KR100996968B1 - SSR primer derived from Oyster Mushroom and use of there - Google Patents

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Abstract

본 발명은 버섯에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 72로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 버섯의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 버섯의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 버섯의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 버섯의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다. The present invention relates to an SSR primer isolated from a mushroom and its use, and more particularly, SSR primer pair having two base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 72, and performing PCR using the same. It relates to a DNA polymorphism detection method of a mushroom comprising the. SSR primer pair provided in the present invention can effectively detect the DNA polymorphism of the mushroom, it can be very useful for preparing the DNA profile of the mushroom. In addition, by efficiently evaluating the genetic resources of the mushroom through this, it is possible to effectively perform redundancy analysis and establishment of novelty with existing resources when introducing new genetic resources.

SSR 프라이머, 버섯, DNA 다형성 SSR Primer, Mushroom, DNA Polymorphism

Description

버섯에서 유래된 ＳＳＲ 프라이머 및 이의 용도{SSR primer derived from Oyster Mushroom and use of there}SSR primer derived from Oyster Mushroom and use of there}

본 발명은 버섯(Oyster Mushroom; Pleurotus Ostreatus Kummer)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention (Oyster Mushroom; Pleurotus SSR primers isolated from Ostreatus Kummer) and their use.

본 발명은 버섯(Oyster Mushroom; Pleurotus Ostreatus Kummer)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 72로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 버섯의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다.The present invention (Oyster Mushroom; Pleurotus SSR primer isolated from Ostreatus Kummer and its use, and more specifically, SSR primer pair having two base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 72 and performing PCR using the same It relates to a DNA polymorphism detection method of a mushroom containing.

육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종 의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.Large quantities of genetic resources are collected annually in most major crops and cultivated crops used for breeding. However, on the other hand, the evaluation of genetic resources has not been sufficiently made. Rapid discrimination between species and subspecies varieties of collected genetic resources is very important for accurate management and protection of genetic resources. In addition, the identification of varieties, the identification and classification of trait traits of genetic resources, and the identification of soft relationships are very important for the conservation of genetic resources, the creation of new varieties, and the improvement of crops.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 초위성체 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요작물 및 소재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.Recent rapid advances in molecular biology have led to the development of nucleic acid fingerprint analysis methods and various DNA markers that enable bio-diversity studies at the nucleic acid (DNA) level. This makes it possible to search useful traits, identify species of species, identify species classifications, and analyze flexible relationships of populations in a simple and quick way with little influence on the external environment. Fingerprinting methods using polymerase chain reaction (PCR) developed so far include randomly amplified polymorphic DNAs (RAPD), amplified fragment length polymorphic DNA (AFLP), and simple sequence repeat (SSR). The RAPD method has a disadvantage of poor reproducibility because the non-specific PCR product is amplified, and the AFLP method is spotlighted by high DNA polymorphism detection, but has a disadvantage of complicated appearance and analysis of a low reproducible band. In contrast, the SSR method is a method of constructing a PCR primer based on nucleotide sequence information of a microsatellite region, which is a DNA repeat sequence. Frequently used. In particular, the SSR method has the advantage that it is not affected by the external environment at all. Due to the superiority of this SSR method, studies are underway to develop SSR markers in several major crops and cultivated crops.

벼에서는 벼 게놈에 반복되는 SSR을 PCR 기술로 증폭하여 벼 품종의 유전자형을 동정하는 초위성체 마커들이 개발되었다(대한민국 특허출원번호 제2001-34003 호). 미국의 탕(Tang) 박사팀은 879개의 SSR 마커들을 개발하여 해바라기의 유전자 지도를 발표한 바 있다(Tang et al ., Theor . Appl . Genet., 105: 1124-1136, 2002). 이외에도 보리, 콩 등에서 많은 SSR 마커들이 개발되었다. 그러나, 버섯에서는 SSR 마커가 아직 국내에서 전혀 개발된 바 없으며, 외국에서도 이와 관련된 연구가 거의 이루어지지 않은 실정이다.In rice, supersatellite markers have been developed that amplify SSR repeated in the rice genome by PCR technology to identify genotypes of rice varieties (Korean Patent Application No. 2001-34003). Tang's team in the United States developed 879 SSR markers and published a genetic map of sunflowers (Tang et al ., Theor . Appl . Genet ., 105: 1124-1136, 2002). In addition, many SSR markers have been developed in barley and soybeans. However, SSR markers have not been developed in Korea at all in mushrooms, and studies related to them have not been made in foreign countries.

이에 본 발명자들은 버섯의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 다양한 버섯 계통들에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have completed the present invention by developing SSR primer pairs showing a large number of polymorphic variation in various mushroom strains, while continuing to develop SSR markers capable of efficiently evaluating the genetic resources of mushrooms.

따라서, 본 발명의 목적은 버섯의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커 및 이의 용도를 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide an SSR marker and its use capable of efficiently evaluating the genetic resources of mushrooms.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 72로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an SSR primer pair having two nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 72.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 버섯의 DNA 다형성 검출 방법 및 버섯의 품종 동정 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for detecting DNA polymorphism of mushrooms and a method for identifying a variety of mushrooms, including performing PCR using the SSR primer pair.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 버섯의 DNA 다형성 검출용 키트 및 버섯의 품종 동정용 키트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a kit for detecting the DNA polymorphism of the mushroom and kit for identifying the variety of the mushroom including the SSR primer pair, DNA polymerase and PCR reaction buffer.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 버섯의 유전적 다형성을 특이적으로 분석할 수 있는 SSR 마커를 제공하는 것을 특징으로 한다. The present invention is characterized by providing an SSR marker capable of specifically analyzing the genetic polymorphism of the mushroom.

본 발명에서는 비오틴-스트렙타비딘 포획(biotin-streptavidin capture; Dixit et al., Mol. Eco. Note, 5: 736-738) 방법으로 버섯로부터 SSR 마커를 개발 하였다. 버섯에서 분리된 SSR 마커는 본 발명에 의해 처음으로 제공되는 것이다.In the present invention, SSR markers were developed from mushrooms by biotin-streptavidin capture (Dixit et al., Mol. Eco.Note, 5: 736-738). SSR markers isolated from mushrooms are the first to be provided by the present invention.

구체적으로, 본 발명의 SSR 마커는 다음과 같은 방법으로 개발되었다. 버섯로부터 추출한 게놈 DNA를 제한효소로 처리해 DNA 단편을 제조한 후 AP11 및 AP12의 2개의 어댑터와 라이게이션하였다.Specifically, the SSR marker of the present invention was developed by the following method. Genomic DNA extracted from the mushroom was treated with restriction enzymes to prepare DNA fragments and then ligated with two adapters of AP11 and AP12.

라이게이션 산물을 비오틴이 표지된 SSR 탐침과 혼성화한 후 마그네틱 비드를 이용해 분리하였다. 이를 AP11 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭한 후 서열을 분석함으로써 버섯의 초위성체를 포함하고 있는 500개의 DNA단편을 수득하였다.Ligation products were hybridized with biotin-labeled SSR probes and then separated using magnetic beads. PCR was performed using the AP11 primer to amplify and analyze the sequence, thereby obtaining 500 DNA fragments containing the mushroom supernatant.

상기에서 수득한 DNA단편을 분석함으로써 5개 이상의 반복 유닛을 포함하고 있는 단편만을 선발하고 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 초위성체를 증폭 할 수 있는 양방향 프라이머 200쌍을 디자인 하였다. 상기 프라이머쌍을 사용하여 다양한 재배형 버섯 계통 및 품종들의 PCR을 통한 DNA 프로파일링을 수행함으로써 다형성 변이를 많이 나타내는 36쌍의 SSR 프라이머쌍을 선발하였다.By analyzing the DNA fragments obtained above, 200 pairs of bidirectional primers were designed to select only fragments containing five or more repeating units and to amplify the supersatellite based on the portion containing the repeating unit. 36 pairs of SSR primer pairs showing polymorphic variation were selected by performing DNA profiling through PCR of various cultured mushroom strains and varieties using the primer pairs.

