KR101331740B1 - SSR primer derived from Paeonia lactiflora and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 작약에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 서열번호 1 내지 28로 이루어진 군에서 선택되는 2 개의 핵산서열을 갖는 SSR 프리이머쌍 및 상기 SSR 프라이머쌍을 포함하는 작약의 품종을 판별하기 위한 키트 및 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 작약의 품종을 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 작약의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 작약의 DNA 프로파일을 작성하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 작약의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써, 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.The present invention relates to an SSR primer isolated from the peony and its use. More specifically, a kit for determining a breed of a peony comprising an SSR primer pair having two nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 and the SSR primer pair and the SSR primer pair It is about how to determine the breed.
The SSR primer pair provided in the present invention can effectively detect the DNA polymorphism of the peony, and can be usefully used to prepare the DNA profile of the peony. In addition, by efficiently evaluating the genetic resources of the peony through this, it is possible to effectively perform redundancy analysis and establishment of novelty with existing holding resources when introducing new genetic resources.
Description
본 발명은 작약에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an SSR primer isolated from the peony and its use.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한, 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.A large amount of genetic resources are being collected every year from most major crops and materials used for breeding. On the other hand, the evaluation of genetic resources has not been done sufficiently. Rapid identification of species and subspecies of collected genetic resources is very important for the management and protection of accurate genetic resources. In addition, identification of genotypes, identification and classification of genotypes, and identification of their relationship are crucial to the conservation of genetic resources, the creation of new varieties, and the improvement of crops.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 초위성체(microsatellite) 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요 작물 및 소재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.Recently, the rapid development of molecular biology has led to the development of nucleic acid fingerprinting methods and various DNA markers that enable the study of bio-diversity at the level of DNA (DNA). Through this, it is possible to perform simple and rapid search of useful traits, identification of species of organisms, classification and identification of cultivars, and flexible relationship analysis of group populations with little effect on external environments. Fingerprinting using the polymerase chain reaction (PCR) developed so far includes randomly amplified polymorphic DNA (RAPD), amplified fragment length polymorphic DNA (AFLP), and simple sequence repeat (SSR) methods. Among these methods, the RAPD method has a disadvantage that the non-specific PCR products are amplified and thus the reproducibility is poor. The AFLP method is disadvantageous in that the appearance and analysis of bands having poor reproducibility are complicated because they are attracted by the detection of high DNA polymorphism. In contrast, the SSR method is a method of preparing a PCR primer based on the nucleotide sequence information of a microsatellite region, which is a DNA repeat sequence. The SSR method is easy for microsatellite analysis and has high reproducibility. It is often used for sympathy. Especially, the SSR method has an advantage that it is not affected by the external environment at all. Due to the superiority of the SSR method, studies are underway to develop SSR markers in several major crops and cultivated crops.
이에 본 발명자들은 작약의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 작약에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have completed the present invention by developing SSR primer pairs that show a large number of polymorphic mutations in the peony, while continuing to develop SSR markers capable of efficiently evaluating the genetic resources of the peony.
본 발명은 SSR 프라이머쌍을 이용하여 작약의 유전적 다양성과 유연관계를 분석하였고, 작약의 품종에 대한 유전자형을 분석하여 품종 판별에 대한 가능성을 검토하고, 효율적인 품종 판별법을 제시하고자 한다.The present invention is to analyze the genetic diversity and flexibility of the peony using SSR primer pairs, to examine the possibility of breed discrimination by analyzing the genotype of the peony varieties, and to propose an efficient breed discrimination method.
본 발명은 서열번호 1 내지 28로 이루어진 군에서 선택되는 2 개의 핵산서열을 갖는 SSR 프리이머쌍을 제공한다.The present invention provides an SSR primer pair having two nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28.
또한, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 포함하는 작약의 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for determining the variety of peony containing the SSR primer pair.
