KR101017378B1 - 발효인삼, 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브틸리스 신균주 - Google Patents
발효인삼, 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브틸리스 신균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 청국장에서 분리된 바실러스 (Bacillus) 속 미생물을 이용하여 인삼 및 홍삼을 발효시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 발효인삼 및 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브스틸리스 신균주에 관한 것이다.
본 발명에 따른 발효인삼 및 발효홍삼의 제조방법은 청국장에서 분리된 바실러스 속 미생물을 이용하여 인삼을 발효시키므로 식품으로서의 안전성이 매우 뛰어나다. 또한 다른 사포닌 성분의 함량은 유지시키면서도 진세노사이드 Rd의 함량만을 비약적으로 증진시킬 수 있다. 나아가, 발효 시 인삼 또는 홍삼만을 원료로 사용하고 다른 첨가물을 첨가하지 않아도 되므로 경제적이다.
또한, 본 발명자들이 최초로 청국장에서 동정한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)는 진세노사이드 Rd의 함량을 150% 이상 증진시킬 수 있어 알려진 청국장 유래의 바실러스 속 균주에 비하여 그 효과가 탁월하다.
발효인삼, 바실러스 서브스틸리스, 진세노사이드 Rd
Description
본 발명은 발효인삼 및 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브틸리스 신균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 청국장에서 분리된 바실러스 (Bacillus) 속 미생물을 이용하여 인삼 또는 홍삼을 발효시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브틸리스 신균주에 관한 것이다.
인삼은 식물 분류학상 오가과 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약 11 종이 알려져 있으며, 대표적인 종의 예로는, 아시아 극동 지역 (북위 33 ~ 48 : 한국, 북만주, 러시아 일부)에 자생하며, 약효가 매우 우수한 고려인삼 (Panax ginseng C.A. Meyer ); 미국, 캐나다에서 자생 및 재배하고 있는 미국삼 (Panax quinquefolium L.); 중국 운남성 동남부로부터 광서성 서남부 지역에서 야생 또는 재배하고 있는 전칠삼 (Panax notoginseng F.H. Chen); 및, 일본, 중국 서 남부, 네팔에 이르기까지 분포되어 있는 죽절삼 (Panax japonicus C.A. Meyer) 등이 있다.
인삼은 신농본초경에 상품으로 수재되어 있을 뿐만 아니라 예로부터 귀중한 보약으로 사용되어 오고 있다. 지금까지 많은 약리 실험을 통해 인삼은 스트레스에 대한 생체의 비특이적 저항성을 강화시키고 항산성 작용을 갖고 있음이 밝혀져 있다. 그 외에 고혈압의 개선, 인슐린 작용증강, 알록산 (ALLOXAN) 당뇨 마우스에서의 혈당강하효과, 흰 쥐의 간 RNA 합성, 단백질 합성, 당 및 지질대사 촉진효과, 항암효과 등이 있음이 밝혀졌다.
상기 인삼은 주로 한국, 중국, 일본 등의 아시아 국가에서 생약의 형태로 정신 의학적 질병, 신경계의 질병 및 당뇨병 등의 여러 가지 질병에 대해 사용되어 왔으며, 상기 인삼의 주요 성분인 사포닌은 강장, 강정, 진정조형 및 항고혈압 등에 효과를 보이는 것으로 알려져 있다.
현재 인삼의 사용은, 재배하여 채취한 상태 그대로의 수삼을 상온에서 건조시킨 백삼, 수삼을 98 ~ 100℃가열 처리하여 제조되는 홍삼, 또는 120 ~ 180℃에서 가열 처리하여 제조되는 선삼, 흑삼 등의 열처리 인삼의 형태로 사용되고 있다.
