KR100957051B1

KR100957051B1 - 니트로푸란토인 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법

Info

Publication number: KR100957051B1
Application number: KR1020070139711A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 김연정; 송미
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2010-05-13
Also published as: KR20090071808A

Abstract

본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폐독성 유발 약물인 니트로푸란토인(nitrofurantoin)에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커유전자는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 폐독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 니트로푸란토인이 폐독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

니트로푸란토인, 마커유전자, 마이크로어레이, 폐독성

Description

니트로푸란토인 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법{Marker genes based on nitrofurantoin treatment for screening of drug inducing pulmonary toxicity and screening method using thereof}

본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폐독성 유발 약물인 니트로푸란토인에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다.

니트로푸란토인(nitrofurantoin)은 5-니트로푸란(nitrofuran)의 유도체로서 항균제제이며 요로감염증 치료제로서 사용된다. 니트로푸란토인 처방으로 약 85%의 환자에게서 폐 부작용이 발견되었으며, 이 중 특히 요로감염증 발생률이 많은 여성들에게서 많은 부작용이 나타나는 것으로 보고되었다(Bobbak V. et al., The Internet Journal of Pulmonary Medicine , 6(2), 2006). 니트로푸란토인 처방으로 발열, 반점상 구진, 관절통, 피로 등이 급성반응으로 나타나며, 일반적으로는 마른 기침, 가슴 통증 등이 나타나는 것으로 알려져 있다. 또한 호산구증다증(eosinopholia)도 나타나는 것으로 보고되었다. 그러나 이러한 반응들은 니트로푸란토인의 처방되는 용량과 연관성은 없다. 1개월 ~ 6개월 처방을 받는 경우, 마른기침, 호흡곤란, 미열, 청색증 등의 아급성 반응이 나타나며, 임상시험에서 적혈구 침강속도와 IgG가 증가되는 것으로 보고되었다(Sovojiarvi, A.R. et al., Scan . J. Respir . Dis ., 58:41-45, 1977). 6개월 ~ 6년 이상 니트로푸란토인을 처방받을 때에는 호흡곤란, 마른기침 등이 만성적인 증상으로 나타나며 심하면 폐섬유증이 유발되는 것으로 보고되었다(Mendex, J.L., Mayo Clin Proc ., 80:1298-1302, 2005). 만성질환에서 더 심해질 경우 객혈과 호흡부전이 나타타는 것으로 보고되었다.

니트로푸란토인은 호기조건과 NADPH 존재 하에서 니트로푸란토인의 니트로기(nitro group)의 한 전자가 환원되면서 니트로 자유라디칼(R-NO₂-)을 형성하고 이것은 산소와 반응하여 O₂-, H₂O₂, OH- 등의 활성산소종을 생성하면서 폐독성을 나타내는 것으로 보고된바있다(Theodore, E.G., The American society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 49(4):308, 1997). 활성산소종은 PDGF(platelet-derived growth factor)에 의한 영향으로 JAK-STAT(Janus kinase-signal transducer and activater of transcription) 경로를 활성화시켜 폐섬유증을 유발하는 것으로 알려져 있다(Amy, R.S., Am J Physiol Cell Physiol ., 275:1640-1652, 1998).

폐섬유증과 관련된 유전자로 MMP(matrix metalloprotease) 7, CCL7 이 보고된바 있으며, 동물 모델에서 FIZZ1도 이와 관련된 것으로 알려져 있다(Kaminski, N. et al., Proc Am Thorac Soc ., 3(4):339-44, 2006). 또한 앤지오텐신(angiotensin) Ⅱ(ANGⅡ)와 변형성 성장 인자(transforming growth factor, TGF)-β1도 폐섬유증과 관련된 것으로 보고되었다. TGF-β1이 앤지오텐신(angiotensin) Ⅱ 유형 1 수용체에 작용하여 Smad, p38 MAPK, JNK, PI3K(phosphatidylinositol 3-kinsae) 시그날 경로(signaling pathway)와 관련하여 폐섬유증을 유발하는 것으로 알려졌다(Martin, M.M., et al., Am J Physiol Cell Physiol ., 293(3):790-799, 2007).

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93: 10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 에질런트(Agilent), 제노믹 솔루션(Genomic Solutions) 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51: 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 애피메트릭스(Affymetrix)사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, 에질런트(Agillent)사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., Am . Acad . Dermatol. 51: 681-692, 2004).

유전자의 발현 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al., Genomics Proteomics I: 1-10, 2002).

최근 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내 에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천 개가 집적된 올리고 마이크로어레이를 이용하여 니트로푸란토인의 유전자 발현 프로파일을 인간 기관지 상피 세포인 BEAS-2B 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 니트로푸란토인에 의해 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하고, 실시간(real-time) 정량 RT-PCR 방법에 의해 상기 유전자들의 발현 양상을 확인하여 폐독성 유발 약물을 검출할 수 있는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 폐독성 유발 약물인 니트로푸란토인에 의해 과발현 또는 저발현되는 마커유전자 및 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폐독성 유발 약물인 니트로푸란토인에 의해 기관지 상피 세포에서 발현변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 폐독성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.

본 발명의 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 새로운 폐독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링하거나 위해성을 판정하는데 유용하며, 니트로푸란토인에 의해 야기되는 폐독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.

상기 마커 유전자는 니트로푸란토인에 의해 자극받은 인간 기관지 상피 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 한다.

상기 마커유전자는 세포자살(apoptosis), 전사(transcription), 면역반응(immune response), 이온수송(ion transport), 세포주기(cell cycle), 단백질 분해(proteolysis), DNA 대사(DNA metabolism), 해당과정(glycolysis), 혈관신생(angiogenesis), TGF-β, MAPK 또는 JAK-STAT에 관련된 유전자로 구성되어 있다.

본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마커유전자를 제공한다:

유전자등록번호(Genebank) BE378852(Transcribed locus), 유전자등록번호(Genebank) BG527520[Transcribed locus, moderately similar to XP_540962.1 PREDICTED: similar to centrin 4(Canis familiaris)]), 유전자등록번호(Genebank) NM_004797(Adiponectin, C1Q and collagen domain containing), 유전자등록번호(Genebank) AF153821[Alcohol dehydrogenase IB(class I), beta polypeptide], 유전자등록번호(Genebank) NM_006818(Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia(trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 11), 유전자등록번호(Genebank)BP871540(Transcribed locus), 유전자등록번호(Genebank) AF269088(Ankyrin repeat domain 30B), 유전자등록번호(Genebank) BC018064(Activating transcription factor 6), 유전자등록번호(Genebank) XM_208270(Acrosin-like protease), 유전자등록번호(Genebank) NM_004323(BCL2-associated athanogene), 유전자등록번호(Genebank) BE816155(RC0-BN0198-220500-021-f04 BN0198 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence.), 유전자등록번호(Genebank) NM_003670(Basic helix-loop-helix domain containing, class B, 2), 유전자등록번호(Genebank) BE614991[Transcribed locus, strongly similar to XP_514491.1 PREDICTED: similar to hypothetical protein(Pan troglodytes)], 유전자등록번호(Genebank) CN484301[Transcribed locus, moderately similar to XP_227769.2 PREDICTED: similar to Ac1147(Rattus norvegicus)], 유전자등록번호(Genebank)AK027152(Chromosome 11 open reading frame 1), 유전자등록번호(Genebank) XM_290629(Chromosome 14 open reading frame 78), 유전자등록번호(Genebank) NM_173817(Chromosome 18 open reading frame 58), 유전자등록번호(Genebank) CR625148(Hypothetical LOC541469 protein), 유전자등록번 호(Genebank)BX537504(Complement component 2), 유전자등록번호(Genebank) BX281604(Chromosome 20 open reading frame 187), 유전자등록번호(Genebank) BU618438(Chromosome 20 open reading frame 77), 유전자등록번호(Genebank) BC020888(Metallophosphoesterase domain containing 1), 유전자등록번호(Genebank)NM_213720(Chromosome 22 open reading frame 16), 유전자등록번호(Genebank) BC027919(Chromosome 5 open reading frame 16), 유전자등록번호(Genebank) NM_030568(Chromosome 6 open reading frame 147), 유전자등록번호(Genebank) AK021476(Chromosome 6 open reading frame 164), 유전자등록번호(Genebank) BC036421(Chromosome 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유전자등록번호(Genebank)AY008294[Zinc finger protein, subfamily 1A, 2(Helios)].