또한, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 작약의 품종을 판별하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for determining the variety of peony using the SSR primer pair.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 작약의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 작약의 DNA 프로파일을 작성하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 작약의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써, 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.The SSR primer pair provided in the present invention can effectively detect the DNA polymorphism of the peony, and can be usefully used to prepare the DNA profile of the peony. In addition, by efficiently evaluating the genetic resources of the peony through this, it is possible to effectively perform redundancy analysis and establishment of novelty with existing holding resources when introducing new genetic resources.
도 1은 UPGMA 계통수는 한국의 다양한 지역에서 수집된 85 수집종(accessions) 사이의 유전적 관계를 나타낸다.Figure 1 shows the genetic relationship between the UPGMA phylogenetic tree collected 85 accessions from various regions of Korea.
본 발명은 서열번호 1 내지 28로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 핵산서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공한다.The present invention provides an SSR primer pair having two nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28.
상기 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27 및 28로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The SSR primer pair is a primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and 2; A pair of primers represented by SEQ ID NOS: 3 and 4; A pair of primers represented by SEQ ID NOS: 5 and 6; A pair of primers represented by SEQ ID NOS: 7 and 8; A pair of primers represented by SEQ ID NOS: 9 and 10; A pair of primers represented by SEQ ID NOs: 11 and 12; A pair of primers represented by SEQ ID NOS: 13 and 14; A pair of primers represented by SEQ ID NOS: 15 and 16; A pair of primers represented by SEQ ID NOs: 17 and 18; A pair of primers represented by SEQ ID NOs: 19 and 20; A pair of primers represented by SEQ ID NOS: 21 and 22; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 23 and 24; Primer pairs represented by SEQ ID NOs: 25 and 26; It may be selected from the group consisting of primer pairs represented by SEQ ID NO: 27 and 28.
또한, 상기 SSR 프라이머쌍은 작약(Paeonia lactiflora)으로부터 유래된 것 일 수 있다. 상기 작약은 작약(芍藥,)은 작약과의 여러해살이풀로 함박꽃이라고 하는 원예종의 원산지는 중국이다. 높이는 1m 내외이고 꽃 색깔에 따라 백작약, 적작약으로 나누기도 한다. 꽃이 아름다워 옛날부터 관상용으로 널리 재배해 왔으며 반 그늘진 곳에서 잘 자란다. 뿌리는 한방에서 귀중한 약재로 취급되어 백작약 뿌리는 빈혈 치료와 진통제로, 적작약 뿌리는 혈압과 해열제로 이용한다.In addition, the SSR primer pair may be derived from Paeonia lactiflora. The peony is a perennial herb of the peony and is the origin of the horticultural species, called peony flower, in China . It is about 1m high and is divided into white peony and red peony according to the flower color. Because of its beautiful flowers, it has been widely cultivated for ornamental purposes since ancient times and grows well in half-shaded places. The root is treated as a valuable medicine in herbal medicine, and the root of Peony is used to treat anemia and painkillers, and the root of Peony is used as a blood pressure and antipyretic agent.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
In the present invention, "primer" refers to a single stranded oligonucleotide sequence that is complementary to the nucleic acid strand to be copied and may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer utilization conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
또한, 본 발명은 상기SSR 프라이머쌍; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 작약의 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.In addition, the present invention is the SSR primer pair; And a kit for determining a variety of peony, comprising a reagent for performing an amplification reaction.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
In the kit of the present invention, the reagent for carrying out the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffer and the like. In addition, the kit of the present invention may further include a user guide describing optimal reaction performing conditions. The manual is a printed document that explains how to use the kit, for example, how to prepare PCR buffer, the reaction conditions presented, and so on. The brochure includes instructions on the surface of the package including the brochure or leaflet in the form of a brochure, a label attached to the kit, and a kit. In addition, the brochure includes information that is disclosed or provided through an electronic medium such as the Internet.
또한, 본 발명은 (a)작약으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b)추출된 게놈 DNA를 주형으로 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c)상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 작약의 품종을 판별하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (a) extracting genomic DNA from the peony; (b) amplifying the target sequence by performing an amplification reaction using the SSR primer pair as a template of the extracted genomic DNA; And (c) provides a method for determining the variety of peony comprising the step of detecting the amplification product.
