KR101059280B1 - 갈근 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 함유하는 면역 활성 증강을 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 대식세포 Raw 264.7 세포내에서 면역증강인자인 NO, TNF-α의 분비능 생성 증가 효과, 비장세포 증식 효과, 사이토카인 발현 증가 효과 및 선천성면역에 관계된 리셉터인 TLR-4(Toll-like receptor 4)의 면역세포 내에서 활성 증진 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 로타바이러스로 유도한 세포내 면역 활성 증진 효과 및 대장균 감염을 유도한 동물모델의 면역 증강 효능이 우수하여 면역저하증의 예방, 억제 및 치료에 우수한 면역증강 효능을 갖는 식품, 의약품 및 사료 첨가제로서 유용하다.

갈근 추출물, 면역 활성 증강, 사이토카인, TLR-4(Toll-like receptor 4), 로타바이러스, 대장균

Description

갈근 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물{Composition comprising the extract of Puerariae Radix for immune activity}

본 발명은 갈근 추출물을 함유하는 면역 활성 증강을 위한 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Richard A. Goldsby, et al., KUBY Immunology, 2000

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[문헌 3] Abul K. Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology 6th, pp.298-301, 2007

[문헌 4] Eisenberg et al., N. Eng. J. Med., 328, pp.246-252

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면역계는 자연저항, 비특이성 면역체계 및 특이성 면역체계로 구분할 수 있다. 자연저항(1차 방어선)이란 미생물을 위시한 모든 침입자들을 그들의 종류에 관계없이 막아내는 해부생리학적 요소들을 말하며, 비특이적 면역(2차 방어선)은 자연저항을 돌파하여 체내로 들어온 침입자들을 제거하는 식세포로 구성된 방어체계를, 그리고 특이성 면역계(3차 방어선)는 림프구들로 구성된 면역체계를 말하는데, 이중 특이성 면역계는 기억능 그리고 자기와 비자기를 구분할 수 있는 능력을 지닌 고도로 발달한 면역체계이다 (Richard A. Goldsby, et al., KUBY Immunology, 2000).

백혈구는 2차 또는 3차 방어선을 구성하여 1차 방어선을 돌파하여 체내에 들어온 이물을 담당하게 되며, 세균, 바이러스 감염 또는 염증 반응 시, 대식세포 및 림프구 활성의 조절은 의약품의 치료 효과의 결정에 있어서 중추적인 역할을 한다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 일산화산소(NO)를 생성하여 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 리포다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산하여, NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 활성화된 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O₂-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)와 같은 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 및 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생산은 비특이적 면역에 있어서 중요한 세포독성 및 세포활성억제기작이다. 대식세포에 의한 ROS 및 NO의 생성에 어떤 천연화합물이 영향을 미치는지 많은 연구들이 수행되어 왔다. 대식세포는 항원을 제시하거나(antigen-presenting), 종양을 없애거나(tumoricidal) 미생물세포를 죽이는(microbicidal) 세포로서, 세포매개 (cell-mediated) 또는 체액성 면역(humoral immunity)에 중심적인 역할을 하는 조절세포로, 활성화된 대식세포에서 생산되는 NO는 비특이적 숙주방어기작인 대식작용, 그리고 세균 및 암세포의 증식억제활성을 보인다 (Dawson T.M., et al., Annu. Rev. Med, 47, pp.219-227, 1996).

대식세포는 많은 라이소솜을 가지고 있고 이들은 산성가수분해효소와 과산화 효소를 함유하고 있다. 또한 유리면과 플라스틱 표면에 강하게 부착하는 성질이 있으며 미생물이나 종양세포 등을 활발하게 탐식한다. 상기 세포는 IFN-γ등의 사이토카인 수용체를 가지고 있다. 이들은 보체성분, 인터페론, 인터루킨-1 및 종양괴사인자 같은 사이토카인을 생산하며 T-세포로부터 생산되는 여러 가지 사이토카인에 의해 기능이 증강될 수 있다. 백혈구의 일종인 T-세포는 혈중 소림프구의 약 70%를 차지한다. T-세포는 흉선에서 분화되며 T-세포항원수용체(TCR)를 갖는다. 말초혈액 T-세포는 CD4 양성인 T_H 세포(helper T-cell)와 CD8 양성인 T_C 세포(cytotoxic T-cell)로 나뉘며, CD4+ T_H 세포는 MHC II 급(class) 분자에 결합된 항원을 인식하여 활성화되며, B세포를 도와서 항체생성을 가능하게 하거나 다른 T 세포의 기능을 돕는다. CD4+ T_H 세포는 다시 그들이 생산하는 사이토카인을 근거로 T_H1 및 T_H2로 분류할 수 있다. 실험용 생쥐(mouse)의 T_H1세포는 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-감마(IFN-γ) 등을 분비하는 반면에 T_H2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 등을 분비한다. 그러나 사람에 있어서는 IL-2, IL-6, IL-10, IL-13의 생성이 엄격히 구분되지 않는다. T_H1세포는 세포면역반응에 관여하며 세포독성 및 염증성 반응을 활성화한다. T_H2 세포에서 생성된 사이토카인은 항체형성을 촉진시키는데, 특히 IgE의 생성을 도우며 호산구의 증식과 기능을 증강시키므로 T_H2 사이토카인은 항체생성 및 알레르기 반응에서 흔히 발견된다. T_H1 과 T_H2 사이토카인은 서로간 억제기능을 가지고 있고, 동물의 감염증에서 항 IL-4 항체와 항 IFN-γ항체로 질환의 경과를 변화시킬 수 있음이 밝혀졌으며, 류마티스 관절염의 환자에 IFN-γ를 주사하여 증상의 호전이 관찰된 예도 있다 (Richard A. Goldsby, et al., KUBY Immunology. 2000).