사포닌이란 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리화합물로 이루어진 것을 말하며 인삼에 있는 사포닌을 특이적으로 진세노사이드라 명명하고 있다. 인삼 사포닌은 다른 식물에서의 사포닌과 비교했을 때 구조가 다르며 그에 따라 약리효능도 틀리다. 또한 인삼 사포닌은 기본구조인 아글리콘에 결합되어 있는 당의 수나 종류, 그리고 위치에 따라 각기 약리효능이 다르다는 것은 이 미 널리 보고되어 있다. 구체적으로 인삼의 뿌리에는 약 4 ~ 10%의 인삼 사포닌 (한국산 인삼은 4 ~ 8%이고 미국삼은 4 ~ 10%임)이 함유되어 있는데, 상기 인삼 사포닌은 다양한 진세노사이드들의 혼합물이며, 그 중 한국산에는 진세노사이드 Rb1, Rc 및 Rg1의 함량이 비교적 높은 편이고 미국산에는 진세노사이드 Rb1 및 Re의 함량이 비교적 높다.
한편 하기 화학식 1은 진세노사이드 Rd(20(S)-protopanaxadiol-3-O-β-D-glucopyranoside)의 화학식으로서 진세노사이드 Rd는 부신피질 자극호르몬 및 코티코스테론 분비촉진, 신장사구체 비대억제작용이 있는 생리활성 물질로 알려져 있다. 이러한 진세노사이드 Rd는 구조적으로 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc와 C3위치에 결합되어 있는 당 2분자는 같고 C20 위치에 결합된 당 한분자의 탄소 6번째 위치에 결합된 당이 없는 구조를 가지고 있다.
한편, 상기 인삼에 포함된 진세노사이드의 함량을 증진시키기 위해 인삼을 발효시키는 방법들이 제안되었다. 특히 대한민국특허 공개공보 제2003-61756호에는 인삼을 아스퍼질러스로 발효한 후 전분 분해효소 및 단백질 분해효소로 분해하는 것을 특징으로 하는 기능성 및 관능성이 우수한 인삼 발효액의 제조방법이 개시되어 있다.
그러나, 이러한 방법의 경우 진세노사이드 Rd의 함량이 증대되는지 여부는 확인할 수 없었다. 한편 한국특허출원 2007-43083호에서는 유산균을 이용하여 발효인삼을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 유산균을 이용하는 경우 발효의 원료로서 인삼외에 별도의 첨가물을 첨가하여야 하며 진세노사이드 Rd의 함량을 증대시키지 않는 문제가 있었다.
한편, 본 발명자들은 청국장에서 분리된 바실러스 속 균주를 이용하여 인삼 또는 홍삼을 발효시키는 경우 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는데 유용하고 나 아가 본 발명에서 최초로 개시된 신균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 이용하는 경우 그 효과가 매우 증진된다는 사실을 최초로 발견하고 본 발명을 개시하였다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 인삼 또는 홍삼의 발효시 청국장 유래의 바실러스 속 균주를 접종하여 다른 진세노사이드의 함량에는 변화가 없으면서도 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd로 전환시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 인삼 또는 홍삼의 발효 시 진세노사이드 Rd의 함량을 최대로 증진시킬 수 있는 신균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 청국장 유래의 바실러스 속 균주를 접종하여 다른 영양분을 첨가하지 않아도 발효인삼 또는 발효홍삼을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 발효인삼의 제조방법은, 청국장에서 분리된 바실러스 (Bacillus) 속 미생물을 이용하여 인삼을 발효시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시킨다.
상기 바실러스 속 미생물은 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이며, 보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 사용할 수 있다.
상기 인삼은 바람직하게는 인삼분말 수용액을 사용할 수 있으며, 상기 발효시간은 바람직하게는 48 ~ 96시간이다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 제공하며, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)는 청국장에서 분리된 것을 특징으로 하며 인삼의 발효시 진세노사이드 Rd의 함량을 비약적으로 증진시킨다.