본 발명의 방법은 작약 시료에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 SSR 프라이머쌍을 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.The method of the present invention comprises the step of separating genomic DNA from a peony sample. As a method for separating the genomic DNA from the sample, a method known in the art can be used. For example, the CTAB method may be used, or a wizard prep kit (Promega) may be used. Using the isolated genomic DNA as a template, the target sequence may be amplified by performing an amplification reaction using the SSR primer pair according to an embodiment of the present invention as a primer. Methods for amplifying a target nucleic acid include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, Strand displacement amplification or amplification with Q [beta] replicase, or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers that specifically bind to a target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지 될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지 될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머쌍은 상기에 기재된 바와 같다.In the method of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. In one embodiment, the labeling material may be, but is not limited to, a material that emits fluorescence, phosphorescence, or radioactivity. Preferably, the labeling substance is Cy-5 or Cy-3. When the target sequence is amplified, PCR is carried out by labeling the 5'-end of the primer with Cy-5 or Cy-3, and the target sequence may be labeled with a detectable fluorescent labeling substance. When the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution, the amplification product may be synthesized and the radioactive substance may be incorporated into the amplification product and the amplification product may be labeled as radioactive. The primer pairs used to amplify the target sequence are as described above.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
The method of the present invention comprises detecting said amplification product. The detection of the amplification product can be performed through capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one method of detecting the amplification product, capillary electrophoresis can be performed. Capillary electrophoresis, for example, can use the ABi Sequencer. In addition, gel electrophoresis can be performed, and gel electrophoresis can utilize agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. Also, in the fluorescence measurement method, Cy-5 or Cy-3 is labeled at the 5'-end of the primer. When PCR is performed, the target is labeled with a fluorescent label capable of detecting the target sequence. The labeled fluorescence is measured using a fluorescence meter can do. In addition, in the case of performing the PCR, the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution to mark the amplification product, and then a radioactive measurement device such as a Geiger counter or liquid scintillation counter The radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
<< 실시예Example >>
1. 재료 및 방법1. Materials and Methods
(1) 식물 재료와 (1) plant material and DNADNA 추출 extraction
작약(Paeonia lactiflora)의 총 85 accessions은 한국의 밀양, 영천 및 김해에서 얻었다(표 1). DNA는 퀴아젠 DNA 추출 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 신선한 잎으로부터 추출했다. 추출한 DNA의 순도와 농도는 NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA)를 이용하여 확인하였고, 최종 DNA 농도는 20 ng/μL로 만들었다. 하기 표 1은 본 실험에서 사용된 작약의 85 수집종(accessions)이다.
A total of 85 accessions of Paeonia lactiflora were obtained from Milyang, Yeongcheon and Gimhae in Korea (Table 1). DNA was extracted from fresh leaves using Qiagen DNA extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany). Purity and concentration of the extracted DNA was confirmed using NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA), the final DNA concentration was 20 ng / μL. Table 1 below shows 85 accessions of the peony used in this experiment.
ID: identification number given by Kongju National University.
ID: identification number given by Kongju National University.
(2) (2) SSRSSR 모티브 motive enrichedenriched librarylibrary 의 구축Build
작약의 게놈 DNA로부터의 SSR 모티프(motif)-enriched library는 수정된 비오틴-스트렙타비딘 포획(biotin-streptavidin capture) 방법으로 구성되었다. 총 DNA는 7개의 제한 효소(EcoRV, DraI, SmaI, PvuI, AluI, HaeIII, 및 RsaI)로 처리하였다. pooling 이후에, 분해된 DNA는 1.4%의 아가로즈 겔(agarose gel)에서 사이즈별로 분별되었다. 300에서 1500bp 범위의 조각들은 겔로부터 녹여서 분리하였고, gel extraction kit (Qiagen)을 사용하여 정제하였으며, 어뎁터(AP11-5'-CTC TTG CTT AGA TCT GGA CTA-3' 및 AP-12-5'-TAG TCC AGA TCT AAG CAA GAG CAC A-3')로 라이게이션하였다. 어뎁터로 라이게이션된 DNA는 긴(40-45 개의 핵산) 비오틴이 표지된 반복 프로브[(GA)20, (CA)20, (AGC)15, (GGC)15, (AAG)15, (AAC)15, (AGG)15]의 혼합물과 혼성화 되었다. 혼성화된 DNA 조각은 streptavidin과 함께 코팅된 자석 구슬로 획득하였다. 확실하게 세척한 후에 DNA 조각은 50ul의 증류수와 함께 비드로부터 녹아서 분리 되었으며, PCR은 AP11 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 생성물은 pGEM-T Easy Vector (Promega)안에 삽입하고 E.coli cells로 이동하여 복제하였다. 재조합된 콜로니는 블루/화이트 콜로니 선택에 의해 확인되었다.
