JP2005261228A - Method for identifying strain of mushroom belonging to genus pleurotus, marker for identifying strain and method for producing marker - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プレロータス属きのこの品種識別を行うための方法、その識別のために特定のマイクロサテライト領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーからなるマーカー及びそのマーカーの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for discriminating varieties of the genus Prelotus, a marker comprising a gene amplification primer for amplifying a specific microsatellite region for the discrimination, and a method for producing the marker.
従来、ＤＮＡの塩基配列の違いによって植物の品種を識別する方法が多く開発されている（例えば特許文献１，２）。これらの方法は、必要とする品種を特定するために、必要とする品種の遺伝子の配列の例えば指紋領域といわれる識別部分を予め特定し、この部分の領域を増幅させるプライマーを開発し、開発されたプライマーを使用して多数の対象種の遺伝子の増幅行い、所定の遺伝子の増幅がなされているか否かによって、目的とする品種か否かの判別を行っている。
Conventionally, many methods for discriminating plant varieties based on differences in DNA base sequences have been developed (for example,
一方、プレロータス属きのこの品種識別に関しては、従来遺伝子を利用する方法は殆ど開発されてなく、試験栽培による判別や対峙培養による反応を調べることによってなされていた。 On the other hand, regarding the cultivar identification of the prelotus genus, few methods using conventional genes have been developed, and it has been done by examining the discrimination by test cultivation and the reaction by counterculture.
また、近年エリンギの生産量が急速に増加し、単価も他のきのこ類に比べて高値で推移していることから、多くのきのこ栽培業者から注目されている。しかし、エリンギ栽培が日本国内に導入されてから日が浅く、また国内に自生していないことから、種菌の入手が困難であるため、市販品から分離して利用する場合が多い。このような市販品からの菌を使用する場合、種苗法によって保護されている新品種か否かの判別が必要となる。
しかし、従来の試験栽培や対峙培養による識別方法では、栽培又は培養中における外的要因によって影響を受けやすく正確な識別ができない。また、これらの方法では栽培又は菌の培養に長時間を要するという問題があった。 However, the conventional identification methods using test cultivation and anti-cultivation culture are easily affected by external factors during cultivation or cultivation and cannot be accurately identified. In addition, these methods have a problem that it takes a long time for cultivation or cultivation of bacteria.
本発明はこのような従来の問題に鑑み、迅速かつ正確にプレロータス属きのこの品種識別を可能とする遺伝子増幅用プライマー及びこれを使用したきのこ品種判別方法の提供を目的としてなされたものである。 The present invention has been made in view of such conventional problems, and has been made for the purpose of providing a gene amplification primer capable of quickly and accurately discriminating varieties of the genus Prelotus and a method for distinguishing mushroom varieties using the same. .
上述の如き従従来の問題を解決し、所期の目的を達成するための請求項１に記載された発明の特徴は、プレロータスエリンギの遺伝子におけるマイクロサテライト領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーからなるマーカーを使用し、識別対象のプレロータスエリンギ遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うプレロータス属きのこの品種識別方法にある。
The feature of the invention described in
請求項２に記載された発明の特徴は、請求項１の構成に加え、前記マーカーとして、別添の配列表における配列番号１と２のプライマーからなる第１マーカー、同３と４のプライマーからなる第２マーカー、同５と６のプライマーからなる第３マーカー、同７と８のプライマーからなる第４マーカー、同９と１０のプライマーからなる第５マーカー、同１１と１２のプライマーからなる第６マーカー及び同１３と１４からなる第７マーカーの内の２以上を使用することにある。
The feature of the invention described in
請求項３に記載の発明の特徴は、別添の配列表における配列番号１と２のプライマーからなる第１マーカー、同３と４のプライマーからなる第２マーカー、同５と６のプライマーからなる第３マーカー、同７と８のプライマーからなる第４マーカー、同９と１０のプライマーからなる第５マーカー、同１１と１２のプライマーからなる第６マーカー及び同１３と１４からなる第７マーカーの内の、２以上のマーカーからなるプレロータス属きのこの品種識別用マーカーにある。 A feature of the invention described in claim 3 is that it comprises a first marker comprising the primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 in the attached sequence listing, a second marker comprising the primers 3 and 4, and primers 5 and 6 A third marker, a fourth marker composed of the primers 7 and 8, a fifth marker composed of the primers 9 and 10, a sixth marker composed of the primers 11 and 12, and a seventh marker composed of the primers 13 and 14. Among these, there is a marker for identifying a variety of a pre-lotus genus comprising two or more markers.
