KR100708593B1 - 발육란 생산성이 우수한 저병원성 ｈ９ｎ２ 아형 조류인플루엔자 바이러스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조류인플루엔자에 대한 백신으로 사용될 수 있는 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스 (Low Pathogenic Avian Influenza Virus, LPAIV)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 계태아에 높은 병원성을 보여 바이러스 생산성이 낮은 야외 바이러스를 수회 계대하여 얻은 발육란 고생산성 조류 인플루엔자 바이러스, 상기 바이러스의 고생산성 관련 유전형질 및 이의 조류 인플루엔자 백신으로서의 용도 또는 생산성 향상을 위해 다른 인플루엔자 바이러스와의 유전자 재배열을 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 발육란 고생산성 바이러스는 조류 인플루엔자의 효과적인 백신으로 유용하게 이용될 수 있으며, 고생산성과 관련된 유전형질은 계태아에서 생산성이 낮은 동물 및 인체 인플루엔자 백신 바이러스의 생산성 향상에 유용하게 이용될 수 있다.

조류인플루엔자바이러스, H9N2 아형, 적혈구응집단백질 (Hemagglutinin, HA), 뉴라미니다제 (Neuraminidase, NA), 발육란 고생산성

Description

발육란 생산성이 우수한 저병원성 Ｈ９Ｎ２ 아형 조류 인플루엔자 바이러스{LOW PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA H9N2 SUBTYPE VIRUS HIGHLY PRODUCTIVE IN CHICKEN EMBRYO}

도 1은 조류 인플루엔자 바이러스 균주의 뉴라미니다제 (Neuraminidase, NA) 목부위 아미노산 결손을 비교한 결과이다.

도 2는 계태아에서의 계대 과정 중 뉴라미니다제 (Neuraminidase, NA) 목 부위 아미노산이 결손된 바이러스가 선발되는 과정을 RT-PCR 법으로 검사한 결과이다.

본 발명은 조류인플루엔자에 대한 백신으로 사용될 수 있는 발육란 고생산성의 H9N2 아형 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 (Low Pathogenic Avian Influenza Virus, LPAIV)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 계태아에 높은 병원성을 보여 바이러스 생산성이 낮은 야외 바이러스를 수회 계대하여 얻은 발육란 고생산성 조류 인플루엔자 바이러스; 상기 바이러스의 고생산성 관련 유전형질; 및 이의 조류 인플루엔자 백신으로서의 용도 또는 생산성 향상을 위해 다른 인플루엔자 바 이러스와의 유전자 재배열을 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 발육란 고생산성 바이러스는 조류 인플루엔자의 효과적인 백신으로 유용하게 이용될 수 있으며, 고생산성과 관련된 유전형질은 계태아에서 생산성이 낮은 동물 및 인체 인플루엔자 백신 바이러스의 생산성 향상에 유용하게 이용될 수 있다는 장점을 갖는다.

인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스에 속하며, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스로서, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 혈구응집 단백질 (hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제 (neuraminidase, NA), 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleoprotein; NP), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M₁, M₂), 중합효소 단위체 A, B1 및 B2 (polymerase subunit A, B1 & B2; 각각 PA, PB1, PB2), 및 비구조 단백질 1 및 2 (nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다.

H9N2 아형(subtype) 조류 인플루엔자는 가금에서 미약한 호흡기와 소화기 증상을 초래하여 병원성이 낮은 것으로 생각되고 있으나, 산란계의 경우 10 내지 40%의 산란율 저하를 초래하고, 전염성 코라이자 및 황색 포도상 구균 (Kishida et al., 2004, Arch Virol., 149:2095-2104) 또는 대장균증 (Bano et al., 2003, Avian Dis, 47:817-822) 등 합병증이 동반되는 경우 폐사도 초래하는 것으로 알려지면서, 경제적인 중요성이 밝혀지고 있다. 또한, 1999년 중국 홍콩의 유아들로부터 H9N2 아형 인플루엔자 바이러스가 분리되어 인체 감염의 가능성이 확인되면서, 공중 보건학적으로 잠재적인 위험 요인으로 간주 되고 있다 (Peiris et al., 1999, The LANCET, 354:916-917).