The SSR motif-enriched library from Peony's genomic DNA consisted of a modified biotin-streptavidin capture method. Total DNA was treated with seven restriction enzymes ( Eco RV, Dra I, Sma I, Pvu I, Alu I, Hae III, and Rsa I). After pooling, digested DNA was fractionated by size on 1.4% agarose gel. Fragments ranging from 300 to 1500 bp were dissolved from the gel, purified using a gel extraction kit (Qiagen), and adapters (AP11-5'-CTC TTG CTT AGA TCT GGA CTA-3 'and AP-12-5'-). TAG TCC AGA TCT AAG CAA GAG CAC A-3 '). The DNA ligated with the adapter was a long (40-45 nucleic acid) biotin-labeled repeat probe [(GA) 20 , (CA) 20 , (AGC) 15 , (GGC) 15 , (AAG) 15 , (AAC) 15 , (AGG) 15 ]. Hybridized DNA fragments were obtained with magnetic beads coated with streptavidin. After thorough washing, the DNA fragments were separated from the beads with 50ul of distilled water, and PCR was amplified using AP11 primer. The amplified DNA product was inserted into pGEM-T Easy Vector (Promega) and E. coli Go to cells and replicate. Recombinant colonies were identified by blue / white colony selection.
(3) (3) DNADNA sequencingsequencing 및 And SSRSSR 프라이머의Primer 디자인 design
총 759의 재조합 클론은 무작위적으로 primary transformation plates로부터 선택되었다. 플라스미드에 DNA 삽입물은 BigDye terminator kit (Applied Biosystems)와 함께 ABI 3730xl DNA sequencer를 사용하여 배열되었다. 복제된 염기서열 및 프라이머 디자인 내에서의 SSR 판별은 SSR MANAGER program (Kim 2004)을 사용하여 실행되었다. 다형성을 위해 프라이머 쌍들은 QIAxcel system (Qiagen)을 사용함으로써, 8 bulk의 패널(bulk 당 작약의 5 accessions)내에서 평가되었다. 다형성 PCR product의 크기는 Schuelke (2000)의 M13 tail PCR 방법에 따라 정확하게 측정되었다. PCR 증폭은 2ul의 게놈 DNA (10 ng/μl), 0.2 μl의 특정한 프라이머, 0.4 μl의 M13 universal 프라이머(10 pmol/μl), 0.6 μl의 normal reverse 프라이머, 2.0 μl의 10× PCR buffer, 1.6 μl의 dNTPs (2.5 mM), 및 0.2 μl의 taq DNA polymerase(5 unit/μl)를 포함한 총 20ul의 부피 내에서 실행되었다. PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 94℃에 3분, 1 단계(94℃에서 30초, 55°C에서 45초, 72°C에서 1분)를 30회 반복하고, 2 단계(94°C에서 30초, 53°C에서 45초, 72에서 1분)를 10회 반복하고, 최종 72에서 10분간 연장반응을 수행하였다. SSR 대립유전자는 GeneMapper 4.1 software을 사용하여 ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)에서 결정되었고, GeneScan 500 ROX (6-carbon-X-rhodamine) molecular size standards (50-500 bp)을 사용하여 크기를 정확하게 측정하였다.
