KR100969325B1 - 홍조류로부터 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법 및 이를 이용한 비독성 자외선 차단제 - Google Patents

홍조류로부터 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법 및 이를 이용한 비독성 자외선 차단제 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 (a) 김 또는 진두발로부터 선택되는 1종 이상의 홍조류를 준비하는 단계; (b) 상기 준비된 홍조류에 탄소수 1 내지 5인 알코올 대 물의 부피비가 1:9 내지 9:1인 혼합 용매를 첨가하고 30~60℃의 온도에서 유지하여 유효성분을 추출하는 단계; 및 (c) 상기 유효성분 및 잔여 홍조류 고형물을 포함하는 혼합 용매를 여과하여 상등액과 잔여 홍조류 고형물로 분리하는 단계; 를 포함한다.
본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 추출 원료로서 김 또는 진두발을 사용하기 때문에 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)을 포함하는 자외선 차단용 추출물의 수율이 다른 녹조류, 갈조류 및 홍조류 식물로부터 추출할 때보다 상대적으로 현저하게 높은 장점을 가진다. 또한, 김 또는 진두발로부터 추출된 자외선 차단용 추출물은 광독성 및 세포독성이 매우 낮기 때문에 피부에 무거운 느낌 내지 잔여물에 의한 이물감을 주지 않으면서, 동시에 자극성 피부염, 접촉 피부염, 광알레르기성 또는 광독성 피부염 등의 피부 자극이나 알레르기 반응, 및 독성 등과 같이 부작용이 없는 자외선 차단제의 주요 성분으로 이용될 수 있다.

Description

홍조류로부터 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법 및 이를 이용한 비독성 자외선 차단제{Manufacturing method of non-toxic extracts with UV ray protective function from red algae and non-toxic sunscreen utilizing the same}
본 발명은 홍조류로부터 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 이용한 비독성 자외선 차단제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍조류 중 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA) 함량이 상대적으로 높은 김 또는 진두발로부터 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법 및 상기 비독성 자외선 차단용 추출물의 자외선 흡수 특성을 이용한 비독성 자외선 차단제에 관한 것이다.
태양 자외선은 홍반으로 대표되는 급성 피부반응을 일으킬 뿐 아니라 장기간 노출 시에 피부노화와 피부암을 유발하게 된다. 지표상에 도달되는 태양광선에 포함된 자외선(Ultraviolet Ray, UV ray)은 파장에 따라 크게 두 가지 영역으로 구분이 되는데 장파인 UV-A(320-400 nm)와 중파인 UV-B(280-320 nm)로 나뉜다.
이 중 상대적으로 에너지가 큰 UV-B가 피부층에 흡수되면 급성 피부 탈착, DNA 변이 또는 암을 유발하는 것으로 알려져 있다.
한편, UV-A는 에너지가 UV-B 보다는 작지만, UV-B보다 피부 더 깊은 곳까지 침투하여 조기 피부노화현상을 발생하는 것으로 알려져 있으며, 활성산소를 발생하게 하거나 IL-1β와 TNF-α와 같은 염증 증상을 유발하여 유전자의 발현을 변화시키게 되는데 UV-A가 NF-κB와 AP-1과 같은 전사요인을 활성화한다는 보고가 있다. UV-A에 의한 전사요인의 활성화에 의해 matrix metalloproteinases(MMP's)라고 불리우는 일련의 콜라겐 분해효소와 엘라스틴 분해효소들이 유도되는데 이에 따른 콜라겐 양의 감소와 섬유소의 분절현상은 궁극적으로 전형적인 광노화현상을 유발하게 된다. 또한, UV-A는 피부의 색소체인 urocanic acid나 DNA 등에 의하여 잘 흡수되어 결과적으로 활성산소를 발생하여 단백질과 지질 등의 중요한 분자들과 반응함으로써 중요 생명분자들을 파괴하거나 기능을 상실하게 만든다.