방사성치료 또는 화학치료와 같은 항암 치료 시 조혈모세포들이 손상을 입게 되어 조혈세포와 면역세포들이 감소되고, 이로 인해 종종 조혈과 면역작용의 형성에 장애가 발생한다. 결과적으로, 환자들은 빈혈과 림프구 감소증, 혈소판 감소증 또는 과립백혈구 감소증을 경험하게 되며, 이것은 심각하고 치명적인 감염을 일으키고 환자들의 사망률을 높이게 된다. 임상적으로, 항암치료나 골수이식후에 골수성장인자인 G-CSF, GM-CSF, IL-1 ∼ 12, M-CSF 및 EPO 등을 사용하고 있으며, 이들 성장인자는 서로 상승작용을 일으키면서 CFU 와 BFU에서부터 세포 분화 및 생성을 촉진시키고, 세포의 이동, 식세포 작용, 슈퍼옥사이드 생성, 항체 자극에 따른 백혈구의 세포 독작용 등도 증가시킨다 (Abul K. Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology 6th, pp.298-301, 2007).

현재 전 세계적으로 면역력 증강을 통해 건강을 증진시키고자 많은 한약재가 사용되고 있다. 미국에서 한약재들은 의약품뿐만 아니라 건강기능성 식품으로도 인정받고 있다. 아시아에서뿐만 아니라 미국인구의 3분의 1이 적어도 한 번은 대체의약의 형태로 한약재를 복용하고 있음이 알려져 있다 (Eisenberg et al., N. Eng. J. Med., 328, pp.246-252). 한약재 유래의 약품은 질병의 예방과 치료를 위한 활성성분의 동정에 초점이 맞추어져 왔다. 서양주목의 수피로부터 얻어진 항암제인 탁솔(Taxol)이 그 대표적인 예이다. 현대 서양 약물치료는 대부분 특정 생화학적 경로를 표적으로 하는 정제된 화합물이나, 우리나라가 과거부터 사용한 한약재는 다양한 화합물의 복합물이며 부작용이 거의 없이 치료효과를 나타낸다.

동의보감 등 과거 한의학 서적에 한약재들에 대한 효능은 언급되어 있지만, 문헌에 의한 정보가 현재의 특정 질병이나 증상과 접목돼 있는 것은 아니다. 또한 한약재의 성분 중 어느 성분이 직접적인 효과를 내는지는 밝혀지지 않았다. 동의보감이나 중의학 대사전에 수록된 한약재들 중 면역증강효과가 있는 것으로 알려져 있는 한약재들은 현대의 과학적인 연구에 의하여 면역증강효능에 대한 검증이 요구된다.

갈근(葛根; Puerariae Radix)은 콩과(Leguminosae)의 덩굴나무인 칡(Pueraria lobata (Willd.) Ohwi.)의 뿌리로 우리나라 전역의 산기슭 양지에서 자라며, 일본, 중국에 분포한다(배기환, 한국의 약용식물, 교학사, p.260, 2000). 갈근의 성분은 푸에라린(puerarin), 다이드제인(daizein), 다이드진(daidzin) 등의 플라보노이드(flavonoid)계 화합물과 소야사포닌(soyasaponin) 등의 사포닌(saponin) 및 전분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다 (생약학교재편찬위원회, 생약학, 동명사, p.100-102, 2006).

