KR100625385B1 - 폴리뉴클레오티드 조성물, 이의 제조방법, 및 용도 - Google Patents

폴리뉴클레오티드 조성물, 이의 제조방법, 및 용도 Download PDF

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Abstract

냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은 적어도 일 폴리뉴클레오티드 및 적어도 일 저온 보호제를 함유하고, 폴리뉴클레오티드:저온 보호제의 비는 1.0 중량부 저온 보호제당 약 0.001 내지 약 1.0 중량부 폴리뉴클레오티드이다. 이 조성물은 또한 최종 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량% 물을 함유한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 약 37℃의 온도에서 최소 10일에 걸쳐 적어도 90%의 초나선을 보유한다는 점에서 증진된 안정성을 특징으로 한다. 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은 또한 개선된 용해도를 가진다. 폴리뉴클레오티드의 개선된 냉동 건조 공정은 특유의 1차 건조 사이클을 이용하여, 상술된 안정한, 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물을 만들어 낸다.
냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물, 개선된 안정성 및 용해도

Description

폴리뉴클레오티드 조성물, 이의 제조방법, 및 용도{POLYNUCLEOTIDE COMPOSITION, METHOD OF PREPARATION, AND USE THEREOF}
본 발명은 개선된 안정성을 지닌 폴리뉴클레오티드 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 냉동 건조를 통해 폴리뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드 조성물은 산업, 제약, 의약, 영양 및/또는 농업 분야에서 각종 용도를 가진다. 일례로, 폴리뉴클레오티드는 이들 분야에 유용한 단백질의 생산에 유용하다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 그 자체로 진단/영상 프로토콜에서의 생체내 시약, 유전자 요법, 안티센스 프로토콜 및 백신 적용시의 시약 또는 유전자 결함, 감염성 질환, 암, 및 자기 면역 질환과 같은 각종 질병을 치료하거나 예방하는 데 사용된 약제로서 유용하다. 폴리뉴클레오티드는 또한 생물학적 리서치 분석, 의약, 진단 및 선별 분석 및 오염 검출 분석과 같은 분석에서 시험관내 시약으로서도 유용하다. 앞서 언급된 각각의 효용을 위해, 플라스미드 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 비냉동 또는 비동결 온도에서 장기간 보유되어야 한다. 이러한 용도로서의 폴리뉴클레오티드의 개발을 방해해 온 일 문제점은 폴리뉴클레오티드가 해동시 불안정해지는 경향이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 몇 시간 이 상동안 용액내에 놓이게 되면 활성이 감소하는 것으로 밝혀졌다.
폴리뉴클레오티드의 안정성을 측정하는 바람직한 방법은 시간에 따른 폴리뉴클레오티드의 초나선 (또는 "SC")의 손실이다. 용어 "초나선"은 폴리뉴클레오티드의 한 가닥이 폴리뉴클레오티드의 나머지 가닥과 아래 또는 위로 꼬인 폴리뉴클레오티드의 물리적 상태로 정의된다. 시간에 따른 초나선의 손실은 폴리뉴클레오티드 조성물의 순도를 감소시키는 바람직하지 않은 효과를 가진다. 따라서, 이러한 문제점을 어드레싱하여 폴리뉴클레오티드의 안정성을 개선시키고자 하는 다수의 시도가 진행되고 있다. 하나의 이러한 시도는 침전에 이어 건조시키는 폴리뉴클레오티드 제조법을 포함한다. 그러나, 이러한 방법은 원하는 폴리뉴클레오티드 안정성을 달성하지 못했다. 업계의 또다른 시도는 염 용액에 폴리뉴클레오티드를 보관하는 것이지만; 이들 방법도 초나선 구조의 손실을 야기한다.
폴리뉴클레오티드를 안정화시키는 또다른 방법은 폴리뉴클레오티드의 냉동 건조 과정을 수반한다. 동결 건조라고도 불리는 냉동 건조는 과거에 식품, 혈장, 살아있는 기관, 단백질, 박테리아와 단세포 진핵 생물과 같은 완전 세포, 및 약물과 같은 생물 활성 물질과 같은 아이템을 안정화시키거나 보존하는데 사용되어왔다. 냉동 건조 공정은 냉동 건조될 물질을 용매, 보통 물에 용해시킨 다음, 용액을 동결시키는 단계를 포함한다. 저온 보호제가 폴리뉴클레오티드를 안정화시키기 위해 빈번하게 포함된다. 용액을 동결시킨 후, 진공을 가해 동결된 물질을 동결 상태에서 용매가 승화되도록 단계적으로 가열한다. 최종 동결 건조물은 전형적으로 동결 물질과 동일한 형상 및 크기의 케이크 형태로 회수되고 충분한 다공성으로 인해 복원이 가능하다. 1980년대 초반에, 예를 들어, American Type Culture Collection이 저온 보호제, 락토스로 안정화된 냉동 건조 DNA를 판매했다.
1996년 12월 27일자에 공개된 PCT 출원 WO96/41873과 1998년 9월 22일자에 발행된 이의 관련 미국 특허 5,811,406(본원에서 참고됨)은 저온 보호제를 함유한 폴리뉴클레오티드 복합체를 발표되지 않은 방법으로 냉동 건조시켜 이를 안정화시키는 방법에 관해 기재하고 있다. 그러나, 냉동 건조의 공정 파라미터는 폴리뉴클레오티드 조성물의 안정성과 용해도에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 냉동 건조 공정은 낮은 용해도를 지닌 폴리뉴클레오티드를 생산할 수 있고, 복원을 위해서는 좀더 많은 용매의 사용을 요구한다. 이들 자료들은 냉동 건조의 이러한 문제점을 어드레싱하지 않고 있으며 냉동 건조 조성물에 개선된 안정성 또는 용해도를 제공하는 방법을 교시하지 않고 있다.
특히 약학 용도를 위한 증진된 안정성이 특징인 폴리뉴클레오티드 조성물, 및 안정한 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하는 방법이 업계에서 요망된다.
발명의 요약
일 측면에서, 본 발명은 적어도 일 폴리뉴클레오티드 및 적어도 일 저온 보호제를 포함하는 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물을 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드:저온 보호제의 비는 저온 보호제 1.0 중량부당 약 0.001 내지 약 1.0 중량부 폴리뉴클레오티드이다. 이 조성물은 또한 최종 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량%의 물을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 약 37℃의 온도에서 최소 10일간에 걸쳐 적어도 90%의 초나선을 보유한다는 점에서 증진된 안정성을 특징으로 한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 증진된 안정성이 특징적인 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 저온 보호제를 함유한 폴리뉴클레오티드 용액을(여기서 조성물을 동결될 때까지 냉각하고 진공을 가함) 조성물의 액화(또한 "역용해"로도 불림)를 피하면서, 약 5 내지 약 30시간에 걸쳐 약 -20℃ 내지 약 20℃의 온도에서 폴리뉴클레오티드 용액을 단계적으로 가열하는 단계를 포함하는 1차 건조 사이클을 제공하는 단계를 포함한다. 이러한 1차 건조 사이클은 완전한 냉동 건조 공정에 필요한 시간을 줄이고 약 37℃의 온도에서 최소 10일에 걸쳐 적어도 90%의 초나선을 보유한 실질적으로 무정형 물리적 구조의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드를 생산한다. 이 산물은 원한다면 수용액에서 복원될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 증진된 안정성과 증진된 용해도를 특징으로 하는 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물을 제공하기 위해 고안된 파라미터를 이용한 냉동 건조법을 제공한다. 이 방법은
(a) 약 6.2 내지 약 7.8의 pH를 가지고, 폴리뉴클레오티드 용액의 총 용적을 기준으로 약 0.1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 적어도 일 폴리뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드 용액의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 10 중량%의 적어도 일 저온 보호제를 포함하는 폴리뉴클레오티드 수용액을 형성하고;
(b) 폴리뉴클레오티드 용액을 동결시까지 약 -30℃ 내지 약 -70℃의 온도로 냉각하며;
(c) 진공을 가해 압력을 약 25 mTorr 내지 약 250 mTorr로 감소시키며;
(d) 초기에 폴리뉴클레오티드 용액을 약 5시간 내지 약 40시간에 걸쳐 약 -40℃ 내지 약 20℃의 온도로 단계적으로 가열하며;
(e) 가열 단계(d) 후 폴리뉴클레오티드 용액을 약 -35℃ 내지 약 10℃의 온도 및 약 25 mTorr 내지 약 250 mTorr의 압력에서 약 1시간 내지 약 10시간 동안 유지하며;
(f) 유지 단계(e) 후 폴리뉴클레오티드 용액을 약 1 시간 내지 약 20시간에 걸쳐 약 25 mTorr 내지 약 150 mTorr의 압력에서 약 20℃ 내지 약 35℃의 온도로 단계적으로 가열한 다음;
(g) 회수된 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량% 함량의 물을 지닌 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물을 회수하는 단계를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 생성된 냉동 건조 조성물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 또한 앞서 기재된 냉동 건조 조성물을 포함하고, 물에서 복원되며 약 6.2 내지 약 7.8의 pH를 특징으로 하는 액상 폴리뉴클레오티드 조성물을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 앞서 기재된 냉동 건조 조성물 또는 앞서 기재된 복원된 액상 조성물인 활성 성분을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이들 성분들은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 원하는 방향으로 배합된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에 유효량의 약학 조성물을 투여하여 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 투여는 통상적인 투여 경로, 예를 들면 경구, 비경구, 비내 또는 폐내로 투여될 수 있다.
본 발명의 기타 측면 및 이점은 하기의 바람직한 양태의 상세한 설명에서 추가로 설명된다.