1) 상기 마커유전자 중에서 폐독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 마커유전자는 하기와 같다:

유전자등록번호(Genebank) BE378852(Transcribed locus), 유전자등록번호(Genebank)BG527520[Transcribed locus, moderately similar to XP_540962.1 PREDICTED: similar to centrin 4(Canis familiaris)]), 유전자등록번호(Genebank) NM_004797(Adiponectin, C1Q and collagen domain containing), 유전자등록번 호(Genebank) AF153821[Alcohol dehydrogenase IB(class I), beta polypeptide], 유전자등록번호(Genebank) NM_006818(Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia(trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 11), 유전자등록번호(Genebank) BP871540(Transcribed locus), 유전자등록번호(Genebank) AF269088(Ankyrin repeat domain 30B), 유전자등록번호(Genebank) BC018064(Activating transcription factor 6), 유전자등록번호(Genebank)XM_208270(Acrosin-like protease), 유전자등록번호(Genebank) NM_004323(BCL2-associated athanogene), 유전자등록번호(Genebank) BE816155(RC0-BN0198-220500-021-f04 BN0198 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence.), 유전자등록번호(Genebank) NM_003670(Basic helix-loop-helix domain containing, class B, 2), 유전자등록번호(Genebank) BE614991[Transcribed locus, strongly similar to XP_514491.1 PREDICTED: similar to hypothetical protein(Pan troglodytes)], 유전자등록번호(Genebank) CN484301[Transcribed locus, moderately similar to XP_227769.2 PREDICTED: similar to Ac1147(Rattus norvegicus)], 유전자등록번호(Genebank) AK027152(Chromosome 11 open reading frame 1), 유전자등록번호(Genebank) XM_290629(Chromosome 14 open reading frame 78), 유전자등록번호(Genebank) NM_173817(Chromosome 18 open reading frame 58), 유전자등록번호(Genebank) CR625148(Hypothetical LOC541469 protein), 유전자등록번호(Genebank) BX537504(Complement component 2), 유전자등록번호(Genebank) BX281604(Chromosome 20 open reading frame 187), 유전자등록번호(Genebank) BU618438(Chromosome 20 open reading frame 77), 유전자등록번호(Genebank) BC020888(Metallophosphoesterase domain containing 1), 유전자등록번호(Genebank)NM_213720(Chromosome 22 open reading frame 16), 유전자등록번호(Genebank) BC027919(Chromosome 5 open reading frame 16), 유전자등록번호(Genebank) NM_030568(Chromosome 6 open reading frame 147), 유전자등록번호(Genebank) AK021476(Chromosome 6 open reading frame 164), 유전자등록번호(Genebank)BC036421(Chromosome 9 open reading frame 103), 유전자등록번호(Genebank) NM_153707(Chromosome 9 open reading frame 138), 유전자등록번호(Genebank) NM_203403(Chromosome 9 open reading frame 150), 유전자등록번호(Genebank) NM_021208(Chromosome 9 open reading frame 27), 유전자등록번호(Genebank) NM_053056(Cyclin D1), 유전자등록번호(Genebank) NM_001295[Chemokine(C-C motif) receptor 1], 유전자등록번호(Genebank) AK126349(CD200 receptor 1), 유전자등록번호(Genebank) AK026467(CD22 antigen), 유전자등록번호(Genebank) AK054921(Cerebellar degeneration-related protein 1, 34kDa), 유전자등록번호(Genebank) NM_012125(Cholinergic receptor, muscarinic 5), 유전자등록번호(Genebank) NM_003992(CDC-like kinase 3), 유전자등록번호(Genebank)A K022155(Coproporphyrinogen oxidase), 유전자등록번호(Genebank) AK090482[Chemokine(C-X-C motif) ligand 12(stromal cell-derived factor 1)], 유전자등록번호(Genebank) NM_152693(Chromosome X open reading frame 50), 유전자등록번호(Genebank) BX108307(Defensin, beta 126), 유전자등록번호(Genebank) AB051529[Dispatched homolog 2(Drosophila)], 유전자등록번호(Genebank) BC014951(chromosome 20 open reading frame 107), 유전자등록번호(Genebank) AK095541[DnaJ(Hsp40) homolog, subfamily A, member 1], 유전자등록번호(Genebank)BC036806(Extracellular matrix protein 2, female organ and adipocyte specific), 유전자등록번호(Genebank) BI830993(Eukaryotic translation initiation factor 4E), 유전자등록번호(Genebank) BX537939[Elastin(supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)], 유전자등록번호(Genebank) AB051895(Epiplakin 1), 유전자등록번호(Genebank) AB209361[Fas(TNF receptor superfamily, member 6)], 유전자등록번호(Genebank) NM_033480(F-box protein 9), 유전자등록번호(Genebank)BC034763(Ferredoxin reductase), 유전자등록번호(Genebank) NM_005141(Fibrinogen beta chain), 유전자등록번호(Genebank) AL832445(Hypothetical protein FLJ25770), 유전자등록번호(Genebank) XM_499008(Hypothetical gene supported by AK124699), 유전자등록번호(Genebank) AK124499(RGS9 anchor protein), 유전자등록번호(Genebank) CR936597(Fibrous sheath interacting protein 2), 유전자등록번호(Genebank) NM_004293(Guanine deaminase), 유전자등록번호(Genebank) NM_177483(Glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D1), 유전자등록번호(Genebank) AK074729(G protein-coupled receptor 19), 유전자등록번호(Genebank) AK122626(G protein-coupled receptor 82), 유전자등록번호(Genebank) NM_014619(Glutamate receptor, ionotropic, kainate 4), 유전자등록 번호(Genebank) NM_002133[Heme oxygenase(decycling) 1], 유전자등록번호(Genebank)CB124304[Transcribed locus, strongly similar to NP_001604.1 alpha 2 actin; alpha-cardiac actin(Homo sapiens)], 유전자등록번호(Genebank) BE745738(CDNA clone IMAGE:3928921), 유전자등록번호(Genebank) BC043212(Hypothetical LOC401057), 유전자등록번호(Genebank) BC008624(Homo sapiens cDNA clone MGC:18299 IMAGE:4179890, complete cds.), 유전자등록번호(Genebank) AK024336(Homo sapiens cDNA FLJ14274 fis, clone PLACE1004979.), 유전자등록번호(Genebank) AK057952(CDNA FLJ25223 fis, clone STM00880), 유전자등록번호(Genebank) AK123483(CDNA FLJ41489 fis, clone BRTHA2004582), 유전자등록번호(Genebank) BU570278[Similar to dJ1153D9.4(novel protein)], 유전자등록번호(Genebank) BE614991[Transcribed locus, strongly similar to XP_514491.1 PREDICTED: similar to hypothetical protein(Pan troglodytes)], 유전자등록번호(Genebank) T77197(TBC1 domain family, member 3B), 유전자등록번호(Genebank) AF119839(predicted protein of HQ0889; Homo sapiens PRO0889 mRNA, complete cds.), 유전자등록번호(Genebank) AF119912(predicted protein of HQ3073; Homo sapiens PRO3073 mRNA, complete cds.), 유전자등록번호(Genebank) BM467031(Ribosomal protein S2), 유전자등록번호(Genebank) CA943742[Transcribed locus, strongly similar to XP_429266.1 PREDICTED: hypothetical protein XP_429266(Gallus gallus)], 유전자등록번호(Genebank) AV727525(Transcribed locus), 유전자등록번호(Genebank) BC015351(Homo sapiens, clone IMAGE:4420333, mRNA), 유전자등록번호(Genebank) BG759321(Homo sapiens, clone IMAGE:4852110, mRNA), 유전자등록번호(Genebank) BF337308(Homeodomain-only protein), 유전자등록번호(Genebank) AK223249(Homeo box B7), 