한방에서 이 약물의 성미는 감(甘), 신(辛), 량(凉)하고, 비(脾)와 위(胃)에 귀경하고, 해기퇴열(解肌退熱), 투발마진(透發痲疹), 생진지갈(生津止渴), 승양지사(升陽止瀉)의 효능이 있어 외감표증(外感表證), 마진불투(痲疹不透), 열병구갈(熱病口渴), 열사열리(熱瀉熱痢), 비허설사(脾虛泄瀉) 등의 치료에 이용되고 있으나(한국생약학교수협의회, 본초학, 사단법인 대한약사회, pp.107-110, 1995), 상기 문헌 어디에도 갈근추출물이 면역 증강 효과에 효과적이라는 어떠한 개시도 된 바가 없다.

따라서, 현대 객관적인 면역 활성 지표들을 이용하여 한약재로 사용되는 천연물 중에 면역증강효과 및 그 작용기전을 밝히고자 하였다.

이에 본 발명자들은 300여종의 천연물 유래 추출물로부터 면역 증강 효과를 갖는 물질을 확인하던 중 본 발명의 갈근 추출물이 대식세포 Raw 264.7 세포내에서 면역증강인자인 NO, TNF-α의 분비능 생성 증가 효과, 비장세포 증식 효과, 사이토카인 발현 증가 효과 및 선천성면역에 관계된 리셉터인 TLR-4(Toll-like receptor 4)의 면역세포 내에서 활성 증진 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 로타바이러스로 유도한 세포내 면역 활성 증진 효과 및 대장균 감염을 유도한 동물모델의 면역 증강 효능이 우수함을 밝혀 본 발명의 갈근 추출물이 면역저하증의 예방, 억제 및 치료에 우수한 면역증강 효능을 갖는 식품, 의약품 그리고 사료의 성분으로 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 동물사료 첨가제를 제공한다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

본 발명의 갈근 추출물은 하기와 같은 제조공정으로 제조될 수 있다.

건조시킨 갈근을 통상적인 추출방법에 따라 제조할 수 있으며, 건조된 갈근 건조 중량의 1 내지 20배, 바람직하게는 5 내지 15배 부피의 물, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물을 가하여 0.5 내지 10시간, 바람직하게는 2 내지 5시간씩, 70℃ 내지 100℃로, 1 내지 10회, 바람직하 게는 2 내지 5회 반복하여 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출 및 환류냉각 추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 열수 추출한 후, 추출액을 여지로 감압 여과한 다음, 여과액을 농축하여 동결건조한 후 본 발명의 갈근 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 갈근 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 면역 증강용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 약학조성물은 화학요법 및 방사선요법과 같은 항암요법에 의한 면역기능의 저하 또는 골수이식 후 면역저하로 인한 질환, 면역계손상으로 인한 에이즈 및 면역기능의 저하로 인한 암질환등과 같은 면역저하증의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 상기 갈근 추출물을 함유하는 면역증강용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 면역력 증강 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다. 본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한점이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클 로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 상기 갈근 추출물을 함유하는 면역증강용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

상기의 동물사료 첨가제용 조성물은 20 내지 90% 고농축액 이거나 분말 또는 과립형태일 수 있다.

본 발명의 동물사료 첨가제용 조성물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈마리 추 출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 조성물은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 동물사료 첨가제용 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 조성물은 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당업계 에 잘 알려진 바와 같이 조성물의 투여 형태는 이들의 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 화합물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물이 동물사료 첨가제로 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물(랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물(예, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물(예, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축 (예, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금 에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 포함한 동물용 사료 배합 방법은, 상기 조성물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1kg당 약 1g 내지 100g의 양으로 혼입한다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이 때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

본 발명의 갈근(Puerariae Radix) 추출물은 대식세포 Raw 264.7 세포내에서 면역증강인자인 NO, TNF-α의 분비능 생성 증가 효과, 비장세포 증식 효과, 사이토카인 발현 증가 효과 및 선천성면역에 관계된 리셉터인 TLR-4(Toll-like receptor 4)의 면역세포 내에서 활성 증진 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 로타바이러스로 유도한 세포내 면역 활성 증진 효과 및 대장균 감염을 유도한 동물모델의 면역 증강 효능를 나타내는바, 면역 저하 및 면역계가 손상된 면역저하증의 예방, 억제 및 치료에 우수한 면역증강 효능을 갖는 식품, 의약품 및 사료 첨가제로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 갈근 추출물의 제조

갈근을 자연 건조시킨 후 잘게 세절하여, 건조된 갈근 1kg에 증류수 10ℓ를 가하여 100℃에서 3시간 동안 가열추출을 3회 반복한 후, 진공 여과하여 여액을 얻고, 여과액을 감압농축 (EYELA사, N-1000, 일본) 및 동결건조하여 갈근 추출물 228g을 수득하였다.

