KR100898721B1 - Method of identification between Hanwoo and foreign beef meats - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따른 한우 및 외래 도입우의 판별방법은 소의 에스알와이(sex-determining region Y; SRY) 유전자의 제한효소 절편길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)을 이용하여 이루어진다. 상기 에스알와이 유전자는 보스 타우루스 품종의 유전자로서, 1707번째 T염기가 G염기로 변이된 부분을 포함한 단일염기다형성(SNP)을 포함한다. 구체적으로 상기 한우 및 외래 도입우의 판별방법은, 상기 한우 및 외래 도입우로부터 DNA를 채취하는 단계, 상기 채취된 각각의 DNA와 상기 에스알와이 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 결합시키는 단계, 상기 결합 산물을 PCR 증폭시키는 증폭 단계, 상기 증폭 산물을 MseⅠ 제한효소로 절단한 후 다형성을 분석하여 한우와 외래 도입우의 유전자형을 대별하는 단계를 포함한다. 상기 판별방법에 따르면 보스 타우루스(Bos taurus) 유래의 한우육과 보스 인디커스 유래의 외래 도입우육(Brahman)을 DNA 수준에서 정확하게 판별할 수 있다.The method for discriminating Korean cattle and foreign introduced cattle according to the present invention is performed using Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) of a sex-determining region Y (SRY) gene. The SL Wai gene is a gene of Bos taurus varieties, and includes a single nucleotide polymorphism (SNP) including a portion in which the 1707 th T base is mutated to the G base. Specifically, the method for discriminating the domestic and foreign introduced cows, the step of collecting DNA from the domestic and foreign introduced cows, the step of combining each of the DNA and the forward and reverse primers of the SAL Y gene, the binding product PCR amplification step, and the amplification product is cleaved with Mse I restriction enzyme and then analyzing the polymorphism comprises the step of classifying the genotype of the Korean cattle and foreign introduced cattle. According to the determination method, Bos taurus- derived From beef cattle and boss indices Foreign Brahmans can be accurately determined at the DNA level.
Description
도 1은 유전자은행에 등록된 한우(Bos taurus, AB039748) 및 외래도입우(Bos indicus, AY079145)의 SRY 유전자 염기서열을 나타낸 염기서열도이다. 1 is a bovine ( Bos taurus , AB039748) and foreign introductions ( Bos indicus , AY079145) is a sequence diagram showing the SRY gene sequence.
도 2는 MseⅠ 제한효소의 특정 염기서열 인지 부위 및 DNA 단편(fragments)의 크기를 도시한 개념도이다. FIG. 2 is a conceptual diagram showing the size of specific nucleotide sequence recognition sites and DNA fragments of Mse I restriction enzyme.
도 3은 보스 타우루스(Bos taurus ) 품종인 한우 및 보스 인디커스(Bos indicus) 품종인 브라만(Brahman)종의 SRY 유전자를 PCR로 증폭하여 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 3 is a bos taurus ( Bos The taurus) breeds of beef carcass and boss indicator (Bos indicus) amplifying the SRY gene of Brahman (Brahman) species varieties by PCR is a photograph showing a result of electrophoresis.
도 4는 한우 및 브라만종의 PCR 증폭산물을 RFLP 처리한 후 절단된 DNA 단편을 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다.Figure 4 is a photograph showing the results of electrophoresis of the cleaved DNA fragment after RFLP treatment of Hanwoo and Brahman PCR amplification products.
본 발명은 한우육과 외래 도입우육을 판별하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 보스 타우루스(Bos taurus ) 품종인 한우육과 보스 인디커스(Bos indicus) 품종인 브라만(Brahman)종 및 브라만종과의 교잡된 품종을 판별할 수 있 는 DNA 표시인자(DNA marker)를 이용한 한우육과 외래우육의 판별방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for discriminating Korean beef and foreign imported beef, and more specifically, Bos taurus ( Bos taurus) varieties of hanwooyuk and boss indicator carcass (Bos indicus) breed of Brahman (Brahman) species, and DNA displays factors can determine the hybridization varieties and Brahmin species (DNA marker) determination of hanwooyuk and foreign beef using method It is about.