請求項４に記載の発明の特徴は、資料とするプレロータスエリンギの全ＤＮＡから制限酵素によって遺伝子を切り出し、その全断片の内からマイクロサテライト領域を含む断片を単離し、その外側にアダプターをつけてベクターに挿入し、プラスミド増幅させ、コロニーハイブリダイゼーションによって目的のベクターを含むものだけを集め、集められたマイクロサテライト領域を含む遺伝子を増幅させ、増幅された遺伝子配列をシーケンスにより判別し、マイクロサテライト領域両側の遺伝子配列を用いて該マイクロサテライト領域を特異的に増幅できるプライマーをデザインすることによって作成することを特徴としてなるプレロータス属きのこの品種識別用マーカーの製造方法にある。 A feature of the invention described in claim 4 is that a gene is excised from the total DNA of pre-rotus eringi used as a material by a restriction enzyme, a fragment containing a microsatellite region is isolated from all the fragments, and an adapter is attached to the outside. The plasmids are amplified by plasmid amplification, and only those containing the target vector are collected by colony hybridization, the collected genes containing the microsatellite region are amplified, the amplified gene sequence is discriminated by the sequence, and the microsatellite The present invention provides a method for producing a pre-Lotus genus cultivar identification marker characterized in that it is prepared by designing a primer capable of specifically amplifying the microsatellite region using gene sequences on both sides of the region.
本発明においては、上述した第１〜第７のマーカーの内の複数又は全部を使用してＰＣＲによる識別対象品種の遺伝子の増幅を行うことで現存する殆ど全てのエリンギの品種識別が可能となり、従来の試験栽培や対峙培養に比べて外的要因によって影響を受けることが無くなり、正確な品種識別が可能となり、またこれらの従来の方法に比べて短時間で識別判定結果を得ることができる。また、エリンギの栽培に際し、優良品種の識別データーを保存しておき、これと比較することによって優良品種のみの栽培に寄与することができる。 In the present invention, it is possible to identify almost all existing eringi varieties by performing amplification of identification target varieties by PCR using a plurality or all of the first to seventh markers described above, Compared with conventional test cultivation and counter cultivation, it is not affected by external factors, and thus it is possible to accurately identify the variety, and it is possible to obtain an identification determination result in a shorter time than these conventional methods. In addition, when cultivating eringi, identification data of excellent varieties can be stored and compared with this to contribute to the cultivation of only excellent varieties.
次に本発明の実施の形態を図面について説明する。 Next, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
本発明に係るプレロータ属きのこの遺伝子増幅用プライマーは、後述の配列表における配列番号１と２からなる第１マーカー、同３と４からなる第２マーカー、同５と６からなる第３マーカー、同７と８からなる第４マーカー、同９と１０からなる第５マーカー、同１１と１２からなる第６マーカー及び同１３と１４からなる第７マーカーの７種類であり、これらの複数マーカーを使用し、対象となるエリンギの菌についてＰＣＲ分析を行うことで品種を識別する。 The gene amplification primer of the genus Prerotor according to the present invention comprises a first marker consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2, a second marker consisting of 3 and 4, a third marker consisting of 5 and 6, There are seven types: a fourth marker consisting of 7 and 8; a fifth marker consisting of 9 and 10; a sixth marker consisting of 11 and 12; and a seventh marker consisting of 13 and 14; Use and identify varieties by performing PCR analysis on the target Eringi fungus.
上記遺伝子増幅用プライマーの作成は、先ず特定のエリンギの全ＤＮＡから制限酵素によって遺伝子を切り出し、その全断片の内からストレプトアビジーンマグネティクビーズ法により、図１に示すようにマイクロサテライト領域Ａを含む断片、即ちマイクロサテライト領域に外側に各種の遺伝子配列Ｂを有する断片Ｃを単離するとともに、その外側すなわち断片Ｃの両側の遺伝子配列Ｂの外側にアダプターＤをつける（図１（１））。これをベクターに挿入し、大腸菌を使用してプラスミド増幅させる。次いでコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的のベクターを含むものだけを集める。 The gene amplification primer is prepared by first cutting out a gene from the total DNA of a specific eringi using a restriction enzyme, and by using the streptavidin magnetic bead method from the entire fragment, the microsatellite region A as shown in FIG. A fragment C containing various gene sequences B on the outside in the microsatellite region is isolated, and an adapter D is attached outside the gene sequence B on both sides of the fragment C (FIG. 1 (1)). . This is inserted into a vector and plasmid amplified using E. coli. Colony hybridization is then performed and only those containing the desired vector are collected.