실험예 1. NO 분비 및 TNF-α 분비의 증가 효과

NO 분비효과를 측정하기 위하여 아질산 이온(NO₂-)의 농도는 NaNO₂를 기준으로 그리스 시약(Griess reagent)을 이용하여 발색정도를 하기와 같이 측정하였다.

RAW 264.7 세포(ATCC The Global Bioresource Center^TM)를 96웰 마이크로플레이트에 웰 당 1×10⁵ 씩 분주하고, 50, 100, 500 μg/㎖ 농도로 상기 실시예 1에서 수득한 갈근 추출물을 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양한 후, 상층액을 취하여, 100㎕의 세포 배양 상층액에 동량의 그리스 시약(Griess reagent, 0.1% (w/v)N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride + 1% (w/v) sulfanilamide in 5%(v/v)phosphoric acid)을 넣고 혼합한 다음, 상온에서 10분 두었으며, 그 후 울트로스펙 4000 스펙트로포토메터 (Pharmacia Biotech사, Uppsala, Sweden)를 사용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다 (Nakai M., et al., Dig Dis Sci., Sep;50(9), pp.1669-1676, 2005).

또한, 같은 조건에서 50㎕의 세포 배양 상층액을 취하여 염증 매개물질(inflammatory mediator)인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 ELISA 검사를 실시하였다 (R&D Systems Quantikine Mouse TNF-α/TNFSF1A kit; Vilcek J., et al., J. Biol. Chem., 266, p.7313, 1991).

실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이 RAW 264.7세포에서 아질산 이온(NO₂ ^-)의 농도가 대조군 대비 4.2배 증가하였고, 양성대조군으로 사용한 LPS 단독 처리군과 유사한 증가를 나타내어, 이를 통해 갈근 추출물이 NO 분비를 증가시킴을 확인할 수 있었으며, 또한, RAW 264.7세포에서 염증 매개물질(inflammatory mediator)인 TNF-α가 대조군 대비 5.1배 증가하여, 양성대조군으로 사용한 LPS 단독 처리군과 유사한 증가효과를 나타냄에 따라, 갈근추출물은 측정된 TNF-α와 NO 분비를 모두 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

실험예 2. 비장세포 증식 효과

갈근 추출물이 세포 증식에 영향을 주는지 알아보기 위해 C57BL/6N 마우스로 부터 비장을 취하여 분별하지 않은 비장세포를 분리한 다음, 96 웰 마이크로 플레이트에 1 x 10⁶ 비장세포를 분주한다. 상기 실시예 1에서 수득한 갈근 추출물 100μg/ml을 24시간 동안 처리하고 MTS 방법(CellTiter96™ AQueous Assay)을 통해 세포증식을 측정하였다 (Wang M., et al., Int Immunopharmacol, 4 , pp.311-315. 2004).

실험결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 갈근 추출물을 처리한 군에서 149%의 세포증식이 관찰되어 대조군(갈근 추출물을 처리하지 않은 군)보다 탁월한 증식효과를 나타내었으며, 따라서 갈근 추출물이 비장세포의 증식을 유도함을 알 수 있었다(도 2 참조).

실험예 3. 비장세포에서 사이토카인 발현 증가 효과

갈근 추출물이 비장세포(splenocyte)로부터 분비되는 T_H1 사이토카인(cytokine) 생성에 영향을 주는지 알아보기 위해, 마우스로부터 비장을 취하여 분별하지 않은 비장세포를 분리한 다음, 96 웰 마이크로 플레이트에 1 x 10⁶ 비장세포를 분주한다. 상기 실시예 1에서 수득한 갈근 추출물을 농도 의존적으로(50 및 100μg/ml) 24시간 동안 처리하고, IFN-γ ELISA 키트(mouseIFN-γ ELISA kit, BD)와 TNF-αELISA 키트(Quantikine Mouse TNF-α/TNFSF1A kit, R&D Systems)를 이용하여 사이토카인(cytokine) 분비 정도를 측정하였다.

실험결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 갈근 추출물을 처리하지 않은 대조군 과 비교하여 갈근 추출물을 처리한 군은 IFN-γ 및 TNF-a 분비능이 증가함을 알 수 있다(도 3 참조).

실험예 4. 갈근 추출물에 의해 유도된 선천성면역세포 내에서 활성 증진 효과

4-1. COX-2, IFNbeta의 유전자 발현 및 NFkB, IRF3의 활성화 효과

갈근 추출물이 선천성면역세포 내에서 활성 증진 효과를 가지는지를 연구하기 위하여, 하기와 같이 면역세포활성 지표들의 변화를 조사하였다.

