JP5343303B2 - L−グルタミン酸生産菌及びl−グルタミン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)L−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、yggB遺伝子を用いて改変されたことにより、非改変株と比較してL−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌。
(2)前記yggB遺伝子が、以下の(a)〜(h)のいずれかから選択されるDNAである(1)のコリネ型細菌:
(a) 配列番号5の塩基番号1437〜3035の塩基配列を含むDNA、
(b) 配列番号5の塩基番号1437〜3035の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号61の塩基番号507〜2093の塩基配列を含むDNA、
(d) 配列番号61の塩基番号507〜2093の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号67の塩基番号403〜2001の塩基配列を含むDNA、
(f) 配列番号67の塩基番号403〜2001の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号83の塩基番号501〜2099の塩基配列を含むDNA、
(h) 配列番号83の塩基番号501〜2099の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(3)前記yggB遺伝子が、配列番号6、62、68、84、もしくは85ら選択されるアミノ酸配列、または配列番号6、62、68、84、もしくは85から選択されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNAである(1)のコリネ型細菌。
(4)yggB遺伝子の発現量が非改変株と比較して上昇するように改変された、(1)のコリネ型細菌。
(5)yggB遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、該遺伝子の発現量が上昇するように改変された、(4)のコリネ型細菌。
(6)変異型yggB遺伝子が導入された、(1)のコリネ型細菌。
(7)前記変異型yggB遺伝子が、配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸番号419−533の配列、または配列番号62のアミノ酸番号419−529の配列をコードする領域に変異を有する、(6)のコリネ型細菌。
(8)前記変異は、前記領域の欠失である、(7)のコリネ型細菌。
(9)前記変異は、前記領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入である、(7)のコリネ型細菌。
(10)前記変異は、前記領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である(7)のコリネ型細菌。
(11)前記変異型yggB遺伝子が、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、424位及び/または437位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である、(7)のコリネ型細菌。
(12)前記変異型yggB遺伝子が、yggB遺伝子がコードするタンパク質の膜貫通領域に変異を有する遺伝子である、(6)のコリネ型細菌。
(13)前記膜貫通領域が、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、アミノ酸番号1−23、25−47、62−84、86−108、及び110−132からなる群から選ばれる領域である、(12)のコリネ型細菌。
(14)前記変異が、フレームシフトを伴うことなく導入された、(12)のコリネ型細菌。
(15)前記変異型yggB遺伝子が、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニン及び/または111位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異を有する遺伝子である、(12)のコリネ型細菌。
(16)前記変異型yggB遺伝子が、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に1又は数アミノ酸を挿入する変異を有する遺伝子である、(12)のコリネ型細菌。
(17)前記変異型yggB遺伝子の導入により、L−グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、(6)〜(16)のいずれかのコリネ型細菌。
(18)さらに上記変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子が不活化するように改変された、(6)〜(17)のいずれかのコリネ型細菌。
(19)前記変異型yggB遺伝子の機能を抑制する遺伝子がsymA遺伝子であり、前記symA遺伝子が以下の(i)または(j)から選択されるDNAである(18)のコリネ型細菌:
(i) 配列番号86の塩基番号585〜1121の塩基配列を含むDNA、
(j) 配列番号86の塩基番号585〜1121の相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、コリネ型細菌内で変異型yggB遺伝子の機能を抑制するDNA。
(20)さらにα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、(1)〜(19)のいずれかのコリネ型細菌。
(21)コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、(1)〜(20)のいずれかのコリネ型細菌。
(22)(1)〜(21)のいずれかのコリネ型細菌を培地で培養し、L−グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体からL−グルタミン酸を回収することを特徴とするL-グルタミン酸の製造法。
(23)下記(a)〜(p)より選ばれる変異型yggB遺伝子:
(a) 配列番号8のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b) 配列番号8のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号20のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d) 配列番号20のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号22のアミノ酸配列をコードするDNA、
(f) 配列番号22のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号24のアミノ酸配列をコードするDNA、
(h) 配列番号24のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL
−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号64のアミノ酸配列をコードするDNA、
(j) 配列番号64のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k) 配列番号70のアミノ酸配列をコードするDNA、
(l) 配列番号70のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m) 配列番号74のアミノ酸配列をコードするDNA、
(n) 配列番号74のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(24)変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損させたコリネ型細菌を、ビオチンを過剰量含む培地に接種し、同培地でL−グルタミン酸を蓄積可能とする株を取得することを特徴とする方法。
(25)変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、in vitroでランダムに変異を導入したyggB遺伝子を導入したコリネ型細菌を、ビオチンを過剰量含む培地に接種し、同培地でL−グルタミン酸を蓄積可能とする株を取得することを特徴とする方法。
(26)変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、転移因子を染色体上にランダムに導入したコリネ型細菌を、ビオチンを過剰量含む培地に接種し、同培地でL−グルタミン酸を蓄積可能とする株を取得することを特徴とする方法。
(27)変異型yggB遺伝子を保有するコリネ型細菌の製造方法であって、コリネ型細菌をL−グルタミン酸アナログを含む培地で培養し、同培地で生育可能な株を取得することを特徴とする方法。
(28)前記変異型yggB遺伝子を保有する菌株が(6)〜(16)のいずれかのコリネ型細菌である、(24)〜(27)のいずれかのコリネ型細菌の製造方法。
(29)前記ビオチンを過剰量含む培地が、ビオチンを30μg/L以上含有する培地である、(24)〜(28)のいずれかのコリネ型細菌の製造方法。
<1>本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、L−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、yggB遺伝子を用いて改変されたことにより、非改変株と比較してL−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌である。
, 255(1991))、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス (コリネバクテリウム・エフィシエンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067(コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14067)
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869(コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869)
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
の登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター)(〒305-5466 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
「L−グルタミン酸生産能が向上した」とは、野生株などの非改変株と比較して、L−グルタミン酸生産能が上昇したことを意味する。ここで、コリネ型細菌の野生株としては、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株、13869株、14067株、コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965株などが挙げられる。なお、「非改変株」としては、上記のような野生株と同程度のyggB遺伝子の発現量を示すような株、yggB遺伝子のコード領域内に変異が導入されていない株も含む。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株(国際公開95/34672号パンフレット)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172;フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP−4173;フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP−4174;フランス特許公報9401748号明細書参照)
P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。コリネ型細菌内で複製能を持たないプラスミドは、エシェリヒア・コリで複製能力を持つプラスミドが好ましく、例えば、pHSG299(宝バイオ社製) pHSG399(宝バイオ社製)等が挙げられる。
145 (1994)69-73)。すなわち、コリネ型細菌では、レバンシュークラーゼを発現させると、シュークロースを資化することによって生成したレバンが致死的に働き、生育することが出来ない。従って、レバンシュークラーゼを搭載したベクターが染色体上に残ったままの菌株をシュークロース含有プレートで培養すると生育できず、ベクターが脱落した菌株のみシュークロース含有プレートで選択することが出来る。
バチルス・アミロリキュファシエンス:sacB GenBank Accession Number X52988
ザイモモナス・モビリス:sacB GenBank Accession Number L33402
バチルス・ステアロサーモフィラス:surB GenBank Accession Number U34874
ラクトバチルス・サンフランシセンシス:frfA GenBank Accession Number AJ508391
アセトバクター・キシリナス:lsxA GenBank Accession Number AB034152