次いでたくさん集められたマイクロサテライト領域を含む配列Ｃ＋Ｄの外側にプライマーＥをつけて増幅させる（図1（２））。これによって増幅された配列Ｃ＋Ｄの内、配列ＡとＢについてシーケンスをして配列を決定し、反復のＣＴマイクロサテライト領域両側の配列Ｂの領域の配列を用いて該マイクロサテライト領域を特異的に増幅できるプライマーをデザインする。 Next, the primer E is attached to the outside of the sequence C + D containing the microsatellite region collected in a large amount (FIG. 1 (2)). Among the amplified sequences C + D, the sequences A and B are sequenced to determine the sequence, and the microsatellite region is specifically amplified using the sequence of the region B on both sides of the repeated CT microsatellite region. Design possible primers.
このようにして得られた多種類のプライマーをマーカーとして多種のエリンギに対して特定のマイクロサテライト領域の遺伝子の増幅を行い、それらのエリンギの品種識別に利用ができるもののみを選定して前記第１〜第７のマーカーを決定した。 Amplification of specific microsatellite region genes for various types of eringi using the various types of primers thus obtained as markers, and selecting only those that can be used to identify the varieties of these eringi. The first to seventh markers were determined.
次に上記各工程の具体的な実施例について説明する。
マーカーの作成
１．資料からのＤＮＡ抽出
試料としてホクト株式会社製の「エリンギ菌株」（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託 ７生寄文第１７７６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１５２９２））を使用した。この該エリンギの凍結乾燥試料５ｍｇに対してＴＥ溶液（１０ｍＭ トリス／塩酸、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）１ｍＬと１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加えて懸濁し６５℃で３０分間なじませる。プロテナーゼＫ １ｍｇ／ｍＬを加え３７℃で４時間反応させた。
Next, specific examples of the above steps will be described.
Creating a marker DNA Extraction from Materials “Eringi strain” manufactured by Hokuto Co., Ltd. (Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, No. 7 Seibun No. 1776 (FERM P-15292)) was used. 1 mL of TE solution (10 mM Tris / hydrochloric acid, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) and 10% SDS (sodium dodecyl sulfate) are added to and suspended in 5 mg of the freeze-dried sample of this eringi and allowed to acclimate for 30 minutes at 65 ° C. .
反応終了後、遠心機で遠心分離（１００００×Ｇ、４℃、２０分間）を行って上清を採取し、１／５量の５Ｍ ＮａＣｌと１０％ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）を加え６５℃で１０分間抽出し、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加えて転倒混和した。 After completion of the reaction, the mixture was centrifuged (10000 × G, 4 ° C., 20 minutes) with a centrifuge to collect the supernatant, and 1/5 amount of 5M NaCl and 10% CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) were added at 65 ° C. For 10 minutes, and an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (chloroform: isoamyl alcohol = 24: 1) was added and mixed by inversion.
次いで、遠心分離（１００００×Ｇ、４℃、１０分間）を行って上清を採取した。上清に等量のクロロホルム／イソアミルアルコールを加えて転倒混和を３回繰り返して得た上清に１／１０量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、さらに冷却したエタノール２．５倍量を加えた。遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで洗浄し、最終沈殿物をＴＥ溶液５００μＬに溶解した。 Subsequently, the supernatant was collected by centrifugation (10000 × G, 4 ° C., 10 minutes). An equal volume of chloroform / isoamyl alcohol was added to the supernatant and the mixture obtained by repeated inversion 3 times was added to the supernatant, 1/10 volume of 7.5M ammonium acetate was added, and 2.5 times the volume of cooled ethanol was further added. . The precipitate obtained by centrifugation was washed with 70% ethanol, and the final precipitate was dissolved in 500 μL of TE solution.