COX-2와 IFNβ는 선천성면역세포인 대식세포에서 TLR4가 박테리아나 바이러스에 의하여 활성화되면 증가하는 대표적인 면역단백질이며, NF-kB와 IRF3는 TLR4에 의해 활성화되는 대표적인 전사인자 (transcription factor)들이다(Youn et al., Biochem Pharmacol, Jan 15;75(2), pp.494-502, 2008).

마우스 대식세포(macrophage) 1 x 10⁵ 세포에 COX-2-promoter, IFNβ-promoter, NF-kB binding site, IRF3 binding site를 각각 가진 루시퍼라제 리포터 플라스미드(luciferase reporter plasmid)를 주입한 후 상기 실시예 1에서 수득한 갈근 추출물을 농도 의존적으로(100 및 500μg/ml) 8시간 처리하였다. 세포추출물을 얻어 발광효소 유전자 분석 키트 (luciferase reporter assay system^TM, Promega Co., Madison, WI) 를 사용하여 COX-2와 IFNβ의 유전자 수준에서의 발현과 NF-kB, IRF3의 활성화를 각각 측정하였다.

실험결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이 갈근 추출물은 각각 100 μg/㎖, 500 μg/㎖에서 농도 의존적으로 COX-2, IFNβ의 발현 및 NF-kB, IRF3의 활성화를 증가시킴을 알 수 있는데, 이러한 결과는 갈근 추출물이 선천성면역에 관련된 전사인자의 활성의 증가 및 면역단백질의 발현을 증가시켜 선천성면역세포의 활성화 역시 증가시키는 것을 알 수 있다(도 4 참조).

4-2. 면역세포 활성 증가에 따른 TLR-4 활성화 지표 측정

상기의 결과를 토대로, 갈근 추출물에 의한 면역세포 활성 증가 효과가 TLR-4 활성화를 경유한 것인지를 조사하였다.

리간드 결합에 따른 TLR-4의 활성화는 어댑터분자들의 세포내 클러스터링을 유발한다. 이는 하위신호전달분자들을 활성화시켜 면역매개물질의 생성을 촉진한다. TLR-4의 주요한 어댑터분자는 MyD88과 TRIF가 있으며, 각각 MyD88-의존적, MyD88-비의존적인 하위신호전달경로를 특이적으로 활성화시키며 하위신호전달분자는 공통적인 분자들도 있으나, 각 경로에 특이적인 kinase, 전사인자도 존재하여 특이적인 타겟 유전자들의 발현을 유도하기도 한다 (Akira S. et al., Nat. Rev. Immunol, 4(7), pp.499-511, 2004).

마우스 대식세포(macrophage) 1 x 10⁵ 세포에 COX-2-promoter 루시퍼라제 리포터 플라스미드(luciferase reporter plasmid)와 TLR4(Toll-like receptor 4), TRIF, MyD88에 대한 각각의 우성-음성 돌연변이(dominant-negative mutant)를 주입한 후 상기 실시예 1에서 수득한 갈근추출물을 500μg/ml 8시간 처리하였다. 세포추출물을 얻어 발광효소 유전자 분석 키트 (luciferase reporter assay system^TM, Promega Co., Madison, WI)를 사용하여 COX-2 발현정도를 측정함으로써 각각의 우성-음성 돌연변이(dominant-negative mutant)가 갈근 추출물에 의한 면역세포 활성 증진을 억제하는지를 측정하였다.

실험결과, 도 5에서 나타낸 바와 같이 갈근 추출물에 의한 COX-2 발현은 TLR-4의 우성-음성 돌연변이(dominant-negative mutant)에 의하여 크게 감소하였으며, TRIF 또는 MyD88 역시 우성-음성 돌연변이(dominant-negative mutant)에 의하여 크게 감소함을 알 수 있는데, 이러한 결과는 갈근 추출물에 의한 면역세포활성화에 TLR-4 및 TLR-4의 어댑터분자인 TRIF, MyD88이 관여함을 보여줌으로서 궁극적으로, 갈근 추출물에 의한 면역세포 활성화 효능이 TLR-4의 활성화를 매개한 것으로 볼 수 있다(도 5 참조).

4-3. TLR-4의 대표적인 신호전달체계의 의한 면역세포 활성화 측정

갈근 추출물에 의해 활성화되는 세포내 TLR-4 신호전달체계를 규명하기 위하여 각 신호체계에 대한 억제제(inhibitor)를 처리한 후 갈근 추출물의 효능 변화를 하기와 같이 측정하였다.