도 1은 아가로스 겔법을 사용하여 시간에 따라 본 발명의 냉동 건조 DNA 조성물(
Figure 112000018994689-pct00001
)과 용액내의 동일한 DNA(
Figure 112000018994689-pct00002
)의 초나선("SC")%의 감소, 즉, 안정성을 도시한 그래프이다. DNA의 붕괴를 나타내는 하기 반응식 1의 속도 방정식 3을 기초로 하여, 실시예 1의 바람직한 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물과 냉동 건조되지 않은 플라스미드 DNA를 함유한 액상 조성물(대조구)에 대해 시간에 따른 ln(%SC) 좌표가 계산된다. 직선 최소 제곱 회귀 분석을 이용하여 좌표의 기울기(-kobs, 가(pseudo)-1차 관찰된 속도 상수)를 계산한다. 냉동 건조 조성물의 경우, 기울기 식은 y = 0.001x + 4.5369이고, 속도 상수(R2) = 0.7988이다. 대조구의 경우 기울기 식은 y = 0.014x + 4,5611이고; R2 = 0.9297이다. 바람직한 냉동 건조 조성물의 속도 상수는 액상 조성물의 속도 상수보다 적어도 10배 낮음이 본 도면에서 알 수 있다.
도 2는 도 1과 유사한 그래프이지만, 시간에 따라, 플라스미드 DNA 및, 4% 수분 함량과 함께 저온 보호제로서 2 중량/중량% 트레할로스를 함유한 본 발명에 따른 바람직한 냉동 건조 조성물(
Figure 112000018994689-pct00003
)(Lyo2T2H)과 냉동 건조되지 않은 용액에서 동 일한 DNA(
Figure 112000018994689-pct00004
,액상). 냉동 건조 조성물의 경우, 기울기 식은 y = 0.0033x + 4.52223이고, R2 = 0.9998이다. 대조구의 경우, 기울기 식은 y = 0.014x + 4.5611이고; R2 = 0.9297이다.
도 3은 본 발명의 냉동 건조 DNA 조성물(gD2 단백질을 암호화 하는 허프스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus) 유전자를 함유한 플라스미드)과 대조구에 대한 Balb/C 마우스에서의 항원-특이성 세포 면역 반응을 도시한 막대 그래프이다. 일 대조구는 저온 보호제를 함유하지 않은 하기 실시예 3의 표 4의 냉동 건조 전(前) 폴리뉴클레오티드 용액 넘버 6이다(Phos Pre-Lyo). 또다른 대조구는 저온 보호제를 함유하지 않은 표 4의 용액 넘버 8의 냉동 건조 시트레이트 완충 조성물이다(Citrate Post-Lyo). "023 대조구"는 DNA가 기타 조성물에 사용된 것과 동일한 플라스미드 백본이지만, gD2 서열을 지니지 않은 냉동 건조 전 용액이다. 이용된 본 발명의 냉동 건조 조성물은 포스페이트 완충액에서 저온 보호제로서 트레할로스를 지닌 표 4의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 용액 넘버 1(Trahalose/Phos); 포스페이트 완충액에 저온 보호제로서 수크로스를 지닌 표 4의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 용액 넘버 3(Sucrose/Phos); 및 시트레이트 완충액에서 저온 보호제로서 수크로스를 지닌 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 용액 넘버 7(Sucrose/Cit)을 포함한다. 세포 면역 반응에 대한 각 폴리뉴클레오티드 조성물의 효과를 실시예 4에 기재된 림프증식 분석으로 측정하고, Stimulation Index(SI)로 기록하고 있다.
도 4는 개개 Balb-C 마우스의 혈청에서 450 nm에서의 광학 밀도(OD)로 측정 된 본 발명의 냉동 건조 DNA 조성물과 도 3에서 동정된 대조구에 대한 체액(항체) 반응을 도시한 막대 그래프이다. 음성 대조구와 023 대조구는 일치한다. 체액 면역 반응에 대한 각 폴리뉴클레오티드 조성물의 효과를 하기 실시예 4에 기재된 표준 ELISA로 측정하였다.
본 발명은 개선된 안정성을 지닌 폴리뉴클레오티드 조성물, 개선된 용해도를 지닌 폴리뉴클레오티드 조성물; 및 안정된 폴리뉴클레오티드 조성물을 만드는 냉동 건조 공정을 제공함으로써 업계의 요구사항을 어드레싱하고 있다.
1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물
본 발명의 "폴리뉴클레오티드 조성물"은 기존의 폴리뉴클레오티드 혼합물보다 증가된 안정성과 용해도를 지닌 폴리뉴클레오티드 혼합물을 말한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 전형적으로 주로 무정형 구조와 함께 단지 소량의 결정 구조를 지닌 분말이고, 폴리뉴클레오티드 용액에 본원에서 기재된 신규 냉동 건조 공정을 적용하여 생산된다.
A. 폴리뉴클레오티드 용액
이하 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 용액"은 냉동 건조 이전의 수성 폴리뉴클레오티드 혼합물을 말한다. 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 용액은 적어도 일 폴리뉴클레오티드와 적어도 일 저온 보호제의 수성 혼합물이다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 용액에서 폴리뉴클레오티드:저온 보호제의 비는 1.0 중량부 저온 보호제당 약 0.001 내지 약 1.0 중량부의 폴리뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드 용액은 또한 임의의 비-수성 용매(들) 및 기타 첨가제를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드, 저온 보호제, (물을 포함한) 용매 및 임의 첨가제의 농도는 폴리뉴클레오티드의 적절한 매스가 냉동 건조되고 폴리뉴클레오티드가 냉동 건조동안 상당히 붕괴되지 않도록 조절된다.
1. 폴리뉴클레오티드
임의 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한 임의 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 사용될 수 있다. 적당한 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 BDNA, ADNA, ZDNA, RNA, tRNA, 및 mRNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 또한 임의 형태일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 환형 또는 선형일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 가닥을 함유할 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 DNA 또는 RNA, 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA-RNA 하이브리드, 또는 삼중 또는 사중 가닥 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 이중 가닥 DNA의 예는 특히 염색체 DNA, R 인자, PCR 산물, 플라스미드 DNA, 박테리오파아지, 바이러스 RNA 및 DNA 벡터(이들 중, 알파바이러스, 아데노바이러스, 백시니아, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 양성 및 음성 가닥 RNA 바이러스, 허프스 바이러스, 및 비로이드, 델타 바이러스 및 폴리오바이러스)를 포함한다. DNA는 바람직하게는 단백질을 암호화 하는, 바람직하게는 조절 요소, 작동자 제어를 포함하는 유전자, 및 종결 영역에 작동가능하게 연결된 암호 서열, 및 플라스미드 DNA와 같은 자기 복제 시스템을 포함한다. 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 라이보자임 및 삼중나선-형성 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 티오에이트, 포스포로티오에이트, 및 포 스포네이트 등으로 변형될 수 있다. 약학용으로 의도된 본 발명의 조성물에서 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 경우, 폴리뉴클레오티드 조성물의 일부로서 치료 가닥에 상보적이거나 "링커 가닥"을 제조함이 바람직하다. 링커 가닥은 별도 가닥이거나, 치료 가닥이 기본적으로 둘로 접어지거나 그 자체로 하이브리드화되도록 치료 가닥에 공유적으로 부착되거나 치료 가닥의 연장일 수 있다. 달리, 링커 가닥은 복수개의 폴리뉴클레오티드 가닥에 하이브리드되도록 상보적인 다수의 아암을 가질 수 있다.
바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 세포에서 작용하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 면역원을 암호화 하는 발현 벡터인 초나선 플라스미드 DNA이다. 몇몇 바람직한 양태에서 암호 서열에 의해 암호화된 면역원은 허프스 심플렉스 바이러스 gD2 단백질 또는 인간 면역결핍 바이러스 단백질(예, HIV-1 gag, pol 또는 env 유전자에 의해 암호화 된 단백질)과 같은 병원체에서 나온 단백질이다. 암호 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV) 중간 초기 프로모터와 같은 적당한 프로모터, 및 SV40 폴리아데닐화 시그널에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 본원에서 참고된 미국 특허 5,593,972는 본 발명에 유용한 플라스미드에 관해 기재하고 있다.
폴리뉴클레오티드는 플라스미드 DNA와 같은 네이키드 폴리뉴클레오티드, 복수 개의 폴리뉴클레오티드 또는 여러 폴리뉴클레오티드의 복사본을 포함하거나, 국부 마취제, 펩티드, 양이온 지질, 리포솜 또는 지질 입자를 포함한 지질, 폴리라이 신과 같은 폴리캐티온, 덴드리머와 같은 측쇄, 삼차원 폴리캐티온, 카보하이드레이트, 양이온 앰피필, 세제, 벤질암모늄 계면 활성제, 또는 세포로 폴리뉴클레오티드 전달을 촉진하는 기타 화합물과 같은 "공-제제"와 결부된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 공-제제의 여러 예들은 미국 특허 5,593,972; 5,703,055; 5,739,118; 5,837,533 및 1996년 4월 4일에 공개된 국제 특허 출원 WO96/10038, 및 1994년 8월 8일에 공개된 국제 특허 출원 WO94/16737에 기재되어 있으며 이들 모두 본원에서 참조된다. 사용된 제제가 국부 마취제, 바람직하게는 부피바카인인 경우, 폴리뉴클레오티드 용액의 총 중량을 기준으로 약 0.1 중량% 내지 약 1.0 중량%의 양이 바람직하다. 또한, 국제 특허 출원 PCT/UX98/22841는 공-제제로서 벤질암모늄 계면 활성제를 약 0.001-0.03 중량% 양으로 투여함을 교시하고 있다.
또한, 본 발명의 용액내에 폴리뉴클레오티드로서 사용하기 위해, 폴리뉴클레오티드 염기, 카보하이드레이트, 또는 링키지가 업계의 숙련인에게 익히 공지된 기술에 의해 변형될 수 있다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 용액내에 약 0.1 mg/mL 내지 약 5.0 mg/mL의 농도로 존재한다. 몇몇 기타 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 용액내에 약 1.0 mg/mL 내지 약 3.0 mg/mL의 농도로 존재한다. 기타 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 용액내에 약 1.0 mg/mL 내지 약 2.0 mg/mL의 농도로 존재한다.
2. 저온 보호제(들)
용어 "저온 보호제"는 용어 "냉동 보호제"와 상호 번갈아가며 사용될 수 있 고, 단일 저온 보호제 및 냉동 보호제와, 2 이상의 저온 보호제 화합물의 혼합물을 말하는 것으로 한다. 저온 보호제는 냉동 건조 도중 및 이후에 폴리뉴클레오티드를 안정화시키는 화합물일 수 있다. 각종 저온 보호제가 통상적인 문헌, 예를 들면 문헌[참조: Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Vol.2, 19th edition(1995)]에 기재되어 있다.