UV-B는 계절, 하루 중 시간, 구름의 유무, 위도 등에 따라 그 양이 다른 반면, UV-A는 일년내내 비교적 일정한 양이 지표상에 도달하기 때문에 지속적인 피부관리를 위해서는 UV-A로부터의 피부 보호가 보다 중요하다. 자외선으로부터 피부를 보호하기 위해 사용되는 자외선 차단제(Sunscreen)는 크게 무기 입자 형태와 유기 화합물 형태로 구분된다. 무기 입자 형태의 자외선 차단제는 극도로 미세한 미네랄 입자인 산화아연, 이산화 티타늄, 이산화 철 같은 종류의 무기 입자를 포함하며, 상기 무기 입자는 피부표면에 점착되어 태양광선(자외선)을 반사하는 장벽역할을 한다. 무기 입자 형태의 자외선 차단제는 피부를 서늘하게 유지시켜주고, 자연스런 태양광선(자외선) 방어를 하며, 피부에 흡수되지 않으므로 피부 문제를 일으키지 않는다는 장점을 가지는 반면 피부에 무거운 느낌을 주고 피부 상에 잔여물을 남긴다는 문제가 있다. 한편, 유기 화합물 형태의 자외선 차단제는 파르졸(Dimethico-diethylbenzalmalonate, Parsol), 벤조페논(Sodium Dihydroxy Dimethoxy Disulfobenzophenone), 파바(p-Aminobenzoic acid, PABA) 같은 자외선을 매우 잘 흡수하는 활성적인 합성화합물을 포함하고 있는 것으로서 UV-A가 피부 깊숙이 침투하여 콜라겐 섬유나 다른 조직에서 노화현상을 일으키는 것과 UV-B에 의하여 선번(Sunburn)이나 피부암 등이 유발되는 것을 막아줄 수 있다는 장점이 있는 반면, 피부염이나 알러지를 일으키고, 쉽게 분해되거나 활성산소를 생산할 수 있다는 단점을 내포하고 있으며, 최근에는 상기 유기 화합물이 내분비계 장애를 비롯한 부작용을 일으킬 수 있다고 보고되고 있다.
따라서, 피부에 무거운 느낌 내지 잔여물에 의한 이물감을 주지 않으면서, 동시에 자극성 피부염, 접촉 피부염, 광알레르기성 또는 광독성 피부염 등의 피부 자극이나 알레르기 반응, 및 독성 등과 같이 부작용이 없는 자외선 차단제용 천연 소재의 개발이 절실히 요구된다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 광독성이나 세포독성 등이 없고 자외선 흡수능이 뛰어나서 자외선 차단제의 주요 성분으로 이용될 수 있는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법을 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 비독성 자외선 차단용 추출물을 이용한 비독성 자외선 차단제를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자는 무수한 실험을 통해 홍조류 중 김과 진두발로부터 UV-A 차단물질로 알려진 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)을 포함하는 자외선 차단용 추출물을 추출할 때 다른 녹조류, 갈조류 및 홍조류 식물로부터 추출할 때보다 더 높은 수율을 가지는 점 및 상기 김과 진두발로부터 추출된 자외선 차단용 추출물이 광독성 및 세포독성이 매우 낮다는 점을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 김 또는 진두발로부터 선택되는 1종 이상의 홍조류를 준비하는 단계; (b) 상기 준비된 홍조류에 탄소수 1 내지 5인 알코올 대 물의 부피비가 1:9 내지 9:1인 혼합 용매를 첨가하고 30~60℃의 온도에서 유지하여 유효성분을 추출하는 단계; 및 (c) 상기 유효성분 및 잔여 홍조류 고형물을 포함하는 혼합 용매를 여과하여 상등액과 잔여 홍조류 고형물로 분리하는 단계; 를 포함하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 바람직하게는 (d) 상기 분리된 상등액을 멤브레인 필터에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 바람직하게는 (e) 상기 분리된 상등액 또는 불순물이 제거된 상등액을 농축하고 건조시켜 고형화된 조추출물을 수득하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 상기 고형화된 조출물이 멤브레인 필터에 의한 불순물 제거 단계를 거치지 않은 경우 바람직하게는 (f) 상기 고형화된 조추출물을 물에 용해시키고 멤브레인 필터에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 바람직하게는 (g) 상기 (f) 단계에 의해 불순물이 제거된 조추출물 수용액을 물과 탄소수 1 내지 5인 알코올의 농도 구배로 전개시키고 280~400 ㎚의 자외선 파장을 흡수하는 조추출 분획물을 수득하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 이때 자외선 파장의 흡수 여부를 측정하기 위하여 UV 디텍터가 사용되고 보충적으로 RI(refractive index)가 더 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 바람직하게는 (h) 상기 조추출 분획물을 소수성 상호 칼럼에 통과시켜 1차 정제 추출물을 수득하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 바람직하게는 (i) 상기 1차 정제 추출물을 크기 배제 칼럼(Size Exclusion Column)에 통과시켜 2차 정제 추출물을 수득하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 바람직하게는 (j) 상기 2차 정제 추출물을 농축하고 건조시켜 고형화된 정제 추출물을 수득하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 제조방법에 의해 제조된 비독성 자외선 차단용 추출물을 포함하는 비독성 자외선 차단제를 제공한다. 이때 자외선 차단용 추출물은 유효성분으로 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)을 함유하며, 함유된 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)의 종류로는 팔리틴(Palythine), 아스테리나-330(Asterina-330), 및 시노린(Shinorine)이 있으며, 추가적으로 포르피라-334(Porphyra-334)를 더 포함한다. 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)은 시클로헥사논(cyclohexanone) 또는 시클로헥세니민(cyclohexenimine) 색소체 구조를 가지고 있어서 UV-A(320~400㎚) 영역의 자외선을 잘 흡수하고 흡광 계수는 인조 자외선 차단제(썬스크린)의 흡광 계수와 유사하다.
