갖는 균주일 수도 있으며, 야생형 yggB 유전자를 포함하는 플라스미드를 갖는 균주가 포함된다.
본원에서 사용되는 "L-글루탐산 유사체"에는 γ-메틸 L-글루타메이트, α-메틸 글루탐산, β-하이드록시글루탐산, 메티오닌설폭시민, 글루탐산-γ-모노하이드 록사메이트, 2-아미노-4-포스포노부티르산, γ-모노에틸 L-글루타메이트, 디메틸 L-글루타메이트, 디-t-부틸 L-글루타메이트, 모노플루오로글루탐산, 디에틸 L-글루타메이트, D-글루탐산, 및 4-플루오로글루탐산이 포함되고, 이들 가운데 4-플루오로글루탐산이 바람직하게 사용된다. 예를 들면, 다음과 같이 L-글루탐산 유사체-내성 균주를 수득할 수 있다. 즉, L-글루탐산 유사체를 함유하는 최소 배지에 코리네형 세균을 접종하고, 24 내지 48시간 후에 출현하는 콜로니를 수거한다. 배지에 첨가되는 L-글루탐산 유사체의 농도는 바람직하게는, 비돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주는 성장할 수 없고 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주는 성장할 수 있는 농도이다. 구체적으로, 4-플루오로글루탐산의 농도는 1.25mM 이상, 바람직하게는 2.5mM 이상, 보다 바람직하게는 5mM 이상이다. 예를 들면, 본원에서 사용되는 "L-글루탐산 유사체-내성 균주"는, 야생형 균주의 생존성 세포 수(콜로니를 형성할 수 있는 세포의 수)가 4-플루오로글루탐산이 없을 때의 1/100 이하로 억제되는 4-플루오로글루탐산을 함유한 배지에서 균주를 배양할 때, 균주가 4-플루오로글루탐산 없이 배양된 균주의 1/10 이상의 성장을 나타내는 것을 의미한다.
수득된 L-글루탐산 유사체-내성 균주를 과량의 비오틴을 함유하는 액체 배지에 접종하고, 진탕하면서 배양하고나서, 배지에 축적된 L-글루탐산의 농도를 측정한다. 야생형 yggB 유전자를 갖는 균주는 L-글루탐산을 거의 축적하지 못하는 반면, L-글루탐산 유사체-내성 균주의 일부는 상당한 양의 L-글루탐산을 축적한다. 이러한 균주로부터 yggB 유전자를 증폭시키고 그것의 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써 새로운 돌연변이형 yggB 유전자를 수득할 수 있다.
(III) 돌연변이형 yggB 유전자
이하, 돌연변이형 yggB 유전자의 구체적 예를 기술할 것이다. 그러나 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자는 이러한 유전자들로 제한되지 않는다.
상기한 방법에 의해 수득된 돌연변이형 yggB 유전자는, 코리네형 세균내로 도입되는 경우 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 한, 특별히 제한되지 않는다.
(III-1) yggB 유전자의 C-말단 영역내의 돌연변이
이 돌연변이는 서열번호 6, 68, 84 또는 85의 아미노산 419번 내지 533번, 또는 서열번호 62의 아미노산 419번 내지 529번을 암호화하는 영역내로 도입된다. 예를 들면, 서열번호 5에서 이 영역은 뉴클레오타이드 2692번 내지 3035번으로 이루어진 영역에 상응한다. 이 돌연변이는, 이 영역내로 도입되는 한, 어떠한 유형이라도 될 수 있으며, 점 돌연변이 및 인공 서열의 삽입을 포함한다. 이들 가운데, 삽입 서열(IS) 또는 인공 트랜스포존을 도입시키는 돌연변이가 바람직하다. 돌연변이는 점 돌연변이, IS 또는 트랜스포존의 삽입의 결과로, 아미노산 치환(미스-센스 돌연변이), 프레임-이동, 또는 종결 코돈(넌-센스 돌연변이)을 야기할 수 있다.
(III-1-1) 전위요소의 삽입에 의한 돌연변이 (2A-1형 돌연변이)
C-말단 영역내의 돌연변이의 예에는 삽입 서열(IS)과 같은 전위요소를 서열번호 5의 2691번 위치의 "G" 다음에 삽입시키는 돌연변이가 포함된다. 이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7에 제시되어 있고, 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 8에 제시되어 있다. 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열내로 삽입된 IS는 IS1207(GenBank 승인번호 X96962) 및 IS719(GenBank 승인번호 E12759)와 높은 상동성을 갖는다. 서열번호 8의 아미노산 서열에서, 419번 위치의 Val을 포함하는 C-말단 영역 및 그 이후의 Ygg 단백질(서열번호 6)은 IS로부터 유래한 더 짧은 서열로 대체된다. 서열번호 6, 62, 68, 84, 및 85의 아미노산 서열내의 C-말단 영역을 변화 또는 결실시키는 돌연변이를 포함하여, 이 유형의 돌연변이는 2A-1형 돌연변이라 명명한다.
또한, 2A-1형 돌연변이에는 다른 IS 또는 트랜스포존을 2A-1형 돌연변이와 동일한 위치내로 도입시키는 다른 돌연변이도 포함된다. IS 또는 트랜스포존이 삽입되는 위치는, 상기한 영역내에 위치하는 한, 어떠한 위치라도 될 수 있다. 트랜스포사제가 쉽게 인식할 수 있는 위치, 또는 IS가 쉽게 삽입될 수 있는 돌연변이 다발점(hot spot)으로 IS가 삽입되는 것이 바람직하다.
(III-1-2) 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이 (66형 및 22형 돌연변이)
또한, C-말단 영역내의 돌연변이의 예에는 C-말단 영역내의 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이도 포함된다. 서열번호 6의 아미노산 서열에서 다음과 같은 위치의 프롤린은 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
424번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 424번)
437번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 437번)
453번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 453번)
457번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 457번)
462번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 462번)
469번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 469번)
484번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 484번)
489번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 489번)
497번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 497번)
515번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 515번)
529번 위치의 Pro (서열번호 68, 84, 85의 529번, 서열번호 62의 525번)
533번 위치의 Pro (서열번호 68, 84, 85의 533번, 서열번호 62의 529번)
YggB 단백질의 C-말단 영역에 있는 프롤린 잔기가 YggB 단백질의 3차원 구조의 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다[참조: Protein Eng. 2002 Jan; 15(1):29-33, J Biol Chem. 1991 Dec 25; 266(36):24287-94].
특히, 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 424번 위치의 프롤린 및/또는 437번 위치의 프롤린을 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다.
다른 아미노산의 예에는 Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Ser, Trp, Tyr, Val, 및 Thr이 포함된다. 424번 위치의 프롤린을 치환하는 다른 아미노산으로서 Ala, Gly, Val, Leu, 및 Ile과 같은 소수성 아미노산이 바람직하고, Leu, Val, 및 Ile과 같이 분지쇄를 갖는 아미노산이 보다 바람직하다. 424번 위치의 Pro을 Leu으로 치환시키는 돌연변이의 예에는 서열번호 67의 1673번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이가 포함된다. 이 돌연변이 를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 69에 제시되어 있고, 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 70에 제시되어 있다.
437번 위치의 프롤린을 치환하는 다른 아미노산으로서 Thr, Ser, Tyr과 같이 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산이 바람직하고, Ser을 포함한 아미노산이 보다 바람직하다. 437번 위치의 Pro을 Ser으로 치환시키는 돌연변이의 예에는 서열번호 5의 2745번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이가 포함된다. 또한, 이 돌연변이에는 서열번호 5의 3060번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이도 포함된다. 이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 73에 제시되어 있고, 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 74에 제시되어 있다.
(III-2) yggB 유전자의 막관통 영역내의 돌연변이
yggB 유전자에 의해 암호화되는 YggB 단백질은 5개의 막관통 영역을 갖는 것으로 예상된다. 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85에 제시된 야생형 YggB 단백질의 아미노산 서열에서, 막관통 영역은 아미노산 1번 내지 23번(첫 번째 막관통 영역), 아미노산 25번 내지 47번(두 번째 막관통 영역), 아미노산 62번 내지 84번(세 번째 막관통 영역), 아미노산 86번 내지 108번(네 번째 막관통 영역), 및 아미노산 110번 내지 132번(다섯 번째 막관통 영역)에 상응한다. 서열번호 5에서, 이러한 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 1437번 내지 1505번, 뉴클레오타이드 1509번 내지 1577번, 뉴클레오타이드 1620번 내지 1688번, 뉴클레오타이드 1692번 내지 1760번, 및 뉴클레오타이드 1764번 내지 1832번에 각각 상응한다. 이 유형의 돌연변이는 바람직하게는 이러한 영역내로 도입된다. 이러한 종류의 돌연변이는 바람직하게는, 프레임 이동 돌연변이 및 해독 종결을 야기하지 않으면서 이러한 영역내로 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가, 삽입 또는 역위를 도입시킨다. 이들 가운데, 상기한 영역에서 아미노산 치환을 야기하는 미스-센스 돌연변이가 바람직하다. 치환, 결실, 부가, 삽입 또는 역위되는 "수개"의 아미노산의 수는 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 바람직하게는 2 내지 3개를 의미한다. 프레임 이동 없이 1개 또는 수개의 아미노산의 삽입 및 결실을 야기하는 돌연변이도 바람직하고, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 또는 21개의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실이 보다 바람직하며, 3, 6, 또는 9개의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입이 보다 바람직하고, 3개의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입이 보다 바람직하다.
막관통 영역내의 돌연변이의 구체적 예에는 다음이 포함된다:
(III-2-1) 첫 번째 막관통 영역내의 돌연변이(A1형 돌연변이)
이 유형의 돌연변이에는 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85에 제시된 아미노산 서열에서 14번 위치의 류신과 15번 위치의 트립토판 사이에 하나 이상의 아미노산을 도입시키는 돌연변이가 포함되고, 특히 14번 위치의 류신과 15번 위치의 트립토판 사이에 3개의 아미노산, 예를 들면 Cys-Ser-Leu을 도입시키는 돌연변이가 포함된다. 이 돌연변이에는 서열번호 5의 야생형 yggB 유전자에서 1480번 위치의 G 다음에 TTCATTGTG를 삽입시키는 돌연변이가 포함된다. 이 돌연변이를 갖는 돌연변이 형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 20에 제시되어 있다.
(III-2-2) 네 번째 막관통 영역내의 돌연변이(19형 돌연변이)
이 유형의 돌연변이에는 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85에 제시된 아미노산 서열에서 100번 위치의 Ala을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이가 포함된다. 다른 아미노산의 예에는 Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, Val, 및 Thr이 포함된다. 이들 가운데, Thr, Ser, 및 Tyr과 같이 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산이 바람직하며, 트레오닌이 보다 바람직하다. 100번 위치의 Ala을 Thr으로 치환시키는 돌연변이에는 서열번호 5의 1734번 위치의 "G"를 "A"로 치환시키는 돌연변이가 포함된다.
이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 21에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시되어 있다.
(III-2-3) 다섯 번째 막관통 영역내의 돌연변이(L30형 돌연변이, 8형 돌연변이)
이 유형의 돌연변이에는 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85에 제시된 아미노산 서열에서 111번 위치의 Ala을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이가 포함된다. 다른 아미노산의 예에는 Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, Val, 및 Thr이 포함된다. 이들 가운데, Val, Ile, 및 Leu과 같이 분지쇄를 갖는 아미노산 및 Thr, Ser, 및 Tyr과 같이 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산이 바람직하고, Val 또는 Thr이 바람직하다. 이 유형의 돌연변이에는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열의 1768번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이(L30형 돌연변이) 및 서열번호 61의 뉴클레오타이드 서열의 837번 위치의 "G"를 "A"로 치환시키는 돌연변이(8형 돌연변이)가 포함된다. L30형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 23에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시되어 있다. 8형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 63에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 64에 제시되어 있다.
(IV) 돌연변이형 yggB 유전자와 동등한 유전자
본 발명에서 사용되는 "돌연변이형 yggB 유전자"는 상기한 "돌연변이형 yggB 유전자"와 실질적으로 상동성을 갖고 기능적으로 동등한 유전자, 예를 들면 과량의 비오틴의 존재하에서 유전자가 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 한, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 1437번 내지 2705번, 서열번호 19의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3044번, 서열번호 21의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 63의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 서열번호 69의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 서열번호 23의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 및 서열번호 73의 뉴클레오타이드 548번 내지 2146번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열 가운데 적어도 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서 열 및 이러한 뉴클레오타이드 서열로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돌연변이형 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 "엄중한 조건"이란 소위 특이적인 하이브리드는 형성되고 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 엄중한 조건의 예에는, 높은 상동성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화 하는 조건, 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화하고, 70% 이하의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화하지 않는 조건, 및 서던 하이브리드화의 전형적 세척과 염 농도에서, 즉 60℃에서 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 68℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 바람직하게는 2 내지 3회 세척하에 DNA가 서로 하이브리드화하는 조건이 포함된다.
본 발명에서 사용되는 돌연변이형 yggB 유전자에는, 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 유지하는 동시에, 상기한 구체적 아미노산 이외의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된, 서열번호 8, 20, 22, 24, 64, 70, 또는 74의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된다. 여기서 언급된 "수개"의 아미노산 잔기의 수는 3차원 구조에서의 위치 또는 단백질의 아미노산 잔기의 유형에 따라 다를 수 있지만, 바람직하게는 2 내지 20개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개, 특히 바람직하게는 2 내지 5개이다.
yggB 유전자는 바람직하게는, 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 유지하는 동시에, 상기한 구체적 아미노산 치환 또는 결실을 갖고, 서열번호 8, 20, 22, 24, 64, 70, 또는 74에 제시된 아미노산 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화한다. 상기한 치환은 바람직하게는 보존적 치환(중성 돌연변이)이다. 방향족 아미노산의 경우, 보존적 치환은 phe, trp, 및 tyr 서로 간의 치환을 포함한다. 소수성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 leu, ile, 및 val 서로 간의 치환을 포함한다. 극성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 gln 및 asn 서로 간의 치환을 포함한다. 염기성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 arg, lys, 및 his 서로 간의 치환을 포함한다. 산성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 asp 및 glu 서로 간의 치환이다. 하이드록실 그룹 함유 아미노산의 경우, 보존적 치환은 ser 및 thr 서로 간의 치환을 포함한다. 보존적 치환은 또한 Ala에서 Ser 또는 Thr으로의 치환, Arg에서 Gln, His 또는 Lys으로의 치환, Asn에서 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp에서 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys에서 Ser 또는 Ala으로의 치환, Gln에서 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg으로의 치환, Glu에서 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly에서 Pro으로의 치환, His에서 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr으로의 치환, Ile에서 Leu, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Leu에서 Ile, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Lys에서 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg으로의 치환, Met에서 Ile, Leu, Val 또는 Phe으로의 치환, Phe에서 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu으로의 치환, Ser에서 Thr 또는 Ala으 로의 치환, Thr에서 Ser 또는 Ala으로의 치환, Trp에서 Phe 또는 Tyr으로의 치환, Tyr에서 His, Phe 또는 Trp으로의 치환, 및 Val에서 Met, Ile 또는 Leu으로의 치환을 포함한다. 상기한 바와 같이, 서열번호 85의 아미노산 서열에서 Xaa로 제시된 아미노산은 치환될 수 있다.
특히, 서열번호 8, 20, 22, 24, 64, 70, 또는 74의 아미노산 서열에서 다음의 아미노산은 치환 또는 결실될 수 있다.
48번 위치의 Glu (바람직하게는 Arg으로 치환된다)
275번 위치의 Asp (바람직하게는 Ser으로 치환된다)
298번 위치의 Glu (바람직하게는 Ala으로 치환된다)
343번 위치의 Ala (바람직하게는 Val으로 치환된다)
396번 위치의 Phe (바람직하게는 Ile으로 치환된다)
438번 위치의 Ser (바람직하게는 Gly으로 치환된다)
445번 위치의 Val (바람직하게는 Ala으로 치환된다)
454번 위치의 Ala (바람직하게는 Val으로 치환된다)
457번 위치의 Pro (바람직하게는 Ser으로 치환된다)
474번 위치의 Ser (바람직하게는 Asp로 치환된다)
517번 위치의 Val (바람직하게는 결실된다)
518번 위치의 Glu (바람직하게는 결실된다)
519번 위치의 Ala (바람직하게는 결실된다)
520번 위치의 Pro (바람직하게는 결실된다)
(V) 상기한 돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균내로 도입시키는 방법
상기한 구체적 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자는 부위-지시된 돌연변이유발 기술을 포함하는 통상적인 방법에 의해 수득할 수 있다. 부위-지시된 돌연변이유발 기술에는 돌연변이를 갖는 PCR 프라이머를 이용하여 돌연변이 유전자를 증폭시키는 중첩연장 PCR 방법이 포함된다[참조: Urban, A., Neukirchen, S. and Jaeger, K. E., A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR. Nucleic Acids Res, 25, 2227-8. (1997)].
상기한 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 본 발명의 코리네형 세균은 상기한 돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균내로 도입시킴으로써 수득할 수 있다. 염색체상의 야생형 yggB 유전자를 돌연변이형 yggB 유전자로 대체시킬 수 있다. 돌연변이형 yggB 유전자를 야생형 yggB 유전자가 파괴된 코리네형 세균내로 도입시킬 수도 있다. 또한, 단일교차 재조합체의 경우에서와 같이 돌연변이형 yggB 유전자가 코리네형 세균내에서 야생형 yggB 유전자와 공존할 수 있다. 예를 들면, 상기한 레반 슈크라제를 암호화하는 sacB 유전자를 포함하는 온도 민감성 플라스미드를 사용하여 염색체상의 yggB 유전자를 대체시킬 수 있다. 또한, 돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균내로 도입시키기 위해서, 코리네형 세균내에서 복제할 수 있는 플라스미드 또는 돌연변이형 yggB 유전자를 포함하는 트랜스포존과 같은 벡터를 사용할 수 있다.
돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균의 염색체 DNA내로 도입시키기 위해서, 염색체 DNA상에 다수의 카피로 존재하는 서열을 표적하여 상동성 재조합을 수 행할 수도 있다. 이러한 서열의 예에는 전위요소의 말단에 있는 반복 DNA 및 역위 반복체가 포함된다. 돌연변이형 yggB 유전자는 코리네형 세균내에 단일 카피 또는 다수의 카피로 존재할 수 있다. PCR, 서던 하이브리드화 등의 방법으로 돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균내로 도입시킬 수 있다.
또한, 돌연변이형 yggB 유전자는, 국제 공보 제WO00/18935호에 기술된 바와 같이, 다른 유전자로부터 유래한 강한 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, PS2 프로모터 등이 강한 프로모터로서 알려져 있다. 돌연변이형 yggB 유전자의 발현이 향상되도록 돌연변이형 yggB 유전자의 프로모터 영역내의 뉴클레오타이드를 치환시킬 수도 있다. 발현 조절 서열을, 예를 들면 온도 민감성 플라스미드를 사용하여 대체시킬 수 있다.
(VI) L-글루탐산 유사체 내성
또한, 본 발명의 코리네형 세균은, 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자가 도입된 결과로, L-글루탐산 유사체에 대한 내성이 향상될 수 있다. 본원에서 사용되는 "L-글루탐산 유사체"에는 γ-메틸 L-글루타메이트, α-메틸 글루탐산, β-하이드록시글루탐산, 메티오닌설폭시민, 글루탐산-γ-모노하이드록사메이트, 2-아미노-4-포스포노부티르산, γ-모노에틸 L-글루타메이트, 디메틸 L-글루타메이트, 디-t-부틸 L-글루타메이트, 모노플루오로글루탐산, 디에틸 L-글루타메이트, D-글루탐산, 및 4-플루오로글루탐산이 포함된다. 예를 들면, 모균주의 생존성 세포 수(콜로니를 형성할 수 있는 세포의 수)가 1/100 이하로 억제될 수 있는 농도의 4-플루오로글루탐산을 함유한 배지에서 본 발명의 균주를 배양할 때, 균주가 4-플루오로글루탐산 없이 배양될 때와 비교하여 1/10 이상의 성장을 나타낸다는 사실에 의해, L-글루탐산 유사체에 대한 내성의 향상을 확인할 수 있다. 구체적으로는, 균주가 1.25mM 이상, 바람직하게는 2.5mM 이상, 보다 바람직하게는 5mM 이상의 4-플루오로글루탐산에 대한 내성을 갖는 것이 바람직하다.
(VII) 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자를 불활성화시키기 위한 추가의 변형
본 발명의 코리네형 세균은, 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자를 불활성화시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. "돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자"는 균주내에서 증폭하여 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주에 의한 L-글루탐산 생산을 억제하는 유전자를 의미한다. 이러한 유전자의 예에는 symA(suppressor of yggB mutation) 유전자가 포함된다. symA 유전자는 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032 균주의 게놈 서열(Genbank 승인번호 NC_003450)의 뉴클레오타이드 2051306번 내지 2051845번으로서 제시되어 있으며, NCgl 1867(NP_601149. hypothetical prot...[gi:19553147])로서 등록되어있다. 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13869 균주의 symA 유전자는 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번에 제시되어 있다. symA 유전자는, DNA가 코리네형 세균에서 상기 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 한, 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 DNA일 수 있다.
유전자의 발현을 감소시키기 위해 유전자를 파괴, 결실, 또는 변형시킴으로 써 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 효소 활성을 저하시키기 위한 상기의 방법과 유사한 방법을 사용하여 symA 유전자를 불활성화시킬 수 있다.
(VIII) α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성을 저하시키기 위한 추가의 변형
본 발명에서, 코리네형 세균은 yggB 유전자를 사용한 변형 외에도, 바람직하게는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(이하, "α-KGDH"로 언급된다)의 활성이 저하되도록 변형된다. "α-KGDH 활성이 저하된다"는 α-KGDH 활성이 모균주와 같은 야생형 균주 또는 비변형 균주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. α-KGDH 활성은 문헌[참조: Shiio et al. Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44(8), 1897-1904, 1980]의 방법에 따라서 측정할 수 있다. α-KGDH 활성은 야생형 균주 또는 모균주와 같은 비변형 균주와 비교하여 저하되는 것으로도 충분하지만, 야생형 또는 비변형 균주에 대하여 약 1/2배 이하, 바람직하게는 약 1/4배 이하, 보다 바람직하게는 약 1/10배 이하로 α-KGDH 활성이 저하되는 것이 바람직하다. 본 발명의 코리네형 세균은 검출가능한 α-KGDH 활성을 갖지 않을 수 있다.
α-KGDH 활성이 저하된 코리네형 세균은 상기의 방법과 유사한 방법으로 작제할 수 있다.
예를 들면, 티아민 피로포스페이트 결합 영역(서열번호 43의 뉴클레오타이드 2498번 내지 2584번(서열번호 44의 686번 Gly 내지 714번 Asp)에 의해 암호화되는 영역)내에 돌연변이를 포함하는 α-KGDH 복합체의 E1o 서브유닛을 암호화하는 유전 자를 도입시킴으로써 α-KGDH 활성을 저하시킬 수 있다.
저하된 α-KGDH 활성을 갖는 균주의 예에는 브레비박테리움 락토퍼멘텀 △S 균주(WO95/34672) 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ12821(FERM BP-4172) 균주(JP-A-06-237779)가 포함된다. 돌연변이형 yggB 유전자를 보유하고 저하된 α-KGDH 활성을 갖는 코리네형 세균을 사용하는 경우, α-KGDH 활성을 먼저 저하시키거나 또는 돌연변이형 yggB 유전자를 먼저 도입시킬 수 있다.
<2> L-글루탐산 생산 방법
배지 및/또는 세균 세포내에 L-글루탐산이 축적되도록 본 발명의 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 배지 및/또는 세균 세포로부터 L-글루탐산을 수거하여 L-글루탐산을 생산할 수 있다. 본 발명의 생산 방법에서, 바람직하게는 본 발명의 코리네형 세균을, 예를 들면 25 내지 40℃에서 8 내지 120시간 동안 배양하여 L-글루탐산을 생산한다.
배양 배지는 탄소원, 질소원, 무기 염, 및 임의로 아미노산 및 비타민과 같은 유기 미량영양소를 함유하는 통상적인 배지일 수 있다. 합성 배지 또는 천연 배지가 사용될 수 있다. 배양되는 균주에 의해 사용될 수 있는 한 어떠한 종류의 탄소원 및 질소원이라도 사용할 수 있다.
글루코즈, 글리세롤, 프럭토즈, 슈크로즈, 말토즈, 만노즈, 갈락토즈, 전분 가수분해물, 및 당밀과 같은 당류가 탄소원으로 사용될 수 있다. 또한, 아세트산, 시트르산과 같은 유기산 및 에탄올과 같은 알코올도 단독으로 또한 함께 탄소원으로서 사용될 수 있다. 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 및 암모늄 아세테이트, 니트레이트 등과 같은 암모니아, 암모늄 염이 질소원으로서 사용될 수 있다. 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 펩톤 함유 물질, 카사미노산, 효모 추출물 및 대두 단백질 분해 산물이 유기 영양소로서 소량으로 사용될 수 있다. 성장을 위해 아미노산 등이 필요한 영양요구성 돌연변이 균주가 사용되는 경우, 당해 필요한 영양분을 부가하는 것이 바람직하다. 인산염, 마그네슘 염, 칼슘 염, 철 염, 망간 염 등이 무기 염으로서 사용될 수 있다.
배양될 균주에 따라 Tween40과 같은 계면활성제, 페니실린, 또는 비오틴을 적당량 첨가할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주를, 계면활성제 또는 페니실린을 함유하는 L-글루탐산 생산 조건 또는 비오틴이 제한된 조건에서 배양할 수도 있지만, 과량의 비오틴의 존재하에서 배양할 수 있다.
바람직하게는, 발효 온도를 조절하고 배양 배지의 pH를 3 내지 9로 조정하여 호기적 배양을 수행한다. 배양하는 동안에 pH가 낮아지는 경우, 탄산칼슘 또는 암모니아 가스와 같은 알칼리를 부가하여 배지를 중화시킨다. 약 10 내지 약 120시간 동안 배양하면 상당한 양의 L-글루탐산이 배지에 축적된다.
또한, 생산된 L-글루탐산이 결정화하고 침전하는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용하여 배양할 수 있다. L-글루탐산이 결정화하는 조건에는 pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 보다 바람직하게는 pH 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 pH 4.0이 포함된다(EP1233069, EP1233070).
배양 완료 후에 배지로부터 통상적인 방법으로 L-글루탐산을 수거할 수 있다. L-글루탐산은, 예를 들면 배지로부터 세균 세포를 제거하고 L-글루탐산을 농축 시키거나, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수거할 수 있다. L-글루탐산이 결정화하고 침전하는 조건하에서 배양하는 경우, 결정화된 L-글루탐산은, 예를 들면 원심분리 또는 여과에 의해 수거할 수 있다. 이 경우, 배지에 용해된 L-글루탐산은 용해된 L-글루탐산이 결정화된 후에 수거할 수도 있다.
본 발명에 따라, yggB 유전자를 이용하여 변형된 균주를 사용함으로써 효율적으로 L-글루탐산을 생산한다.
이하, 하기 비제한적 실시예를 참조로 하여 본 발명을 구체적으로 설명할 것이다.