일반적으로, 외형적 특징인 모색이나 체형 등 표현형으로 구별되는 소 품종이라 할지라도 도축 후 쇠고기의 형태로 되면 소 품종 식별은 거의 불가능하게 된다. 한우육의 경우 유통과정에서 외래도입우육과 국내산 젖소육이 한우고기로 부정 유통되는 사례가 빈번하여 소비자 및 한우사육농가의 피해는 물론 한우 산업의 경쟁력을 약화시키는 원인으로 지적되어 왔다. 젖소고기가 한우고기로 둔갑 시 100% 감별 가능한 기술이 확보되어 현장에 적용되고 있으나 외래도입우육에 대해서는 직접 활용 가능한 기술이 아직 개발되지 못하고 있는 실정이다.In general, even cattle breeds that are distinguished by phenotypes such as groping, body shape, etc., which are external features, are almost impossible to identify after breeding beef. In the case of Korean beef, many cases of foreign imports of domestically imported beef and domestic cow meat are illegally distributed as Korean beef, which has been pointed out as a cause of damage to consumers and Korean cattle farmers as well as weakening the competitiveness of Korean beef industry. When cow beef is Hanwoo beef, 100% discriminating technology is secured and applied to the field. However, the technology that can be applied directly to the imported beef has not been developed yet.
본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 종래기술의 미비점을 보완하고자 하는 것으로서, 보스 타우루스(Bos taurus ) 품종인 한우육과 보스 인디커스(Bos indicus) 품종인 브라만(Brahman)종 및 브라만 교잡종을 판별할 수 있는 DNA 표시인자(DNA marker)를 발굴하고, 이를 이용하여 한우육과 외래 도입육의 효과적 판별방법을 제공하고자 함이다. 특히 본 발명은 외래 도입우 및 순종이 아닌 혼합우의 경우 보스 인디커스(Bos indicus)인 브라만종의 혼입이 많이 이루어져 있는 유전적 사실에 착안된 것이다. An object of the present invention is to compensate for the shortcomings of the prior art as described above, Bos Taurus ( Bos taurus) varieties of hanwooyuk and boss indicator carcass (Bos indicus) breed of Brahman (Brahman) species and identify Brahmin hybrid DNA display factor (DNA marker) can be determined, and by using this effective determination of hanwooyuk and foreign introduced six To provide a method. In particular, the present invention focuses on the genetic fact that a lot of infusions of Brahmans , which are Bos indicus, in the case of non-introduced cows and mixed cows that are not purebred.
본 발명의 일 특징에 따른 한우 및 외래 도입우의 판별방법은 소의 에스알와이(sex-determining region Y; SRY) 유전자의 제한효소 절편길이 다형성 (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)을 이용하여 이루어진다. 상기 한우는 보스 타우루스(Bos taurus) 유래이고 상기 외래 도입우는 보스 인디커스(Bos indicus) 유래의 브라만(Brahman)종이다. The method for discriminating Korean cattle and foreign introduced cattle according to an aspect of the present invention is performed using restriction fragment length polymorphism (RFLP) of a sex-determining region Y (SRY) gene. The Hanwoo is from Bos taurus and the foreign introduced cow is Brahman from Bos indicus.
상기 에스알와이 유전자는 보스 타우루스 품종의 유전자로서, 1707번째 T염기가 G염기로 변이된 부분을 포함한 단일염기다형성(SNP)을 포함한다.The SL Wai gene is a gene of Bos taurus varieties, and includes a single nucleotide polymorphism (SNP) including a portion in which the 1707 th T base is mutated to the G base.
구체적으로 상기 한우 및 외래 도입우의 판별방법은, 상기 한우 및 외래 도입우로부터 DNA를 채취하는 단계, 상기 채취된 각각의 DNA와 상기 에스알와이 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 결합시키는 단계, 상기 결합 산물을 PCR 증폭시키는 증폭 단계, 상기 증폭 산물을 MseⅠ 제한효소로 절단한 후 다형성을 분석하여 한우와 외래 도입우의 유전자형을 대별하는 단계를 포함한다. Specifically, the method for discriminating the domestic and foreign introduced cows, the step of collecting DNA from the domestic and foreign introduced cows, the step of combining each of the DNA and the forward and reverse primers of the SAL Y gene, the binding product PCR amplification step, and the amplification product is cleaved with Mse I restriction enzyme and then analyzing the polymorphism comprises the step of classifying the genotype of the Korean cattle and foreign introduced cattle.
