CN111349678A - 一种油菜花粉多糖提取方法以及提取产物 - Google Patents

一种油菜花粉多糖提取方法以及提取产物 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药微生物技术领域，具体涉及一种提高油菜花粉多糖含量的方法。该方法是通过微生物发酵的方法提高油菜花粉多糖含量，该微生物选自植物内生菌及已知的微生物菌群。可以是单一菌群，也可以是混合菌群。本发明所述微生物发酵方法在显著提高植物药多糖含量的同时，还能够营造产物益生菌环境，提高药理活性，可广泛用于植物药深层发酵生产。

Description

一种油菜花粉多糖提取方法以及提取产物
技术领域
本专利属于中药材微生物技术应用领域，具体涉及提高油菜花粉多糖含量的方法。
背景技术
油菜花粉含有丰富的功能性物质(包括蛋白质、维生素、微量元素、黄酮类化合物)，这些物质协同作用于机体，调节机体的多种功能，平衡体内营养，增强新陈代谢，防止毛细血管通透性的障碍。花粉还能促进内分泌腺的发育，有提高和调节内分泌腺分泌功能，因此对由内分泌功能紊乱引起的疾病起到了治疗作用。
油菜花粉益肾、固本、强腰，而且含黄酮醇较高，具有抗动脉粥样硬化、治疗静脉曲张性溃疡、降低胆固醇和抗辐射的作用。花粉对人类的保健作用、药理作用及功效。结果表明，花粉能够防治脑心血管疾病，降血脂，调节神经***，促进睡眠，调节胃肠***功能，促进消化，治疗***衡，由里及表，从根本上改善皮肤细胞的活力，增强皮肤的代谢机能，防止面部色素沉着、皮肤粗糙、衰老，使皮肤保持湿润、洁白，有光泽，富有弹性。
多糖是生物体中广泛存在的物质，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，它是生物体内重要的生物大分子，是维持生命活动正常运转的基本物质之一。植物多糖，又称植物多聚糖，是植物细胞代谢产生的聚合度超过10个的聚糖。
现今植物多糖研究日益受到关注，国际科学界甚至提出21世纪是多糖的世纪。科学实验研究显示，许多植物多糖具有生物学活性和药理活性，它不仅可以作为广谱免疫促进剂调节机体免疫功能，还可以在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗辐射等方面发挥广泛的药理作用。多糖因其来源广泛，药理活性强，细胞毒性低，安全性强，毒副作用较小，已引起医药界的广泛关注，并成为当今生命科学研究的热点之一。
糖蛋白是一种结合蛋白质，其中非蛋白质部分为糖类物质，并以共价键与蛋白质部分相连接，所连接的糖或是单糖或是相对短的寡糖。通常每个分子的含糖量较少(约4％)。一些糖蛋白只含一个或几个糖基，另一些含有多个线性或分支的寡糖侧链。糖蛋白通常或分泌到体液中或是膜蛋白，后者定位于细胞外，并有相应功能。糖蛋白包括酶、激素、载体、凝集素、抗体等。
迄今为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中分离出来。目前植物多糖的提取方法主要有：热水浸提法、碱浸提法、酶解提取法、微波辅助法以及超声波法等。其中酶法是采用酶与热水浸提相结合的方法，酶多采用一定量的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶。主要的方法有复合酶法、分别酶法和单一酶法。酶法提取植物多糖具有反应条件温和、效率高、杂质易除、工艺简便和省时等许多优点，本专利在酶法提取基础上加入微生物发酵大大提高了多糖的含量。
植物内生菌(Endophyte)是在一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的一大类微生物，他们能与植物形成寄生、共生、腐生等关系。研究发现，不仅从各种植物中可以分离得到内生菌，而且在同一种植物的根、茎、叶、花、果实和种子等中均有内生菌被发现。内生菌数量庞大，种类众多，包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌等。植物内生菌具有丰富的生物多样性，对于一种植物而言，从中可分离到的内生真菌或细菌通常为几种至几十种，有的甚至可达几百种。
发明内容
油菜花粉多糖结构复杂，种类繁多，采用常规提取方法使得植物多糖的提取率偏低，成本较高。针对现有技术的不足，本发明提供了一种油菜花粉多糖提取方法，旨在采用本发明特殊微生物菌种发酵的方法提高油菜花粉多糖的含量，增加药物活性。
本发明第二目的在于，提供一种采用所述的提取方法得到的发酵液，所述的发酵液包含丰富多糖、糖蛋白以及本发明所述的微生物的益生菌环境，具有良好的药用效果。
一种油菜花粉多糖提取方法，对油菜花粉进行微生物发酵处理，得含有多糖的发酵液；
所述的微生物包含(Parengyodontium SP.)MD313901菌株(本发明也简称为MD313901)和/或(Purpureocillium SP.)MD313902菌株(本发明也简称为MD313902)中的至少一种，还选择性包含酵母菌、乳酸菌中的至少一种；
或者，所述的微生物包含至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌；
(Parengyodontium SP.)MD313901菌株的保藏号为CCTCC M 2018256；
(Purpureocillium SP.)MD313902菌株的保藏号为CCTCC M 2018257。
本发明人发现，采用本发明所述的微生物菌种对油菜花粉进行发酵，可以显著提升油菜花粉的多糖提取率；提高油菜花粉的多糖含量，同时还可以营造产物益生菌环境，提高油菜花粉的药理活性。