본 발명에서 제공하는 SSR 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 72로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다. 바람직하게는 GB-PO-001(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-006(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-011(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-025(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-026(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-028(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이 머쌍), GB-PO-039(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-050(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-051(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-061(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-064(서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-076(서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-079(서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-080(서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-086(서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-094(서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-097(서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-102(서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-113(서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-115(서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-117(서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-124(서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-128(서열번호 45와 46으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-131(서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-134(서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-135(서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-138(서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-149(서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-152(서열번호 57과 58로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-154(서열번호 59와 60으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-157(서열번호 61과 62로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-171(서열번호 63과 64로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-172(서열번호 65와 66으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-173(서열번호 67과 68로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-181(서열번호 69와 70으로 표시되는 프라이머쌍) 및 GB-PO- 190(서열번호 71과 72로 표시되는 프라이머쌍)으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 및 이들에 의해 증폭되는 초위성체에 존재하는 반복 모티브(repeat motif), 증폭되는 초위성체의 크기, Tm(℃) 및 초위성체가 존재하는 염색체 대립인자에 대한 정보를 하기 표 1에 기재하였다.The SSR marker provided by the present invention refers to a pair of PCR primers, and includes a forward primer and a reverse primer. SSR primer pair provided in the present invention has two base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 72. Preferably GB-PO-001 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 1 and 2), GB-PO-006 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 3 and 4), GB-PO-011 (SEQ ID NOs: 5 and 6) Primer pairs shown in the figure), GB-PO-025 (primary pairs shown in SEQ ID NOs: 7 and 8), GB-PO-026 (primary pairs shown in SEQ ID NOs: 9 and 10), GB-PO-028 (SEQ ID NO: Primer pairs represented by numbers 11 and 12), GB-PO-039 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 13 and 14), GB-PO-050 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 15 and 16), and GB-PO -051 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 17 and 18), GB-PO-061 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 19 and 20), and GB-PO-064 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 21 and 22) , GB-PO-076 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 23 and 24), GB-PO-079 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 25 and 26), and GB-PO-080 (SEQ ID NOs: 27 and 28) Primer pairs), GB-PO-086 (SEQ ID NOS: 29 and 30) Primer pairs), GB-PO-094 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 31 and 32), GB-PO-097 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 33 and 34), and GB-PO-102 (SEQ ID NOs 35 and Primer pair represented by 36), GB-PO-113 (primary pair represented by SEQ ID NOs: 37 and 38), GB-PO-115 (primary pair represented by SEQ ID NOs: 39 and 40), and GB-PO-117 ( Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 41 and 42), GB-PO-124 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 43 and 44), GB-PO-128 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 45 and 46), GB- PO-131 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 47 and 48), GB-PO-134 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 49 and 50), and GB-PO-135 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 51 and 52) ), GB-PO-138 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 53 and 54), GB-PO-149 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 55 and 56), and GB-PO-152 (SEQ ID NOs: 57 and 58) Primer pairs shown), GB-PO-154 (SEQ ID NOs: 59 and 60) Primer pairs), GB-PO-157 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 61 and 62), GB-PO-171 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 63 and 64), and GB-PO-172 (SEQ ID NO: 65 Primer pairs represented by and 66), GB-PO-173 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 67 and 68), GB-PO-181 (primer pairs represented by SEQ ID NOs: 69 and 70), and GB-PO-190 (A primer pair represented by SEQ ID NOs: 71 and 72). Information on the primer pairs provided in the present invention and the repeat motifs present in the supersatellites amplified by them, the size of the supersatellites to be amplified, T m (° C.) and the chromosomal alleles in which the supersatellites are present It is listed in Table 1 below.

프라이머명Primer Name 서열order 서열
번호order
number 반복모티브Repeating motif 증폭되는 초위성체의 크기의 범위(bp)Range of size of supersatellite to be amplified (bp) Tm(℃)Tm (℃) 대립인자의 수Number of alleles GB-PO-001GB-PO-001 F : CGCAAGCTACAAACGGACF: CGCAAGCTACAAACGGAC 1One (GCA)3(ATTGGC)(GCA)1(GCA) 3 (ATTGGC) (GCA) 1 307-313307-313 5252 22 R : AGCAGCAAGCACAAGAGCR: AGCAGCAAGCACAAGAGC 22 GB-PO-006GB-PO-006 F : TGTGGCAAACCCAAGTTCF: TGTGGCAAACCCAAGTTC 33 (GGC)4(GAC)(GGC)1(GGC) 4 (GAC) (GGC) 1 203-206203-206 5252 22 R : CCCAAAGGATGAGGAAGGR: CCCAAAGGATGAGGAAGG 44 GB-PO-011GB-PO-011 F : TCCCATACCCTGACATCGF: TCCCATACCCTGACATCG 55 (CTG)4(TA)(CTG)1(CTG) 4 (TA) (CTG) 1 166-235166-235 5252 55 R : ATCATCAAGCGCCACAACR: ATCATCAAGCGCCACAAC 66 GB-PO-025GB-PO-025 F : TGATCATGGCGAGTAGGGF: TGATCATGGCGAGTAGGG 77 (GGA)10(GGA) 10 214-217214-217 5252 22 R : GGAACTGTCAGCAGACGCR: GGAACTGTCAGCAGACGC 88 GB-PO-026GB-PO-026 F : AATCGCATGGGCTCTGF: AATCGCATGGGCTCTG 99 (TTG)3(TTC)(TTG)3(TTG) 3 (TTC) (TTG) 3 293-296293-296 5252 22 R : CTGTCCCTCCGTGTACCAR: CTGTCCCTCCGTGTACCA 1010 GB-PO-028GB-PO-028 F : CTGGAGAATCGTAGCCCCF: CTGGAGAATCGTAGCCCC 1111 (GTC)13(CAT)5(GTC) 13 (CAT) 5 291-318291-318 5252 55 R : ACAAGCGCTCGGAATACAR: ACAAGCGCTCGGAATACA 1212 GB-PO-039GB-PO-039 F : TGTGGATGTGATGTGATGTGF: TGTGGATGTGATGTGATGTG 1313 (GGT)2(GGC)(GGT)5(GGT) 2 (GGC) (GGT) 5 191-224191-224 5252 44 R : ACGTCCAGCGTCGAGTTAR: ACGTCCAGCGTCGAGTTA 1414 GB-PO-050GB-PO-050 F : CATCCGATACAGACCCGAF: CATCCGATACAGACCCGA 1515 (GTT)5(GTT) 5 145-175145-175 5252 55 R : AGGCATCCCACAACACTGR: AGGCATCCCACAACACTG 1616 GB-PO-051GB-PO-051 F : CATAGGGACGACAGCGAGF: CATAGGGACGACAGCGAG 1717 (GCT)6(GCT) 6 272-278272-278 5252 33 R : ACTGAGCCTTCAGCACCAR: ACTGAGCCTTCAGCACCA 1818 GB-PO-061GB-PO-061 F : TAACTTGGGCGCTTGAAAF: TAACTTGGGCGCTTGAAA 1919 (GCA)2(CAGTAC)(GCA)3(GCA) 2 (CAGTAC) (GCA) 3 258-270258-270 5252 22 R : TGGAACGCGTAGACTTGGR: TGGAACGCGTAGACTTGG 2020 GB-PO-064GB-PO-064 F : GTTCTGAGGGTTGAGGGGF: GTTCTGAGGGTTGAGGGG 2121 (GTT)5(ATT)(GTT)3(GTT) 5 (ATT) (GTT) 3 209-227209-227 5252 33 R : CCAACCACACTCTTCCCAR: CCAACCACACTCTTCCCA 2222 GB-PO-076GB-PO-076 F : TCGATTGTCAGATTGTTGGAF: TCGATTGTCAGATTGTTGGA 2323 (GGC)6(GGC) 6 233-248233-248 5252 44 R : CGGAGAAGCAGTTGGTTGR: CGGAGAAGCAGTTGGTTG 2424 GB-PO-079GB-PO-079 F : ACCCAGACGATTTGGGAGF: ACCCAGACGATTTGGGAG 2525 (GGA)4(AGA)(GGA)2(GGA) 4 (AGA) (GGA) 2 230-233230-233 5252 44 R : AGGCTGGCGTGGAATACTR: AGGCTGGCGTGGAATACT 2626 GB-PO-080GB-PO-080 F : CACCCATGTGCCTCAGTCF: CACCCATGTGCCTCAGTC 2727 (GGC)6(GGC) 6 203-233203-233 5252 22 R : TGTCTATGGGTTACGGCGR: TGTCTATGGGTTACGGCG 2828 GB-PO-086GB-PO-086 F : CATCTTCGATGAACCGGAF: CATCTTCGATGAACCGGA 2929 (GA)3(GGAGAAGC)(GA)3, (CGA)3(GA) 3 (GGAGAAGC) (GA) 3, (CGA) 3 378-380378-380 5252 22 R : CGAAGATGAGCCAGCAACR: CGAAGATGAGCCAGCAAC 3030 GB-PO-094GB-PO-094 F : CGCGAGACAATTAAACGCF: CGCGAGACAATTAAACGC 3131 (CCT)2(TCT)(CCT)2(CCT) 2 (TCT) (CCT) 2 303-324303-324 5252 22 R : ACAGTTCCTGGAGCCCATR: ACAGTTCCTGGAGCCCAT 3232 GB-PO-097GB-PO-097 F : CATGGAGAGAGGGCGGF: CATGGAGAGAGGGCGG 3333 (GGT)5(GGT) 5 241-247241-247 5252 33 R : CGTTTCATCGTTCGCTGTR: CGTTTCATCGTTCGCTGT 3434 GB-PO-102GB-PO-102 F : TGTCTATGGGTTACGGCGF: TGTCTATGGGTTACGGCG 3535 (GCC)4(GC)(GCC)1(GCC) 4 (GC) (GCC) 1 266-269266-269 5252 22 R : TGCAAAGCAAATCGGAACR: TGCAAAGCAAATCGGAAC 3636 GB-PO-113GB-PO-113 F : GTTCATCTGAACGCCGTCF: GTTCATCTGAACGCCGTC 3737 (CGC)5(CGC) 5 270-375270-375 5252 22 R : CCTATGACGAGGGGAAGGR: CCTATGACGAGGGGAAGG 3838 GB-PO-115GB-PO-115 F : TGGTAGCAGGTTGTTGGGF: TGGTAGCAGGTTGTTGGG 3939 (TGC)5(GCTGGC)(TGC)4(TGC) 5 (GCTGGC) (TGC) 4 213-228213-228 5252 33 R : CCGCTAAGCCACTGTTTGR: CCGCTAAGCCACTGTTTG 4040 GB-PO-117GB-PO-117 F : TCAAACTCACGTGGTACGCF: TCAAACTCACGTGGTACGC 4141 (TGC)7(TGC) 7 218-224218-224 5252 33 R : TCACATATCCGCCGGTAGR: TCACATATCCGCCGGTAG 4242 GB-PO-124GB-PO-124 F : TGCGTTTGCTCGGTTAATF: TGCGTTTGCTCGGTTAAT 4343 (CG)5(CG) 5 264-300264-300 5252 55 R : CGCTACTACGTCGATCCGR: CGCTACTACGTCGATCCG 4444 GB-PO-128GB-PO-128 F : TGATTGGTTTGAATGGGCF: TGATTGGTTTGAATGGGC 4545 (GTT)10(GTT) 10 214-238214-238 5252 55 R : GCACGATGAGGATGCAGTR: GCACGATGAGGATGCAGT 4646 GB-PO-131GB-PO-131 F : CTCCCTCCTCCGTGTACCF: CTCCCTCCTCCGTGTACC 4747 (CCT)2(CCCC)(CCT)2(CCT) 2 (CCCC) (CCT) 2 200-212200-212 5252 33 R : CGTAACGTTCGCTTCCTGR: CGTAACGTTCGCTTCCTG 4848 GB-PO-134GB-PO-134 F : GAGTGTGAAGAATCGGCGF: GAGTGTGAAGAATCGGCG 4949 (GA)2(GT)(GA)3(GA) 2 (GT) (GA) 3 115-269115-269 5252 22 R : GTGCACTCTGCCTATCGCR: GTGCACTCTGCCTATCGC 5050