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス:lsdA GenBank Accession Number L41732
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949 (BP-2632:特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (P-5736;特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007;特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P- P-5020;特開昭56-1889号公報参照)ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318;特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM-P4319;特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472;特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136;特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004;特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426(FERM P-5123;特開平56-048890号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440(FERM P-5137;特開平56-048890号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796(FERM P-6402;特開平58-158192号公報参照)
yggB遺伝子を用いた改変としては、後述のようなyggB遺伝子の発現量を増加させること、および変異型yggB遺伝子を導入することを含む。
yggB遺伝子は、メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として知られ、mscSとも呼ばれるタンパク質をコードする(FEMS Microbiol Lett. 2003 Jan 28;218(2):305-9.)。
yggB遺伝子の発現量を増加させることにより、コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能が非改変株に比べて向上する。すなわち、yggB遺伝子の発現量が増加するように改変されたコリネ型細菌を培養することにより、非改変株に比べて多くの量のL-グルタミン酸を培地中に蓄積するか、あるいは、非改変株に比べて速い速度でL-グルタミン酸を生産する。例えば、yggB遺伝子発現増強株は、親株あるいは非改変株と比べて、対糖収率でL-グルタミン酸の収率が2%以上上昇していることが好ましく、4%以上上昇していることがより好ましく、6%以上向上していることが特に好ましい。yggB遺伝子発現増強株は、非改変株と比べて、除菌体収率が向上していてもよい。除菌体収率とは、対糖収率から菌体生成に用いられた炭素収率を除いたものを意味する。
ここで、「L-グルタミン酸生産条件」とは炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する培地に、L−グルタミン酸生産を誘導する物質を添加したり、あるいはL−グルタミン酸生産を阻害する物質の培地中の量
を制限した条件を意味し、L−グルタミン酸生産を誘導するために添加する物質には、ペニシリンGやTween40等の飽和脂肪酸を含む界面活性剤が挙げられ、L−グルタミン生産を阻害するために制限する物質とはビオチンが挙げられる(アミノ酸発酵 学会出版センター 1986年)。L−グルタミン酸生産条件でのこれらの物質の培地中の添加濃度は、ビオチンは、15μg/L未満、好ましくは、10μg/L未満、さらに好ましくは、5μg/L未満であり、培地中にビオチンを全く含まなくてもよい。ペニシリンの培地中の添加濃度は、0.1U/ml以上、好ましくは、0.2U/ml以上、さらに好ましくは、0.4U/ml以上であり、界面活性剤の添加濃度は、0.5g/L以上、好ましくは、1g/L以上、さらに好ましくは、2g/L以上である。
一方、「過剰量のビオチンを含む条件」とは、例えば、培地中にビオチンを30μg/L以上、好ましくは40μg/L、さらに好ましくは50μg/L含む条件をいう。
また、コリネ型細菌の種や菌株によってyggB遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、yggB遺伝子は配列番号5の塩基番号1437-3035番目からなる塩基配列のバリアントであってもよい。yggB遺伝子のバリアントは、配列番号5の塩基番号1437-3035番目からなる塩基配列の配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、yggB遺伝子のバリアントは、yggB遺伝子ホモログ、例えばコリネ型細菌の染色体を鋳型にして例えば配列番号75、76の合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。また、本発明の遺伝子は、コリネ型細菌のyggB遺伝子が望ましいがコリネ型細菌で機能を有する限り、他の微生物由来の遺伝子を用いてもよい。また、後述する変異型yggB遺伝子を用いてもよい。
上記置換は保存的置換が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙
げられる。
さらに、本発明のyggB遺伝子は、配列番号6、62、68、または84のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子も含む。ここで、ホモロジーは、Karlin とAltschulによるBLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)) や PearsonによるFASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990))などによって計算することができる。これらのアルゴリズムによるホモロジー検索プログラム(BLASTN 、BLASTP など)が、NCBIなどより入手できる(//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
なお、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yggB遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
48番目のグルタミン残基(望ましくはアルギニン残基への置換)
275番目のアスパラギン残基(望ましくはセリン残基への置換)
298番目のグルタミン酸残基(望ましくはアラニン残基への置換)
343番目のアラニン残基(望ましくはバリン残基への置換)
396番目のフェニルアラニン残基(望ましくはイソロイシン残基への置換)
438番目のセリン残基(望ましくはグリシン残基への置換)
445番目のバリン残基(望ましくはアラニン残基への置換)
454番目のアラニン残基(望ましくはバリン残基への置換)
457番目のプロリン残基(望ましくはセリン残基への置換)
474番目のセリン残基(望ましくはアスパラギン残基への置換)
517番目のバリン残基(望ましくは欠失)
518番目のグルタミン酸残基(望ましくは欠失)
519番目のアラニン残基(望ましくは欠失)
520番目のプロリン残基(望ましくは欠失)
また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号5の塩基配列の1437-3035番目の配列を有する遺伝子、配列番号61の塩基配列の507-2093番目の配列を有する遺伝子、配列番号67の塩基配列の403-2001番目の配列を有する遺伝子、または配列番号83の塩基配列の501-2099番目の配列を有する遺伝子を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート(EMS)等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yggB遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。これらの遺伝子がコリネ型細菌に導入したときにL−グルタミン酸生産能を向上させるか否かは、例えば、これらの遺伝子をコリネ型細菌の野生株に導入し、上述の条件でL−グルタミン酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより、確かめるこ
とができる。
なお、発現量を増強するyggB遺伝子は、後述するような変異型yggB遺伝子であってもよい。
pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
ターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば、特開平3−210184号公報に記載のプラスミドpCRY30;特開平2−72876号公報及び米国特許5,185,262号公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX;特開平1−191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3;特開昭58−67679号公報に記載のpAM330;特開昭58−77895号公報に記載のpHM1519;特開昭58−192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844;特開昭57−134500号公報に記載のpCG1;特開昭58−35197号公報に記載のpCG2;特開昭57−183799号公報に記載のpCG4およびpCG11等、特開平10-215883号公報に記載のpVK7を挙げることができる。
75 1929 (1978))も応用できる。また、電気パルス法(特開平2-207791号公報)や、接合伝達法(Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84-7).によっても、コリネ型細菌の形質転換を行うことができる。
えられる。例えば用いることが出来るベクターは、pSUP301(Simo等, Bio/Technology 1, 784〜791 (1983) )、pK18mobまたはpK19mob(Schaefer等, Gene
145, 69〜73 (1994) )、pGEM−T(Promega corporation, Madison, WI, USA)、pCR2.1−TOPO(Shuman (1994). Journal of Biological Chemisty 269: 32678〜84; US-A 5487993)、pCR(R)Blunt(Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534〜541 (1993))、pEM1(Schrumpf等,1991, Journal of Bacteriology 173: 4510〜4516)またはpBGS8(spratt等, 1986, Gene, 41:337〜342)等が挙げられる。yggB遺伝子を含むプラスミドベクターをコリネ型細菌中に接合または形質転換によって転移させる。接合法は、例えばSchaefer等(Applied and Environmental Microbiology 60, 756〜759 (1994))に記載されている。形質転換法は、例えばTheirbach等(Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356〜362 (1988))、DunicanおよびShivinan(Bio/Technology 7, 1067〜1070 (1989))およびTauch等(FEMS Microbiological Letters 123, 343〜347 (1994))に記載されている。
発現調節配列の置換は、例えば上述の温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、yggB遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
yggB遺伝子を用いた改変として、コリネ型細菌への変異型yggB遺伝子の導入も挙げられる。ここで、「変異型yggB遺伝子の導入」とは、コリネ型細菌の染色体上のyggB遺伝子への変異の導入であってもよいし、変異型yggB遺伝子を含むプラスミドのコリネ型細菌への導入であってもよいし、染色体上のyggB遺伝子の変異型yggB遺伝子への置換であってもよい。
本発明において、「変異型yggB遺伝子」とは、yggB遺伝子のコード領域内の変異であって、コリネ型細菌のビオチンを過剰量含む条件下でのL-グルタミン酸生産能を向上させる機能をyggB遺伝子に付与する変異、を含むyggB遺伝子を意味する。なお、変異型yggB遺伝子は、コリネ型細菌に導入したときに、ビオチンを過剰量含む条件下だけでなく、上述したようなL-グルタミン酸生産条件でもL-グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子であって
もよい。