H9N2 아형 저병원성 조류 인플루엔자 (LPAI)는 1990년대 들어 전 세계적인 발생양상을 보여, 중국에서는 1992년부터 계군에서 가장 빈번하게 보고 되기 시작하였고 (Liu et al., 2003, Virus Genes, 27:197-202), 국내에서는 1996년 최초 보고 되었으며 (Mo et al., 1997, Proceedings of the 4th International Symposium on Avian Influenza, 379-383), 유럽(1994-1998), 아프리카 (1995), 미국 (1995, 1996), 중동 국가 (1998-2001), 파키스탄(1999) 등에서도 보고 되었다 (Banks et al., 2000, Avian Pathol, 29:353-360).

H9 아형의 바이러스들은 HA 유전자의 염기서열에 따라 크게 세 개의 계통으로 분류되는데, 첫 번째는 주로 북미에서 분리된 H9 아형의 바이러스와 유럽 분리주이며, 두 번째는 한국 분리주, 유럽 분리주 및 홍콩 분리주이고, 세 번째는 중동 분리주, 인도-파키스탄 분리, 중국 분리주 및 독일 분리주이다 (Banks et al., 2000, Avian Pathol, 29:353-360).

중국은 인플루엔자 바이러스의 진앙지 (epicenter)로 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 경우 인체 감염 예에서 분리된 바이러스를 포함하는 G1 계열의 바이러스, 인체 및 돼지 유래 바이러스들을 포함하며 항원 및 계통 분류학적으로 G1 계열 바이러스들과 뚜렷한 차이를 보이는 G9 계열의 바이러스들이 가금 바이러스의 주류를 이루며, 국내에서 분리되는 바이러스들과 계통 분류학상으로 유사한 바이러스도 존재하는 것으로 알려져 있다. 이 중, G1 계열의 바이러스들은 계태아 증식성이 우수하여 백신 개발에 어려움이 없으나, G9 계열 바이러스들의 경우에는 계태아 증식성이 낮아 백신 개발의 어려움이 있다 (Chen et al., 2003, Vaccine, 21:1974-1979).

현재 인체 인플루엔자 A 백신은 계태아 증식성이 탁월한 재배열 주를 포르말린으로 불활성화 하여 HA와 NA만을 정제한 단위 백신으로, 항원 생산성 향상을 위해 최신 유행하는 인체 인플루엔자 바이러스와 발육란 증식성이 탁월한 것으로 알려진 A/Puerto Rico/8/34 (PR8)을 혼합 감염시켜 증식성이 탁월하나, 최근 바이러스의 HA와 NA를 갖는 재배열 주를 선발하여 백신 생산에 사용하고 있다(Kilbourne E.D., Future influenza vaccines and the use of genetic recombinants. Bull. World Health Organ 1969. 41:643 ).

인플루엔자 바이러스의 증식성은 HA와 NA 활성의 조화가 중요한 것으로 알려져 있는데, HA의 수용기 결합 부위 가까이에 있는 158번 (H3 numbering) 아스파라긴에 당이 결합되는 경우 수용기 결합력이 낮아져 바이러스 감염속도가 저하되는 것으로 알려져 있으며, NA의 목 부분의 길이가 줄어드는 경우 뉴라미니다제 분해효소 기능이 저하되어 감염 세포로부터 출아(budding)가 늦어져 바이러스의 증식성이 저하되는 것으로 알려져 있다 (Mitnaul 등, 2000 Journal of Virology 74:6015-6020). 일반적으로 발육란(계태아)에서의 바이러스 생산성은 세포배양과는 달리, 병원성이 높은 바이러스의 경우 계태아의 폐사를 초래하므로 요막강 내 바이러스 역가는 낮으며, 계태아의 조기 폐사로 인해 수확되는 요막액의 양이 줄어들어 바이러스 생산성이 감소하는 것으로 알려져 있다.