실시예 1
<유전자 파괴를 위한 sacB 유전자를 보유하는 벡터의 작제>
(1-1) pBS3의 작제
국제 공보 제WO2005/113745호 및 국제 공보 제WO2005/113744호의 방법을 사용함으로써 sacB 유전자를 보유하는 유전자 파괴 벡터를 작제하였다. 주형으로서 바실러스 섭틸리스의 염색체 DNA 및 프라이머로서 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR에 의해 sacB 유전자(서열번호 11)를 수득하였다. LA taq(구입원: TaKaRa)을 이용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다: 94℃에서 5분 동 안의 보온의 1회 사이클; 및 94℃에서 30초 동안의 변성, 49℃에서 30초 동안의 어닐링 및 72℃에서 2분 동안의 신장의 25회 사이클. 수득된 PCR 산물을 통상적인 방법으로 정제하고, 이어서 BglII 및 BamHI으로 분해시키고 평활말단화시켰다. AvaII로 분해되어 평활말단화된 pHSG299에 당해 단편을 삽입하였다. 수득된 DNA를 사용하여 에스케리키아 콜라이 JM109(구입원: TAKARA BIO INC.)의 컴피턴트 세포를 형질전환시켰다. 이어서, 형질전환된 세균 세포를 25㎍/ml의 카나마이신(이하, "Km"으로 약칭됨)을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하고 하룻밤 동안 배양하였다. 그 후에, 형질전환체로서 하나의 콜로니를 분리하였다. 수득된 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하고, 목적 PCR 산물이 삽입된 플라스미드를 pBS3이라 명명하였다. 도 1에 pBS3의 작제 공정이 도시되어 있다.
(1-2) pBS4S의 작제
SmaI 엔도뉴클레아제에 의해 pBS3가 절단되지 않도록, 아미노산 치환은 야기하지 않으면서 교차 PCR을 사용하여, pBS3 상의 카나마이신-내성 유전자 내의 SmaI 인식 부위를 뉴클레오타이드 치환에 의해 변형시켰다. 먼저, 주형으로서 pBS3 및 프라이머로서 서열번호 15 및 16의 합성 DNA를 사용한 PCR을 수행하여 카나마이신-내성 유전자의 N-말단 단편을 수득하였다. 한편, 카나마이신-내성 유전자의 C-말단 단편을 수득하기 위해서 주형으로서 pBS3 및 프라이머로서 서열번호 17 및 18의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. Pyrobest DNA 폴리머라제(구입원: TAKARA BIO INC.)를 이용하여 다음과 같이 PCR을 수행하여 목적 PCR 산물을 수득하였다: 98℃에서 5분 동안의 보온의 1회 사이클; 및 98℃에서 10초 동안의 변성, 57℃에서 30초 동안의 어닐링 및 72℃에서 1분 동안의 신장의 25회 사이클. 서열번호 16 및 17은 서로 부분적으로 상보적이고 SmaI 인식 부위를 포함하지 않는다. 이어서, SmaI 인식 부위가 없는 돌연변이 카나마이신-내성 유전자의 전체길이 단편을 수득하기 위해, 상기한 N-말단 및 C-말단 유전자 산물을 실질적인 등몰량으로 혼합하였다. SmaI 부위가 변형된 카나마이신-내성 유전자 단편을 수득하기 위해서, 주형으로서 유전자 산물 및 프라이머로서 서열번호 15 및 18의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. Pyrobest DNA 폴리머라제(구입원: TAKARA BIO INC.)를 이용하여 다음과 같이 PCR을 수행하여 목적 PCR 산물을 수득하였다: 98℃에서 5분 동안의 보온의 1회 사이클; 및 98℃에서 10초 동안의 변성, 57℃에서 30초 동안의 어닐링 및 72℃에서 1.5분 동안의 신장의 25회 사이클.
PCR 산물을 통상적인 방법으로 정제하고, 이어서 BanII로 분해시키고 상기한 pBS3의 BanII 인식 부위내로 삽입시켰다. 수득된 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(구입원: TaKaRa Bio)를 형질전환시켰다. 즉, 형질전환된 세균 세포를 25㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하고 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서, 출현한 콜로니를 형질전환체로서 선별하였다. 수득된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 목적 PCR 산물이 삽입된 플라스미드를 pBS4S라 명명하였다. 도 2에 pBS4S의 작제 공정이 도시되어 있다.
실시예 2
<씨. 글루타미컴 ATCC13869 균주로부터 odhA 유전자-파괴된 균주의 작제>
코리네형 세균의 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 이미 동정되었다[참조: Microbiology 142, 3347-3354, (1996), GenBank 승인번호 D84102]. odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기반하여, 서열번호 1 및 2에 기술된 프라이머를 고안하였고, odhA 유전자의 내부서열을 증폭시키기 위해 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하고 프라이머를 사용한 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 단편을 BamHI으로 완전히 분해시키고, 실시예 1에서 작제된 pBS4S의 BamHI 부위로 삽입시켜 pBS4S△sucAint 플라스미드를 수득하였다(도 3).
전기 펄스 방법(JP-A-02-207791)에 의해 pBS4S△sucAint를 씨. 글루타미컴 ATCC13869 균주내로 도입시키고, 형질전환된 세균 세포를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 한천 배지(5g/l 글루코즈, 10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 3g/l 우레아, 1.2g/l 대두 단백질 가수분해물, 및 20g/l 한천, NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조정함: 120℃에서 20분간 고압증기멸균함)에 도말하였다. 31.5℃에서 배양한 후, 출현한 균주로부터 추출한 각각의 염색체를 사용한 PCR을 수행하여, 이러한 균주가 상동성 재조합에 의해 염색체내로 pBS4S△sucAint가 혼입된 단일교차 재조합체임을 확인하였다. 각각 pBS4S 플라스미드에 특이적인 서열(서열번호 3) 및 염색체상의 서열에 상보적인 서열(서열번호 4)을 갖는 프라이머를 PCR에 사용하였다. 단일 단편이 단일교차 재조합체로부터 증폭되는 반면에, 비재조합체 균주에는 pBS4S의 서열이 없기 때문에 비재조합체 균주로부터는 단편이 증폭되지 않는다.
이렇게 수득된 단일교차 재조합체를 2A-1 균주라 명명하였다. 야생형 13869 균주 및 2A-1 균주를 20ml의 플라스크 배지(30g/l 글루코즈, 15g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1(비타민 B1), 300㎍/l 비오틴, 및 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N: 총 질소), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 1g의 열-멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 각각의 균주를 31.5℃에서 진탕하면서 배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 배지에 축적된 L-글루탐산의 농도를 측정하였다. 결과는 표 1에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). 과량의 비오틴의 존재하에서 모균주 ATCC 13869는 L-글루탐산을 전혀 생산하지 못한 반면에, 2A-1 균주는 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다.
실시예 3
<2A-1 균주로부터 odhA 유전자-복귀돌연변이 균주의 작제>
2A-1 균주에서, pBS4S△sucAint에 의해 염색체상의 odhA 유전자를 파괴하였다. 이 균주의 염색체로부터 플라스미드를 제거함으로써 odhA 유전자를 야생형 유전자로 복귀시킬 수 있었다. odhA 유전자-파괴된 균주는 당을 함유하지 않는 배지에서 매우 느리게 성장하지만, odhA 유전자가 야생형 유전자로 복귀된 odhA 유전자-복귀돌연변이 균주는 CM2B(10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl, 10㎍/l 비오틴, 20g/l 한천, KOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정함)와 같이 당을 함유하지 않는 배지에서 잘 성장한다. 이러한 복귀돌연변이 균주를 수득하기 위해서, 2A-1 균주를 CM2B 한천 배지에 도말하여 성장이 개선된 균주를 선별하였다. 출현한 성장이 개선된 균주를 2A-1R이라 명명하였고, CM2B 한천 배지상에 분리하였으며, 2A-1R 균주의 카나마이신-민감성을 검사하였다. 그 결과, 선별된 모든 균주가 카나마이신-민감성 및 슈크로즈-내성임이 밝혀졌다. pBS4S△sucAint는 카나마이신-내성 유전자 및 레반 슈크라제를 암호화하는 sacB 유전자를 포함하기 때문에, pBS4S△sucAint를 보유한 균주는 카나마이신-내성 및 슈크로즈-민감성을 나타내는 반면에, pBS4S△sucAint가 제거된 균주는 카나마이신-민감성 및 슈크로즈-내성을 나타낸다. 따라서, 2A-1R 균주내의 odhA 유전자가 야생형 유전자로 복귀된 것으로 생각된다. odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 균주가 야생형 odhA 유전자를 보유함을 확인하였다.
과량의 비오틴의 존재하에서 2A-1R 균주가 L-글루탐산을 생산하는 능력을 실시예 2와 같은 방법에 의해 확인하였다. 결과는 표 2에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). 2A-1R 균주에 의한 L-글루탐산의 축적은 2A-1 균주와 비교하여 약간 감소하였지만, 과량의 비오틴의 존재하에서 2A-1R 균주는 야생형 ATCC13869 균주보다 더 많은 L-글루탐산을 생산하였다(표 2). 또한, 당이 완전히 소비된 후 진탕배양을 계속한 경우에, L-글루탐산의 분해가 관찰되어, 이 균주에서 odhA 유전자가 야생형으로 복귀되었음이 입증되었다(도 4).
실시예 4
<2A-1R 균주의 L-글루탐산 생산에 관여하는 유전자의 분리>
CM2B 한천 배지상에서, 2A-1R 균주는 야생형 균주 ATCC13869와 실질적으로 동일한 비율로 콜로니를 형성할 수 있었다. 그러나 최소 플레이트 배지(20g/l 글루코즈, 2.64g/l 황산암모늄, 0.5g/l KH2PO4, 0.5g/l K2HPO4, 0.25g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·7H2O, 0.01g/l CaCl2, 0.02mg/l CuSO4, 40g/l MOPS, 30mg/l 프로토카테쿠산, 200㎍/l VB1·Hu, 300㎍/l 비오틴, 20g/l 한천, NaOH를 사용하여 pH 6.7로 조정함)상에서, 2A-1R 균주는 야생형 ATCC13869 균주와 비교하여 상당히 감소된 콜로니 형성 비율을 나타내었다. 따라서, 최소 배지에서 2A-1R 균주의 성장을 회복시킬 수 있는 유전자를 밝혔다.
ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 Sau3AI으로 부분적으로 분해시키고, BamHI으로 분해된 pVK9 셔틀벡터에 연결시켰다. 수득된 플라스미드를 에탄올로 침전시키고, 전기 펄스 방법에 의해 이. 콜라이 DH5α(TAKARA BIO INC.)의 컴피턴트 세포를 형질전환시키기 위해 사용하였다. pVK9은, pHSG299(TAKARA BIO INC.)의 AvaII 부위를 평활말단화시키고, 코리네형 세균에서 자발적으로 복제할 수 있는 서열을 포함하는, pHK4(JP-A-05-007491)로부터 BamHI 및 KpnI으로 절단된 단편을 삽입시킴으로써 수득된 셔틀벡터이다. 형질전환된 세포를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지(10g/l 폴리펩톤, 5g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl, 20g/l 한천, NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정함)에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날에, 출현한 모든 콜로니를 백금이로 플레이트로부터 수거하고, ATCC13869 균주의 플라스미드 라이브러리를 작제하기 위해 플라스미드를 추출하였다. 플라스미드 라이브러리를 실시예 3에서 수득된 2A-1R 균주로 전기 펄스 방법에 의해 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 최소 한천 배지에 적용시켰다. 콜로니 형성 비율의 증가를 나타내는 균주를 선별하였다. 콜로니 형성 비율의 증가를 나타내는 선별된 균주로부터 플라스미드를 추출함으로써, 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 단편이 pVK9의 BamHI 부위내로 삽입되었음이 밝혀졌다. 수득된 플라스미드를 pL5k라 명명하였다.
pL5k에 삽입된 뉴클레오타이드 서열을 이미 보고된 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032(승인번호 NC_003450)의 게놈 서열과 비교하여, pL5k가 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 1개의 ORF만을 보유함이 나타났다.
ORF가 막단백질을 암호화하는지의 여부를 예측하기 위해 인터넷상에서 입수할 수 있는 "SOSUI" 프로그램(sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.html, 2004년10월7일 현재)을 사용하였다. "SOSUI"를 이용한 ORF의 분석 결과는 이 아미노산 서열에 5개의 막관통 영역이 존재함을 시사하였다. 서열번호 6의 아미노산 서열에서, 막관통 영역은 아미노산 1번 내지 23번, 아미노산 25번 내지 47번, 아미노산 62번 내지 84번, 아미노산 86번 내지 108번, 및 아미노산 110번 내지 132번에 상응한다. 이러한 영역을 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 1505번, 뉴클레오타이드 1509번 내지 1577번, 뉴클레오타이드 1620번 내지 1688번, 뉴클레오타이드 1692번 내지 1760번, 및 뉴클레오타이드 1764번 내지 1832번에 상응한다. 이러한 영역의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 25 내지 29 및 표 3에 제시되어 있다.
추가적인 문헌의 검색에서, 상기 ORF를 YggB (NCgl1221)라 명명하는 것으로 나타났다[참조: FEMS Microbiology letters 218(2003) 305-309].
실시예 5
<2A-1R 균주의 yggB 유전자내로 도입된 돌연변이의 동정>
yggB 유전자는 최소 배지에서 2A-1R 균주의 성장을 회복시킬 수 있었고, 이는 2A-1R 균주의 yggB 유전자에 어떤 돌연변이가 있을 가능성을 시사하였다. 따라서, 2A-1R 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 그 결과, 2A-1R 균주에서 야생형 yggB 유전자의 C-말단 영액내로 IS가 삽입된 것으로 나타났다(도 5). 2A-1R 균주로부터 유래한 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7에 제시되어 있고, 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시되어 있다.
이는 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 2A-1R 균주의 능력이 yggB 유전자내의 돌연변이 때문이었을 가능성을 시사하였다. 이 돌연변이는 2A-1R 균주뿐만 아니라 2A-1 균주에도 존재했음을 유의해야 한다. 이 돌연변이는, odhA 유전자가 파괴된 경우, L-글루탐산을 세포로부터 안정하게 분비하기 위한 서프레서 돌연변이로서 발생한 것으로 예상된다. IS가 삽입된 돌연변이를 2A-1형 돌연변이라 명명하였다.
실시예 6
<2A-1형 돌연변이 yggB 유전자를 보유한 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
(6-1) 야생형 균주내로의 2A-1형 돌연변이의 도입 및 L-글루탐산 생산능의 평가 (단일교차 재조합체)
2A-1형 돌연변이를 갖는 yggB 유전자의 단편을 증폭시키기 위해 주형으로서 2A-1 균주의 염색체 DNA 및 프라이머로서 서열번호 9 및 10에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 산물을 SacI으로 처리하고 실시예 1에서 수득된 pBS3의 SacI 부위내로 삽입시켜 2A-1형 돌연변이 yggB 유전자를 보유한 플라스미드를 수득하였다(pBS3yggB2A).
수득된 pBS3yggB2A를 전기 펄스 방법에 의해 씨. 글루타미컴 ATCC13869내로 도입시키고, 형질전환된 세포를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 한천 배지에 도말하였다. 31.5℃에서 배양한 후 출현한 균주를 PCR로 평가하여, 상동성 재조합에 의해 염색체내로 pBS3yggB2A가 혼입된 단일교차 재조합체임을 확인하였다. 수득된 단일교차 재조합체를 13869-2A라 명명하였다. 이 균주에는, 야생형 yggB 유전자 및 돌연변이형 yggB 유전자가 둘다 존재하고 발현된다.
수득된 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주 13869-2A가 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 능력은 실시예 2에 기술된 방법에 의해 평가하였다. 결과는 표 4에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). 과량의 비오틴의 존재하에서 야생형 ATCC13869 균주가 L-글루탐산을 생산할 수 없을 때 13869-2A 균주는 L-글루탐산을 생산하였다. 이는 yggB 유전자내의 돌연변이가 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산 생산을 향상시킬 수 있음을 나타내었다.
(6-2) 야생형 균주내로의 2A-1형 돌연변이 yggB 유전자의 도입 및 L-글루탐산 생산능의 평가 (이중교차 재조합체)
돌연변이형 yggB 유전자만을 보유한 균주를 작제하기 위해서, 13869-2A 균주를 CM-Dex 액체 배지에서 하룻밤 동안 배양하고, 수득된 배양물을 S10 한천 배지(100g/l 슈크로즈, 10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 3g/l 우레아, 1.2g/l 대두 단백질 가수분해물, 20g/l 한천, NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조정함: 120℃에서 20분간 고압증기멸균함)에 도말하고 31.5℃에서 배양하였다. 출현한 콜로니 가운데, 카나마이신에 대한 민감성을 나타내는 균주를 CM2B 한천 배지상에 분리하였다. 염색체 DNA를 균주로부터 제조하였다. 이어서, 균주가 돌연변이형 yggB 유전자만을 보유함을 확인하기 위해 프라이머로서 서열번호 9 및 10에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. IS와 유사한 서열이 삽입된 돌연변이형 yggB 유전자를 보유한 균주를 13869-2A-7이라 명명하였다.
수득된 13869-2A-7 균주가 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 능력은 실시예 2에 기술된 방법에 의해 평가하였다. 결과는 표 5에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). 13869-2A-7 균주는 2A-1R 균주와 동등한 또는 보다 더 많은 L-글루탐산을 생산하여, 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산은 yggB 유전자내의 돌연변이에 의해 야기되었음이 확인되었다.
실시예 7
<A1형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
L-글루탐산을 생산하는 상기한 odhA 유전자-파괴된 균주(△sucA 균주)를 이용하여 스크리닝한 결과, 상기한 2A-1 돌연변이 외에도 yggB 유전자상에 다섯 종류의 돌연변이가 동정되었다. 이하, 이러한 돌연변이를 Al형 돌연변이, 19형 돌연변이, L30형 돌연변이, 8형 돌연변이, 및 66형 돌연변이라 명명하였다. 각각의 A1형 돌연변이, 19형 돌연변이, 및 L30형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자를 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 각 돌연변이의 영향을 평가하였다. 8형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자를 ATCC14067 균주의 염색체내로 도입시키고, 돌연변이의 영향을 평가하였다. 66형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자를 씨. 멜라세콜라 ATCC17965 균주의 염색체내로 도입시키고, 돌연변이의 영향을 평가하였다.
A1형 돌연변이는 야생형 yggB 유전자(씨. 글루타미컴의 야생형 유전자는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번에 제시되어 있다)의 1480번 위치의 "G" 다음에 "TTCATTGTG"를 삽입시키는 돌연변이이며, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 14번 위치의 Leu 및 15번 위치의 Trp 사이에 CysSerLeu의 삽입을 야기한다. 이러한 돌연변이가 도입된 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB의 아미노산 서열은 서열번호 20에 제시되어 있다.
다음과 같이 A1형 돌연변이 유전자를 수득할 수 있다. N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 31에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 32 및 33에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, A1형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 수득된 돌연변이형 yggB 유전자 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득한다. 이렇게 수득된 pBS4yggBA1을 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 플라스미드 부분만을 제거한다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, A1형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별한다. A1형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 ATCC13869-A1 균주라 명명하였다.
ATCC13869-A1 균주 및 ATCC13869 대조군 균주를 실시예 2와 같은 방법으로 배양하였다. 배양 완료 후에 배양 배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 공지된 방법에 의해 측정하였다. A1형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주는 과량의 비오틴의 존재하에서 대조군 균주와 비교하여 더 많은 양의 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다.
실시예 8
<19형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
19형 돌연변이는 야생형 yggB 유전자(씨. 글루타미컴의 야생형 유전자는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번에 제시되어 있다)의 1734번 위치의 "G"를 "A"로 치환시키는 돌연변이이며, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 100번 위치의 Ala을 Thr으로 치환시킨다. 이 유형의 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 21에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시되어 있다.
실시예 7과 같은 방법으로, 19형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 작제한다. 구체적으로는, N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 35에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 33 및 36에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, 19형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 수득된 yggB 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득한다. 이렇게 수득된 pBS4yggB19를 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거한다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 19형 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별한다. 19형 돌연변이 균주를 ATCC13869-19 균주라 명명하였다.
ATCC13869-19 균주 및 ATCC13869 대조군 균주를 실시예 2와 같은 방법으로 배양하였다. 배양 완료 후에 배양 액체배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 통상적인 방법에 의해 측정하였다. 19형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주는 과량의 비오틴의 존재하에서 대조군 균주와 비교하여 더 많은 양의 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다.
실시예 9
<L30형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
L30형 돌연변이는 야생형 yggB 유전자(씨. 글루타미컴의 야생형 유전자는 서열번호 5에 제시되어 있다)의 1768번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이이며, 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열에서 111번 위치의 Ala을 Val으로 치환시킨다. 이 유형의 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 23에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시되어 있다.
실시예 7과 같은 방법으로, L30형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 작제하였다. 구체적으로는, N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 37에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 34 및 38에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, L30형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 수득된 yggB 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득하였다. 이렇게 수득된 pBS4yggB-L을 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거하였다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, L30형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별하였다. L30형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 ATCC13869-L30 균주라 명명하였다.
ATCC13869-L30 균주 및 ATCC13869 대조군 균주를 실시예 2와 같은 방법으로 배양하였다. 배양 완료 후에 배양 액체배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 통상적인 방법에 의해 측정하였다. 결과는 표 8에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). L30형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 ATCC13869-L30 균주는 ATCC13869 모균주와 비교하여 더 많은 양의 L-글루탐산의 축적을 야기하였다.
실시예 10
<L-글루탐산 생산 조건하에서 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주의 평가>
코리네형 세균의 L-글루탐산 생산은 Tween40과 같은 계면활성제의 부가 또는 비오틴 농도의 제한에 의해 유도된다. 따라서, Tween40을 함유하는 조건 및 제한된 양의 비오틴을 함유하는 조건하에서 각각 ATCC13869 균주 및 ATCC13869-19 균주를 배양하였다.
각각의 균주를 20ml의 종균배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후에 수득된 배양 용액은 다음의 본배양에서 종균배양 용액으로서 사용하였다.
Tween40이 부가된 배양을 하기 위해서, 2ml의 종균배양 용액을 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 101배로 희석된 배양 액체배지의 OD620이 0.2에 도달했을 때, Tween40을 부가하여 최종농도가 5g/L가 되게 하고 배양을 계속하였다.
비오틴이 제한된 배양을 하기 위해서, 1ml의 종균배양 용액을 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 이러한 배양 조건하에서, 비오틴의 최종농도는 약 2.9㎍/L로 계산된다.
40시간 배양한 후, Tween40이 부가된 배양 및 비오틴이 제한된 배양에 대해 배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 측정하였다. 결과는 표 9에 제시되어 있다. ATCC13869-19 균주는 L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 대조군 균주보다 더 많은 양의 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다.
야생형 ATCC13869 균주, yggB 돌연변이 균주 ATCC13869-19, ATCC13869-A1, ATCC13869-L30, 및 야생형 yggB 유전자를 보유한 플라스미드를 갖는 균주(ATCC13869/pL5k-1), 및 대조군 플라스미드를 갖는 균주(ATCC13869/pVK9)를 Tween40을 부가하여 배양하였다. 이러한 각각의 균주를 CM-Dex 플레이트 배지상에서 하룻밤 동안 배양하고, 플레이트 면적의 1/6에서 수거한 세포를 20ml의 플라스크 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 및 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N: 총 질소), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 1g의 열-멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 각각의 균주를 31.5℃에서 진탕하면서 배양하였다. 5시간 배양한 후, Tween40을 부가하여 최종농도가 1g/L가 되게 하고 배양을 계속하였다. 24시간 후의 세포의 양(OD620) 및 배지에 축적된 L-글루탐산의 양은 표 10에 제시되어 있다. L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 ATCC13869-19 균주, ATCC13869-A1 균주, ATCC13869-L30 균주, 및 야생형 yggB 유전자를 보유한 플라스미드를 갖는 균주는 향상된 L-글루탐산 생산능을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 11
<8형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
8형 돌연변이는 서열번호 61의 837번 위치의 "G"를 "A"로 치환시키는 돌연변이이며, 서열번호 62의 아미노산 서열에서 111번 위치의 Ala을 Thr으로 치환시킨다. 이 유형의 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 63의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 64에 제시되어 있다.
실시예 7과 같은 방법으로, 8형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 작제한다. 구체적으로는, N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 65에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 34 및 66에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, 8형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 수득된 yggB 유전자 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득한다. 이렇게 수득된 pBS4yggB8을 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC14067 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거한다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 8형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별하였다. 8형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 ATCC14067-yggB8 균주라 명명하였다.
실시예 12
<66형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
66형 돌연변이는 서열번호 67의 1673번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이이며, 서열번호 68의 아미노산 서열에서 424번 위치의 Pro을 Leu으로 치환시킨다. 이 유형의 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 69에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 70에 제시되어 있다.
실시예 7과 같은 방법으로, 66형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 작제한다. 구체적으로는, N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 71에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 씨. 멜라세콜라 ATCC17965 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 34 및 72에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, 66형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 수득된 yggB 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득한다. 이렇게 수득된 pBS4yggB66을 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC17965 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거한다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 66형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별하였다. 66형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 ATCC17965-yggB66 균주라 명명한다.
실시예 13
<시험관내 돌연변이에 의한 돌연변이형 yggB 유전자의 스크리닝>
돌연변이형 yggB 유전자는, 시험관내에서 무작위 돌연변이를 야생형 yggB 유전자내로 도입시키고, 돌연변이-도입된 yggB 유전자로 코리네형 세균을 형질전환시키고, 과량의 비오틴의 존재하에서 계면활성제 또는 페니실린의 부가 없이 L-글루탐산을 생산할 수 있는 돌연변이 균주를 선별함으로써 수득할 수 있다.
(13-1) yggB 유전자-파괴된 균주의 작제
돌연변이형 yggB 유전자를 스크리닝하기 위해서, 먼저 yggB 유전자-파괴된 균주를 작제하였다. N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 39 및 40에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 41 및 42에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 서열번호 40 및 서열번호 41은 서로 상보적이다. 이어서, ORF가 결실된 yggB 유전자를 갖는 단편을 수득하기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 39 및 42에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다.
수득된 PCR 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 yggB 유전자 파괴에 유용한 플라스미드를 수득하였다. 이렇게 수득된 pBS4△yggB를 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거하였다. 주형으로서 수득된 카나마이신-민감성 균주의 염색체 DNA 및 프라이머로서 서열번호 39 및 42의 합성 DNA를 사용한 PCR을 수행하여 yggB 유전자가 파괴되었음을 확인하였다. 수득된 yggB-파괴된 균주를 ATCC13869△yggB 균주라 명명하였다.
(13-2) 돌연변이형 yggB 유전자의 시험관내 스크리닝
다음과 같이 yggB 유전자의 돌연변이유발을 수행하였다. 먼저, 상기한 pL5k 플라스미드를 XhoI 및 SalI으로 처리하고 자가-연결시켜 yggB 유전자 이외의 영역을 제거함으로써 pL5kXS 플라스미드를 수득하였다. SalI 인식 부위는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열상에는 존재하지 않고, pBS3의 다중-클로닝 부위상에는 존재한다. 수득된 pL5kXS의 약 10㎍을, 400mM 하이드록실아민 및 1mM EDTA (pH 6.0)를 함유하는 500mM 인산염 완충액에 용해시키고, 돌연변이를 도입시키기 위해서 75℃에서 30 내지 90분 동안 가열하였다. 돌연변이유발 처리 후 SUPREC-02 (구입원: TAKARA BIO INC.)를 이용하여 플라스미드를 탈염시키고, 이어서 실시예 6에 기술된 방법에 의해 ATCC13869△yggB 균주내로 도입시켰다. 형질전환된 세포를 25㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 CM2B 배지에서 스크리닝하였다. 대조군으로서, 돌연변이유발 처리를 하지 않은 pL5kXS를 ATCC13869△yggB 균주내로 도입시켰다. 출현한 형질전환체를 2ml의 CM2BGU2 액체 배지(추가로 10g/l 글루코즈 및 15g/l 우레아를 함유하는 실시예 3에 기술된 CM2B 배지)에 접종하고, 31.5℃에서 5시간 동안 진탕하면서 배양하고, 배양 액체배지에 축적된 L-글루탐산의 농도를 측정한다.
CM2BGU2 배지에서 돌연변이된 pL5kXS로 ATCC13869△yggB 균주를 형질전환시켜 수득된 균주의 배양 결과는 표 11에 제시되어 있다. 60 또는 90분 동안 돌연변이시킨 플라스미드로 형질전환시킨 형질전환체 가운데 1g/L 이상의 L-글루탐산의 축적을 야기하는 세 균주를 수득하였다. 초기 배지에 함유된 L-글루탐산의 양은 0.16g/L이고, ATCC13869△yggB/pL5kXS 대조군 균주(돌연변이유발 처리를 하지 않은)에 의해 축적된 L-글루탐산의 양은 0.31g/L였다.