「過剰量のビオチンを含む条件下でのL−グルタミン酸生産能が向上した」とは、本発明のコリネ型細菌を、非改変株がL-グルタミン酸を蓄積できないような濃度のビオチンを含む条件、例えば、30μg/L以上の濃度のビオチンを含む培地で培養したときに、本発明のコリネ型細菌が、非改変株に比べて多くの量のL-グルタミン酸を培地中に蓄積するか、あるいは、非改変株に比べて速い速度でL-グルタミン酸を生産することを意味する。
(II-1)odhA遺伝子欠損株を利用する方法
変異型yggB遺伝子を取得する方法として、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1oサブユニットをコードしているodhA遺伝子(sucA遺伝子)を欠損した株(以下odhA破壊株という)が利用出来ることを本発明者は発見した。odhA破壊株の構築は、上述したようなsacB遺伝子などを用いる方法によって行うことが可能である。
ンが過剰量含まれる培地で培養することにより確認する。例えば20mlのL−グルタミン酸生産フラスコ培地(グルコース30g/l, 硫酸アンモニウム 15g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1(ビタミンB1) 200μg/l, Biotin 300μg/l, 大豆加水分解物(T-N全窒素)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に候補株を接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養し、糖を完全消費後、L−グルタミン酸の蓄積を確認する。L-グルタミン酸の対糖収率が50%以上を示した株について、そのyggB遺伝子の配列を決定することにより変異を特定することができる。
また、変異型yggB遺伝子を有するコリネ型細菌はコリネ型細菌で機能する転移因子を用いてスクリーニングしてもよい。転移因子とはインサーションシーケンス(IS因子)、トランスポゾンを含む。変異型yggB遺伝子は、野生型のyggB遺伝子にインサーションシーケンス(IS因子)、トランスポゾンが偶然挿入されることによって取得できるものでもよいし、人工トランスポゾンを用いて、人為的に構築したものでもよい。転移因子が挿入された株は、例えばL-グルタミン酸アナログに対する感受性の低下を指標として選択することができる。L-グルタミン酸のアナログとしては、4−フルオログルタミン酸が利用できる。また、薬剤耐性遺伝子含む人工トランスポゾンを用いて薬剤耐性株をランダムに選択し、耐性株のyggB遺伝子長をPCRで確認することによっても転移因子挿入株を選択できる。
2. NCgl0235 Cgl0238; putative transposase
3. NCgl0348 Cgl0355; putative transposase
4. NCgl0688 Cgl0718; putative transposase
5. NCgl0919 Cgl0959; transposase
6. NCgl0993 Cgl1037; transposase
7. NCgl1021 Cgl1066; transposase
8. NCgl1464 Cgl1521; putative transposase
9. NCgl1496 Cgl1557; transposase
10. NCgl1662 Cgl1733; putative transposase
11. NCgl1664 Cgl1734; transposase
12. NCgl2131 Cgl2212; transposase
13. NCgl2284 Cgl2367; transposase
14. NCgl2392 Cgl2479; putative transposase
15. NCgl2418 Cgl2504; putative transposase
16. NCgl2420 Cgl2506; putative transposase
17. NCgl2460 Cgl2548; predicted transposase
18. NCgl2542 Cgl2631; predicted transposase
19. NCgl2665 Cgl2761; putative transposase
20. NCgl2748 Cgl2845; putative transposase
21. NCgl2850 Cgl2951; predicted transposase
人工トランスポゾンを搭載したプラスミドをコリネホルム細菌に導入する方法としては、通常よく用いられるプロトプラスト法(Gene, 39, 281-286 (1985))、エレクトロポーレーション法(Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989))等の方法を用いればよい。
(特開平7−107976号、Vertes,A.A., Asai,Y., Inui,M., Kobayashi,M., Kurusu,Y. and Yukawa,H. :Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994))。
また、変異型yggB遺伝子は、in vitroでランダムに変異を導入し、その中から界面活性剤等の添加なしにL−グルタミン酸生産が可能となるクローンから選択することも出来る。スクリーニングに用いる親株としては、ビオチンが過剰量含まれた条件でL−グルタミン酸を蓄積することが出来ない株、例えば、C.glutamicum 野生株であるATCC13869株、ATCC13032株、ATCC14067株、C.melasecola野生株であるATCC17965が望ましい。
StEP−PCRによって、遺伝子組換えにより人工的にyggB遺伝子に変異を導入して変異型yggB遺伝子を取得することも出来る。(Firth AE, Patrick WM;Bioinformatics. 2005 Jun 2; Statistics of protein library construction.)
なお、上記のような染色体上のyggB遺伝子に変異を導入する方法としては、上述の方法以外に、コリネ型細菌にX線や紫外線を照射する方法、またはコリネ型細菌をN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。この方法によって、変異型yggB遺伝子が導入されたかどうかは、染色体上のyggB遺伝子の塩基配列を決定することやビオチンを過剰量含む培地でL−グルタミン酸を生成させることによって確認出来る。
変異型yggB遺伝子は、野生型のyggB遺伝子を有するコリネ型細菌をL−グルタミン酸アナログを含む培地で培養し、同培地で生育可能なL-グルタミン酸アナログ耐性株を取得することによっても取得することができる。スクリーニングに用いる親株としては、上述のコリネ型細菌野生株が好ましいが、野生型のyggB遺伝子を有するものであれば、いずれでもよい。また野生型のyggB遺伝子を搭載したプラスミドを有するコリネ型細菌でもよい。
L-グルタミン酸アナログとしては、L−グルタミン酸−γ−メチルエステル、α−メチルグルタミン酸、β−ヒドロキシグルタミン酸、メチオニンスルホキシミン、グルタミン酸−γ−モノヒドロキサメ−ト、2−アミノ−4−ホスホノ酪酸、L−グルタミン酸−γ−モノエチルエステル、L−グルタミン酸ジメチルエステル、L−グルタミン酸−ジ−t−ブチルエステル、モノフロログルタミン酸、L−グルタミン酸ジエチルエステル、D−グルタミン酸、4−フルオログルタミン酸が挙げられ、特に4−フルオログルタミン酸アナログが使用できる。
L-グルタミン酸アナログ耐性株は以下のような手法で行う。コリネ型細菌をL-グルタミン酸アナログを添加した最小培地に接種し、24時間〜48時間後にコロニーを形成した株を取得する。培地中に含まれるL-グルタミン酸アナログの濃度は、yggB遺伝子が改変されていないコリネ型細菌が生育できず、yggB遺伝子に変異が導入されたコリネ型細菌が生育できる濃度が好ましい。より具体的には、4−フルオログルタミン酸を用いる場合は、1.25mM、好ましくは2.5mM、より好ましくは5mMが好ましい。ここで、本発明のL-グルタミン酸アナログ耐性とは、最少培地に4−フルオログルタミン酸を添加して一昼夜培養した際に、親株の生菌数(コロニー形成能を有する菌数)を1/100まで抑制できるような濃度においても1/10以上の増殖を示すことを意味する。
取得できたL-グルタミン酸アナログ耐性株をビオチンを過剰量含むL−グルタミン酸生産液体培地に接種し、しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量する。L-グルタミン酸は野生株では殆ど増加しないが、L-グルタミン酸アナログ耐性株では、L-グルタミン酸を有意に蓄積する株が存在する。そのような株よりyggB遺伝子をPCRによって増幅し、そのyggB遺伝子の塩基配列を決定することで、新規な変異型yggB遺伝子が取得できる。
以下、変異型yggB遺伝子の具体例を挙げる。ただし、変異型yggB遺伝子は、コリネ型細菌においてビオチンが過剰量存在する条件で、L-グルタミン酸生産能を向上させうる変異であれば特に制限されない。
この変異は、配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸番号419−533の配列、または配列番号62のアミノ酸番号419−529の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である。例えば、この領域は、配列番号5の塩基配列においては、塩基番号2692-3035番目に相当する。上記領域の塩基配列中の少なくとも一部に変異が導入されていればいずれでもよいが、インサーションシーケンス(以下ISという)や、トランスポゾンが挿入されたものが好ましい。変異は、アミノ酸置換を伴うもの(ミスセンス変異)や、上記ISの挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの、ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよい。
C末端側変異の一例として、配列番号5の2691番目のGの次にISが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号7に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号8に示す。配列番号8においては、配列番号6の419位のバリンから下流の領域が短いISに由来する配列に置換されている。なお、配列番号7にて挿入されたISは、IS1207(Genbank accession No. X96962) 、IS719: (Genbank accession No E12759)と相同性の高い配列である。
上記変異型yggB遺伝子を2A−1型変異と呼ぶ。2A−1型変異には、配列番号6、62、68、84および85のC末端側の該領域を欠失または置換する変異が含まれる。
また、上記領域に他のISが挿入されたもの、例えば上述したようなtransposaseをコードするISが挿入されたものも、本発明の範囲に含まれる。transposaseが導入される位置は上記領域のいずれの位置でもよいが、それぞれのtransposaseが認識しやすい箇所やISが挿入しやすいホットスポットの位置が好ましい。
またC末端側変異の一例として、配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸番号419−533の配列、または配列番号62のアミノ酸番号419−529の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異が挙げられる。置換してもよいプロリンは、配列番号6の以下の位置に存在する。
424番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の424番目)
437番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の437番目)
453番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の453番目)
457番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の457番目)
462番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の462番目)
469番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の469番目)
484番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の484番目)
489番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の489番目)
497番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の497番目)
515番目のプロリン残基(配列番号62、68、84、85の515番目)
529番目のプロリン残基(配列番号68、84、85の529番目、配列番号62番目の525番目)
533番目のプロリン残基(配列番号68、84、85の533番目、配列番号62番目の529番目)
yggB遺伝子のC末端側のプロリン残基は、YggBタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられる。(Protein Eng. 2002 Jan;15(1):29-33、J Biol Chem. 1991 Dec 25;266(36):24287-94.)