국내 조류 인플루엔자는 주로 저병원성 H9N2 아형의 바이러스에 의한 저병원성 조류인플루엔자로 1996년 최초 발생이후 발생이 없다가 1999년 발생 이후부터 2004년 까지 매년 발생하고 있으며, 그 빈도는 20-30% 정도로 국내 계군에 만연해 있으며, 외국의 경우처럼 산란율 저하 및 폐사로 경제적인 피해를 초래하고 있다 (Lee et al., 2000, Avian Dis, 44:527-535). 1996년 및 최근에 분리된 H9N2 바이러스들은 계태아 증식성이 낮아 (이 등., 1998, 서울대학교 대학원 석사학위논문) 불활화 백신 제조시 적게는 10배에서 많게는 100배를 농축하여야만 효과를 얻을 수 있는 것으로 생각되고 있다.

이에, 본 발명자들은 국내 저병원성 조류 인플루엔자의 주요 유전형으로서 발육 계태아에 대해서도 병원성이 낮은 동시에 높은 증식성을 보이고, 포유류에 안전한 백신 후보주를 선발하였고, 생산성 향상 및 안전성과 관계있는 고유한 유전형질을 확인하였으며, 백신 생산성을 높이기 위한 최적의 항원 생산법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 국내 저병원성 조류 인플루엔자의 주요 원인 바이러스로 병원성이 낮아 안전하고, 계태아(발육란)에서의 증식성이 탁월한 백신 후보 바이러스, 상기 바이러스의 생산성 향상과 관련된 고유한 유전형질 및 백신 생산성을 높이기 위한 최적의 항원 생산법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 최근 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스로부터 계태아 계대를 통해 선발된 계태아 병원성이 없고, 증식성이 탁월한 백신 후보주, 그의 게놈 유전자 염기서열, 고생산성 관련 유전형질 및 최적의 백신 생산법을 제공한다.

상기한 바와 같이, 본 발명자들은 국내 가금에서 문제를 일으키는 H9N2 아형에 의한 저병원성 조류 인플루엔자와 인체 독감 백신으로 사용할 수 있을 정도로 계태아(발육란)에서의 생산성이 탁월하고, 현재 유행하는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스들과 항원성이 유사하며, 마우스 등의 포유류에 대한 병원성이 낮은 조류 인플루엔자 백신주를 개발하기 위한 연구를 거듭하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 계태아에서의 증식성이 뛰어나고 병원성이 낮아 조류 인플루엔자 및 인체 인플루엔자에 대한 백신으로 사용될 수 있는 신규한 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스 (Low Pathogenic Avian Influenza virus, LPAIV), 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 조류 인플루엔자 백신을 제공한다.

본 명세서에 있어서의 모든 아미노산 서열의 아미노산 번호는 H3 numbering에 따른다.

본 발명은 게놈 유전자가 매트릭스 단백질 2 (M2, 서열번호 2)의 코딩 서열, 매트릭스 단백질 1 (M1, 서열번호 4)의 코딩 서열, 비구조단백질 2 (NS2, 서열번호 6)의 코딩 서열, 비구조단백질 1 (NS1, 서열번호 8)의 코딩 서열, 중합효소 A (PA, 서열번호 10)의 코딩 서열, 적혈구응집 단백질 아형 9 (HA9, 서열번호 12)의 코딩 서열, 뉴라미니다제 아형 2 (NA2, 서열번호 14)의 코딩 서열, 뉴클레오캡시드 단백질 (NP, 서열번호 16)의 코딩 서열, 중합효소 B1 (PB1, 서열번호 18)의 코딩 서열 및 중합효소 B2 (PB2, 서열번호 20)의 코딩 서열을 갖는 것이고, 계태아 증식성 이 우수하고 병원성이 낮은 신규한 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에 있어서, 상기 매트릭스 단백질 2 (M2)의 코딩 서열은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 매트릭스 단백질 1 (M1)의 코딩 서열은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 비구조단백질 2 (NS2)의 코딩 서열은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 비구조단백질 1 (NS1)의 코딩 서열은 서열번호 7의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 중합효소 A (PA)의 코딩 서열은 서열번호 9의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 적혈구응집 단백질 아형 9 (HA9)의 코딩 서열은 서열번호 11의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 뉴라미니다제 아형 2 (NA2)의 코딩 서열은 서열번호 13의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 뉴클레오캡시드 단백질 (NP)의 코딩 서열은 서열번호 15의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 중합효소 B1 (PB1)의 코딩 서열은 서열번호 17의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 중합효소 B2 (PB2)의 코딩 서열은 서열번호 19의 염리서열을 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스는 본 명세서에서 KBNP-0028이라고 명명된 것이 수 있다 (기탁번호: KCTC 10866BP).