유전자등록번호(Genebank) NM_021192(Homeo box D11), 유전자등록번호(Genebank) NM_005345(Heat shock 70kDa protein 1A), 유전자등록번호(Genebank) NM_006597(Heat shock 70kDa protein 8), 유전자등록번호(Genebank) U88896, 유전자등록번호(Genebank) NM_134470(Interleukin 1 receptor accessory protein), 유전자등록번호(Genebank) BC069137[Interleukin 5(colony-stimulating factor, eosinophil)], 유전자등록번호(Genebank) AB039920(KCNQ1 downstream neighbor), 유전자등록번호(Genebank) AB033055(Outer dense fiber of sperm tails 2-like), 유전자등록번호(Genebank) AK001632(Hypothetical protein FLJ10770), 유전자등록번호(Genebank) BC042437[Keratin 14(epidermolysis bullosa simplex, Dowling-Meara, Koebner)], 유전자등록번호(Genebank) BX647923(Keratin 17), 유전자등록번호(Genebank) BC025396[Spermatogenesis associated 18 homolog(rat)], 유전자등록번호(Genebank) BC016613(Similar to hypothetical protein FLJ13841), 유전자등록번호(Genebank) BU536672(Ribosomal protein L22-like 1), 유전자등록번호(Genebank) BC012203(Hypothetical protein LOC284361), 유전자등록번호(Genebank) BC044311(Hypothetical protein LOC339344), 유전자등록번호(Genebank) AK022806(Hypothetical protein LOC340281), 유전자등록번호(Genebank) XM_371643(Similar to hypothetical protein MGC39725), 유전자등록번호(Genebank) XM_372625(similar to protein kinase related to Raf protein kinases; Method: conceptual translation supplied by author), 유전자등록번호(Genebank) XM_498623(LOC440309), 유전자등록번호(Genebank) XM_496818(similar to RIKEN cDNA 2410146L05), 유전자등록번호(Genebank) XM_497458(Similar to large subunit ribosomal protein L36a), 유전자등록번호(Genebank) AK127395(Ankyrin repeat domain 37), 유전자등록번호(Genebank) AK126961(Leucine rich repeat transmembrane neuronal 4), 유전자등록번호(Genebank) AK026984(Multiple C2 domains, transmembrane 2), 유전자등록번호(Genebank) BE644770(Mitofusin 1), 유전자등록번호(Genebank) AK123160(Chromosome 1 open reading frame 162), 유전자등록번호(Genebank) AK125877(Hypothetical protein MGC27016), 유전자등록번호(Genebank) AK124107(Leucine rich repeat containing 43), 유전자등록번호(Genebank) AK097334(Hypothetical protein MGC45840), 유전자등록번호(Genebank) AK123482(Microsomal glutathione S-transferase 1), 유전자등록번호(Genebank) AK128769(calcium channel, voltage-dependent, beta 2 subunit), 유전자등록번호(Genebank) AY154467(NACHT, leucine rich repeat and PYD containing 12), 유전자등록번호(Genebank) AK124709(N-myc downstream regulated gene 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_016931(NADPH oxidase 4), 유전자등록번호(Genebank) BX640730(Nebulin-related anchoring protein), 유전자등록번호(Genebank) AA524504(Full length insert cDNA clone ZE12C10), 유전자등록번호(Genebank)NM_002563(Purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 1), 유전자 등록번호(Genebank) AL834134(Protocadherin 15), 유전자등록번호(Genebank) NM_001011515(PDZ and LIM domain 5), 유전자등록번호(Genebank) S81916(Phosphoglycerate kinase 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_003662[Pirin(iron-binding nuclear protein)], 유전자등록번호(Genebank) NM_033256[Protein phosphatase 1, regulatory(inhibitor) subunit 14A], 유전자등록번호(Genebank) NM_014068(Psoriasis susceptibility 1 candidate 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_002900(Retinol binding protein 3, interstitial), 유전자등록번호(Genebank) AK055999(Ret finger protein-like 2), 유전자등록번호(Genebank) AB209019(Regulator of G-protein signalling 4), 유전자등록번호(Genebank) NM_004040(Ras homolog gene family, member B), 유전자등록번호(Genebank) BU902070(Ribosomal protein L36a-like), 유전자등록번호(Genebank) BF983391(Ribosomal protein S27-like), 유전자등록번호(Genebank) NM_173640[R-spondin homolog(Xenopus laevis)], 유전자등록번호(Genebank) BG182941[Transcribed locus, weakly similar to XP_510104.1 PREDICTED: similar to hypothetical protein FLJ25224(Pan troglodytes)], 유전자등록번호(Genebank) NM_004057(S100 calcium binding protein G), 유전자등록번호(Genebank) BC041022(SCAN domain containing 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_002639[Serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 5], 유전자등록번호(Genebank) NM_005668(ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 4), 유전자등록번호(Genebank) NM_003830(Sialic acid binding Ig-like lectin 5), 유전자 등록번호(Genebank) BC053934[Sirtuin(silent mating type information regulation 2 homolog) 4(S. cerevisiae)], 유전자등록번호(Genebank) NM_052832(Solute carrier family 26, member 7), 유전자등록번호(Genebank) NM_014332(Small muscle protein, X-linked), 유전자등록번호(Genebank) BC026316[Suppression of tumorigenicity 18(breast carcinoma)(zinc finger protein)], 유전자등록번호(Genebank) AK122707(Sulfotransferase family, cytosolic, 1A, phenol-preferring, member 3), 유전자등록번호(Genebank) AK026585(Tumor-associated calcium signal transducer 1), 유전자등록번호(Genebank) AL038125(Zinc finger, AN1-type domain 3), 유전자등록번호(Genebank) NM_000361(Thrombomodulin), 유전자등록번호(Genebank) BC010553(TIMP metallopeptidase inhibitor 4), 유전자등록번호(Genebank) NM_003840(Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 10d, decoy with truncated death domain), 유전자등록번호(Genebank) NM_004881(Tumor protein p53 inducible protein 3), 유전자등록번호(Genebank) NM_033229(Tripartite motif-containing 15), 유전자등록번호(Genebank) BC063872(Tripartite motif-containing 9), 유전자등록번호(Genebank) NM_003314(Tetratricopeptide repeat domain 1), 유전자등록번호(Genebank) AK024002(Tubulin, alpha 4), 유전자등록번호(Genebank) NM_006087(Tubulin, beta 4), 유전자등록번호(Genebank) AF219946(Tubby like protein 4), 유전자등록번호(Genebank) AK025742[Uncoupling protein 2(mitochondrial, proton carrier)], 유전자등록번호(Genebank) AI699331(Transcribed locus), 유전자등록번 호(Genebank) AF055634[Unc-5 homolog C(C. elegans)], 유전자등록번호(Genebank) AK023940(Homo sapiens cDNA FLJ13878 fis, clone THYRO1001411), 유전자등록번호(Genebank) BE815283(Transcribed locus), 유전자등록번호(Genebank) BM913228[Full-length cDNA clone CS0DI020YI20 of Placenta Cot 25-normalized of Homo sapiens(human)], 유전자등록번호(Genebank) BX099682(Transcribed locus), 유전자등록번호(Genebank) BX640772[MRNA; cDNA DKFZp686P02129(from clone DKFZp686P02129)], 유전자등록번호(Genebank) AK094191(Chromosome 8 open reading frame 34), 유전자등록번호(Genebank) NM_033400(Zinc finger homeobox 2), 유전자등록번호(Genebank) XM_040592(Zinc finger protein 469).