中でも424番目と437番目のプロリンが他のアミノ酸に置換することが望ましい。
ここで他のアミノ酸とは、プロリン以外のアミノ酸で天然型アミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく、Lys,Glu,Thr,Val,Leu,Ile,Ser,Asp,Asn,Gln,Arg,Cys,Met,Phe,Trp,Tyr,Gly,Ala,Hisから選択される残基に置換すればよい。特に、424番目のプロリンは、疎水性アミノ酸であるAla、Gly、Val、Leu、Ileに置換されることが望ましく、中でも分岐鎖アミノ酸であるLeu、Val、Ileが望ましい。(66型変異)424番目のプロリンをロイシンに置換する変異として、例えば、配列番号67の1673位の“C”を“T”に置換する変異が挙げられる。この変異型yggB遺伝子を配列番号69に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号70に示す。
また、437番目のプロリンは、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(Thr,Ser,Tyr)に置換することが望ましく、中でもSerへの置換が望ましい。(22型変異)437番目のプロリンをセリンに置換する変異としては、例えば配列番号5の2745位のCをTに置換する変異が挙げられる。また、本変異は、3060位のCをTに置換する変異を伴っていてもよい。この変異型yggB遺伝子を配列番号73に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号74に示す。
yggB遺伝子がコードするYggBタンパク質は、5個の膜貫通領域を有していると推測される。配列番号6、62、68、84、85の野生型のYggBタンパク質のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号1〜23(第1膜貫通領域)、25〜47(第2膜貫通領域)、62〜84(第3膜貫通領域)、86〜108(第4膜貫通領域)、110〜132(第5膜貫通領域)の領域に相当する。これらをコードするDNAは配列番号5の1437-1505、1509-1577、1620-1688、1692-1760、1764-1832番目の塩基に該当する。本発明の変異は、この膜貫通領域をコードするDNA内に変異を有していることが望ましく、変異導入は1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入又は逆位を含む変異で、フレームシフト変異、ナンセンス変異を伴わないものが望ましい。従って、ここでアミノ酸配列の置換の場合は、アミノ酸置換を伴うミスセンス変異が好ましく、上記数個の
置換、欠失、付加、挿入又は逆位とは、2〜20個、好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜5個、さらに好ましくは2〜3個を意味する。またアミノ酸の挿入、欠失変異は、1〜数塩基のポイントミューテーションの導入や、フレームシフト変異を伴わない塩基配列導入、例えば、3,6,9,12,15,18、または21塩基の挿入または欠失、好ましくは、3,6、または9塩基の欠失または挿入、より好ましくは3塩基の塩基配列の欠失または挿入が望ましい。
(III-2−1)第1膜貫通領域の変異(A1型変異)
この変異は、配列番号6、62、68、84、85に示されるアミノ酸配列において、14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間に1又は数アミノ酸挿入された変異である。
具体例としては、14番目のロイシン残基、15番目のトリプトファン残基間に、3アミノ酸導入されたもの、例えばCys-Ser-Leuが挿入されたものが挙げられ、この変異の例として、配列番号5の1480番目のGの次にTTCATTGTGが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号19に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号20に示す。
この変異は、配列番号6、62、68、84、85に示されるアミノ酸配列において、100番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であればいずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(スレオニン、セリン、チロシン)に置換されていることが望ましく、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。一例として配列番号5の1734番目のGがAに置換された変異が挙げられる。
この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号21に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に示す。
この変異は、配列番号6、62、68、84、85に示されるアミノ酸配列において、111番目のアラニン残基が、他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは、アラニン以外のアミノ酸残基であれば、いずれでもよく、他のアミノ酸とはアルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン、スレオニンを意味するが、中でも分岐鎖アミノ酸(バリン、イソロイシン、ロイシン)、特にバリン残基や、側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸(スレオニン、セリン、チロシン)、特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。この変異の例として、配列番号5の1768番目のCがTに置換された変異(L30型変異)や、配列番号61の837番目のGがAに置換された変異(8型変異)が挙げられる。L30型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号23に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に示す。8型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号63に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号64に示す。
48位のGlu(好ましくはArgによる置換)
275位のAsp(好ましくはSerによる置換)
298位のGlu(好ましくはAlaによる置換)
343位のAla(好ましくはValによる置換)
396位のPhe(好ましくはIleによる置換)
438位のSer(好ましくはGlyによる置換)
445位のVal(好ましくはAlaによる置換)
454位のAla(好ましくはValによる置換)
457位のPro(好ましくはSerによる置換)
474位のSer(好ましくはAspによる置換)
517位のVal(好ましくは欠失)
518位のGlu(好ましくは欠失)
519位のAla(好ましくは欠失)
520位のPro(好ましくは欠失)
上記のような変異を有する変異型yggB遺伝子は、例えば、部位特異的変異導入法などによって得ることができる。より具体的には、yggB遺伝子の該当領域に変異を含む配列を有するPCRプライマーを用いて、該当箇所を増幅するオーバーラップエクステンションPCR法などを用いて、変異を含むyggB遺伝子を増幅してクローニングすることができる (Urban,
A., Neukirchen, S. and Jaeger, K. E., A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR. Nucleic Acids Res, 25, 2227-8. (1997).)。
得られた変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより本発明のコリネ型細菌を得ることができる。導入の方法としては、変異型yggB遺伝子で染色体上の野生型のyggB遺伝子を置換する方法が挙げられる。染色体上の野生型のyggB遺伝子を破壊した株に変異型yggB遺伝子を導入してもよい。なお、一回組換え株のように、野生型のyggB遺伝子を染色体上に残したまま、変異型yggB遺伝子を導入してもよく、野生型遺伝子と、変異型遺伝子が組み込まれる1コピーずつ染色体上に存在してもよい。染色体上のyggB遺伝子の置換は、例えば、上述したレバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子を含む温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。
No. NC_003450として登録されているゲノム配列中の塩基番号2051306..2051845にコードされており、NCgl 1867として登録されている(NP_601149. hypothetical prot...[gi:19553147])。C.glutamicum ATCC13869のsymA遺伝子を配列番号86の塩基番号585〜1121に示す。遺伝子の不活化は、遺伝子を破壊するあるいは、発現量を低下するように改変することで達成でき、symA遺伝子の破壊や発現量を低下させるような変異の導入は、上述の酵素活性の低下と同様の方法で行うことができる。
ことができる。α-KGDH活性は、野生株又は親株等の非改変株に対して低下していればよいが、親株に対して約1/2以下、好ましくは1/4以下、さらに好ましくは1/10以下に低下していることが望ましく、全く活性を有しなくてもよい。
中でもチアミンピロリン酸結合領域(配列番号43の2498番目〜2584番目の塩基によってコードされる領域(配列番号44の686Gly-714Asp))に変異を導入することが好ましい。
例えば、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株(国際公開WO95/34672号パンフレット)や、 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム AJ12821(FERM BP−4172)株(特開平06-237779)が挙げられる。尚、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの弱化と変異型yggB遺伝子の導入は、どちらを先に行ってもよい。
上記のようにして得られるコリネ型細菌をを培地に培養し、培地中にL−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、L−グルタミン酸を該培地から採取することにより、L−グルタミン酸を製造することが出来る。
また、用いるyggB遺伝子改変株の性質にあわせて適当な濃度の界面活性剤、ペニシリンを加えてもよいし、用いるyggB遺伝子改変株の性質にあわせてビオチン濃度も調節すればよい。
行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。L−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したL−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているL−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