本发明所述的(Parengyodontium SP.)MD313901菌株和(Purpureocillium SP.)MD313902菌株均属于植物内生真菌，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地点为武汉，保藏时间为2018年5月20日；保藏号分别为CCTCC M 2018256、CCTCC M 2018257。
本发明人还发现，采用MD313901菌株或MD313902菌株的单一菌种进行发酵，可以有效提升油菜花粉多糖的提取率。进一步地，将MD313901菌株和MD313902菌株联合，或者进一步和酵母菌、乳酸菌联合，可以进一步协同提升油菜花粉的多糖提取率。此外，本发明人还发现，采用包含酵母菌和乳酸菌的菌群对油菜花粉进行发酵，同样也能达到协同提升油菜花粉的多糖提取率的目的。
作为优选，所述的微生物包含(Parengyodontium SP.)MD313901菌株、(Purpureocillium SP.)MD313902菌株、酵母菌、乳酸菌中的至少两种菌种的菌群。采用优选的两种及以上的菌种的菌群，可以协同提升油菜花粉多糖的提取率。
进一步优选，所述的微生物包含(Parengyodontium SP.)MD313901菌株和/或(Purpureocillium SP.)MD313902菌株中的至少一种，还包含酵母菌和/或乳酸菌。本发明研究发现，采用本发明创新的MD313901菌株和/或MD313902菌株，和酵母菌和/或乳酸菌在发酵提升油菜花粉多糖提取率方面具有协同效果，通过本发明创新的植物内生真菌与酵母菌和/或乳酸菌联用，可以进一步协同提升油菜花粉的多糖提取效果。
更进一步优选，所述的微生物包含(Parengyodontium SP.)MD313901菌株、至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌。
或，所述的微生物为(Parengyodontium SP.)MD313901菌株、(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株、至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌。
或，所述的微生物为至少两种酵母菌和至少两种乳酸菌。
或，所述的微生物为(Parengyodontium SP.)MD313901菌株和(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株。研究发现，本发明该两种菌种联合，可以出人意料地协同提升多糖提取率。
优选的微生物具有更优的协同效果，可以进一步提升油菜花粉的多糖提取率。
作为优选，所用酵母菌为产朊假丝酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、***克鲁维酵母、啤酒酵母、面包酵母、葡萄汁酵母中的一种或多种；进一步优选为产朊假丝酵母和/或乳酸克鲁维酵母。
作为优选，所用乳酸菌为植物乳杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸链球菌、嗜热芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌、软化芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或多种；进一步优选为乳酸杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌中的至少一种。
更进一步优选，所述的微生物为(Parengyodontium SP.)MD313901菌株、(Purpureocillium SP.)MD313902菌株、产朊假丝酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌中的至少两种菌种的菌群。研究发现，采用该优选的两种及以上的菌群对油菜花粉进行发酵，可以出人意料地进一步提升油菜花粉多糖提取率。
最优选，所述的微生物为Parengyodontium SP.MD313901菌株、双歧杆菌和乳酸克鲁维酵母；或者为(Parengyodontium SP.)MD313901菌株、(Purpureocillium SP.)MD313902菌株、乳酸克鲁维酵母和鼠李糖乳杆菌；或者为产朊假丝酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸杆菌和鼠李糖乳杆菌。
作为优选，所述的油菜花粉进行微生物发酵预先经破壁预处理。
进一步优选，所述的破壁预处理为生物酶酶解。
本发明研究发现，先通过生物酶对油菜花粉进行破壁处理，后通过本发明所述的微生物菌种进行发酵，如此能进一步有效促进油菜花粉多糖成分含量，显著提升多糖的提取率。
本发明中，将生物酶处理和微生物菌种的发酵组合，先进行生物酶处理，促进有效成分快速释放，再进行微生物菌种的发酵，提高植物多糖成分含量。
本发明中，生物酶酶解过程为：将待处理的油菜花粉经清洗、匀浆、加入微生物酶进行破壁。
作为优选，所述的生物酶为果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶中的至少一种。
作为优选，酶解过程中，生物酶的用量为油菜花粉重量的0.01％-5％；优选为2～5％。
进一步优选，所述的生物酶为果胶酶和纤维素酶，其中，果胶酶的用量为油菜花粉重量的0.1％-5％；纤维素酶的用量为油菜花粉重量的0.1％-5％。
生物酶处理采用适宜温度和pH等条件进行。
优选的酶解过程的pH为4～8。
优选的酶解过程的温度为30-60℃。
酶解时间优选为2-8小时。