본 발명의 다른 특징에 따른 발효인삼의 제조방법은, 1) 인삼을 분쇄하여 분말인삼을 제조하는 단계, 2) 상기 분말인삼을 증류수에 첨가하여 인삼분말액을 제조하는 단계 및 3) 상기 인삼분말액에 청국장에서 분리된 바실러스 (Bacillus) 속 미생물을 접종하여 상기 인삼분말액을 발효시키는 단계를 포함한다.
이 경우, 상기 발효인삼은 진세노사이드 Rd의 함량이 증대되며, 상기 3)단계는 바람직하게는 48 ~ 96시간 동안 수행된다.
상기 바실러스 속 미생물은 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이며, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)일 수 있다.
상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 특징에 따른 발효홍삼의 제조방법은, 청국장에서 분리된 바실러스 (Bacillus) 속 미생물을 이용하여 인삼을 발효시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시킨다.
상기 바실러스 속 미생물은 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이며, 보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 사용할 수 있다.
상기 홍삼은 바람직하게는 홍삼분말 수용액 또는 홍삼 농축물을 사용할 수 있으며, 상기 발효시간은 바람직하게는 48 ~ 96시간이다.
본 발명에 따른 발효인삼의 제조방법은 청국장에서 분리된 바실러스 속 미생물을 이용하여 인삼을 발효시키므로 식품으로서의 안전성이 매우 뛰어나다. 또한 다른 사포닌 성분의 함량은 유지시키면서도 진세노사이드 Rd의 함량만을 비약적으로 증진시킬 수 있다. 나아가, 발효 시 인삼만을 원료로 사용하고 다른 첨가물을 첨가하지 않아도 되므로 경제적이다.
또한, 본 발명자들이 최초로 청국장에서 동정한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)는 진세노사이드 Rd의 함량을 150%(2.5배) 이상 증진시킬 수 있어 알려진 청국장 유래의 바실러스 속 균주에 비하여 그 효과가 탁월하다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 발효인삼은 청국장에서 분리된 바실러스 (Bacillus) 속 미생물을 이용하여 인삼을 발효시키는 단계를 포함하여 제조한다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 발효인삼 제조에 사용되는 인삼은 그 종류, 원산지 및 형태가 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 발효인삼 제조에 사용되는 인삼의 종류로는 수삼, 백삼을 모두 사용할 수 있다. 상기 수삼은 밭에서 캐낸 후 가공하지 아니한 상태의 생삼을 말하며, 백삼은 주로 4∼6년근 수삼을 원료로 하여 표피를 제거하거나 제거하지 않고 건조, 가공한 것으로서 가공방법에 따라 직삼, 곡삼, 반곡삼, 생건삼, 미삼 등으로 구분된다.
또한, 본 발명에 따른 발효인삼의 제조에 사용되는 인삼의 원산지로는 특별히 한정되지 않으며 예를 들면, 국내산, 미국산, 일본, 히말라야, 베트남 및 중국산을 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 발효인삼의 제조에 사용되는 인삼의 형태로는 특별히 한정되지 않으며 예를 들면, 추출물, 분말 및 농축물 형태일 수 있다. 상기 추출물은 열수추출법, 주정추출법 및 혼합추출법으로 제조할 수 있고 분말은 건조인삼을 분쇄기를 이용하여 분쇄함으로써 제조하거나 추출물 분말을 사용할 수 있다. 상기에서 인삼홍삼의 분말화 정도는 특별히 한정되지는 않으며, 청국장 유래의 바실러스 속 균주가 인삼의 조직 또는 섬유소 내에 높은 효율로 침투할 수 있을 정도인 것이 바람직하다. 예를 들어, 인삼의 분말화 정도는 입자크기가 30∼150 메쉬 정도가 되도록 할 수 있다. 상기 농축물은 감압증류법 이나 박막증류법으로 제조할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 인삼을 분쇄한 후 수용액을 제조하여 발효시킬 수도 있다.