일 양태에서, 본 발명에 유용한 저온 보호제는 당 알콜, 예를 들면 알디톨, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합물이다. 특히 폴리에틸렌 글리콜이 바람직하다. 또다른 양태에서, 저온 보호제는 알돈산, 우론산, 알다르산, 및 이들의 조합물을 포함한 당 산이다.
본 발명의 저온 보호제는 또한 카보하이드레이트일 수 있다. 적당한 카보하이드레이트는 2 이상의 하이드록실 그룹을 함유한 알데히드 또는 케톤 화합물이다. 카보하이드레이트는 환형 또는 선형일 수 있고 예를 들면 알도스, 케토스, 아미노 당, 알디톨, 이노시톨, 알돈산, 우론산, 또는 알다르산, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 카보하이드레이트는 또한 모노-, 디-, 또는 폴리-카보하이드레이트, 예를 들면 디사카라이드 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 적당한 카보하이드레이트는 예를 들면 글리세르알데히드, 아라비노스, 릭소스, 펜토스, 리보스, 자일로스, 갈락토스, 글루코스, 헥소스, 이도스, 만노스, 탈로스, 헵토스, 글루코스, 프룩토스, 글루콘산, 솔비톨, 락토스, 만니톨, 메틸 α-글루코피라노시드, 말토스, 이소아스코르브산, 아스코르브산, 락톤, 솔보스, 글루카르산, 에리트로스, 트레오스, 아라 비노스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 에리트룰로스, 리불로스, 자일룰로스, 시코스, 타가토스, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루카르산, 갈락투론산, 만우론산, 글루코사민, 갈락토사민, 수크로스, 트레할로스, 또는 뉴라민산 또는 이들의 유도체를 포함한다. 적당한 폴리카보하이드레이트는 예를 들면 아라비난, 프룩탄, 푸칸, 갈락탄, 갈락투로난, 글루칸, 만난, 자일란(예를 들면, 이눌린), 레반, 푸코이단, 카라게난, 갈락토카롤로스, 펙틴, 펙트산, 아밀로스, 풀루란, 글리코겐, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 덱스트란, 푸스툴란, 키틴, 아가로스, 케라틴, 콘드로이틴, 데르마탄, 하이알루론산, 알긴산, 잔탄 검 또는 전분을 포함한다. 특히 유용한 카보하이드레이트는 수크로스, 글루코스, 락토스, 트레할로스, 및 이들의 조합물이다. 수크로스가 특히 유용한 저온 보호제이다.
바람직하게는, 본 발명의 저온 보호제는 카보하이드레이트 또는 다가 알콜일 수 있는 "당" 알콜이다. 다가 화합물은 1 이상의 하이드록실 그룹을 함유한 화합물이다. 바람직하게는, 다가 화합물은 선형이다. 적당한 다가 화합물은 예를 들면 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 글리세롤; 또는 펜타에리트리톨; 또는 이들의 조합물을 포함한다.
몇몇 바람직한 양태에서, 저온 보호제는 수크로스, 트레할로스, 만니톨 또는 솔비톨이다. 기타 바람직한 양태에서, 저온 보호제는 수크로스이다. 이들 저온 보호제 중 임의 것은 원한다면 나머지 저온 보호제 중 적어도 하나와의 혼합물 형태로 형성될 수 있다.
저온 보호제 또는 저온 보호제의 혼합물은 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 용액에 약 0.5 중량% 내지 약 10 중량%의 농도로 존재한다. 몇몇 양태에서, 저온 보호제(들)는 용액내에 약 1.0 중량% 내지 약 8.0 중량%의 농도로 존재한다. 기타 양태에서, 저온 보호제(들)는 용액내에 약 1.0 중량% 내지 약 5.0 중량%의 농도로 존재한다.
3. 폴리뉴클레오티드 용액내의 임의 첨가제
폴리뉴클레오티드 용액은 바람직하게는 수용액이다. 그러나, 원한다면, 1 이상의 용매가 물, 폴리뉴클레오티드 및 저온 보호제와 화합 가능한 용액에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 또는 글리세롤과 같은 수용성 알콜이 용액에 첨가될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 용액은 바람직하게는 완충액과 함께 제조되어, 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물의 재수화시 등장성이 달성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 용액은 바람직하게는 약 6.2 내지 약 7.8의 pH를 가진다. 일 양태에서, 폴리뉴클레오티드 용액은 약 6.2 내지 약 7.8의 pH를 가진다. 또다른 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 용액은 바람직하게는 약 6.2 내지 약 6.9의 pH를 가진다. 이 pH 범위는 본 발명의 냉동 건조법 동안 폴리뉴클레오티드의 붕괴를 막는 역할을 한다. 따라서, 사용될 수 있는 완충액은 냉동 건조 동안 앞서 언급된 원하는 pH를 유지할 수 있는 임의 화합물을 포함한다. 바람직한 완충액은 일반적으로 5-60 mM 농도의 포스페이트와 시트레이트를 포함한다. 바람직하게는, 완충액은 폴리뉴클레오티드 용액의 총 중량을 기준으로 약 0.1 중량% 내지 약 1.2 중량% 수준으로 이용된다.
(앞서 기재된) 촉진제, 계면 활성제, 또는 염 또는 이들의 조합물과 같은 기 타 임의 첨가제가 폴리뉴클레오티드 용액에 첨가될 수 있다. 염은 폴리뉴클레오티드 용액의 등장성을 조절하기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 나트륨 클로라이드와 같은 염이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 염은 폴리뉴클레오티드 용액의 총 중량을 기준으로 약 0.1 중량% 내지 약 1.0 중량%의 양으로 사용된다.
전반적인 이들 임의 첨가제는 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 용액의 총 중량%를 기준으로 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량%를 포함한다.
이들 성분들을 배합하여 형성된 폴리뉴클레오티드 용액은 본 발명의 냉동 건조 공정에 의해, 본 발명의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물이 만들어 진다.
B. 냉동 건조 조성물
앞서 기재된 폴리뉴클레오티드 용액으로부터 제조된 본 발명의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은
(a) 적어도 일 폴리뉴클레오티드,
(b) 적어도 일 저온 보호제(폴리뉴클레오티드:저온 보호제의 비는 1.0 중량부 저온 보호제당 약 0.001 내지 약 1.0 중량부 폴리뉴클레오티드임), 및
(c) 폴리뉴클레오티드 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량% 물을 포함한다.
몇몇 양태에서 이러한 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은 약 6% 이하의 물을 함유한다. 몇몇 양태에서, 폴리뉴클레오티드 조성물은 약 5% 이하의 물을 함유한다. 기타 양태에서, 냉동 건조 조성물은 약 2 중량% 내지 약 3 중량%의 물을 함유한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 선행 폴리뉴클레오티드 조성물에 비해 증가된 안정성을 특징으로 한다. 초나선의 퍼센티지는 폴리뉴클레오티드의 순도 수준을 규정한다. 이에 따라, 폴리뉴클레오티드의 안정성은 시간에 따라 보유된 순도 수준으로 결정된다. "증가된 또는 증진된 안정성"은 폴리뉴클레오티드가 약 37℃에서 최소 10일간의 시간에 걸쳐서 적어도 90%의 초나선을 보유함을 의미한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA는 최소 20일에 걸쳐 37℃에서 초나선의 적어도 90%를 보유한다. 좀더 바람직하게는, 몇몇 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 최소 30일에 걸쳐 약 37℃에서 적어도 90%의 초나선을 보유한다.
안정성 이외에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 바람직하게는 기존의 기타 폴리뉴클레오티드 조성물에 비해 증가된 용해도를 가진다. "증가된 용해도"란 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물이 약 25℃(즉, 실온)의 물에서 최소 1 밀리그램/밀리리터("mg/mL")의 용해도를 가짐을 의미한다. 원한다면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 약 25℃의 물에서 최소 2 mg/mL의 용해도를 가진다. 기타 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 약 25℃의 물에서 적어도 10 mg/mL의 용해도를 가진다. 약 20 mg/mL만큼 높은 용해도도 가능하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물의 증가된 안정성 및 용해도는 바람직하게는 본원에 기재된 방법에 따라 폴리뉴클레오티드 용액의 냉동 건조에 의해 얻어진다.
본 발명에 따른 냉동 건조 조성물은 또한 주로 무정형 물리적 구조를 특징으로 한다. 몇몇 양태에서, 조성물은 실질적으로 무정형이지만, 약간 소량 또는 적은 퍼센티지의 결정, 예를 들면 라텍스 구조를 함유한 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
C. 약학 조성물
냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은 저장 또는 시험관내 또는 생체내 사용을 위해 여러 형태로 제형될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물이 특히 유용한 생체내 용도의 예는 미국 특허 5,593,972; 5,703,055; 5,676,954; 5,580,859; 5,589,466; 5,739,118 및 5,837,533; 1996년 12월 27일자에 공개된 국제 특허 출원 WO96/41873; 및 1994년 8월 8일자에 공개된 국제 특허 출원 WO94/16737에 기재(본원에서 참조됨)된 백신 접종법 및 플라스미드 DNA를 이용하는 유전자 요법을 포함한다.
본 발명의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은 각종 건조상 또는 액상으로 제형될 수 있다. 원한다면, 본 발명의 건조상 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은 밀링, 그라운딩, 또는 체질되어 업계의 숙련인에게 익히 공지된 기술에 의해 분말을 형성할 수 있다. 예를 들어, 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은 조립기, 제트 밀, 럼프 제거기 또는 절단기를 통해 분말로 전환될 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 조성물은 약 100 ㎛ 이하의 평균 입자 크기를 가진다. 조성물이 폐 투여에 의해 약제로서 사용되려면, 예를 들어, ≤ 10㎛의 입자 크기가 바람직하다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 예를 들면 분말, 정제, 캡슐, 장 용피제 또는 캡슐, 또는 좌약 형태로 포유동물에 투여하도록 제조된다.
또다른 예로서, 액상 폴리뉴클레오티드 조성물은 물에서 냉동 건조 조성물을 복원시켜 제조되고/제조되거나 액상 조성물로 제조될 수 있다. 복원된 조성물은 바람직하게는 초기 폴리뉴클레오티드 용액의 경우에 앞서 기재된 바와 같이 약 6.2 내지 약 7.8의 pH를 가진다.