(A)pBS3の構築
sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築は、国際公開WO2005113745 号、WO2005113744 号の方法を参照にして行った。sacB遺伝子(配列番号11)をバチルス・ズブチリスの染色体DNAを鋳型として配列番号13と14をプライマーとして用いて、PCRにより取得した。PCR反応は、LA taq(TaKaRa)を用い、94 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 30秒、会合49℃ 30秒、伸長72℃ 2分からなるサイクルを25回繰り返した。生成したPCR産物を常法により精製後BglIIとBamHIで消化し、平滑化した。この断片をpHSG299のAvaIIで消化後、平滑化した部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル(宝バイオ社製)を用いて形質転換を行い、カナマイシン(以下、Kmと略す)25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS3と命名した。pBS3の構築過程を図1に示す。
pBS3上に存在するカナマイシン耐性遺伝子配列中のSmaI部位をアミノ基置換を伴わない塩基置換(SmaIにより切断されない変異)によりカナマイシン耐性遺伝子を破壊したプラスミドをクロスオーバーPCRで取得した。まず、pBS3を鋳型として配列番号15,16 の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子のN末端側の増幅産物を得る。一方Km耐性遺伝子のC末端側の増幅産物を得るためにpBS3を鋳型として配列番号17,18の合成DNAを鋳型としてPCRを行った。PCR反応はPyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社製)を用い、98 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。配列番号16と17は部分的に相補的であり、またこの配列内に存在するSmaI部位はアミノ酸置換を伴わない塩基置換を施すことにより破壊されている。次にSmaI部位が破壊された変異型カナマイシン耐性遺伝子断片を得るために、上記カナマイシン耐性遺伝子N末端側及びC末端側の遺伝子産物を、それぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号15,18の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたKm耐性遺伝子増幅産物を得た。PCR反応はPyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社)を用い、98 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1.5分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。
コリネ型細菌のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードしているodhA遺伝子の配列は既に明らかにされている(Microbiology 142, 3347-3354, (1996)、GenBank accession No.D84102)。公開されているodhA遺伝子の配列を基に、配列番号1、2に記載のプライマーを設計しATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、odhA遺伝子の内部配列のみを増幅した。増幅したPCR断片をBamHIで完全分解し、実施例1で構築したpBS4SのBamHI部位に挿入したプラスミドpBS4SΔsucAintを構築した(構築図は図3に記載)。
300μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培地中のL−グルタミン酸濃度を測定した。結果を表1に示す(OD620は101倍希釈の濁度で菌体量の指標であり、Glu(g/L)はL−グルタミン酸の蓄積量を示す)。親株のATCC13869ではL−グルタミン酸を全く生成しない条件においても2A-1株ではL−グルタミン酸生産能を有することが確認された。
取得した2A-1株は、染色体上のodhA遺伝子がpBS4SΔT¥sucAintによって破壊されている。この株から染色体上のプラスミドを脱落させればodhAは野生型に復帰する。一方、odhAが欠損した株では、糖を含まない培地での生育が著しく遅いが、odhAが野生型に復帰すれば糖を含まないCM2B(ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、NaCl 5g/l、Biotin 10μg/L、寒天 20g/l、KOHを用いてpH7.0に調整)のような培地でも良好に生育すると推測される。そこで、2A-1株をCM2Bプレートに塗布し、生育改善株を誘導した。こうして出現した生育改善株2A-1R株をCM2Bプレートで純化し、そのカナマイシン感受性を調べたところ
、すべてカナマイシン感受性であり、スクロース耐性であることが明らかとなった。
2A-1R株は、CM2Bプレート培地上においては、野生株ATCC13869とほぼ変わらない速度でコロニーを形成できる。しかし、最少培地(グルコース20g/l,硫酸アンモニウム 2.64g/L, KH2PO4 0.5g/L, K2HPO4 0.5g/L, MgSO4・7H2O 0.25g/L, FeSO4・7H2O 0.01g/L, MnSO4・7H2O 0.01g/L, CaCl2 0.01g/L, CuSO4 0.02mg/L, MOPS 40g/L, プロトカテク酸 30mg/L, VB1・HCl200μg/L, Biotin 300μg/L, 寒天 20g/L, NaOHを用いてpH6.7に調整)プレート上では野生株ATCC13869に比し著しくコロニー形成速度が低下していることが明らかとなった。そこで、最少培地で2A-1R株の生育を回復できる遺伝子の探索をおこなった。
のゲノム配列(Acc.No. NC_003450)を比較した結果、pL5kには完全長のORFとして、配列番号6に示すアミノ酸配列をもつORFのみが含まれていることが明らかとなった。ORFが膜タンパク質か否かは、インターネット上で利用可能なプログラム「SOSUI」によって予測可能である(2004/10/07 現在http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.htmlにリンクされている)。「SOSUI」でこのORFを解析した結果、5回の膜貫通領域が存在していることが示唆された。配列番号6のアミノ酸配列において、膜貫通領域はそれぞれ、アミノ酸番号1〜23、25〜47、62〜84、86〜108、110〜132の領域に相当する。これらをコードするDNA配列は、配列番号5の1437-1505、1509-1577、1620-1688、1692-1760、1764-1832番目の塩基配列に、膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号25−29、表3に示した
2A-1R株の最少培地における生育をpL5Kが相補したことから、2A-1R株のyggB遺伝子には何らかの変異がある可能性が示唆された。そこで、2A-1R株のyggB遺伝子の塩基配列を決定した。その結果2A-1R株ではYggB遺伝子のC末端側の領域にISが挿入されていることが明らかとなった(図5)。2A-1R株の変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号7に、アミノ酸配列を配列番号8に記した。このことから、2A-1R株のグルタミン酸生産能は、yggB遺伝子の変異によって維持されていた可能性が示唆された。なお、この変異は2A-1R株のみならず2A-1株にも存在していた。odhA遺伝子に変異を導入した際に、安定してグルタミン酸を細胞外に放出するためのサプレッサー変異として起こった変異であると推測される。ここで、ISが挿入されたこの変異を、2A-1型変異とした。
(6−1) 2A-1型変異の野生株への導入と評価(1回組換え株)
2A-1株の染色体DNAを鋳型として、配列番号9と配列番号10に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、2A-1型変異を有するyggB遺伝子断片を増幅した。増幅産物はSacIで処理し、実施例1のpBS3のSacI部位に挿入した。2A-1型変異を有するyggB断片がクローニングされたプラスミドをpBS3yggB2Aと名付けた。
電気パルス法にてC.glutamicum ATCC13869にpBS3yggB2Aを導入し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地上に塗布した。31.5℃にて培養後生育してきた株を、相同組換えによって染色体上にpBS3yggB2Aが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。
得られた一回組換え株を13869-2Aとした。この株では、野生型のyggB遺伝子と変異型のyggB遺伝子の両方が発現していることとなる。
変異型遺伝子のみを有する株を構築する為、13869-2A株をCM-Dex液体培地で一夜培養した懸濁液をS10寒天培地(スクロース 100g/l、ポリペプトン 10g/l、酵母エキス 10g/l、KH2PO4 1g/l、MgSO4・7H2O 0.4g/l、FeSO4・7H2O 0.01g/l、MnSO4・4-5H2O 0.01g/l、尿素 3g/l、大豆蛋白加水分解液1.2g/l、寒天 20g/l、NaOHを用いてpH7.5に調整:オートクレーブ120℃20分)上に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をs2B寒天培地上で純化した。これらの株より染色体DNAを調整し、配列番号9と配列番号10に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異を確認し、yggB遺伝子にIS様配列が挿入されていた株を13869-2A-7とした。
上述のL−グルタミン酸生産性のodhA変異株を解析した結果、上述の2A-1変異の他にyggB遺伝子上に5種類の変異を見出した。以下、それぞれA1型変異、19型変異、L30型変異、8型変異、66型変異とし、前者3つについてはATCC13869の染色体に変異を導入
して効果を確認した。8型変異についてはATCC14067の染色体に変異を導入して効果を確認した。66型変異に関しては、C.melassecola ATCC17965の染色体に変異を導入して効果を確認した。
A1変異を染色体上に導入した、ATCC13869-A1株は親株のATCC13869株と比べてL−グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