다른 측면에 있어서, 본 발명은 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스인 SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/2000 (H9N2)] 세포주를 SPF (specific pathogen free) 계태아의 요막강에 접종하여 배양하고, 배양 3일 이후에 생존하는 계태아의 요막액을 수집하여 종란에 접종하는 단계를 15회 내지 19회 반복하여 계대배양하는 것을 포함하는 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 방법에 의하여 생산되고, 게놈 유전자가 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질(AAV52598)의 158번째(H3 numbering) 아미노산 위치에 당결합이 존재하는 HA 단백질 코딩 서열과 야생형 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 NA 단백질(ABC75113)의 64번부터 79번까지의 16개의 아미노산 결손을 갖는 변형된 NA 단백질 코딩 서열을 갖는 것인 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명에 따른 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스를 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스용 백신을 제공한다. 본 발명의 백신은 닭과 오리 등의 조류 뿐 아니라 인간과 마우스 등을 포함하는 포유류에도 적용 가능하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 환자로부터 분리한 혈액 시료와 본 발명에 따른 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 키트를 제공한다. 상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 얻어진 것일 수 있으며, 상기 환자는 조류 또는 포유류일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

국내 저병원성 조류 인플루엔자를 예방하기 위한 백신주를 개발하기 위하여, 2000년 국내 야외에서 분리한 SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/2000 (H9N2)] 세포주를 10 내지 11일령 SPF (specific pathogen free) 계태아의 요막강에 접종하여 배양한다. 상기 SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/00(H9N2)]은 폐사 및 산란저하를 보이는 육용종계로부터 분리된 H9N2 아형의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스이다. 배양 후, 3 일 이내에 폐사가 일어난 계태아는 폐기하였으며, 3일까지 폐사가 일어나지 않는 계태아의 요막액만을 수확하여 그 양과 혈구응집역가를 측정하여 가장 성적이 좋은 재료를 희석하여 종란에 접종하는 방식으로 15 내지 19 회, 바람직하게는 19회에 걸쳐서 계대배양을 반복하여, 병원성이 거의 없고, 생산성이 탁월한 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스를 얻을 수 있다.

본 발명에서 얻어진 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스는 게놈 유전자가 매트릭스 단백질 2 (M2, 서열번호 2), 매트릭스 단백질 1 (M1, 서열번호 4), 비구조단백질 2 (NS2, 서열번호 6), 비구조단백질 1 (NS1, 서열번호 8), 중합효소 A (PA, 서열번호 10), 적혈구응집 단백질 아형 9 (HA9, 서열번호 12), 뉴라미니다제 아형 2 (NA2, 서열번호 14), 뉴클레오캡시드 단백질 (NP, 서열번호 16), 중합효소 B1 (PB1, 서열번호 18) 및 중합효소 B2 (PB2, 서열번호 20)의 코딩 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 한 구체예에 있어서, 상기와 같은 방법으로 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바 이러스를 분리하여, 이를 KBNP-0028이라 명명하였으며, 대한민국 대전시 유성구 어은동에 위치하는 유전자 은행에 2005년 10월 26일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 10866BP를 부여 받았다.

본 발명의 발육란 고생산성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 계태아 생산성을 알아보기 위하여, 본 발명에서 분리된 상기 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스와 인체 인플루엔자 백신주 개량에 널리 사용되고 있는 A/Puer Torico/PR8/34 주를 발생란에 각각 접종한 후, 각 발생란 당 총 혈구응집역가를 측정한 결과, 본 발명의 발육란 고생산성 바이러스 접종된 발육란은 개당 혈구응집역가가 536,029 (HAU/종란)인데 비해 A/Puer Torico/PR8/34가 접종된 경우에는 503,808 (HAU/종란)인 것으로 나타나, 본 발명의 발육란 고생산성 바이러스가 우월한 생산성을 보이는 것을 알 수 있다 (표 1 참조).