酶解完成后，无需对酶解体系进行分离，直接灭菌接种本发明创新的菌种进行发酵。
灭菌的方法可采用现有方法。例如，采用蒸汽灭菌，时间例如为30-60分钟。
本发明方法，对破壁的体系进行本发明所述的菌种或者菌群的发酵，可将破壁体系中的多糖以外的某些成分进一步转化成多糖，从而，进一步提高发酵液中的多糖的含量，提高多糖的提取率。
本发明除创新的菌种的使用外，进一步配合对油菜花粉的破壁预处理以及发酵参数的控制，可以进一步提升发酵效果，进一步改善多糖的提取率。
作为优选，发酵过程中，微生物的接种量为总原料(指油菜花粉重量)质量的0.01～20％；进一步优选为1～10％；更进一步优选为4～8％。在该优选的接种范围下，可有效缩短发酵周期，此外，还可避免菌种生长过快，降低菌种快速衰老死亡，提高发酵产物多糖含量。
作为优选，发酵温度为10～50℃。控制在优选的范围下，发酵效果更优，未控制在该优选的范围下，对多糖提取率不利。
进一步优选，发酵温度为25～30℃。
作为优选，发酵时间为48h及以上；优选为5～30天。
发酵过程在密闭容器中进行。
发酵方式优选为静置发酵。
本发明中，可以采用现有方法，从发酵液中提升多糖以及所需成分。
作为优选，从所述的发酵液中提取得到油菜花粉多糖；
优选地，提取过程包括以下进行的水提和醇提。
所述水提物为用水在40℃-90℃温度下对发酵成分进行提取。
所述的醇提为向水提液中添加醇，控制溶液体系中醇的含量为60～90％，进行醇提。
水提处理后，去除水提产物中的游离蛋白，随后再经醇提。
本发明一种优选的油菜花粉的发酵处理方法，具体是通过以下步骤实现的：
(1)选取优质的去除杂质的油菜花粉。放入发酵罐，加入0.01％-5％生物酶，控制酶解温度30-60℃，加食用酸或食用碱调整PH值至4.0-8.0，酶解2-8小时，酶解结束后，通入蒸汽灭菌30-60分钟；
(2)酶解液冷却至室温后，加入原料重量0.01％-20％的微生物菌种，控制发酵灌搅拌速度为50-300rpm，控制发酵温度为15-50℃，进行密闭发酵5-30天。
(3)收集发酵液，发酵液进行提取、分离、纯化得油菜花粉糖蛋白和油菜花粉多糖。
作为优选，发酵液经过水提、醇沉、分离得到油菜花粉多糖。
本发明还公开了一种所述提取方法获得的发酵液(发酵产物)。
优选地，所述的发酵液中包含油菜花多糖和所述的微生物。
进一步优选地，所述的发酵液中还包含糖蛋白。
本发明发酵后的发酵液经过水提、醇沉、分离得到油菜花粉糖蛋白亦是本专利所要保护的有效活性成分。
有益效果
本发明提供了全新的(Parengyodontium SP.)MD313901菌株和(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株；并创新地发现该全新的菌株有助于提升油菜花粉多糖、糖蛋白的提取率。此外，本发明还研究发现，(Parengyodontium SP.)MD313901菌株和(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株联合使用具有协同效果，有助于进一步提升油菜花粉的多糖的提取率。
所述微生物菌种为植物内生菌及已知的微生物菌群。所述的(ParengyodontiumSP.)MD313901菌株和(Purpureocillium SP.)MD313902菌株和酵母菌、乳酸菌还具有良好的协同效果；可以进一步提升发酵产物中含有丰富多糖以及糖蛋白，同时还可以营造产物益生菌环境，提高植物药的药理活性。
具体实施方式
下面的实施例是对本申请的具体描述，这些实施例旨在对本申请进行进一步说明，不能理解为对发明的保护范围有任何限制，本领域的技术人员基于本申请作出的改进和调整也属于受保护的范围。
(Parengyodontium SP.)MD313901菌株、(Purpureocillium SP.)MD313902菌株分离
制备例1
植物内生菌群制备方法是经过以下步骤实现的：
(1)植物组织预处理
植物组织(采用表1所示的不同产地、不同品种玉竹植物药材)用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干表面水分后将其切段，长度0.5-2.0cm，然后把切好的材料置于体积浓度70％乙醇消毒2min，无菌水清洗，再用质量浓度3％次氯酸钠浸泡10min，后用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；
(2)植物组织内生菌浸出
将消毒后的玉竹组织置于消毒过的研钵中，加入生物酶(纤维素酶，用量为5％)进行研磨，研磨液转入锥形瓶中25℃条件下200rpm振荡2小时，得上清液和植物残渣。1
(3)植物内生菌株的分离、纯化
在无菌条件下将浸出过程所得的上清液用无菌水稀释10倍，分别取200μL涂布于MS培养基上进行培养，培养一段时间形成菌落后，挑选不同形态的菌落，真菌至PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基培养，细菌至牛肉膏蛋白胨培养基培养。采用划线法纯化。
选取不同产地、不同品种玉竹植物药材，分离其植物内生菌见表1。
表1
Figure BDA0001913803720000071
Figure BDA0001913803720000081
表1结果表明不同产地，不同品种的玉竹采用本专利分离方法同样能够得到两种菌种。
以下案例，所述的总原料重量，除特别声明外，均指油菜花粉重量。
对本发明的MD313901菌株的16sRNA片段进行分析，具有真菌特异性ITS2片段，且其和Parengyodontium SP.具有99％的同源性，命名为MD313901，(Parengyodontium SP.)MD313901菌株已经在2018年5月20日经中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M2018256。