본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 추출 원료로서 김 또는 진두발을 사용하기 때문에 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)을 포함하는 자외선 차단용 추출물의 수율이 다른 녹조류, 갈조류 및 홍조류 식물로부터 추출할 때보다 상대적으로 현저하게 높은 장점을 가진다. 또한, 김 또는 진두발로부터 추출된 자외선 차단용 추출물은 광독성 및 세포독성이 매우 낮기 때문에 피부에 무거운 느낌 내지 잔여물에 의한 이물감을 주지 않으면서, 동시에 자극성 피부염, 접촉 피부염, 광알레르기성 또는 광독성 피부염 등의 피부 자극이나 알레르기 반응, 및 독성 등과 같이 부작용이 없는 자외선 차단제의 주요 성분으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법의 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 조추출물(PE)과 2차 정제 추출물(P7)의 광독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 조추출물(PE)의 농도가 500㎍/㎖ 일 때의 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 2차 정제 추출물(P7)의 농도가 250㎍/㎖ 일 때의 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이다.
본 발명의 일 측면은 광독성이나 세포독성 등이 없고 자외선 흡수능이 뛰어나서 자외선 차단제의 주요 성분으로 이용될 수 있는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이하, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법을 도 1을 통해 단계별로 설명한다. 다만, 도 1은 바람직한 일 실시예에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법의 공정을 나타낸 것으로서, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.
추출 원료를 준비하는 단계( S1 )
추출 원료로는 김(Porphyra) 또는 진두발(Chondrus)로부터 선택되는 1종 이상을 사용한다. 김 또는 진두발은 홍조류(Rhodophyta) 식물의 하나로서 본 발명자의 연구에 의하면 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)을 포함하는 자외선 차단용 추출물의 수율이 다른 녹조류, 갈조류 및 홍조류 식물로부터 추출할 때보다 상대적으로 현저하게 높은 장점을 가진다.
김 또는 진두발은 바람직하게는 건조된 것을 사용하며, 보다 바람직하게는 조쇄(粗碎)된 것을 특징으로 한다. 조쇄된 김 또는 진두발은 표면적이 매우 커서 추출 용매에 의한 추출 속독 및 추출 수율을 향상시킨다. 김 또는 진두발은 유발(乳鉢, 막자사발), 또는 분쇄 장치 등을 통해 조쇄될 수 있다.
추출 용매를 이용하여 유효성분을 추출하는 단계( S2 )
조쇄된 김 또는 진두발과 같은 홍조류에 추출 용매를 첨가하고 소정의 온도로 유지하여 유효성분을 추출한다. 이때 추출 용매로는 물, 알코올, 또는 물과 알코올의 혼합 용매가 사용되는데 바람직하게는 알코올 대 물의 부피비가 1:9 내지 9:1인 혼합 용매이고 보다 바람직하게는 알코올 대 물의 부피비가 4:1인 것을 특징으로 한다. 알코올 대 물의 부피비가 1:9보다 낮은 경우 알코올의 함량이 너무 작아서 추출 속도 및 추출 수율이 떨어지고, 알코올 대 물의 부피비가 9:1보다 큰 경우 알코올 함량의 증가에 따른 추출 속도 및 추출 수율의 증가율이 크지 않아서 경제성이 떨어지며, 알코올 대 물의 부피비가 4:1인 경우 추출 속도, 추출 수율, 및 경제성이 최적이다.
알코올은 탄소수 1 내지 5인 것을 사용하는데, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용하고 보다 바람직하게는 메탄올은 사용한다. 메탄올을 사용하는 경우 추출 속도 및 추출 수율이 다른 알코올보다 높다.
추출 온도는 그 범위가 크게 제한되지 않으나, 바람직하게는 약 30~60℃이다. 추출 온도가 30℃ 미만인 경우 추출 속도 및 추출 수율이 너무 낮고 추출 온도가 60℃를 초과하는 경우 알코올의 일부가 기화되어 추출에 이용되지 못한다.
여과에 의해 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리하는 단계( S3 )
추출 용매에 의해 유효 성분의 추출이 완료되면, 유효성분 및 잔여 홍조류 고형물을 포함하는 혼합 용매를 여과하여 상등액과 잔여 홍조류 고형물로 분리한다. 여과에 사용되는 여과재로는 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리할 효과적으로 분리할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 여과지(Filter paper), 또는 여과포 등이 있으며 기공 크기는 약 0.1 ㎛ ~ 0.005 ㎜의 범위를 가진다.
한편, 1회 추출 후 여과에 의해 분리된 잔여 홍조류 고형물에는 추출되지 않은 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)과 같은 유효 성분이 존재하는데, 최종 추출 수율을 높이기 위해 상기의 잔여 홍조류 고형물을 혼합 용매에 첨가하고 추출 후 여과에 의해 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리하는 과정을 1회 내지 3회 더 반복할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 도 1에는 도시되지 않았으나, 분리된 상등액을 멤브레인 필터(Membrane filter)에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계를 선택적으로 더 포함할 수 있다. 멤브레인 필터는 나노 사이즈의 기공 크기(약 100 ㎚ 미만)를 가지는 막으로서 여과된 상등액에 포함된 불순물이나 오염 물질 등을 상등액으로부터 제거하는 역할을 한다.