본 발명의 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 계태아 병원성을 알아보기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 본 발명의 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스와 모균주인 SNU0028를 SPF 발육란에 2대 계대한 KBNP-0028(E2)를 비교한 결과, 본 발명의 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스는 10%의 계태아 폐사율을 보인 반면, KBNP-0028(E2)는 30%의 폐사율을 보여, 본 발명의 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스가 모균주에 비해 폐사율이 낮아진 것을 확인할 수 있다 (표 2 참조).

본 발명의 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스 균주로부터 RNA를 추출하고, 이를 RT-PCR한 후 8개 유전자 분절의 암호화 부위 의 염기서열을 동정하여, 상기 바이러스의 게놈 유전자 구조를 결정하였다. 상기 결과에 따르면, 본 발명의 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 게놈 유전자는 서열번호 2의 매트릭스단백질 2 (M2)의 코딩 서열, 서열번호 2의 매트릭스 단백질 4 (M1)의 코딩 서열, 서열번호 6의 비구조단백질 2 (NS2)의 코딩 서열, 서열번호 8의 비구조단백질 1 (NS1)의 코딩 서열, 서열번호 10의 중합효소 A (PA)의 코딩 서열, 서열번호 12의 적혈구응집 단백질 아형 9 (HA9)의 코딩 서열, 서열번호 14의 뉴라미니다제 아형 2 (NA2)의 코딩 서열, 코딩서열 8의 뉴클레오캡시드 단백질 (NP)의 코딩 서열, 서열번호 18의 중합효소 B1 (PB1)의 코딩 서열 및 서열번호 20의 중합효소 B2 (PB2)의 코딩서열을 가지며, 바람직하게는, 상기 서열은 각각 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스에서 발현되는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20의 단백질을 기존의 외국 조류 인플루엔자 바이러스 균주의 단백질과 비교하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 서열번호 12의 HA 단백질의 단백분해 효소 인식부위의 아미노산 서열은 96년 분리주인 A/chicken/Korea/ms96/1996 및 A/chicken/Korea/96323/1996의 경우 ₃₂₀PAASYR/GL₃₂₆이었으나, 본 발명의 경우에는 324번 Tyr이 Gly으로 변해 차이를 보였으나, 저병원성 조류 인플루엔자로 분류되었다. 혈구응집 단백질의 수용기 결합 부위 가까이에 위치하는 158번 (H3 numbering) 위치에 아스파라긴이 존재하면 여기에 당이 결합하게 되어, 수용기 결합력이 저하되고 세포 감염성이 저하된다. 대부분의 국내 1996년 분리주 및 최근 분리주들은 상기 위치에 아스파라긴이 아닌 당 결합이 일어나지 않는 아미노산 서열을 가지고 있었으나, A/Chicken/Korea/ms96 /1996과 본 발명의 경우에는 당 결합이 일어날 수 있는 아미노산 서열 (아스파라긴-아스파라긴-세린)을 가지고 있는 것으로 나타났다 (표 5 참조). 전체 HA 단백질의 아미노산 서열을 외국 및 국내 바이러스들과 비교한 결과, 외국 주들과는 87 내지 92%의 유사성을 보였으나 최근 국내 주들과는 96%의 유사성을 보였다 (표 6 참조).

본 발명의 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 NA 단백질은 그 야생형(ABC75113)의 목부위 코딩 서열서 48개의 뉴클레오티드가 결손되어 16개 아미노산의 결손이 일어나, 뉴라미니다제의 목 부위가 짧아진 돌연변이가 관찰된다. 뉴라미니다제 목 부위에서의 뉴클레오티드 결손에 의한 2개 (38-39), 3개 (63-65), 25개 (57-81) 등의 아미노산 결손은 알려져 있으나, 본 발명에서와 같이 16개 (64-79) 아미노산이 결손된 것은 보고된 바가 없다 (도 1 참조). 기존에 알려진 뉴라미니다제 목 부위에 2 개 또는 3 개의 아미노산 결손을 갖는 경우에는 뉴라미니다제의 기능에 아무런 영향을 미치지 못하며, 25 개의 아미노산 결손을 갖는 경우에는 뉴라미니다제의 기능이 완전히 소실된다. 그러나, 본 발명에서와 같이, 뉴라미니다제 목 부위에 16개의 아미노산 결손을 갖는 경우에는 뉴라미니다제의 기능이 저하되면서도 완전히 소실되지는 않아서, HA 단백질 활성과 균형을 이루는 최적의 조건을 보이는 것으로 나타났다.