마우스 대식세포(macrophage) 1 x 10⁵ 세포에 COX-2-promoter 루시퍼라제 리포터 플라스미드(luciferase reporter plasmid)를 주입한 후 상기 실시예 1에서 수득한 갈근추출물을 농도 의존적으로(100 및 500μg/ml) 8시간 처리하였다. 실험에 따라 갈근 추출물 처리 전에 NF-kB 및 p38 경로 저해제를 처리하였다. 세포추출물을 얻어 발광효소 유전자 분석 키트 (luciferase reporter assay system^TM, Promega Co., Madison, WI)를 사용하여 COX-2 발현정도를 측정함으로써 갈근 추출물에 의한 면역세포 활성 증진을 억제하는지를 측정하였다. TLR-4의 대표적 신호전달체계인 NF-kB와 p38 경로가 갈근 추출물에 의한 면역세포 활성화에 기여하는지를 측정하였다.

실험결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 갈근 추출물에 의한 면역세포활성화는 NF-kB의 저해제인 TPCK 처리에 의한 억제 및 NF-kB의 초-억제제(Super-repressor)인 IkBa 돌연변이(mutant)에 의해 억제되는 결과를 보였다(도 6 참조). 이러한 결과는 갈근 추출물에 의한 TLR-4 활성화가 NF-kB 경로의 활성화를 유발함을 제시할 뿐만 아니라, 갈근 추출물에 의한 면역세포활성화시에 NF-kB 경로와 더불어 p38 경로가 주요하게 활성화될 것으로 보인다.

따라서, 갈근 추출물은 면역세포를 활성화시키는 효능이 있으며, 특히 TLR-4를 활성화시킴으로써 면역세포의 활성화 및 면역반응의 증강을 유도할 가능성이 있음을 알 수 있다.

실험예 5. 갈근추출물이 로타바이러스에 의한 면역 활성 증진 효과

5-1. 갈근 추출물이 로타바이러스에 의한 장염에서 면역반응에 미치는 영향

갈근 추출물이 로타바이러스에 의한 장염에서 면역반응에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 갈근 추출물을 C57BL/6 신생 마우스(5~6일령, n=4)에 3일간 경구투여(10 mg/마우스)하고 로타바이러스(wild-type murine 로타바이러스, EC strain, 미국 스탠포드 의과대학의 Harry B. Greenberg 교수로부터 분양 받음, 국립수의과학검역원, 수입허가번호 2007-56)를 마지막 갈근 추출물 투여 다음날 감염시켜 장염을 유도한 후 바이러스(장염)에 의한 설사량 및 바이러스(장염)에 감염된 소장에서 바이러스의 양(level)을 확인하였다.

실험결과, 도 7에서 나타내는 바와 같이 갈근 추출물을 섭취한 군의 마우스는 대조군에 비하여 설사량이 줄었으며, 특히 소장에서 바이러스 NSP3 유전자의 양은 바이러스 감염 4일 후에 대조군에 비하여 갈근 추출물이 확연히 감소됨을 확인 할 수 있었다 (도 7 참조).

5-2. 갈근 추출물이 로타바이러스 특이 면역반응에 미치는 영향

갈근 추출물이 로타바이러스 특이 면역반응에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 갈근 추출물을 C57BL/6 신생 마우스(5~6일령, n=4)에 3일간 경구투여(10 mg/마우스)하고 로타바이러스(wild-type murine 로타바이러스, EC strain, 미국 스탠포드 의과대학의 Harry B. Greenberg 교수로부터 분양 받음)를 마지막 갈근추출물 투여 다음날 감염시킨 후 2주 후에 마우스의 비장을 채취하여 로타바이러스(RRV strain) 항원을 자극한 비장세포(splenocytes)와 5일간 혼합배양 후에 세포배양액을 채취하여 IFN-γ ELISA(mouseIFN-γ ELISA kit, BD)방법을 실시하였다.

실험결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 갈근 추출물을 섭취한 군의 마우스 그룹 에서 탁월하게 증가된 IFN-γ 생산을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

5-3. 갈근 추출물이 로타바이러스 감염된 마우스의 다클론성 항체(polyclonal) 자극에 미치는 영향

갈근 추출물이 로타바이러스 감염된 마우스의 다클론성 항체(polyclonal) 자극에 미치는 영향을 알아보기 위해서, 갈근 추출물을 C57BL/6 신생 마우스(5~6일령, n=4)에 3일간 경구투여(10 mg/마우스)하고 로타바이러스(EC strain)를 마지막 갈근추출물 투여 다음날 감염시킨 후 2주 후에 마우스의 비장을 채취하여 Anti-CD3항체가 코팅된 플레이트 웰(plate well) 1 x 10⁶에 배양을 한 후 IFN-γ FACS staining(1일 배양) 및 BrdU (4일 배양)를 인코퍼레이션 어세이(incorporation assay)법으로 측정하였다.