이러한 건조상 조성물 또는 액상 용액이 바람직하게는 약학 조성물로 사용된다. 이에 따라, 본 발명의 또다른 양태는 약학 조성물이고, 이는 임의의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께, 본원에서 기재된 냉동 건조 조성물 또는 본원에 기재된 복원된 액상 조성물을 활성 성분으로 포함한다. 약학 조성물의 원하는 목적에 따라, 부형제 또는 담체가 경구, 비경구, 비내, 및 폐내와 같은 투여 경로에 적당하다. 이러한 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은 비내 또는 폐 적용의 경우를 포함하여, 분말, 액체 또는 서스펜션 투여 형태를 위한 기타 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 출발 물질로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[참고: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19th edtion (1995), Chapter 95 Aerosols]을 참조하라.
이들 활성제를 이용하는 바람직한 약학 조성물은 장 용피제이다. 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오티드 조성물은 장 용피 캡슐에 경구 백신 형태로 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 DNA이다. 바람직하게는, 약 1 mg의 DNA가 Capsugel, a division of Warner Lambert Parke-Davis에 의해 제조된 것과 같이 경질 젤라틴 캡슐에 로딩된다. 활석, 마그네슘 스테아레이트와 같은 유동 윤활제가 폴리뉴클레오티드 조성물에 첨가될 수 있다. 마찬가지로, 셀룰로스와 같은 벌킹제 도 첨가될 수 있다. 젤라틴 캡슐은 예를 들면, EUDRAGIT 장 용피 폴리머 물질을 이용하여 장 용피된다. 기타 양태에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 폐로 전달하기 위해 에어로졸 형태로 투여되는 분말을 형성한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 조성물은 폐 질환 치료에 유용한 유전자를 전달하기 위해 제조될 수 있다. 또한, 예를 들어, 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자를 암호화 하는 DNA를 지닌 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 낭포성 섬유증을 치료하는 데 사용될 수 있다.
D. 용법
이에 따라, 본 발명의 또다른 양태로서, 포유동물에 상술된 약학 조성물 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 치료 방법이 제공된다. 조성물의 투여 목적에 따라, 이들 치료법은 경구, 비경구, 비내, 및 폐내를 포함한 원하는 투여 경로에 의해 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 조성물은 허용가능한 등장성을 지닌 액상으로 제형되고 근육내, 정맥내, 경피 또는 피하 적용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 조성물은 또한 분말의 비내 또는 폐내 전달(흡입)을 통해 적용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 조성물은 또한 질, 직장 및 입과 같은 체강으로 좌약 형태로 적용될 수 있다. 이들 조성물의 이용 방법은 특히 질환, 예를 들면 낭포성 섬유증을 위한 유전자 요법 프로토콜을 포함한다.
II. 본 발명의 냉동 건조 공정
본 발명의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물과 본 발명의 약학 조성물을 제조하기 위해, 앞서 기재된 바와 같이 형성된 폴리뉴클레오티드 용액은 생성된 냉 동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물의 안정성과 용해도를 증가시키는 효과를 지닌 주의깊게 조절된 단계에 따라 냉동 건조된다. 용액을 냉동 건조시키는 데 사용된 장치는 진공하에 폴리뉴클레오티드 용액을 서서히 냉각하고 서서히 가열할 수 있는 임의 장치일 수 있다. 본원에서 사용된, "유지" 또는 "유지하는"은 시간에 따라 주어진 온도 및/또는 진공을 유지함을 의미한다. "램프" 또는 "램핑"은 시간에 따라 온도 및/또는 진공 조건을 변화시킴을 의미한다. 냉동 건조 공정에서, 몇몇 단계는 유지 단계이고 나머지는 램핑 단계이다.
본 발명의 냉동 건조 공정은 하기에 좀더 상세히 기재된다:
약 6.2 내지 약 7.8의 pH를 가지고, 폴리뉴클레오티드 용액의 총 용적을 기준으로 약 0.1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 적어도 일 폴리뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드 용액의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 10 중량%의 적어도 일 저온 보호제를 포함하는 폴리뉴클레오티드 수용액을 우선 냉각시켜 용액을 고형화 또는 동결시킨다. 일 양태에서, 용액은 약 -30℃ 내지 약 -70℃의 온도로 냉각된다. 또다른 양태에서, 용액은 약 -40℃ 내지 약 -60℃의 온도로 냉각된다. 기타 양태에서, 용액은 약 -40℃ 내지 약 -50℃의 온도로 냉각된다. 이러한 냉각 단계는 바람직하게는 약 1 시간 내지 약 5시간, 좀더 바람직하게는 약 1시간 내지 약 3시간에 걸쳐 단계적이면서 램핑되거나 이렇게 수행된다. 몇몇 양태에서, 용액은 1시간 내지 2시간에 걸쳐 냉각된다. 몇몇 양태에서, 용액은 2시간 내지 3시간에 걸쳐 냉각된다. 바람직하게는 용액은 원하는 냉각 기간 동안 선속도로 냉각된다. 단계적인 냉각이 바람직하지만, 냉동 건조동안 폴리뉴클레오티드를 상당히 붕괴함이 없이 용액을 빠르게(예, 10분 이하) 동결시킬 수 있다.
원하는 동결 온도에 이르면, 진공이 즉시 가해져, 압력을 약 25 mTorr 내지 약 250 mTorr로 감소시킨다. 몇몇 양태에서, 진공은 압력을 약 50 내지 약 100 mTorr로 감소시킨다. 조성물은 임의로는 이러한 온도 및 압력에서 약 30분 내지 약 5시간, 바람직하게는 적어도 1시간 동안 유지된다. 일 특정 바람직한 양태에서, 진공을 가하여 압력을 약 300 mTorr 내지 약 200 mTorr로 빠르게 감소시킨 후, 약 1시간 내지 약 2시간에 걸쳐 압력을 약 150 mTorr에 이어 약 40 mTorr로 단계적으로 감소시킨다.
냉각 후, 폴리뉴클레오티드 용액은 "1차 건조 또는 가열 사이클"을 받는데, 이는 본 방법의 성능에 상당히 기여한다. 이러한 1차 가열 단계에서, 동결된 용액은 초기에 약 5시간 내지 약 40 시간에 걸쳐 약 -40℃ 내지 약 20℃의 온도로 단계적으로 가열된다. 원하는 양태에서, 동결된 용액은 초기에 약 5시간 내지 약 20시간에 걸쳐 약 -10℃ 내지 약 20℃의 온도로 단계적으로 가열된다. 또다른 양태에서, 동결된 용액은 약 -40℃ 내지 약 10℃의 온도로 단계적으로 가열된다. 또다른 양태에서, 동결된 용액은 초기에 약 8시간 내지 약 20시간에 걸쳐 약 -5℃ 내지 약 5℃의 온도로 단계적으로 가열된다. 특히 바람직한 양태에서, 동결된 용액은 초기에 0℃의 온도로 가열된다. 이러한 1차 가열 단계는 바람직하게는 약 5시간 내지 40시간, 원한다면 약 5 내지 20시간, 좀더 바람직하게는 약 6시간 내지 15시간에 걸쳐 수행된다. 몇몇 양태에서, 이러한 초기 가열 단계는 약 10시간에 걸쳐 수행된다.
1차 건조 사이클동안 폴리뉴클레오티드 용액을 가열하는 것 이외에, 진공이 가해져 용액을 건조하기 시작한다. 바람직하게는, 진공은 1차 가열 단계가 개시되는 순간 적용된다. 이러한 가열 단계 동안 진공압은 바람직하게는 약 250 mTorr이하이고, 좀더 바람직하게는 약 25 내지 약 150 mTorr이다. 특정 양태에서 진공압은 약 40 내지 약 150 mTorr이다. 기타 양태에서, 이러한 가열 단계동안 진공압은 약 60 mTorr 내지 약 150 mTorr이다. 일 바람직한 양태에서, 진공은 바람직하게는 압력이 5분 이내에 200 mTorr로 떨어진 다음 약 1시간 내지 약 2시간에 걸쳐 원하는 압력으로 감소되도록 적용된다.
1차 가열 단계에 이어, 폴리뉴클레오티드 용액은 폴리뉴클레오티드 용액이 평형이 이루어지도록 일정한 온도 및 압력으로 유지된다. 이러한 유지 단계는 바람직하게는 약 1시간 내지 약 10시간, 좀더 바람직하게는 약 2시간 내지 약 6시간이다. 바람직하게는 이러한 유지 단계동안 온도는 약 -35℃ 내지 약 10℃로 유지된다. 몇몇 양태에서, 온도는 약 2 내지 약 10시간 동안 약 -10℃ 내지 약 10℃로 유지된다. 기타 양태에서, 온도는 약 5시간 내지 약 7시간 동안 약 -5℃ 내지 약 5℃로 유지된다. 바람직한 양태에서, 온도는 약 0℃로 유지된다. 바람직하게는 이러한 유지동안 진공압은 약 1시간 내지 약 10시간 동안 약 200 mTorr 이하, 좀더 바람직하게는 약 25 mTorr 내지 약 250 mTorr로 유지된다. 몇몇 양태에서, 이러한 유지동안 진공압은 약 40 mTorr 내지 약 150 mTorr로 유지된다. 몇몇 양태에서, 이러한 유지동안 진공압은 약 60 mTorr 내지 약 150 mTorr로 유지된다. 선택된 압력 및 온도는 바람직하게는 1차 가열 단계의 마지막에 달성된 온도 및 압력이다. 진공은 바 람직하게는 이러한 유지 단계에서 다음 단계로 연속 적용된다.