프라이머명Primer Name 서열order 서열
번호order
number 반복모티브Repeating motif 증폭되는 초위성체의 크기의 범위(bp)Range of size of supersatellite to be amplified (bp) Tm(℃)Tm (℃) 대립인자의 수Number of alleles GB-PO-135GB-PO-135 F : AGGAGGGGGTGCTTGATAF: AGGAGGGGGTGCTTGATA 5151 (GGA)2(GGGA)(GGA)2(GGA) 2 (GGGA) (GGA) 2 244-271244-271 5252 22 R : TCCTCCGCCTTCTCTACCR: TCCTCCGCCTTCTCTACC 5252 GB-PO-138GB-PO-138 F : TATGGAACGGTGCGAAGTF: TATGGAACGGTGCGAAGT 5353 (CCG)4, (TTC)3(CCG) 4, (TTC) 3 191-206191-206 5252 33 R : GCCGTCAAAAGGGAACTCR: GCCGTCAAAAGGGAACTC 5454 GB-PO-149GB-PO-149 F : AGTGCATATGCCCGACACF: AGTGCATATGCCCGACAC 5555 (TCC)8(TCC) 8 193-205193-205 5252 33 R : CGTCGTAGATGCAGGCTCR: CGTCGTAGATGCAGGCTC 5656 GB-PO-152GB-PO-152 F : ACTGAGCCTTCAGCACCAF: ACTGAGCCTTCAGCACCA 5757 (AGC)5(AGC) 5 272-278272-278 5252 33 R : CATAGGGACGACAGCGAGR: CATAGGGACGACAGCGAG 5858 GB-PO-154GB-PO-154 F : GTCGTAGCCAGCCATGAGF: GTCGTAGCCAGCCATGAG 5959 (CGA)7(CGA) 7 254-266254-266 5252 44 R : AGGGTATCTCGGGTGCATR: AGGGTATCTCGGGTGCAT 6060 GB-PO-157GB-PO-157 F : ATGGACGTGGTGTTCTGCF: ATGGACGTGGTGTTCTGC 6161 (GCT)4(GCT) 4 281-302281-302 5252 33 R : AAACCAAGCCTACCCAGCR: AAACCAAGCCTACCCAGC 6262 GB-PO-171GB-PO-171 F : TCTCGGGCATCATTCTTGF: TCTCGGGCATCATTCTTG 6363 (TTG)3, (TA)4(TTG) 3, (TA) 4 295-310295-310 5252 44 R : ACGTCAGGGTGTCAAACGR: ACGTCAGGGTGTCAAACG 6464 GB-PO-172GB-PO-172 F : GCAGAAGTTGCCCAAAGAF: GCAGAAGTTGCCCAAAGA 6565 (TGC)2(TAC)(TGC)5(TGC) 2 (TAC) (TGC) 5 169-229169-229 5252 22 R : ATGTCCAGCGGAAGACCTR: ATGTCCAGCGGAAGACCT 6666 GB-PO-173GB-PO-173 F : ATGAAGTGTGAGCCGTGGF: ATGAAGTGTGAGCCGTGG 6767 (GT)8(GT) 8 294-309294-309 5252 44 R : TGTCCATTCATGCGTTCAR: TGTCCATTCATGCGTTCA 6868 GB-PO-181GB-PO-181 F : TTATTGTGAAGCCCCCGF: TTATTGTGAAGCCCCCG 6969 (CAG)1(CAA)(CAG)5(CAG) 1 (CAA) (CAG) 5 240-246240-246 5252 33 R : GACATCGGCAGAAGGTCAR: GACATCGGCAGAAGGTCA 7070 GB-PO-190GB-PO-190 F : TTTCCATTTCCGTTGGTGF: TTTCCATTTCCGTTGGTG 7171 (TGC)3(TGT)(TGC)2(TGC) 3 (TGT) (TGC) 2 186-198186-198 5252 44 R : CAGGGGGTGATTATGCAAR: CAGGGGGTGATTATGCAA 7272

aF: 정방향 프라이머 bR: 역방향 프라이머 a F: forward primer b R: reverse primer

본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 버섯에서 DNA 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 버섯의 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 버섯의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다. SSR primer pairs provided in the present invention can be usefully used to detect DNA polymorphism and to analyze genetic diversity in mushrooms. The SSR primers according to the present invention can be used to efficiently evaluate and preserve the genetic resources of mushrooms. Accordingly, the present invention provides a method for detecting DNA polymorphism of a mushroom comprising performing PCR using the SSR primer pair.