서열번호 8와 서열번호 20으로 기재되는 NS1 및 PB2에는 조류 인플루엔자 바이러스가 마우스에 대한 병원성을 획득하는데 중요한 아미노산에 변화가 없어 마우스 등의 포유류에 대한 병원성이 없는 것으로 확인되었다. 즉, 역 유전학 기법을 통해 NS1의 92번 아스파탐산이 글루탐산으로 치환되는 경우와 PB2의 627번의 글루탐산이 리신으로 치환되는 경우 마우스에 대한 병원성이 증가하는 것으로 알려져 있으나 (Seo 등, 2002; Lipatov 등, 2005), 본 발명의 경우에는 이러한 치환이 일어나지 않고, NS1의 92번 아미노산 위치에 아스파탐산을 PB2의 627번 아미노산 위치에 글루탐산을 가지고 있는 것으로 나타나, 포유류에 대하여 병원성이 없음을 알 수 있다 (표 1 참조).

본 발명의 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스와 최근 유행하는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스와의 항원적 관련성을 알아보기 위하여, 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스를 면역하여 얻은 항혈청을 사용하여, 2005년 분리된 조류 인플루엔자 야외주와 일방 교차 혈구응집억제검사를 실시하였다. 그 결과, 본 발명의 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청은 최근 바이러스에 대해 자기 자신에 대한 역가와 비슷한 정도의 역가를 보여 항원성면에서 차이가 없는 것으로 나타나서, 백신으로서 유용할 것으로 판단된다 (표 8 참조).

본 발명에서는 바이러스의 계대과정 중에 뉴라미니다제의 목 부위 뉴클레오티드 결손이 일어나며 이로 인하여, 계태아 저병원성 및 고생산성 바이러스가 선발된다는 점을 증명하기 위하여, 7대, 10대, 11대, 15대, 19대 계대 재료로부터 RNA 를 추출하여 RT-PCR을 수행하여 48개 뉴클레오티드 결손부위의 증폭을 수행한 결과, 7대 계대 재료에서는 결손 되지 않은 바이러스가 우위를 점하였으며, 계대수가 증가할수록 결손 변이주가 증가하여, 15대 계대 재료부터는 결손된 바이러스만이 존재한다는 사실을 확인하였다 (도 2 참조).

따라서, 본 발명의 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스는 혈구응집 단백질의 158번 아미노산에 당 결합이 있어 수용기 결합능력이 낮아 감염속도가 늦고, 뉴라미니다제 목 부위에 16개 아미노산 결손이 있어 효소 기능이 낮아 출아 속도가 낮으므로 바이러스의 증식속도는 낮지만 계태아에 대해 병원성이 거의 없으므로 계태아의 조기 폐사가 일어나지 않고 충분히 바이러스 증식이 일어나며, 그 과정에서 계태아의 발육이 지체되므로 요막액 생산량이 급격히 증가되어 최종 바이러스 생산성이 증가되는 것으로 나타났다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 발육란 고생산성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스 KBNP-0028 제조

1-1. 바이러스 계대 배양

SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/00(H9N2); 국립수의과학검역원 분리 신고, 2005년 5월 9일]은 폐사 및 산란저하를 보이는 육용종계로부터 분리된 H9N2 아 형의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스로, 상기 바이러스 분리는 감염계 (전라북도 소재 육용종계 농장)의 신장과 기관시료를 유제하여 인산완충 용액에 부유하여 직경 0.45㎛의 여과지에 여과하여 각 시료를 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY) 3개의 요막강 (allantoic cavity)에 접종하였고, 37℃에 배양한 후 요막액 (allantoic fluid)을 수확하여 수행하였다. 상기 요막액 20㎕와 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY)을 부화시킨 닭에서 추출한 0.1% 닭 적혈구 20㎕를 유리 평판에 점적 후 혼합하여 평판혈구응집검사를 실시하였다. 그 결과 신장과 기관 시료를 접종하여 얻은 요막액 모두 혈구응집괴를 형성하였고, H9N2 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR 및 염기서열 분석으로 바이러스를 동정 (김 민철, 2002 서울대학교 대학원 석사학위논문)하여 -70℃에서 보존하였으며, 이 중 기관 시료에서 분리된 바이러스를 실험에 사용하였다.