A total of 759 recombinant clones were randomly selected from primary transformation plates. DNA inserts in the plasmids were arranged using an ABI 3730xl DNA sequencer with the BigDye terminator kit (Applied Biosystems). SSR determination within replicated sequences and primer designs was performed using the SSR MANAGER program (Kim 2004). Primer pairs for polymorphism were evaluated in 8 bulk panels (5 accessions of peony per bulk) using the QIAxcel system (Qiagen). The size of the polymorphic PCR product was measured accurately according to Schuelke's (2000) M13 tail PCR method. PCR amplification was performed with 2 ul genomic DNA (10 ng / μl), 0.2 μl specific primer, 0.4 μl M13 universal primer (10 pmol / μl), 0.6 μl normal reverse primer, 2.0 μl 10 × PCR buffer, 1.6 μl DNTPs (2.5 mM), and 0.2 μl of taq DNA polymerase (5 unit / μl) in total volume of 20 ul. PCR amplification conditions are as follows: 3 minutes at 94 ° C., 1 step (30 seconds at 94 ° C., 45 seconds at 55 ° C., 1 minute at 72 ° C.), 30 times and 2 steps (at 94 ° C.) 30 seconds, 45 seconds at 53 ° C., 1 minute at 72) was repeated 10 times, and the extension reaction was carried out for 10 minutes at the final 72. SSR alleles were determined on an ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) using GeneMapper 4.1 software and sized accurately using GeneScan 500 ROX (6-carbon-X-rhodamine) molecular size standards (50-500 bp). Measured.
(4) 데이터 분석(4) data analysis
각 유전자 부분의 변이성은 genetic analysis package POPGENE version 1.31을 사용하여 대립인자의 수, 이형접합성 관찰치(observed heterozygosity), 이형접합성 기대치(expected heterozygosity) 및 각각 수집자원(accessions) 사이의 유전적 거리 등을 측정되었다. 총 대립인자의 수, 주 대립인자의 빈도(Major allele frequency), 유전자의 다양성(Gene Diversity), 및 다형성 정보 함량(Polymorphic Information Content)을 측정하기 위해 PowerMarker version 3.25 (Liu and Muse 2005)를 사용하였다. UPGMA 알고리즘은 MEGA4 software(Tamura et al. 2007)을 사용하여 distance matrix로부터 unrooted phylogram을 그리기 위해 사용되었다.
The variability of each gene segment is measured using the genetic analysis package POPGENE version 1.31 to measure the number of alleles, observed heterozygosity, expected heterozygosity, and the genetic distance between accessions, respectively. It became. PowerMarker version 3.25 (Liu and Muse 2005) was used to measure the total number of alleles, major allele frequency, Gene Diversity, and Polymorphic Information Content. . The UPGMA algorithm was used to draw unrooted phylograms from the distance matrix using the MEGA4 software (Tamura et al. 2007).
2. 결과2. Results
(1) (One) SSRSSR 개발 Development
SSRs을 위한 enriched library는 작약의 게놈 DNA로부터 실행되었다. enriched library의 구축을 위한 개발단계 와 그것의 구조 및 특징을 표 2에 요약하였다. 하기 표 2는 작약에 있어서, 초위성체(microsatellite) 농축된 라이브러리의 구조 및 특성 내에서 스크리닝 과정에 관한 것이다.The enriched library for SSRs was run from Peony's genomic DNA. The development stages for constructing the enriched library and its structure and characteristics are summarized in Table 2. Table 2, below, relates to the screening process within the structure and properties of the microsatellite enriched library in the peony.
총 759 재조합 클론은 무작위로 선택되었고 나열되었으며, 35(4.6%) 여분의 클론을 발견하였다. 나머지 724(95.4%)의 독특한 클론 중에서, 321(42.3%)는 SSR 시퀀스를 가졌다.A total of 759 recombinant clones were randomly selected and listed and found 35 (4.6%) extra clones. Of the remaining 724 (95.4%) unique clones, 321 (42.3%) had an SSR sequence.