19型変異は、配列番号5の1734番目のGがAに置換された変異であり、配列番号6のアミノ酸配列の100番目のアラニンがスレオニンに置換された変異である。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号21に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に示す。実施例7と同様の方法にて、19型変異が導入されたyggB変異株を構築した。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号35に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号33と配列番号36の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えば19型YggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られたYggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られたpBS4 YggB19を実施例6記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、19型に置
換されていた株を選択すれば、19型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つ19型変異株をATCC13869-19株とした。
L30型変異は、配列番号5の1768番目のCがTに置換された変異であり、配列番号6の111番目のアラニンがバリンに置換された変異である。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号23に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に示す。
実施例7と同様の方法にて、L30型変異が導入されたyggB変異株を構築した。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号37に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号34と配列番号38の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行ないL30型YggB遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型YggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られたpBS4 YggB-Lを実施例6記載の方法と同様にATCC13869株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、L30型に置換されていた株を選択し、L30型変異を有する株を構築した。このような変異を持つL30型変異株をATCC13869-L株とした。
コリネ型細菌はTween40等の脂肪酸系界面活性剤の添加や、ビオチン制限によりグルタミン酸生成を誘導できる。そこで、ATCC13869株とATCC13869-19株について、Tween40添加条件およびビオチン制限条件での培養も行った。シード培養は、20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費した培養液を種培養液とした。Tween40添加培養においては、種培養液2mlを20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後、OD620(x101)=0.2に到達した時点で、最終濃度5g/LとなるようにTween40を添加し培養を継続した。ビオチン制限培養においては、種培養液1mlを20mlのフラスコ培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。この条件ではビオチンの終濃度が約2.9μg/Lとなる。
Tween40添加培養およびビオチン制限培養ともに、培養開始後40時間後の培地中のL−グルタミン酸濃度を測定した。結果を表9に示す(OD620は101倍希釈の菌体量、Glu(g/L)はL−グルタミン酸の蓄積量を示す)。ATCC13869-19株では、L-グルタミン酸生産条件でもL-グルタミン酸の蓄積の増大が認められた。
30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始5時間後にTween40を終濃度1g/Lとなるように添加し、培養開始から24時間後の菌体量とL-グルタミン酸の収量を分析した。その結果、表10に示すように、ATCC13869-19, ATCC13869-L30, ATCC13869-A1株、野生型のyggB遺伝子増幅株(ATCC13869/pL5k-1)ともにL-グルタミン酸生産条件でのL-グルタミン酸の収量が向上していることが示された。
8型変異は、配列番号61の837位のGがAに置換された変異であり、配列番号62の111位のアラニンがスレオニンに置換されている。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号63に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号64に示す。
実施例7と同様の方法にて、8型変異が導入されたyggB変異株を構築する。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号65に示す合成DNAをプライマーとして、Brevibacterium flavumATCC14067株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製する。同様に配列番号34と配列番号66の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号34の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、8型YggB遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型YggB断片はSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたpBS4 YggB8を実施例6記載の方法と同様にATCC14067株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、8型に置換されていた株を選択し、8型変異を有する株を構築する。このような変異を持つ8型変異株をATCC14067yggB8株とする。
66型変異は、配列番号67の1673番目のCがTに置換された変異であり、配列番号68の424番目のプロリンがロイシンに置換されている。この変異が導入された変異型YggB遺伝子の塩基配列を配列番号69に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号70に示す。
実施例7と同様の方法にて、66型変異が導入されたyggB変異株を構築する。具体的には、配列番号30に示す合成DNAと配列番号71に示す合成DNAをプライマーとして、C.melassecolaATCC17965株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号34と配列番号72の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製する。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号9と配列番号10の合成DNAをプライマーとしてPCRを行えば66型yggB遺伝子の部分断片を取得できる。得られた変異型YggB断片をSacIで処理してpBS4SのSacI部位に挿入することにより、変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られたpBS4 YggB66を実施例6記載の方法と同様にATCC17965株の染色体に挿入した後、脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のyggB遺伝子の配列を決定し、66型に置換されていた株を選択することで、66型変異を有する株を構築できる。このような変異を持つ66型変異株をyggB66株とする。
(13−1)yggB欠損株の構築
変異型のyggB遺伝子をin vitroでyggBに変異をランダムに導入し、その中から界面活性剤等の添加なしにグルタミン酸生産が可能となるクローンを選択することも出来る。変異型遺伝子のスクリーニングを行うため、まずyggB欠損株を構築した。配列番号39に示す合成DNAと配列番号40に示す合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、N末端側断片を調製した。同様に配列番号41と配列番号42の合成DNAをプライマーとして、C末端側断片を調製した。配列番号40と41は互いに相補的である。続いてN末端側断片とC末端側断片を等量混合したものを鋳型として、配列番号39と配列番号42の合成DNAをプライマーとしてPCRを行ないyggB遺伝子のORFを欠失した断片を取得した。
一方、yggB遺伝子の変異処理は以下のようにして行った。まず、プラスミドpL5kはyggB遺伝子以外の領域を若干含んでいるため、pL5kをXhoIとSalIで処理し、セルフライゲーションすることにより、プラスミドpL5kXSを得た。なおSalI認識部位は、配列番号5の塩基配列上には存在しないが、pBS3のマルチクローニングサイトに存在している。得られたpL5kXS約10μgを500mMリン酸緩衝液、400mMヒドロキシルアミン、1mM EDTA (pH6.0)に溶解し、75℃で30分から90分処理することにより変異を導入した。変異導入後のプラスミドは、SUPREC-02(タカラバイオ)で脱塩した後、実施例6記載の方法でATCC13869ΔyggB株に導入し、Km25μg/mlを含むCM2B培地で形質転換体を選択した。また、対照として変異処理前のpL5kXSについてもATCC13869ΔyggB株に導入した。出現した形質転換体を、CM2BGU2培地(実施例3記載のCM2B培地にグルコース10g/Lと15g/LのUreaを含む)2mlの液体培地に接種し、31.5℃で5時間しんとう培養したのち、グルタミン酸濃度を定量した。
表11に、ATCC13869ΔyggBを変異処理したpL5kXSで形質転換した株をCM2BGU2培地にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間60分と90分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中には、1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積するクローンが3クローンが存在していた。なお、培地中にもともと含まれていたグルタミン酸は0.16g/Lであり、ATCC13869ΔyggB/pL5kXS(変異処理なし)
のグルタミン酸蓄積量は0.31g/Lであった。
表12に、ATCC13869ΔyggBを変異処理したpL5kXSで形質転換した株をCM2BGU培地(Ureaが1.5g/Lである以外はCM2BGU2培地と同組成)にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間90分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中に、1g/L以上のL-グルタミン酸を蓄積するクローンが1クローン存在していた。