2) 상기 마커유전자 중에서, 폐독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 감소하는 마커유전자는 하기와 같다:

유전자등록번호(Genebank)(Genebank) NM_007313(V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_203380(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 5), 유전자등록번호(Genebank) BC040531(Activin A receptor, type IB), 유전자등록번호(Genebank) Y13786[ADAM metallopeptidase domain 19(meltrin beta)], 유전자등록번호(Genebank) AJ250725(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 12), 유전자등록번호(Genebank) AJ315733(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 15), 유전자등록번호(Genebank) NM_133638(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 19), 유전자등록번호(Genebank) NM_014243(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 3), 유전자등록번호(Genebank) NM_207517(ADAMTS-like 3), 유전자등록번호(Genebank) BC013780(Adenosine A2a receptor), 유전자등록번호(Genebank) AK160382(AT-hook transcription factor), 유전자등록번호(Genebank) AK122839(V-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2), 유전자등록번호(Genebank) AK128709(Aldehyde dehydrogenase 1 family, member A2), 유전자등록번호(Genebank) NM_003748(Aldehyde dehydrogenase 4 family, member A1), 유전자등록번호(Genebank) NM_172196(TFIIA-alpha/beta-like factor), 유전자등록번호(Genebank) NM_152526[Amyotrophic lateral sclerosis 2(juvenile) chromosome region, candidate 19], 유전자등록번호(Genebank) NM_139314(Angiopoietin-like 4), 유전자등록번호(Genebank) NM_000037(Ankyrin 1, erythrocytic), 유전자등록번호(Genebank) AJ583444[Ankyrin repeat domain 2(stretch responsive muscle)], 유전자등록번호(Genebank) NM_145641(Apolipoprotein L, 3), 유전자등록번호(Genebank) BC006276(Apolipoprotein L, 4), 유전자등록번호(Genebank) NM_003224(ADP-ribosylation factor related protein 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_021069(Sorbin and SH3 domain containing 2), 유전자등록번호(Genebank) AK090447(Rho GTPase activating protein 19), 유전자등록번호(Genebank) NM_015071(Rho GTPase activating protein 26), 유전자등록번 호(Genebank) NM_032199[AT rich interactive domain 5B(MRF1-like)], 유전자등록번호(Genebank) NM_183376(Arrestin domain containing 4), 유전자등록번호(Genebank) AK000643(Ankyrin repeat and SOCS box-containing 9), 유전자등록번호(Genebank) AB209032(Activating transcription factor 3), 유전자등록번호(Genebank) NM_032827[Atonal homolog 8(Drosophila)], 유전자등록번호(Genebank) BX537444(ATPase, Ca++ transporting, plasma membrane 4), 유전자등록번호(Genebank) NM_006045(ATPase, Class II, type 9A), 유전자등록번호(Genebank) AB011106(Attractin-like 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_000707(Arginine vasopressin receptor 1B), 유전자등록번호(Genebank) CR933657[Axin 2(conductin, axil)], 유전자등록번호(Genebank) NM_152384(Bardet-Biedl syndrome 5), 유전자등록번호(Genebank) NM_021948(Brevican), 유전자등록번호(Genebank) AA608624(Breast carcinoma amplified sequence 3), 유전자등록번호(Genebank) NM_017745(BCL6 co-repressor), 유전자등록번호(Genebank) S72478, 유전자등록번호(Genebank) NM_001710(B-factor, properdin), 유전자등록번호(Genebank) CR749373(chromosome 1 open reading frame 178), 유전자등록번호(Genebank) AL713697(Bridging integrator 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_001165(Baculoviral IAP repeat-containing 3), 유전자등록번호(Genebank) BM984396(Plasminogen-like B2), 유전자등록번호(Genebank) NM_001203(Bone morphogenetic protein receptor, type IB), 유전자등록번호(Genebank) AK098095(V-raf murine sarcoma 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유전자등록번호(Genebank) NM_002160(Tenascin C(hexabrachion)), 유전자등록번호(Genebank) BC028148[Tumor necrosis factor(TNF superfamily, member 2)], 유전자등록번호(Genebank) NM_006291(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), 유전자등록번호(Genebank) NM_006290(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3), 유전자등록번호(Genebank) NM_007115(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6), 유전자등록번호(Genebank) BC052977(Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B), 유전자등록번호(Genebank) NM_003811[Tumor necrosis factor(ligand) superfamily, member 9], 유전자등록번호(Genebank) AB210011[Transportin 2(importin 3, karyopherin beta 2b)], 유전자등록번호(Genebank) NM_005427(Tumor protein p73), 유전자등록번호(Genebank) AB032995(Two pore segment channel 1), 유전자등록번호(Genebank) S76980[hexosaminidase A(alpha polypeptide)], 유전자등록번호(Genebank) NM_003320[Tubby homolog(mouse)], 유전자등록번호(Genebank) NM_003328(TXK tyrosine kinase), 유전자등록번호(Genebank) NM_006472(Thioredoxin interacting protein), 유전자등록번호(Genebank) NM_003360[UDP glycosyltransferase 8(UDP-galactose ceramide galactosyltransferase)], 유전자등록번호(Genebank) NM_025154[Unc-84 homolog A(C. elegans)], 유전자등록번호(Genebank) BC094797[Unc-84 homolog B(C. elegans)], 유전자등록번호(Genebank) AW016806(Transcribed locus), 유전자등록번호(Genebank) AW341701(Transcribed locus), 유전자등록번호(Genebank) NM_199511(Steroid sensitive gene 1), 유전자등록번호(Genebank) DQ097177(HECT, UBA and WWE domain containing 1), 유전자등록번호(Genebank) BC027954(Tcell receptor gamma variable 7), 유전자등록번호(Genebank) NM_003371(Vav 2 oncogene), 유전자등록번호(Genebank) AF167081(Variable charge, X-linked), 유전자등록번호(Genebank) AK058041[Vestigial like 4(Drosophila)], 유전자등록번호(Genebank) AJ132099(Vanin 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_014588[Visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like(zebrafish)], 유전자등록번호(Genebank) NM_000638[Vitronectin(serum spreading factor, somatomedin B, complement S-protein)], 유전자등록번호(Genebank) NM_022170(Myosin XVB pseudogene), 유전자등록번호(Genebank) NM_032951(MLX interacting protein-like), 유전자등록번호(Genebank) BC052234(Wingless-type MMTV integration site family, member 10A), 유전자등록번호(Genebank) AK126706(X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 3), 유전자등록번호(Genebank) NM_020205(Zinc finger, A20 domain containing 1), 유전자등록번호(Genebank) D26122(splicing factor 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_032441(Zinc finger, matrin type 1), 유전자등록번호(Genebank) BC036823(Zinc finger protein 289, ID1 regulated), 유전자등록번호(Genebank) NM_182975(Zinc finger protein 326), 유전자등록번호(Genebank) NM_181489(Zinc finger protein 445), 유전자등록번호(Genebank) BG201273[Zinc finger protein 75(D8C6)], 유전자등록번호(Genebank) AY008294[Zinc finger protein, subfamily 1A, 2(Helios)].

본 발명자들은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 발굴하기 위하여, 폐독성을 나타내는 니트로푸란토인을 인간 기관지 상피 세포주(BEAS-2B)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 니트로푸란토인은 인간 기관지 상피 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 니트로푸란토인의 처리를 위한 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 니트로푸란토인을 인간 기관지 상피 세포주에 처리하고, 상기 약물을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 Cy5 형광물질로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3 형광물질로 표지하였다. 상기 형광 표지된 cDNA를 44 k 인간 유전체 전체(Human whole genome) 올리고마이크로어레이 칩(Agilent, USA)과 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 2.0 배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.5 배 이하인 경우 발현 감소화된 유전자로 분류하였다. 그 결과, 발현이 증가된 유전자는 0.375%(44,290개의 유전자 중 166개), 발현이 감소된 유전자는 0.921%(44,290개의 유전자 중 408개)임을 확인하였다. 이때, 니트로푸란토인에 의해 2.0 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 폐독성에 작용하는 기능으로 판단되는 세포자살(apoptosis), 전사(transcription), 면역반응(immune response), 이온수송(ion transport), 세포주기(cell cycle), 단백질 분해(proteolysis), DNA 대사(DNA metabolism), 해당과정(glycolysis), 혈관신생(angiogenesis), TGF-β, MAPK 또는 JAK-STAT에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 니트로푸란토인을 처리했을 때, 인간 기관지 상피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

본 발명의 실시예에서는 상기 유전자 중 JAk-STAT 관련 유전자 7종, TGF-β 관련 유전자 3종, 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 관련 유전자 8종을 분리하여 실시간 역전사유전자증폭기술(real-time reverse transcript polymerase chain reaction, RT-PCR) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 4종의 과발 현 유전자들과 14종의 저발현 유전자의 발현 양상이 올리고 마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 5 참조).

또한, 본 발명은 상기 마커유전자 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 마커유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.

본 발명의 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다:

상기 탐색된 마커유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

본 발명은

1) 인간 기관지 세포 또는 폐 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;

3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계;

4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;

5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및

6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마커유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 세포는 인간 기관지 상피 세포인 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 표 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 모두 사용 가능하며 본 발명의 실시예에서는 직접 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하였다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어라면 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명은

2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;

3) 단계 2)의 RNA를, 본 발명의 마커유전자에 상보적이고 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계; 및

4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 마커유전자 유전자와 상보적이고, 마커유전자를 증폭할 수 있으며, 증폭산물이 100 내지 300 bp(base pair)가 되도록 설계된 프라이머라면 모두 사용가능하다. 본 발명에서는 서열번호 1 내지 36으로 기재되는 정방향 및 역방향 프라이머 18쌍을 제시하였으나 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 DNA 마이크로어레이 칩은 본 발명의 방법으로 제작한 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 검색용 키트는 추가적으로 인간 기관지 상피 세포를 포함할 수 있으며, 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 검색용 키트는 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.

상기 검색용 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.

상기 검색용 키트에 추가적으로 상기 마커유전자 유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있으며, 프라이머는 서열번호 1 내지 36로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 마커유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있으며 증폭산물이 100 내지 300bp가 되도록 설계된 정방향 또는 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리

<1-1> 세포배양

인간 기관지 상피 세포주인 BEAS-2B 세포(CRL-9609, ATCC, USA)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 T 75 플라스크에서 5 × 10⁵ 세포/ml가 되도록 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 폐독성을 부작용으로 나타나는 대표적인 약물인 니트로푸란토인을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포 독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리

Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 BEAS-2B 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 3× 10⁴/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 니트로푸란토인을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 4 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다. BEAS-2B 세포주에서 니트로푸란토인의 세포독성을 살펴본 결과, 20% 생존 저해율을 보이는 농도(IC₂₀)는 89.45 uM 이었으며(도 1 참조), 상기 농도로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

< 실시예 2> 마이크로어레이 실험

<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지

1.24 × 10⁶ cell/㎖ 농도로 100 mm 디쉬에 BEAS-2B 세포를 분주한 후, 실시예<1-2>에서 결정된 니트로푸란토인의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 순도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)으로 확인하였다.

<2-2> 표지된 cDNA 제조

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예<2-1>에서 수득한 니트로푸란토인 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.