溶解後、ＲＮａｓｅ １ｍｇを加え３７℃で２時間反応させた。反応後、遠心分離（１００００×Ｇ、４℃、１０分間）を行って上清を採取した。上清に等量のクロロホルム／イソアミルアルコールを加えて転倒混和を３回繰り返し繰り返して得た上清に１／１０量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、さらに冷却したエタノール２．５倍量を加えた。遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで洗浄し、最終沈殿物をＴＥ溶液２５０μＬに溶解してＤＮＡ試料とした。
２．ＤＮＡ断片へのアダプターの修飾
市販のアダプター修飾キット（インビトロジェン社製）を用いて、ＤＮＡ試料（１μg／１０μＬ）に対し制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ／Ｍｓｅ Ｉを１μＬ加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、等量のアダプターとＴ４リガーゼ１Ｕ／μＬを加え、４℃で一晩反応させＤＮＡを断片化させた。反応後、断片化されたＤＮＡ溶液２．５μＬにＥｃｏ ＲＩプライマー（５０ｐｍｏｌ／１μＬ）１μ、Ｍｓｅ Ｉプライマー（１０ｐｍｏｌ／１μＬ）１μ、２．５ユニットのＥＸ Ｔａｇポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）２μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）２．５μＬ、滅菌水１５．５μＬを加えた反応液を調製した。
After dissolution, 1 mg of RNase was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction, the supernatant was collected by centrifugation (10000 × G, 4 ° C., 10 minutes). Add an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol to the supernatant and repeat the inversion and mixing 3 times. Add 1/10 volume of 7.5M ammonium acetate to the supernatant, and then add 2.5 volumes of cooled ethanol. It was. The precipitate obtained by centrifugation was washed with 70% ethanol, and the final precipitate was dissolved in 250 μL of TE solution to obtain a DNA sample.
2. Modification of Adapter to DNA Fragment Using a commercially available adapter modification kit (manufactured by Invitrogen), 1 μL of restriction enzyme Eco RI / Mse I was added to a DNA sample (1 μg / 10 μL) and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction, an equal amount of adapter and 1 U / μL of T4 ligase were added and reacted overnight at 4 ° C. to fragment the DNA. After the reaction, 2.5 μL of the fragmented DNA solution was added to Eco RI primer (50 pmol / 1 μL) 1 μ, Mse I primer (10 pmol / 1 μL) 1 μ, 2.5 units of EX Tag polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) 100 ｄ dNTPs. (Deoxyribonucleotide triphosphate mixed solution) 2 μL of a solution (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), 2.5 μL of 10-fold PCR buffer solution (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and 15.5 μL of sterilized water were prepared.
調製した反応液の増幅は、９４℃で３０秒間、５６℃で１分間、７２℃で１分間の条件で２０サイクル行い、アダプターを修飾したＤＮＡ断片を獲得した。
３．マグネティクビーズを利用したモチーフ配列を持つＤＮＡ断片の濃縮
獲得したアダプターを修飾したＤＮＡ断片の濃縮法は、Ｋｉｊａｓら（１９９４. Circle Reader Service No.193.P657-662）の方法を参考にして行った。モチーフ配列にビオチンを修飾した標識物３μＬ（１μg／μＬ）をマグネティクビーズに結合させた溶液と、アダプターを修飾したＤＮＡ断片を熱変性させた溶液とを混合し、モチーフ配列を持ちアダプターを修飾したＤＮＡ断片をマグネティクビーズに結合している標識物に結合させた。マグネティクビーズの洗浄後、結合しているＤＮＡ断片を回収し濃縮ＤＮＡ断片とした。
４．ＤＮＡ断片のプラスミドベクターへの挿入
濃縮ＤＮＡ断片５μＬ、Ｅｃｏ ＲＩプライマー（５０ｐｍｏｌ／１μＬ）０．５μＬ、Ｍｓｅ Ｉプライマー（１０ｐｍｏｌ／１μＬ）０．５μＬ、２．５ユニットのＥＸ Ｔａｇ ポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）１．２μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）１．５μＬ、滅菌水５．８μＬを加えた反応液を調製した。
Amplification of the prepared reaction solution was carried out for 20 cycles under the conditions of 94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute to obtain a DNA fragment modified with an adapter.
3. Concentration of DNA fragments with motif sequences using magnetic beads The method for concentrating DNA fragments modified with acquired adapters is based on the method of Kijas et al. (1994. Circle Reader Service No.193.P657-662). It was. A solution in which 3 μL (1 μg / μL) of a label with a motif sequence modified with biotin is bound to a magnetic bead and a solution in which a DNA fragment modified with an adapter is heat-denatured are mixed to modify the adapter with the motif sequence. The obtained DNA fragment was bound to a label bound to magnetic beads. After washing the magnetic beads, the bound DNA fragments were recovered and used as concentrated DNA fragments.