SSR-함유한 모든 클론의 시퀀스 분석은 총 396의 다른 반복 모티프를 확인하였다. 디뉴클레오티드 SSRs (86.9%)은 트리뉴클레오티드 SSRs (11.6%; 표 3)보다 우세하였다. 적은 수(1.5%)의 tetra-/penta-/gexa뉴클레오티드 SSRs도 또한 library 내에 존재하였다. 디뉴클레오티드 타입 사이에서, 반복된 모티프의 AG/GA class는 가장 빈번하게(36.6%) 확인되었고, GT/TG(24.1%) class, CT/TC(21.8%) class, 나머지(17.2%) class들이 뒤따랐다. 트리뉴클레오티드 SSRs 중에서, 반복된 모티프의 GAA/AAG/AGA class가 우세(23.9%)하였고, GAG/AGG/GGA(17.4%) class, GTT/TTG/TGT(17.4%) class, 나머지(41.3%) class가 뒤따랐다. 마지막으로, 212 프라이머 쌍들은 SSR을 포함한 클론의 핵산염기서열부분(the flanking sequences)에 기초하여 설계되었다. 이 중에서 40 프라이머 쌍은 다형성을 위해 스크리닝 하는데 사용되었다. 오직 14개의 프라이머 쌍은 독특하고 재현성 있는 다형성 밴드를 생산하였고, 후행 실험을 위해 선택되었다. 하기 표 3은 작약에 있어서, 풍부한 라이버리 내에서 확인된 microsatellite 염기서열에 관한 것이다. Sequence analysis of all SSR-containing clones identified a total of 396 different repeat motifs. Dinucleotide SSRs (86.9%) were superior to trinucleotide SSRs (11.6%; Table 3). A small number (1.5%) of tetra- / penta- / gexanucleotide SSRs were also present in the library. Among the dinucleotide types, the AG / GA class of repeated motifs was most frequently identified (36.6%), GT / TG (24.1%) class, CT / TC (21.8%) class, and the rest (17.2%) classes. Followed. Of the trinucleotide SSRs, the GAA / AAG / AGA class of the repeated motifs was dominant (23.9%), GAG / AGG / GGA (17.4%) class, GTT / TTG / TGT (17.4%) class, and the remainder (41.3%). The class followed. Finally, 212 primer pairs were designed based on the flanking sequences of clones containing SSR. Of these, 40 primer pairs were used for screening for polymorphism. Only 14 primer pairs produced unique and reproducible polymorphic bands and were selected for later experiments. Table 3 below relates to the microsatellite sequences identified in the abundance of lively for the peony.
(Tetra/Penta/Hexa)Other
(Tetra / Penta / Hexa)
(2) (2) SSRSSR 다형성 Polymorphism
각 유전자 부분에서의 변이성은 대립인자의 수, 이형접합성 관찰치(observed heterozygosity), 주 대립 인자의 빈도(Major allele frequency), 유전자의 다양성(Gene Diversity), 및 다형성 정보 함량(Polymorphic Information Contents)의 관점에서 측정되었다. 14 SSR 마커는 85 accessions 중에서 103 대립유전자(allele)를 나타내었고, 3 개의 영역을 나타내었다(표 1). 유전자 부분 당 대립유전자의 많은 정도는 마커들 사이에서 다양하였고, 4개의 대립유전자(knu21, knu94)에서 16개의 allele(knu154)의 범위와 평균 7.4 의 대립유전자를 가졌다(표 4). 14개의 다형성 유전자 부분 중에서, 8개의 유전자 부분은 디뉴클레오티드 또는 트리뉴클레오티드 SSRs의 완전한 반복으로 구성되었다. 3개의 유전자 부분(knu14, knu114, 및 knu124)은 서로 다른 반복 모티프로 구성된 복합 반복(즉, 서로 다른 반복 모티프로 구성된)으로 구성되었고, 3개의 유전자 부분(knu21, knu35, 및 knu115)은 여러 반복(1 SSR보다 많은)으로 구성되었다. 유전자 부분당 주 대립유전자의 빈도(Major allele frequency) 및 이형접합성 기대치(expected heterozygosity)는 각각 0.61 및 0.62의 평균을 가지고, 각각 0.39 (knu14)에서 0.88 (knu21) 및 0.41 (knu21)에서 0.78 (knu14)로 다양하였다. 유전적 다양성의 값은 평균 0.50을 가지고, 0.21 (knu21)에서 0.71 (knu14 및 knu78) 범위를 가지며, PIC 값은 평균 0.43을 가지고, 0.19 (knu21)에서 0.67 (knu78) 범위를 가졌다. 