22型変異は、437番目のプロリンをセリンに置換する変異であり、例えば配列番号5の2745位のCをTに置換する変異である。また、本変異は、3060位のCをTに置換する変異を伴っている。この変異型yggB遺伝子を配列番号73に、該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号74に示す。
(13−2)で得られた新規変異型yggB遺伝子をコリネ型細菌に導入する。導入方法は、実施例6に記載された方法でpBS4Sに変異型遺伝子を導入し、ATCC13869の染色体上の野生型のyggB遺伝子と置換した。この新規変異型遺伝子を導入した株と親株のATCC13869株を実施例2と同様の方法で培養を行う。培養終了後、培養液中に含まれるL−グルタミン酸の量を公知の方法で測定し、変異導入株がL-グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でL−グルタミン酸生産能の向上したyggB変異株を取得することが出来る。
(14−1)固体培地における4-フルオログルタミン酸感受性
yggB変異によってL-グルタミン酸の生産能が向上している株では、L-グルタミン酸アナログ感受性が低下していることが予測された。そこで、yggB変異によるL-グルタミン酸のアナログとして、4-フルオログルタミン酸に対する感受性の変化を検討した。実施例4記載の最少培地に、NaOHでpH6.7に調整しフィルター滅菌した4−フルオログルタミン酸を終濃度7.5mMとなるように添加した。ATCC13869株、ATCC13869-L30株、ATCC13869-A1株をCM-Dex培地に塗布して一夜培養した後集菌し、滅菌した0.85%のNaCl溶液で洗浄し、図6上部に記載の菌濃度となるように希釈してプレートにスポットした。プレートは31.5℃で培養し、その経時変化を図6に示した。4-フルオログルタミン酸を無添加の条件では、ATCC13869株が最も生育が速いのに対し、4-フルオログルタミン酸添加条件ではATCC13869株の生育が抑えられ、ATCC13869-L株およびATCC13869-A1株の方が生育が良好であることが示された。
実施例4記載の最少培地(ただし寒天を含まない)に、NaOHでpH6.7に調整しフィルター滅菌した4−フルオログルタミン酸を終濃度1.25mM, 2.5mM, 5mM, 10mM, 20mMとなるように添加した。ATCC13869株、ATCC13869ΔyggB株、ATCC13869-L30株、ATCC13869-A1株をCM-Dex培地に塗布して31.5℃で一夜培養した後集菌し、滅菌した0.85%のNaCl溶液で洗浄し、液体培地に接種し31.5℃にて振とう培養した。各菌株において、4-フルオログルタミン酸を無添加の培地でのOD660の値が1に到達した時点で培養を終了し、培養液を適当に希釈してCM-Dexプレートに塗布した。翌日出現したコロニー数を計測し、液体培養終了時の生菌数とした。4−フルオログルタミン酸無添加区の生菌数を1として、4−フルオログルタミン酸添加による相対生菌数の変化を図7に示した。ATCC13869-A1株およびATCC13869-L30株では、4−フルオログルタミン酸に対する感受性が低下(4フルオログルタミン酸耐性が向上)していることが明らかとなった。
これらの結果から、4-フルオログルタミン酸等、グルタミン酸の構造類縁体の感受性を指標としたスクリーニングによっても本発明のyggB変異株が取得できることが示された。
まず、ATCC13869-L株のodhA遺伝子に表14に示す変異を導入した株を構築した。なお、表14では、配列番号43の塩基番号2528〜2562に相当する領域の配列を示した。また、表15では配列番号44のアミノ酸番号696〜707に相当する領域の配列を示した。
配列番号45の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA8株を構築するには以下のようにすればよい。まず配列番号53と配列番号54に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、odhA断片を調整する。得られたodhA断片をBamHI処理して、タカラバイオ製Mutan-Super Express Kmに付属のプラスミドpKF19mのBamHI部位にクローニングした後、5'末端がリン酸化された配列番号55の合成DNAとMutan-Super Express Kmに添付されているセレクションプライマーを用いてPCRを行い、得られたPCR産物でsup0のE.coli例えばMV1184株を形質転換することで変異型odhA断片を含むプラスミドを構築する。次にこの断片をBamHIで切り出し、pBS4SのBamHI部位に挿入することで変異導入用プラスミドが構築できる。このプラスミドを用いて実施例1記載の方法と同様にしてATCC13869-L株を形質転換し、染色体に変異導入用プラスミドが挿入された株を取得する。次に、これらの染色体にプラスミドが挿入された株から、スクロースに耐性を示し、かつカナマイシンに感受性を示す株を分離する。さらにodhA遺伝子の配列を確認し、目的フレームシフトが導入された株を選択することによりodhA遺伝子が欠損したL30sucA8(odhA8)株が構築できる。
配列番号47の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA801株の取得には、5'末端がリン酸化された配列番号55の合成DNAの代わりに5'末端がリン酸化された配列番号56の合成DNAを用いて上記方法を適用すればよい。
配列番号49の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA805株の取得には、5'末端がリン酸化された配列番号55の合成DNAの代わりに5'末端がリン酸化された配列番号57の合成DNAを用いて上記方法を適用すればよい。
配列番号51の塩基配列を有する変異型odhA遺伝子が導入されたL30sucA77株の取得には、5'末端がリン酸化された配列番号55の合成DNAの代わりに5'末端がリン酸化された配列番号58の合成DNAを用いて上記方法を適用すればよい。
L30sucA8株のodhA遺伝子はフレームシフト変異であるために、αKGDH活性を有さない。しかし、L30sucA801株、L30sucA805株、L30sucA77株はodhA遺伝子に欠失があるものの、フレームシフトが起こらない変異となっており、αKGDH活性を有しているが活性は非改変株より低下している。(データは示さず)
これらのodhA改変株のL−グルタミン酸生産能を、坂口フラスコを用いた培養を行うことにより検証した。表14に示した株をCM-Dex寒天培地で31.5℃で一昼夜培養を行い、フラスコ培地(グルコース60g/l、硫安22.5g/l、KH2PO4 1g/l、MgSO4・7H2O 0.4g/l、FeSO4・7H2O 0.01g/l、MnSO4・4-5H2O 0.01g/l、ビタミンB1 200μg/l、大豆蛋白加水分解液0.48g/l、ビオチン300μg/l、KOHを用いてpH8.0に調整)20mlに1/6プレート分の菌体を接種し、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム1gを添加した後、31.5℃、速度115rpmで振とう培養を行った。培養開始19時間目のL−グルタミン酸蓄積を表16に示した。odhA改変株の中には、ATCC13869-L株とほぼ同等のL−グルタミン酸蓄積のものも含まれていたが、sucA801, sucA805,sucA77株はsucA8株よりも高いグルタミン酸蓄積を示した。これらの結果から、yggB遺伝子の変異と共にodhA遺伝子に変異を導入することによって、さらにL−グルタミン酸収率が向上することを見出した。
8型変異を有するyggB変異株よりodhA欠損株を構築し、odhA欠損のみを有する株と比較培養を行なった。まず、odhAを完全欠損するためのプラスミドを構築した。ATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列番号77と配列番号78の合成DNAを用いてPCRを行い、sucA遺伝子の上流側断片を調製した。続けて、ATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列番号79と配列番号80の合成DNAを用いてPCRを行い、sucA遺伝子の下流側断片を調製した。次に、上流側断片と下流側断片を等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号81と配列番号82の合成DNAを用いてPCRを行い、odhAを欠失した遺伝子断片を調製した。得られたPCR断片をBamHIで処理した後、実施例1で構築したpBS4Sにクローニングした。こうして得られるプラスミドをpBSΔsucA47とした。
pBSΔsucA47を実施例6記載の方法と同様にATCC14067株またはATCC14067yggB8株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体DNAを調製し、これを鋳型として配列番号77および配列番号80の合成DNAを用いてPCRを行い、odhA領域が欠損している株を選択した。こうして構築したodhA欠損株をそれぞれATCC14067ΔodhA株およびATCC14067ΔodhA yggB8株とした。
構築したATCC14067ΔodhA株およびATCC14067ΔodhA yggB8株を実施例3記載の方法で培養した結果を表17に示した。yggB8変異によってodhA変異株のL-グルタミン酸収量を向上できることが明らかとなった。
実施例3で構築した、yggBにIS挿入変異を有する2A-1R株より、symA(suppressor of ygg mutation A)遺伝子を欠損した株を構築し、2A-1R株と比較培養を行なった。ATCC13869株のNCgl1867遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号86および87に記した。まず、symA遺伝子を完全欠損するためのプラスミドを構築した。ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号88と配列番号89の合成DNAを用いてPCRを行い、symA遺伝子の上流側断片を調製した。続けて、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号90と配列番号91の合成DNAを用いてPCRを行い、symA遺伝子の下流側断片を調製した。次に、上流側断片と下流側断片を等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号88と配列番号91の合成DNAを用いてPCRを行い、symA遺伝子を欠失した遺伝子断片を調製した。得られたPCR断片をBglIIで処理した後、実施例1で構築したpBS4Sにクローニングした。こうして得られるプラスミドをpBSΔsymAとした。
pBSΔsymAを実施例6記載の方法と同様に2A-1R株の染色体に挿入した後、脱落させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体DNAを調製し、これを鋳型として配列番号88および配列番号91の合成DNAを用いてPCRを行い、symA領域が欠損している株を選択した。こうして構築したsymA欠損株を2A-1RΔsymA株とした。
構築した2A-1RΔsymA株および親株の2A-1R株を実施例3記載の方法で培養した結果を表18に示した。symA遺伝子の欠損によって、変異型yggB遺伝子を有する株のグルタミン酸生産能を向上できることが明らかとなった。