실험결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 갈근 추출물을 섭취한 마우스 그룹의 림프 장기에서 더욱 증가된 IFN-γ 생산 증가 효과 및 림프구 증식(proliferation)효과를 확인할 수 있었다(도 9 참조).

5-4. 갈근 추출물이 로타바이러스 감염 후 선천성 면역수용체의 발현에 미치는 영향

갈근 추출물을 C57BL/6 신생 마우스(5~6일령, n=4)에 3일간 경구투여(10 mg/마우스)하고 로타바이러스(EC strain)를 마지막 갈근 추출물 투여 다음날 감염시킨 후 4, 8일 후에 마우스의 장간막 림프절을 채취하여 TLR2 및 TLR4의 유전자 발현을 확인하였다.

실험결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 갈근 추출물을 경구투여 받은 그룹에서 TLR2와 TLR4의 발현이 바이러스 감염 후 4일째에 증가되었으나, 바이러스 클리어런스(virus clearance)가 이루어지는 8일째에는 양 그룹간의 TLRs 발현의 차이가 없었다. 따라서, 갈근 추출물은 TLR2와 TLR4의 발현을 증진함으로서, 로타바이러스에 대한 방어 면역을 증가시킴을 확인할 수 있다(도 10 참조).

실험예 6. 대장균 감염을 유도한 동물모델의 면역 증강 효과

갈근 추출물의 면역증강 효과를 규명하고자 대장균을 마우스의 복강 내 투여하여 갈근 추출물에 의한 대장균 세균 감염증에 의한 폐사 예방 효과를 통하여 병원성세균에 대한 방어효과 평가를 하기와 같이 수행하였다 (김종만 등, 농업과학논문집, 39, pp.1-7, 1997).

대장균 (E. coli; Escherichia coli)은 K88ab 균주(서울대학교 수의과대학)를 사용하였고, 실험동물은 6주령 수컷 ICR 마우스 30두를 샘타코(오산, 한국)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 시험은 각각 무처치 대조군, 대장균 접종 양성대조군, 갈근 추출물 투여 후 대장균 접종군인 3개군으로 각 군당 10두의 마우스를 사용하였다. 갈근 추출물을 물로 녹여 2군과 3군의 마우스에 1회 500mg/kg 용량으로 1일 간격으로 2회 경구 투여하고 24시간 후 각각의 마우스에 대장균 배양액 0.5ml (10 MLD) 씩을 복강 내 투여로 공격접종하였다. 공격접종 후 4일간 폐사수를 기록 하여 갈근 추출물의 병원성 세균 방어율을 조사하였다.

실험결과, 도 11에서 나타낸 바와 같이 대장균 접종 양성대조군(Ⅰ)의 동물들은 대장균 접종 후 1일 째 (D1)에 10두 모두 폐사하여 폐사율 100%를 보였으나, 갈근추출물을 투여한 갈근 추출물 투여 후 대장균 접종군(Ⅲ)은 대장균 투여 후 1일째 6두, 2일째 1두, 3일째 1두의 폐사가 발생하여 최종 시험 종료시점에서 모두 2두의 생존 마우스가 있어서 결과적으로, 병원성대장균에 공격접종 방어효과 실험에서 20% 생존율 보임에 따라 세균방어 효과가 있는 것으로 판단된다 (도 11 참조).

실험예 7. 경구투여 독성실험

본 실험에서는 7주령의 ICR 마우스 (오리엔트바이오, Japan)를 사용하여 갈근 추출물 투여 전 4시간 동안 마우스를 절식하고, 체중을 측정하한 후, 식품의약품안전청의 독성시험기준(식품의약품안전청, 의약품등의 독성시험기준, 식품의약품안전청고시 2005-60호, 2005)에 따라 2,000 mg/kg을 최고 용량으로 정하고, 정제 증류수로 희석하여 5 mg/kg, 50 mg/kg 및 500 mg/kg의 시험물질을 제조하였다. 투여는 임상에서의 주요 적용경로인 경구투여로 하였으며, 투여방법은 동물을 경배부 피부 고정법으로 고정한 후 금속제 경구투여용 존대를 이용하여 위내에 직접주입 하였다. 1일 1회 당일 체중을 기준으로 체중 kg당 10 ml을 투여액량으로 하여 투여하였고, 시험동물에 시험물질투여 후 2시간 동안은 사료를 제한하였으며, 이후 시험기간 동안 사료와 물은 계속 공급하였다.