나아가, 본 발명에서 사용되는 상기 인삼은 인삼의 뿌리, 잎 및 줄기 중에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 인삼의 청국장에서 분리한 바실러스 속 균주를 이용한 발효는 상술한 인삼에 상기 균주를 접종하고 상기 균주의 적당한 발효온도인 25∼40℃에서 48시간∼96시간동안 배양함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 인삼분말 1kg을 물 1000∼2000ml에 현탁하여 5∼60분간 침지시킨 후 여기에 상기 균주를 접종할 수 있다. 상기에서 균주의 접종량은 바람직하게는 인삼의 전체 부피에 대해 2%(v/v)이고, 균수는 102 ~ 103 CFU/㎖이다.
한편, 본 발명의 제조방법은 통상의 발효인삼의 제조방법에서 사용되는 탄소원, 유기산, 무기원소 등을 첨가하지 않고 오로지 인삼만을 사용하여 발효시킬 수 있으며 이를 통해 제조원가를 현저히 절감시킬 수 있다.
한편 본 발명에서는 청국장에서 분리된 바실러스 속 균주를 사용하므로 인체에 무해하며, 사용되는 상기 바실러스 속 균주는 청국장에서 분리된 바실러스 속 균주이면 무엇이든지 사용가능하며, 바람직하게는 바실러스 속 균주 중 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리케니포미스 종에 속하는 균주를 사용할 수 있으며 가장 바람직하게는 본 발명자들이 최초로 청국장에서 동정하여 생물자원센터에 2008. 5. 28.자로 기탁한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 사용하는 것이 진세노사이드 Rd의 함량이 가장 높다. 상기 바실러스 속 균주는 공인된 기탁기관으로부터 분양받아 사용할 수 있다.
본 발명의 발효인삼의 제조방법을 통해 제조된 발효인삼은 다른 진세노사이드 성분의 함량변화가 없으면서 오직 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd로만 변화시킨다. 특히 청국장 유래의 바실러스 속 균주 중 바실러스 서브틸리스종 균주의 진세노사이드 Rd 전환능이 우수하며, 이 중 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)의 진세노사이드 Rd의 증가율은 150% 이상으로서 매우 높은 효율을 보인다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 발효홍삼의 청국장에서 분리된 바실러스 (Bacillus) 속 미생물을 이용하여 인삼을 발효시키는 단계를 포함하여 제조한다.
구체적으로, 본 발명의 발효홍삼의 제조방법은 발효의 대상이 홍삼인 것을 제외하고는 상술한 발효인삼의 제조방법과 동일하다. 이때, 사용가능한 홍삼의 종류는 제한이 없으며, 사용되는 홍삼의 형태도 분말, 형태로는 특별히 한정되지 않으며 예를 들면, 추출물, 분말 및 농축물 형태일 수 있다. 상기 추출물은 열수추출법, 주정추출법 및 혼합추출법으로 제조할 수 있고 분말은 건조홍삼을 분쇄기를 이용하여 분쇄함으로써 제조하거나 추출물 분말을 사용할 수 있다. 상기에서 홍삼의 분말화 정도는 특별히 한정되지는 않으며, 청국장 유래의 바실러스 속 균주가 홍삼의 조직 또는 섬유소 내에 높은 효율로 침투할 수 있을 정도인 것이 바람직하다. 예를 들어, 홍삼의 분말화 정도는 입자크기가 30∼150 메쉬 정도가 되도록 할 수 있다. 상기 농축물은 감압증류법 이나 박막증류법으로 제조할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 홍삼을 분쇄한 후 수용액을 제조하여 발효시킬 수도 있다.
본 발명에서 홍삼의 청국장에서 분리한 바실러스 속 균주를 이용한 발효는 상술한 인삼에 상기 균주를 접종하고 상기 균주의 적당한 발효온도인 25∼40℃에서 48시간∼96시간동안 배양함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 홍삼분말 1kg을 물 1000∼2000ml에 현탁하여 5∼60분간 침지시킨 후 여기에 상기 균주를 접종할 수 있다. 상기에서 균주의 접종량은 홍삼의 전체 부피에 대해 상기에서 균주의 접종량은 바람직하게는 인삼의 전체 부피에 대해 2%(v/v)이고, 균수는 102 ~ 103 CFU/㎖이다.