이러한 유지 후, 2차 건조 단계가 수행된다. 폴리뉴클레오티드 용액은 약 1시간 내지 약 20시간에 걸쳐, 약 25 mTorr 내지 약 250 mTorr의 압력에서 약 20℃ 내지 약 35℃의 온도로 단계적으로 2차 가열한다. 원하는 양태에서, 이러한 2차 가열 단계는 25 mTorr 내지 약 150 mTorr의 압력에서 약 1시간 내지 약 10시간에 걸쳐 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도로 용액을 단계적으로 가열한다. 또다른 양태에서 2차 가열은 약 2시간 내지 약 3시간에 걸쳐 온도를 약 23℃에서 약 27℃로 상승시킨다. 바람직한 2차 가열 단계에서, 온도는 약 25℃로 상승된다. 2차 가열 단계동안 진공압은 바람직하게는 약 250 mTorr 이하, 좀더 바람직하게는 약 25 내지 약 150 mTorr, 몇몇 양태에서는 약 40 내지 약 110 mTorr이다. 이러한 2차 가열 단계는 바람직하게는 약 1시간 내지 약 5시간, 좀더 바람직하게는 약 2 내지 3시간에 걸쳐 수행된다.
본 발명의 냉동 건조 공정의 특히 바람직한 양태에서, 1차 가열 단계는 바람직하게는 약 7시간 내지 약 11시간에 걸쳐 일어나고, 차후 유지 단계는 약 1시간 동안 진행되며, 2차 가열 단계는 약 2시간에 걸쳐 일어난다.
이러한 2차 가열 후, 폴리뉴클레오티드 용액은 임의로는 폴리뉴클레오티드 용액의 평형을 유지하기 위해 일정한 온도 및 압력으로 유지될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 2차 유지는 약 1시간 내지 약 10시간, 좀더 바람직하게는 약 2시간 내지 약 5시간이다. 몇몇 양태에서, 2차 유지는 약 2 내지 3시간이다. 바람직하게는 이러한 유지동안 온도는 약 20℃ 내지 약 30℃, 좀더 바람직하게는 약 23℃ 내 지 약 27℃, 가장 바람직하게는 25℃에서 유지된다. 바람직하게는 이러한 유지동안 진공압은 약 150 mTorr 이하, 좀더 바람직하게는 약 20 mTorr 내지 약 100 mTorr에서 유지된다. 선택된 압력과 온도는 바람직하게는 2차 가열 단계의 마지막에 달성되는 온도 및 압력이다.
바람직한 양태에서, 1차 가열 단계는 용액의 역용해(액화)를 피하면서 약 5시간 내지 약 30시간에 걸쳐 약 -20℃ 내지 약 20℃의 온도에서 용액을 단계적으로 가열한다. 이러한 가열 단계의 바람직한 시간은 약 5 내지 약 20시간, 좀더 바람직하게는 약 5 내지 약 10시간이다. 이 단계의 바람직한 온도는 약 -10℃ 내지 약 20℃이고, 좀더 바람직하게는 온도는 약 0℃이다. 이러한 바람직한 1차 건조 사이클은 완전한 냉동 건조 공정에 필요한 시간을 줄여준다. 실제로, 바람직한 1차 건조 단계는 2차 건조 단계를 가능케하고, 여기서 폴리뉴클레오티드 용액은 약 23℃ 내지 약 27℃의 온도로 가열되어, 약 2시간 내지 약 3시간에 걸쳐 진행되며, 약 37℃에서 최소 10일에 걸쳐 적어도 90%의 초나선을 보유하는 실질적으로 무정형 물리적 구조의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
전반적으로, 일단 진공이 이러한 공정의 단계들에서 적용되면, 마지막 단계가 완료(즉, 2차 가열 또는 임의 2차 유지)될 때까지 계속 적용되는 것이 바람직하다. 그러나, 임의 시간때에 적용된 진공압이 약 200 mTorr 이하라면 각 가열 단계에서 진공압을 변화시킬 수 있다
임의적인 최종 유지가 완료된 후, 생성된 폴리뉴클레오티드 조성물이 회수되며, 이는 회수된 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량% 함량 의 물을 가진다. 회수된 폴리뉴클레오티드 조성물은 폴리뉴클레오티드 조성물의 총 중량을 기준으로, 약 0.5 내지 약 6 중량%, 바람직하게는 약 1 중량% 내지 약 5 중량%, 좀더 바람직하게는 약 2 중량% 내지 약 4 중량%의 물을 가진다. 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물은 바람직하게는 1 중량부의 저온 보호제당 약 0.001 중량부 폴리뉴클레오티드 내지 약 1 중량부 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 일 양태에서 폴리뉴클레오티드 조성물은 바람직하게는 1 중량부의 저온 보호제당 약 0.001 중량부 폴리뉴클레오티드 내지 약 0.5 중량부 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 폴리뉴클레오티드 조성물은 바람직하게는 조성물의 용해도를 개선시키기 위해 무정형 구조이다. 증가된 용해도는 비교적 빠른 복원을 가능케 하고 좀더 농축된 조성물을 만들기 위해 원해진다.
하기 실시예는 본 발명의 몇몇 양태를 상세히 설명해 준다. 이들 실시예는 단지 본 발명의 예시에 불과하며 본 발명의 범위를 제한하는 의도는 아니다.
실시예 1: 본 발명의 바람직한 냉동 건조 조성물
플라스미드 DNA를 폴리뉴클레오티드로 사용하고 수크로스를 저온 보호제로 사용하는 본 발명의 일 바람직한 냉동 건조 조성물을 앞서 기재된 공정에 의해 제조한다. 이들 조성물에 사용된 DNA 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 프로모터와 SV40 폴리아데닐화 부위에 연결된 gD2 단백질을 암호화 하는 허프스 심플렉스 바이러스 유전자를 함유한다. 플라스미드 24로 언급된 이 플라스미드는 1997년 11월 13 일자에 공개된 국제 특허 출원 WO97/41892 및 미국 특허 5,593,972의 도 8D에 상세히 기재되어 있다.
냉동 건조 전 폴리뉴클레오티드 용액과 액상 대조구 조성물의 성분들은 표 1에 기록되어 있다.
성분 냉동 건조 전 폴리뉴클레오티드 용액 액상 대조구 조성물
플라스미드 DNA 0.2 중량/용적% 0.2 중량/용적%
수크로스 2.0 중량/용적% ---
포스페이트 완충액(5 mM) 0.045 중량/용적% 나트륨 포스페이트, 일염기성; 및 0.047 중량/용적% 나트륨 포스페이트, 이염기성 ---
주사용 수(충분량) 100 mL 100 mL
부피바카인(촉진제) --- 0.25 중량/용적%
EDTA --- 0.01 중량/용적%
시트레이트 완충액 --- 30 mM
pH 6.7 6.4
표 1의 냉동 건조 전 용액을 동결, 1차 건조 및 2차 건조 단계를 위한 특정 파라미터에 의해 특징지워지는 본 발명에 따른 냉동 건조 공정에 투입한다. 이들 파라미터는 표 2에 제시된 순서대로 수행되고 두차례 연속 1차 건조 공정과 네차례 연속 2차 건조 공정을 포함한다.
냉동 건조 사이클 온도(℃) 진공(mTorr) 시간(분) 램프/유지
동결 단계 -40 200 30 유지
1차 건조 단계 (2) 0 100 30 램프
0 100 720 유지
2차 건조 단계 (4) 30 75 20 램프
30 75 180 유지
25 50 5 램프
25 50 120 유지
%초나선(%SC) 감소를 근거로 37℃에서 본 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성 물과 액상 대조구의 안정성을 모니터링한다. 아가로스 겔법을 이용하여 샘플에 대한 %SC를 분석한다. 아가로스 겔법은 여러 형태의 DNA 분리를 위해 분자 생물학에서 일반적으로 수행되는 전기영동 과정이다. 아가로스 겔법에 의한 검출은 에티디움 브로마이드 다이의 DNA로의 삽입 정도에 달려 있다. 이 방법은 검출을 위해 이중 가닥(ds)-DNA에 결합하는 형광 다이를 이용하고, 형광을 간접적으로 측정한다. DNA를 에티디움 브로마이드(EtBr)를 함유한 아가로스 겔상에서 전기영동시킨다. DNA중으로 삽입시, EtBr의 형광이 강하게 증폭된다. CCD(Charge-Coupled Device)를 이용하여 형광 시그널을 모은다. 이미지를 합쳐(Alpha Innotech TM 소프트웨어) 샘플에 존재하는 개환 플라스미드와 초나선 플라스미드의 상대적인 양을 계산한다. 결과는 플라스미드에 EtBr의 일관되고 일정한 결합에 좌우된다. 그러나, 관찰 결과는 %SC가 93% 이하이면, 겔 방법이 인위적으로 낮은 결과를 제공하는 것으로 나타났다. 이러한 이유로 인해, 문헌[참조: Montgomery et al, Pharmsci., (suppl. 1998) "HPLC Assay for Determining Purity of [%Supercoiled] Plasmid DNA in a Vaccine Product", Abstract 2503]에 기재된 대체 HPLC법이 개발되었다. 플라스미드 DNA의 순도는 초나선 T 형태의 함량으로 평가된다. 백본의 포스포디에스테르 링키지에서 단일 가수분해 단계는 초나선 DNA(SC)를 개환 형태(OC)로 전환하기에 충분하다. 이러한 형태 변화는 아가로스 겔상에서 변형된 이동성에 반영된다. 현재 플라스미드 DNA를 위해 가장 일반적으로 사용되는 순도 분석(%SC 분석)은 아가로스 겔법이다.
DNA의 붕괴를 나타내는 속도 방정식이 하기 표 3에 제공된다.
표 3
방정식 1 - kobs는 관찰된 속도 상수이고 DNA의 전반적 붕괴를 나타낸다(SC = 초나선; OC = 개환)
Figure 112000018994689-pct00005
방정식 2 - (가) 1차 조건하에, DNA 붕괴에 대한 속도 방정식은 하기로 표현될 수 있다: 여기서, [DNA]는 순도(%SC) 또는 DNA의 능력임
방정식 3 - 초기 조건을 이용한 상기 방정식의 적분, 시간 t = 0에서, [DNA]=[DNA]0는 하기 방정식을 만들어 낸다:
ln[DNA] = ln[DNA]0 - kobst
%SC(DNA의 순도) 안정성 데이터를 이용하는 방정식 3을 이용하면 특정 온도가 주어지고, 시간에 따른 ln(%SC)의 좌표가 만들어질 수 있으며 kobs를 좌표의 기울기로부터 계산할 수 있다.