구체적으로 버섯의 DNA 다형성 검출 방법은 Specifically, the DNA polymorphism detection method of mushrooms

(a) 버섯으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (a) extracting genomic DNA from the mushroom;

(b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및(b) performing PCR using the extracted genomic DNA as a template and the SSR primer pair provided by the present invention; And

(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.(c) separating the PCR products by size.

상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol . Biol . Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al ., Nuc . Res ., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. Extraction of genomic DNA in step (a) is phenol / chloroform extraction, SDS extraction (Tai et. al ., Plant Mol . Biol . Reporter , 8: 297-303, 1990), CTAB separation method (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al . , Nuc . Res . , 4321-4325, 1980) or commercially available DNA extraction kits.

또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 버섯에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 52-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분 30초를 36 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다. In addition, the PCR in the step (b) may be performed using a PCR reaction mixture containing a variety of components known in the art required for the PCR reaction. The PCR reaction mixture includes an appropriate amount of DNA polymerase, dNTP, PCR buffer and water (dH 2 O) in addition to genomic DNA extracted from the mushroom to be analyzed and the SSR primer pair provided in the present invention. The PCR buffer solution includes Tris-HCl, MgCl 2 , KCl, and the like. At this time, MgCl 2 Concentration greatly affects the specificity and quantity of amplification, and may be preferably used in the range of 1.5-2.5 mM. In general, when Mg 2 + is insufficient if the excess will increase the non-specific PCR amplification products and, Mg 2 + PCR The yield of the product is reduced. The PCR buffer may further include an appropriate amount of Triton X-100. PCR also denatured the template DNA at 94-95 ° C., followed by denaturation; Annealing; And a cycle of extension, followed by general PCR reaction conditions which are finally elongated at 72 ° C. The denaturation and amplification may be performed at 94-95 ° C. and 72 ° C., respectively, and the temperature at the time of binding may vary depending on the type of primer. Preferably it is 52-57 degreeC, More preferably, it is 55 degreeC. The time and number of cycles in each step can be determined according to the conditions generally made in the art. The optimal reaction conditions when performing PCR using the SSR primer pair according to the present invention are as follows: After denature the template DNA for 3 minutes at 95 ℃, 30 seconds at 95 ℃; 30 seconds at 55 ° C .; And repeating 36 cycles of 1 minute 30 seconds at 72 ° C., and finally reacting at 72 ° C. for 5 minutes.

상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.In step (c), DNAs of PCR products may be separated according to sizes according to methods well known in the art. Preferably it can be confirmed by an agarose gel (agarose gel) or polyacrylamide gel electrophoresis or fluorescence analysis (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram). At this time, in order to use the fluorescence analyzer PCR is performed in the step (b) using a primer pair attached to a fluorescent die known in the art. PCR amplification results can be preferably confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis, more preferably modified polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis results can be analyzed by silver staining after electrophoresis. General PCR performance and resulting analysis methods are well known in the art.

아울러, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 버섯의 품종 동정 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for identifying a variety of mushrooms, including performing PCR using the SSR primer pair.

구체적으로 버섯의 품종 동정 방법은 Specifically, how to identify mushroom varieties

(a) 버섯 및 대조군 버섯 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (a) extracting genomic DNA from mushroom and control mushroom varieties;

(b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;(b) performing PCR using each of the extracted genomic DNA as a template and the SSR primer pair provided by the present invention;

(c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및 (c) separating each PCR product by size; And

(d) 상기 (c) 단계의 각각의 크기별 분리 결과를 서로 비교하는 단계를 포함한다.(d) comparing the separation results for each size of step (c) with each other.

(a) 내지 (c) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 (d) 단계에서 버섯 및 대조군 버섯 품종에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대한 시료가 되는 버섯과 대조군 버섯 품종의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 버섯과 대조군 버섯 품종의 결과와 모두 일치하면 시료가 되는 버섯은 대조군 버섯 품종과 동일한 품종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종의 동정 방법은 신규 유전자원 도입시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.Genomic DNA extraction in step (a) to (c), PCR and separation of PCR products by size are as described above, and in step (d) the comparison of mushroom and control mushroom varieties is the same combination of SSR primers This is done by comparing the size of each PCR product of the mushroom and the control mushroom variety that is a sample for the pair. By comparing the size comparison results for each SSR primer pair, if the sample and the control mushroom varieties match both, the sample mushroom can be identified as the same varieties as the control mushroom varieties. The identification method of the variety can be useful when the identification of the breed, such as judging whether there is a violation of the labeling of origin through judging whether the overlapping when introducing a new genetic resource and confirm the origin.

대조군 버섯 품종에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 버섯과 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 버섯 보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 버섯에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.Genomic DNA extraction, PCR, and size separation of PCR products for control mushroom varieties may be performed simultaneously with the sample mushroom, but may be performed prior to the sample mushroom and prepared as a reference for identification. Using such a reference table can be useful because it can be compared with the reference table by performing genomic DNA extraction, PCR and separation of the size of the PCR product for the mushroom to be a sample.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 버섯의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. The present invention also provides a kit for detecting DNA polymorphism of a mushroom comprising a SSR primer pair according to the present invention. In addition, DNA polymerase and a PCR reaction buffer of the above-described composition may be additionally included in order to easily perform a PCR reaction, and components necessary for performing electrophoresis to confirm amplification of a PCR product are present. It may be further included in the kit of the invention.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 버섯의 품종 동정용 키트를 제공한다. 품종 동정 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. The present invention also provides a kit for identifying a variety of mushrooms comprising the SSR primer pair according to the present invention. The breed identification method is as described above. In addition to the DNA polymerase and the PCR reaction buffer of the above-described composition in order to be able to easily perform the PCR reaction may be further included, the components or known to perform electrophoresis to confirm whether the PCR product amplification or not Identification criteria for selected varieties may be further included in the kits of the present invention.

본 발명에 적용될 수 있는 버섯은 Pleurotus Ostreatus Kummer 및 이들의 변종일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 Pleurotus Ostreatus Kummer 일 수 있다.Mushroom that can be applied to the present invention is Pleurotus Ostreatus Kummer and variants thereof, but are not limited thereto. Preferably Pleurotus Ostreatus It can be Kummer.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 버섯에서 처음으로 SSR 마커를 개발하였다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 버섯의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 버섯의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 버섯의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 버섯의 품종을 판별할 수 있다. As described above, in the present invention, the first SSR marker was developed in the mushroom. SSR primer pairs provided in the present invention can be very useful for effectively preparing DNA profiles of mushrooms by effectively detecting the DNA polymorphism of mushrooms. In this way, by efficiently evaluating the genetic resources of mushrooms, it is possible to effectively perform redundancy analysis and establishment of novelty with existing resources when introducing new genetic resources, and to identify mushroom varieties.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<< 실시예Example 1>  1> 게놈 Genome DNADNA 추출 extraction