상등액으로부터 고형화된 조추출물을 수득하는 단계( S4 )
여과 분리 또는 멤브레인 필터 처리된 상등액을 농축 및 건조 과정에 의해 고형화함으로서 조추출물을 수득한다.
상등액의 농축은 바람직하게는 감압 농축인 것을 특징으로 하고, 건조는 동결 건조인 것을 특징으로 한다. 감압 농축에 의할 경우 낮은 온도에서 추출 용매를 쉽게 증발시킬 수 있고, 동결 건조에 의할 때 낮은 온도에서 추출물이 고형화되므로 추출물의 유효 성분이 열에 의해 변성되는 것을 방지할 수 있다.
고형화된 조추출물 수용액을 제조하고 멤브레인 필터 처리하는 단계( S5 )
고형화된 조추출물을 물에 용해시켜 조추출물 수용액을 제조한다. 한편, 조출출물 수용액의 조추출물이 제조 과정에서 멤브레인 필터 처리를 거치지 않은 경우 조추출물 수용액을 멤브레인 필터에 통과시켜 불순물 등을 제거한다. 불순물이 제거된 조추출물 수용액은 후술하는 분획 및 정제 단계를 거친다. 또한, 도 1에는 도시되지 않았으나, 여과에 의해 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리하는 단계(S3)에서 여과 및 멤브레인 필터 처리를 거친 상등액을 후술하는 분획 및 정제 처리할 수도 있다.
조추출물 수용액을 분획하는 단계( S6 )
불순물이 제거된 조추출물 수용액 또는 여과에 의해 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리하는 단계(S3)에서 여과 및 멤브레인 필터 처리를 거친 상등액을 물-알코올 농도 구배로 전개시키고, 전개된 조추출물 수용액 중 280~400 ㎚의 자외선 파장을 흡수하는 조추출 분획물을 수득한다. 이때 알코올로는 탄소수 1 내지 5인 알코올을 사용하며, 바람직하게는 메탄올을 사용한다. 물-알코올 농도 구배의 전개는 구체적인 예로 물, 50 부피 %의 알코올 수용액을 순차적으로 전개하는 방법이 있다. 한편, 전개된 조출추출 수용액 또는 상등액 중 80~400 ㎚의 자외선 파장을 흡수하는 분획 부분을 측정하기 위하여 UV 디텍터가 사용되며, 보충적으로 RI(refractive index)가 더 사용될 수 있다.
조추출 분획물을 소수성 상호 칼럼으로 1차 정제하는 단계( S7 )
수집된 조추출 분획물을 소수성 상호 칼럼에 통과시켜 1차 정제 추출물을 수득한다. 이때 사용되는 소수성 상호 칼럼으로는 그 종류가 제한되지 않으며, 구체적으로 아가로오스(agarose) 겔, 실리카 겔, 또는 유기 중합체 수지로 이루어진 베이스 입자 표면에 소수성 알킬기, 소수성 아릴기, 소수성 시아노기, 및 소수성 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 소수성 관능기가 결합된 것으로 구성된다. 소수성 알킬기로는 부틸기, 옥틸기, 옥타데실(Octadecyl)기 등이 있으며, 소수성 아릴기로는 페닐에틸기가 있으며, 소수성 시아노기로는 시아노프로필기가 있으며, 소수성 아민기로는 아미노프로필기가 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 소수성 상호 칼럼은 바람직하게는 실리카 겔 표면에 소수성 알킬기, 소수성 아릴기, 소수성 시아노기, 및 소수성 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 소수성 관능기가 결합된 것을 특징으로 하며, 이러한 소수성 상호 칼럼으로는 상업적으로 일본 시세이도사의 CAPCELL PAK C8, CAPCEll PAk C18 등이 있다. 이중 CAPCELL PAK C18은 캘슐 타입의 실리카 겔 표면에 실리콘(Silicone) 고분자를 증착하여 단층을 형성하고 단층 표면에 옥타데실기를 결합시킨 것이다. 특히 본 발명에서 소수성 상호 칼럼으로 CAPCELL PAK C18 UG120을 사용하는 경우 이동상으로는 아세트산 수용액을 사용한다.
1차 정제 추출물을 크기 배제 칼럼으로 2차 정제하는 단계( S8 )
1차 정제 추출물을 크기 배제 칼럼(Size Exclusion Column)에 통과시켜 2차 정제 추출물을 수득한다. 이때 사용되는 크기 배제 칼럼은 수용성 시스템에 사용되는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 시세이도사의 실리카 베이스 수용계 크기 배제 칼럼(KW-800 시리즈, KW-400 시리즈), 폴리하이드록시메타크릴레이트 베이스의 크기 배제 칼럼(OHpak 시리즈) 등이 있다.