방정식 4 - 주어진 온도에서, 저장 수명(shelf life)(t90, 90% SC에 이르는 온도)를 하기와 같이 계산할 수 있다:
Figure 112000018994689-pct00006
여기서, [%SC]0은 시간, t = 0에서 DNA의 순도를 나타낸다.
방정식 5 - 방정식 4에서 [%SC]0=95로 가정하면, 주어진 온도에서 플라스미드 DNA의 저장 수명은 하기와 같이 계산될 수 있다:
Figure 112000018994689-pct00007
표 2의 방정식 3를 기초로 하여, 전술된 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물과 표 1의 대조구의 경우 시간에 따른 ln(%SC)의 좌표를 만든다. 결과는 도 1의 그래프에 나타나 있다. 직선 최소 제곱 회귀 분석을 이용하여 좌표의 기울기(-kobs, 가-1차 관찰된 속도 상수)를 측정한다. 도 1은 바람직한 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물에 대한 속도 상수가 액상 대조구 조성물에 대한 속도 상수보다 최소 10배 낮음을 보여준다. 이들 결과는 또한 냉동 건조 조성물의 저장 수명이 37℃에서 액상 조성물보다 최소 10배 높음을 보여준다(반응식 1에서 방정식 5를 이용하여 계산하면 54일:4일).
표 1의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물을 X-선 회절에 의해 pH 6.4의 시트레이트 완충액에서 앞서 언급된 것과 동일한 gD2 유전자-함유 플라스미드 DNA(0.2 중량/용적%)로 구성된 DNA 용액(이 용액은 에탄올 침전법을 이용하여 침전됨[Sambrook, J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. E10=E11 "Concentrating Nucleic Acid: Precipitation with Ethanol or Isopropanol"])과 비교한다. X-선 회절 패턴은 두 조성물의 경우에 통상적으로 얻어지며 이는 냉동 건조 조성물이 무정형 구조의 X-선 회절 패턴 특성을 가지는 반면, 침전된 DNA는 상당한 결정 구조의 회절 패턴 특성을 나타냄을 보여준다. 본 발명의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물이 무정형 구조이면서 상당히 다공성인 물리적 성질을 가지기 때문에, 본 발명의 조성물은 상당한 수용성(약 20 mg/mL 이하)이다. 통상적인 HPLC법을 이용하여 용해도 시험을 수행한다.
실시예 2: 본 발명의 바람직한 냉동 건조 조성물
실시예 1에 기재된 플라스미드 DNA를 폴리뉴클레오티드로 사용하고 트레할로스를 저온 보호제 및 안정제로 사용하는 본 발명의 또다른 바람직한 냉동 건조 조성물을 본 발명 공정에 따라 제조한다. 액상 대조구는 실시예 1에 사용된 것과 일치한다. 표 4는 냉동 건조 전 용액의 조성과 액상 플라스미드 대조구의 조성을 보여준다.
성분 냉동 건조 전 폴리뉴클레오티드 용액 액상 대조구 조성물
플라스미드 DNA 0.2 중량/용적% 0.2 중량/용적%
트레할로스 2.0 중량/용적% ---
포스페이트 완충액(5 mM) 0.045 중량/용적% 나트륨 포스페이트, 일염기성; 및 0.047 중량/용적% 나트륨 포스페이트, 이염기성 ---
주사용 수(충분량) 100 mL 100 mL
부피바카인(촉진제) --- 0.25 중량/용적%
EDTA -- 0.01 중량/용적%
시트레이트 완충액 --- 30 mM
pH 6.7 6.4
냉동 건조 전 용액에 실시예 1에 기재된 냉동 건조 공정을 적용하고, 상기 실시예 1에 기재된 %초나선(SC) 감소를 기초로 37℃에서 이 조성물의 안정성을 모 니터링한다. 아가로스 겔법을 이용하여 샘플의 %SC를 분석한다. 도 2는 표 4의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물과 액상 대조구 조성물에 대해 시간에 따른 ln(%SC)의 좌표를 보여준다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 직선 최소 제곱 회귀 분석을 이용하여 좌표의 기울기(-kobs, 관찰된 속도 상수)를 측정한다. 도 2의 결과는 본 발명의 냉동 건조 조성물의 속도 상수가 액상 대조구의 속도 상수보다 4배 낮음을 보여준다. 이러한 데이터는 또한 본 발명의 냉동 건조 조성물의 저장 수명이 37℃에서 액상 대조구보다 4배 높음을 보여준다.
실시예 3: 저온 보호제의 선별
플라스미드 DNA와 함께 여러 저온 보호제(수크로스, 트레할로스, PVP 및 솔비톨)를 함유한 다수의 폴리뉴클레오티드 용액을 본 발명에 따라 냉동 건조시킨다. 이들 실험에 사용된 플라스미드 DNA는 허프스 심플렉스 바이러스, 타입 2의 gD2 항원을 발현시키는 실시예 1에 사용된 것과 동일한 플라스미드이다.
표 5는 평가된 8가지의 냉동 건조 전 폴리뉴클레오티드 용액의 조성을 나타낸다. 냉동 건조 파라미터는 실시예 1의 표 2에 기재된 것과 동일하다. %SC를 본 발명에 따른 이들 용액의 냉동 건조 이전 및 이후 모두에 상기 실시예 1에 기재된 아가로스 겔법을 이용하여 측정한다. 이에 따라, 표 5는 또한 각 폴리뉴클레오티드 용액에 대한 냉동 건조 전 %SC 및 본 발명에 따라 냉동 건조된 각 폴리뉴클레오티드 조성물에 대한 냉동 건조 후 %SC를 제공한다.
성분 또는 특성 폴리뉴클레오티드 용액
1 2 3 4 5 6 7 8
플라스미드 DNA(mg/mL) 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1
트레할로스(중량/용적%) 2 -- -- -- -- -- -- --
PVP(중량/용적%) -- 5 -- -- -- -- -- --
수크로스(중량/용적%) -- -- 2 2 -- -- 2 --
솔비톨(중량/용적%) -- -- -- -- 5 -- -- --
포스페이트 완충액(mM) 10 10 10 10 10 10 -- --
시트레이트 완충액(mM) -- -- -- -- -- -- 10 10
EDTA(%) -- -- -- 0.01 -- -- -- --
주사용 물(충분히) 100mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL
pH 6.9± 0.2 6.9± 0.2 6.9± 0.2 6.9± 0.2 6.9± 0.2 6.9± 0.2 6.9± 0.2 6.9± 0.2
냉동 건조 후 수분 함량(%) 1-2% >>1% 1-2% 1-2% 1-2% 1-2% 1-2% 1-2%
냉동 건조 전 %SC 96.8± 0.7 96.8± 0.7 96.8± 0.7 96.8± 0.7 96.8± 0.7 96.8± 0.7 96.4± 0.6 96.4± 0.6
냉동 건조 후 %SC 93.8± 0.7 81.2± 0.7 92.0±0.2 92.7±0.6 92.4± 0.7 66.1±1.0 92.7±1.0 90.7±0.9
이들 결과를 기초로 해보면, 트레할로스 및 수크로스가 PVP와 솔비톨보다 좀더 효과적인 저온 보호제이다. 저온 보호제가 없으면, 본 발명에 따른 용액 6의 냉동 건조에 기초한 냉동 건조 포스페이트 완충액 대조구는 30% 이상의 초나선 손실을 보이고 용액 8의 냉동 건조에 기초한 냉동 건조 시트레이트 완충액 대조구는 5% 이하의 손실을 보인다. 이는 무정형 일염기 종 이전에 결정 이염기 종의 동결로 인한 포스페이트 샘플의 산성 pH로의 가능한 pH 이동에 기인될 수 있다. 그러나, 이러한 현상은 저온 보호제 수크로스 존재하의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물에서는 관찰되지 않는다(용액 3과 7 참조). 따라서, 저온 보호제의 존재에서, 완충액 종은 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물에 어떠한 작용도 보이지 않는다.
냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물의 경우 수분 결과는 기타 저온 보호제(수분 함유 1-2%)를 함유한 냉동 건조 조성물과 비교시 PVP를 함유한 냉동 건조 조성물이 대부분 건조(수분 <<1%)되기 때문에 PVP가 우수한 동결 방지성을 보이지 않 음을 보여준다. PVP-함유 냉동 건조 조성물은 또한 15% 이상의 초나선 손실을 보여준다. 이러한 데이터에 따르면, 수크로스 및 트레할로스가 본 발명에 따른 냉동 건조 플라스미드 DNA 조성물에 대한 우수한 저온 보호제이다.
실시예 4. 면역 반응에 대한 본 발명의 냉동 건조 조성물의 효과
본 발명의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물의 약제 또는 리서치 시제로서의 효능을 평가하기 위해, 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 냉동 건조 조성물을 이용하여 면역 반응에 대한 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물과 대조구의 효과를 평가한다.
냉동 건조 조성물에 대한 일 대조구는 저온 보호제를 함유하지 않은 표 5의 냉동 건조 전 폴리뉴클레오티드 용액 넘버 6이다(Phos Pre-Lyo). 이들 실험에 사용된 또다른 대조구는 저온 보호제를 함유하지 않은 표 5의 용액 넘버 8의 냉동 건조 시트레이트 완충액 조성물이다(Citrate Post-Lyo). 이 실험에서 평가된 본 발명의 냉동 건조 조성물은 포스페이트 완충액에서 저온 보호제로 트레할로스를 지닌 표 5의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 용액 넘버 1(Trahalose/Phos); 포스페이트 완충액에서 저온 보호제로서 수크로스를 지닌 표 5의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 용액 넘버 3(Sucrose/Phos); 및 시트레이트 완충액에서 저온 보호제로서 수크로스를 지닌 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 용액 넘버 7(Sucrose/Cit)이다. 도 3과 4의 대조구(023 대조구 및 음성 대조구)는 일치하고 gD2 서열이 없는 플라스미드 백본과 완충액을 함유한다.
오리지날 냉동 건조 전 용액에 사용된 것이 무엇이든 간에, 각 냉동 건조 조성물을 포스페이트 또는 시트레이트 완충 용액에서 복원시킨다. 실시예 3의 각 복원된 냉동 건조 조성물 100 μL 용적내의 50 ㎍/DNA를 이용하여 근육내 경로에 의해 Balb/C 마우스(그룹당 5마리)를 면역화시킨다. 기타 성분은 이들 조성물에 첨가하지 않는다. 3주 후 동물을 안락사시킨다.