구성	부피(㎕)
5X first strand buffer	6
dNTPs	0.6
0.1 M DDT	3
SuperScript II enzyme	3
Cy-3 or Cy-5 dUTP	2

대조군인 BEAS-2B 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)으로 표지화하였고, 니트로푸란토인을 처리한 BEAS-2B 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)를 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 44 k Whole Human Genome 올리고 마이크로어레이(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(2분간 2× SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1× SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.

<2-4> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 니트로푸란토인에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2 참조).

그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 니트로푸란토인에 의해 Cy5/Cy3의 비율이 2.0배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 0.375%(44,290개의 유전자 중 166개)이고, 발현이 감소된 유전자는 0.921%(44,290개의 유전자 중 408개)임을 확인하였다.

이때, 니트로푸란토인에 의해 2.0 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 폐독성에 작용하는 기능으로 판단되는 세포자살(apoptosis), 전사(transcription), 면역반응(immune response), 이온수송(ion transport), 세포주기(cell cycle), 단백질 분해(proteolysis), DNA 대사(DNA metabolism), 해당과정(glycolysis), 혈관신생(angiogenesis), TGF-β, MAPK 또는 JAK-STAT과 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 니트로푸란토인을 처리했을 때, 인간 기관지 상피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

니트로푸란토인에 의해 발현이 증가하는 유전자

등록번호	유전자 약어	유전자 명	중간값의 비
1. JAK-STAT
NM_053056	CCND1	Cyclin D1	2.1137
BC069137	IL5	Interleukin 5(colony-stimulating factor, eosinophil)	2.0345
2. MAPK
NM_006597	HSPA8	Heat shock 70kDa protein 8	2.2048
AK128769	CACNLB2	calcium channel, voltage-dependent, beta 2 subunit	2.1998
NM_004465	FGF10	Fibroblast growth factor 10	2.018
3. 세포자살(apoptosis)
NM_003840	TNFRSF10D	Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 10d, decoy with truncated death domain	2.0266
AY154467	NALP12	NACHT, leucine rich repeat and PYD containing 12	2.05
NM_004323	BAG1	BCL2-associated athanogene	2.0378
AF055634	UNC5C	Unc-5 homolog C(C. elegans)	2.3297
NM_005345	HSPA1A	Heat shock 70kDa protein 1A	2.1214
AB209361	FAS	Fas(TNF receptor superfamily, member 6)	2.4387
NM_004040	RHOB	Ras homolog gene family, member B	2.5158
BC041022	SCAND1	SCAN domain containing 1	2.394
4. 전사(transcription)
BC026316	ST18	Suppression of tumorigenicity 18(breast carcinoma)(zinc finger protein)	2.1275
NM_003662	PIR	Pirin(iron-binding nuclear protein)	2.6652
BF337308	HOP	Homeodomain-only protein	2.1065
AK223249	HOXB7	Homeo box B7	2.0725
NM_003670	BHLHB2	Basic helix-loop-helix domain containing, class B, 2	2.5164
BC044311	LOC339344	Hypothetical protein LOC339344	2.1674
BC053934	SIRT4	Sirtuin(silent mating type information regulation 2 homolog) 4(S. cerevisiae)	2.0169
BC018064	ATF6	Activating transcription factor 6	2.177
BC041022	SCAND1	SCAN domain containing 1	2.394
AF219946	TULP4	Tubby like protein 4	2.2316
NM_004465	FGF10	Fibroblast growth factor 10	2.018
AK123051	MYCBP	C-myc binding protein	2.0113
NM_033400	ZFHX2	Zinc finger homeobox 2	2.0324
XM_040592	ZNF469	Zinc finger protein 469	2.5383
5. 면역반응( immune response )
BM905227	FTH1	Ferritin, heavy polypeptide 1	2.0071
NM_001295	CCR1	Chemokine(C-C motif) receptor 1	2.0668
NM_134470	IL1RAP	Interleukin 1 receptor accessory protein	2.0842
AY154467	NALP12	NACHT, leucine rich repeat and PYD containing 12	2.05
AB209361	FAS	Fas(TNF receptor superfamily, member 6)	2.4387
AK090482	CXCL12	Chemokine(C-X-C motif) ligand 12(stromal cell-derived factor 1)	2.6952
BC069137	IL5	Interleukin 5(colony-stimulating factor, eosinophil)	2.0345
AK026467	CD22	CD22 antigen	2.0039
BX537504	C2	Complement component 2	2.1733
AF186094	IL1F5	Interleukin 1 family, member 5(delta)	2.0308
6. 이온수송(ion transport)
BM905227	FTH1	Ferritin, heavy polypeptide 1	2.0071
NM_014619	GRIK4	Glutamate receptor, ionotropic, kainate 4	2.3513
NM_001035	RYR2	Ryanodine receptor 2(cardiac)	2.0242
NM_004797	ACDC	Adiponectin, C1Q and collagen domain containing	2.0948
AK025742	UCP2	Uncoupling protein 2(mitochondrial, proton carrier)	2.5468
AK128769	MYSB; CACNLB2; FLJ23743	calcium channel, voltage-dependent, beta 2 subunit	2.1998
7. 세포주기(cell cycle)
NM_004465	FGF10	Fibroblast growth factor 10	2.018
NM_053056	CCND1	Cyclin D1	2.1137
NM_004040	RHOB	Ras homolog gene family, member B	2.5158
BC041022	SCAND1	SCAN domain containing 1	2.394
8. 단백질 분해(proteolysis)
XM_208270	bA395L14.13	Acrosin-like protease	2.0651
BX108307	DEFB126	Defensin, beta 126	2.2969
NM_002900	RBP3	Retinol binding protein 3, interstitial	2.5707
BX537504	C2	Complement component 2	2.1733
9. DNA 대사(DNA metabolism)
BX537939	ELN	Elastin(supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)	2.2722
BC053934	SIRT4	Sirtuin(silent mating type information regulation 2 homolog) 4(S. cerevisiae)	2.0169
10. 해당과정(glycolysis)
S81916	PGK1	Phosphoglycerate kinase 1	2.1276