상기 한우는 2개의 제한효소 절편길이 다형성을 갖고 상기 외래 도입우는 3개의 제한효소 절편길이 다형성을 갖는다. The Hanwoo had two restriction enzyme fragment length polymorphisms and the foreign introduced cow had three restriction enzyme fragment length polymorphisms.
이하 본 발명을 자세하게 설명하도록 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 따른 한우육 (Bos taurus)과 외래도입우육 (Bos indicus)의 판별 방법은 에스알아이 유전자(SRY SNP)의 제한효소 절편길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP) 방법을 포함한다. 상기 판별방법은 상기 RFLP를 이용하여, 유전자은행(GenBank)에 등록된 소 염기서열을 기초로 보스 타우루스(Bos taurus ) 품종인 한우(AB039748)와 보스 인디커스(Bos indicus ) 품종인 브라만(Brahman)의 SRY 유전자 염기서열상의 구조적 차이를 분석하여 유전자 증폭(PCR)후 MseⅠ 제한효소로 특정 염기서열(T/TAA)을 인지 및 절단하여 절편의 다형 성을 분석하는 단계를 포함한다. Korean beef meat according to the present invention ( Bos taurus ) and exotic beef ( Bos indicus ) method includes restriction fragment length polymorphism (RFLP) of SRY SNP. The discrimination method is based on the bovine sequence registered in the GenBank using the RFLP, Hanwoo (AB039748) and Bos indicus ( Bos taurus ) varieties indicus ) , which analyzes structural differences in SRY gene sequences of Brahman, Brahman, and recognizes and cleaves specific sequences (T / TAA) with Mse I restriction enzymes after gene amplification (PCR) to analyze polymorphism of fragments. Steps.
제한효소 절편길이 다형성 (Restriction enzyme fragment length polymorphism ( RFLPRFLP ))
제한효소절편 길이다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)는 대부분의 원핵생물 세포에서 발견되는 다형성(polymorphism)의 일종으로서, DNA 절단효소로 특정부위의 점 돌연변이(point mutation)에 의해 제한효소로 절단하였을 때 생기는 절편들의 길이가 다양하게 나타나는 DNA의 다형성이다. 이런 점 돌연변이는 제한효소가 인지하는 염기서열에 발생하여 제한효소의 인지부위가 새로 생성되거나 현존하는 제한효소 인지 부위가 소실되어 제한효소에 의한 DNA의 절편양상이 달라지고 이것은 전기영동을 통하여 쉽게 감지될 수 있다. DNA의 다형성은 개체마다 다르게 나타나므로 RFLP는 개체식별 및 법의학적으로 응용되며 또한 유전병 관련 표지인자로 활용되고 있다. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) is a type of polymorphism found in most prokaryotic cells. It is a polymorphism of DNA that appears in varying lengths of fragments. This point mutation occurs in the nucleotide sequence recognized by the restriction enzyme, and the recognition site of the restriction enzyme is newly generated or the existing restriction enzyme recognition site is lost, thereby changing the DNA fragmentation pattern by the restriction enzyme, which is easily detected by electrophoresis. Can be. Since the polymorphism of DNA is different from person to person, RFLP has been applied to individual identification and forensic use as well as markers related to genetic diseases.