발육란 고생산성 백신주를 선발하기 위하여, 상기 분리된 SNU0028을 0.05 내지 0.5 HAU/ml 농도로 인산완충용액으로 희석하여 200㎕의 양으로 10 내지 11일령 SPF 종란(Sunrise Co., NY,)에 요막강 경로로 접종하여 3일 간 37℃에 배양하였다. 매일 오전과 오후에 검란을 통해 3일 전에 폐사한 발육란은 폐기하였다. 3일 동안 생존한 발육란은 4℃에서 12 내지 24시간 보관한 후, 요막액을 수확하여, 각각에 대해 그 부피와 혈구응집역가를 측정하였으며, 가장 양이 많고 혈구응집역가가 높은 요막액을 동일한 방법으로 발육란에 접종하여 19 대 계대하여, 혈구응집역가가 높고, 요막액 수확량이 높아 생산성이 증가된 것을 분리하여, KBNP-0028라고 명명하고, 이를 대한민국 대전시 유성구 어은동에 위치하는 유전자 은행에 2005년 10월 26일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 10866BP를 부여 받았다.

1-2. 계태아 생산성 측정

상기에서 얻어진 KBNP-0028의 계태아 생산성을 측정하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 발육란 고증식성으로 인하여 인체 인플루엔자바이러스 개량에 사용되고 있는 A/Puer Torico/PR8/34의 발육란에서의 생산성과 비교하였다.

상기 KBNP-0028와 A/Puer Torico/PR8/34 (H1N1, ATCC VR-95)를 인산완충용액에 각각 0.05 내지 0.5 HAU/ml 농도로 희석하여 200㎕의 양으로 10 내지 11일령 SPF 종란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 접종하여 3일 간 37℃에 배양하였다. 그리고 나서, 4℃에서 12 내지 24시간 보관한 후 요막액을 수확하여 그 부피와 혈구응집역가를 측정하여 얻어진 결과를 하기의 표 1에 나타내었다. 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 KBNP-0028 균주는 기존의 A/Puer Torico/PR8/34 균주에 비하여 우수한 혈구응집역가를 보였으며, 이를 통하여 본 발명의 KBNP-0028가 우수한 계태아 생산성을 갖는다는 것을 알 수 있다.

[표 1]

동일한 방법으로 KBNP-0028 균주와 상기 모균주 SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/00(H9N2)]를 SPF 발육란(Sunrise Co., NY)에 2번 계대 배양한 KBNP-0028(E2)를 각각 SPF 발육란(Sunrise Co., NY)에 접종하고, 3일간 오 전과 오후 검란하여 계태아의 폐사를 관찰한 결과를 아래의 표 2에 나타내었다. 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 KBNP-0028은 10%의 폐사율을 보인 반면, KBNP-0028(E2)은 30%의 폐사율을 보여, 본 발명의 KBNP-0028이 계태아 병원성이 낮고, 생산성 및 안전성이 우수한 것으로 나타났다.

[표 2]

실시예 2: 발육란 고생산성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스 KBNP-0028 유전자 분석

2-1. RNA 분리 및 RT-PCR의 수행

산-구아니디늄-페놀 (acid-guanidinium-phenol) 방법 (Chomzinski and Sacci, 1985)을 사용하여, 상기 실시예 1-1에서 제작된 KBNP-0028 균주의 게놈 RNA를 요막액으로부터 추출하였다.

이를 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. RNA분리를 위하여, 상기 1-1에서 얻어진 발육란 배양 요막강액 100㎕에 easyBlue (iNtRON Co. Ltd., 서울, 대한민국) 1 ml를 첨가하고, 제조사에서 제공한 방법에 따라 RNA를 분리하여, DEPC (diethyl-pyrocarbonate; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA)로 처리한 멸균 3차 증류수 10㎕에 용해시켜 RNA 용액을 만들었다. 얻어진 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여, 1st strand buffer (iNtRON Co.) 4㎕, 0.1M DTT (iNtRON Co.) 1㎕, 2.5mM dNTP (iNtRON Co.) 1㎕, random hexamer (50ng/㎕) 1㎕ 및 상기 RNA 용액 10㎕를 혼합하고, 70℃에서 15분간 가온한 후, 얼음에서 급냉시켰다. 그리고 나서, 실온에서 10분간 정치한 후, 역전사효소 (iNtRON Co.) 1㎕를 첨가하고, 42℃에서 1시간 반응시킨 후, 95℃에서 5분간 역전사효소를 불활화 하였다.