니트로푸란토인에 의해 발현이 감소하는 유전자

등록번호	유전자 약어	유전자 명	중간값의 비
1. JAK - STAT
NM_003629	PIK3R3	Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3(p55, gamma)	0.4727
NM_003955	SOCS3	Suppressor of cytokine signaling 3	0.4724
NM_002309	LIF	Hypothetical protein MGC20647	0.4145
NM_172220	CSF3	Colony stimulating factor 3(granulocyte)	0.3212
AA995107	il7R	Transcribed locus, moderately similar to XP_517807.1 PREDICTED: interleukin 7 receptor [Pan troglodytes]	0.2921
2. TGF -β
CR618407	BMP2	Bone morphogenetic protein 2	0.4922
U68019	SMAD3	SMAD, mothers against DPP homolog 3(Drosophila)	0.4998
BM906235	ID3	Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein	0.4846
3. MAPK
CR614015	CD14	CD14 antigen	0.4996
BC021552	CACNG6	Calcium channel, voltage-dependent, gamma subunit 6	0.4523
AK098095	BRAF	V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1	0.4225
BC008678	IL1B	Interleukin 1, beta	0.3934
NM_000575	IL1A	Interleukin 1, alpha	0.3616
NM_000944	PPP3CA	Protein phosphatase 3(formerly 2B), catalytic subunit, alpha isoform(calcineurin A alpha)	0.2288
4. 전사( transcription )
AB028450	NCOR1	Nuclear receptor co-repressor 1	0.493212
AB028978	KIAA1055	TBC1 domain family, member 2B	0.373305
AB046767	TLE3	Transducin-like enhancer of split 3(E(sp1) homolog, Drosophila)	0.454191
AB209032	ATF3	Activating transcription factor 3	0.4627
AB209404	GLIS3	GLIS family zinc finger 3	0.499299
AF227948	HBXAP	Hepatitis B virus x associated protein	0.18956
AK055224	NEUROD6	Neurogenic differentiation 6	0.310333
AK058041	VGLL4	Vestigial like 4(Drosophila)	0.477415
AK075040	HES6	Hairy and enhancer of split 6(Drosophila)	0.265698
AK090459	NFE2L1	Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 1	0.416157
AK092414	MAFK	V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog K(avian)	0.374604
AK127845	GATA2	GATA binding protein 2	0.489248
AK128256	MEF2B	MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide B(myocyte enhancer factor 2B)	0.252736
AL834223	HDAC11	Histone deacetylase 11	0.404137
AY008294	ZNFN1A2	Zinc finger protein, subfamily 1A, 2(Helios)	0.46617
BC016743	BRF1	BRF1 homolog, subunit of RNA polymerase III transcription initiation factor IIIB(S. cerevisiae)	0.391778
BC017222	SQSTM1	Sequestosome 1	0.353541
BC028148	TNF	Tumor necrosis factor(TNF superfamily, member 2)	0.473784
BC033580	KLF1	Kruppel-like factor 1(erythroid)	0.494264
BC051352	OLIG3	Oligodendrocyte transcription factor 3	0.419368
BG201273	ZNF75	Zinc finger protein 75(D8C6)	0.422708
BM906235	ID3	Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein	0.484579
BX537368	ELF3	E74-like factor 3(ets domain transcription factor, epithelial-specific )	0.134814
D26122	ZFM1	splicing factor 1	0.359911
NM_000545	TCF1	Transcription factor 1, hepatic; LF-B1, hepatic nuclear factor(HNF1), albumin proximal factor	0.452407
NM_000937	POLR2A	Polymerase(RNA) II(DNA directed) polypeptide A, 220kDa	0.318903
NM_001426	EN1	Engrailed homolog 1	0.46928
NM_001618	PARP1	Poly(ADP-ribose) polymerase family, member 1	0.426054
NM_001987	ETV6	Ets variant gene 6(TEL oncogene)	0.482984
NM_003106	SOX2	SRY(sex determining region Y)-box 2	0.451572
NM_003107	SOX4	SRY(sex determining region Y)-box 4	0.49185
NM_003482	MLL2	Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 2	0.450355
NM_005427	TP73	Tumor protein p73	0.461904
NM_005461	MAFB	V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B(avian)	0.328194
NM_005967	NAB2	NGFI-A binding protein 2(EGR1 binding protein 2)	0.392293
NM_006162	NFATC1	Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 1	0.489525
NM_006290	TNFAIP3	Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3	0.442261
NM_007313	ABL1	V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1	0.24919
NM_014588	VSX1	Visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like(zebrafish)	0.465103
NM_015267	CUTL2	Cut-like 2(Drosophila)	0.387868
NM_015335	THRAP2	Thyroid hormone receptor associated protein 2	0.400021
NM_017745	BCOR	BCL6 co-repressor	0.456985
NM_021170	HES4	Hairy and enhancer of split 4(Drosophila)	0.291789
NM_032199	ARID5B	AT rich interactive domain 5B(MRF1-like)	0.466118
NM_032827	ATOH8	Atonal homolog 8(Drosophila)	0.229052
NM_032951	WBSCR14	MLX interacting protein-like	0.068795
NM_139067	SMARCC2	SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily c, member 2	0.344644
NM_172196	ALF	TFIIA-alpha/beta-like factor	0.215999
NM_178229	IQGAP3	IQ motif containing GTPase activating protein 3	0.437937
NM_181489	ZNF445	Zinc finger protein 445	0.479497
NM_182975	ZNF326	Zinc finger protein 326	0.451742
U52682	IRF4	Interferon regulatory factor 4	0.477867
U68019	SMAD3	SMAD, mothers against DPP homolog 3(Drosophila)	0.499751
X99975		H.sapiens mRNA for hRTR/hGCNF protein.	0.473776
XM_379934	KIAA1718	KIAA1718 protein	0.49617
5. 면역 반응( immune response )
AA995107	IL-7R	Transcribed locus, moderately similar to XP_517807.1 PREDICTED: interleukin 7 receptor [Pan troglodytes]	0.292088
AB209622	ITK	IL2-inducible T-cell kinase	0.382631
AK001872	PDCD1LG2	Programmed cell death 1 ligand 2	0.436178
AK090459	NFE2L1	Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 1	0.416157
AK093049	SERPINA3	Serpin peptidase inhibitor, clade A(alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3	0.28734
AK124894	CRHR1	Corticotropin releasing hormone receptor 1	0.438102
BC008678	IL1B	Interleukin 1, beta	0.393366
BC013780	ADORA2A	Adenosine A2a receptor	0.471238
BC017222	SQSTM1	Sequestosome 1	0.353541
BC020698	CCL20	Chemokine(C-C motif) ligand 20	0.107276
BC021117	CSF1	Colony stimulating factor 1(macrophage)	0.405005
BC028148	TNF	Tumor necrosis factor(TNF superfamily, member 2)	0.473784
BC053653	CXCL2	Chemokine(C-X-C motif) ligand 2	0.418757
BC063852	C3	Complement component 3	0.436545
BC071718	CCL4L1	Chemokine(C-C motif) ligand 4-like 1	0.414565
BE873976	CSF2	Colony stimulating factor 2(granulocyte-macrophage)	0.454655
BG564326	SAA4	Serum amyloid A4, constitutive	0.300004
BG564669	SAA1	Serum amyloid A2	0.351094
CR614015	CD14	CD14 antigen	0.499567
CR627018	MBP	Myelin basic protein	0.32601
NM_000575	IL1A	Interleukin 1, alpha	0.361611
NM_000600	IL6	Interleukin 6(interferon, beta 2)	0.424519
NM_000638	VTN	Vitronectin(serum spreading factor, somatomedin B, complement S-protein)	0.493649
NM_001511	CXCL1	Chemokine(C-X-C motif) ligand 1(melanoma growth stimulating activity, alpha)	0.471373
NM_001710	BF	B-factor, properdin	0.263983
NM_001733	C1R	Complement component 1, r subcomponent	0.397334
NM_002090	CXCL3	Chemokine(C-X-C motif) ligand 3	0.367169
NM_002260	KLRC3	Killer cell lectin-like receptor subfamily C, member 2	0.208751
NM_002309	LIF	Hypothetical protein MGC20647	0.414547
NM_002341	LTB	Lymphotoxin beta(TNF superfamily, member 3)	0.426139
NM_002852	PTX3	Pentraxin-related gene, rapidly induced by IL-1 beta	0.472989
NM_002982	CCL2	Chemokine(C-C motif) ligand 2	0.211062
NM_002994	CXCL5	Chemokine(C-X-C motif) ligand 5	0.432597
NM_003004	SECTM1	Secreted and transmembrane 1	0.464917
NM_003811	TNFSF9	Tumor necrosis factor(ligand) superfamily, member 9	0.356923
NM_007115	TNFAIP6	Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6	0.420323
NM_007329	DMBT1	Deleted in malignant brain tumors 1	0.473838
NM_014002	IKBKE	Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase epsilon	0.338014
NM_015254	KIF13B	Kinesin family member 13B	0.46456
NM_015259	ICOSLG	Inducible T-cell co-stimulator ligand	0.179785
NM_030754	SAA2	Serum amyloid A2	0.28334
NM_145641	APOL3	Apolipoprotein L, 3	0.426904
NM_153443	KIR3DL1	Killer cell immunoglobulin-like receptor, three domains, long cytoplasmic tail, 1	0.464448
NM_172220	CSF3	Colony stimulating factor 3(granulocyte)	0.321243
NM_212482	FN1	Fibronectin 1	0.35946
U52682	IRF4	Interferon regulatory factor 4	0.477867
U81234	CXCL6	Chemokine(C-X-C motif) ligand 6(granulocyte chemotactic protein 2)	0.279764
X03663	CSF1R	Colony stimulating factor 1 receptor, formerly McDonough feline sarcoma viral(v-fms) oncogene homolog	0.491888
6. 이온 수송( ion transport )
AB032995	TPCN1	Two pore segment channel 1	0.456192
AF225988	SCN8A	Sodium channel, voltage gated, type VIII, alpha	0.495297
AK091926	SLC13A2	Solute carrier family 13(sodium-dependent dicarboxylate transporter), member 2	0.478773
AY358424	C1QTNF1	C1q and tumor necrosis factor related protein 1	0.367293
BC021552	CACNG6	Calcium channel, voltage-dependent, gamma subunit 6	0.452338
BC098390	SLC12A7	Solute carrier family 12(potassium/chloride transporters), member 7	0.341166
BX537444	ATP2B4	ATPase, Ca++ transporting, plasma membrane 4	0.460825
NM_000393	COL5A2	Collagen, type V, alpha 2	0.139148
NM_001426	EN1	Engrailed homolog 1	0.46928
NM_001845	COL4A1	Collagen, type IV, alpha 1	0.482467
NM_001848	COL6A1	Collagen, type VI, alpha 1	0.269869
NM_001850	COL8A1	Collagen, type VIII, alpha 1	0.339945
NM_004370	COL12A1	Collagen, type XII, alpha 1	0.438416
NM_005929	MFI2	Antigen p97(melanoma associated) identified by monoclonal antibodies 133.2 and 96.5	0.388677
NM_006045	ATP9A	ATPase, Class II, type 9A	0.471922
NM_006514	SCN10A	Sodium channel, voltage-gated, type X, alpha	0.363017
NM_033380	COL4A5	Collagen, type IV, alpha 5(Alport syndrome)	0.449827
NM_052892	PKD1L2	Polycystic kidney disease 1-like 2	0.401605
NM_144579	SFXN5	Sideroflexin 5	0.43044
NM_153320	SLC22A7	Solute carrier family 22(organic anion transporter), member 7	0.417303
NM_198056	SCN5A	Sodium channel, voltage-gated, type V, alpha(long QT syndrome 3)	0.332343
NM_203327	SLC23A2	Solute carrier family 23(nucleobase transporters), member 2	0.47014
NM_213621	HTR3A	5-hydroxytryptamine(serotonin) receptor 3A	0.294901
Z74615	COL1A1	Collagen, type I, alpha 1	0.461826
7. 세포자살( apoptosis )
AF545571	SULF1	Sulfatase 1	0.360979
AK098095	BRAF	V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1	0.422475
BC008678	IL1B	Interleukin 1, beta	0.393366
BC013780	ADORA2A	Adenosine A2a receptor	0.471238
BC028148	TNF	Tumor necrosis factor(TNF superfamily, member 2)	0.473784
BC052977	TNFRSF1B	Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B	0.418911
BG284742	P8	P8 protein(candidate of metastasis 1)	0.466431
CR614015	CD14	CD14 antigen	0.499567
D79987	ESPL1	Extra spindle poles like 1(S. cerevisiae)	0.463569
NM_000514	GDNF	Glial cell derived neurotrophic factor	0.451455
NM_000575	IL1A	Interleukin 1, alpha	0.361611
NM_000600	IL6	Interleukin 6(interferon, beta 2)	0.424519
NM_001003940	BMF	Bcl2 modifying factor	0.475556
NM_001165	BIRC3	Baculoviral IAP repeat-containing 3	0.451681
NM_002982	CCL2	Chemokine(C-C motif) ligand 2	0.211062
NM_003811	TNFSF9	Tumor necrosis factor(ligand) superfamily, member 9	0.356923
NM_003955	SOCS3	Suppressor of cytokine signaling 3	0.472433
NM_005427	TP73	Tumor protein p73	0.461904
NM_006290	TNFAIP3	Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3	0.442261
NM_007313	ABL1	V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1	0.24919
NM_139314	ANGPTL4	Angiopoietin-like 4	0.437459
NM_147780	CTSB	Cathepsin B	0.476026
8. 혈관신생( angiogenesis )
AK024680		CDNA: FLJ21027 fis, clone CAE07110	0.495956
AL833606	NRP2	Neuropilin 2	0.421126
NM_002825	PTN	Pleiotrophin(heparin binding growth factor 8, neurite growth-promoting factor 1)	0.487819
NM_003873	NRP1	Neuropilin 1	0.435039
NM_006291	TNFAIP2	Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2	0.484915
U38320	MMP19	Matrix metallopeptidase 19	0.477695