对本发明的MD313902菌株的16sRNA片段进行分析，具有真菌特异性ITS2片段，且其和Purpureocillium SP.具有99％的同源性，命名为MD313902，(Purpureocillium SP.)MD313902菌株已经在2018年5月20日经中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M2018257。
微生物菌种发酵提高油菜花粉多糖含量的实施例：
实施例1：
1.油菜花粉破壁：
取油菜花粉10kg，除去杂质倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入1％的纤维素酶(总原料质量分数)和1％半纤维素酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整pH值为6.7，控制温度46℃，酶解2个小时，后通入蒸汽灭菌30min。
2.发酵：
冷却至室温后，加入4％(总原料质量分数)Parengyodontium SP.MD313901菌株，在28℃环境下静置发酵30天，过滤，收集药液待处理。
3.油菜花粉糖蛋白的提取及含量测定
发酵后收集的药液加入药材8倍量的纯化水，100℃加热回流2次，每次3小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，Sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得油菜花粉总多糖。
油菜花粉多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后油菜花粉多糖提取率为14.0％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出1.84倍。
实施例2
1.油菜花粉的破壁：
取油菜花粉10kg，除去杂质倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入1％的纤维素酶(总原料质量分数)和1％半纤维素酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整pH值为6.7，控制温度46℃，酶解2个小时，后通入蒸汽灭菌30min。
2.发酵：
冷却至室温后，加入4％(总原料质量分数)Purpureocillium SP.MD313902菌株，在28℃环境下静置发酵30天，过滤，收集药液待处理。
3.油菜花粉糖蛋白的提取及含量测定
发酵后收集的药液加入药材8倍量的纯化水，100℃加热回流2次，每次3小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，Sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得油菜花粉总多糖。
油菜花粉多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后油菜花粉多糖提取率为12.3％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出1.6倍。
实施例3
1.油菜花粉的破壁
取油菜花粉15kg，除去杂质倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入1％的果胶酶(总原料质量分数)和4％木瓜蛋白酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整pH值为6.5，控制温度48℃，酶解4个小时，后通入蒸汽灭菌40min。
2.发酵：
冷却至室温后，加入2％(总原料质量分数)Parengyodontium SP.MD313901菌株、2％(总原料质量分数)Purpureocillium SP.MD313902菌种，在37℃环境下静置发酵25天，过滤，收集药液待处理。
3.油菜花粉糖蛋白的提取及含量测定
发酵后收集的药液加入药材10倍量的纯化水，90℃加热回流3次，每次2小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，Sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得油菜花粉总多糖。
油菜花粉多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后油菜花粉多糖提取率为16.3％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出2.1倍。
实施例4
1.油菜花粉的破壁：
取油菜花粉10kg，除去杂质倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入1％的纤维素酶(总原料质量分数)和1％半纤维素酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整pH值为6.7，控制温度46℃，酶解2个小时，后通入蒸汽灭菌30min。
2.发酵：
冷却至室温后，加入2％(总原料质量分数)Parengyodontium SP.MD313901菌株、3％(总原料质量分数)双歧杆菌、3％(总原料质量分数)乳酸克鲁维酵母混合菌种，在28℃环境下静置发酵15天，过滤，收集药液待处理。
3.油菜花粉糖蛋白的提取及含量测定