한편 상술한 발효인삼과 마찬가지로 발효홍삼에 사용되는 청국장 유래의 미생물은 바실러스 속 균주를 사용하는 것이 그 효율이 가장 높으며 그 중 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리케니포미스 종에 속하는 균주를 사용할 수 있고 가장 바람직하게는 본 발명자들이 최초로 청국장에서 동정하여 생물자원센터에 2008. 5. 28.자로 기탁한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 사용하는 것이 진세노사이드 Rd의 증가율을 비약적으로 향상시킬 수 있다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
<실시예 1> 청국장에서 동정한 바실러스 속 균주의 인삼발효능 측정
(1) 조사포닌의 추출
인삼발효에 이용할수 있는 균주를 선별하기 위한 실험을 진행하기 위하여 인삼에서 조사포닌을 추출하였다. 조사포닌을 추출하기 위한 재료는 금산 4년근 인삼을 사용하였으며, Shibata법을 이용하여 추출하였다. 우선 인삼을 건조시키고 효율적으로 추출하기 위하여 50 메쉬로 분말화하였다. 95% EtOH로 1시간씩 2회 추출을 하였으며, 감압농축을 하였다. 이를 증류수에 용해시킨후 에틸에테르(ethylether)로 3회 처리하여 지용성 성분을 제거하고, 수포화부탄올로 3회 처리하여 얻은 수포화부탄올층을 감압 농축하여 조사포닌을 얻었다.
(2) 인삼발효를 위한 바실러스 속 균주선별
청국장으로부터 바실러스 속 균주를 분리하기 위해 시험관에서 청국장을 멸균수에 현탁하고 80℃에서 15분간 물중탕을 하였다. 이를 LB 고체 배지에 도말하여 콜로니 모양이 다른 균주들을 분리한 후, 그람 염색과 포자 염색을 하여 그람양성의 간균으로 포자를 형성하는 21종의 균주를 분리하였다. 인삼발효를 위한 균주를 선별하기 위하여 조사포닌이 첨가된 액체 LB 배지에서 사포닌 전환능력을 시험하였다. 테스트 튜브에 5ml의 LB 액체배지를 만들고 멸균처리된 조사포닌액을 2500ppm의 농도로 첨가시켰다. 조사포닌이 들어있는 LB 액체배지에 균주를 접종하였으며, 37℃에서 배양을 진행하였다. 48시간 후에 원심분리를 통해 사포닌이 녹아있는 배양상등액 200μl 샘플을 취하여 1.5ml 튜브에서 shibata법을 이용한 에틸에테르와 수포화부탄올의 사포닌 추출방법을 진행하였으며, 이렇게 추출된 결과물은 40% 아세토니트릴에 녹여서 HPLC분석을 진행하였다. 그 결과 진세노사이드 Rd의 전환능이 가장 높은 균주를 선별하여 AS-3으로 명명하였다.
(3) 바실러스 서브틸리스 AS-3 균주의 동정
본 발명에서 진세노사이드 Rd로의 전환활성이 가장 높은 AS-3 균주는 그람 염색과 포자 염색을 한 결과 그람양성의 간균으로 포자를 형성하는 균주로 판명되었다. 이 균주를 정확하게 동정하기 위해 16S rRNA의 유전자 서열(서열목록 1 및 도 1)을 분석하였다. 균주를 LB 플레이트에 도말하여 얻은 콜로니를 멸균수에 현탁한 후 100℃에서 10분간 중탕하고 원심분리를 이용하여 침전물을 제거하여 상등액을 얻었다. 이를 주형(template)으로 이용하여 유전자를 증폭하는 PCR을 하였으며 이 때, pBact 27F primer (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 pUniv 1492R (5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하였다. 이렇게 PCR을 하여 증폭된 유전자는 전기영동을 하여 확인하였으며, 겔 추출키트 (QIAGEN, Germany)를 이용하여 아가로즈에서 DNA를 분리하였다. 분리한 샘플을 (주)솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 분석하였으며 최종적으로 분석된 서열을 NCBI 데이터베이스에서 비교 분석하였다. 분석결과 바실러스 서브틸리스 NBRC 13719T와 99.69%의 가장 높은 서열 유사도를 나타내었다. 따라서 본 발명의 균주를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)으로 명명하였다.