2차 정제 추출물로부터 고형화된 정제 추출물을 수득하는 단계( S9 )
2차 정제 추출물을 농축하고 건조시켜 고형화된 정제 추출물을 수득한다. 2차 정제 추출물의 농축은 바람직하게는 감압 농축인 것을 특징으로 하고, 건조는 동결 건조인 것을 특징으로 한다. 감압 농축에 의할 경우 낮은 온도에서 물 등의 용매를 쉽게 증발시킬 수 있고, 동결 건조에 의할 때 낮은 온도에서 정제 추출물이 고형화되므로 정제 추출물의 유효 성분이 열에 의해 변성되는 것을 방지할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 비독성 자외선 차단용 추출물을 이용한 비독성 자외선 차단제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물은 유효성분으로 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)을 함유하고, 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)으로 팔리틴(Palythine), 아스테리나-330(Asterina-330), 및 시노린(Shinorine)을 포함하며, 포르피라-334(Porphyra-334)를 선택적으로 더 포함 있어서 UV-A 흡수능이 뛰어나다. 또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물(특히 2차 정제 추출물)은 광독성이나 세포독성이 매우 낮아 비독성 자외선 차단제의 주요 성분으로 이용될 수 있다.
자외선 차단제의 구체적인 조성을 살펴보면, 활성 성분으로 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물 약 0.05~10 중량%, 유상 매질 약 5~40 중량%, 유화제 약 1~10 중량%, 미량의 보조제 및 잔량으로 물과 같은 수상 매질을 포함한다.
유상 매질로는 파라핀이나 미네랄 오일과 같은 탄화수소 오일, 파라핀 왁스, 천연 오일, 실리콘 오일, 이소프로필 팔미테이트와 같은 지방산 에스터, 스테아릴 알코올과 같은 지방산 알코올 등이 있으며, 유상 매질은 유중수적(water in oil) 또는 수중유적(oil in water) 상태의 유상 성분을 구성한다.
유화제(Emulsifier)로는 솔비탄 에스터(Sorbitan eser, 상표명 SPAN), 에톡실화 솔비탄 에스터(Ethoxylated 으로 Sorbitan eser, 상표명 Tween), 실리콘 폴리올, 포타지움 스테아레이트, 에톡실화 지방산 에스터 등이 있다.
보조제로는 자외선 차단제에 통상적으로 포함되는 에몰리언트(emolient), 보습제, 항산화제, 유화 안정제, 증점제, 방부제, 방향제, 착색제 등이 있다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 보다 명확하게 설명한다. 다만, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 보호범위가 제한되는 것은 아니다.
1. 추출 원료의 선별
국내 해수에 존재하는 녹조류(Green algae, CHLOROPHYTA), 갈조류(Brown algae, PHAEOPHYTA), 홍조류(Red algae, RHODOPHYTA) 샘플을 취하고, 여지로 수분을 제거한 후 유발에서 조쇄하여 각 샘플 당 100g의 추출 원료를 준비하였다, 추출 원료 100g에 80 부피%의 메탄올 농도를 가진 수용액(메탄올 부피 80 및 물 부피 20으로 구성된 혼합 용매)을 10 ㎖ 첨가하고 약 45℃에서 믹서로 5분간 교반하면서 유효 성분을 추출한 후 여과지로 여과하고 약 280~400㎚의 파장을 가진 자외선으로 스캐닝하여 추출액의 자외선 흡수능을 검색하였다.
표 1은 녹조류 샘플에서 추출한 추출액의 자외선 흡수능 결과를 나타낸 것이고, 표 2는 갈조류 샘플에서 추출한 추출액의 자외선 흡수능 결과를 나타낸 것이며, 표 3은 홍조류 샘플에서 추출한 추출액의 자외선 흡수능 결과를 나타낸 것이다. 표 1에 나타나는 바와 같이 녹조류에서는 280~400㎚의 파장을 가진 자외선의 흡수 정점이 발견되지 않았고, 표 2에 나타나는 바와 같이 갈조류에서는 16종 중 5종에서 280~400㎚의 파장을 가진 자외선의 흡수 정점이 발견되었으나, 홍조류에서 발견된 흡수 정점에 비해 그 높이가 낮아 상대적으로 낮은 유효 성분 함량을 보였다. 홍조류의 경우 표 3에서 나타나는 바와 같이 27종 중 24종에서 280~400㎚의 파장을 가진 자외선의 흡수 정점이 발견되었으며, 참곱슬이(Plocamium telfairiae)를 제외한 26종에서 흡수 정점의 높이가 갈조류에서 나타난 흡수 정점보다 커서 상대적으로 높은 유효 성분 함량을 보였다.