发酵后收集的药液加入药材8倍量的纯化水，100℃加热回流2次，每次3小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，Sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得油菜花粉总多糖。
油菜花粉多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后油菜花粉多糖提取率为13.6％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出1.8倍。
实施例5
1.油菜花粉的破壁
取油菜花粉15kg，除去杂质倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入1％的果胶酶(总原料质量分数)和4％木瓜蛋白酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整pH值为6.5，控制温度48℃，酶解4个小时，后通入蒸汽灭菌40min。
2.发酵：
冷却至室温后，加入2％(总原料质量分数)Parengyodontium SP.MD313901菌株、2％(总原料质量分数)Purpureocillium SP.MD313902、2％(总原料质量分数)乳酸克鲁维酵母、2％(总原料质量分数)鼠李糖乳杆菌混合菌种，在37℃环境下静置发酵15天，过滤，收集药液待处理。
3.油菜花粉糖蛋白的提取及含量测定
发酵后收集的药液加入药材10倍量的纯化水，90℃加热回流3次，每次2小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，Sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得油菜花粉总多糖。
油菜花粉多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后油菜花粉多糖提取率为14.5％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出1.9倍。
实施例6
1.油菜花粉的破壁
取油菜花粉15kg，除去杂质倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入2％的果胶酶(总原料质量分数)、1％纤维素酶(总原料质量分数)、1木瓜蛋白酶％木瓜蛋白酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整pH值为6.8，控制温度40℃，酶解3个小时，后通入蒸汽灭菌50min。
2.发酵：
冷却至室温后，加入1％(总原料质量分数)产朊假丝酵母、1％(总原料质量分数)乳酸克鲁维酵母、1％(总原料质量分数)乳酸杆菌、1％(总原料质量分数)鼠李糖乳杆菌混合菌种，在37℃环境下静置发酵20天，过滤，收集药液待处理。
3.油菜花粉糖蛋白的提取及含量测定
发酵后收集的药液加入药材10倍量的纯化水，95℃加热回流2次，每次2小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，Sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得油菜花粉总多糖。
油菜花粉多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后油菜花粉多糖提取率为15.3％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出2.0倍。
实施例7
和实施例1相比，区别仅在于，未进行步骤1的破壁处理，直接将蒲公英药材除去杂质用自来水冲洗干净，倒入发酵罐中，灭菌后接种所述的菌种，进行步骤2的发酵，随后采用步骤3进行多糖提取。采用实施例1的方法，测试发酵液中的多糖的含量为10.4％。
实施例8
和实施例1相比，区别仅在于，步骤1中超微粉碎破壁方法替代实施例1的酶解破壁方法。其他操作以及参数均等同于实施例1。采用实施例1的方法，测试发酵液中的多糖的含量为12.1％。
通过实施例1、实施例7和实施例8比较发现，对药材预先进行破壁处理与非破壁处理的发酵实验对比，结果破壁处理后的发酵物多糖含量明显提高。此外，本发明还研究发现，采用的破壁技术为生物酶破壁，实验实施过程中选择了超微粉碎破壁方法做对比，相比较于超微粉碎破壁技术生物酶破壁更加温和，破壁效果更加充分，对于活性成分无影响。

Claims (10)

1.一种油菜花粉多糖提取方法，其特征在于，对油菜花粉进行微生物发酵处理，得含有多糖的发酵液；
所述的微生物包含(Parengyodontium SP.)MD313901菌株和/或(PurpureocilliumSP.)MD313902菌株中的至少一种，还选择性包含酵母菌、乳酸菌中的至少一种；
或者，所述的微生物包含至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌；
(Parengyodontium SP.)MD313901菌株的保藏号为CCTCC M 2018256；
(Purpureocillium SP.)MD313902菌株的保藏号为CCTCC M 2018257。
2.如权利要求1所述的油菜花粉多糖提取方法，其特征在于，所述的微生物包含(Parengyodontium SP.)MD313901菌株、(Purpureocillium SP.)MD313902菌株、酵母菌、乳酸菌中的至少两种菌种的菌群。