본 발명에 따른 판별방법에 따르며, DNA 염기서열상의 구조적 차이를 이용하여 동종 내 품종 판별이 가능하다. 즉 우리나라 고유의 유전자원이며 보스 타우루스(Bos Taurus ) 품종의 하나인 한우를 보스 인디커스(Bos indicus ) 품종인 브라만(Brahman)과 구별하기 위하여 유전자 증폭 및 제한효소 절편길이 다형성 기법(PCR-RFLP)을 이용하면 기존의 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 또는 SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions)를 이용하는 방법과 달리 보다 정확하고 재현성이 우수한 판별이 가능하다. 상기 SRY 유전자를 이용하여 상기 PCR-RFLP 기법을 적용하면, 한우육과 보스 인디커스 유래 외래 도입우육을 판별하는데 유용하게 사용될 수 있다. According to the discrimination method according to the present invention, it is possible to discriminate varieties in the same species by using the structural difference in the DNA sequence. That unique genetic resources of the country and the boss Taurus (Bos Taurus), one of the beef carcass Indy boss of the breed (Bos a method using a indicus) breed of Brahman (Brahman) With the gene amplification and restriction fragment length polymorphism method (PCR-RFLP) existing RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) or SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) in order to distinguish it from the Otherwise, more accurate and reproducible discrimination is possible. Applying the PCR-RFLP technique using the SRY gene, it can be usefully used to determine the foreign introduced beef derived from Hanwoo beef and Boss Indicus.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 자세하게 설명하도록 한다. 그러한 하기 실시예에 의하여 본 발명의 기술적 사상이 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. The technical spirit of the present invention is not limited by the following examples.
[실시예]EXAMPLE
1. 공시재료 1. Materials
한우 159두 (한우 32차 후대 검정우 156두, 충북대 한우 3두)와 축산연구소로부터 외래도입우(Bos indicus, Brahman품종) 23두의 제노믹(genomic) DNA를 추출하여 DNA의 농도를 50 ng/㎕로 일정하게 한 후 PCR 반응에 이용하였다.159 cows (156 cows of the 32th generation, 156 cows of Korean cattle, 3 cows of Chungbuk National University) and the outpatient introduction of cattle ( Bos indicus , Brahman variety) 23 genomic DNAs were extracted and the DNA concentration was constant to 50 ng / μl and used for PCR reaction.
2. SRY 프라이머의 설계 및 합성2. Design and Synthesis of SRY Primer
유전자 은행(GenBank)에 등록된 소 염기서열을 기초로 하여 한우를 포함한 보스 타우루스(Bos taurus ) 품종(AB039748)과 보스 인디커스 유래 외래 도입우의 SRY 유전자를 검토한 후 염기서열상의 구조적 차이를 비교 분석하였다. Based on the bovine sequence registered in the GenBank ( Bos Taurus) taurus ) strain (AB039748) and SRY genes from bovine indices-derived foreign cows were examined and their structural differences were compared.
본 실시예에 따른 SRY 유전자는 보스 타우루스 품종의 유전자로서, 1707번째 T염기가 G염기로 변이된 부분을 포함한 단일염기다형성(SNP)이다. The SRY gene according to this embodiment is a gene of Bos taurus variety, and is a single nucleotide polymorphism (SNP) including a portion in which the 1707 th T base is mutated to the G base.
상기 SRY 유전자는 보스 타우루스(Bos taurus)(AB039748)의 1003 내지 1803번째 염기서열 부위, 보스 인디커스(Bos indicus)(AY079145)의 273 내지 1073번째 염기서열 부위의 801bp 단편을 증폭하기 위한 프라이머로서 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 하기 표 1에 도시된 염기서열을 갖도록 설계 및 합성되었다. The SRY gene is a primer for amplifying the 801bp fragment of the 1003 to 1803 nucleotide sequence of Bos taurus (AB039748) and the 273 to 1073 nucleotide sequence of Bos indicus (AY079145). Forward primers and reverse primers were designed and synthesized to have the nucleotide sequences shown in Table 1 below.
3. SRY 유전자의 PCR 증폭3. PCR amplification of the SRY gene
SRY 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응조건은 유전자 증폭기(제품명:GeneAmp PCR System 2700)를 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다. 반응액은 PCR 튜브에 템플릿(template) DNA 50ng, 10x PCR 버퍼(buffer), MgCl2 1.5 ㎕, dNTP (10 mM) 0.5 ㎕, 프라이머 각 10 pmol/㎕, Taq DNA 중합효소(polymerase) (Ampli Taq Gold, USA) 1 unit를 첨가하여 PCR 반응액이 총 25 ㎕가 되도록 조성되었다. Reaction conditions for PCR amplification of the SRY gene are gene amplifiers (product name: GeneAmp PCR System 2700) was used under the following conditions. The reaction solution was placed in a PCR tube with 50ng of template DNA, 10x PCR buffer, 1.5 μl of MgCl 2 , 0.5 μl of dNTP (10 mM), 10 pmol / μl of primer each, and Taq DNA polymerase (Ampli Taq). Gold, USA) 1 unit was added so that the PCR reaction solution was 25 μl total.