녹조류 종류 흡수 정점을 보이는 자외선 파장(㎚)
Ulva lactuca L. 검출 되지 않음
Ulva pertusa Kjellman 검출 되지 않음
Ulva conglobata Kjellman 검출 되지 않음
갈조류 종류 흡수 정점을 보이는 자외선 파장(㎚)
Agarum cribrosom Bory 검출 되지 않음
Corda filum Lamouroux 검출 되지 않음
Eklonia stolonifera 검출 되지 않음
Kjellmaniela crassifolia Miyabe 검출 되지 않음
Hizikia fusiforme 검출 되지 않음
Laminaria japonica 검출 되지 않음
Sargassum confusum Agardh 335
Sargassum thunbergii O. Kuntze 검출 되지 않음
Sargassum horneri C. Agardh 검출 되지 않음
Sargassum fulvellum Agardh 검출 되지 않음
Sargassum tortile C. Agardh 검출 되지 않음
Spathoglossum pacificum Yendo 322
Scytosiphon lomentaria J. Agardh 검출 되지 않음
Pelvetia wrightii Yendo 332
Pardina aborescens Holmes 305
Undaria pinnatifida Suringar 337
홍조류 종류 흡수 정점을 보이는 자외선 파장(㎚)
Acrosorium polyneurum Okamura 검출 되지 않음
Carpopeltis affinis Okamura 328, 334
Chondria crassicaulis Harvey 327, 329
Chondrus ocellatus Holmes 326
Corallina officinalis Linne 326
Carpopeltis affinis Okamura 305
Gelidium amansii Lamouroux 329, 333
Gracilaria textorii J.Agardh 검출 되지 않음
Grateloupia filicina J. Agardh 330
Grateloupia filicina C. Agardh 330
Grateloupia turuturu Yamada 330
Gymnogongrus flabelliformis Harvey 334
Gigartina tenella Harvey 326
Gloiopeltis complanata Yamada 320
Gloiopeltis furcata J. Agardh 329, 332
Grateloupia prolongata J. Agardh 검출 되지 않음
Hypnea saidana Holmes 332
Halymenia acuminata J. Agardh 329
Hypnea charoides Lamouroux 320
Lomentaria catenata Harvey 330
Porphyra suborbiculata Kjellman 334
Porphyra yezoensis 337
Pachymeniopsis elliptica Yamada 328, 330, 334
Phacelocarpus japonicus Okamura 300
Pterocladia tenuis Okamura 334
Plocamium telfairiae Harvey 322(trace)
Schizymenia dubyi J. Agardh 334
조사된 대부분의 홍조류 추출물에서 자외선 흡수 물질의 존재 가능성이 파악됨에 따라 홍조류 추출물을 대상으로 4가지 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)인 팔리틴(Palythine), 아스테리나-330(Asterina-330), 시노린(Shinorine), 포르피라-334(Porphyra-334)를 표준물질로 사용하여 홍조류 추출물 내의 미코스포린-유사 아미노산 성분의 함량을 분석하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 분석은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 수행되었다.
홍조류 종류 미코스포린-유사 아미노산 추출 수율(%, 추출 원료 건조 중량 기준)
팔리틴 아스테리나-330 시노린 포르피라-334 4가지 미코스포린-유사 아미노산 전체
Porphyra yezoensis 0.225540 0.131668 0.228878 1.099902 1.685989
Chondrus ocellatus 1.058505 0.448038 0.173267 - 1.276576
Grateloupia filicina 0.43331 0.000412 0.315449 - 0.749172
Gloiopeltis furcata 0.342213 0.009644 0.030747 0.261463 0.644067
Pachymeniopsis elliptica 0.411870 0.006765 0.159964 - 0.578598
Carpopeltis affinis 0.29995 0.005995 0.090416 - 0.396367
Grateloupia turuturu 0.190443 0.002925 0.115745 - 0.309112
Gymnogongrus flabelliformis 0.000482 0.000161 0.297636 0.000097 0.298375
Gelidium amansii 0.024122 0.120514 0.123046 - 0.267681
표 4에서 나타나는 바와 같이 4가지 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA) 표준물질 전체 함량을 기준으로 한 수율은 김(Porphyra) 추출물에서 약 1.7%, 진두발(Chondrus) 추출물에서 약 1.3%로 다른 홍조류 추출물(약 0.3~0.7%)보다 상대적으로 높게 나타났다. 또한, 김 추출물은 4가지 표준 물질을 모두 포함하였으며, 포르피린-334의 함량이 매우 높은 것으로 나타났다. 또한, 진두발 추출물은 포르피린-334를 제외한 3가지 표준 물질을 포함하였으며, 팔리틴의 함량이 매우 높은 것으로 나타났다. 상기에서 검토한 결과를 바탕으로 자외선 차단용 추출물의 원료 후보로서 김과 진두발을 선택하였다.