A. 세포 면역 반응 평가
앞서 기재된 마우스로부터 비장을 적출하여 림프증식 분석을 이용하여 항원-특이성 세포 면역 반응을 결정하는 데 사용한다. 수거된 비장으로부터 단일 세포 현탁물을 제조하고 이들 세포는 정제된 gD2 단백질의 부재 또는 20 ng/mL의 존재하에 2 x 105 세포/웰에서의 배양물이다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 4일간 배양한 후 1 μCi의 3[H] 티미딘(ICN Inc., 미국 캘리포니아 코스타 메사소재)을 함유한 완전 RPMI-1640 배지 20 μL를 각 웰에 첨가하고 추가 18시간 동안 배양한다. 복수 샘플 수거기를 이용하여 세포를 유리 섬유 매트상으로 모아 베타 카운터(Wallac, 핀란드)에서 통상적인 액체 신틸레이션 과정을 이용하여 방사능 도입을 측정한다.
B. 체액 면역 반응 평가
HSV gD2에 대한 항체 (체액) 반응을 평가하기 위해 혈청 샘플을 모은다. 혈청에서 gD2 특이성 IgG 항체를 ELISA로 평가한다. 간단히 말하면, 96 웰 평저 플레이트(Co-star, 미국 매사츄세츠 캠브리지소재)를 정제된 gD2 단백질로 0.4 ㎍/mL 농 도로 4℃에서 밤새 코팅한다. 플레이트를 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 4% 소 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹한다. 혈청의 적절한 희석액 50 μL를 플레이트에 첨가하고 4℃에서 밤새 둔다. PBST로 5회 세척한 후, 퍼옥시다제와 접합된 항-마우스 IgG(Sigma, 미국 미주리 세인트 루이스) 1:2000 희석액을 첨가하고 플레이트를 1시간 동안 배양한다. 플레이트를 PBST로 세척하고 기질 3,3',5,5'- 테트라메틸벤지딘(TMB)-H2O2(Biotecx, 미국 텍사스 휴스톤)를 첨가한다. 색을 30분간 전개시킨 다음 450 nm에서 Emax 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, 미국 캘리포니아 서니베일)를 읽는다.
C. 결과
도 3과 4는 각각 상기 조성물에 대한 세포 및 체액 반응을 나타낸다. 결과는 본 발명의 냉동 건조 포스페이트/시트레이트 조성물과 냉동 건조 시트레이트/무-저온 보호제 대조구에 비해 본 발명의 냉동 건조 시트레이트/수크로스 조성물에 대해 보다 높은 세포 및 체액 반응을 보여준다. 본 발명의 냉동 건조 조성물의 결과를 포스페이트 완충액에서 냉동 건조 전 대조구와 비교하면, 냉동 건조 공정과, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 조성물에서 저온 보호제(수크로스 또는 트레할로스)의 포함이 세포 반응과 체액 반응에 악영향을 미치지 않음이 분명하다. 본 발명의 냉동 건조 조성물은 플라스미드 또는 이들 내에 함유된 폴리뉴클레오티드의 활성을 보유한다.
실시예 5: 본 발명의 냉동 건조 조성물의 평가
16개의 다른 냉동 건조 전 용액을 평가하고 이를 표 6에 기재하고 있다. 사용된 각 용액에서 DNA는 실시예 1에 기재된 동일한 gD2-함유 플라스미드이다. 이들 용액은 표에서 여러 코드로 구분되고 있으며 (조성물 코드에서 첫번째 숫자로 표시된) DNA 농도, (코드에서 첫번째 문자로 표시된) 저온 보호제, (코드에서 두번째 숫자로 표시된) 저온 보호제 농도, 및 (코드에서 낮음은, L로, 높음은 H로 표시된) 냉동 건조 후 수분 함량에 있어 차이가 난다. 냉동 건조 전 용액을 주사용으로 충분한 100 mL 물과 함께 제조하고, 이를 상기 표 2에서 약술된 냉동 건조 사이클 파라미터를 이용하여 본 발명에 따라 냉동 건조한다.
1 mg/mL의 플라스미드 DNA와 함께 실시예 1의 표 1에 기록된 액상 대조구 제형을 지닌 액상 대조구(조성물 코드 # 96F0254)에서와 같이 표 6의 모든 냉동 건조 조성물을 37℃에서 촉진된 안정성 시험에 투입한다. 안정성 연구는 또다른 대조구로서 저온 보호제가 없는 냉동 건조 플라스미드 조성물을 포함한다. 샘플을 0일 내지 30일에서 여러 시간 간격으로 모아 실시예 1에 기재된 아가로스 겔법을 이용하여 %SC를 분석한다. 최소 제곱 회귀 분석에서 %SC 데이터를 이용하여(표 3에서 방정식 3 참조), 여러 조성물에서 DNA 붕괴에 대한 가-1차 속도 상수(kobs)를 측정한다. 여러 조성물에 대한 95% 신뢰구간(CI)과 R2(적합도)값을 이용한 kobs값을 표 6에 요약하고 있다.
화합물 코드 # DNA (mg/mL) 저온 보호제 (중량/중량%) 냉동건조 후 수분 함량(%) Kobs(95% C.I. (x10-4)일-1 냉동 건조 후 R2 냉동 건조 후
96F-0254 1 -- -- 139.8±117 0.93
1S1L 1 수크로스 1% 2 12.3±20.39 0.77
1S2L 1 수크로스 2% 2 4.0±6.7 0.77
1T1L 1 트레할로스 1% 2 66.5±46.2 0.95
1T2L 1 트레할로스 2% 2 94.1±28.9 0.99
2S1L 2 수크로스 1% 2 11.2±8.6 0.94
2S2L 2 수크로스 2% 2 10.2±15.5 0.80
2T1L 2 트레할로스 1% 2 40.5±28.2 0.95
2T2L 2 트레할로스 2% 2 55.0±7.6 1.00
1S1H 1 수크로스 1% 4 18.9±43.1 0.64
1S2H 1 수크로스 2% 4 3.1±10 0.47
1T1H 1 트레할로스 1% 4 48.5±24.9 0.97
1T2H 1 트레할로스 2% 4 41.9±41 0.91
2S1H 2 수크로스 1% 4 6.1±20 0.47
2S2H 2 수크로스 2% 4 21.6±19.2 0.92
2T1H 2 트레할로스 1% 4 26.1±20.1 0.94
2T2H 2 트레할로스 2% 4 32.5±1.4 1.00
%SC 결과는 본 발명의 모든 수크로스-함유 냉동 건조 조성물이 37℃에서 최소 4주간(즉, 실험 기간 동안) 안정함을 보여준다. 95% 신뢰 구간(CI)과 표 5에서 보고된 R2(적합도)를 이용한 가-1차 속도 상수(kobs)로부터 기존의 임상 조성물에 대한 kobs가 저온 보호제로서 수크로스를 함유한 본 발명의 대부분의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물에 대한 kobs보다 최소 10배 높음을 명백히 알 수 있다. 마찬가지로, 기존의 임상 조성물에 대한 kobs는 저온 보호제로서 트레할로스를 함유한 본 발명의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물에 대한 kobs보다 최소 1.5배 높다. 이러한 데이터를 기초로, 수크로스는 본 발명의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물의 경우에 최상의 저온 보호제일 뿐만 아니라 최상의 안정제이다.
수크로스를 함유한 냉동 건조 조성물(코드 2S2L)의 저장 수명(%초나선 95% 내지 90%)은 37℃에서 54일인데 비해, 액상 조성물 코드 96F0254의 저장 수명은 4일이다. 그러나, 5℃에서, 이러한 기존의 임상 조성물은 2년간 안정하다. 따라서, 추정해보면, 본 발명의 냉동 건조 조성물은 매우 긴 저장 수명을 가질 것으로 예상된다. 주위 온도(25℃)에서, 최소 6개월간의 안정성이 기대된다. 저온 보호제로서 트레할로스를 함유한 본 발명의 고 수분, 냉동 건조 조성물은 트레할로스를 함유한 유사한 저 수분 조성물에 비해 우수한 안정성을 보인다.
수크로스를 함유한 본 발명의 저 수분 냉동 건조 조성물의 속도 상수는 수크로스를 함유한 본 발명의 고 수분, 냉동 건조 조성물에 비해 비교적 낮다. 이러한 데이터를 기초로, 실시예 1의 냉동 건조 조성물(2% 수크로스를 함유함)을 다음 실험을 위한 바람직한 조성물로서 선택했다.
실시예 6: 고 농도 DNA 산물
본 발명의 바람직한 냉동 건조 조성물을 촉진제를 함유한 최종 고 농도 약제 제조를 위해 벌크 DNA를 냉동 건조시키는 데 제공한다. 이러한 조성물은 냉동 건조 전 용액에 0.2 중량/용적%의 실시예 1에 기재된 것과 동일한 플라스미드 DNA, 저온 보호제로서 2.0 중량/용적% 농도의 수크로스, 시트레이트 완충액(5 mM, pH 6.7) 및 주사용으로 충분한 물 100 mL를 함유한다. 상기 실시예 1의 표 2에 기재된 사이클을 이용하여 조성물을 냉동 건조시킨다. 여러 농도의 부피바카인, 촉진제(0.25, 0.6 및 1.0 중량/용적%)를 시트레이트 완충액(5 mM, pH 6.7)에서 제조하고 이를 이용하여 상술된 냉동 건조 산물을 복원시킨다. 원하는 DNA 농도를 얻기 위해, 다양 한 양의 부피바카인 완충액을 냉동 건조 분말에 첨가한다. 생성된 "약제" 제형은 표 7에 기재되어 있고, 표 7에는 또한 상술된 %SC로 측정된 복원 후의 시간(일 수)에 따른 고 농도 DNA 산물의 안정성을 보고하고 있다.