< 실시예 3> 실시간 RT - PCR ( Real - time reverse transcriptase polymerase chain reaction ) 정량

니트로푸란토인에 의해 발현 유도된 상기 실시예 2의 과발현 및 저발현된 유전자 중 니트로푸란토인에 의해 주로 야기되는 폐독성 관련 기전으로 JAK-STAT, TGF-β, MAPK 관련 유전자 18종을 선별하였다. 이들 유전자들은 유전자등록번호(Genebank) NM_053056(Cyclin D1), 유전자등록번호(Genebank) BC069137[Interleukin 5(colony-stimulating factor, eosinophil)], 유전자등록번호(Genebank) NM_003629[Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3(p55, gamma)], 유전자등록번호(Genebank) NM_003955(Suppressor of cytokine signaling 3), 유전자등록번호(Genebank) NM_002309(Hypothetical protein MGC20647), 유전자등록번호(Genebank) NM_172220[Colony stimulating factor 3(granulocyte)], 유전자등록번호(Genebank) AA995107[Transcribed locus, moderately similar to XP_517807.1 PREDICTED: interleukin 7 receptor(Pan troglodytes)], 유전자등록번호(Genebank) CR618407(Bone morphogenetic protein 2), 유전자등록번호(Genebank) U68019[SMAD, mothers against DPP homolog 3(Drosophila)], 유전자등록번호(Genebank) BM906235(Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자등록번호(Genebank) NM_006597(Heat shock 70kDa protein 8), 유전자등록번호(Genebank) NM_004465(Fibroblast growth factor 10), 유전자등록번호(Genebank) CR614015(CD14 antigen), 유전자등록번호(Genebank) BC021552(Calcium channel, voltage-dependent, gamma subunit 6), 유전자등록번호(Genebank) AK098095(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1), 유전자등록번호(Genebank) BC008678(Interleukin 1, beta), 유전자등록번호(Genebank) NM_000575(Interleukin 1, alpha), 유전자등록번호(Genebank) NM_000944[Protein phosphatase 3(formerly 2B), catalytic subunit, alpha isoform(calcineurin A alpha)]이다.

상기 유전자들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 0.2 ㎕와 물 3.8 ㎕, 센스 프라이머 0.5 ㎕, 안티센스 프라이머 0.5 ㎕, 사이버그린 I 염색 수퍼믹스(Bio-rad, USA) 5 ㎕ 를 혼합하여, PCR 튜브에 담아 단계 1: 95℃, 3분; 단계 2(45회 반복): 단계 2-1: 95℃, 10초; 단계 2-2: 55 내지 65℃ 45초; 단계 3: 95℃, 1분; 단계 4: 55℃, 1분; 단계 5(반복 80회): 55℃, 10초로 프로그램을 설계한 My IQ 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색(Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 4 참조)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다(표 5 참조).

프라이머 서열

등록번호	유전자명	PCR 프라이머 서열 (5'->3')
NM_053056	Cyclin D1	센스 (서열번호 1)	ACGAAGGTCTGCGCGTGTT
		안티센스 (서열번호 2)	CCGCTGGCCATGAACTACCT
BC069137	Interleukin 5(colony-stimulating factor, eosinophil)	센스 (서열번호 3)	GGCACTGCTTTCTACTCATCGA
		안티센스 (서열번호 4)	AGTTGGTGATTTTTATGTACAGGAACA
NM_003629	Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3(p55, gamma)	센스 (서열번호 5)	AGGAATCTTCTGCTCCATGTGGCT
		안티센스 (서열번호 6)	AAACAGCTGACTCACTCTGAGCCT
NM_003955	Suppressor of cytokine signaling 3	센스 (서열번호 7)	TTCCAAAGTCTACCTGGTGCCTGA
		안티센스 (서열번호 8)	TGAAAGATGTCCCGTCTCCTCCAT
NM_002309	Hypothetical protein MGC20647	센스 (서열번호 9)	TATCACCATCTGTGCCTTTGCTGC
		안티센스 (서열번호 10)	TCTGCCAGATTGTTCCTATGCCCA
NM_172220	Colony stimulating factor 3 (granulocyte)	센스 (서열번호 11)	GGACATGGTTTGACTCCCGAACAT
		안티센스 (서열번호 12)	ACACACAGGCCTGACATGATTCCT
AA995107	interleukin 7 receptor [Pan troglodytes]	센스 (서열번호 13)	TTGCTCAGGGTCAGCCCATTCTTA
		안티센스 (서열번호 14)	TGTCGCTCACGGTAAGTTCAGTCT
CR618407	Bone morphogenetic protein 2	센스 (서열번호 15)	TCACCTCAGCAGAGCTTCAGGTTT
		안티센스 (서열번호 16)	ACTTTCCCACCTGCTTGCATTCTG
U68019	SMAD, mothers against DPP homolog 3(Drosophila)	센스 (서열번호 17)	AGTGCTGGTGACTGGATAGCAGTT
		안티센스 (서열번호 18)	GCACAAGCTGCAAGGTGAAGATGT
BM906235	Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein	센스 (서열번호 19)	TCAGCTTAGCCAGGTGGAAATC
		안티센스 (서열번호 20)	TGGCTCGGCCAGGACTAC
NM_006597	Heat shock 70kDa protein 8	센스 (서열번호 21)	TCCAAGGGACCTGCAGTTGGTATT
		안티센스 (서열번호 22)	ACTTGATTCTTTGCGGCATCACCG
NM_004465	Fibroblast growth factor 10	센스 (서열번호 23)	CATTGTGCCTCAGCCTTTC
		안티센스 (서열번호 24)	TCCATTTTCCTCTATCCTCTCC
CR614015	CD14 antigen	센스 (서열번호 25)	GAATGGACTCAAACTGCCTTGGCT
		안티센스 (서열번호 26)	GGGCAAAGGGTTGAATTGGTCGAA
BC021552	Calcium channel, voltage-dependent, gamma subunit 6	센스 (서열번호 27)	TCTGTGGCTGTATGTGGGTTGCTT
		안티센스 (서열번호 28)	AGTGAATCGATCCAGACCTGGGAA
AK098095	V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1	센스 (서열번호 29)	TTTCCAGGGTTTCCGCTGTCAAAC
		안티센스 (서열번호 30)	TCCTGTGGTATTGGGTGGTGTTCA
BC008678	Interleukin 1, beta	센스 (서열번호 31)	TCCCCAGCCCTTTTGTTGA
		안티센스 (서열번호 32)	TTAGAACCAAATGTGGCCGTG
NM_000575	Interleukin 1, alpha	센스 (서열번호 33)	AGGCATCCTCCACAATAGCAGACA
		안티센스 (서열번호 34)	TCGGACCAATTACTGGCTCAAGGT
NM_000944	Protein phosphatase 3(formerly 2B), catalytic subunit, alpha isoform(calcineurin A alpha)	센스 (서열번호 35)	TTGATGCGCCAGTCACTGTTTGTG
		안티센스 (서열번호 36)	AAGAAGAGGTAGCGAGTGTTGGCA