<실시예 2> 바실러스 속 균주의 인삼배지에서 생장능 측정
인삼을 발효시키기 위하여 선별된 바실러스 속 균주가 인삼만을 영양분으로 했을때 생장을 할 수 있는지 생장능을 측정하였다. 생장능 측정을 위한 인삼배지는 증류수 50ml에 건조하여 분말화한 인삼을 1.25g첨가하여 121℃에서 1.5기압으로 15분간 고온가압을 이용하여 멸균과정을 거쳤다. 상기 방법으로 제조된 배지에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 접종하여 생장능을 측정하였다. 인삼분말배지는 혼탁하기 때문에 혼탁도를 이용하여 생장능을 측정할 수 없기 때문에 LB 고체배지에 균을 도말하여 콜로니 개수를 확인하는 균수 측정법을 사용하였다. 도 2는 시간에 따른 생장능의 측정결과로서 48시간 이후에 균주들이 107이상의 생장능을 보였으므로 인삼을 발효할 수 있는 능력이 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 3> 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)에 의한 발효인삼의 제조
발효를 위한 인삼은 상기 실시예 2와 동일하게 제작하였다. 인삼을 건조시키고 이를 분말화하고, 증류수 50ml에 인삼분말 1.25g을 넣어 발효배지를 제작한 다음 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 접종하여 37℃에서 교반하면서 48시간동안 발효시켰다. 발효가 끝난 후 원심분리를 이용하여 상등액과 펠렛을 분리하였으며, 상등액은 에틸에테르로 3회 처리하여 지용성 성분을 제거하고, 수포화부탄올로 3회 처리하여 얻은 수포화부탄올층을 감압 농축하여 HPLC 분석을 위한 샘플을 만들었다. 펠렛부분은 95% EtOH로 1시간씩 2회 추출을 하였으며, 감압농축하였다. 이를 증류수에 용해시킨후 상등액과 같은 전처리 과정을 통하여 HPLC 분석을 실시하였다.
<실시예 4> 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KFCC 11336에 의한 발효인삼의 제조
발효에 사용된 균주로서 청국장에서 분리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KFCC 11336을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 발효인삼을 제조하였다.
<실시예 5> 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 3135에 의한 발효인삼의 제조
발효에 사용된 균주로서 청국장에서 분리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 3135을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 발효인삼을 제조하였다.
<실시예 6> 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis ) KCTC 1918에 의한 발효인삼의 제조
발효에 사용된 균주로서 청국장에서 분리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 1918을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 발효인삼을 제조하였다.
<실시예 7> 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)에 의한 발효홍삼의 제조
홍삼농축물이 첨가된 액체 LB 배지에서 홍삼사포닌의 전환능력을 시험하였다. 테스트 튜브에 5ml의 LB 액체배지를 만들고 멸균처리된 홍삼몽축물을 2500ppm의 농도로 첨가시켰다. 홍삼농축물이 들어있는 LB 액체배지에 균주를 접종하였으며, 37℃에서 배양을 진행하였다. 48시간 후에 원심분리를 통해 홍삼농축물이 녹아있는 배양상등액 200㎕ 샘플을 취하여 1.5ml 튜브에서 shibata법을 이용한 에틸에테르와 수포화부탄올의 사포닌 추출방법을 진행하였으며, 이렇게 추출된 결과물은 40% 아세토니트릴에 녹여서 HPLC분석을 진행하였다.