4). Insertion of DNA fragment into plasmid vector Concentrated DNA fragment 5 μL, Eco RI primer (50 pmol / 1 μL) 0.5 μL, Mse I primer (10 pmol / 1 μL) 0.5 μL, 2.5 units of EX Tag polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) ) A reaction in which 100 μl of dNTP (deoxyribonucleotide 3-phosphate mixed solution) solution (Takara Shuzo Co., Ltd.) 1.2 μL, PCR 10-fold diluted buffer solution (Takara Shuzo Co., Ltd.) 1.5 μL, and sterilized water 5.8 μL were added. A liquid was prepared.
調製した反応液の増幅は、９４℃で３０秒間、５６℃で１分間、７２℃で１分間の条件で２０サイクル行い、増幅した濃縮ＤＮＡ断片を得た。増幅した濃縮ＤＮＡ断片５μＬ、ライゲイション緩衝液（プロメガ社製）１０μＬ、プラスミドベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ）２μＬ、T４リガーゼ２μＬ（１Ｕ／μＬ）、滅菌水１μＬを加えた反応液を調製し、一晩反応させて濃縮ＤＮＡ断片をプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ）に挿入させた。
５．形質転換とゲノムライブラリー
濃縮ＤＮＡ断片を挿入したプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ）とコンピテントセル(Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＨ５α（東洋紡績株式会社製）)を氷中で４０分間反応させた後、４２℃で４５秒の反応を行い、プラスミドベクターをコンピテントセルへ形質転換させた。
Amplification of the prepared reaction solution was performed 20 cycles under the conditions of 94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute to obtain an amplified concentrated DNA fragment. A reaction solution was prepared by adding 5 μL of the amplified concentrated DNA fragment, 10 μL of ligation buffer (Promega), 2 μL of plasmid vector (pGEM-T Easy Vector), 2 μL of T4 ligase (1 U / μL), and 1 μL of sterilized water. The concentrated DNA fragment was inserted into a plasmid vector (pGEM-T Easy Vector) by reacting overnight.
5). Transformation and Genomic Library A plasmid vector (pGEM-T Easy Vector) into which a concentrated DNA fragment was inserted and a competent cell (E. coli DH5α (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)) were reacted in ice for 40 minutes. The reaction was carried out at 45 ° C. for 45 seconds to transform the plasmid vector into competent cells.
形質転換した細胞は、ＳＯＣ培地（東洋紡績株式会社製）９００μＬ加え３７℃で１時間培養し、Ｘ−ｇａｌ ４０ｍＬ（４０mg／ｍｌ）を染み込ませたＬＢ（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ、０．５％ Ｖｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ＮａＣｌ、１．５％ 寒天、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ））平面培地に塗布して３７℃で一晩培養し、挿入断片を含む白色コロニーをＬＢ寒天培地に単離した。
６．ハイブリダイゼイションと検出
単離したコロニーからモチーフ配列を持ったプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ）が存在するコロニーを検出する。単離したコロニーをメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に付着させ、アルカリ変性液（０．５Ｎ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）で反応させ、さらに中和液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ トリス／塩酸、ｐＨ７．４）処理を行った後、メンブレンをオーブンで８０℃、２時間の処理でプラスミドをメンブレンの表面に固定する。
The transformed cells were added with 900 μL of SOC medium (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and cultured at 37 ° C. for 1 hour, and LB (1% Bacto Tripton, 0.5% Veast) soaked with 40 mL (40 mg / ml) of X-gal. Extract, 1% NaCl, 1.5% agar, ampicillin (50 μg / ml) were spread on a flat medium and cultured overnight at 37 ° C., and a white colony containing the insert fragment was isolated on an LB agar medium.
6). Hybridization and detection A colony containing a plasmid vector (pGEM-T Easy Vector) having a motif sequence is detected from the isolated colony. The isolated colony was attached to a membrane (Hybond-N +), reacted with an alkali-denaturing solution (0.5N NaOH, 1.5M NaCl), and further neutralized solution (1.5M NaCl, 0.5M Tris / hydrochloric acid, After the treatment at pH 7.4), the membrane is fixed to the membrane surface in an oven at 80 ° C. for 2 hours.