CM2BGU 배지에서 돌연변이된 pL5kXS로 ATCC13869△yggB 균주를 형질전환시켜 수득된 형질전환체의 배양 결과는 표 12에 제시되어 있으며, CM2BGU 배지는 우레아의 농도가 1.5g/L인 것을 제외하고 상기한 CM2BGU2 배지와 조성이 같다. 90분 동안 돌연변이시킨 플라스미드로 형질전환시킨 형질전환체 가운데 1g/L 이상의 L-글루탐산의 축적을 야기하는 1개의 클론을 수득하였다.
60분 동안 돌연변이시킨 플라스미드로 형질전환시켜 1g/L 이상의 L-글루탐산을 생산한 표 11에 제시된 균주에서 플라스미드를 추출하고, 수득된 플라스미드를 pL5kXSm-22라 명명하였다. 60분 동안 돌연변이시킨 플라스미드로 형질전환시켜 0.9g/L 이상의 L-글루탐산을 생산한 표 12에 제시된 균주에서도 플라스미드를 추출하고, 수득된 플라스미드를 pL5kXSm-27이라 명명하였다. 플라스미드로 ATCC13869 균주를 형질전환시키고, 수득된 균주를 각각 ATCC13869△yggB/pL5kXS 및 ATCC13869△yggB/pL5kXSm-27, ATCC13869△yggB/pL5kXSm-22라 명명하였다. 이러한 균주를 실시예 2에 기술된 조건하에서 배양하고, 4시간 배양한 후 L-글루탐산 축적을 분석하였다. 3개의 독립적인 실험의 평균값은 표 13에 제시되어 있다. ATCC13869△yggB/pL5kXSm-27 균주 및 ATCC13869△yggB/pL5kXSm-22 균주는 비돌연변이된 플라스미드-도입된 균주보다 상당히 더 많은 양의 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자를 시험관내 무작위 돌연변이유발에 의해 수득할 수 있음을 증명한다. pL5kXSm-22에 포함된 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 73 및 75에 각각 제시되어 있다. pL5kXSm-22 플라스미드는 서열번호 5의 2745번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키고 서열번호 6의 437번 위치의 Pro을 Ser으로 치환시키는 돌연변이를 갖는다. 또한, 이 돌연변이는 서열번호 5의 3060번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이(22형 돌연변이)를 동반하였다. 이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 73에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 74에 제시되어 있다.
(13-3) 코리네형 세균내로의 돌연변이형 yggB 유전자의 도입 및 L-글루탐산 생산량의 평가
코리네형 세균내로 (13-2)에서 수득된 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시킨다. 유전자를 도입시키는 방법은 다음과 같다.
각각의 돌연변이형 yggB 유전자를 실시예 6에 기술된 방법에 의해 pBS4S내로 도입시키고, 수득된 플라스미드를 사용하여 염색체상의 야생형 yggB 유전자가 돌연변이형 yggB 유전자로 대체된 균주를 수득한다. 돌연변이형 yggB 유전자가 도입된 균주 및 ATCC13869 대조군 균주를 실시예 2와 같은 방법으로 배양하였다. 배양 완료 후에 배양 배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 공지된 방법에 의해 측정하여 돌연변이형 yggB 유전자의 도입으로 L-글루탐산의 축적이 증가함을 확인한다. 이러한 방법으로, L-글루탐산 생산능이 향상된 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주를 수득할 수 있다.
실시예 14
<돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주의 L-글루탐산 유사체-내성의 평가>
(14-1) 고체 배지상에서 4-플루오로글루탐산에 대한 내성의 평가
돌연변이형 yggB 유전자의 도입으로 인해 향상된 L-글루탐산 생산능을 갖는 균주는 L-글루탐산 유사체에 대한 민감성이 감소(내성이 증가)할 것이라고 예측하였다. 따라서, 4-플루오로글루탐산에 대한 균주의 민감성을 다음과 같이 분석하였다.
NaOH를 사용하여 pH 6.7로 조정하고 여과멸균한 4-플루오로글루탐산 용액을 실시예 4에 기술한 최소 배지에 부가하여 4-플루오로글루탐산의 최종농도가 7.5mM이 되게 하였다. 각각의 ATCC13869 균주, ATCC13869-L30 균주, 및 ATCC13869-A1 균주를 CM-Dex 플레이트에 도말하고 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트로부터 세포를 수거하고 멸균된 0.85% NaCl 용액으로 세척하였으며, 도 6에 기술된 세포 농도로 희석시키고, 4-플루오로글루탐산을 함유하는 플레이트 및 4-플루오로글루탐산을 함유하지 않은 대조군 플레이트에 접종하고, 31.5℃에서 배양하였다. 시간 경과에 따른 각 균주의 성장은 도 6에 도시되어 있다. 4-플루오로글루탐산이 없을 때 야생형 ATCC13869 균주는 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주보다 빠르게 성장하지만, 4-플루오로글루탐산의 존재하에서는 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주가 야생형 ATCC13869 균주보다 빠르게 성장한다.
(14-2) 액체 배지에서 4-플루오로글루탐산에 대한 내성의 평가
실시예 4에 기술한 것과 동일한 조성을 갖지만 한천을 함유하지 않는 최소 액체 배지에 4-플루오로글루탐산을 부가하여 최종농도가 각각 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 10mM, 및 20mM이 되게 하였다. 각각의 ATCC13869 균주, ATCC13869△yggB 균주, ATCC13869-L30 균주, 및 ATCC13869-A1 균주를 CM-Dex 플레이트에 도말하고 31.5℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 수거하고 멸균된 0.85% NaCl 용액으로 세척한 후에, 액체 배지에 접종하고 31.5℃에서 진탕하면서 배양하였다. 4-플루오로글루탐산 없이 배양된 각 균주의 OD660이 1.0에 도달했을 때, 배양을 종료하고 수득된 배양 용액을 적절하게 희석하여 하룻밤 동안 CM-Dex 플레이트에 도말하였다. 출현한 콜로니의 수를 계산하고 생존성 세포 수라 명명하였다. 도 7은 4-플루오로글루탐산이 없을 때 배양된 세포의 수를 1이라고 했을 때, 각 4-플루오로글루탐산 농도에서의 상대적인 세포 수를 도시한 것이다.
ATCC13869-A1 균주 및 ATCC13869-L30 균주는 4-플루오로글루탐산에 대한 민감성이 저하된 것으로 밝혀졌다.
이러한 결과는 4-플루오로글루탐산과 같은 L-글루탐산 유사체를 사용하여 스크리닝함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주를 수득할 수 있음을 또한 보여주었다.
실시예 15
<yggB 유전자 및 odhA 유전자-이중 돌연변이 균주의 작제>
돌연변이형 odhA 유전자를 상기한 ATCC13869-L30 균주내로 도입시킴으로써 yggB 유전자 및 odhA 유전자-이중 돌연변이 균주를 제조하였다.
먼저, 표 14에 제시된 각 돌연변이를 ATCC13869-L30 균주의 염색체상에 있는 α-KGDH의 E1o 서브유닛을 암호화하는 odhA 유전자내로 도입시켰다. 표 14에, 각각의 돌연변이형 odhA 유전자에서 서열번호 43의 뉴클레오타이드 2528번 내지 2562번에 상응하는 영역의 뉴클레오타이드 서열이 제시되어 있다. 표 15에, 돌연변이형 odhA 유전자에 의해 암호화된 각각의 아미노산 서열에서 서열번호 44의 아미노산 696번 내지 707번에 상응하는 영역의 아미노산 서열이 제시되어 있다.
서열번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 odhA 유전자가 도입된 L30sucA8 균주를 다음과 같이 수득할 수 있다. 서열번호 53 및 54의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 돌연변이 odhA 유전자 단편을 제조한다. 수득된 단편을 BamHI으로 분해시키고 Mutan-Super Express Km(Takara Bio)에 부착된 플라스미드 pKF19m의 BamHI 부위에 연결시킨다. 이어서, 인산화된 5'-말단을 갖는 서열번호 55의 프라이머 및 Mutan-Super Express Km의 선별 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고, 수득된 PCR 산물을 사용하여 MV1184 균주와 같은 sup0-이. 콜라이 균주를 형질전환시켜 돌연변이 odhA 단편을 보유하는 플라스미드를 수득한다. 이 단편을 pBS4S 플라스미드내로 삽입시키고 수득된 플라스미드를 사용하여 ATCC13869-L30 균주를 형질전환시킴으로써 플라스미드가 염색체내로 통합된 균주를 수득한다. 이어서, 이러한 균주로부터 슈크로즈에 대해 내성이고 카나마이신에 대해 민감성인 균주를 선별한다. 선별된 균주의 odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, odhA 유전자내의 프레임 이동 돌연변이에 의해 α-KGDH의 기능에 결함이 있는 균주를 ATCC13869-L30sucA8(odhA8) 균주로서 선별한다.
ATCC13869-L30 균주를 사용하는 유사한 공정에 의해 다른 odhA 돌연변이 균주를 수득할 수 있다.
서열번호 55의 프라이머 대신에 인산화된 5'-말단을 갖는 서열번호 56의 프라이머가 사용되는 상기한 방법과 유사한 방법에 의해, 서열번호 47의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 돌연변이 odhA 유전자가 도입된 sucA801 균주를 수득할 수 있다.
서열번호 55의 프라이머 대신에 인산화된 5'-말단을 갖는 서열번호 57의 프라이머가 사용되는 상기한 방법과 유사한 방법에 의해, 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 돌연변이 odhA 유전자가 도입된 sucA805 균주를 수득할 수 있다.
서열번호 55의 프라이머 대신에 인산화된 5'-말단을 갖는 서열번호 58의 프라이머가 사용되는 상기한 방법과 유사한 방법에 의해, 서열번호 51의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 돌연변이 odhA 유전자가 도입된 sucA77 균주를 수득할 수 있다.
sucA8 돌연변이는 α-KGDH 단백질의 미성숙 절단을 야기하는 프레임-이동 돌연변이이기 때문에, L30sucA8 균주는 세포내 α-KGDH를 갖지 않는다. 반면에, sucA801 균주, sucA805 균주, 및 sucA77 균주는, 이들 돌연변이가 프레임-이동 돌연변이가 아니고 α-KGDH 단백질의 미성숙 절단을 야기하지 않기 때문에, 낮지만 약간의 α-KGDH 활성을 갖는다.
<yggB 유전자 및 odhA 유전자-이중 돌연변이 균주를 사용한 L-글루탐산 생산>
ygg 유전자 및 odhA 유전자-이중 돌연변이 균주의 L-글루탐산 생산성을, Sakaguchi 플라스크에서 이들 균주를 배양하여 평가하였다. 표 14에 열거된 각각의 균주를 CM-Dex 한천 배지에서 하룻밤 동안 31.5℃에서 배양하고, 이어서 배양물의 1/6을 60g/l 글루코즈, 22.5g/l (NH4)2SO4, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l 비타민 B1, 0.48g/l 대두 단백질 가수분해물, 및 300㎍/l 비오틴을 함유하는 20ml의 배지(KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함)로 옮기고, CaCO3를 부가하고, 31.5℃에서 115rpm으로 교반하면서 배양하였다. 19시간 배양한 후에 축적된 L-글루탐산의 양은 표 16에 제시되어 있다. sucA801, sucA805, 및 sucA77 균주는, 야생형 odhA 유전자를 보유한 ATCC13869-L30 균주 및 프레임-이동 돌연변이가 있는 odhA 유전자를 보유한 sucA8 균주보다 더 높은 L-글루탐산 생산성을 나타내었다. 이러한 결과는 odhA 유전자의 티아민 피로포스페이트 결합 영역에 인접한 부위로 돌연변이를 도입시켜 α-KGDH 활성을 조절함으로써 L-글루탐산이 효율적으로 생산됨을 보여주었다.
실시예 16
<ATCC14067yggB8 균주에서의 odhA 유전자의 파괴>
ATCC14067 균주 및 ATCC14067yggB8 균주에서 각각 odhA 유전자를 파괴하고, 수득된 균주를 배양하였다. 먼저, odhA 유전자 파괴를 위한 플라스미드를 작제하였다. odhA 유전자의 N-말단 영역을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해서, 프라이머로서 서열번호 77 및 78에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 ATCC14067 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. odhA 유전자의 C-말단 영역을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해서, 프라이머로서 서열번호 79 및 80에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 ATCC14067 균주의 염색체 DNA를 사용하여 또 다른 PCR을 수행하였다. 이어서, odhA 유전자의 내부서열이 결실된 단편을 제조하기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 81 및 82의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 BamHI으로 분해시키고 실시예 1에서 작제된 pBS4S내로 삽입시켜 플라스미드 pBS△sucA47을 수득하였다.
염색체내로 결실형 odhA 유전자를 도입시키고 벡터 부분만을 제거하기 위해서 pBS△sucA47로 실시예 11의 ATCC14067 균주 및 ATCC14067yggB8을 실시예 6과 같은 방법으로 형질전환시켰다. 서열번호 77 및 80의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 카나마이신-민감성 균주로부터 odhA 유전자가 파괴된 균주를 선별하였다. 이렇게 수득된 균주를 각각 ATCC14067△odhA 균주 및 ATCC14067△odhA yggB8 균주라 명명하였다.
실시예 3에 기술된 방법에 따른 ATCC14067△odhA 균주 및 ATCC14067△odhA yggB8 균주의 배양 결과는 표 17에 제시되어 있다. 8형 돌연변이 yggB 유전자를 도입시킴으로써 odhA 유전자-파괴된 균주의 L-글루탐산 생산능이 향상된 것으로 밝혀졌다.
실시예 17
<yggB 돌연변이 균주에서의 symA 유전자의 파괴>
실시예 3에서 작제되고 yggB 유전자에 삽입된 IS를 갖는 2A-1R 균주에서 symA 유전자를 파괴시키고, 수득된 균주를 2A-1R 균주와 비교하여 배양하였다. ATCC13869 균주의 symA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 86에 제시되어 있고, 아미노산 서열은 서열번호 87에 제시되어 있다. 먼저, symA 유전자 파괴를 위한 플라스미드를 작제하였다. symA 유전자의 N-말단 영역을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해서, 프라이머로서 서열번호 88 및 89에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. symA 유전자의 C-말단 영역을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해서, 프라이머로서 서열번호 90 및 91에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 또 다른 PCR을 수행하였다. 이어서, SymA 유전자의 내부서열이 결실된 단편을 제조하기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 88 및 91의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 BamHI으로 분해시키고 실시예 1에서 작제된 pBS4S내로 삽입시켜 플라스미드 pBS△1867을 수득하였다.
염색체내로 결실형 SymA 유전자를 도입시키고 벡터 부분만을 제거하기 위해서 pBS△1867로 2A-1R 균주를 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 형질전환시켰다. 서열번호 88 및 91의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 카나마이신-민감성 균주로부터 SymA 유전자가 파괴된 균주를 선별하였다. 이렇게 수득된 균주를 2A-1R△SymA 균주라 명명하였다.
실시예 3에 기술된 방법에 따른 2A-1R△SymA 균주 및 2A-1R 균주의 배양 결과는 표 18에 제시되어 있다. SymA 유전자를 결실시킴으로써 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주의 L-글루탐산 생산능이 추가로 향상된 것으로 밝혀졌다.
실시예 18
<야생형 yggB 유전자-증폭된 균주의 작제>
코리네형 세균내로 야생형 yggB 유전자를 도입시키기 위해서 코리네형 세균의 야생형 yggB 유전자를 보유하는 pL5k를 사용하였다. pL5k와 유사한 구조를 갖는 플라스미드는, 서열번호 59 및 60의 프라이머 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하는 PCR을 수행하고, 증폭된 산물을 BamHI으로 분해시키고, 수득된 단편을 pVK9의 BamHI 부위내로 삽입시킴으로써 작제할 수도 있다. pVK9은, pHSG299(Takara Bio)의 AvaII 부위를 평활말단화시키고, BamHI 및 KpnI으로 pHK4(JP-A-05-007491)로부터 절단된 코리네형 세균에서의 자발적인 복제에 관여하는 단편을 삽입시킴으로써 수득된 셔틀벡터이다.
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13869 균주를 전기 펄스 방법(JP-A-2-207791)에 의해 pL5k로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 CM2B 플레이트 배지(10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl, 20g/l 한천, KOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정함)에 도말하고, 하룻밤 동안 31.5℃에서 배양하였다. 다음날에, 출현한 콜로니를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트 배지에서 정제하여 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주를 수득하였다. 통상적인 방법에 의해 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하여 표적 플라스미드가 도입되었음을 확인하였다. 이렇게 수득된 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주를 ATCC13869/pL5k라 명명하였다. 대조군 균주로서, pVK9가 도입된 ATCC13869/pVK9를 상기한 방법과 같은 방법으로 작제하였다.
실시예 19
<야생형 yggB 유전자-증폭된 균주의 평가>
(2-1) 비오틴이 제한된 배양 조건하에서의 평가
실시예 17에서 작제된 각각의 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주 및 대조군 균주로부터 3개의 클론을 분리하고, 각 클론을 20ml의 종균배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 2ml의 배양물을 비오틴을 함유하지 않은 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 배지내의 L-글루탐산의 농도를 측정하였다. 그 결과, 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주(ATCC13869/pL5k)는 벡터-도입된 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적을 야기한 것으로 밝혀졌다.(표 19에서, OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, GH(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다.)
(2-2) 계면활성제가 부가된 조건하에서의 평가
상기 (2-1)에서 사용된 동일한 클론을 20ml의 종균배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 2ml의 배양물을 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 배양을 시작하고 2시간 후, Tween40을 부가하여 최종농도가 5g/L가 되게 하고 배양을 계속하였다. 당이 완전히 소비된 후, 배지내의 L-글루탐산의 농도를 측정하였다. 그 결과, 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주(ATCC13869/pL5k)는 벡터-도입된 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적을 야기한 것으로 밝혀졌다.
(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, GH는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다.)
(2-3) 페니실린 G가 부가된 조건하에서의 평가
상기 (2-1)에서 사용된 동일한 클론을 20ml의 종균배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 2ml의 배양물을 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 배양을 시작하고 2시간 후, 페니실린 G를 부가하여 최종농도가 0.5U/ml가 되게 하고 배양을 계속하였다. 당이 완전히 소비된 후, 배지내의 L-글루탐산의 농도를 측정하였다. 그 결과, 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주(ATCC13869/pL5k)는 벡터-도입된 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적을 야기한 것으로 밝혀졌다(표 21).
(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, GH는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다.)
본 발명에 따라, yggB 유전자를 이용하여 변형된 균주를 사용함으로써 효율적으로 L-글루탐산을 생산한다.
본 발명의 대표적인 양태를 참조하여 본 발명을 상세히 설명하였지만, 본 발명의 범위 내에서, 다양한 변형이 이루어질 수 있고 동등한 실시가 이루어질 수 있음이 당업자에게는 명백하다. 상기한 각각의 문헌은 본원에 그 자체로서 참조 문헌으로 인용되었다.
도 1은 플라스미드 pBS3의 작제를 도시한 것이다.
도 2는 플라스미드 pBS4S의 작제를 도시한 것이다.
도 3은 플라스미드 pBS4sucAint의 작제를 도시한 것이다.
도 4는 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주 및 대조군 균주에 의한 L-글루탐산의 축적을 도시한 그래프이다.
도 5는 yggB 유전자에서 2A-1형 돌연변이를 도시한 것이다.
도 6은 CM-Dex 플레이트 배지에서 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주의 4-플루오로글루탐산에 대한 내성을 도시한 사진이다.