등록번호	유전자명	실시간 PCR (상대적 배율)	cDNA 마이크로어레이 ( Cy3 / Cy5 비율)
NM_006597	Heat shock 70kDa protein 8	1.763	2.205
NM_053056	Cyclin D1	1.765	2.114
BC069137	Interleukin 5(colony-stimulating factor, eosinophil)	1.862	2.034
NM_004465	Fibroblast growth factor 10	1.578	2.018
U68019	SMAD, mothers against DPP homolog 3(Drosophila)	0.468	0.500
CR614015	CD14 antigen	0.509	0.500
CR618407	Bone morphogenetic protein 2	0.375	0.492
BM906235	Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein	0.475	0.485
NM_003629	Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3(p55, gamma)	0.552	0.473
NM_003955	Suppressor of cytokine signaling 3	0.601	0.472
BC021552	Calcium channel, voltage-dependent, gamma subunit 6	0.533	0.452
AK098095	V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1	0.345	0.422
NM_002309	Hypothetical protein MGC20647	0.522	0.415
BC008678	Interleukin 1, beta	0.546	0.393
NM_000575	Interleukin 1, alpha	0.265	0.362
NM_172220	Colony stimulating factor 3(granulocyte)	0.291	0.321
AA995107	interleukin 7 receptor [Pan troglodytes]	0.347	0.292
NM_000944	Protein phosphatase 3(formerly 2B), catalytic subunit, alpha isoform(calcineurin A alpha)	0.402	0.229

그 결과, 4종의 과발현 유전자들과 14종의 저발현 유전자들의 유전자 발현 양상은 폐독성 유발 약물들에 의한 유전자 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다.

도 1은 니트로푸란토인의 인간 기관지 상피 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이고,

도 2는 마이크로어레이 칩을 이용한 니트로푸란토인을 처리한 인간 기관지 상피 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Marker genes based on nitrofurantoin treatment for screening of drug inducing pulmonary toxicity and screening method using thereof <130> 7p-12-28 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclin D1 sense primer <400> 1 acgaaggtct gcgcgtgtt 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclin D1 antisense primer <400> 2 ccgctggcca tgaactacct 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin 5 sense primer <400> 3 ggcactgctt tctactcatc ga 22 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin 5 antisense primer <400> 4 agttggtgat ttttatgtac aggaaca 27 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 sense primer <400> 5 aggaatcttc tgctccatgt ggct 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 antisense primer <400> 6 aaacagctga ctcactctga gcct 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Suppressor of cytokine signaling 3 sense primer <400> 7 ttccaaagtc tacctggtgc ctga 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Suppressor of cytokine signaling 3 antisense primer <400> 8 tgaaagatgt cccgtctcct ccat 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hypothetical protein MGC20647 sense primer <400> 9 tatcaccatc tgtgcctttg ctgc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hypothetical protein MGC20647 antisense primer <400> 10 tctgccagat tgttcctatg ccca 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Colony stimulating factor 3 sense primer <400> 11 ggacatggtt tgactcccga acat 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Colony stimulating factor 3 antisense primer <400> 12 acacacaggc ctgacatgat tcct 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 7 receptor sense primer <400> 13 ttgctcaggg tcagcccatt ctta 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 7 receptor antisense primer <400> 14 tgtcgctcac ggtaagttca gtct 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bone morphogenetic protein 2 sense primer <400> 15 tcacctcagc agagcttcag gttt 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bone morphogenetic protein 2 antisense primer <400> 16 actttcccac ctgcttgcat tctg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMAD, mothers against DPP homolog 3 sense primer <400> 17 agtgctggtg actggatagc agtt 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMAD, mothers against DPP homolog 3 antisense primer <400> 18 gcacaagctg caaggtgaag atgt 24 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein sense primer <400> 19 tcagcttagc caggtggaaa tc 22 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein antisense primer <400> 20 tggctcggcc aggactac 18 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heat shock 70kDa protein 8 sense primer <400> 21 tccaagggac ctgcagttgg tatt 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heat shock 70kDa protein 8 antisense primer <400> 22 acttgattct ttgcggcatc accg 24 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibroblast growth factor 10 sense primer <400> 23 cattgtgcct cagcctttc 19 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibroblast growth factor 10 antisense primer <400> 24 tccattttcc tctatcctct cc 22 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD14 antigen sense primer <400> 25 gaatggactc aaactgcctt ggct 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD14 antigen antisense primer <400> 26 gggcaaaggg ttgaattggt cgaa 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Calcium channel, voltage-dependent, gamma subunit 6 sense primer <400> 27 tctgtggctg tatgtgggtt gctt 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Calcium channel, voltage-dependent, gamma subunit 6 antisense primer <400> 28 agtgaatcga tccagacctg ggaa 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 sense primer <400> 29 tttccagggt ttccgctgtc aaac 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 antisense primer <400> 30 tcctgtggta ttgggtggtg ttca 24 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin 1, beta sense primer <400> 31 tccccagccc ttttgttga 19 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin 1, beta antisense primer <400> 32 ttagaaccaa atgtggccgt g 21 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin 1, alpha sense primer <400> 33 aggcatcctc cacaatagca gaca 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin 1, alpha antisense primer <400> 34 tcggaccaat tactggctca aggt 24 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein phosphatase 3(formerly 2B), catalytic subunit, alpha isoform sense primer <400> 35 ttgatgcgcc agtcactgtt tgtg 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein phosphatase 3(formerly 2B), catalytic subunit, alpha isoform antisense primer <400> 36 aagaagaggt agcgagtgtt ggca 24

Claims

하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 니트로푸란토인 처리에 대한 JAK-STAT 신호경로(signaling pathway) 관련 기능을 갖는 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:

유전자등록번호(Genebank) NM_053056(Cyclin D1), 유전자등록번호(Genebank) BC069137[Interleukin 5 (colony-stimulating factor, eosinophil), 유전자등록번호(Genebank) NM_003629[Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 (p55, gamma)], 유전자등록번호(Genebank) NM_003955(Suppressor of cytokine signaling 3), 유전자등록번호(Genebank) NM_002309(Hypothetical protein MGC20647), 유전자등록번호(Genebank) NM_172220[Colony stimulating factor 3 (granulocyte)], 유전자등록번호(Genebank) AA995107[Transcribed locus, moderately similar to XP_517807.1 PREDICTED: interleukin 7 receptor (Pan troglodytes)].
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1) 인간 기관지 세포 또는 폐 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;

3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;

5) 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및

6) 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 니트로푸란토인 처리에 대한 JAK-STAT 신호경로(signaling pathway) 관련 기능을 갖는 유전자 발현 여부 확인 방법.
제 6항에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 세포는 인간 기관지 상피 세포인 BEAS-2B 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
1) 인간 기관지 세포 또는 폐 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;

3) 단계 2)의 RNA를, 제 1항의 마이크로어레이칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 18머 내지 30머 길이의 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 니트로푸란토인 처리에 대한 JAK-STAT 신호경로(signaling pathway) 관련 기능을 갖는 유전자 발현 여부 확인 방법.
제 9항에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 세포는 인간 기관지 상피 세포인 BEAS-2B 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는, 니트로푸란토인 처리에 대한 JAK-STAT 신호경로(signaling pathway) 관련 기능을 갖는 유전자 발현 여부 확인용 키트.
제 11항에 있어서, BEAS-2B 세포, 인간 기관지 세포 또는 폐 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 11항에 있어서, 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin- like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 11항에 있어서, 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 18머 내지 30머 길이의 프라이머쌍을 포함하는, 니트로푸란토인 처리에 대한 JAK-STAT 신호경로(signaling pathway) 관련 기능을 갖는 유전자 발현 여부 확인용 키트.
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