3.如权利要求2所述的油菜花粉多糖提取方法，其特征在于，所述的微生物包含(Parengyodontium SP.)MD313901菌株、至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌；
或为(Parengyodontium SP.)MD313901菌株和(Purpureocillium SP.)MD313902菌株、至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌；
或为至少两种酵母菌和至少两种乳酸菌；
或为(Parengyodontium SP.)MD313901菌株和(Purpureocillium SP.)MD313902菌株。
4.如权利要求1～3任一项所述的油菜花粉多糖提取方法，其特征在于，酵母菌包括产朊假丝酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、***克鲁维酵母、啤酒酵母、面包酵母、葡萄汁酵母中的一种或多种；
优选地，所述的乳酸菌包括植物乳杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、肠膜明串珠菌、乳酸链球菌、嗜热芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌、软化芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的油菜花粉多糖提取方法，其特征在于，所述的微生物为(Parengyodontium SP.)MD313901菌株、(Purpureocillium SP.)MD313902菌株、产朊假丝酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌中的至少两种菌种的菌群。
6.如权利要求1～5任一项油菜花粉多糖提取方法，其特征在于，所述的油菜花粉进行微生物发酵预先经破壁预处理；
所述的破壁预处理优选为生物酶酶解；
所述生物酶为果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶中的一种或多种；
优选地，酶解过程中，生物酶的用量为油菜花粉重量的0.01％-5％；
酶解过程的pH为4～8。
7.如权利要求1～6任一项油菜花粉多糖提取方法，其特征在于，发酵过程中，微生物的接种量为油菜花粉质量的0.01～20％。
8.如权利要求7油菜花粉多糖提取方法，其特征在于，发酵温度为10～50℃，发酵时间为48h及以上。
9.如权利要求1油菜花粉多糖提取方法，其特征在于，从所述的发酵液中提取得到油菜花粉多糖；
优选地，提取过程包括以下进行的水提和醇提。
10.一种权利要求1～9任一项所述提取方法获得的发酵液；
优选地，所述的发酵液中包含油菜花多糖和所述的微生物；
进一步优选地，所述的发酵液中还包含糖蛋白。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114107082A (zh) * 2020-08-27 2022-03-01 安琪酵母股份有限公司 一种复合菌剂及其应用
CN115626853A (zh) * 2022-11-07 2023-01-20 中科荣耀(苏州)生物科技有限公司 一种含花粉多糖和褐藻寡糖的增效尿素及其制备方法
CN116444692A (zh) * 2023-05-19 2023-07-18 四川农业大学 一种花粉类多糖的酶解提取方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1452888A (zh) * 2003-03-24 2003-11-05 浙江大学 油菜花粉发酵破壁新方法
CN105669875A (zh) * 2016-02-18 2016-06-15 襄阳利高乐生物化学科技有限公司 一种油菜花粉多糖的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1452888A (zh) * 2003-03-24 2003-11-05 浙江大学 油菜花粉发酵破壁新方法
CN105669875A (zh) * 2016-02-18 2016-06-15 襄阳利高乐生物化学科技有限公司 一种油菜花粉多糖的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
冯慧等: "不同发酵法对油菜蜂花粉破壁的影响", 《中国酿造》 *
孟良玉等: "纤维素酶对油菜蜂花粉的破壁作用", 《食品科学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114107082A (zh) * 2020-08-27 2022-03-01 安琪酵母股份有限公司 一种复合菌剂及其应用
CN114107082B (zh) * 2020-08-27 2024-03-15 安琪酵母股份有限公司 一种复合菌剂及其应用
CN115626853A (zh) * 2022-11-07 2023-01-20 中科荣耀(苏州)生物科技有限公司 一种含花粉多糖和褐藻寡糖的增效尿素及其制备方法
CN115626853B (zh) * 2022-11-07 2023-12-15 中科荣耀(苏州)生物科技有限公司 一种含花粉多糖和褐藻寡糖的增效尿素及其制备方法
CN116444692A (zh) * 2023-05-19 2023-07-18 四川农业大学 一种花粉类多糖的酶解提取方法

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