コリネ型細菌の野生型yggB遺伝子を含むプラスミドにはpL5kを用いた。pL5kは、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株の染色体DNAをSau3AIで部分分解して得られたDNA断片を、pVK9のBamHI部位に挿入して得たプラスミドである。pVK9のBamHI部位に挿入されているDNA配列を配列番号5に、yggB遺伝子のコード領域を配列番号5 の塩基番号1437-3035番目に示す。なお、pVK9は、pHSG299(タカラバイオ)のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。pL5kと同様の構成のプラスミドは、配列番号59と配列番号60の合成DNAをプライマーとして、ATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、得られた増幅産物をBamHIで処理してpVK9のBamHI部位に挿入することによっても構築できる。
(2−1)ビオチン制限培養での効果確認
実施例18で構築した野生型yggB遺伝子増強株および対照株をそれぞれ3クローン選択し、20mlの種培養培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培養液2mlを、ビオチンを含まない20mlの主培養培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O
0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。糖を完全に消費したのち、培地中のグルタミン酸濃度を測定した。その結果、ベクター導入株に比しyggB増強株(ATCC13869/pL5k)ではグルタミン酸の培地中の蓄積が向上していることが示された。(表19 OD620は菌体量、GH(g/L)はグルタミン酸生産量を示す)
実施例18で構築した野生型YggB増強株および対照株をそれぞれ3クローン選択し、20mlの種培養培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培養液2mlを、20mlの主培養培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後2時間後
に、Tween40を終濃度5g/Lとなるように添加し、培養を継続した。糖を完全に消費したのち、培地中のグルタミン酸濃度を測定した。その結果、ベクター導入株に比し野生型YggB増強株(ATCC13869/pL5k)ではL−グルタミン酸の培地中の蓄積が向上していることが示された。(表20 OD620は菌体量、GHはL−グルタミン酸生産量を示す。)
実施例18で構築した野生型yggB遺伝子増強株および対照株をそれぞれ3クローン選択し、20mlの種培養培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち、培養液2mlを、20mlの主培養培地(グルコース80g/l, 硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4〜5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物(T-N)0.48g/l, KOHを用いてpH8.0に調整:オートクレーブ115℃10分)に接種した後、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを1g加え、31.5℃で振とう培養した。培養開始後2時間後に、ペニシリンGを終濃度0.5U/mlとなるように添加し、培養を継続した。糖を完全に消費したのち、培地中のL−グルタミン酸濃度を測定した。その結果、ベクター導入株に比しYggB導入株(ATCC13869/pL5k)ではL−グルタミン酸の蓄積が向上していることが示された。(表21)
Claims (12)
- L−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって、
変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してL−グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって
前記変異型yggB遺伝子は、(i)、(i’)、(i’’)または(ii)の変異が導入された、コリネ型細菌:
(i)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419−533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419−529の領域の欠失、
(i’)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419−533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419−529の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入、
(i’’)配列番号6、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号419−533の領域もしくは配列番号62のアミノ酸番号419−529の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異、
または
(ii)配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列のアミノ酸番号1−23、86−108、及び110−132からなる群から選ばれる領域における1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入。 - 前記(i’’)の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列に
おいて、424位及び/または437位のプロリンを他のアミノ酸に置換する変異である
、請求項1に記載のコリネ型細菌。 - 前記(ii)の変異は、フレームシフトを伴うことなく導入された、請求項1に記載のコリネ型細菌。
- 前記(ii)の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列において、100位のアラニン及び/または111位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異である
、請求項1に記載のコリネ型細菌。 - 前記(ii)の変異は、配列番号6、62、68、84もしくは85のアミノ酸配列におい
て、14位のロイシンと15位のトリプトファンの間に1又は数アミノ酸を挿入する変異である、請求項1に記載のコリネ型細菌。 - 前記変異型yggB遺伝子が、下記(a)〜(n)より選ばれる変異型yggB遺伝子である請求項1〜5のいずれか一項に記載のコリネ型細菌:
(a) 配列番号8のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b) 配列番号8のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号20のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d) 配列番号20のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号22のアミノ酸配列をコードするDNA、
(f) 配列番号22のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号24のアミノ酸配列をコードするDNA、
(h) 配列番号24のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号64のアミノ酸配列をコードするDNA、
(j) 配列番号64のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k) 配列番号70のアミノ酸配列をコードするDNA、
(l) 配列番号70のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m) 配列番号74のアミノ酸配列をコードするDNA、
(n) 配列番号74のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。 - 前記変異型yggB遺伝子の導入により、L−グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
- さらに(i)のsymA遺伝子が不活化するように改変された、請求項1〜7のいずれか一項
に記載のコリネ型細菌。
(i) 配列番号86の塩基番号585〜1121の塩基配列を含むDNA。 - さらにα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、請求項1
〜8のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。 - コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、請求項1〜9のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し、L−グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体からL−グルタミン酸を回収することを特徴とするL-グルタミン酸の製造法。
- 下記(a)〜(n)より選ばれる変異型yggB遺伝子:
(a) 配列番号8のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b) 配列番号8のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号20のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d) 配列番号20のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号22のアミノ酸配列をコードするDNA、
(f) 配列番号22のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号24のアミノ酸配列をコードするDNA、
(h) 配列番号24のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号64のアミノ酸配列をコードするDNA、
(j) 配列番号64のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(k) 配列番号70のアミノ酸配列をコードするDNA、
(l) 配列番号70のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m) 配列番号74のアミノ酸配列をコードするDNA、
(n) 配列番号74のアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、コリネ型細菌に導入することにより、過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
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