식품의약품안전청의 독성시험기준 및 국제경제협력기구의 급성독성시험 가이 드라인 (OECD Guideline for the Testing Chemicals revised draft guideline 420, Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), 2001)에 독성시험기준에 따라 투여 후 처음 6시간 동안을 특별한 주의를 가지고 시험동물의 피부, 털, 눈, 점막, 호흡기, 순환기, 자율신경계, 중추신경계, 신체 운동 활동성, 행동형태 및 시험동물의 진전(tremors), 경련(convulsions), 유연(salivation), 설사(diarrhoea), 기면(lethargy), 수면(sleep), 혼수(coma) 등의 유무를 관찰하였다. 투여 후 14 일 동안 1일 1회씩 일반 임상증상을 관찰하고 시험동물의 개별 체중은 시험물질을 투여하기 전과 후, 시험기간 동안 1일 1회씩 측정하였다.

투여 후 14일째에 ICR 마우스를 에틸 에테르(ethyl ether)로 마취하고, 방혈 치사시킨 후 모든 장기를 적출하여, 개체 시험동물의 육안적 병변 관찰하고 장기의 무게를 측정하였다.

면역증강에 효과를 나타내는 갈근 추출물의 단회 경구투여에 의한 급성독성시험결과, 본 연구에 사용된 시험동물 및 조건에서 투여된 최고 용량인 2,000 mg/kg에서 사망하는 개체가 관찰되지 않았으며, 사용한 어떠한 용량에서도 식품의약품안전청의 독성시험기준에 따라 관찰된 모든 지표에서 갈근 추출물의 투여에 의한 독성은 유발되지 않았다. 결론적으로 갈근 추출물은 급성독성시험 권고 최대용량인 2,000 mg/kg에서도 독성이 없이 안전함을 확인하였다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

갈근 추출물 20 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

갈근 추출물 10 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

갈근 추출물 10 ㎎

결정성 셀룰로오스 3 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

갈근 추출물 10 ㎎

만니톨 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 2974 ㎎

Na₂HPO₄·12H₂O 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

갈근 추출물 20 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한 다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

갈근 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B₂ 0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

갈근 추출물 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B₁ 0.25 g

비타민 B₂ 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호]

RTI05-03-02

[부처명]

지식경제부

[연구사업명]

지방기술혁신사업

[연구과제명]

인수공통감염병 치료제 연구개발사업

[주관기관]

원광대학교

[연구기간]

2005년 05월 01일 ~ 2010년 04월 30일

도 1은 갈근 추출물을 처리했을 때 RAW264.7 세포에서 NO 생성 및 TNF-α의 분비 증가 효과를 나타낸 도이고,

도 2는 갈근 추출물에 의한 비장세포 증식 효과를 나타낸 도이며,

도 3는 갈근 추출물에 의한 비장세포(splenocyte)의 IFN-γ 및 TNF-a 생성 증가 효과를 나타낸 도이고,

도 4는 갈근 추출물을 RAW264.7 세포에서 농도 의존적으로 처리 했을 때, COX-2, IFNbeta의 발현 증가 및 NFkB, IRF3의 활성화 증가 효과를 나타낸 도이며,

도 5는 갈근 추출물에 의한 각각의 COX-2 발현의 TLR4 및 TLR4의 하위신호분자인 TRIF 또는 MyD88의 우성-음성 돌연변이(dominat-negative mutant)에 의한 감소 효과를 나타낸 도이고,

도 6은 갈근 추출물에 의한 COX-2 발현이 NFkB의 저해제인 TPCK, p38 경로 저해제 (SB203580)에 의한 억제 효과 및 NFkB의 Super-repressor인 IkBa 돌연변이(mutant)에 의한 감소 효과를 나타낸 도이며,

도 7은 갈근 추출물이 로타바이러스에 의한 장염 및 바이러스 유전자의 감소 효과를 나타낸 도이고,

도 8은 갈근 추출물이 비장세포에서 로타바이러스(RV)의 특이 면역반응으로 유도된 IFN-γ의 생성 증가 효과를 나타낸 도이며,

도 9는 갈근 추출물에 의한 림프장기 내에서의 IFN-γ생산 및 림프구 증식(proliferation)의 증가 효과를 나타낸 도이고,

도 10은 로타바이러스 감염을 유도한 동물모델에서 갈근추출물에 의한 선천성 면역수용체인 TLR2 및 TLR4의 발현 증가 효과를 나타낸 도이며,

도 11는 대장균 감염을 유도한 동물모델에서의 갈근 추출물에 의한 폐사율 감소 효과를 나타낸 도이다.

Claims (7)

1. 갈근(Puerariae Radix) 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 약학조성물.
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4. 갈근(Puerariae Radix) 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 건강기능식품.
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