재배종 버섯(농업생명공학연구원 유전자원과, 보존번호 : PO06)로부터 SDS를 이용한 방법(Tai et al., Plant Mol . Biol . Reporter, 8: 297-303, 1990)에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 이를 상세히 설명하면 다음과 같다. 생육 1개월째의 어린 버섯 식물체로부터 0.5 g의 잎 조직을 채취하여 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 액체질소로 급냉시켰다. 이후, 즉시 플라스틱 막대로 잎을 곱게 마쇄하였다. 마쇄된 잎이 녹기 전에 추출 완충용액(200 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 750 ㎕를 첨가하고, 혼합액을 65℃에서 30분간 보관하였다. 여기에 동량의 페놀(phenol):클로로포름(chloroform):이소아밀알코올(isoamylalchol) (25:24:1) 용액을 추가로 첨가한 후, 약 15분간 교반하였다. 이를 13,000 rpm에서 15분간 원심 분리하였다. 상등액을 취하여 새 튜브에 옮겼다. 상기 튜브에 동량의 이소프로판올(-20℃)을 첨가하고, -20℃에서 1시간 보관하였다. 이후, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 버린 후 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하였다. DNA를 건조시킨 후, 약 300 ㎕의 RNase (50 ㎍/㎖)를 함유하는 TE 완충용액(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4)을 첨가하여 충분히 녹인 후, 37℃에서 1시간동안 보관하였다. Method using SDS from cultivated mushrooms (Dept. of Genetic Resources, Agricultural Biotechnology Research Institute, Conservation No .: PO06) (Tai et al ., Plant Mol . Biol . Genomic DNA was extracted according to Reporter , 8: 297-303, 1990). This will be described in detail as follows. 0.5 g of leaf tissue was taken from the young mushroom plants at 1 month of growth and placed in a 1.5 ml tube and quenched with liquid nitrogen. The leaf was then ground finely with a plastic rod immediately. Before the ground leaves were dissolved, 750 μl of extraction buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8.0), 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) was added and the mixture was stored at 65 ° C. for 30 minutes. An equivalent amount of a phenol (chloro): chloroform: isoamylalchol (25: 24: 1) solution was further added thereto, followed by stirring for about 15 minutes. It was centrifuged for 15 minutes at 13,000 rpm. The supernatant was taken and transferred to a new tube. Equal amount of isopropanol (-20 ° C.) was added to the tube and stored at −20 ° C. for 1 hour. Thereafter, the mixture was centrifuged at 13,000 rpm for 15 minutes. After discarding the supernatant, the precipitated DNA was washed with 70% ethanol. After the DNA was dried, it was sufficiently dissolved by adding TE buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4) containing about 300 µl of RNase (50 µg / ml), followed by 1 hour at 37 ° C. Stored.

<< 실시예Example 2>  2> 어댑터와의 라이게이션(Ligation with adapters ( ligationligation ))

상기 실시예 1에서 얻은 게놈 DNA 500 ng을 각 제한효소 제조사의 지침에 따라 EcoRV, DraI, SmaI, PvuI, AluI, HaeIII 및 RsaI로 절단하였다. 절단된 DNA를 1.2% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 약 300-1500 bp 크기의 DNA 단편만을 겔로부터 일루션(elution)하여 수득하였다. 이후, 수득된 DNA 단편을 표 2에 나타낸 2개의 어댑터(adapter; AP-11 및 AP-12, 각 50ng)와 T4 DNA 라이게이즈(ligase; Promega, 미국)를 이용하여 12℃에서 하룻밤 동안 라이게이션시켰다. 이 때 라이게이션 효율을 높이기 위해 AP-12 어댑터는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, Promega, 미국)로 5’ 말단을 인산화하였으며, 라이게이션시의 반응용액의 조성은 다음과 같다: 1X 라이게이션 버퍼(Promega, 미국), 50ng AP11 어댑터, 50ng AP12 어댑터, 150ng DNA 단편, 3 Unit T4 라이게이즈(Promega, 미국).500 ng of genomic DNA obtained in Example 1 was digested with Eco RV, Dra I, Sma I, Pvu I, Alu I, Hae III and Rsa I according to the instructions of each restriction enzyme manufacturer. After cleaved DNA was electrophoresed in a 1.2% agarose gel, only DNA fragments of about 300-1500 bp size were obtained by elution from the gel. The DNA fragments obtained were then lysed overnight at 12 ° C. using two adapters (AP-11 and AP-12, 50 ng each) and a T4 DNA ligase (Promega, USA) shown in Table 2. Gated. To increase ligation efficiency, the AP-12 adapter phosphorylated the 5 'end with alkaline phosphatase (Promega, USA), and the composition of the reaction solution during ligation is as follows: 1X ligation buffer (Promega). , USA), 50 ng AP11 adapter, 50 ng AP12 adapter, 150 ng DNA fragment, 3 Unit T4 ligation (Promega, USA).

어댑터 명Adapter name 염기서열Sequence 서열번호SEQ ID NO: AP-11AP-11 5'-CTCTTGCTTAGATCTGGACTA-3'5'-CTCTTGCTTAGATCTGGACTA-3 ' 7373 AP-12AP-12 5'-TAGTCCAGATCTAAGCAAGAGCACA-3'5'-TAGTCCAGATCTAAGCAAGAGCACA-3 ' 7474

<< 실시예Example 3>  3> 초위성체를Supersatellite 포함하고 있는  Containing DNADNA 단편의 선발 및 분리 Selection and Separation of Fragments

<3-1> 마그네틱 비드 준비<3-1> Magnetic Bead Preparation

마그네틱 비드(magnetic bead; SA-PMPs, Promega, 미국; 1 mg/ml) 0.6 ml를 마그네틱 분리기(magnetic stand; Promega, 미국)로 수집한 후 용액을 제거하였다. 여기에 0.5x SSC(Saline-Sodium Citrate) 버퍼 0.6 ml를 넣어 세척을 하고 다시 마그네틱 분리기로 수집한 후 용액을 제거하였다. 0.5x SSC 버퍼를 이용한 세척은 3회 반복하여 실시하였다. 세척한 마그네틱 비드에 0.5x SSC 버퍼 100 ㎕를 넣은 후 30분이내에 사용하였다.The solution was removed after collecting 0.6 ml of magnetic beads (SA-PMPs, Promega, USA; 1 mg / ml) with a magnetic stand (Promega, USA). 0.6 ml of 0.5x Saline-Sodium Citrate (SSC) buffer was added thereto, washed, and collected again using a magnetic separator to remove the solution. Washing with 0.5 × SSC buffer was performed three times. 100 μl of 0.5 × SSC buffer was added to the washed magnetic beads and used within 30 minutes.

<3-2> 혼성화<3-2> hybridization

상기 실시예 2에서 제조한 라이게이션 산물에 증류수를 넣어 500 ㎕가 되도록 한 후 65℃에서 10분간 변성(denature)시켰다. 여기에 바로 비오틴(biotin)이 표지된 SSR 탐침 1.5 ㎕(20ng)와 20x SSC 버퍼 13 ㎕를 넣고 상온에서 10분간 방치하여 결합을 유도하였다. 혼성화에 사용된 8개의 SSR 탐침은 하기 표 3에 기재하였으며, SSR 탐침은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 비오틴으로 표지하였다.Distilled water was added to the ligation product prepared in Example 2 to 500 μl, and then denatured at 65 ° C. for 10 minutes. Biotin-labeled SSR probe 1.5 μl (20ng) and 20 μl SSC buffer 13 μl were added thereto and left for 10 minutes at room temperature to induce binding. The eight SSR probes used for hybridization are listed in Table 3 below, and the SSR probes were labeled with biotin according to conventional methods known in the art.

서열order 서열번호SEQ ID NO: Biotin-(GA)20 Biotin- (GA) 20 7575 Biotin-(AT)20 Biotin- (AT) 20 7676 Biotin-(CA)20 Biotin- (CA) 20 7777 Biotin-(AGC)15 Biotin- (AGC) 15 7878 Biotin-(GGC)15 Biotin- (GGC) 15 7979 Biotin-(AAG)15 Biotin- (AAG) 15 8080 Biotin-(AAC)15 Biotin- (AAC) 15 8181 Biotin-(AGG)15 Biotin- (AGG) 15 8282

혼성화 반응을 통하여 게놈 DNA 단편 중 상기 반복염기서열을 가지고 있는 DNA 단편들은 비오틴이 표지된 SSR 탐침들과 상보적 결합을 할 것이고, 이를 SSR 탐침-템플릿(template) 혼성체(hybrid)라고 한다.Through hybridization reaction, DNA fragments having the repeat base sequence of genomic DNA fragments will complementarily bind to biotin-labeled SSR probes, which are called SSR probe-template hybrids.