固定したメンブレンに、モチーフ配列を持つＤＩＧ（ジゴキシゲニン）化標識物３μＬ（１μg／μＬ）をプラスミドとハイブリダイゼイションさせた。ＤＩＧ化標識物の検出は、ＤＩＧ発光検出キット（ロシュ社）を使用した。結合しなかったＤＩＧ化標識物を洗浄し、結合しているＤＩＧ化標識物にアルカリ性フォスファターゼを結合した特異的抗ＤＩＧ抗体を結合させた後、発光検出試薬と反応させた。反応させたメンブレンをX線フィルムに露光させ、モチーフ配列を持つコロニーを特定した。
７．シークエンスとプライマーの設計および確認
特定したコロニーに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を解読する。まず特定したコロニーを一晩、ＬＢ（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ、０．５％ Ｖｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ＮａＣｌ）液体培地で培養し、挿入されたＤＮＡ断片をＰＲＣで増幅した。
3 μL (1 μg / μL) of a DIG (digoxigenin) -labeled product having a motif sequence was hybridized with the plasmid on the fixed membrane. A DIG luminescence detection kit (Roche) was used to detect the DIG-labeled product. Unbound DIG-labeled product was washed, and a specific anti-DIG antibody conjugated with alkaline phosphatase was bound to the bound DIG-labeled product, and then reacted with a luminescence detection reagent. The reacted membrane was exposed to an X-ray film to identify colonies having motif sequences.
7). Sequence and primer design and confirmation Decode the base sequence of the DNA fragment inserted in the identified colony. First, the identified colony was cultured overnight in LB (1% Bacto Tripton, 0.5% Best Extract, 1% NaCl) liquid medium, and the inserted DNA fragment was amplified by PRC.
増幅は、培養体を３μＬ、Ｔ７プライマー（２０ｐｍｏｌ）１μＬ、ＳＰ６プライマー（２０ｐｍｏｌ）１μＬ、２．５ユニットのＨｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｇ ポリメラーゼ（キアゲン社製）、１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）８μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）１０μＬ、滅菌水７６μＬの反応液を、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の条件で２５サイクル行った。増幅産物は、一部を１．０％アガロースゲル電気泳動で増幅を確認し、残りを精製した。 For amplification, 3 μL of the culture, 1 μL of T7 primer (20 pmol), 1 μL of SP6 primer (20 pmol), 2.5 units of Hot Star Tag polymerase (manufactured by Qiagen), 100 Μ dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate mixed solution) solution (Takara Shuzo Co., Ltd.) 8 μL, PCR 10-fold diluted buffer solution (Takara Shuzo Co., Ltd.) 10 μL, sterile water 76 μL of reaction solution at 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 2 minutes, 72 ° C. for 3 minutes For 25 cycles. A part of the amplified product was confirmed by amplification by 1.0% agarose gel electrophoresis, and the remainder was purified.
精製した産物は、Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒキット（アプライドバイオシステム社製）を用いてシークエンスサンプルを調製した。シークエンスは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｍｏｄｅｌ ３１０（アプライドバイオシステム社製）を用いて断片の塩基配列を解読した。 For the purified product, a sequence sample was prepared using a Dye-terminator kit (Applied Biosystems). For the sequence, the base sequence of the fragment was decoded using ABI Prism Model 310 (Applied Biosystems).
解読した塩基配列からモチーフ配列のマイクロサテライト領域を見いだし、モチーフ配列のマイクロサテライト領域を確実に増幅できる一組のプライマー（Ｆ側／Ｒ側）を定法に従って設計した。 A microsatellite region of the motif sequence was found from the decoded base sequence, and a set of primers (F side / R side) capable of reliably amplifying the microsatellite region of the motif sequence was designed according to a standard method.