도 7은 4-플루오로글루탐산(4-FG)을 함유하는 액체 배지에서 대조군 균주 및 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주의 성장을 도시한 것이다.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> L-GLUTAMIC ACID-PRODUCING MICROORGANISM AND A METHOD FOR PRODUCING L-GLUTAMIC ACID
<130> C401-C5216
<150> JP 2004-378615
<151> 2004-12-28
<150> JP 2004-378604
<151> 2004-12-28
<150> JP 2005-262087
<151> 2005-09-09
<160> 91
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> odhA primer
<400> 1
ggggatccat cggtatgcca caccgtggtc gcc 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> odhA primer
<400> 2
ggggatccac gactgcttct gcatcttcgt tgg 33
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> M1 primer
<400> 3
gtaaaacgac ggccagt 17
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> odhA primer
<400> 4
cagaaggaat catcggtgag caggc 25
<210> 5
<211> 3481
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1437)..(3035)
<223> yggB
<400> 5
gatcttgccg atttcggcag gatcaatgtc ggcgtgaatg atcttggcat caggtgcgaa 60
agtgtcaacg tcaccggtga cgcggtcatc aaagcgggag ccgatagcaa tcagcaggtc 120
gctgcgctgc agtgcaccaa cagcggacac agtgccatgc atgcctggca tacccatgtg 180
cagctcgtgg gactctggga aggttcccag cgccatcaat gtggtgacaa ctggaatgcc 240
ggtgtgctca gcgaacgcac gaagctcttc gtgggcatca gccttgataa cgccgccgcc 300
aacgtaaagg acaggcttct tagactcacc gatcagtttg acagcctgct caatctgtcg 360
agcatgcggt gttgaaactg ggcggtagcc tggcaggtcg atctttggtg gccagacgaa 420
atccaattca gcgttctgaa catccttggg gatatccact agaacaggac cagggcgacc 480
agtaatcgcg aggtggaatg cctcagccaa tgcctgtgga atgtcgttgg ggttggtgac 540
catgaagttg tgcttggtca ctggcatggt gatgccgcgg atatcggctt cctggaaagc 600
atcggtaccc agcaggctac ttccgacctg gccggtgatg gcaaccatgg gaacggagtc 660
caagtttgca tcagcgattg gggtaaccaa gttggttgcg cctgggccag aggttgcaat 720
gcagacgcca acgcgtccag taacctgcgc gtagccggtt gctgcgtggc ctgcgccctg 780
ctcgtggcgc actaggacgt ggcgcacctt tgtggaggaa tagagcgggt catacaccgg 840
tagcaccgca ccaccaggaa taccgaacac gatgtcggcg ttaagctcct cgagcgatcg 900
aacaattgcc tgtgcacctg tcatccgctc aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac 960
cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc cacattcacg actttctggc tcctttacta 1020
aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa 1080
agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg 1140
ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200
gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260
ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320
aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380
ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439
Met
1
att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg 1487
Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp
5 10 15
att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt 1535
Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe
20 25 30
ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag cga 1583
Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln Arg
35 40 45
gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc 1631
Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe
50 55 60 65
gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt 1679
Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu
70 75 80
gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg 1727
Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala
85 90 95
att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag tcg 1775
Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser
100 105 110
att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa 1823
Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln
115 120 125
ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt 1871
Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val
130 135 140 145
gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg 1919
Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr
150 155 160
att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg tgc 1967
Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys
165 170 175
atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc 2015
Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile
180 185 190
ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa 2063
Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu
195 200 205
gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc 2111
Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile
210 215 220 225
ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg 2159
Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr
230 235 240
gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc 2207
Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val
245 250 255
acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc 2255
Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile
260 265 270
atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga 2303
Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly
275 280 285
acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc tcg 2351
Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser
290 295 300 305
ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct 2399
Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala
310 315 320
gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac 2447
Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp
325 330 335
aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt 2495
Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu
340 345 350
gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa 2543
Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu
355 360 365
aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac 2591
Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr
370 375 380 385
tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc 2639
Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg
390 395 400
atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt 2687
Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe
405 410 415
aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac tcc agt gga 2735
Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly
420 425 430
tgg ctg tca cca agc act gcc acc tca act gcg gtg acc acc tcc gaa 2783
Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu
435 440 445
act tcc gcg cca gca agc acg cct tcg atg aca gtg ccc act acg gtg 2831
Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val
450 455 460 465
gag gag acc cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag cag gaa acc 2879
Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr
470 475 480
tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga gcc gac acc atc gaa ccg 2927
Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro
485 490 495
acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg act gca tcg cag acg cag 2975
Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln
500 505 510
tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gaa aca gtt gcg ccg 3023
Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro
515 520 525
acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt ctttactact 3075
Thr Ser Thr Pro
530
attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg aaaaatttca 3135
cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat tattagtcat 3195
cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct tcggttactg 3255
ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact acgccttcaa 3315
gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg gtgcccgcac 3375
tttcgctcgc accacctccg atgcagaagt caccctcccc ggcgtcacct tcaactccct 3435
tccccgcctt gaagctgctt cccacggccg catccccgat gcgatc 3481
<210> 6
<211> 533
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515 520 525
Pro Thr Ser Thr Pro
530
<210> 7
<211> 4934
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1437)..(2705)
<223> 2A-1
<400> 7
gatcttgccg atttcggcag gatcaatgtc ggcgtgaatg atcttggcat caggtgcgaa 60
agtgtcaacg tcaccggtga cgcggtcatc aaagcgggag ccgatagcaa tcagcaggtc 120
gctgcgctgc agtgcaccaa cagcggacac agtgccatgc atgcctggca tacccatgtg 180
cagctcgtgg gactctggga aggttcccag cgccatcaat gtggtgacaa ctggaatgcc 240
ggtgtgctca gcgaacgcac gaagctcttc gtgggcatca gccttgataa cgccgccgcc 300
aacgtaaagg acaggcttct tagactcacc gatcagtttg acagcctgct caatctgtcg 360
agcatgcggt gttgaaactg ggcggtagcc tggcaggtcg atctttggtg gccagacgaa 420
atccaattca gcgttctgaa catccttggg gatatccact agaacaggac cagggcgacc 480
agtaatcgcg aggtggaatg cctcagccaa tgcctgtgga atgtcgttgg ggttggtgac 540
catgaagttg tgcttggtca ctggcatggt gatgccgcgg atatcggctt cctggaaagc 600
atcggtaccc agcaggctac ttccgacctg gccggtgatg gcaaccatgg gaacggagtc 660
caagtttgca tcagcgattg gggtaaccaa gttggttgcg cctgggccag aggttgcaat 720
gcagacgcca acgcgtccag taacctgcgc gtagccggtt gctgcgtggc ctgcgccctg 780
ctcgtggcgc actaggacgt ggcgcacctt tgtggaggaa tagagcgggt catacaccgg 840
tagcaccgca ccaccaggaa taccgaacac gatgtcggcg ttaagctcct cgagcgatcg 900
aacaattgcc tgtgcacctg tcatccgctc aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac 960
cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc cacattcacg actttctggc tcctttacta 1020
aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa 1080
agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg 1140
ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200
gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260
ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320
aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380
ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439
Met
1
att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg 1487
Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp
5 10 15
att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt 1535
Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe
20 25 30
ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag cga 1583
Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln Arg
35 40 45
gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc 1631
Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe
50 55 60 65
gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt 1679
Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu
70 75 80
gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg 1727
Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala
85 90 95
att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag tcg 1775
Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser
100 105 110
att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa 1823
Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln
115 120 125
ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt 1871
Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val
130 135 140 145
gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg 1919
Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr
150 155 160
att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg tgc 1967
Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys
165 170 175
atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc 2015
Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile
180 185 190
ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa 2063
Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu
195 200 205
gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc 2111
Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile
210 215 220 225
ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg 2159
Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr
230 235 240
gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc 2207
Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val
245 250 255
acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc 2255
Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile
260 265 270
atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga 2303
Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly
275 280 285
acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc tcg 2351
Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser
290 295 300 305
ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct 2399
Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala
310 315 320
gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac 2447
Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp
325 330 335
aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt 2495
Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu
340 345 350
gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa 2543
Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu
355 360 365
aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac 2591
Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr
370 375 380 385
tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc 2639
Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg
390 395 400
atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt 2687
Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe
405 410 415
aag ggg ctc ttc ctg ttt tagagtgcat tgatcttatg gaccaactgc 2735
Lys Gly Leu Phe Leu Phe
420
cctgaatgga taaggcaccg cagaatgtag tggttcaaat tacggaaacc tagagcaatc 2795
ccacgcaaat gctccaaccg tccgttgatc gcttcgaccg gaccgttgga gacaccaaca 2855
tcgaaatacg ccaacacatc accaagtcgt ttaaacaaac tacgacccaa ctgcgcgagt 2915
tccttattcg gccccttcaa cacccgaagc tgatcaataa tggtccgcat tttcttcttc 2975
gcttcacgct tattacccat ctgataacaa tcaataatcg cctgatacgc aagccacgca 3035
agctttaaca ccccgtagtc tttgtcatac gcccacaact gctccaagct ttcttgctga 3095
cgaggactca accacttgtg cgtggtcaac aaggtcttcc ggtttttata caacggatcc 3155
tggcttaaac cacgacgctg gtatttctcc cgctggaggc gttgccggca ggcggtgagc 3215
ttgtcaccag caagccgcac aacatggaat ggatccatca cgcgacgagc agaaggaatg 3275
agttctttac ttgctgtggc gtagccttgg aacccatcca tggacacgat ccgtatctga 3335
ttgcggaact gttcaccgcg ggaaccaagc caggaccgta aagcatcagc actacgacct 3395
gggacgacat ctaataaccg ggcaggacac cgtgagtcat accgatgccc ggtcatatcg 3455
acaatcacgg tgacaaaccc atcaccatgc ttagccctat tatgtgacca cttatgctca 3515
tccaccccaa tgacatacac tccatcaaga tggtgaggat cgttatagac cagctcacgg 3575
cacatatcga gggctagttg gcaggttaaa tcccacccta gcccaagtgc tttcgcggtt 3635
gcgtgaacac tcatccggtc aatagcaagg cgttgcaaaa tccagcgggt gacccggtgg 3695
gtgacctttt taccgtggtc agcgcagctt agttctgctt ggaaatactt ttgcttacat 3755
gtcgggttgg tgcagcggta gcgaggtaga cggataaaca gtttggtggg aaacccgacg 3815
atgggtaaat caatgagcat ccggtgggtg tgatgacgaa acaccccagg ttgggagcat 3875
tctgggcagg tggaggtata gtcgagtgcg tctgcttcga tcagggtgta atcacctgca 3935
tcggaagcgc cggtgatggt gagtcctagt tccgcagtgc ggcagatggt gtcagcgatg 3995
atgttgccgg tagacttcat gggtagagcc ttttgttggt gtttggttag cttagatacc 4055
taaaccttaa ccctgacaaa aggctcgttt attttcgggt ctacaccgct agcccaggtt 4115
ctgtgatgta ccccaaaacc ggaagggcct catgactgtg gaaccaagtg agaattggca 4175
aaactccagt ggatggctgt caccaagcac tgccacctca actgcggtga ccacctccga 4235
aacttccgcg ccagcaagca cgccttcgat gacagtgccc actacggtgg aggagacccc 4295
aacgatggaa tctagcgtcg aaacgcagca ggaaacctca acccctgcaa ccgcaacgcc 4355
ccagcgagcc gacaccatcg aaccgaccga ggaagccacg tcgcaggagg aaacgactgc 4415
atcgcagacg cagtctccag cagtggaagc accaaccgcg gtccaagaaa cagttgcgcc 4475
gacgtccacc ccttaggacg ctgattacag acgtgtccca tttctttact actattggaa 4535
attatgagtt cagacgcaga aaaggcatcc gtggagcttt ccgaaaaatt tcacccagaa 4595
cgcacccata ttttgggcgc cgttgttttt ggcctgatct cattattagt catcggcgca 4655
gcccctcagt acctgttttg gctgctcgcg ctccctgtca tcttcggtta ctgggttcta 4715
aaatcatcca cgatcgttga tgaacagggc atcaccgcaa actacgcctt caagggcaaa 4775
aaggttgtgg cctgggaaga cctcgcagga atcggattca agggtgcccg cactttcgct 4835
cgcaccacct ccgatgcaga agtcaccctc cccggcgtca ccttcaactc ccttccccgc 4895
cttgaagctg cttcccacgg ccgcatcccc gatgcgatc 4934
<210> 8
<211> 423
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 8
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Gly Leu Phe Leu Phe
420
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
gggagctcga ctttctggct cctttact 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gggagctcgc cgatgactaa taatgaga 28
<210> 11
<211> 2014
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (464)..(1885)
<223> sacB
<400> 11
gatccttttt aacccatcac atatacctgc cgttcactat tatttagtga aatgagatat 60
tatgatattt tctgaattgt gattaaaaag gcaactttat gcccatgcaa cagaaactat 120
aaaaaataca gagaatgaaa agaaacagat agatttttta gttctttagg cccgtagtct 180
gcaaatcctt ttatgatttt ctatcaaaca aaagaggaaa atagaccagt tgcaatccaa 240
acgagagtct aatagaatga ggtcgaaaag taaatcgcgc gggtttgtta ctgataaagc 300
aggcaagacc taaaatgtgt aaagggcaaa gtgtatactt tggcgtcacc ccttacatat 360
tttaggtctt tttttattgt gcgtaactaa cttgccatct tcaaacagga gggctggaag 420
aagcagaccg ctaacacagt acataaaaaa ggagacatga acg atg aac atc aaa 475
Met Asn Ile Lys
1
aag ttt gca aaa caa gca aca gta tta acc ttt act acc gca ctg ctg 523
Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr Thr Ala Leu Leu
5 10 15 20
gca gga ggc gca act caa gcg ttt gcg aaa gaa acg aac caa aag cca 571
Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr Asn Gln Lys Pro
25 30 35
tat aag gaa aca tac ggc att tcc cat att aca cgc cat gat atg ctg 619
Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg His Asp Met Leu
40 45 50
caa atc cct gaa cag caa aaa aat gaa aaa tat caa gtt cct gaa ttc 667
Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln Val Pro Glu Phe
55 60 65
gat tcg tcc aca att aaa aat atc tct tct gca aaa ggc ctg gac gtt 715
Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys Gly Leu Asp Val
70 75 80
tgg gac agc tgg cca tta caa aac gct gac ggc act gtc gca aac tat 763
Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Val Ala Asn Tyr
85 90 95 100
cac ggc tac cac atc gtc ttt gca tta gcc gga gat cct aaa aat gcg 811
His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn Ala
105 110 115
gat gac aca tcg att tac atg ttc tat caa aaa gtc ggc gaa act tct 859
Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val Gly Glu Thr Ser
120 125 130
att gac agc tgg aaa aac gct ggc cgc gtc ttt aaa gac agc gac aaa 907
Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys Asp Ser Asp Lys
135 140 145
ttc gat gca aat gat tct atc cta aaa gac caa aca caa gaa tgg tca 955
Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr Gln Glu Trp Ser
150 155 160
ggt tca gcc aca ttt aca tct gac gga aaa atc cgt tta ttc tac act 1003
Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg Leu Phe Tyr Thr
165 170 175 180
gat ttc tcc ggt aaa cat tac ggc aaa caa aca ctg aca act gca caa 1051
Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu Thr Thr Ala Gln
185 190 195
gtt aac gta tca gca tca gac agc tct ttg aac atc aac ggt gta gag 1099
Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile Asn Gly Val Glu
200 205 210
gat tat aaa tca atc ttt gac ggt gac gga aaa acg tat caa aat gta 1147
Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Asn Val
215 220 225
cag cag ttc atc gat gaa ggc aac tac agc tca ggc gac aac cat acg 1195
Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly Asp Asn His Thr
230 235 240
ctg aga gat cct cac tac gta gaa gat aaa ggc cac aaa tac tta gta 1243
Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His Lys Tyr Leu Val
245 250 255 260
ttt gaa gca aac act gga act gaa gat ggc tac caa ggc gaa gaa tct 1291
Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln Gly Glu Glu Ser
265 270 275
tta ttt aac aaa gca tac tat ggc aaa agc aca tca ttc ttc cgt caa 1339
Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser Phe Phe Arg Gln
280 285 290
gaa agt caa aaa ctt ctg caa agc gat aaa aaa cgc acg gct gag tta 1387
Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg Thr Ala Glu Leu
295 300 305
gca aac ggc gct ctc ggt atg att gag cta aac gat gat tac aca ctg 1435
Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Thr Leu
310 315 320
aaa aaa gtg atg aaa ccg ctg att gca tct aac aca gta aca gat gaa 1483
Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr Val Thr Asp Glu
325 330 335 340
att gaa cgc gcg aac gtc ttt aaa atg aac ggc aaa tgg tac ctg ttc 1531
Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys Trp Tyr Leu Phe
345 350 355
act gac tcc cgc gga tca aaa atg acg att gac ggc att acg tct aac 1579
Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly Ile Thr Ser Asn
360 365 370
gat att tac atg ctt ggt tat gtt tct aat tct tta act ggc cca tac 1627
Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Ser Leu Thr Gly Pro Tyr
375 380 385
aag ccg ctg aac aaa act ggc ctt gtg tta aaa atg gat ctt gat cct 1675
Lys Pro Leu Asn Lys Thr Gly Leu Val Leu Lys Met Asp Leu Asp Pro
390 395 400
aac gat gta acc ttt act tac tca cac ttc gct gta cct caa gcg aaa 1723
Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val Pro Gln Ala Lys
405 410 415 420
gga aac aat gtc gtg att aca agc tat atg aca aac aga gga ttc tac 1771
Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn Arg Gly Phe Tyr
425 430 435
gca gac aaa caa tca acg ttt gcg cca agc ttc ctg ctg aac atc aaa 1819
Ala Asp Lys Gln Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu Leu Asn Ile Lys
440 445 450
ggc aag aaa aca tct gtt gtc aaa gac agc atc ctt gaa caa gga caa 1867
Gly Lys Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Ile Leu Glu Gln Gly Gln
455 460 465
tta aca gtt aac aaa taa aaacgcaaaa gaaaatgccg atatcctatt 1915
Leu Thr Val Asn Lys
470
ggcattttct tttatttctt atcaacataa aggtgaatcc catatgaact atataaaagc 1975
aggcaaatgg ctaaccgtat tcctaacctt ttgaagatc 2014
<210> 12
<211> 473
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 12
Met Asn Ile Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr
1 5 10 15
Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr
20 25 30
Asn Gln Lys Pro Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg
35 40 45
His Asp Met Leu Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln
50 55 60
Val Pro Glu Phe Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys
65 70 75 80
Gly Leu Asp Val Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr
85 90 95
Val Ala Asn Tyr His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp
100 105 110
Pro Lys Asn Ala Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val
115 120 125
Gly Glu Thr Ser Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys
130 135 140
Asp Ser Asp Lys Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr
145 150 155 160
Gln Glu Trp Ser Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg
165 170 175
Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu
180 185 190
Thr Thr Ala Gln Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile
195 200 205
Asn Gly Val Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr
210 215 220
Tyr Gln Asn Val Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly
225 230 235 240
Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His
245 250 255
Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln
260 265 270
Gly Glu Glu Ser Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser
275 280 285
Phe Phe Arg Gln Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg
290 295 300
Thr Ala Glu Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp
305 310 315 320
Asp Tyr Thr Leu Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr
325 330 335
Val Thr Asp Glu Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys
340 345 350
Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly
355 360 365
Ile Thr Ser Asn Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Ser Leu
370 375 380
Thr Gly Pro Tyr Lys Pro Leu Asn Lys Thr Gly Leu Val Leu Lys Met
385 390 395 400
Asp Leu Asp Pro Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val
405 410 415
Pro Gln Ala Lys Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn
420 425 430
Arg Gly Phe Tyr Ala Asp Lys Gln Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu
435 440 445
Leu Asn Ile Lys Gly Lys Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Ile Leu
450 455 460
Glu Gln Gly Gln Leu Thr Val Asn Lys
465 470
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sacB primer
<400> 13
cgggatcctt tttaacccat caca 24
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sacB primer
<400> 14
gaagatcttc aaaaggttag gaatacggt 29
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sacB primer
<400> 15
ccttttgaag atcgaccagt tgg 23
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sacB primer
<400> 16
tacctggaat gctgttttcc cagggatcgc agtggtgagt aacc 44
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sacB primer
<400> 17
cctgggaaaa cagcattcca ggtattag 28
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sacB primer
<400> 18
tgcaggtcga ctctagagga tcc 23
<210> 19
<211> 3490
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1437)..(3044)
<223> A1
<400> 19
gatcttgccg atttcggcag gatcaatgtc ggcgtgaatg atcttggcat caggtgcgaa 60
agtgtcaacg tcaccggtga cgcggtcatc aaagcgggag ccgatagcaa tcagcaggtc 120
gctgcgctgc agtgcaccaa cagcggacac agtgccatgc atgcctggca tacccatgtg 180
cagctcgtgg gactctggga aggttcccag cgccatcaat gtggtgacaa ctggaatgcc 240
ggtgtgctca gcgaacgcac gaagctcttc gtgggcatca gccttgataa cgccgccgcc 300
aacgtaaagg acaggcttct tagactcacc gatcagtttg acagcctgct caatctgtcg 360
agcatgcggt gttgaaactg ggcggtagcc tggcaggtcg atctttggtg gccagacgaa 420
atccaattca gcgttctgaa catccttggg gatatccact agaacaggac cagggcgacc 480
agtaatcgcg aggtggaatg cctcagccaa tgcctgtgga atgtcgttgg ggttggtgac 540
catgaagttg tgcttggtca ctggcatggt gatgccgcgg atatcggctt cctggaaagc 600
atcggtaccc agcaggctac ttccgacctg gccggtgatg gcaaccatgg gaacggagtc 660
caagtttgca tcagcgattg gggtaaccaa gttggttgcg cctgggccag aggttgcaat 720
gcagacgcca acgcgtccag taacctgcgc gtagccggtt gctgcgtggc ctgcgccctg 780
ctcgtggcgc actaggacgt ggcgcacctt tgtggaggaa tagagcgggt catacaccgg 840
tagcaccgca ccaccaggaa taccgaacac gatgtcggcg ttaagctcct cgagcgatcg 900
aacaattgcc tgtgcacctg tcatccgctc aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac 960
cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc cacattcacg actttctggc tcctttacta 1020
aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa 1080
agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg 1140
ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200
gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260
ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320
aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380
ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439
Met
1
att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgt tca ttg 1487
Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Cys Ser Leu
5 10 15
tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc 1535
Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val
20 25 30
ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc 1583
Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile
35 40 45
aag cag cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag 1631
Lys Gln Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln
50 55 60 65
ctc gcg ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt 1679
Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe
70 75 80
ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg 1727
Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala
85 90 95
ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt 1775
Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly
100 105 110
gcg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg 1823
Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr
115 120 125
gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc 1871
Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly
130 135 140 145
atc gtt gtt gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa 1919
Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys
150 155 160
att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg 1967
Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala
165 170 175
aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt 2015
Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val
180 185 190
att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg 2063
Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala
195 200 205
cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca 2111
Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala
210 215 220 225
ccg gaa atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca 2159
Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr
230 235 240
ccg cca acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc 2207
Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu
245 250 255
gtg caa gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc 2255
Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg
260 265 270
aca gaa atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act 2303
Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr
275 280 285
aca tcg gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca 2351
Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro
290 295 300 305
aag acc tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag 2399
Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys
310 315 320
ccg gag gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac 2447
Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp
325 330 335
gat gca gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag 2495
Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu
340 345 350
aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa 2543
Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu
355 360 365
ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc 2591
Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg
370 375 380 385
act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga 2639
Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly
390 395 400
cgt gtc cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg 2687
Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu
405 410 415
tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac 2735
Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn
420 425 430
tcc agt gga tgg ctg tca cca agc act gcc acc tca act gcg gtg acc 2783
Ser Ser Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr
435 440 445
acc tcc gaa act tcc gcg cca gca agc acg cct tcg atg aca gtg ccc 2831
Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro
450 455 460 465
act acg gtg gag gag acc cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag 2879
Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln
470 475 480
cag gaa acc tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga gcc gac acc 2927
Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr
485 490 495
atc gaa ccg acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg act gca tcg 2975
Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser
500 505 510
cag acg cag tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gaa aca 3023
Gln Thr Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr
515 520 525
gtt gcg ccg acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt 3074
Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro
530 535
ctttactact attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg 3134
aaaaatttca cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat 3194
tattagtcat cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct 3254
tcggttactg ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact 3314
acgccttcaa gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg 3374
gtgcccgcac tttcgctcgc accacctccg atgcagaagt caccctcccc ggcgtcacct 3434
tcaactccct tccccgcctt gaagctgctt cccacggccg catccccgat gcgatc 3490
<210> 20
<211> 536
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 20
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Cys Ser
1 5 10 15
Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu
20 25 30
Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile
35 40 45
Ile Lys Gln Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn
50 55 60
Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala
65 70 75 80
Phe Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu
85 90 95
Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu
115 120 125
Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn
130 135 140
Gly Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr
145 150 155 160
Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr
165 170 175
Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val
180 185 190
Val Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile
195 200 205
Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile
210 215 220
Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val
225 230 235 240
Thr Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe
245 250 255
Leu Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile
260 265 270
Arg Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr
275 280 285
Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu
290 295 300
Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro
305 310 315 320
Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn
325 330 335
Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro
340 345 350
Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu
355 360 365
Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe
370 375 380
Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly
385 390 395 400
Gly Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu
405 410 415
Leu Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln
420 425 430
Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val
435 440 445
Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val
450 455 460
Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr
465 470 475 480
Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp
485 490 495
Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala
500 505 510
Ser Gln Thr Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu
515 520 525
Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro
530 535
<210> 21
<211> 3481
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1437)..(3035)
<223> 19
<400> 21
gatcttgccg atttcggcag gatcaatgtc ggcgtgaatg atcttggcat caggtgcgaa 60
agtgtcaacg tcaccggtga cgcggtcatc aaagcgggag ccgatagcaa tcagcaggtc 120
gctgcgctgc agtgcaccaa cagcggacac agtgccatgc atgcctggca tacccatgtg 180
cagctcgtgg gactctggga aggttcccag cgccatcaat gtggtgacaa ctggaatgcc 240
ggtgtgctca gcgaacgcac gaagctcttc gtgggcatca gccttgataa cgccgccgcc 300
aacgtaaagg acaggcttct tagactcacc gatcagtttg acagcctgct caatctgtcg 360
agcatgcggt gttgaaactg ggcggtagcc tggcaggtcg atctttggtg gccagacgaa 420
atccaattca gcgttctgaa catccttggg gatatccact agaacaggac cagggcgacc 480
agtaatcgcg aggtggaatg cctcagccaa tgcctgtgga atgtcgttgg ggttggtgac 540
catgaagttg tgcttggtca ctggcatggt gatgccgcgg atatcggctt cctggaaagc 600
atcggtaccc agcaggctac ttccgacctg gccggtgatg gcaaccatgg gaacggagtc 660
caagtttgca tcagcgattg gggtaaccaa gttggttgcg cctgggccag aggttgcaat 720
gcagacgcca acgcgtccag taacctgcgc gtagccggtt gctgcgtggc ctgcgccctg 780
ctcgtggcgc actaggacgt ggcgcacctt tgtggaggaa tagagcgggt catacaccgg 840
tagcaccgca ccaccaggaa taccgaacac gatgtcggcg ttaagctcct cgagcgatcg 900
aacaattgcc tgtgcacctg tcatccgctc aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac 960
cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc cacattcacg actttctggc tcctttacta 1020
aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa 1080
agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg 1140
ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200
gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260
ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320
aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380
ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439
Met
1
att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg 1487
Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp
5 10 15
att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt 1535
Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe
20 25 30
ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag cga 1583
Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln Arg
35 40 45
gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc 1631
Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe
50 55 60 65
gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt 1679
Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu
70 75 80
gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg 1727
Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala
85 90 95
att ccg aca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag tcg 1775
Ile Pro Thr Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser
100 105 110
att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa 1823
Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln
115 120 125
ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt 1871
Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val
130 135 140 145
gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg 1919
Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr
150 155 160
att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg tgc 1967
Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys
165 170 175
atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc 2015
Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile
180 185 190
ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa 2063
Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu
195 200 205
gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc 2111
Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile
210 215 220 225
ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg 2159
Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr
230 235 240
gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc 2207
Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val
245 250 255
acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc 2255
Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile
260 265 270
atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga 2303
Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly
275 280 285
acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc tcg 2351
Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser
290 295 300 305
ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct 2399
Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala
310 315 320
gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac 2447
Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp
325 330 335
aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt 2495
Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu
340 345 350
gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa 2543
Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu
355 360 365
aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac 2591
Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr
370 375 380 385
tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc 2639
Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg
390 395 400
atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt 2687
Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe
405 410 415
aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac tcc agt gga 2735
Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly
420 425 430
tgg ctg tca cca agc act gcc acc tca act gcg gtg acc acc tcc gaa 2783
Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu
435 440 445
act tcc gcg cca gca agc acg cct tcg atg aca gtg ccc act acg gtg 2831
Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val
450 455 460 465
gag gag acc cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag cag gaa acc 2879
Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr
470 475 480
tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga gcc gac acc atc gaa ccg 2927
Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro
485 490 495
acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg act gca tcg cag acg cag 2975
Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln
500 505 510
tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gaa aca gtt gcg ccg 3023
Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro
515 520 525
acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt ctttactact 3075
Thr Ser Thr Pro
530
attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg aaaaatttca 3135
cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat tattagtcat 3195
cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct tcggttactg 3255
ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact acgccttcaa 3315
gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg gtgcccgcac 3375
tttcgctcgc accacctccg atgcagaagt caccctcccc ggcgtcacct tcaactccct 3435
tccccgcctt gaagctgctt cccacggccg catccccgat gcgatc 3481
<210> 22
<211> 533
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 22
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Thr Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515 520 525
Pro Thr Ser Thr Pro
530
<210> 23
<211> 3481
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1437)..(3035)
<223> L30
<400> 23
gatcttgccg atttcggcag gatcaatgtc ggcgtgaatg atcttggcat caggtgcgaa 60
agtgtcaacg tcaccggtga cgcggtcatc aaagcgggag ccgatagcaa tcagcaggtc 120
gctgcgctgc agtgcaccaa cagcggacac agtgccatgc atgcctggca tacccatgtg 180
cagctcgtgg gactctggga aggttcccag cgccatcaat gtggtgacaa ctggaatgcc 240
ggtgtgctca gcgaacgcac gaagctcttc gtgggcatca gccttgataa cgccgccgcc 300
aacgtaaagg acaggcttct tagactcacc gatcagtttg acagcctgct caatctgtcg 360
agcatgcggt gttgaaactg ggcggtagcc tggcaggtcg atctttggtg gccagacgaa 420
atccaattca gcgttctgaa catccttggg gatatccact agaacaggac cagggcgacc 480
agtaatcgcg aggtggaatg cctcagccaa tgcctgtgga atgtcgttgg ggttggtgac 540
catgaagttg tgcttggtca ctggcatggt gatgccgcgg atatcggctt cctggaaagc 600
atcggtaccc agcaggctac ttccgacctg gccggtgatg gcaaccatgg gaacggagtc 660
caagtttgca tcagcgattg gggtaaccaa gttggttgcg cctgggccag aggttgcaat 720
gcagacgcca acgcgtccag taacctgcgc gtagccggtt gctgcgtggc ctgcgccctg 780
ctcgtggcgc actaggacgt ggcgcacctt tgtggaggaa tagagcgggt catacaccgg 840
tagcaccgca ccaccaggaa taccgaacac gatgtcggcg ttaagctcct cgagcgatcg 900
aacaattgcc tgtgcacctg tcatccgctc aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac 960
cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc cacattcacg actttctggc tcctttacta 1020
aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa 1080
agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg 1140
ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200
gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260
ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320
aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380
ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439
Met
1
att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg 1487
Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp
5 10 15
att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt 1535
Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe
20 25 30
ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag cga 1583
Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln Arg
35 40 45
gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc 1631
Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe
50 55 60 65
gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt 1679
Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu
70 75 80
gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg 1727
Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala
85 90 95
att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gtg cag tcg 1775
Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Val Gln Ser
100 105 110
att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa 1823
Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln
115 120 125
ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt 1871
Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val
130 135 140 145
gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg 1919
Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr
150 155 160
att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg tgc 1967
Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys
165 170 175
atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc 2015
Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile
180 185 190
ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa 2063
Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu
195 200 205
gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc 2111
Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile
210 215 220 225
ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg 2159
Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr
230 235 240
gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc 2207
Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val
245 250 255
acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc 2255
Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile
260 265 270
atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga 2303
Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly
275 280 285
acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc tcg 2351
Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser
290 295 300 305
ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct 2399
Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala
310 315 320
gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac 2447
Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp
325 330 335
aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt 2495
Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu
340 345 350
gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa 2543
Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu
355 360 365
aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac 2591
Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr
370 375 380 385
tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc 2639
Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg
390 395 400
atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt 2687
Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe
405 410 415
aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac tcc agt gga 2735
Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly
420 425 430
tgg ctg tca cca agc act gcc acc tca act gcg gtg acc acc tcc gaa 2783
Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu
435 440 445
act tcc gcg cca gca agc acg cct tcg atg aca gtg ccc act acg gtg 2831
Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val
450 455 460 465
gag gag acc cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag cag gaa acc 2879
Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr
470 475 480
tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga gcc gac acc atc gaa ccg 2927
Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro
485 490 495
acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg act gca tcg cag acg cag 2975
Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln
500 505 510
tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gaa aca gtt gcg ccg 3023
Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro
515 520 525
acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt ctttactact 3075
Thr Ser Thr Pro
530
attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg aaaaatttca 3135
cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat tattagtcat 3195
cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct tcggttactg 3255
ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact acgccttcaa 3315
gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg gtgcccgcac 3375
tttcgctcgc accacctccg atgcagaagt caccctcccc ggcgtcacct tcaactccct 3435
tccccgcctt gaagctgctt cccacggccg catccccgat gcgatc 3481
<210> 24
<211> 533
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 24
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Val Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515 520 525
Pro Thr Ser Thr Pro
530
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 25
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe
20
<210> 26
<211> 23
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 26
Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys
20
<210> 27
<211> 23
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 27
Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala
1 5 10 15
Phe Phe Met Leu Ala Val Ser
20
<210> 28
<211> 23
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 28
Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly
20
<210> 29
<211> 23
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 29
Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu
1 5 10 15
Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val
20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
ggctgttgag aagctgccac 20
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
ccaattccac aatgaacaca atgaatagag caaatattga 40
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
tcaatatttg ctctattcat tgtgttcatt gtggaattgg 40
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
ttcggttcct taagagcctg 20
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 34
gggagctcca cggcatgccg accaccgt 28
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 35
gacgcaatgg ttgtcggaat cgc 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 36
gcgattccga caaccattgc gtc 23
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 37
ccgcaacaat cgactgcaca ccaagacca 29
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 38
tggtcttggt gtgcagtcga ttgttgcgg 29
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 39
gggagctcac ctttgtggag gaatagag 28
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 40
gggacacgtc tgtaatcagc gtcctagagc caagattagc gctgaa 46
<210> 41
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 41
ttcagcgcta atcttggctc taggacgctg attacagacg tgtccc 46
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 42
gggagctcag tactcttcct tggacatc 28
<210> 43
<211> 4400
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (443)..(4213)
<223> odhA
<400> 43
gtcgacaagc aaaatcgaag cggcagcacg ccgcgtcgga gccttaaacg ccatcgccgc 60
catccctgat ggtttcaacc atcaagtcgg tgaacgcggg cgcaacctgt catccggaca 120
gcgccaactg atcgcgctgg cgcgcgccga acttatcgag ccttccatca tgcttctcga 180
cgaagccacc tccaccctcg accccgccac cgaagccgtt atcctcaacg cctccgatcg 240
agtcactaag ggacgcacca gcatcatcgt cgcgcaccgc ttggcaaccg ctaaaagggc 300
cgaccgtatt cttgttgttg aacaaggacg tatcattgag gacggatctc acgacgcgtt 360
gttgtctgct aacggcacct acgcccgcat gtggcattta atggcctgac acgttatttt 420
taggagaact gtcaacaaat ta atg cta caa ctg ggg ctt agg cat aat cag 472
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln
1 5 10
cca acg acc aac gtt aca gtg gat aaa aca aag ctc aat aaa ccc tca 520
Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Thr Lys Leu Asn Lys Pro Ser
15 20 25
aga agc aag gaa aag agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568
Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr
30 35 40
ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616
Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln
45 50 55
aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664
Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala
60 65 70
cag ggg gga cca aat act acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712
Gln Gly Gly Pro Asn Thr Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser
75 80 85 90
gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760
Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala
95 100 105
aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gac aag acc gcc cct 808
Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Asp Lys Thr Ala Pro
110 115 120
aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856
Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro
125 130 135
gga caa acc cca atc agg ggt att ttc aag tcc atc gcg aag aac atg 904
Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met
140 145 150
gat atc tcc ctg gaa atc cca acc gca acc tcg gtt cgc gat atg cca 952
Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro
155 160 165 170
gct cgc ctc atg ttc gaa aac cgc gcg atg gtc aac gat cag ctc aag 1000
Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys
175 180 185
cgc acc cgc ggt ggc aag atc tcc ttc acc cac atc att ggc tac gcc 1048
Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala
190 195 200
atg gtg aag gca gtc atg gct cac ccg gac atg aac aac tcc tac gac 1096
Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp
205 210 215
gtc atc gac ggc aag cca acc ctg atc gtg cct gag cac atc aac ctg 1144
Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu
220 225 230
ggc ctt gct atc gac ctt cct cag aag gac ggc tcc cgc gca ctt gtc 1192
Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val
235 240 245 250
gta gca gcc atc aag gaa acc gag aag atg aac ttc tcc gag ttc ctc 1240
Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu
255 260 265
gca gcc tac gaa gac atc gtg gca cgc tcc cgc aag ggc aag ctc acc 1288
Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Ala Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr
270 275 280
atg gat gac tac cag ggc gtt acc gtt tcc ttg acc aac cca ggt ggc 1336
Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly
285 290 295
atc ggt acc cgc cac tct gtt cca cgt cta acc aag ggc cag ggc acc 1384
Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr
300 305 310
atc atc ggt gtc ggt tcc atg gat tac cca gca gag ttc cag ggc gct 1432
Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala
315 320 325 330
tca gaa gac cgc ctt gca gag ctc ggc gtt ggc aaa ctt gtc acc atc 1480
Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile
335 340 345
acc tcc acc tac gat cac cgc gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa 1528
Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu
350 355 360
ttc ctg cgc acc atg tct cgc ctg ctc acc gat gat tcc ttc tgg gat 1576
Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp
365 370 375
gag atc ttc gac gca atg aac gtt cct tac acc cca atg cgt tgg gca 1624
Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala
380 385 390
cag gac gtt cca aac acc ggt gtt gat aag aac acc cgc gtc atg cag 1672
Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln
395 400 405 410
ctc att gag gca tac cgc tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac 1720
Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn
415 420 425
cca ctt tca tgg gtt cag cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac 1768
Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp
430 435 440
ctc gac atc gag acc cac aac ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc 1816
Leu Asp Ile Glu Thr His Asn Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr
445 450 455
ttc aac gtc ggt ggc ttc ggc ggc aag gag acc atg acc ctg cgc gag 1864
Phe Asn Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu
460 465 470
gta ctg tcc cgc ctc cgc gct gcg tac acc ctc aag gtc ggc tcc gaa 1912
Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu
475 480 485 490
tac acc cac atc ctg gac cgc gac gag cgc acc tgg ctg cag gac cgc 1960
Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg
495 500 505
ctc gag gcc gga atg cca aag cca acc cag gca gag cag aag tac atc 2008
Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile
510 515 520
ctg cag aag ctg aac gcc gcg gag gct ttc gag aac ttc ctg cag acc 2056
Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr
525 530 535
aag tac gtc ggc cag aag cgc ttc tcc ctc gaa ggt gca gaa gca ctt 2104
Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu
540 545 550
atc cca ctg atg gac tcc gcc atc gac acc gcc gca ggc caa ggc ctc 2152
Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu
555 560 565 570
gac gaa gtt gtc atc ggt atg cca cac cgt ggt cgc ctc aac gtg ctg 2200
Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu
575 580 585
ttc aac atc gtg ggc aag cca ctg gca tcc atc ttc aac gag ttt gaa 2248
Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu
590 595 600
ggc caa atg gag cag ggc cag atc ggt ggc tcc ggt gac gtg aag tac 2296
Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr
605 610 615
cac ctc ggt tcc gaa ggc cag cac ctg cag atg ttc ggc gac ggc gag 2344
His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu
620 625 630
atc aag gtc tcc ctg act gct aac ccg tcc cac ctg gaa gct gtt aac 2392
Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn
635 640 645 650
cca gtg atg gaa ggt atc gtc cgc gca aag cag gac tac ctg gac aag 2440
Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys
655 660 665
ggc gta gac ggc aag act gtt gtg cca ctg ctg ctc cac ggt gac gct 2488
Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala
670 675 680
gca ttc gca ggc ctg ggc atc gtg cca gaa acc atc aac ctg gct aag 2536
Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys
685 690 695
ctg cgt ggc tac gac gtc ggc ggc acc atc cac atc gtg gtg aac aac 2584
Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn
700 705 710
cag atc ggc ttc acc acc acc cca gac tcc agc cgc tcc atg cac tac 2632
Gln Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr
715 720 725 730
gca acc gac tac gcc aag gca ttc ggc tgc cca gtc ttc cac gtc aac 2680
Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn
735 740 745
ggc gac gac cca gag gca gtt gtc tgg gtt ggc cag ctg gcc acc gag 2728
Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu
750 755 760
tac cgt cgt cgc ttc ggc aag gac gtc ttc atc gac ctc gtc tgc tac 2776
Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr
765 770 775
cgc ctc cgc ggc cac aac gaa gct gat gat cct tcc atg acc cag cca 2824
Arg Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro
780 785 790
aag atg tat gag ctc atc acc ggc cgc gag acc gtt cgt gct cag tac 2872
Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr
795 800 805 810
acc gaa gac ctg ctc gga cgt gga gac ctc tcc aac gaa gat gca gaa 2920
Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu
815 820 825
gca gtc gtc cgc gac ttc cac gac cag atg gaa tct gtg ttc aac gaa 2968
Ala Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu
830 835 840
gtc aag gaa ggc ggc aag aag cag gct gag gca cag acc ggc atc acc 3016
Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr
845 850 855
ggc tcc cag aag ctt cca cac ggc ctt gag acc aac atc tcc cgt gaa 3064
Gly Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu
860 865 870
gag ctc ctg gaa ctg gga cag gct ttc gcc aac acc cca gaa ggc ttc 3112
Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe
875 880 885 890
aac tac cac cca cgt gtg gct ccc gtt gct aag aag cgc gtc tcc tct 3160
Asn Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser
895 900 905
gtc acc gaa ggt ggc atc gac tgg gca tgg ggc gag ctc ctc gcc ttc 3208
Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe
910 915 920
ggt tcc ctg gct aac tcc ggc cgc ttg gtt cgc ctt gca ggt gaa gat 3256
Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp
925 930 935
tcc cgc cgc ggt acc ttc acc cag cgc cac gca gtt gcc atc gac cca 3304
Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro
940 945 950
gcg acc gct gaa gag ttc aac cca ctc cac gag ctt gca cag tcc aag 3352
Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys
955 960 965 970
ggc aac aac ggt aag ttc ctg gtc tac aac tcc gca ctg acc gag tac 3400
Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr
975 980 985
gca ggc atg ggc ttc gag tac ggc tac tcc gta gga aac gaa gac tcc 3448
Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser
990 995 1000
atc gtt gca tgg gaa gca cag ttc ggc gac ttc gcc aac ggc gct 3493
Ile Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala
1005 1010 1015
cag acc atc atc gat gag tac gtc tcc tca ggc gaa gct aag tgg 3538
Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp
1020 1025 1030
ggc cag acc tcc aag ctg atc ctt ctg ctg cct cac ggc tac gaa 3583
Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu
1035 1040 1045
ggc cag ggc cca gac cac tct tcc gca cgt atc gag cgc ttc ctg 3628
Gly Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu
1050 1055 1060
cag ctg tgc gct gag ggt tcc atg act gtt gct cag cca tcc acc 3673
Gln Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr
1065 1070 1075
cca gca aac cac ttc cac cta ctg cgt cgt cac gct ctg tcc gac 3718
Pro Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp
1080 1085 1090
ctg aag cgt cca ctg gtt atc ttc acc ccg aag tcc atg ctg cgt 3763
Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg
1095 1100 1105
aac aag gct gct gcc tcc gca cca gaa gac ttc act gag gtc acc 3808
Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr
1110 1115 1120
aag ttc cag tcc gtg atc aac gat cca aac gtt gca gat gca gcc 3853
Lys Phe Gln Ser Val Ile Asn Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala
1125 1130 1135
aag gtg aag aag gtc atg ctg gtc tcc ggc aag ctg tac tac gaa 3898
Lys Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu
1140 1145 1150
ttg gca aag cgc aag gag aag gac gga cgc gac gac atc gcg atc 3943
Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile
1155 1160 1165
gtt cgt atc gaa atg ctc cac cca att ccg ttc aac cgc atc tcc 3988
Val Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser
1170 1175 1180
gag gct ctt gcc ggc tac cct aac gct gag gaa gtc ctc ttc gtt 4033
Glu Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val
1185 1190 1195
cag gat gag cca gca aac cag ggc cca tgg ccg ttc tac cag gag 4078
Gln Asp Glu Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu
1200 1205 1210
cac ctc cca gag ctg atc ccg aac atg cca aag atg cgc cgc gtt 4123
His Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val
1215 1220 1225
tcc cgc cgc gct cag tcc tcc acc gca act ggt gtt gcc aag gtg 4168
Ser Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val
1230 1235 1240
cac cag ctg gag gag aag cag ctt atc gac gag gct ttc gag gct 4213
His Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1245 1250 1255
taagtcttta tagtcctgca ctagcctaga agggccttat gccgtgtgaa tcacacagca 4273
tacggccctt tttgctgccg tggttgccta aggtggaagg tatgaaacga atctgtgcgg 4333
tcgcgatctc ttcagtactt ttgttaagtg gctgctcctc cacttccaca acgcagctcg 4393
agggatt 4400
<210> 44
<211> 1257
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 44
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln Pro Thr Thr Asn Val Thr
1 5 10 15
Val Asp Lys Thr Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg
20 25 30
Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp
35 40 45
Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val
50 55 60
Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Thr
65 70 75 80
Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala
85 90 95
Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val
100 105 110
Glu Thr Lys Pro Ala Asp Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser
115 120 125
Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg
130 135 140
Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile
145 150 155 160
Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu
165 170 175
Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys
180 185 190
Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met
195 200 205
Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro
210 215 220
Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu
225 230 235 240
Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu
245 250 255
Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile
260 265 270
Val Ala Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly
275 280 285
Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser
290 295 300
Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser
305 310 315 320
Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala
325 330 335
Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His
340 345 350
Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser
355 360 365
Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met
370 375 380
Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr
385 390 395 400
Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg
405 410 415
Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln
420 425 430
Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His
435 440 445
Asn Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Asn Val Gly Gly Phe
450 455 460
Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg
465 470 475 480
Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp
485 490 495
Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro
500 505 510
Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala
515 520 525
Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys
530 535 540
Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser
545 550 555 560
Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly
565 570 575
Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys
580 585 590
Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly
595 600 605
Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly
610 615 620
Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr
625 630 635 640
Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile
645 650 655
Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr
660 665 670
Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly
675 680 685
Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val
690 695 700
Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr
705 710 715 720
Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys
725 730 735
Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala
740 745 750
Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly
755 760 765
Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn
770 775 780
Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile
785 790 795 800
Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly
805 810 815
Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe
820 825 830
His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys
835 840 845
Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro
850 855 860
His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly
865 870 875 880
Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val
885 890 895
Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile
900 905 910
Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser
915 920 925
Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe
930 935 940
Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe
945 950 955 960
Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe
965 970 975
Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu
980 985 990
Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Ile Val Ala Trp Glu Ala
995 1000 1005
Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu
1010 1015 1020
Tyr Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu
1025 1030 1035
Ile Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His
1040 1045 1050
Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gly
1055 1060 1065
Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe His
1070 1075 1080
Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val
1085 1090 1095
Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser
1100 1105 1110
Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe Gln Ser Val Ile
1115 1120 1125
Asn Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys Lys Val Met
1130 1135 1140
Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Lys Glu
1145 1150 1155
Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val Arg Ile Glu Met Leu
1160 1165 1170
His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr
1175 1180 1185
Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu Pro Ala Asn
1190 1195 1200
Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu Leu Ile
1205 1210 1215
Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln Ser
1220 1225 1230
Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys
1235 1240 1245
Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1250 1255
<210> 45
<211> 4389
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (443)..(2542)
<223> sucA8
<400> 45
gtcgacaagc aaaatcgaag cggcagcacg ccgcgtcgga gccttaaacg ccatcgccgc 60
catccctgat ggtttcaatc atcaagtcgg tgaacgcggg cgcaacctgt catccggaca 120
gcgccaactg atcgcgctgg cgcgcgccga actcatcgag ccttccatca tgcttctcga 180
cgaagccacc tccaccctcg accccgccac cgaagccgtt atcctcaacg cctccgatcg 240
agtcactaag ggacgcacca gcatcatcgt cgcgcaccgc ttggcaaccg ctaaaagggc 300
cgaccgtatt cttgttgttg aacaaggacg tatcattgag gacggatctc acgacgcgtt 360
gttgtctgct aacggcacct acgcccgcat gtggcattta atggcctgac acgttatttt 420
taggagaact gtcaacaaat ta atg cta caa ctg ggg ctt agg cat aat cag 472
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln
1 5 10
cca acg acc aac gtt aca gtg gat aaa ata aag ctc aat aaa ccc tca 520
Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser
15 20 25
aga agc aag gaa aag agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568
Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr
30 35 40
ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616
Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln
45 50 55
aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664
Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala
60 65 70
cag ggg gga cca aat gct acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712
Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser
75 80 85 90
gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760
Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala
95 100 105
aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gcc aag acc gcc cct 808
Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro
110 115 120
aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856
Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro
125 130 135
gga caa acc cca atc agg ggt att ttc aag tcc atc gcg aag aac atg 904
Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met
140 145 150
gat atc tcc ctg gaa atc cca acc gca acc tcg gtt cgc gat atg cca 952
Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro
155 160 165 170
gct cgc ctc atg ttc gaa aac cgc gcg atg gtc aac gat cag ctc aag 1000
Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys
175 180 185
cgc acc cgc ggt ggc aag atc tcc ttc acc cac atc att ggc tac gcc 1048
Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala
190 195 200
atg gtg aag gca gtc atg gct cac ccg gac atg aac aac tcc tac gac 1096
Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp
205 210 215
gtc atc gac ggc aag cca acc ctg atc gtg cct gag cac atc aac ctg 1144
Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu
220 225 230
ggc ctt gcc atc gac ctt cct cag aag gac ggc tcc cgc gca ctt gtc 1192
Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val
235 240 245 250
gta gca gcc atc aag gaa acc gag aag atg aac ttc tcc gag ttc ctc 1240
Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu
255 260 265
gca gca tac gaa gac atc gtg aca cgc tcc cgc aag ggc aag ctc acc 1288
Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr
270 275 280
atg gat gac tac cag ggc gtt acc gtt tcc ttg acc aac cca ggt ggc 1336
Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly
285 290 295
atc ggt acc cgc cac tct gtc cca cgt ctg acc aag ggc cag ggc acc 1384
Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr
300 305 310
atc atc ggt gtc ggt tcc atg gat tac cca gca gag ttc cag ggc gct 1432
Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala
315 320 325 330
tcc gaa gac cgc ctt gca gag ctc ggc gtt gga aag ctt gtc acc atc 1480
Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile
335 340 345
acc tcc acc tac gat cac cgc gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa 1528
Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu
350 355 360
ttc ctg cgt acc atg tct cgc ctg ctc acc gat gat tcc ttc tgg gat 1576
Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp
365 370 375
gag atc ttc gac gca atg aac gtt cct tac acc cca atg cgt tgg gca 1624
Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala
380 385 390
cag gac gtt cca aac acc ggt gtt gat aag aac acc cgc gtc atg cag 1672
Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln
395 400 405 410
ctc att gag gca tac cgc tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac 1720
Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn
415 420 425
cca ctt tca tgg gtt cag cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac 1768
Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp
430 435 440
ctc gac atc gag acc cac agc ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc 1816
Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr
445 450 455
ttc agc gtc ggt ggc ttc ggc ggc aag gag acc atg acc ctg cgc gag 1864
Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu
460 465 470
gta ctg tcc cgc ctg cgc gct gcc tac acc ttg aag gtc ggc tcc gaa 1912
Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu
475 480 485 490
tac acc cac atc ctg gac cgc gac gag cgc acc tgg ctg cag gac cgc 1960
Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg
495 500 505
ctc gaa gcc gga atg cca aag cca acc cag gca gag cag aag tac atc 2008
Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile
510 515 520
ctg cag aag ctg aac gcc gca gag gct ttc gag aac ttc ctg cag acc 2056
Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr
525 530 535
aag tac gtc ggc cag aag cgc ttc tcc ctc gaa ggt gca gaa gct ctc 2104
Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu
540 545 550
atc cca ctg atg gac tcc gcc atc gac acc gcc gca ggc cag ggc ctc 2152
Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu
555 560 565 570
gac gaa gtt gtc atc ggt atg cca cac cgt ggt cgc ctc aac gtg ctg 2200
Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu
575 580 585
ttc aac atc gtg ggc aag cca ctg gca tcc atc ttc aac gag ttt gaa 2248
Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu
590 595 600
ggc caa atg gag cag ggc cag atc ggt ggc tcc ggt gac gtg aag tac 2296
Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr
605 610 615
cac ctc ggt tcc gaa ggc cag cac ctg cag atg ttc ggc gac ggc gag 2344
His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu
620 625 630
atc aag gtc tcc ctg act gct aac ccg tcc cac ctg gaa gct gtt aac 2392
Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn
635 640 645 650
cca gtg atg gaa ggt atc gtc cgc gca aag cag gac tac ctg gac aag 2440
Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys
655 660 665
ggc gta gac ggc aag act gtt gtg cca ctg ctg ctc cac ggt gac gct 2488
Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala
670 675 680
gca ttc gca ggc ctg ggc atc gtg cca gaa acc atc aac ctg gct aag 2536
Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys
685 690 695
ctg cgt cgacgtcgga ggcaccatcc acatcgtggt gaacaaccag atcggcttca 2592
Leu Arg
700
ccaccacccc agactccagc cgctccatgc actacgcaac cgactacgcc aaggcattcg 2652
gctgcccagt cttccacgtc aatggtgatg acccagaggc agttgtctgg gttggccagc 2712
tggcaaccga gtaccgtcgt cgcttcggca aggacgtctt catcgacctc gtttgctacc 2772
gcctccgcgg ccacaacgaa gctgatgatc cttccatgac ccagccaaag atgtatgagc 2832
tcatcaccgg ccgcgagacc gttcgtgctc agtacaccga agacctgctc ggacgtggag 2892
acctctccaa cgaagatgca gaagcagtcg tccgcgactt ccacgaccag atggaatctg 2952
tgttcaacga agtcaaggaa ggcggcaaga agcaggctga ggcacagacc ggcatcaccg 3012
gctcccagaa gcttccacac ggccttgaga ccaacatctc ccgtgaagag ctcctggaac 3072
tgggacaggc tttcgccaac accccagaag gcttcaacta ccacccacgt gtggctccag 3132
ttgctaagaa gcgcgtctcc tctgtcaccg aaggtggcat cgactgggca tggggcgagc 3192
tcctcgcctt cggttccctg gctaactccg gccgcttggt tcgccttgca ggtgaagatt 3252
cccgccgcgg taccttcacc cagcgccacg cagttgccat cgacccagcg accgctgaag 3312
agttcaaccc actccacgag cttgcacagt ccaagggcaa caacggtaag ttcctggtct 3372
acaactccgc actgaccgag tacgcaggca tgggcttcga gtacggctac tccgtaggaa 3432
acgaagactc cgtcgttgca tgggaagcac agttcggcga cttcgccaac ggcgctcaga 3492
ccatcatcga tgagtacgtc tcctcaggcg aagctaagtg gggccagacc tccaagctga 3552
tccttctgct gcctcacggc tacgaaggcc agggcccaga ccactcttcc gcacgtatcg 3612
agcgcttcct gcagctgtgc gctgagggtt ccatgactgt tgctcagcca tccaccccag 3672
caaaccactt ccacctgctg cgtcgtcacg ctctgtccga cctgaagcgt ccactggtta 3732
tcttcacccc gaagtccatg ctgcgtaaca aggctgctgc ctccgcacca gaagacttca 3792
ctgaggtcac caagttccaa tccgtgatcg acgatccaaa cgttgcagat gcagccaagg 3852
tgaagaaggt catgctggtc tccggcaagc tgtactacga attggcaaag cgcaaggaga 3912
aggacggacg cgacgacatc gcgatcgttc gtatcgaaat gctccaccca attccgttca 3972
accgcatctc cgaggctctt gccggctacc ctaacgctga ggaagtcctc ttcgttcagg 4032
atgagccagc aaaccagggc ccatggccgt tctaccagga gcacctccca gagctgatcc 4092
cgaacatgcc aaagatgcgc cgcgtttccc gccgcgctca gtcctccacc gcaactggtg 4152
ttgctaaggt gcaccagctg gaggagaagc agcttatcga cgaggctttc gaggcttaag 4212
tctttatagt cctgcactag cctagagggc cttatgcagt gtgaatcaca cagcataagg 4272
ccctttttgc tgccgtggtt gcctaaggtg gaaggcatga aacgaatctg tgcggtcacg 4332
atctcttcag tacttttgct aagtggctgc tcctccactt ccaccacgca gctcgag 4389
<210> 46
<211> 700
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 46
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln Pro Thr Thr Asn Val Thr
1 5 10 15
Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg
20 25 30
Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp
35 40 45
Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val
50 55 60
Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala
65 70 75 80
Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala
85 90 95
Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val
100 105 110
Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser
115 120 125
Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg
130 135 140
Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile
145 150 155 160
Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu
165 170 175
Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys
180 185 190
Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met
195 200 205
Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro
210 215 220
Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu
225 230 235 240
Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu
245 250 255
Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile
260 265 270
Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly
275 280 285
Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser
290 295 300
Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser
305 310 315 320
Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala
325 330 335
Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His
340 345 350
Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser
355 360 365
Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met
370 375 380
Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr
385 390 395 400
Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg
405 410 415
Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln
420 425 430
Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His
435 440 445
Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe
450 455 460
Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg
465 470 475 480
Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp
485 490 495
Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro
500 505 510
Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala
515 520 525
Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys
530 535 540
Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser
545 550 555 560
Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly
565 570 575
Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys
580 585 590
Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly
595 600 605
Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly
610 615 620
Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr
625 630 635 640
Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile
645 650 655
Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr
660 665 670
Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly
675 680 685
Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg
690 695 700
<210> 47
<211> 4391
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (443)..(4210)
<223> sucA801
<400> 47
gtcgacaagc aaaatcgaag cggcagcacg ccgcgtcgga gccttaaacg ccatcgccgc 60
catccctgat ggtttcaatc atcaagtcgg tgaacgcggg cgcaacctgt catccggaca 120
gcgccaactg atcgcgctgg cgcgcgccga actcatcgag ccttccatca tgcttctcga 180
cgaagccacc tccaccctcg accccgccac cgaagccgtt atcctcaacg cctccgatcg 240
agtcactaag ggacgcacca gcatcatcgt cgcgcaccgc ttggcaaccg ctaaaagggc 300
cgaccgtatt cttgttgttg aacaaggacg tatcattgag gacggatctc acgacgcgtt 360
gttgtctgct aacggcacct acgcccgcat gtggcattta atggcctgac acgttatttt 420
taggagaact gtcaacaaat ta atg cta caa ctg ggg ctt agg cat aat cag 472
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln
1 5 10
cca acg acc aac gtt aca gtg gat aaa ata aag ctc aat aaa ccc tca 520
Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser
15 20 25
aga agc aag gaa aag agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568
Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr
30 35 40
ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616
Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln
45 50 55
aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664
Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala
60 65 70
cag ggg gga cca aat gct acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712
Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser
75 80 85 90
gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760
Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala
95 100 105
aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gcc aag acc gcc cct 808
Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro
110 115 120
aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856
Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro
125 130 135
gga caa acc cca atc agg ggt att ttc aag tcc atc gcg aag aac atg 904
Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met
140 145 150
gat atc tcc ctg gaa atc cca acc gca acc tcg gtt cgc gat atg cca 952
Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro
155 160 165 170
gct cgc ctc atg ttc gaa aac cgc gcg atg gtc aac gat cag ctc aag 1000
Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys
175 180 185
cgc acc cgc ggt ggc aag atc tcc ttc acc cac atc att ggc tac gcc 1048
Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala
190 195 200
atg gtg aag gca gtc atg gct cac ccg gac atg aac aac tcc tac gac 1096
Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp
205 210 215
gtc atc gac ggc aag cca acc ctg atc gtg cct gag cac atc aac ctg 1144
Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu
220 225 230
ggc ctt gcc atc gac ctt cct cag aag gac ggc tcc cgc gca ctt gtc 1192
Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val
235 240 245 250
gta gca gcc atc aag gaa acc gag aag atg aac ttc tcc gag ttc ctc 1240
Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu
255 260 265
gca gca tac gaa gac atc gtg aca cgc tcc cgc aag ggc aag ctc acc 1288
Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr
270 275 280
atg gat gac tac cag ggc gtt acc gtt tcc ttg acc aac cca ggt ggc 1336
Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly
285 290 295
atc ggt acc cgc cac tct gtc cca cgt ctg acc aag ggc cag ggc acc 1384
Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr
300 305 310
atc atc ggt gtc ggt tcc atg gat tac cca gca gag ttc cag ggc gct 1432
Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala
315 320 325 330
tcc gaa gac cgc ctt gca gag ctc ggc gtt gga aag ctt gtc acc atc 1480
Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile
335 340 345
acc tcc acc tac gat cac cgc gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa 1528
Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu
350 355 360
ttc ctg cgt acc atg tct cgc ctg ctc acc gat gat tcc ttc tgg gat 1576
Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp
365 370 375
gag atc ttc gac gca atg aac gtt cct tac acc cca atg cgt tgg gca 1624
Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala
380 385 390
cag gac gtt cca aac acc ggt gtt gat aag aac acc cgc gtc atg cag 1672
Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln
395 400 405 410
ctc att gag gca tac cgc tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac 1720
Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn
415 420 425
cca ctt tca tgg gtt cag cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac 1768
Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp
430 435 440
ctc gac atc gag acc cac agc ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc 1816
Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr
445 450 455
ttc agc gtc ggt ggc ttc ggc ggc aag gag acc atg acc ctg cgc gag 1864
Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu
460 465 470
gta ctg tcc cgc ctg cgc gct gcc tac acc ttg aag gtc ggc tcc gaa 1912
Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu
475 480 485 490
tac acc cac atc ctg gac cgc gac gag cgc acc tgg ctg cag gac cgc 1960
Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg
495 500 505
ctc gaa gcc gga atg cca aag cca acc cag gca gag cag aag tac atc 2008
Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile
510 515 520
ctg cag aag ctg aac gcc gca gag gct ttc gag aac ttc ctg cag acc 2056
Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr
525 530 535
aag tac gtc ggc cag aag cgc ttc tcc ctc gaa ggt gca gaa gct ctc 2104
Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu
540 545 550
atc cca ctg atg gac tcc gcc atc gac acc gcc gca ggc cag ggc ctc 2152
Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu
555 560 565 570
gac gaa gtt gtc atc ggt atg cca cac cgt ggt cgc ctc aac gtg ctg 2200
Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu
575 580 585
ttc aac atc gtg ggc aag cca ctg gca tcc atc ttc aac gag ttt gaa 2248
Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu
590 595 600
ggc caa atg gag cag ggc cag atc ggt ggc tcc ggt gac gtg aag tac 2296
Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr
605 610 615
cac ctc ggt tcc gaa ggc cag cac ctg cag atg ttc ggc gac ggc gag 2344
His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu
620 625 630
atc aag gtc tcc ctg act gct aac ccg tcc cac ctg gaa gct gtt aac 2392
Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn
635 640 645 650
cca gtg atg gaa ggt atc gtc cgc gca aag cag gac tac ctg gac aag 2440
Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys
655 660 665
ggc gta gac ggc aag act gtt gtg cca ctg ctg ctc cac ggt gac gct 2488
Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala
670 675 680
gca ttc gca ggc ctg ggc atc gtg cca gaa acc atc aac ctg gct aag 2536
Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys
685 690 695
ctg cgt ctc gac gtc gga ggc acc atc cac atc gtg gtg aac aac cag 2584
Leu Arg Leu Asp Val Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln
700 705 710
atc ggc ttc acc acc acc cca gac tcc agc cgc tcc atg cac tac gca 2632
Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala
715 720 725 730
acc gac tac gcc aag gca ttc ggc tgc cca gtc ttc cac gtc aat ggt 2680
Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly
735 740 745
gat gac cca gag gca gtt gtc tgg gtt ggc cag ctg gca acc gag tac 2728
Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr
750 755 760
cgt cgt cgc ttc ggc aag gac gtc ttc atc gac ctc gtt tgc tac cgc 2776
Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg
765 770 775
ctc cgc ggc cac aac gaa gct gat gat cct tcc atg acc cag cca aag 2824
Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys
780 785 790
atg tat gag ctc atc acc ggc cgc gag acc gtt cgt gct cag tac acc 2872
Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr
795 800 805 810
gaa gac ctg ctc gga cgt gga gac ctc tcc aac gaa gat gca gaa gca 2920
Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala
815 820 825
gtc gtc cgc gac ttc cac gac cag atg gaa tct gtg ttc aac gaa gtc 2968
Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val
830 835 840
aag gaa ggc ggc aag aag cag gct gag gca cag acc ggc atc acc ggc 3016
Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly
845 850 855
tcc cag aag ctt cca cac ggc ctt gag acc aac atc tcc cgt gaa gag 3064
Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu
860 865 870
ctc ctg gaa ctg gga cag gct ttc gcc aac acc cca gaa ggc ttc aac 3112
Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn
875 880 885 890
tac cac cca cgt gtg gct cca gtt gct aag aag cgc gtc tcc tct gtc 3160
Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val
895 900 905
acc gaa ggt ggc atc gac tgg gca tgg ggc gag ctc ctc gcc ttc ggt 3208
Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly
910 915 920
tcc ctg gct aac tcc ggc cgc ttg gtt cgc ctt gca ggt gaa gat tcc 3256
Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser
925 930 935
cgc cgc ggt acc ttc acc cag cgc cac gca gtt gcc atc gac cca gcg 3304
Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala
940 945 950
acc gct gaa gag ttc aac cca ctc cac gag ctt gca cag tcc aag ggc 3352
Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly
955 960 965 970
aac aac ggt aag ttc ctg gtc tac aac tcc gca ctg acc gag tac gca 3400
Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala
975 980 985
ggc atg ggc ttc gag tac ggc tac tcc gta gga aac gaa gac tcc gtc 3448
Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val
990 995 1000
gtt gca tgg gaa gca cag ttc ggc gac ttc gcc aac ggc gct cag 3493
Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln
1005 1010 1015
acc atc atc gat gag tac gtc tcc tca ggc gaa gct aag tgg ggc 3538
Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly
1020 1025 1030
cag acc tcc aag ctg atc ctt ctg ctg cct cac ggc tac gaa ggc 3583
Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly
1035 1040 1045
cag ggc cca gac cac tct tcc gca cgt atc gag cgc ttc ctg cag 3628
Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln
1050 1055 1060
ctg tgc gct gag ggt tcc atg act gtt gct cag cca tcc acc cca 3673
Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro
1065 1070 1075
gca aac cac ttc cac ctg ctg cgt cgt cac gct ctg tcc gac ctg 3718
Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu
1080 1085 1090
aag cgt cca ctg gtt atc ttc acc ccg aag tcc atg ctg cgt aac 3763
Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn
1095 1100 1105
aag gct gct gcc tcc gca cca gaa gac ttc act gag gtc acc aag 3808
Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys
1110 1115 1120
ttc caa tcc gtg atc gac gat cca aac gtt gca gat gca gcc aag 3853
Phe Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys
1125 1130 1135
gtg aag aag gtc atg ctg gtc tcc ggc aag ctg tac tac gaa ttg 3898
Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu
1140 1145 1150
gca aag cgc aag gag aag gac gga cgc gac gac atc gcg atc gtt 3943
Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val
1155 1160 1165
cgt atc gaa atg ctc cac cca att ccg ttc aac cgc atc tcc gag 3988
Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu
1170 1175 1180
gct ctt gcc ggc tac cct aac gct gag gaa gtc ctc ttc gtt cag 4033
Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln
1185 1190 1195
gat gag cca gca aac cag ggc cca tgg ccg ttc tac cag gag cac 4078
Asp Glu Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His
1200 1205 1210
ctc cca gag ctg atc ccg aac atg cca aag atg cgc cgc gtt tcc 4123
Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser
1215 1220 1225
cgc cgc gct cag tcc tcc acc gca act ggt gtt gct aag gtg cac 4168
Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His
1230 1235 1240
cag ctg gag gag aag cag ctt atc gac gag gct ttc gag gct 4210
Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1245 1250 1255
taagtcttta tagtcctgca ctagcctaga gggccttatg cagtgtgaat cacacagcat 4270
aaggcccttt ttgctgccgt ggttgcctaa ggtggaaggc atgaaacgaa tctgtgcggt 4330
cacgatctct tcagtacttt tgctaagtgg ctgctcctcc acttccacca cgcagctcga 4390
g 4391
<210> 48
<211> 1256
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 48
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln Pro Thr Thr Asn Val Thr
1 5 10 15
Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg
20 25 30
Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp
35 40 45
Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val
50 55 60
Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala
65 70 75 80
Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala
85 90 95
Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val
100 105 110
Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser
115 120 125
Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg
130 135 140
Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile
145 150 155 160
Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu
165 170 175
Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys
180 185 190
Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met
195 200 205
Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro
210 215 220
Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu
225 230 235 240
Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu
245 250 255
Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile
260 265 270
Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly
275 280 285
Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser
290 295 300
Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser
305 310 315 320
Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala
325 330 335
Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His
340 345 350
Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser
355 360 365
Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met
370 375 380
Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr
385 390 395 400
Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg
405 410 415
Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln
420 425 430
Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His
435 440 445
Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe
450 455 460
Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg
465 470 475 480
Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp
485 490 495
Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro
500 505 510
Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala
515 520 525
Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys
530 535 540
Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser
545 550 555 560
Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly
565 570 575
Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys
580 585 590
Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly
595 600 605
Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly
610 615 620
Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr
625 630 635 640
Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile
645 650 655
Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr
660 665 670
Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly
675 680 685
Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg Leu Asp Val Gly
690 695 700
Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr Thr
705 710 715 720
Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala
725 730 735
Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val
740 745 750
Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys
755 760 765
Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn Glu
770 775 780
Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr
785 790 795 800
Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg
805 810 815
Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe His
820 825 830
Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys
835 840 845
Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro His
850 855 860
Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln
865 870 875 880
Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val Ala
885 890 895
Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp
900 905 910
Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly
915 920 925
Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr
930 935 940
Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn
945 950 955 960
Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu
965 970 975
Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr
980 985 990
Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala Gln
995 1000 1005
Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr
1010 1015 1020
Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile
1025 1030 1035
Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His Ser
1040 1045 1050
Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gly Ser
1055 1060 1065
Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu
1070 1075 1080
Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile
1085 1090 1095
Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala
1100 1105 1110
Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe Gln Ser Val Ile Asp
1115 1120 1125
Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu
1130 1135 1140
Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys
1145 1150 1155
Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val Arg Ile Glu Met Leu His
1160 1165 1170
Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr Pro
1175 1180 1185
Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu Pro Ala Asn Gln
1190 1195 1200
Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu Leu Ile Pro
1205 1210 1215
Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln Ser Ser
1220 1225 1230
Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys Gln
1235 1240 1245
Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1250 1255
<210> 49
<211> 4391
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (443)..(4210)
<223> sucA805
<400> 49
gtcgacaagc aaaatcgaag cggcagcacg ccgcgtcgga gccttaaacg ccatcgccgc 60
catccctgat ggtttcaatc atcaagtcgg tgaacgcggg cgcaacctgt catccggaca 120
gcgccaactg atcgcgctgg cgcgcgccga actcatcgag ccttccatca tgcttctcga 180
cgaagccacc tccaccctcg accccgccac cgaagccgtt atcctcaacg cctccgatcg 240
agtcactaag ggacgcacca gcatcatcgt cgcgcaccgc ttggcaaccg ctaaaagggc 300
cgaccgtatt cttgttgttg aacaaggacg tatcattgag gacggatctc acgacgcgtt 360
gttgtctgct aacggcacct acgcccgcat gtggcattta atggcctgac acgttatttt 420
taggagaact gtcaacaaat ta atg cta caa ctg ggg ctt agg cat aat cag 472
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln
1 5 10
cca acg acc aac gtt aca gtg gat aaa ata aag ctc aat aaa ccc tca 520
Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser
15 20 25
aga agc aag gaa aag agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568
Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr
30 35 40
ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616
Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln
45 50 55
aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664
Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala
60 65 70
cag ggg gga cca aat gct acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712
Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser
75 80 85 90
gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760
Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala
95 100 105
aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gcc aag acc gcc cct 808
Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro
110 115 120
aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856
Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro
125 130 135
gga caa acc cca atc agg ggt att ttc aag tcc atc gcg aag aac atg 904
Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met
140 145 150
gat atc tcc ctg gaa atc cca acc gca acc tcg gtt cgc gat atg cca 952
Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro
155 160 165 170
gct cgc ctc atg ttc gaa aac cgc gcg atg gtc aac gat cag ctc aag 1000
Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys
175 180 185
cgc acc cgc ggt ggc aag atc tcc ttc acc cac atc att ggc tac gcc 1048
Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala
190 195 200
atg gtg aag gca gtc atg gct cac ccg gac atg aac aac tcc tac gac 1096
Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp
205 210 215
gtc atc gac ggc aag cca acc ctg atc gtg cct gag cac atc aac ctg 1144
Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu
220 225 230
ggc ctt gcc atc gac ctt cct cag aag gac ggc tcc cgc gca ctt gtc 1192
Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val
235 240 245 250
gta gca gcc atc aag gaa acc gag aag atg aac ttc tcc gag ttc ctc 1240
Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu
255 260 265
gca gca tac gaa gac atc gtg aca cgc tcc cgc aag ggc aag ctc acc 1288
Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr
270 275 280
atg gat gac tac cag ggc gtt acc gtt tcc ttg acc aac cca ggt ggc 1336
Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly
285 290 295
atc ggt acc cgc cac tct gtc cca cgt ctg acc aag ggc cag ggc acc 1384
Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr
300 305 310
atc atc ggt gtc ggt tcc atg gat tac cca gca gag ttc cag ggc gct 1432
Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala
315 320 325 330
tcc gaa gac cgc ctt gca gag ctc ggc gtt gga aag ctt gtc acc atc 1480
Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile
335 340 345
acc tcc acc tac gat cac cgc gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa 1528
Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu
350 355 360
ttc ctg cgt acc atg tct cgc ctg ctc acc gat gat tcc ttc tgg gat 1576
Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp
365 370 375
gag atc ttc gac gca atg aac gtt cct tac acc cca atg cgt tgg gca 1624
Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala
380 385 390
cag gac gtt cca aac acc ggt gtt gat aag aac acc cgc gtc atg cag 1672
Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln
395 400 405 410
ctc att gag gca tac cgc tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac 1720
Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn
415 420 425
cca ctt tca tgg gtt cag cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac 1768
Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp
430 435 440
ctc gac atc gag acc cac agc ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc 1816
Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr
445 450 455
ttc agc gtc ggt ggc ttc ggc ggc aag gag acc atg acc ctg cgc gag 1864
Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu
460 465 470
gta ctg tcc cgc ctg cgc gct gcc tac acc ttg aag gtc ggc tcc gaa 1912
Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu
475 480 485 490
tac acc cac atc ctg gac cgc gac gag cgc acc tgg ctg cag gac cgc 1960
Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg
495 500 505
ctc gaa gcc gga atg cca aag cca acc cag gca gag cag aag tac atc 2008
Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile
510 515 520
ctg cag aag ctg aac gcc gca gag gct ttc gag aac ttc ctg cag acc 2056
Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr
525 530 535
aag tac gtc ggc cag aag cgc ttc tcc ctc gaa ggt gca gaa gct ctc 2104
Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu
540 545 550
atc cca ctg atg gac tcc gcc atc gac acc gcc gca ggc cag ggc ctc 2152
Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu
555 560 565 570
gac gaa gtt gtc atc ggt atg cca cac cgt ggt cgc ctc aac gtg ctg 2200
Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu
575 580 585
ttc aac atc gtg ggc aag cca ctg gca tcc atc ttc aac gag ttt gaa 2248
Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu
590 595 600
ggc caa atg gag cag ggc cag atc ggt ggc tcc ggt gac gtg aag tac 2296
Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr
605 610 615
cac ctc ggt tcc gaa ggc cag cac ctg cag atg ttc ggc gac ggc gag 2344
His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu
620 625 630
atc aag gtc tcc ctg act gct aac ccg tcc cac ctg gaa gct gtt aac 2392
Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn
635 640 645 650
cca gtg atg gaa ggt atc gtc cgc gca aag cag gac tac ctg gac aag 2440
Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys
655 660 665
ggc gta gac ggc aag act gtt gtg cca ctg ctg ctc cac ggt gac gct 2488
Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala
670 675 680
gca ttc gca ggc ctg ggc atc gtg cca gaa acc atc aac ctg gct aaa 2536
Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys
685 690 695
agc tgc gtc gac gtc gga ggc acc atc cac atc gtg gtg aac aac cag 2584
Ser Cys Val Asp Val Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln
700 705 710
atc ggc ttc acc acc acc cca gac tcc agc cgc tcc atg cac tac gca 2632
Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala
715 720 725 730
acc gac tac gcc aag gca ttc ggc tgc cca gtc ttc cac gtc aat ggt 2680
Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly
735 740 745
gat gac cca gag gca gtt gtc tgg gtt ggc cag ctg gca acc gag tac 2728
Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr
750 755 760
cgt cgt cgc ttc ggc aag gac gtc ttc atc gac ctc gtt tgc tac cgc 2776
Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg
765 770 775
ctc cgc ggc cac aac gaa gct gat gat cct tcc atg acc cag cca aag 2824
Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys
780 785 790
atg tat gag ctc atc acc ggc cgc gag acc gtt cgt gct cag tac acc 2872
Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr
795 800 805 810
gaa gac ctg ctc gga cgt gga gac ctc tcc aac gaa gat gca gaa gca 2920
Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala
815 820 825
gtc gtc cgc gac ttc cac gac cag atg gaa tct gtg ttc aac gaa gtc 2968
Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val
830 835 840
aag gaa ggc ggc aag aag cag gct gag gca cag acc ggc atc acc ggc 3016
Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly
845 850 855
tcc cag aag ctt cca cac ggc ctt gag acc aac atc tcc cgt gaa gag 3064
Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu
860 865 870
ctc ctg gaa ctg gga cag gct ttc gcc aac acc cca gaa ggc ttc aac 3112
Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn
875 880 885 890
tac cac cca cgt gtg gct cca gtt gct aag aag cgc gtc tcc tct gtc 3160
Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val
895 900 905
acc gaa ggt ggc atc gac tgg gca tgg ggc gag ctc ctc gcc ttc ggt 3208
Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly
910 915 920
tcc ctg gct aac tcc ggc cgc ttg gtt cgc ctt gca ggt gaa gat tcc 3256
Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser
925 930 935
cgc cgc ggt acc ttc acc cag cgc cac gca gtt gcc atc gac cca gcg 3304
Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala
940 945 950
acc gct gaa gag ttc aac cca ctc cac gag ctt gca cag tcc aag ggc 3352
Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly
955 960 965 970
aac aac ggt aag ttc ctg gtc tac aac tcc gca ctg acc gag tac gca 3400
Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala
975 980 985
ggc atg ggc ttc gag tac ggc tac tcc gta gga aac gaa gac tcc gtc 3448
Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val
990 995 1000
gtt gca tgg gaa gca cag ttc ggc gac ttc gcc aac ggc gct cag 3493
Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln
1005 1010 1015
acc atc atc gat gag tac gtc tcc tca ggc gaa gct aag tgg ggc 3538
Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly
1020 1025 1030
cag acc tcc aag ctg atc ctt ctg ctg cct cac ggc tac gaa ggc 3583
Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly
1035 1040 1045
cag ggc cca gac cac tct tcc gca cgt atc gag cgc ttc ctg cag 3628
Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln
1050 1055 1060
ctg tgc gct gag ggt tcc atg act gtt gct cag cca tcc acc cca 3673
Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro
1065 1070 1075
gca aac cac ttc cac ctg ctg cgt cgt cac gct ctg tcc gac ctg 3718
Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu
1080 1085 1090
aag cgt cca ctg gtt atc ttc acc ccg aag tcc atg ctg cgt aac 3763
Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn
1095 1100 1105
aag gct gct gcc tcc gca cca gaa gac ttc act gag gtc acc aag 3808
Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys
1110 1115 1120
ttc caa tcc gtg atc gac gat cca aac gtt gca gat gca gcc aag 3853
Phe Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys
1125 1130 1135
gtg aag aag gtc atg ctg gtc tcc ggc aag ctg tac tac gaa ttg 3898
Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu
1140 1145 1150
gca aag cgc aag gag aag gac gga cgc gac gac atc gcg atc gtt 3943
Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val
1155 1160 1165
cgt atc gaa atg ctc cac cca att ccg ttc aac cgc atc tcc gag 3988
Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu
1170 1175 1180
gct ctt gcc ggc tac cct aac gct gag gaa gtc ctc ttc gtt cag 4033
Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln
1185 1190 1195
gat gag cca gca aac cag ggc cca tgg ccg ttc tac cag gag cac 4078
Asp Glu Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His
1200 1205 1210
ctc cca gag ctg atc ccg aac atg cca aag atg cgc cgc gtt tcc 4123
Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser
1215 1220 1225
cgc cgc gct cag tcc tcc acc gca act ggt gtt gct aag gtg cac 4168
Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His
1230 1235 1240
cag ctg gag gag aag cag ctt atc gac gag gct ttc gag gct 4210
Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1245 1250 1255
taagtcttta tagtcctgca ctagcctaga gggccttatg cagtgtgaat cacacagcat 4270
aaggcccttt ttgctgccgt ggttgcctaa ggtggaaggc atgaaacgaa tctgtgcggt 4330
cacgatctct tcagtacttt tgctaagtgg ctgctcctcc acttccacca cgcagctcga 4390
g 4391
<210> 50
<211> 1256
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 50
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln Pro Thr Thr Asn Val Thr
1 5 10 15
Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg
20 25 30
Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp
35 40 45
Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val
50 55 60
Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala
65 70 75 80
Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala
85 90 95
Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val
100 105 110
Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser
115 120 125
Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg
130 135 140
Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile
145 150 155 160
Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu
165 170 175
Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys
180 185 190
Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met
195 200 205
Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro
210 215 220
Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu
225 230 235 240
Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu
245 250 255
Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile
260 265 270
Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly
275 280 285
Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser
290 295 300
Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser
305 310 315 320
Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala
325 330 335
Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His
340 345 350
Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser
355 360 365
Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met
370 375 380
Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr
385 390 395 400
Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg
405 410 415
Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln
420 425 430
Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His
435 440 445
Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe
450 455 460
Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg
465 470 475 480
Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp
485 490 495
Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro
500 505 510
Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala
515 520 525
Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys
530 535 540
Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser
545 550 555 560
Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly
565 570 575
Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys
580 585 590
Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly
595 600 605
Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly
610 615 620
Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr
625 630 635 640
Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile
645 650 655
Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr
660 665 670
Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly
675 680 685
Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Ser Cys Val Asp Val Gly
690 695 700
Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr Thr
705 710 715 720
Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala
725 730 735
Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val
740 745 750
Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys
755 760 765
Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn Glu
770 775 780
Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr
785 790 795 800
Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg
805 810 815
Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe His
820 825 830
Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys
835 840 845
Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro His
850 855 860
Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln
865 870 875 880
Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val Ala
885 890 895
Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp
900 905 910
Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly
915 920 925
Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr
930 935 940
Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn
945 950 955 960
Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu
965 970 975
Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr
980 985 990
Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala Gln
995 1000 1005
Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr
1010 1015 1020
Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile
1025 1030 1035
Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His Ser
1040 1045 1050
Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gly Ser
1055 1060 1065
Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu
1070 1075 1080
Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile
1085 1090 1095
Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala
1100 1105 1110
Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe Gln Ser Val Ile Asp
1115 1120 1125
Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu
1130 1135 1140
Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys
1145 1150 1155
Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val Arg Ile Glu Met Leu His
1160 1165 1170
Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr Pro
1175 1180 1185
Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu Pro Ala Asn Gln
1190 1195 1200
Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu Leu Ile Pro
1205 1210 1215
Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln Ser Ser
1220 1225 1230
Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys Gln
1235 1240 1245
Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1250 1255
<210> 51
<211> 4391
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (443)..(4210)
<223> sucA77
<400> 51
gtcgacaagc aaaatcgaag cggcagcacg ccgcgtcgga gccttaaacg ccatcgccgc 60
catccctgat ggtttcaatc atcaagtcgg tgaacgcggg cgcaacctgt catccggaca 120
gcgccaactg atcgcgctgg cgcgcgccga actcatcgag ccttccatca tgcttctcga 180
cgaagccacc tccaccctcg accccgccac cgaagccgtt atcctcaacg cctccgatcg 240
agtcactaag ggacgcacca gcatcatcgt cgcgcaccgc ttggcaaccg ctaaaagggc 300
cgaccgtatt cttgttgttg aacaaggacg tatcattgag gacggatctc acgacgcgtt 360
gttgtctgct aacggcacct acgcccgcat gtggcattta atggcctgac acgttatttt 420
taggagaact gtcaacaaat ta atg cta caa ctg ggg ctt agg cat aat cag 472
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln
1 5 10
cca acg acc aac gtt aca gtg gat aaa ata aag ctc aat aaa ccc tca 520
Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser
15 20 25
aga agc aag gaa aag agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568
Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr
30 35 40
ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616
Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln
45 50 55
aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664
Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala
60 65 70
cag ggg gga cca aat gct acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712
Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser
75 80 85 90
gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760
Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala
95 100 105
aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gcc aag acc gcc cct 808
Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro
110 115 120
aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856
Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro
125 130 135
gga caa acc cca atc agg ggt att ttc aag tcc atc gcg aag aac atg 904
Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met
140 145 150
gat atc tcc ctg gaa atc cca acc gca acc tcg gtt cgc gat atg cca 952
Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro
155 160 165 170
gct cgc ctc atg ttc gaa aac cgc gcg atg gtc aac gat cag ctc aag 1000
Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys
175 180 185
cgc acc cgc ggt ggc aag atc tcc ttc acc cac atc att ggc tac gcc 1048
Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala
190 195 200
atg gtg aag gca gtc atg gct cac ccg gac atg aac aac tcc tac gac 1096
Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp
205 210 215
gtc atc gac ggc aag cca acc ctg atc gtg cct gag cac atc aac ctg 1144
Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu
220 225 230
ggc ctt gcc atc gac ctt cct cag aag gac ggc tcc cgc gca ctt gtc 1192
Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val
235 240 245 250
gta gca gcc atc aag gaa acc gag aag atg aac ttc tcc gag ttc ctc 1240
Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu
255 260 265
gca gca tac gaa gac atc gtg aca cgc tcc cgc aag ggc aag ctc acc 1288
Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr
270 275 280
atg gat gac tac cag ggc gtt acc gtt tcc ttg acc aac cca ggt ggc 1336
Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly
285 290 295
atc ggt acc cgc cac tct gtc cca cgt ctg acc aag ggc cag ggc acc 1384
Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr
300 305 310
atc atc ggt gtc ggt tcc atg gat tac cca gca gag ttc cag ggc gct 1432
Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala
315 320 325 330
tcc gaa gac cgc ctt gca gag ctc ggc gtt gga aag ctt gtc acc atc 1480
Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile
335 340 345
acc tcc acc tac gat cac cgc gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa 1528
Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu
350 355 360
ttc ctg cgt acc atg tct cgc ctg ctc acc gat gat tcc ttc tgg gat 1576
Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp
365 370 375
gag atc ttc gac gca atg aac gtt cct tac acc cca atg cgt tgg gca 1624
Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala
380 385 390
cag gac gtt cca aac acc ggt gtt gat aag aac acc cgc gtc atg cag 1672
Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln
395 400 405 410
ctc att gag gca tac cgc tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac 1720
Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn
415 420 425
cca ctt tca tgg gtt cag cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac 1768
Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp
430 435 440
ctc gac atc gag acc cac agc ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc 1816
Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr
445 450 455
ttc agc gtc ggt ggc ttc ggc ggc aag gag acc atg acc ctg cgc gag 1864
Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu
460 465 470
gta ctg tcc cgc ctg cgc gct gcc tac acc ttg aag gtc ggc tcc gaa 1912
Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu
475 480 485 490
tac acc cac atc ctg gac cgc gac gag cgc acc tgg ctg cag gac cgc 1960
Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg
495 500 505
ctc gaa gcc gga atg cca aag cca acc cag gca gag cag aag tac atc 2008
Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile
510 515 520
ctg cag aag ctg aac gcc gca gag gct ttc gag aac ttc ctg cag acc 2056
Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr
525 530 535
aag tac gtc ggc cag aag cgc ttc tcc ctc gaa ggt gca gaa gct ctc 2104
Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu
540 545 550
atc cca ctg atg gac tcc gcc atc gac acc gcc gca ggc cag ggc ctc 2152
Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu
555 560 565 570
gac gaa gtt gtc atc ggt atg cca cac cgt ggt cgc ctc aac gtg ctg 2200
Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu
575 580 585
ttc aac atc gtg ggc aag cca ctg gca tcc atc ttc aac gag ttt gaa 2248
Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu
590 595 600
ggc caa atg gag cag ggc cag atc ggt ggc tcc ggt gac gtg aag tac 2296
Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr
605 610 615
cac ctc ggt tcc gaa ggc cag cac ctg cag atg ttc ggc gac ggc gag 2344
His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu
620 625 630
atc aag gtc tcc ctg act gct aac ccg tcc cac ctg gaa gct gtt aac 2392
Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn
635 640 645 650
cca gtg atg gaa ggt atc gtc cgc gca aag cag gac tac ctg gac aag 2440
Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys
655 660 665
ggc gta gac ggc aag act gtt gtg cca ctg ctg ctc cac ggt gac gct 2488
Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala
670 675 680
gca ttc gca ggc ctg ggc atc gtg cca gaa acc atc aac ctg gct ata 2536
Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Ile
685 690 695
agc tgc gtc gac gtc gga ggc acc atc cac atc gtg gtg aac aac cag 2584
Ser Cys Val Asp Val Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln
700 705 710
atc ggc ttc acc acc acc cca gac tcc agc cgc tcc atg cac tac gca 2632
Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala
715 720 725 730
acc gac tac gcc aag gca ttc ggc tgc cca gtc ttc cac gtc aat ggt 2680
Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly
735 740 745
gat gac cca gag gca gtt gtc tgg gtt ggc cag ctg gca acc gag tac 2728
Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr
750 755 760
cgt cgt cgc ttc ggc aag gac gtc ttc atc gac ctc gtt tgc tac cgc 2776
Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg
765 770 775
ctc cgc ggc cac aac gaa gct gat gat cct tcc atg acc cag cca aag 2824
Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys
780 785 790
atg tat gag ctc atc acc ggc cgc gag acc gtt cgt gct cag tac acc 2872
Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr
795 800 805 810
gaa gac ctg ctc gga cgt gga gac ctc tcc aac gaa gat gca gaa gca 2920
Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala
815 820 825
gtc gtc cgc gac ttc cac gac cag atg gaa tct gtg ttc aac gaa gtc 2968
Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val
830 835 840
aag gaa ggc ggc aag aag cag gct gag gca cag acc ggc atc acc ggc 3016
Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly
845 850 855
tcc cag aag ctt cca cac ggc ctt gag acc aac atc tcc cgt gaa gag 3064
Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu
860 865 870
ctc ctg gaa ctg gga cag gct ttc gcc aac acc cca gaa ggc ttc aac 3112
Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn
875 880 885 890
tac cac cca cgt gtg gct cca gtt gct aag aag cgc gtc tcc tct gtc 3160
Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val
895 900 905
acc gaa ggt ggc atc gac tgg gca tgg ggc gag ctc ctc gcc ttc ggt 3208
Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly
910 915 920
tcc ctg gct aac tcc ggc cgc ttg gtt cgc ctt gca ggt gaa gat tcc 3256
Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser
925 930 935
cgc cgc ggt acc ttc acc cag cgc cac gca gtt gcc atc gac cca gcg 3304
Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala
940 945 950
acc gct gaa gag ttc aac cca ctc cac gag ctt gca cag tcc aag ggc 3352
Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly
955 960 965 970
aac aac ggt aag ttc ctg gtc tac aac tcc gca ctg acc gag tac gca 3400
Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala
975 980 985
ggc atg ggc ttc gag tac ggc tac tcc gta gga aac gaa gac tcc gtc 3448
Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val
990 995 1000
gtt gca tgg gaa gca cag ttc ggc gac ttc gcc aac ggc gct cag 3493
Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln
1005 1010 1015
acc atc atc gat gag tac gtc tcc tca ggc gaa gct aag tgg ggc 3538
Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly
1020 1025 1030
cag acc tcc aag ctg atc ctt ctg ctg cct cac ggc tac gaa ggc 3583
Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly
1035 1040 1045
cag ggc cca gac cac tct tcc gca cgt atc gag cgc ttc ctg cag 3628
Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln
1050 1055 1060
ctg tgc gct gag ggt tcc atg act gtt gct cag cca tcc acc cca 3673
Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro
1065 1070 1075
gca aac cac ttc cac ctg ctg cgt cgt cac gct ctg tcc gac ctg 3718
Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu
1080 1085 1090
aag cgt cca ctg gtt atc ttc acc ccg aag tcc atg ctg cgt aac 3763
Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn
1095 1100 1105
aag gct gct gcc tcc gca cca gaa gac ttc act gag gtc acc aag 3808
Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys
1110 1115 1120
ttc caa tcc gtg atc gac gat cca aac gtt gca gat gca gcc aag 3853
Phe Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys
1125 1130 1135
gtg aag aag gtc atg ctg gtc tcc ggc aag ctg tac tac gaa ttg 3898
Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu
1140 1145 1150
gca aag cgc aag gag aag gac gga cgc gac gac atc gcg atc gtt 3943
Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val
1155 1160 1165
cgt atc gaa atg ctc cac cca att ccg ttc aac cgc atc tcc gag 3988
Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu
1170 1175 1180
gct ctt gcc ggc tac cct aac gct gag gaa gtc ctc ttc gtt cag 4033
Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln
1185 1190 1195
gat gag cca gca aac cag ggc cca tgg ccg ttc tac cag gag cac 4078
Asp Glu Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His
1200 1205 1210
ctc cca gag ctg atc ccg aac atg cca aag atg cgc cgc gtt tcc 4123
Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser
1215 1220 1225
cgc cgc gct cag tcc tcc acc gca act ggt gtt gct aag gtg cac 4168
Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His
1230 1235 1240
cag ctg gag gag aag cag ctt atc gac gag gct ttc gag gct 4210
Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1245 1250 1255
taagtcttta tagtcctgca ctagcctaga gggccttatg cagtgtgaat cacacagcat 4270
aaggcccttt ttgctgccgt ggttgcctaa ggtggaaggc atgaaacgaa tctgtgcggt 4330
cacgatctct tcagtacttt tgctaagtgg ctgctcctcc acttccacca cgcagctcga 4390
g 4391
<210> 52
<211> 1256
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 52
Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln Pro Thr Thr Asn Val Thr
1 5 10 15
Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg
20 25 30
Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp
35 40 45
Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val
50 55 60
Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala
65 70 75 80
Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala
85 90 95
Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val
100 105 110
Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser
115 120 125
Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg
130 135 140
Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile
145 150 155 160
Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu
165 170 175
Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys
180 185 190
Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met
195 200 205
Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro
210 215 220
Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu
225 230 235 240
Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu
245 250 255
Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile
260 265 270
Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly
275 280 285
Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser
290 295 300
Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser
305 310 315 320
Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala
325 330 335
Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His
340 345 350
Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser
355 360 365
Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met
370 375 380
Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr
385 390 395 400
Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg
405 410 415
Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln
420 425 430
Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His
435 440 445
Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe
450 455 460
Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg
465 470 475 480
Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp
485 490 495
Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro
500 505 510
Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala
515 520 525
Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys
530 535 540
Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser
545 550 555 560
Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly
565 570 575
Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys
580 585 590
Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly
595 600 605
Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly
610 615 620
Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr
625 630 635 640
Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile
645 650 655
Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr
660 665 670
Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly
675 680 685
Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Ile Ser Cys Val Asp Val Gly
690 695 700
Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr Thr
705 710 715 720
Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala
725 730 735
Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val
740 745 750
Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys
755 760 765
Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn Glu
770 775 780
Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr
785 790 795 800
Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg
805 810 815
Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe His
820 825 830
Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys
835 840 845
Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro His
850 855 860
Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln
865 870 875 880
Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val Ala
885 890 895
Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp
900 905 910
Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly
915 920 925
Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr
930 935 940
Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn
945 950 955 960
Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu
965 970 975
Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr
980 985 990
Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala Gln
995 1000 1005
Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr
1010 1015 1020
Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile
1025 1030 1035
Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His Ser
1040 1045 1050
Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gly Ser
1055 1060 1065
Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu
1070 1075 1080
Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile
1085 1090 1095
Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala
1100 1105 1110
Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe Gln Ser Val Ile Asp
1115 1120 1125
Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu
1130 1135 1140
Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys
1145 1150 1155
Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val Arg Ile Glu Met Leu His
1160 1165 1170
Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr Pro
1175 1180 1185
Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu Pro Ala Asn Gln
1190 1195 1200
Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu Leu Ile Pro
1205 1210 1215
Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln Ser Ser
1220 1225 1230
Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys Gln
1235 1240 1245
Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala
1250 1255
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 53
gccgggatcc ctgtgtgatt cacactgcat aaggccctct 40
<210> 54
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 54
gccgggatcc ccatcgccgc catccctgat ggtttcaatc 40
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sucA8primer
<400> 55
ctgcgtcgac gtcggaggca ccatccac 28
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sucA801primer
<400> 56
ctgcgtctcg acgtcggagg caccatccac 30
<210> 57
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sucA805primer
<400> 57
gctaaaagct gcgtcgacgt cggaggcacc atccac 36
<210> 58
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sucA77
<400> 58
gctataagct gcgtcgacgt cggaggcacc atccac 36
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> yggB primer-N
<400> 59
ggggatcctg ccgatttcgg caggatcaat gtc 33
<210> 60
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> yggB primer-C
<400> 60
ttccttgctt gcggggatcc catcggggat g 31
<210> 61
<211> 2432
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (507)..(2093)
<400> 61
aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc 60
cacattcacg actttctggc tcctttacta aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc 120
caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga 180
tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca 240
acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga 300
cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc ggttactact acaagtcgaa taatggtcat 360
ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc 420
caaaactccc ccacttcggt taaggaatca ggattctcac aaagttcagg caggctcccg 480
ctacttttca gcgctaatct tggctc atg att tta ggc gta ccc att caa tat 533
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr
1 5
ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta 581
Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val
10 15 20 25
gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg 629
Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu
30 35 40
gcc atg cgt att atc aag cgg cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac 677
Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp
45 50 55
acc act aag aac cag ctc gcg ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg 725
Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala
60 65 70
caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt 773
Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe
75 80 85
ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct 821
Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala
90 95 100 105
gcc att ggc ctt ggt gcg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga 869
Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly
110 115 120
ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgt 917
Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg
125 130 135
ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtc gaa ggc acc gtc att gag atc acc 965
Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr
140 145 150
atg cgc gcg acc aaa att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc 1013
Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile
155 160 165
ccc aac tcc acg gcg aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg 1061
Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser
170 175 180 185
cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc 1109
Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile
190 195 200
aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc 1157
Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly
205 210 215
cag gag aaa atc gca ccg gaa atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca 1205
Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro
220 225 230
gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc 1253
Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val
235 240 245
acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc 1301
Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val
250 255 260 265
gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac 1349
Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr
270 275 280
ggc agc gca acc act aca tcg gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt 1397
Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val
285 290 295
gag cat gaa gag cca aag acc tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct 1445
Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala
300 305 310
ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct 1493
Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala
315 320 325
gca tcg tct aac gac gat gca gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat 1541
Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn
330 335 340 345
gca ggc aat cca gag aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa 1589
Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu
350 355 360
ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc 1637
Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu
365 370 375
cga ggc ttc ttc cgc act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc 1685
Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile
380 385 390
ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt 1733
Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly
395 400 405
gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt 1781
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser
410 415 420 425
gag aat tgg caa aac tcc agt gga tgg ctg tca cca agc act gcc acc 1829
Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr
430 435 440
tca act gcg gtg acc acc tcc gaa act tcc gcg cca gta agc act tct 1877
Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Ser
445 450 455
tcg atg aca gtg ccc act acg gtg gag gag acc cca acg atg gaa tct 1925
Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser
460 465 470
agc gtc gaa acg cag cag gaa acc tca acc cct gca acc gca acg ccc 1973
Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro
475 480 485
cag cga gcc gac acc atc gaa ccg acc gag gaa gcc acg tcg cag gag 2021
Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu
490 495 500 505
gaa acg act gcg tcg cag acg cag tct cca gca acc gcg gtt caa gag 2069
Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln Ser Pro Ala Thr Ala Val Gln Glu
510 515 520
aca gtt gcg ccg acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt 2123
Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro
525
ctttactact attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg 2183
aaaaatttca cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat 2243
tattagtcat cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct 2303
tcggttactg ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact 2363
acgccttcaa gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg 2423
gtgcccgca 2432
<210> 62
<211> 529
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 62
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Ser Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr
515 520 525
Pro
<210> 63
<211> 2432
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (507)..(2093)
<400> 63
aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc 60
cacattcacg actttctggc tcctttacta aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc 120
caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga 180
tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca 240
acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga 300
cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc ggttactact acaagtcgaa taatggtcat 360
ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc 420
caaaactccc ccacttcggt taaggaatca ggattctcac aaagttcagg caggctcccg 480
ctacttttca gcgctaatct tggctc atg att tta ggc gta ccc att caa tat 533
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr
1 5
ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta 581
Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val
10 15 20 25
gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg 629
Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu
30 35 40
gcc atg cgt att atc aag cgg cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac 677
Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp
45 50 55
acc act aag aac cag ctc gcg ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg 725
Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala
60 65 70
caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt 773
Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe
75 80 85
ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct 821
Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala
90 95 100 105
gcc att ggc ctt ggt acg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga 869
Ala Ile Gly Leu Gly Thr Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly
110 115 120
ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgt 917
Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg
125 130 135
ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtc gaa ggc acc gtc att gag atc acc 965
Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr
140 145 150
atg cgc gcg acc aaa att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc 1013
Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile
155 160 165
ccc aac tcc acg gcg aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg 1061
Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser
170 175 180 185
cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc 1109
Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile
190 195 200
aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc 1157
Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly
205 210 215
cag gag aaa atc gca ccg gaa atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca 1205
Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro
220 225 230
gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc 1253
Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val
235 240 245
acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc 1301
Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val
250 255 260 265
gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac 1349
Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr
270 275 280
ggc agc gca acc act aca tcg gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt 1397
Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val
285 290 295
gag cat gaa gag cca aag acc tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct 1445
Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala
300 305 310
ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct 1493
Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala
315 320 325
gca tcg tct aac gac gat gca gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat 1541
Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn
330 335 340 345
gca ggc aat cca gag aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa 1589
Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu
350 355 360
ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc 1637
Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu
365 370 375
cga ggc ttc ttc cgc act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc 1685
Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile
380 385 390
ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt 1733
Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly
395 400 405
gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt 1781
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser
410 415 420 425
gag aat tgg caa aac tcc agt gga tgg ctg tca cca agc act gcc acc 1829
Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr
430 435 440
tca act gcg gtg acc acc tcc gaa act tcc gcg cca gta agc act tct 1877
Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Ser
445 450 455
tcg atg aca gtg ccc act acg gtg gag gag acc cca acg atg gaa tct 1925
Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser
460 465 470
agc gtc gaa acg cag cag gaa acc tca acc cct gca acc gca acg ccc 1973
Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro
475 480 485
cag cga gcc gac acc atc gaa ccg acc gag gaa gcc acg tcg cag gag 2021
Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu
490 495 500 505
gaa acg act gcg tcg cag acg cag tct cca gca acc gcg gtt caa gag 2069
Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln Ser Pro Ala Thr Ala Val Gln Glu
510 515 520
aca gtt gcg ccg acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt 2123
Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro
525
ctttactact attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg 2183
aaaaatttca cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat 2243
tattagtcat cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct 2303
tcggttactg ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact 2363
acgccttcaa gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg 2423
gtgcccgca 2432
<210> 64
<211> 529
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 64
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Thr Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Ser Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr
515 520 525
Pro
<210> 65
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 5'-primer for 8-type mutation
<400> 65
tggccttggt acgcagtcga ttgttgcgg 29
<210> 66
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 3'-primer for 8-type mutation
<400> 66
ccgcaacaat cgactgcgta ccaaggcca 29
<210> 67
<211> 2131
<212> DNA
<213> Corynebacterium melassecola
<220>
<221> CDS
<222> (403)..(2001)
<400> 67
caggacccgt ccaagccaag ccgatttcaa ctcagcctaa agacaaagcc ctcatttaaa 60
attgttccga cgcggatgcg tgtgcacgca gtgcgacaga tgtctgttgc aaagttggct 120
acttgggtca taaccaacaa gaaagccctc gttccaacac tgtggtgagt gttgtcgagg 180
gcgcttgacg agacgacttg gaaggccgtt acggcaggcg ccgcgcggtt actactacaa 240
gtcgaataat ggtcatgatg tgtcatgcta cacacatcga gtttccaatt ccacaacgca 300
cgaaaattcc cacccccaaa actcccccac ttcggttaag gaatcaggat tctcacaaag 360
ttcaggcagg ctcccgctac ttttcagcgc taatcttggc tc atg att tta ggc 414
Met Ile Leu Gly
1
gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg att gtc gat 462
Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp
5 10 15 20
acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt ttg att cca 510
Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro
25 30 35
cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cgc cga gtg gag tct 558
Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg Arg Val Glu Ser
40 45 50
gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc gct ggc gtt 606
Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val
55 60 65
ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt gcc gtc tcc 654
Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser
70 75 80
gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg att ccg gca 702
Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala
85 90 95 100
acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag tcg att gtt gcg 750
Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala
105 110 115
gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa ttc ggc gtg 798
Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val
120 125 130
ggt gac tgg gtg cgt ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt gaa ggc acc 846
Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val Glu Gly Thr
135 140 145
gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg att gca caa 894
Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln
150 155 160
gag acc gtg atc atc ccc aac tcc acg gcg aaa gtg tgc atc aac aat 942
Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn
165 170 175 180
tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc ccc atg ttg 990
Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu
185 190 195
ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa gct gcg act 1038
Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr
200 205 210
cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc ctc ggt gaa 1086
Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu
215 220 225
ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg gtg gtc ggc 1134
Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr Val Val Gly
230 235 240
atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc acc gcc ggc 1182
Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val Thr Ala Gly
245 250 255 260
aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc atc aac gaa 1230
Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile Ile Asn Glu
265 270 275
ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga acc ctc att 1278
Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile
280 285 290
gat tcc tta cac gtt gcg cat gaa gag cca aag acc tcg ctt atc gac 1326
Asp Ser Leu His Val Ala His Glu Glu Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp
295 300 305
gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct gcg gcg acg 1374
Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr
310 315 320
gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac aat gca gac 1422
Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp
325 330 335 340
gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt gat tcc gat 1470
Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp
345 350 355
gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa aca gca aaa 1518
Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys
360 365 370
cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac tac cca aat 1566
Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn
375 380 385
cgg tgg cag aag atc ctg tcg atc ggc gga cgt gtc cgc atg agc acg 1614
Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val Arg Met Ser Thr
390 395 400
tcc ctg ctg ttg ggt gcg ctc cta ttg ctg tca ctg ttt aag gtc atg 1662
Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe Lys Val Met
405 410 415 420
act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac tcc agt gga tgg ctg tca 1710
Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser
425 430 435
cca ggc act gcc acc tca act gcg gcg acc acc tcc gaa act tcc gcg 1758
Pro Gly Thr Ala Thr Ser Thr Ala Ala Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala
440 445 450
cca gta agc acg cct tcg atg aca gtg ccc act acg gtg gag gag acc 1806
Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr
455 460 465
cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag cag gaa acc tca acc cct 1854
Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro
470 475 480
gca acc gca acg ccg cag cga gcc gac acc atc gaa ccg acc gag gaa 1902
Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu
485 490 495 500
gcc acg tcg cag gag gaa acg act gcg tcg cag acg cag tct cca gca 1950
Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln Ser Pro Ala
505 510 515
gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gag aca gtt gcg ccg acg tcc acc 1998
Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr
520 525 530
cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt ctttactact attggaaatt 2051
Pro
atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg aaaaatttca cccagaacgc 2111
acccatattt tgggcgccgt 2131
<210> 68
<211> 533
<212> PRT
<213> Corynebacterium melassecola
<400> 68
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Ala His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Gly Thr Ala Thr Ser Thr Ala Ala Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515 520 525
Pro Thr Ser Thr Pro
530
<210> 69
<211> 2131
<212> DNA
<213> Corynebacterium melassecola
<220>
<221> CDS
<222> (403)..(2001)
<400> 69
caggacccgt ccaagccaag ccgatttcaa ctcagcctaa agacaaagcc ctcatttaaa 60
attgttccga cgcggatgcg tgtgcacgca gtgcgacaga tgtctgttgc aaagttggct 120
acttgggtca taaccaacaa gaaagccctc gttccaacac tgtggtgagt gttgtcgagg 180
gcgcttgacg agacgacttg gaaggccgtt acggcaggcg ccgcgcggtt actactacaa 240
gtcgaataat ggtcatgatg tgtcatgcta cacacatcga gtttccaatt ccacaacgca 300
cgaaaattcc cacccccaaa actcccccac ttcggttaag gaatcaggat tctcacaaag 360
ttcaggcagg ctcccgctac ttttcagcgc taatcttggc tc atg att tta ggc 414
Met Ile Leu Gly
1
gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg att gtc gat 462
Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp
5 10 15 20
acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt ttg att cca 510
Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro
25 30 35
cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cgc cga gtg gag tct 558
Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg Arg Val Glu Ser
40 45 50
gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc gct ggc gtt 606
Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val
55 60 65
ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt gcc gtc tcc 654
Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser
70 75 80
gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg att ccg gca 702
Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala
85 90 95 100
acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag tcg att gtt gcg 750
Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala
105 110 115
gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa ttc ggc gtg 798
Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val
120 125 130
ggt gac tgg gtg cgt ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt gaa ggc acc 846
Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val Glu Gly Thr
135 140 145
gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg att gca caa 894
Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln
150 155 160
gag acc gtg atc atc ccc aac tcc acg gcg aaa gtg tgc atc aac aat 942
Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn
165 170 175 180
tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc ccc atg ttg 990
Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu
185 190 195
ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa gct gcg act 1038
Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr
200 205 210
cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc ctc ggt gaa 1086
Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu
215 220 225
ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg gtg gtc ggc 1134
Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr Val Val Gly
230 235 240
atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc acc gcc ggc 1182
Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val Thr Ala Gly
245 250 255 260
aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc atc aac gaa 1230
Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile Ile Asn Glu
265 270 275
ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga acc ctc att 1278
Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile
280 285 290
gat tcc tta cac gtt gcg cat gaa gag cca aag acc tcg ctt atc gac 1326
Asp Ser Leu His Val Ala His Glu Glu Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp
295 300 305
gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct gcg gcg acg 1374
Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr
310 315 320
gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac aat gca gac 1422
Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp
325 330 335 340
gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt gat tcc gat 1470
Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp
345 350 355
gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa aca gca aaa 1518
Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys
360 365 370
cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac tac cca aat 1566
Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn
375 380 385
cgg tgg cag aag atc ctg tcg atc ggc gga cgt gtc cgc atg agc acg 1614
Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val Arg Met Ser Thr
390 395 400
tcc ctg ctg ttg ggt gcg ctc cta ttg ctg tca ctg ttt aag gtc atg 1662
Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe Lys Val Met
405 410 415 420
act gtg gaa cta agt gag aat tgg caa aac tcc agt gga tgg ctg tca 1710
Thr Val Glu Leu Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser
425 430 435
cca ggc act gcc acc tca act gcg gcg acc acc tcc gaa act tcc gcg 1758
Pro Gly Thr Ala Thr Ser Thr Ala Ala Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala
440 445 450
cca gta agc acg cct tcg atg aca gtg ccc act acg gtg gag gag acc 1806
Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr
455 460 465
cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag cag gaa acc tca acc cct 1854
Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro
470 475 480
gca acc gca acg ccg cag cga gcc gac acc atc gaa ccg acc gag gaa 1902
Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu
485 490 495 500
gcc acg tcg cag gag gaa acg act gcg tcg cag acg cag tct cca gca 1950
Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln Ser Pro Ala
505 510 515
gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gag aca gtt gcg ccg acg tcc acc 1998
Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr
520 525 530
cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt ctttactact attggaaatt 2051
Pro
atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg aaaaatttca cccagaacgc 2111
acccatattt tgggcgccgt 2131
<210> 70
<211> 533
<212> PRT
<213> Corynebacterium melassecola
<400> 70
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Ala His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Leu Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Gly Thr Ala Thr Ser Thr Ala Ala Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515 520 525
Pro Thr Ser Thr Pro
530
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 5'-primer for 66-type mutation
<400> 71
gactgtggaa ctaagtgaga 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 3'-primer for 66-type mutation
<400> 72
tctcacttag ttccacagtc 20
<210> 73
<211> 2592
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (548)..(2146)
<400> 73
tcgagcgatc gaacaattgc ctgtgcacct gtcatccgct caggggcggc ggatcgacca 60
cggcttgcaa ccgtggcggg agtgggctgt tgagaagctg ccacattcac gactttctgg 120
ctcctttact aaataaggat tttcacagga cccgtccaag ccaagccgat ttcaactcag 180
cctaaagaca aagccctcat ttaaaattgt tccgacgcgg atgcgtgtgc acgcagtgcg 240
acagatgtct gttgcaaagt tggctacttg ggtcataacc aacaagaaag ccctcgttcc 300
aacactgtgg tgagtgttgt cgagggcgct tgacgagacg acttggaagg ccgttacggc 360
aggcgccgcg cggttactac tacaagtcga ataatggtca tggtgtgtca tgctacacac 420
atcgagtttc caattccaca acgcacgaaa attcccaccc ccaaaactcc cccacttcgg 480
ttaaggaatc aggattctca caaagttcag gcaggctccc gctacttttc agcgctaatc 540
ttggctc atg att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg 589
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu
1 5 10
tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc 637
Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val
15 20 25 30
ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc 685
Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile
35 40 45
aag cag cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag 733
Lys Gln Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln
50 55 60
ctc gcg ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt 781
Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe
65 70 75
ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg 829
Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala
80 85 90
ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt 877
Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly
95 100 105 110
gcg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg 925
Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr
115 120 125
gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc 973
Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly
130 135 140
atc gtt gtt gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa 1021
Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys
145 150 155
att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg 1069
Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala
160 165 170
aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt 1117
Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val
175 180 185 190
att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg 1165
Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala
195 200 205
cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca 1213
Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala
210 215 220
ccg gaa atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca 1261
Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr
225 230 235
ccg cca acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc 1309
Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu
240 245 250
gtg caa gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc 1357
Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg
255 260 265 270
aca gaa atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act 1405
Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr
275 280 285
aca tcg gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca 1453
Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro
290 295 300
aag acc tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag 1501
Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys
305 310 315
ccg gag gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac 1549
Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp
320 325 330
gat gca gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag 1597
Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu
335 340 345 350
aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa 1645
Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu
355 360 365
ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc 1693
Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg
370 375 380
act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga 1741
Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly
385 390 395
cgt gtc cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg 1789
Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu
400 405 410
tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac 1837
Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn
415 420 425 430
tcc agt gga tgg ctg tca tca agc act gcc acc tca act gcg gtg acc 1885
Ser Ser Gly Trp Leu Ser Ser Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr
435 440 445
acc tcc gaa act tcc gcg cca gca agc acg cct tcg atg aca gtg ccc 1933
Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro
450 455 460
act acg gtg gag gag acc cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag 1981
Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln
465 470 475
cag gaa acc tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga gcc gac acc 2029
Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr
480 485 490
atc gaa ccg acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg act gca tcg 2077
Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser
495 500 505 510
cag acg cag tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gaa aca 2125
Gln Thr Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr
515 520 525
gtt gcg ccg acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtctcattt 2176
Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro
530
ctttactact attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg 2236
aaaaatttca cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat 2296
tattagtcat cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct 2356
tcggttactg ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact 2416
acgccttcaa gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg 2476
gtgcccgcac tttcgctcgc accacctccg atgcagaagt caccctcccc ggcgtcacct 2536
tcaactccct tccccgcctt gaagctgctt cccacggccg catccccgat gcgatc 2592
<210> 74
<211> 533
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 74
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Ser Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515 520 525
Pro Thr Ser Thr Pro
530
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 5'-primer
<400> 75
caattcggcg tgggtgactg gg 22
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 3'-primer
<400> 76
gtgcggatgg cgcgttcgac cagcc 25
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 5'-primer for N-terminal fragment of odhA gene
<400> 77
ccaggcactc gtcctcggtt 20
<210> 78
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 3'-primer for N-terminal fragment of odhA gene
<400> 78
aggctagtgc aggactataa agaccagttc tcctaaaaat aacgtgtc 48
<210> 79
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 5'-primer for C-terminal fragment of odhA gene
<400> 79
gacacgttat ttttaggaga actggtcttt atagtcctgc actagcct 48
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> C'-primer for C-terminal fragment of odhA gene
<400> 80
tccatcgtgg ccaccgatcc 20
<210> 81
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 5'-primer for odhA disruption
<400> 81
cgggatcccc accggcgtac tcgtg 25
<210> 82
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 3'-primer for odhA disruption
<400> 82
ccacggatcc ttccaatgct attggttg 28
<210> 83
<211> 2102
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (501)..(2099)
<400> 83
ggcggatcga ccacggcttg caaccgtggc gggagtgggc tgttgagaag ctgccacatt 60
cacgactttc tggctccttt actaaataag gattttcaca ggacccgtcc aagccaagcc 120
gatttcaact cagcctaaag acaaagccct catttaaaat tgttccgacg cggatgcgtg 180
tgcacgcagt gcgacagatg tctgttgcaa agttggctac ttgggtcata accaacaaga 240
aagccctcgt tccaacactg tggtgagtgt tgtcgagggc gcttgacgag acgacttgga 300
aggccgttac ggcaggcgcc gcgcggttac tactacaagt cgaataatgg tcatggtgtg 360
tcatgctaca cacatcgagt ttccaattcc acaacgcacg aaaattccca cccccaaaac 420
tcccccactt cggttaagga atcaggattc tcacaaagtt caggcaggct cccgctactt 480
ttcagcgcta atcttggctc atg att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc 533
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu
1 5 10
tat tca ttg tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att 581
Tyr Ser Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile
15 20 25
atc ctg gtc ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg 629
Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met
30 35 40
cgt att atc aag cgc cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act 677
Arg Ile Ile Lys Arg Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr
45 50 55
aag aac cag ctc gcg ttc gcc ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att 725
Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile
60 65 70 75
gtg gcg ttt ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc 773
Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe
80 85 90
tct ctc gcg ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att 821
Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile
95 100 105
ggc ctt ggt gcg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc 869
Gly Leu Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe
110 115 120
atc ctg acg gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgt ttt gag 917
Ile Leu Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu
125 130 135
ggc aac ggc atc gtt gtc gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc 965
Gly Asn Gly Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg
140 145 150 155
gcg acc aaa att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc ccc aac 1013
Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn
160 165 170
tcc acg gcg aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg 1061
Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala
175 180 185
gtt gtc gtt att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat 1109
Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp
190 195 200
gtc atc gcg cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag 1157
Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu
205 210 215
aaa atc gca ccg gaa atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg 1205
Lys Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr
220 225 230 235
gaa gtc acg ccg cca acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg 1253
Glu Val Thr Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met
240 245 250
cgt ttc ctc gtg caa gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc 1301
Arg Phe Leu Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg
255 260 265
gcc atc cgc aca gaa atc atc agc gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc 1349
Ala Ile Arg Thr Glu Ile Ile Ser Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser
270 275 280
gca acc act aca tcg gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat 1397
Ala Thr Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His
285 290 295
gaa gag cca aag acc tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag 1445
Glu Glu Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys
300 305 310 315
gaa ccg aag ccg gag gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcc 1493
Glu Pro Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser
320 325 330
tct aac gac gat gca gac aat gca gac gcc tcg gtg atc aat gca ggc 1541
Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Val Ile Asn Ala Gly
335 340 345
aat cca gag aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc 1589
Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser
350 355 360
agc gaa gaa ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc 1637
Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly
365 370 375
ttc ttc cgc act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg 1685
Phe Phe Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser
380 385 390 395
ttt ggc gga cgt gtc cgc atg agc acg tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg 1733
Phe Gly Gly Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu
400 405 410
ctc ttg ctg tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat 1781
Leu Leu Leu Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn
415 420 425
tgg caa aac tcc agt gga tgg ctg tca cca agc act gcc acc tca act 1829
Trp Gln Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr
430 435 440
gcg gtg acc acc tcc gaa act tcc gcg cca gta agc acg cct tcg atg 1877
Ala Val Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Pro Ser Met
445 450 455
aca gtg ccc act acg gtg gag gag acc cca acg atg gaa tct aac gtc 1925
Thr Val Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Asn Val
460 465 470 475
gaa acg cag cag gaa acc tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga 1973
Glu Thr Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg
480 485 490
gcc gac acc atc gaa ccg acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg 2021
Ala Asp Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr
495 500 505
act gcg tcg cag acg cag tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc 2069
Thr Ala Ser Gln Thr Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val
510 515 520
caa gag aca gtt gcg ccg acg tcc acc cct tag 2102
Gln Glu Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro
525 530
<210> 84
<211> 533
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 84
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Ser Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Val Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Asn Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515 520 525
Pro Thr Ser Thr Pro
530
<210> 85
<211> 533
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48), (275), (298), (343), (396), (438), (445), (454), (457), (474), (517)..(520)
<223> Xaa = any amino acid
<400> 85
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Xaa
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Xaa Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Xaa His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Xaa Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Xaa Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Xaa Thr Ala Thr Ser Thr Ala Xaa Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Xaa Ser Thr Xaa Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Xaa Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515 520 525
Pro Thr Ser Thr Pro
530
<210> 86
<211> 1550
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (585)..(1121)
<400> 86
gcattgatgt tgaggtccac gacaatgcag atgcttacat ccgcaatggt ggcgaaactg 60
tcggcatgct ggtttctgaa ggtgcagaga agattgccag cggcagcggc gctgtcatcc 120
cggacgcatc cgcagagttt tccgcacgcg tgttgtctgc cgagtaccgc accaacactc 180
ttaccggcca gcgttttatc cacgcaacag ttgatggcct cttcgctttt gatgtgtgcc 240
ttcctgatgc accagaacta cctgcccgtg acagcgtgtt gtctggcaaa gtcatgctga 300
ctgctgccgt tatccccact gaggtcaccg gctgcggtgg ctccggtggc ggctgtggct 360
caggtagctg tggctgcggc ggacactaaa attctgcaca attttttaag aggaccccag 420
ctccggggtc cttttccatt ttttacccag tacttgaaac gtgatatatg tctattctga 480
aaatcatcgc atagaatact ggtgcaatcg tttacgttcg ctattaatgt gacacgtata 540
agccgacact tttaacgaag cgcagaagga gtgagagcaa gaaa atg gga gaa caa 596
Met Gly Glu Gln
1
ctt ccg ttt gct aat ggt tca cgc tcc aac aaa ctg ccg ctc atc gtc 644
Leu Pro Phe Ala Asn Gly Ser Arg Ser Asn Lys Leu Pro Leu Ile Val
5 10 15 20
atc ggt ttg tgc tgc ata atg ctg atc ctg tgg ctt aaa ctt ccc ggc 692
Ile Gly Leu Cys Cys Ile Met Leu Ile Leu Trp Leu Lys Leu Pro Gly
25 30 35
gta ctg ctt gcc acc atc att ggg gtt gcc acg gtg agt gtg atg cgg 740
Val Leu Leu Ala Thr Ile Ile Gly Val Ala Thr Val Ser Val Met Arg
40 45 50
atg cgc acc tcc acc cca gaa act gcc tcg ctg gtt act tct att cgg 788
Met Arg Thr Ser Thr Pro Glu Thr Ala Ser Leu Val Thr Ser Ile Arg
55 60 65
ctg tct gcg gaa gat att tcc gat gtg caa cat gag tgg cag cag ttt 836
Leu Ser Ala Glu Asp Ile Ser Asp Val Gln His Glu Trp Gln Gln Phe
70 75 80
ttg acc tcc ccc gag gcc gat gcg ctg gct gat cgc acg ctt gtc cgt 884
Leu Thr Ser Pro Glu Ala Asp Ala Leu Ala Asp Arg Thr Leu Val Arg
85 90 95 100
ccc gca ctg gcg gat cca gat tgt ggc gat aag gct atc gag aaa ttt 932
Pro Ala Leu Ala Asp Pro Asp Cys Gly Asp Lys Ala Ile Glu Lys Phe
105 110 115
cat tat gaa atc agc aat gcc aat cgc ttc ttg ggc agg ttg gac gct 980
His Tyr Glu Ile Ser Asn Ala Asn Arg Phe Leu Gly Arg Leu Asp Ala
120 125 130
cgt ctg caa caa aac ctc gtg gtc agt gag cta gaa aca ctt ctc aaa 1028
Arg Leu Gln Gln Asn Leu Val Val Ser Glu Leu Glu Thr Leu Leu Lys
135 140 145
gta acg gac gag cgc gca cta gag ctg cgg gaa acg tgg ctg gat gcg 1076
Val Thr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Leu Arg Glu Thr Trp Leu Asp Ala
150 155 160
cgt aaa gcg gcc cag aaa ctt ggg ccg aac tac aat cgc gaa tct 1121
Arg Lys Ala Ala Gln Lys Leu Gly Pro Asn Tyr Asn Arg Glu Ser
165 170 175
tagatctgca cctcaccgag tgcgatgatg gcgcttgggc cggtgagtgt ggagccgtcg 1181
tcaaatatct ggacttctac ttccccacct ggaacgcaca ctttaactgt gccttctccc 1241
aatccagcat cagctaaagc agcacacgct gcagcaacgg ttcccgtgcc acaggagcgg 1301
gtttcgccca ctccgcgttc ccacacgcgc atcgatactg cgtcatcttc taattctgtg 1361
acgatttcta cgttcacacc gtgggggaag aattcctgat caaacgtggg tgcgcgcagt 1421
tccatatcgg caagagccga cgcacttaag cccggcacaa cgcacgctag gtgtgggtta 1481
cccatatcaa cgccaaggcc agcgaatact tggccgttga tgtcgcaggt ggataatccc 1541
gtgacgtca 1550
<210> 87
<211> 179
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 87
Met Gly Glu Gln Leu Pro Phe Ala Asn Gly Ser Arg Ser Asn Lys Leu
1 5 10 15
Pro Leu Ile Val Ile Gly Leu Cys Cys Ile Met Leu Ile Leu Trp Leu
20 25 30
Lys Leu Pro Gly Val Leu Leu Ala Thr Ile Ile Gly Val Ala Thr Val
35 40 45
Ser Val Met Arg Met Arg Thr Ser Thr Pro Glu Thr Ala Ser Leu Val
50 55 60
Thr Ser Ile Arg Leu Ser Ala Glu Asp Ile Ser Asp Val Gln His Glu
65 70 75 80
Trp Gln Gln Phe Leu Thr Ser Pro Glu Ala Asp Ala Leu Ala Asp Arg
85 90 95
Thr Leu Val Arg Pro Ala Leu Ala Asp Pro Asp Cys Gly Asp Lys Ala
100 105 110
Ile Glu Lys Phe His Tyr Glu Ile Ser Asn Ala Asn Arg Phe Leu Gly
115 120 125
Arg Leu Asp Ala Arg Leu Gln Gln Asn Leu Val Val Ser Glu Leu Glu
130 135 140
Thr Leu Leu Lys Val Thr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Leu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Trp Leu Asp Ala Arg Lys Ala Ala Gln Lys Leu Gly Pro Asn Tyr Asn
165 170 175
Arg Glu Ser
<210> 88
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 5'-primer
<400> 88
ggagatctgc attgatgttg aggtccac 28
<210> 89
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 3'-primer
<400> 89
cggtgaggtg cagatctatt ctcccatttt cttgctctc 39
<210> 90
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 5'-primer
<400> 90
gagagcaaga aaatgggaga atagatctgc acctcaccg 39
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 3'-primer
<400> 91
ggagatcttg acgtcacggg attatcca 28
Claims (14)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- a) 30㎍/l 이상의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 축적할 수 없으며 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자에 결함이 있는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)으로부터 선택된 코리네형 세균을 30㎍/l 이상의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하는 단계,b) 상기 배지에서 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계, 및c) 선별된 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 yggB 유전자에 돌연변이가 도입된 균주를 수득하는 단계를 포함하여, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)으로부터 선택된 코리네형 세균을 스크리닝하는 방법.
- a) 30㎍/l 이상의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 축적할 수 없으며 시험관내에서 무작위로 돌연변이가 도입된 yggB 유전자를 갖는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)으로부터 선택된 코리네형 세균을 30㎍/l 이상의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하는 단계,b) 상기 배지에서 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계, 및c) 선별된 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 yggB 유전자에 돌연변이가 도입된 균주를 수득하는 단계를 포함하여, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)으로부터 선택된 코리네형 세균을 스크리닝하는 방법.
- a) 30㎍/l 이상의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 축적할 수 없으며 염색체상에 무작위로 도입된 전위요소(transposable element)를 갖는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)으로부터 선택된 코리네형 세균을 30㎍/l 이상의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하는 단계,b) 상기 배지에서 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계, 및c) 선별된 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 yggB 유전자에 돌연변이가 도입된 균주를 수득하는 단계를 포함하여, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)으로부터 선택된 코리네형 세균을 스크리닝하는 방법.
- a) 30㎍/l 이상의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 축적할 수 없는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)으로부터 선택된 코리네형 세균을 γ-메틸 L-글루타메이트, α-메틸 글루탐산, β-하이드록시글루탐산, 메티오닌설폭시민, 글루탐산-γ-모노하이드록사메이트, 2-아미노-4-포스포노부티르산, γ-모노에틸 L-글루타메이트, 디메틸 L-글루타메이트, 디-t-부틸 L-글루타메이트, 모노플루오로글루탐산, 디에틸 L-글루타메이트 및 4-플루오로글루탐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 L-글루탐산 유사체를 함유하는 배지에 접종하는 단계,b) 상기 L-글루탐산 유사체를 함유하는 상기 배지에서 성장하며, 30㎍/l 이상의 비오틴을 함유하는 배지에서 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계, 및c) 선별된 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 yggB 유전자에 돌연변이가 도입된 균주를 수득하는 단계를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)으로부터 선택된 코리네형 세균을 스크리닝하는 방법.
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004378604 | 2004-12-28 | ||
JPJP-P-2004-378604 | 2004-12-28 | ||
JPJP-P-2004-378615 | 2004-12-28 | ||
JP2004378615 | 2004-12-28 | ||
JP2005262087 | 2005-09-09 | ||
JPJP-P-2005-262087 | 2005-09-09 | ||
PCT/JP2005/024280 WO2006070944A2 (en) | 2004-12-28 | 2005-12-28 | L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing l-glutamic acid |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020077017511A Division KR100948246B1 (ko) | 2004-12-28 | 2005-12-28 | L-글루탐산 생산 미생물 및 l-글루탐산의 제조방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20100017581A KR20100017581A (ko) | 2010-02-16 |
KR101233739B1 true KR101233739B1 (ko) | 2013-02-18 |
Family
ID=36590855
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020097025199A KR101233739B1 (ko) | 2004-12-28 | 2005-12-28 | L-글루탐산 생산 미생물 및 l-글루탐산의 제조방법 |
KR1020077017511A KR100948246B1 (ko) | 2004-12-28 | 2005-12-28 | L-글루탐산 생산 미생물 및 l-글루탐산의 제조방법 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020077017511A KR100948246B1 (ko) | 2004-12-28 | 2005-12-28 | L-글루탐산 생산 미생물 및 l-글루탐산의 제조방법 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP2949660A1 (ko) |
JP (1) | JP2012165765A (ko) |
KR (2) | KR101233739B1 (ko) |
CN (2) | CN103468758B (ko) |
AU (1) | AU2005320486B2 (ko) |
BR (3) | BR122020021800B1 (ko) |
MY (1) | MY170930A (ko) |
PE (1) | PE20060952A1 (ko) |
WO (1) | WO2006070944A2 (ko) |
Families Citing this family (46)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸または核酸の製造方法 |
JP2010130899A (ja) | 2007-03-14 | 2010-06-17 | Ajinomoto Co Inc | L−グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | L-アミノ酸の製造法 |
WO2009103547A1 (en) | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Basf Se | Process for the production of gamma-aminobutyric acid |
WO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 味の素株式会社 | L-アミノ酸の製造法 |
KR101348461B1 (ko) | 2010-12-08 | 2014-01-08 | 씨제이제일제당 (주) | 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법 |
KR101372635B1 (ko) * | 2010-12-08 | 2014-03-13 | 씨제이제일제당 (주) | 오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 오르니틴을 생산하는 방법 |
KR101433599B1 (ko) | 2011-11-10 | 2014-08-27 | 씨제이제일제당(주) | L-글루탐산을 함유하는 조미료 및 그 제조 방법 |
WO2013069634A1 (ja) | 2011-11-11 | 2013-05-16 | 味の素株式会社 | 発酵法による目的物質の製造法 |
CN102703537B (zh) * | 2012-06-26 | 2013-08-07 | 呼伦贝尔东北阜丰生物科技有限公司 | 一种新的谷氨酸生产方法 |
KR101773755B1 (ko) | 2013-05-13 | 2017-09-01 | 아지노모토 가부시키가이샤 | L-아미노산의 제조법 |
JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
JP2015029474A (ja) * | 2013-08-02 | 2015-02-16 | 学校法人東京電機大学 | プリン系物質の製造法 |
JP2016192903A (ja) | 2013-09-17 | 2016-11-17 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのl−アミノ酸の製造方法 |
WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
BR112016008830B1 (pt) | 2013-10-23 | 2023-02-23 | Ajinomoto Co., Inc | Método para produzir uma substância alvo |
CN105441473A (zh) * | 2014-08-18 | 2016-03-30 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 一种谷氨酸生产菌株及其制备方法 |
JP6623690B2 (ja) | 2015-10-30 | 2019-12-25 | 味の素株式会社 | グルタミン酸系l−アミノ酸の製造法 |
CN105695383B (zh) * | 2016-03-02 | 2020-06-19 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 重组菌株及其应用 |
DE102016007810B4 (de) * | 2016-06-25 | 2023-12-07 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Herstellung von D-Xylonat |
US10428359B2 (en) | 2016-10-03 | 2019-10-01 | Ajinomoto Co, Inc. | Method for producing L-amino acid |
CN108250278B (zh) * | 2016-12-29 | 2021-06-22 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 生产l-谷氨酸的菌株和生产l-谷氨酸的方法 |
JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | L-アミノ酸の製造法 |
KR102008673B1 (ko) * | 2017-12-07 | 2019-08-09 | 대상 주식회사 | 락토바실러스 퍼멘텀 c-7a 균주 및 이의 용도 |
WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
KR102075160B1 (ko) * | 2018-12-13 | 2020-02-10 | 대상 주식회사 | L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법 |
CN110904169B (zh) * | 2019-12-19 | 2022-07-15 | 呼伦贝尔东北阜丰生物科技有限公司 | 氨基酸的高效绿色制造工艺 |
CN110885866B (zh) * | 2019-12-21 | 2022-07-15 | 呼伦贝尔东北阜丰生物科技有限公司 | 新型谷氨酸发酵与味精生产方法 |
KR102269639B1 (ko) * | 2020-02-12 | 2021-06-25 | 대상 주식회사 | L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법 |
CN113444655B (zh) * | 2020-03-26 | 2023-05-16 | 吉林中粮生化有限公司 | 谷氨酸棒状杆菌、高谷氨酸产量的温度敏感型菌株及其获得方法、应用以及谷氨酸发酵方法 |
CN112063571B (zh) * | 2020-08-14 | 2022-05-06 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 高产l-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用 |
MX2023002783A (es) * | 2020-09-09 | 2023-03-15 | Cj Cheiljedang Corp | Un microorganismo recombinante para producir acido l-glutamico y un metodo para producir acido l-glutamico utilizando el mismo. |
JPWO2022092018A1 (ko) | 2020-10-28 | 2022-05-05 | ||
KR102254635B1 (ko) * | 2021-01-27 | 2021-05-21 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 |
EP4060035A4 (en) * | 2021-01-27 | 2023-01-25 | CJ CheilJedang Corporation | NEW VARIANT OF RIBONUCLEASE P, AND METHOD FOR PRODUCING L-GLUTAMIC ACID USING THE SAME |
KR102277403B1 (ko) * | 2021-01-27 | 2021-07-14 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 리보뉴클레아제 p 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 |
KR102277404B1 (ko) * | 2021-01-27 | 2021-07-14 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 갈락토사이드 o-아세틸트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 |
KR102266233B1 (ko) * | 2021-01-27 | 2021-06-17 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 abc 트랜스포터 atp-결합 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 |
KR102257842B1 (ko) * | 2021-01-27 | 2021-05-28 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 d-알라닌-d-알라닌 리가아제 a 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 |
WO2023013655A1 (ja) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | 味の素株式会社 | 食品の風味を改善する方法 |
CN114480357B (zh) * | 2022-01-25 | 2023-04-07 | 江南大学 | 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸生产中的应用 |
KR20240094161A (ko) * | 2022-12-13 | 2024-06-25 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 망간 의존성 전사 조절자 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 |
KR20240104321A (ko) * | 2022-12-27 | 2024-07-05 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 텔루륨 저항성 막단백질 운송자 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 |
Family Cites Families (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3002889A (en) * | 1960-06-20 | 1961-10-03 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method of producing l-glutamic acid |
JPS50113209A (ko) | 1974-02-13 | 1975-09-05 | ||
JPS5238088A (en) | 1975-09-19 | 1977-03-24 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-glutamic acid |
JPS55124492A (en) | 1979-03-16 | 1980-09-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Production of l-glutamic acid through fermentation process |
JPS561889A (en) | 1979-06-20 | 1981-01-10 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-glutamic acid by fermentation |
JPS5832596B2 (ja) | 1979-08-10 | 1983-07-14 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−グルタミン酸の製造方法 |
JPS5810075B2 (ja) | 1979-08-31 | 1983-02-24 | 味の素株式会社 | 新規変異株 |
JPS56140895A (en) | 1980-04-02 | 1981-11-04 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-glutamic acid by fermentation |
JPS5765198A (en) | 1980-10-09 | 1982-04-20 | Ajinomoto Co Inc | Fermentative production of l-glutamic acid |
JPS57134500A (en) | 1981-02-12 | 1982-08-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Plasmid pcg1 |
JPS572689A (en) | 1981-03-23 | 1982-01-08 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-glutamic acid |
JPS5835197A (ja) | 1981-08-26 | 1983-03-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | プラスミドpcg2 |
JPS5867699A (ja) | 1981-10-16 | 1983-04-22 | Ajinomoto Co Inc | プラスミド |
JPS5877895A (ja) | 1981-11-02 | 1983-05-11 | Ajinomoto Co Inc | プラスミドphm1519 |
JPS58158192A (ja) | 1982-03-15 | 1983-09-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−グルタミン酸の製造方法 |
JPS58192900A (ja) | 1982-05-04 | 1983-11-10 | Ajinomoto Co Inc | 複合プラスミド |
FR2627508B1 (fr) | 1988-02-22 | 1990-10-05 | Eurolysine | Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede |
JP2678995B2 (ja) | 1988-09-08 | 1997-11-19 | 三菱化学株式会社 | トリプトフアンシンターゼの製造法 |
US5185262A (en) | 1988-07-27 | 1993-02-09 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | DNA fragment containing gene which encodes the function of stabilizing plasmid in host microorganism |
JPH02207791A (ja) | 1989-02-07 | 1990-08-17 | Ajinomoto Co Inc | 微生物の形質転換法 |
US5272067A (en) * | 1989-07-19 | 1993-12-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing L-glutamic acid |
JP2973446B2 (ja) | 1990-01-11 | 1999-11-08 | 三菱化学株式会社 | 新規プラスミドベクター |
JPH0488994A (ja) | 1990-07-30 | 1992-03-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 発酵法によるl―グルタミン酸の製造法 |
DE69133559T2 (de) | 1990-09-27 | 2007-11-22 | Invitrogen Corp., Carlsbad | Direkte Klonierung von PCR amplifizierten Nucleinsäuren |
JPH07108228B2 (ja) | 1990-10-15 | 1995-11-22 | 味の素株式会社 | 温度感受性プラスミド |
JPH05791A (ja) | 1991-06-25 | 1993-01-08 | Hitachi Building Syst Eng & Service Co Ltd | エレベータホールドアのロツク点検装置 |
WO1993003158A1 (fr) | 1991-07-30 | 1993-02-18 | Orsan | Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries |
JP3301140B2 (ja) | 1993-02-16 | 2002-07-15 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−グルタミン酸の製造法 |
JP3449758B2 (ja) | 1993-10-15 | 2003-09-22 | 三菱化学株式会社 | 挿入配列 |
CN1177926C (zh) | 1994-06-14 | 2004-12-01 | 味之素株式会社 | 产l-谷氨酸棒状细菌及生产l-谷氨酸的方法 |
JPH0970291A (ja) | 1995-06-30 | 1997-03-18 | Ajinomoto Co Inc | 人工トランスポゾンを用いた遺伝子増幅方法 |
EP1002866B1 (en) | 1997-07-09 | 2005-10-12 | Ajinomoto Co., Inc. | TEMPERATURE SENSITIVE dtsR GENES |
JP4066543B2 (ja) | 1998-01-12 | 2008-03-26 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−セリンの製造法 |
JP4184606B2 (ja) | 1998-09-04 | 2008-11-19 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規遺伝子 |
HU225541B1 (en) | 1998-09-25 | 2007-03-28 | Ajinomoto Kk | Process for producing l-amino acids by fermentation and amino acid-producing bacterium strains |
PE20001375A1 (es) | 1998-12-18 | 2000-12-14 | Ajinomoto Kk | Metodo para producir acido l-glutamico por fermentacion |
JP4239334B2 (ja) | 1998-12-18 | 2009-03-18 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−グルタミン酸の製造法 |
JP2000262288A (ja) | 1999-03-16 | 2000-09-26 | Ajinomoto Co Inc | コリネ型細菌の温度感受性プラスミド |
JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
JP4599725B2 (ja) | 2001-02-20 | 2010-12-15 | 味の素株式会社 | L−グルタミン酸の製造法 |
JP4599726B2 (ja) | 2001-02-20 | 2010-12-15 | 味の素株式会社 | L−グルタミン酸の製造法 |
DE10154177A1 (de) * | 2001-11-05 | 2003-05-08 | Basf Ag | Gene die für neue Proteine codieren |
BRPI0510919A (pt) | 2004-05-20 | 2008-05-20 | Ajinomoto Kk | bactéria produtora de ácido succìnico e processo para produzir ácido succìnico |
JP5572279B2 (ja) | 2004-05-20 | 2014-08-13 | 味の素株式会社 | コハク酸生産菌及びコハク酸の製造方法 |
CN101010423B (zh) * | 2004-09-10 | 2012-06-27 | 味之素株式会社 | 生产l-谷氨酸的微生物和生产l-谷氨酸的方法 |
-
2005
- 2005-12-28 AU AU2005320486A patent/AU2005320486B2/en active Active
- 2005-12-28 CN CN201310361804.XA patent/CN103468758B/zh active Active
- 2005-12-28 BR BR122020021800-2A patent/BR122020021800B1/pt active IP Right Grant
- 2005-12-28 BR BRPI0519410-5A patent/BRPI0519410B1/pt active IP Right Grant
- 2005-12-28 BR BR122019024048-5A patent/BR122019024048B1/pt active IP Right Grant
- 2005-12-28 EP EP15162372.5A patent/EP2949660A1/en active Pending
- 2005-12-28 EP EP05824547.3A patent/EP1831250B1/en active Active
- 2005-12-28 KR KR1020097025199A patent/KR101233739B1/ko active IP Right Grant
- 2005-12-28 CN CN200580045189.5A patent/CN101090911B/zh active Active
- 2005-12-28 KR KR1020077017511A patent/KR100948246B1/ko active IP Right Grant
- 2005-12-28 MY MYPI20056242A patent/MY170930A/en unknown
- 2005-12-28 WO PCT/JP2005/024280 patent/WO2006070944A2/en active Application Filing
-
2006
- 2006-01-03 PE PE2006000019A patent/PE20060952A1/es active IP Right Grant
-
2012
- 2012-06-14 JP JP2012134820A patent/JP2012165765A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FEMS Microbiology Letters. 2003, Vol. 218, No. 2, pp. 305-309 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101090911A (zh) | 2007-12-19 |
BR122019024048B1 (pt) | 2022-05-24 |
MY170930A (en) | 2019-09-19 |
WO2006070944A2 (en) | 2006-07-06 |
PE20060952A1 (es) | 2006-09-20 |
KR20100017581A (ko) | 2010-02-16 |
CN103468758B (zh) | 2015-10-28 |
WO2006070944A3 (en) | 2006-09-14 |
AU2005320486B2 (en) | 2009-08-13 |
EP2949660A1 (en) | 2015-12-02 |
BRPI0519410B1 (pt) | 2020-12-22 |
KR100948246B1 (ko) | 2010-03-18 |
EP1831250A2 (en) | 2007-09-12 |
CN103468758A (zh) | 2013-12-25 |
BR122020021800B1 (pt) | 2021-05-04 |
KR20070097557A (ko) | 2007-10-04 |
EP1831250B1 (en) | 2015-05-06 |
CN101090911B (zh) | 2014-05-07 |
BRPI0519410A2 (pt) | 2009-01-20 |
JP2012165765A (ja) | 2012-09-06 |
AU2005320486A1 (en) | 2006-07-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101233739B1 (ko) | L-글루탐산 생산 미생물 및 l-글루탐산의 제조방법 | |
US8278074B2 (en) | L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid | |
KR100930842B1 (ko) | L-글루탐산 생산 미생물 및 l-글루탐산의 제조방법 | |
JP4560998B2 (ja) | 発酵法によるl−グルタミンの製造法及びl−グルタミン生産菌 | |
US7205132B2 (en) | L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid | |
JP5343303B2 (ja) | L−グルタミン酸生産菌及びl−グルタミン酸の製造方法 | |
KR101078611B1 (ko) | L-글루탐산 생산균 및 l-글루탐산의 제조방법 | |
JP2006340603A (ja) | L−グルタミン酸の製造法 | |
JP2007175016A (ja) | L−グルタミン酸生産菌及びl−グルタミン酸の製造方法 | |
JP4239334B2 (ja) | 発酵法によるl−グルタミン酸の製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A107 | Divisional application of patent | ||
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160119 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170119 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180119 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190117 Year of fee payment: 7 |