<3-3> 템플릿의 분리<3-3> Separation of Template

<3-1>에서 제조한 마그네틱 비드 용액을 <3-2>에서의 SSR 탐침-템플릿 혼성체 용액에 넣고 상온에서 10분간 방치시킨다. 반응용액에서 마그네틱 분리기로 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 수집하고 상등액을 제거하였다. 상기 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 0.1x SSC 300 ㎕로 4회 세척한 후 증류수 50 ㎕를 넣고 90℃에서 5분간 가열하여 하기 템플릿을 분리하였다.The magnetic bead solution prepared in <3-1> was placed in the SSR probe-template hybrid solution in <3-2> and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Magnetic beads in which the SSR probe-template hybrid was bound were collected by using a magnetic separator in the reaction solution, and the supernatant was removed. The magnetic beads combined with the SSR probe-template hybrid were washed four times with 300 μl of 0.1 × SSC, and then 50 μl of distilled water was added and heated at 90 ° C. for 5 minutes to separate the template.

<3-4> PCR 반응<3-4> PCR reaction

<3-3>에서 분리한 템플릿에 대해 AP-11 어댑터를 프라이머로 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 혼합물(20㎕)의 조성은 다음과 같다: 250 ng 어댑터-라이게이션된 DNA, 10 pmol AP11 프라이머, 2 mM dNTP, 2 units Taq DNA 중합효소, 5 ㎕ 10× 완충용액. PCR 반응은 72℃에서 2분, 94℃에서 3분동안 가열한 후 94℃에서 30초; 56℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 24 싸이클(cycle)로 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다.The PCR reaction was performed using the AP-11 adapter as a primer on the template isolated in <3-3>. The composition of the PCR reaction mixture (20 μl) is as follows: 250 ng adapter-ligated DNA, 10 pmol AP11 primer, 2 mM dNTP, 2 units Taq DNA polymerase, 5 μl 10 × buffer. PCR reactions were heated at 72 ° C. for 2 minutes, 94 ° C. for 3 minutes, and then at 94 ° C. for 30 seconds; 30 seconds at 56 ° C .; And 1 minute at 72 ° C. for 24 cycles, and finally at 72 ° C. for 10 minutes.

이와 같은 방법으로 본 발명에서는 초위성체를 함유하고 있는 500개의 DNA 단편을 분리하였다. In this manner, in the present invention, 500 DNA fragments containing supersatellites were isolated.

<< 실시예Example 4>  4> 분리된 Separated DNADNA 단편의 서열분석 및  Sequencing of fragments and 프라이머primer 디자인 design

상기 실시예 3에서 분리된 초위성체를 함유하고 있는 DNA 단편들을 pGEM T-easy vector 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하여 이들의 서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 (주)솔젠트에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 서열을 기초로 하여 5개 이상의 반복 유닛(repeat unit)을 포함하고 있는 단편만을 선발하였다. 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 하여 초위성체를 증폭할 수 있는 양 방향의 프라이머를 디자인하였다. 총 200쌍의 프라이머쌍을 디자인하였다(결과미도시).DNA fragments containing the supersatellite isolated in Example 3 were cloned into pGEM T-easy vector vector (Promega, USA) to analyze their sequence. Sequence analysis was performed by requesting Solgent. Only fragments containing 5 or more repeat units were selected based on the analyzed sequences. Based on the part containing the repeating unit, a primer in both directions was designed to amplify the supersatellite. A total of 200 pairs of primer pairs were designed (results not shown).

<< 실시예Example 5>  5> SSRSSR 마커의Of marker 선발 Selection

상기 실시예 4에서 디자인된 프라이머쌍 중에서 다양한 버섯 계통에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머 조합을 선발하기 위하여, 하기 표 4에 기재된 16점의 재배형 버섯 또는 버섯 품종에 대하여 PCR을 통한 DNA 프로파일링(profiling) 분석을 수행하였다. In order to select an SSR primer combination showing a large number of polymorphic variation in various mushroom strains among the primer pairs designed in Example 4, DNA profiling through PCR for 16-point cultivated mushrooms or mushroom varieties shown in Table 4 below ( profiling) analysis was performed.

기탁번호Deposit number 기탁기관Depositary Institution 수집국
(원산지)Collection
(origin) 형(type)Type PO06PO06 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO01PO01 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO03PO03 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO07PO07 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO16PO16 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO18PO18 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO19PO19 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO24PO24 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO25PO25 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO26PO26 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO28PO28 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO34PO34 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO35PO35 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO54PO54 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO62PO62 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer PO73PO73 농촌진흥청Rural Development Administration 대한민국Republic of Korea Pleurotus Ostreatus Kummer Pleurotus Ostreatus kummer

각각의 PCR 반응 혼합물 (20㎕)의 조성은 다음과 같다: 실시예 1의 방법에 의해 분리한 버섯 주형 DNA 40ng, 정방향 프라이머 0.2μM, 역방향 프라이머 0.6μM, 형광물질이 표지된 M13 프라이머(TGTAAAACGACGGCCAGT, 서열번호 83) 0.6μM, 1X PCR 반응액 (10mM Tris-HCl (pH 8.8), 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 unit DNA 중합효소. PCR 반응은 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 각 프라이머의 Tm(표 1 참조)에 해당하는 온도에서 30초; 및 72℃에서 45초의 조건으로 35회 반복한 후, 다시 94℃에서 30초; 53℃에서 45초; 및 72℃에서 45초의 조건으로 15회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 15분의 조건으로 수행하였다. The composition of each PCR reaction mixture (20 μl) was as follows: 40 ng of mushroom template DNA isolated by the method of Example 1, 0.2 μM forward primer, 0.6 μM reverse primer, M13 primer labeled with fluorescent material (TGTAAAACGACGGCCAGT, SEQ ID NO: 83) 0.6 μM, 1 × PCR reaction solution (10 mM Tris-HCl, pH 8.8), 1.5 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 unit DNA polymerase. PCR reaction was performed after denaturing the template DNA for 3 minutes at 94 ℃, 30 seconds at 94 ℃; 30 seconds at the temperature corresponding to the T m of each primer (see Table 1); And 35 repetitions under conditions of 45 seconds at 72 ° C., and then 30 seconds at 94 ° C .; 45 sec at 53 ° C .; And 15 repetitions at 45 ° C. for 45 seconds, and finally at 72 ° C. for 15 minutes.

각기 다른 형광물질로 증폭된 PCR 산물 단편의 크기를 분석하기 위해 자동 염기서열 분석 장치 (ABI 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였다. 분석을 위하여, PCR 산물 1.5㎕, Hi-di 포름아미드(formamide) 9.2㎕, 내부 크기 표준시약(Internal Size Standard; Genescan-500 ROX) 0.3㎕을 혼합한 후 94℃에서 3분간 변성하여 분석에 사용하였다.An automated sequencing device (ABI 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, USA) was used to analyze the size of PCR product fragments amplified with different fluorescent materials. For the analysis, 1.5 μl of PCR product, 9.2 μl of Hi-di formamide, and 0.3 μl of internal size standard (Genscan-500 ROX) were mixed and denatured at 94 ° C. for 3 minutes. It was.