設計したプライマーは、数品種のエリンギから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲによる増幅を行い、多型を確認した。反応溶液は、数品種のエリンギから抽出したＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）２μＬ、Ｆ側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、Ｒ側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、２．５ユニットのＨｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｇ ポリメラーゼ（キアゲン社製）、１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）１μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）２μＬ、滅菌水１４．５μＬを加えた反応液を調製し、９２℃で１分間、使用するプライマーのアニール温度により４６〜６０℃で１分間、７２℃で１分間の条件で３３サイクル行った。 The designed primers were amplified by PCR using DNA extracted from several varieties of eringi to confirm polymorphism. The reaction solution consists of 2 μL of DNA extracted from several varieties of eringi (10 ng / μL), 1 μL of F side primer (10 pmol / μL), 1 μL of R side primer (10 pmol / μL), 2.5 units of Hot Star Tag polymerase (Qiagen) ), 100 μl of dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate mixed solution) solution (Takara Shuzo) 1 μL, PCR 10-fold diluted buffer solution (Takara Shuzo) 2 μL, and sterilized water 14.5 μL The sample was prepared for 33 cycles under the conditions of 92 ° C. for 1 minute, 46 to 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute depending on the annealing temperature of the primer used.
増幅産物は、１３％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ＤＮＡの染色と撮影は、常法に従って行った。分離の結果、品種間で多型が得られるプライマーを選択し、増幅される領域を識別マーカーとし第１マーカー〜第７マーカーと記した。 Amplified products were separated by 13% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. DNA staining and photography were performed according to conventional methods. As a result of the separation, primers capable of obtaining a polymorphism between varieties were selected, and the amplified region was designated as a first marker to a seventh marker, using the amplified region as an identification marker.
このようにして第１表のＦ側及びＲ側のプライマーを１組とした第１〜第７マーカーを作成した。
数品種のエリンギから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲによる増幅を行い、多型を確認する。反応溶液は、数品種のエリンギから抽出したＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）２μＬ、Ｆ側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、Ｒ側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、２．５ユニットのＨｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｇ ポリメラーゼ（キアゲン社製）、１００ΜのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸混合液）溶液（宝酒造株式会社製）１μＬ、ＰＣＲ用１０倍希釈緩衝液（宝酒造株式会社製）２μＬ、滅菌水１４．５μＬを加えた反応液を調製し、９２℃で１分間、使用するプライマーのアニール温度により４６〜６０℃で１分間、７２℃で１分間の条件で３３サイクル行った。プライマーは２組以上の組み合わせを使用し、増幅を行う。増幅産物は、１３％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ＤＮＡの染色と撮影は、常法に従って行い、ＤＮＡの多型を確認することでエリンギの品種を識別する。
Thus, the 1st-7th marker which made the F side and R side primer of Table 1 1 set was created.
第１〜第７のマーカーを使用して８種類のエリンギサンプルの品種識別を行った結果、第２表の如くであった。 Table 2 shows the results of identification of 8 types of eringi samples using the first to seventh markers.
即ち、マーカー１を使用した品種識別では、識別対象エリンギサンプルＮｏ．１とＮｏ．５〜７は識別ができず、また、Ｎｏ．２〜４及びＮｏ．８識別ができないが、Ｎｏ．１、とＮｏ．２とは識別ができたことを意味している。また、マーカー２を使用した品種識別では、Ｎｏ．１、Ｎｏ．３及びＮｏ．５は識別できず、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６及びＮｏ．７は識別できず、Ｎ．４及びＮｏ．８は識別できないが、Ｎｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．４は識別できた。従って、例えばエリンギサンプルＮｏ．２とＮｏ．３は、マーカー１では識別ができないが、マーカー２では識別ができ、両エリンギサンプルは異なった品種であることが分かる。
That is, in the product type identification using the
実験によれば、上述した第１〜第７マーカーを全て使用することによって、現存する品種の異なる１５種類のエリンギ全てについて判別が可能であった。 According to the experiment, it was possible to discriminate all 15 types of eringi having different varieties by using all the first to seventh markers described above.
尚、上述の実施例においては、識別対象としてプレロータスエリンギの品種識別について説明しているが、上述した第１マーカー〜第７マーカーの２以上を使用し、上記１５種類以外のプレロータス属のきのこの識別も可能である。 In addition, although the above-mentioned Example demonstrates the kind identification of the pre-lotus eringi as an identification object, two or more of the above-mentioned first marker to the seventh marker are used, and the pre-lotus genus other than the above 15 types is used. Mushroom identification is also possible.
Ａ マイクロサテライト領域
Ｂ マイクロサテライト領域両側の塩基配列
Ｃ 断片
Ｄ アダプター
Ｅ プライマー
A Microsatellite region B Base sequence on both sides of microsatellite region C Fragment D Adapter E Primer
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