하기 표 4는 작약을 위해 개발된 14개의 새로운 다형성 마커의 일반적인 특성에 관한 것이다.Variability in each gene segment is in terms of number of alleles, observed heterozygosity, major allele frequency, gene diversity, and polymorphic information content. Measured in The 14 SSR markers showed 103 alleles and 85 regions among 85 accessions (Table 1). Many degrees of alleles per gene portion varied between markers, ranging from four alleles (knu21, knu94) to 16 alleles (knu154) and an average of 7.4 alleles (Table 4). Of the 14 polymorphic gene moieties, 8 gene moieties consisted of complete repetition of dinucleotide or trinucleotide SSRs. The three gene segments (knu14, knu114, and knu124) consisted of complex repeats consisting of different repeat motifs (that is, composed of different repeat motifs), and the three gene parts (knu21, knu35, and knu115) are multiple repeats. (More than 1 SSR). The major allele frequency and the expected heterozygosity per gene segment have averages of 0.61 and 0.62, respectively, and 0.39 (knu14) to 0.88 (knu21) and 0.41 (knu21) to 0.78 (knu14), respectively. ) Varied. The values of genetic diversity had an average of 0.50, ranging from 0.21 (knu21) to 0.71 (knu14 and knu78), with PIC values of 0.43 on average and ranging from 0.19 (knu21) to 0.67 (knu78). Table 4 below relates to the general characteristics of the 14 new polymorphic markers developed for peony.
(3) 계통발생적 관계 (3) phylogenetic relationship
공유 대립인자의 비율은 본 실험에서 사용된(표 5) 85 수집종(accessions) 사이의 모든 pairwise 조합 사이의 유전적 거리를 계산하기 위해서 사용되었다. PowerMarker에 의해 측정된 유전적 매트릭스 거리를 Mega4 software를 사용하여 UPGMA tree를 그리기 위해 이용하였다. 작약의 85 수집종(accessions) 사이의 유전적 거리는 0.56의 평균을 가진 0.10 에서 0.95 범위였다. SSRs에 의해 밝혀진 다른 수집종(accessions) 사이의 유전적 거리의 다양성은 DNA 레벨에서 다형성의 높은 기준을 반영했다. 모든 수집종(accessions)은 UPGMA 계통도 내에서 5 그룹(groups I, II, III, IV, 및 V) 으로 무리지어질 수 있었다(도 1). 표 5는 Nei's의 유전적 거리를 나타낸다.The proportion of covalent alleles was used to calculate the genetic distance between all pairwise combinations between the 85 accessions used in this experiment (Table 5). Genetic matrix distances measured by PowerMarker were used to draw the UPGMA tree using Mega4 software. The genetic distance between the 85 accessions of the Peony ranged from 0.10 to 0.95 with an average of 0.56. The diversity of genetic distances between the different accessions identified by SSRs reflected a high standard of polymorphism at the DNA level. All accessions could be grouped into 5 groups (groups I, II, III, IV, and V) within the UPGMA tree (FIG. 1). Table 5 shows Nei's genetic distances.
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Claims (7)
(b)추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항에 따른 한국의 작약 품종 판별용 SSR 프라이머쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c)상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 한국의 작약 품종을 판별하는 방법.(a) extracting genomic DNA from the peony;
(b) amplifying the target sequence by using the extracted genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the SSR primer pair for discriminating Korean peony varieties according to claim 1; And
(c) a method of discriminating Korean peony varieties comprising detecting the amplification products.
The method of claim 5, wherein the detection of the amplification product is carried out by capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement.
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