그 결과, 국내 및 국외에서 수집된 버섯 재배형 및 버섯 품종들에서 다형성을 나타내는 SSR 프라이머쌍 36쌍을 확인하여 GB-PO-001(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-006(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-011(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-025(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-026(서열번호 9과 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-028(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-039(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-050(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-051(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-061(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-064(서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-076(서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-079(서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-080(서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-086(서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-094(서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-097(서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-102(서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-113(서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-115(서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-117(서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-124(서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-128(서열번호 45와 46으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-131(서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-134(서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-135(서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-138(서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-149(서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-152(서열번호 57과 58로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-154(서열번호 59와 60으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-157(서열번호 61과 62로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-171(서열번호 63과 64로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-172(서열번호 65와 66으로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-173(서열번호 67과 68로 표시되는 프라이머쌍), GB-PO-181(서열번호 69와 70으로 표시되는 프라이머쌍) 및 GB-PO-190(서열번호 71과 72로 표시되는 프라이머쌍)을 선별하였다(표 1 참조). 상기 36쌍의 프라이머에 의해 증폭된 PCR 단편의 각각의 크기는 다음 표 5와 같다.As a result, we identified 36 pairs of SSR primer pairs showing polymorphisms in mushroom cultivars and mushroom varieties collected domestically and internationally. GB-PO-001 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 1 and 2), GB-PO- 006 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 3 and 4), GB-PO-011 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 5 and 6), GB-PO-025 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 7 and 8), GB-PO-026 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 9 and 10), GB-PO-028 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 11 and 12), and GB-PO-039 (SEQ ID NOs: 13 and 14) Primer pairs), GB-PO-050 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 15 and 16), GB-PO-051 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 17 and 18), and GB-PO-061 (SEQ ID NOs: 19 and Primer pair represented by 20), GB-PO-064 (primary pair represented by SEQ ID NOs: 21 and 22), GB-PO-076 (primary pair represented by SEQ ID NOs: 23 and 24), and GB-PO-079 ( Shown in SEQ ID NOs: 25 and 26 Is a primer pair), GB-PO-080 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 27 and 28), GB-PO-086 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 29 and 30), and GB-PO-094 (SEQ ID NO: 31 And primer pairs represented by 32), GB-PO-097 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 33 and 34), GB-PO-102 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 35 and 36), GB-PO-113 (Primary pairs represented by SEQ ID NOs: 37 and 38), GB-PO-115 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 39 and 40), GB-PO-117 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 41 and 42), GB -PO-124 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 43 and 44), GB-PO-128 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 45 and 46), and GB-PO-131 (primers represented by SEQ ID NOs: 47 and 48) Pairs), GB-PO-134 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 49 and 50), GB-PO-135 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 51 and 52), GB-PO-138 (SEQ ID NOs 53 and 54) Primer pair), GB-PO-149 (SEQ ID NOs. 55 and 56) Primer pairs), GB-PO-152 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 57 and 58), GB-PO-154 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 59 and 60), and GB-PO-157 (SEQ ID NO: Primer pairs represented by 61 and 62), GB-PO-171 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 63 and 64), GB-PO-172 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 65 and 66), and GB-PO- 173 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 67 and 68), GB-PO-181 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 69 and 70), and GB-PO-190 (primary pairs represented by SEQ ID NOs: 71 and 72) Screened (see Table 1). The size of each PCR fragment amplified by the 36 pairs of primers is shown in Table 5 below.

기탁번호
프라이머Deposit number
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<110> Rural Development Administration <120> SSR primer derived from Oyster Mushroom and use of there <160> 83 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-001 <400> 1 cgcaagctac aaacggac 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> revese primer of GB-PO-001 <400> 2 agcagcaagc acaagagc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-006 <400> 3 tgtggcaaac ccaagttc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-006 <400> 4 cccaaaggat gaggaagg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-011 <400> 5 tcccataccc tgacatcg 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-011 <400> 6 atcatcaagc gccacaac 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-025 <400> 7 tgatcatggc gagtaggg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-025 <400> 8 ggaactgtca gcagacgc 18 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-026 <400> 9 aatcgcatgg gctctg 16 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-026 <400> 10 ctgtccctcc gtgtacca 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-028 <400> 11 ctggagaatc gtagcccc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-028 <400> 12 acaagcgctc ggaataca 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-039 <400> 13 tgtggatgtg atgtgatgtg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-039 <400> 14 acgtccagcg tcgagtta 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-050 <400> 15 catccgatac agacccga 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-050 <400> 16 aggcatccca caacactg 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-051 <400> 17 catagggacg acagcgag 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-051 <400> 18 actgagcctt cagcacca 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-061 <400> 19 taacttgggc gcttgaaa 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-061 <400> 20 tggaacgcgt agacttgg 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-064 <400> 21 gttctgaggg ttgagggg 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-064 <400> 22 ccaaccacac tcttccca 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-076 <400> 23 tcgattgtca gattgttgga 20 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-076 <400> 24 cggagaagca gttggttg 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-079 <400> 25 acccagacga tttgggag 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-079 <400> 26 aggctggcgt ggaatact 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-080 <400> 27 cacccatgtg cctcagtc 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-080 <400> 28 tgtctatggg ttacggcg 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-086 <400> 29 catcttcgat gaaccgga 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-086 <400> 30 cgaagatgag ccagcaac 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-094 <400> 31 cgcgagacaa ttaaacgc 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-094 <400> 32 acagttcctg gagcccat 18 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-097 <400> 33 catggagaga gggcgg 16 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-097 <400> 34 cgtttcatcg ttcgctgt 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-102 <400> 35 tgtctatggg ttacggcg 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-102 <400> 36 tgcaaagcaa atcggaac 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-113 <400> 37 gttcatctga acgccgtc 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-113 <400> 38 cctatgacga ggggaagg 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-115 <400> 39 tggtagcagg ttgttggg 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-115 <400> 40 ccgctaagcc actgtttg 18 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-117 <400> 41 tcaaactcac gtggtacgc 19 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-117 <400> 42 tcacatatcc gccggtag 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-124 <400> 43 tgcgtttgct cggttaat 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-124 <400> 44 cgctactacg tcgatccg 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-128 <400> 45 tgattggttt gaatgggc 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-128 <400> 46 gcacgatgag gatgcagt 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-131 <400> 47 ctccctcctc cgtgtacc 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-131 <400> 48 cgtaacgttc gcttcctg 18 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer GB-PO-134 <400> 49 gagtgtgaag aatcggcg 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-134 <400> 50 gtgcactctg cctatcgc 18 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-135 <400> 51 aggagggggt gcttgata 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-135 <400> 52 tcctccgcct tctctacc 18 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-138 <400> 53 tatggaacgg tgcgaagt 18 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-138 <400> 54 gccgtcaaaa gggaactc 18 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-149 <400> 55 agtgcatatg cccgacac 18 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-149 <400> 56 cgtcgtagat gcaggctc 18 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-152 <400> 57 actgagcctt cagcacca 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse pimer of GB-PO-152 <400> 58 catagggacg acagcgag 18 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-154 <400> 59 gtcgtagcca gccatgag 18 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-154 <400> 60 agggtatctc gggtgcat 18 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-157 <400> 61 atggacgtgg tgttctgc 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-157 <400> 62 aaaccaagcc tacccagc 18 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-171 <400> 63 tctcgggcat cattcttg 18 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-171 <400> 64 acgtcagggt gtcaaacg 18 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-172 <400> 65 gcagaagttg cccaaaga 18 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-172 <400> 66 atgtccagcg gaagacct 18 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-173 <400> 67 atgaagtgtg agccgtgg 18 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-173 <400> 68 tgtccattca tgcgttca 18 <210> 69 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-181 <400> 69 ttattgtgaa gcccccg 17 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-181 <400> 70 gacatcggca gaaggtca 18 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-190 <400> 71 tttccatttc cgttggtg 18 <210> 72 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-190 <400> 72 cagggggtga ttatgcaa 18 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor, AP-11 <400> 73 ctcttgctta gatctggact a 21 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor, AP-12 <400> 74 tagtccagat ctaagcaaga gcaca 25 <210> 75 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(GA)20 <400> 75 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 40 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AT)20 <400> 76 atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 40 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(CA)20 <400> 77 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40 <210> 78 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AGC)15 <400> 78 agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagc 45 <210> 79 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(GGC)15 <400> 79 ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggc 45 <210> 80 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AAG)15 <400> 80 aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaag 45 <210> 81 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AAC)15 <400> 81 aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaac 45 <210> 82 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-(AGG)15 <400> 82 aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggagg 45 <210> 83 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 primer <400> 83 tgtaaaacga cggccagt 18 <110> Rural Development Administration <120> SSR primer derived from Oyster Mushroom and use of there <160> 83 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-001 <400> 1 cgcaagctac aaacggac 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> revese primer of GB-PO-001 <400> 2 agcagcaagc acaagagc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-006 <400> 3 tgtggcaaac ccaagttc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-006 <400> 4 cccaaaggat gaggaagg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-011 <400> 5 tcccataccc tgacatcg 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-011 <400> 6 atcatcaagc gccacaac 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-025 <400> 7 tgatcatggc gagtaggg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-025 <400> 8 ggaactgtca gcagacgc 18 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-026 <400> 9 aatcgcatgg gctctg 16 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-026 <400> 10 ctgtccctcc gtgtacca 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-028 <400> 11 ctggagaatc gtagcccc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-028 <400> 12 acaagcgctc ggaataca 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-039 <400> 13 tgtggatgtg atgtgatgtg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-039 <400> 14 acgtccagcg tcgagtta 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-050 <400> 15 catccgatac agacccga 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-050 <400> 16 aggcatccca caacactg 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-051 <400> 17 catagggacg acagcgag 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-051 <400> 18 actgagcctt cagcacca 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-061 <400> 19 taacttgggc gcttgaaa 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-061 <400> 20 tggaacgcgt agacttgg 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-064 <400> 21 gttctgaggg ttgagggg 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-064 <400> 22 ccaaccacac tcttccca 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-076 <400> 23 tcgattgtca gattgttgga 20 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-076 <400> 24 cggagaagca gttggttg 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-079 <400> 25 acccagacga tttgggag 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-079 <400> 26 aggctggcgt ggaatact 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-080 <400> 27 cacccatgtg cctcagtc 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-080 <400> 28 tgtctatggg ttacggcg 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-086 <400> 29 catcttcgat gaaccgga 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-086 <400> 30 cgaagatgag ccagcaac 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-094 <400> 31 cgcgagacaa ttaaacgc 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-094 <400> 32 acagttcctg gagcccat 18 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-097 <400> 33 catggagaga gggcgg 16 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-097 <400> 34 cgtttcatcg ttcgctgt 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-102 <400> 35 tgtctatggg ttacggcg 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-102 <400> 36 tgcaaagcaa atcggaac 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-113 <400> 37 gttcatctga acgccgtc 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-113 <400> 38 cctatgacga ggggaagg 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-115 <400> 39 tggtagcagg ttgttggg 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-115 <400> 40 ccgctaagcc actgtttg 18 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-117 <400> 41 tcaaactcac gtggtacgc 19 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-117 <400> 42 tcacatatcc gccggtag 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-124 <400> 43 tgcgtttgct cggttaat 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-124 <400> 44 cgctactacg tcgatccg 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-128 <400> 45 tgattggttt gaatgggc 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-128 <400> 46 gcacgatgag gatgcagt 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-131 <400> 47 ctccctcctc cgtgtacc 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-131 <400> 48 cgtaacgttc gcttcctg 18 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer GB-PO-134 <400> 49 gagtgtgaag aatcggcg 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-134 <400> 50 gtgcactctg cctatcgc 18 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-135 <400> 51 aggagggggt gcttgata 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-135 <400> 52 tcctccgcct tctctacc 18 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-138 <400> 53 tatggaacgg tgcgaagt 18 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-138 <400> 54 gccgtcaaaa gggaactc 18 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-149 <400> 55 agtgcatatg cccgacac 18 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-149 <400> 56 cgtcgtagat gcaggctc 18 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-152 <400> 57 actgagcctt cagcacca 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse pimer of GB-PO-152 <400> 58 catagggacg acagcgag 18 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-154 <400> 59 gtcgtagcca gccatgag 18 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-154 <400> 60 agggtatctc gggtgcat 18 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-157 <400> 61 atggacgtgg tgttctgc 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-157 <400> 62 aaaccaagcc tacccagc 18 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-171 <400> 63 tctcgggcat cattcttg 18 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-171 <400> 64 acgtcagggt gtcaaacg 18 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-172 <400> 65 gcagaagttg cccaaaga 18 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-172 <400> 66 atgtccagcg gaagacct 18 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-173 <400> 67 atgaagtgtg agccgtgg 18 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-173 <400> 68 tgtccattca tgcgttca 18 <210> 69 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-181 <400> 69 ttattgtgaa gcccccg 17 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-181 <400> 70 gacatcggca gaaggtca 18 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GB-PO-190 <400> 71 tttccatttc cgttggtg 18 <210> 72 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GB-PO-190 <400> 72 cagggggtga ttatgcaa 18 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adapter, AP-11 <400> 73 ctcttgctta gatctggact a 21 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adapter, AP-12 <400> 74 tagtccagat ctaagcaaga gcaca 25 <210> 75 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Biotin- (GA) 20 <400> 75 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 40 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Biotin- (AT) 20 <400> 76 atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 40 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Biotin- (CA) 20 <400> 77 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40 <210> 78 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Biotin- (AGC) 15 <400> 78 agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagc 45 <210> 79 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Biotin- (GGC) 15 <400> 79 ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggc 45 <210> 80 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Biotin- (AAG) 15 <400> 80 aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaag 45 <210> 81 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Biotin- (AAC) 15 <400> 81 aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaac 45 <210> 82 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Biotin- (AGG) 15 <400> 82 aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggagg 45 <210> 83 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 primer <400> 83 tgtaaaacga cggccagt 18  