<실시예 8> 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KFCC 11336에 의한 발효홍삼의 제조
발효에 사용된 균주로서 청국장에서 분리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KFCC 11336을 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일하게 실시하여 발효홍삼을 제조하였다.
<실시예 9> 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 3135에 의한 발효홍삼의 제조
발효에 사용된 균주로서 청국장에서 분리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 3135을 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일하게 실시하여 발효홍삼을 제조하였다.
<실시예 10> 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis ) KCTC 1918에 의한 발효홍삼의 제조
발효에 사용된 균주로서 청국장에서 분리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 1918을 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일하게 실시하여 발효홍삼을 제조하였다.
<실험예> HPLC 분석
실시예 3 ~ 10의 인삼 또는 홍삼의 발효에서 생성된 각각의 부탄올층을 HPLC로 분석하였다. HPLC분석 조건은 ProStar 335 시스템(Varian, USA)이고, 컬럼은 Atlantis dC18(Waters, 4.6x250mm, USA)을 사용하였다. 이동상 용매는 HPLC용 증류수와 Acetonitrile을 사용하였으며, 농도구배 조건은 17% ACN으로 시작하여 30분 40% ACN, 50분 80% ACN, 55분 17%ACN, 60분 17% ACN이었고, 유속은 0.8ml/min 이었다. 검출은 UV 203nm에서 측정하여 그 중 진세노사이드 Rd의 증가량(발효 전의 인삼 또는 홍삼에서의 진세노사이드 Rd의 함량 기준)을 표 1에 나타내었다.
[표 1]
| 균주명 | 진세노사이드 Rd의 증가율(%) | 비고 |
| 실시예 3 | 155 | 본 발명의 신균주 |
| 실시예 4 | 22 | 청국장에서 분리된 균주 |
| 실시예 5 | 17 | Bacillus subtilis의 type strain |
| 실시예 6 | 11 | Bacillus licheniformis의 type strain |
| 실시예 7 | 104 | 본 발명의 신균주 |
| 실시예 8 | 18 | 청국장에서 분리된 균주 |
| 실시예 9 | 14 | Bacillus subtilis의 type strain |
| 실시예 10 | 7 | Bacillus licheniformis의 type strain |
상기 표 1에서 알 수 있듯이, 청국장에서 분리된 바실러스 속 균주를 이용하여 발효인삼 또는 발효홍삼을 제조하는 경우 별다른 물질을 첨가하지 않아도 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시킬 수 있었다. 특히 상기 바실러스 속 균주 중 바실러스 서브틸리스 종의 균주의 전환능이 우수하며, 그 중 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)의 전환능이 발효인삼에서 155%(약 2.5배), 발효홍삼에서 104%(약 2배)로서 다른 바실러스 속 균주들에 비하여 비약적으로 뛰어남을 확인할 수 있다.
한편, 도 3a는 발효 전 인삼의 진세노사이드 함량에 대한 HPLC 분석 그래프 이고 도 3b는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 접종하여 발효한 발효인삼의 진세노사이드 함량에 대한 HPLC 분석 그래프로서 양 그래프를 비교하면 진세노사이드 Rc의 함량이 줄어들고 진세노사이드 Rd의 함량이 늘어나는 것을 알 수 있으며 이는 진세노사이드 Rc가 진세노사이드 Rd로 전환되는 것을 보여주는 것이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 접종하여 발효한 발효인삼의 진세노사이드의 성분변화를 보여주는 그래프로서 다른 진세노사이드의 함량은 일정하게 유지되나 진세노사이드 Rc의 함량이 줄어드는 반면 진세노사이드 Rd의 함량이 비약적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 진세노사이드 Rc만이 특이적으로 진세노사이드 Rd로 전환되는 것을 알 수 있다.