PCR 사이클은 최초 94℃에서 10분간 예비가열 후 94℃ 30초, 60℃에서 30초 그리고 72℃에서 45초간의 순환 공정을 총 38회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 10분간 가열하고 DNA 증폭과정을 종료했다.The PCR cycle was repeated for a total of 38 cycles of preheating at 94 ° C for 10 minutes, followed by 94 cycles of 30 seconds at 60 ° C, 30 seconds at 60 ° C, and 45 seconds at 72 ° C. Exited.
4. 제한효소 처리에 의한 DNA 절단 및 전기영동4. DNA cleavage and electrophoresis by restriction enzyme treatment
PCR 후 생성된 SRY 유전자의 801bp PCR 증폭산물에 대한 제한효소 처리는 다음과 같이 수행하였다. 15 ㎕의 증폭산물에 MseⅠ (10 u/㎕) 제한효소를 사용하여 총 부피를 20 ㎕로 조성한 후 37℃에서 오버나잇(overnight) 반응하여 절단했다. 제한효소로 절단하여 얻어진 DNA 단편(표 2 참조)을 확인하기 위하여 3 % 아가로스겔(agarose gel)로 전기영동하여 분리한 후 Et-Br(ethidium bromide) 용액으로 염색하여 UV상에 발현된 DNA 밴드를 검출하였다. Restriction enzyme treatment of the 801bp PCR amplification product of the SRY gene generated after PCR was performed as follows. 15 μl of the amplification product was digested with Mse I (10 u / μl) restriction enzyme using a total volume of 20 μl and overnight at 37 ° C. DNA fragments obtained by cleavage with restriction enzymes (see Table 2) were electrophoresed with 3% agarose gel, isolated, and stained with Et-Br (ethidium bromide) solution. Bands were detected.
표 2에서 보는 바와 같이, 한우(Bos taurus)에서 1707번째 T염기가 G염기로 변이되어 581bp와 220bp의 크기를 갖는 두개의 밴드가 검출되었고 브라만종(Bos indicus)은 581bp, 123bp 및 97bp의 크기를 갖는 3개의 밴드가 검출되었다. As shown in Table 2, the 1707th T base was changed to G base in Bos taurus , and two bands with sizes of 581 bp and 220 bp were detected, and Bos indicus was 581 bp, 123 bp and 97 bp. Three bands with were detected.
도 4를 참조하면, 상기 밴드의 생성 여부를 명확하게 알 수 있다. Referring to FIG. 4, it can be clearly seen whether the band is generated.
본 발명에 따른 SRY 유전자의 RFLP 유전자형의 구조적 차이점을 판별 방법에 의하면, 보스 타우루스 유래(Bos taurus )의 한우육과 보스 인디커스 유래의 외래도입우육(Brahman)을 정확하게 판별할 수 있다.According to the method for determining the structural difference of the RFLP genotype of the SRY gene according to the present invention, Bos Taurus derived ( Bos from taurus ) and beef indigo Introduce Brahman accurately.
이상 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. Although described with reference to the embodiments above, those skilled in the art will understand that the present invention can be variously modified and changed without departing from the spirit and scope of the invention as set forth in the claims below. Could be.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> METHOD OF IDENTIFICATION BETWEEN HANWOO AND FOREIGN BEEF MEATS <130> APC-05-0121 <140> 10-2005-0127393 <141> 2005-12-21 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRY-F <400> 1 ttagaacgct tacaccgcat attacttc 28 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRY-R <400> 2 tagtaaaatt gagataaaga gcgcctttgt tag 33 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> METHOD OF IDENTIFICATION BETWEEN HANWOO AND FOREIGN BEEF MEATS <130> APC-05-0121 <140> 10-2005-0127393 <141> 2005-12-21 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRY-F <400> 1 ttagaacgct tacaccgcat attacttc 28 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRY-R <400> 2 tagtaaaatt gagataaaga gcgcctttgt tag 33
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
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E902 | Notification of reason for refusal | ||
E90F | Notification of reason for final refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration | ||
GRNT | Written decision to grant |