조성물 # DNA 농도(mg/mL) 부피바카인 농도 (중량/용적%) 시간(일) 순도(%SC)
1 5.3 - 0 95
18 92
2 5.3 0.6 0 95
18 93
3 10 1.0 0 95
1 95
3 95
4 10 - 0 95
18 94
5 20 - 0 95
18 93
이들 결과로부터 본 발명의 복원된 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물 최소 20 mg/mL 이하가 순도를 기준으로 18일간 안정함을 관찰할 수 있다. 복원된 용액이 물리적 외관을 기초로 할 때 균일함을 주목해야 한다.
앞서 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본원에서 참조된다. 본 발명의 다수의 변형 및 수정도 상술된 명세서에 포함되고 업계의 숙련인도 이를 분명히 알 수 있다. 본 발명의 조성물 및 공정에 대한 이러한 수정 및 변형도 첨부된 청구항의 범위내에 포함되는 것으로 해석한다.

Claims (55)

  1. (a) 폴리뉴클레오티드,
    (b) 1.0 중량부의 저온 보호제 당 약 0.001 내지 약 1.0 중량부의 폴리뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드:저온 보호제의 비를 갖는 저온 보호제, 및
    (c) 폴리뉴클레오티드 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량%의 물
    을 포함하고;
    약 37℃에서 최소 10일간에 걸쳐 90% 이상의 초나선을 보유하는 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 물이 약 1 중량% 내지 약 5 중량%로 존재하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 물이 약 2 중량% 내지 약 3 중량%로 존재하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 ADNA, BDNA, ZDNA, RNA, tRNA, mRNA, 및 이들의 조합물로 구성된 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥 DNA인 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 플라스미드 DNA인 조성물.
  7. 제 4 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 바이러스 벡터인 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 2 이상의 저온 보호제의 조합물을 추가로 포함하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 저온 보호제가 당 알콜인 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 당 알콜이 알디톨, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합물로 구성된 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 저온 보호제가 폴리에틸렌 글리콜인 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 저온 보호제가 당 산인 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 산이 알돈산, 우론산, 알다르산, 및 이들의 조합물로 구성된 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서, 저온 보호제가 카보하이드레이트인 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 카보하이드레이트가 알도스, 케토스, 아미노 당, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 및 이들의 조합물로 구성된 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 당이 수크로스, 글루코스, 락토스, 트레할로스, 및 이들의 조합물로 구성된 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 저온 보호제가 수크로스인 조성물.
  18. 제 1 항에 있어서, 주로 무정형 물리적 구조를 지닌 조성물.
  19. 제 6 항에 있어서, 플라스미드 DNA가 37℃에서 최소 20일간에 걸쳐 90% 이상의 초나선을 보유하는 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 냉동 건조 조성물을 포함하고, 물에서 복원되며 약 6.2 내지 약 7.8의 pH를 특징으로 하는 액상 폴리뉴클레오티드 조성물.
  21. (a) 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 냉동 건조 조성물; 및
    (b) 제 20 항의 액상 조성물로 구성된 그룹 중에서 선택된 활성 성분과
    임의의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 부형제 또는 담체가 경구, 비경구, 비내, 및 폐내로 구성된 그룹 중에서 선택된 투여 경로에 적당한 조성물.
  23. 제 21 항의 조성물 유효량을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유 동물의 치료방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 경구, 비경구, 비내, 및 폐내로 구성된 그룹 중에서 선택된 투여 경로에 의해 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. (a) 약 6.2 내지 약 7.8의 pH를 가지고, 폴리뉴클레오티드 용액의 총 용적을 기준으로 약 0.1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 폴리뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드 용액의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 10 중량%의 저온 보호제를 포함하는 폴리뉴클레오티드 수용액을 형성하는 단계;
    (b) 폴리뉴클레오티드 용액을 동결시까지 약 -30℃ 내지 약 -70℃의 온도로 냉각하는 단계;
    (c) 진공을 가해 압력을 약 25 mTorr 내지 약 250 mTorr로 감소시키는 단계;
    (d) 초기에 폴리뉴클레오티드 용액을 약 5시간 내지 약 40시간에 걸쳐 약 -40℃ 내지 약 20℃의 온도로 단계적으로 가열하는 단계;
    (e) 가열 단계(d) 후 폴리뉴클레오티드 용액을 약 -35℃ 내지 약 10℃의 온도 및 약 25 mTorr 내지 약 250 mTorr의 압력에서 약 1시간 내지 약 10시간 동안 유지하는 단계;
    (f) 유지 단계(e) 후 폴리뉴클레오티드 용액을 약 1 시간 내지 약 20시간에 걸쳐 약 25 mTorr 내지 약 150 mTorr의 압력에서 약 20℃ 내지 약 35℃의 온도로 단계적으로 가열하는 단계; 및
    (g) 회수된 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량% 함량의 물을 함유한 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물을 회수하는 단계
    를 포함하는 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 조성물의 제조방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 단계 (a)의 폴리뉴클레오티드 용액이 완충액을 추가로 포함하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 단계(f) 후, 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도 및 25 mTorr 내지 약 150 mTorr의 압력에서 약 1시간 내지 약 10시간 동안 폴리뉴클레오티드 용액을 유지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 단계(d)가 초기에 약 5시간 내지 약 20시간에 걸쳐 약 -10℃ 내지 약 20℃의 온도로 폴리뉴클레오티드 용액을 단계적으로 가열하는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 유지 단계(e) 동안, 폴리뉴클레오티드 용액을 약 -10℃ 내지 약 10℃의 온도에서 약 2 내지 약 10시간 동안 유지시키는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 유지 단계(e) 동안, 폴리뉴클레오티드 용액을 약 -5℃ 내지 약 5℃의 온도에서 약 5시간 내지 약 7시간 동안 유지시키는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 유지 단계(e) 동안, 폴리뉴클레오티드 용액을 약 40 mTorr 내지 약 150 mTorr의 압력에서 유지시키는 방법.
  32. 제 25 항에 있어서, 냉각 단계(b) 동안, 폴리뉴클레오티드 용액을 약 1시간 내지 약 5시간에 걸쳐 약 -30℃ 내지 약 -70℃의 온도로 단계적으로 냉각시키는 방법.
  33. 제 25 항에 있어서, 단계(c)에서, 압력을 약 50 내지 약 100 mTorr로 감소시키는 방법.
  34. 제 25 항에 있어서, 단계(c)와 (d) 사이에, 폴리뉴클레오티드 용액을 단계(b)의 온도 및 단계(c)의 압력에서 약 0.5 내지 약 5 시간 동안 유지시키는 방법.
  35. 제 25 항에 있어서, 가열 단계(d) 동안, 폴리뉴클레오티드 용액을 약 8시간 내지 약 20시간에 걸쳐 약 -5℃ 내지 약 5℃의 온도로 단계적으로 가열하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 가열 단계(d) 동안, 압력이 약 40 mTorr 내지 약 150 mTorr인 방법.
  37. 제 25 항에 있어서, 단계(c)에서, 약 1시간 내지 약 2시간에 걸쳐 압력이 약 300 mTorr 내지 약 200 mTorr로 빠르게 감소된 후 압력이 약 150 mTorr 내지 약 40 mTorr로 단계적으로 감소되도록 진공을 가하는 방법.
  38. 제 25 항에 있어서, 가열 단계(f) 동안, 폴리뉴클레오티드 용액을 약 2시간 내지 약 3시간에 걸쳐 약 23℃ 내지 약 27℃의 온도로 가열하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 가열 단계(f) 동안, 압력이 약 40 mTorr 내지 약 110 mTorr인 방법.
  40. 제 25 항에 있어서, 가열 단계(d)가 약 7시간 내지 약 11시간에 걸치고; 유지 단계(e)가 약 1시간이며, 가열 단계(f)가 약 2시간에 걸치는 방법.
  41. 제 25 항에 있어서, 저온 보호제가 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 솔비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 조합물로 구성된 그룹 중에서 선택되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 저온 보호제가 수크로스 및 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  43. 제 25 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 냉동 건조 폴리뉴클레오티드 산물.
  44. 제 43 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 산물이 약 37℃에서 최소 10일에 걸쳐 적어도 90%의 초나선을 보유하는 산물.
  45. 제 43 항의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 수용액에서 복원되며 약 6.2 내지 약 7.8의 pH를 특징으로 하는 액상 폴리뉴클레오티드 조성물.
  46. (a) 제 43 항의 냉동 건조 조성물; 및
    (b) 제 45 항의 액상 조성물로 구성된 그룹 중에서 선택된 활성 성분 및
    임의의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서, 부형제 또는 담체가 경구, 비경구, 비내, 및 폐내로 구성된 그룹 중에서 선택되는 투여 경로에 적당한 조성물.
  48. 제 46 항의 조성물 유효량을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유 동물의 치료 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 경구, 비경구, 비내, 및 폐내로 구성된 그룹 중에서 선택되는 투여 경로에 의해 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. 폴리뉴클레오티드 조성물을 동결시키고, 동결된 조성물에 진공을 가하며, 1차 건조 단계를 수행하고, 건조 단계의 산물에 압력을 증가시키며, 2차 건조 단계를 수행한 다음, 냉동 건조 산물을 회수하는 단계를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물의 개선된 냉동 건조 방법에 있어서,
    저온 보호제를 함유한 폴리뉴클레오티드 용액(용액을 동결시까지 냉각하고 진공을 가함)에, 용액을 약 -20℃ 내지 약 20℃의 온도에서 약 5시간 내지 약 30시간에 걸쳐 단계적으로 가열하고 용액의 역용해를 피하는 1차 건조 사이클을 적용하는 단계를 포함하고,
    1차 건조 사이클이 완전한 냉동 건조 공정에 필요한 시간을 줄이고 약 37℃ 에서 최소 10일에 걸쳐 적어도 90%의 초나선을 보유한 실질적으로 무정형 물리적 구조의 냉동 건조 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하는 개선된 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 시간이 약 5 내지 약 20시간인 방법.
  52. 제 50 항에 있어서, 시간이 약 5 내지 약 10시간인 방법.
  53. 제 50 항에 있어서, 온도가 약 -10℃ 내지 약 20℃인 방법.
  54. 제 50 항에 있어서, 온도가 약 0℃인 방법.
  55. 제 50 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 용액을 약 2시간 내지 약 3시간에 걸쳐 약 23℃ 내지 약 27℃의 온도로 가열하는 2차 건조 단계를 추가로 포함하는 방법.
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