Claims (7)

서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 45와 46으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 59와 60으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 61과 62로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 65와 66으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 67과 68로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 69와 70으로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 버섯의 품종 동정용 조성물. Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 13 and 14; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 15 and 16; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 17 and 18; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 23 and 24; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 31 and 32; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 35 and 36; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 39 and 40; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 43 and 44; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 45 and 46; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 47 and 48; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 55 and 56; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 59 and 60; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 61 and 62; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 65 and 66; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 67 and 68; And a pair of primers represented by SEQ ID NOs: 69 and 70. 제 1 항에 있어서, 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 57과 58로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 63과 64로 표시되는 프라이머쌍 및 서열번호 71과 72로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머쌍을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 버섯의 품종 동정용 조성물. The method of claim 1, wherein the primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and 2; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 7 and 8; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 9 and 10; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 11 and 12; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 19 and 20; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 21 and 22; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 25 and 26; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 27 and 28; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 29 and 30; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 33 and 34; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 37 and 38; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 41 and 42; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 49 and 50; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 51 and 52; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 53 and 54; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 57 and 58; Composition for identifying a variety of mushrooms, characterized in that it further comprises at least one primer pair selected from the group consisting of a primer pair represented by SEQ ID NO: 63 and 64 and a primer pair represented by SEQ ID NO: 71 and 72. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 버섯(Oyster Mushroom; Pleurotus Ostreatus Kummer)으로부터 유래된 것을 특징으로 버섯의 품종 동정용 조성물.The composition of claim 1, wherein the primer pair is derived from Oyster Mushroom ( Pleurotus Ostreatus Kummer). (a) 버섯로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (a) extracting genomic DNA from the mushroom; (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항의 조성물에 포함된 각각의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및(b) PCR using the extracted genomic DNA as a template and each primer pair included in the composition of claim 1 or 2; And (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 버섯의 DNA 다형성 검출 방법.(C) method for detecting DNA polymorphism of mushroom comprising the step of separating the PCR product by size. (a) 버섯 및 대조군 버섯 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (a) extracting genomic DNA from mushroom and control mushroom varieties; (b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항의 조성물에 포함된 각각의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;(b) subjecting each extracted genomic DNA to a template and performing PCR using each primer pair contained in the composition of claim 1 or 2; (c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및(c) separating each PCR product by size; And (d) 상기 버섯 및 대조군 버섯 품종의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 버섯의 품종 동정 방법.(d) a method of identifying a variety of mushrooms comprising the step of comparing the results of the separation of the mushroom and the size of the control mushroom varieties. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 버섯의 DNA 다형성 검출용 키트. A kit for detecting DNA polymorphism of a mushroom comprising the composition of claim 1. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 버섯의 품종 동정용 키트. A kit for identifying a variety of mushrooms comprising the composition of claim 1.
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