한편, 도 5a는 발효 전 홍삼의 진세노사이드 함량에 대한 HPLC 분석 그래프이고 도 5b는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)를 접종하여 발효한 발효인삼의 진세노사이드 함량에 대한 HPLC 분석 그래프로서 양 그래프를 비교하면 진세노사이드 Rc의 함량이 줄어들고 진세노사이드 Rd의 함량이 늘어나는 것을 알 수 있으며 이는 진세노사이드 Rc가 진세노사이드 Rd로 전환되는 것을 보여주는 것이다.
본 발명은 인삼 또는 홍삼에 포함된 진세노사이드 성분 중 진세노사이드 Rc 만을 특이적으로 선별하여 진세노사이드 Rd로 전환시키므로 식품산업에 매우 유용한 발명이다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 기술되었지만, 본 발명의 기술사상 범위내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
도 1은 본 발명의 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)의 16S rRNA 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 인삼배지에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)의 생장능을 측정한 그래프이다.
도 3a는 발효 전의 인삼의 진세노사이드에 대한 HPLC 그래프이고, 도 3b는 본 발명의 일실시예에 따른 인삼배지에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)의 진세노사이드에 대한 HPLC 그래프이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)에 의한 진세노사이드의 성분변화를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 발효 전의 홍삼의 진세노사이드에 대한 HPLC 그래프이고, 도 5b는 홍삼배지에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)의 진세노사이드에 대한 HPLC 그래프이다.
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korean gineng researchco., ltd.
<120> MANUFACTURING METHOD OF FERMENTATIVE GINSENG, FERMENTATIVE RED
GINSENG AND NOVEL MICROORGANISM BACILLUS SUBSTILIS FROM FERMENTED
SOYBEANS THEREOF
<160> 1
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1290
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt 60
gtttgaaccg catggttcag acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc 120
gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc 180
tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 240
agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa 300
ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg 360
caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 420
acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt 480
aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg 540
agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg 600
aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg 660
ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt 720
agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac 780
ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 840
gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag 900
agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 960
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca 1020
ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1080
caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg 1140
gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc 1200
tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1260
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1290
Claims (22)
- 청국장에서 분리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP) 미생물을 이용하여 인삼을 발효시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 발효인삼의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 인삼은 분말 수용액인 것을 특징으로 하는 상기 발효인삼의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 발효시간은 48 ~ 96시간인 것을 특징으로 하는 상기 발효인삼의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 증진된 진세노사이드 Rd는 진세노사이드 Rc에서 전환 된 것을 특징으로 하는 상기 발효인삼의 제조방법.
- 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)
- 제7항에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)는 청국장에서 분리된 것을 특징으로 하는 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)
- 제7항에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)는 인삼의 발효시 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP)
- 1) 인삼을 분쇄하여 분말인삼을 제조하는 단계;2) 상기 분말인삼을 증류수에 첨가하여 인삼분말액을 제조하는 단계; 및3) 상기 인삼분말액에 청국장에서 분리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP) 미생물을 접종하여 상기 인삼분말액을 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효인삼의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 발효인삼은 진세노사이드 Rd의 함량이 증대된 것을 특징으로 하는 발효인삼의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 3)단계는 48 ~ 96시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 상기 발효인삼의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조방법을 통해 제조된 발효인삼.
- 청국장에서 분리된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AS-3(수탁번호 : KCTC 11339BP) 미생물을 이용하여 홍삼을 발효시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 발효홍삼의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제16항에 있어서, 상기 홍삼은 분말 수용액 또는 홍삼 농축물인 것을 특징으로 하는 상기 발효홍삼의 제조방법.
- 제16항에 있어서, 상기 발효시간은 48 ~ 96시간인 것을 특징으로 하는 상기 발효홍삼의 제조방법.
- 제16항에 있어서, 상기 증진된 진세노사이드 Rd는 진세노사이드 Rc에서 전환된 것을 특징으로 하는 상기 발효홍삼의 제조방법.
- 제16항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 제조방법을 통해 제조된 발효홍삼.
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