2. 김으로부터 자외선 차단용 추출물의 제조
(1) 조추출물(PE)의 제조
건조 김(Porphyra yezoensis) 100g을 바이얼(vial)에 담고 여기에 80 부피%의 메탄올 수용액(메탄올 부피 80 및 물 부피 20으로 구성된 혼합 용매) 20㎖를 첨가한 후 45℃로 유지된 항온 수조에서 3시간동안 유지시켜 유효 성분을 추출하였다. 이후 바이얼 내의 내용물을 여과지(whatman No.2)로 여과하여 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리시켰다. 분리된 잔여 홍조류 고형물로부터 상기의 추출 및 여과에 의해 2회 더 추출하였다. 분리된 상등액을 모두 모은 후 이를 진공 건조시켜 농축하고를 반복하여 2회 추출하였다.을 과 같은 방식으로 포함 유지하였다. 이후 용액을 여과하고(whatman No.2), 잔여고형물은 같은 방식으로 두 차례 추출을 시도하였다. 이렇게 해서 얻은 추출액을 모두 모아서 진공 증발기로 농축하고 건조시켜서 고형화된 조추출물(Pophyra extract, PE)를 수득하였다.
(2) 조추출 분획물의 제조
고형화된 조추출물 10㎖를 증류수 90㎖에 첨가하고 용해시켜 조추출물 수용액을 제조한 후 이를 기공 크기가 0.45㎚인 멤브레인 필터(Gelman, USA)에 여과시켜 불순물을 제거하였다. 불순물이 제거된 조추출물 수용액을 Prep LC system[dual pump(Koto, Japan), auto injector, UV/RI detector, fraction collector로 구성됨 상에서 물-메탄올 농도 구배(처음엔 물, 다음엔 50 부피%의 메탄올 수용액)로 전개(전개속도는 5㎖/min)시킨 후 UV 디텍터 및 RI 디텍터를 사용하여 280~400 ㎚의 자외선 파장을 흡수하는 조추출 분획물을 수득하였다.
(3) 정제 추출물(P7)의 제조
수득한 조추출 분획물을 UG120 guard column(Shiseido, Japan)으로 보호된 소수성 상호 칼럼(Capcellpak C18 UG120 semi-prepatative column; Shiseido, Japan)에 0.2 부피%의 아세트산 수용액과 함께 10㎖/min의 속도로 전개하여 1차 정제하였다. 1차 정제 추출물을 크기 배제 칼럼(Ohpak 2002; Shiseido, Japan)에 물과 함께 2.5㎖/min의 속도로 정개하여 2차 정제 하였다. 2차 정제 추출물은 밝은 노란빛을 가진 액체이었고, 이를 진공 증발기로 농축하고 동결 건조시켜서 고형화된 정제 추출물(P7)을 수득하였다.
3. 김으로부터 추출된 자외선 차단용 추출물의 독성 실험
(1) 광독성(phototoxicity)
김으로부터 제조된 추출물인 PE와 P7에 대해 인체 광독성 결과와 양호한 일치를 보인다고 알려진 OECD의 화학물질의 평가법인 3T3 NRU 광독성 시험법(The 3T3 neutral red uptake photoxicity test,3T3 NRU PT)과 산소의존적 세포막 손상을 효과적으로 검색하는 방법으로 알려진 광용혈 시험법(Photohemolysis Test)을 적용하여 광독성을 평가하였다. 3T3 NRU 광독성 시험법에는 마우스 유래의 섬유아세모(NIH/3T3)가 사용되었고, 광용혈 시험법에는 인간 적혈구(Human Erythrocyte)가 사용되었다.
3T3 NRU 광독성 시험법(The 3T3 neutral red uptake photoxicity test,3T3 NRU PT)은 화장품의 광독성 평가에 대한 대체시험법으로 2004년 4월 OECD 독성시험 기준으로 채택되었으녀, 마우스 유래의 섬유아세포인 3T3 cell을 이용하여 광조사한 것과 광조사하지 않은 세포와의 세포독성을 NRU 시험을 이용하여 그 정도를 비교하여 그 차이(PIF, photoirritation factor)가 5배 이상이 되면 광독성 물질로 분류하는 평가방법이다.
표 5는 3T3 NRU 광독성 시험법에 의한 김으로부터 제조된 추출물인 PE와 P7의 광독성 결과를 나타낸 것이다.
표 5에서 나타나는 바와 같이 정제 추출물인 P7은 평균 반수 치사량(IC50, 일반적으로 독성이 예상되는 물질 일정량을 동물에 투여해 실험에 사용된 동물의 수가 반수 이상 죽는 량을 말한다.) 농도가 자외선 조사 여부와 관계없이 1000 ㎎/㎖를 초과하고, PIF 값이 1을 나타내어 비광독성 물질(non-phototoxic substance)로 판정되었다. 또한, 조추출물인 PE의 경우 평균 반수 치사량의 농도가 P7보다 낮게 나타나 상대적으로 독성 정도가 높았으나, PIF 값이 5 미만으로 나타나 비광독성 물질로 판정되었다.
추출물 종류 3T3 NRU 광독성 시험 결과
평균 IC50 농도
(UV-, ㎎/㎖)		 평균 IC50 농도
(UV+, ㎎/㎖)		 PIF
[IC50(UV-)/IC50(UV+)]
PE 932.5 215.0 4.34
P7 > 1000 > 1000 1
도 2는 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 조추출물(PE)과 2차 정제 추출물(P7)의 광독성 결과를 나타낸 그래프이다. 또한, 도 3은 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 조추출물(PE)의 농도가 500㎍/㎖ 일 때의 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이고, 도 4는 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 2차 정제 추출물(P7)의 농도가 250㎍/㎖ 일 때의 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이다. 도 2 내지 도 4에 나타난 광용혈 시험에서 사용된 자외선 조사량은 UVA 15J/㎠ 이었다.
인간 적혈구를 이용한 광용혈 시험법에 의한 광독성 결과는 3T3 NRU 광독성 시험법에 의한 광독성 시험 결과와 거의 동일하였다.
(2) 세포독성(Cytotoxicity)
김으로부터 제조된 추출물인 PE와 P7에 대해 사람의 각질세포(keratinocyte)인 HaCaT에 대한 세포독성 시험(cytotoxicity test)을 수행하였다. 세포독성의 평가는 Neutral red assay를 이용하였다.
표 6는 3김으로부터 제조된 추출물인 PE와 P7의 사람의 각질세포(keratinocyte)인 HaCaT에 대한 세포독성 시험 결과를 나타낸 것이다.
표 6에서 나타나는 바와 같이 PE와 P7의 HaCaT에 대한 반수 치사량 농도가 모두 5㎎/㎖ 이상으로 나타나 비세포독성 물질(non-cytotoxic substance)로 사료된다.
추출물 종류 IC50 농도(㎎/㎖)
PE > 5
P7 > 5
상기에서 검토한 바와 같이 김으로부터 제조된 조추출물과 정제 추출물은 모두 비독성 자외선 차단용 추출물로 판명되었으며, 상기 추출물은 자외선 차단제와 같은 화장료 조성물의 주요 성분으로 사용될 수 있다. 이때 화장료 조성물은 크림, 로션, 겔, 토닉 또는 미스트 등의 유형으로 제조될 수 있고, 자외선 차단용 주출물의 함량은 피부에 독성을 일으키지 않는 범위에서 적절하게 선택될 수 있다.
도 2 내지 도 4에서 PE는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 의해 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 조추출물을 나타내고, P7은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 의해 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 2차 정제 추출물을 나타내고, UV-는 자외선을 조사하지 않은 상태를 나타내고, UV+는 자외선을 조사한 상태를 나타낸다.

Claims (14)

  1. (a) 김 또는 진두발로부터 선택되는 1종 이상의 홍조류를 준비하는 단계;
    (b) 상기 준비된 홍조류에 탄소수 1 내지 5인 알코올 대 물의 부피비가 1:9 내지 9:1인 혼합 용매를 첨가하고 30~60℃의 온도에서 유지하여 유효성분을 추출하는 단계; 및
    (c) 상기 유효성분 및 잔여 홍조류 고형물을 포함하는 혼합 용매를 여과하여 상등액과 잔여 홍조류 고형물로 분리하는 단계; 를 포함하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 홍조류는 조쇄된 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 잔여 홍조류 고형물을 가지고 (b) 단계 및 (c) 단계를 1회 내지 3회 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    (d) 상기 분리된 상등액을 멤브레인 필터에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    (e) 상기 분리된 상등액을 농축하고 건조시켜 고형화된 조추출물을 수득하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    (f) 상기 고형화된 조추출물을 물에 용해시키고 멤브레인 필터에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계; 및
    (g) 상기 불순물이 제거된 조추출물 수용액을 물과 탄소수 1 내지 5인 알코올의 농도 구배로 전개시키고 280~400 ㎚의 자외선 파장을 흡수하는 조추출 분획물을 수득하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    (h) 상기 조추출 분획물을 소수성 상호 칼럼에 통과시켜 1차 정제 추출물을 수득하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 소수성 상호 칼럼은 실리카 겔 표면에 소수성 알킬기, 소수성 아릴기, 소수성 시아노기, 및 소수성 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 소수성 관능기가 결합된 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    (i) 상기 1차 정제 추출물을 크기 배제 칼럼(Size Exclusion Column)에 통과시켜 2차 정제 추출물을 수득하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    (j) 상기 2차 정제 추출물을 농축하고 건조시켜 고형화된 정제 추출물을 수득하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 비독성 자외선 차단용 추출물을 포함하는 비독성 자외선 차단제.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 비독성 자외선 차단용 추출물은 유효성분으로 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)을 함유하는 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단제.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 비독성 자외선 차단용 추출물은 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)으로 팔리틴(Palythine), 아스테리나-330(Asterina-330), 및 시노린(Shinorine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단제.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 비독성 자외선 차단용 추출물은 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)으로 포르피라-334(Porphyra-334)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비독성 자외선 차단제.
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