그리고 나서, 10X PCR buffer (iNtRON Co.) 1㎕, 2.5mM dNTP (iNtRON Co.) 0.2㎕, 프라이머 (Hoffmann 등, Archives Virol, 2001) (5pmol/㎕) 각각 0.2㎕, Taq polymerase (iNtRON Co.; 1U/㎕) 0.2㎕, 멸균증류수 7.2㎕ 및 상기에서 얻어진 cDNA 1㎕를 혼합하고, Thermocycler 9600 (Perkin-Elmer Co, Foster City, CA, USA)을 이용하여 94℃에서 4분간 변성시킨 후, 94℃에서 20초, 52℃에서 15초, 72℃에서 2분간의 반응을 35회 실시한 후, 72℃에서 7분간 반응시켜 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 얻어진 증폭산물을 1.0% 아가로오스 젤에서 전기영동하여 에티디움브로마이드로 염색하여 관찰하였다.

2-2. 염기서열 결정

본 발명의 KBNP-0028의 게놈을 이루는 8개 절편의 RNA의 염기서열을 DNA 자동분석장치(ABI Prism 3700, Applied Biosystems Co. CA)와 다이 종결 키트 (dye terminator kit, Perkin Elmer, Foster, CA)를 사용하여 분석하였다. 유전자 클로닝을 위해 pCR8/GW/TOPO TA 클로닝 벡터 (Invitrogen Co. CA)를 사용하였으며, 서열결정 프라이머 (sequencing primer)로 벡터 M13 정방향 프라이머(5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'; 서열번호 21)와 M13 역방향 프라이머(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'; 서열번호 22)를 사용하였고, 각 유전자별로 사용한 내부 프라이머 서열을 하기 의 표 3에 나타내었다.

[표 3] 염기서열 결정용 프라이머

유전자	프라이머	염기서열(5'>3')
PB1	0028-PB1-697	GAGCACTGACTTTGAACAC (서열번호 23)
PB2	0028-PB2-713	AAGCAGCGTATACATTGAGG (서열번호 24)
PA	0028-PA-733	ATGTGGATGGATTTGAACCG (서열번호 25)
HA	0028-HA-729	AGGCCTCCTGTCAATGGTC (서열번호 26)
NP	0028-NP-596	TGGTGCAGCAGTAAAGGGAG (서열번호 27)

상기의 염기서열 결정 결과, 본 발명의 KBNP-0028의 게놈 유전자의 염기서열은 M2 코딩 서열(서열번호 1), M1 코딩 서열(서열번호 3), NS2 코딩 서열(서열번호 5), NS1 코딩 서열(서열번호 7), PA 코딩 서열(서열번호 9), HA9 코딩 서열(서열번호 11), NA2 코딩 서열(서열번호 13), NP 코딩 서열(서열번호 15), PB1 코딩 서열(서열번호 17) 및 PB2 코딩 서열(서열번호 19)의 염기서열을 포함하는 것으로 나타났으며, 이는 모두 시작코돈과 종결코돈에 해당하는 부분을 포함하는 완전 염기서열이다.

2-3. HA 아미노산 분석

인플루엔자 바이러스의 방어 항원으로 가장 중요한 혈구응집(HA) 단백질의 아미노산 서열을 비교하기 위하여, 본 발명의 HA 단백질 코딩 서열 (서열번호 11)과 아래의 표 4에 기재된 균주 (1-의 HA 단백질 코딩 유전자의 염기서열들을 멕 얼라인 패키지 (MegAlign package, Windows version 3.12e; DNASTAR, Madison, Wis, USA)의 번역 프로그램을 이용하여 얻은 아미노산 서열들을 사용하였다.

[표 4] 비교를 위하여 사용된 HA 유전자

균주 (H9N2)	HA 유전자의 등록번호	출처
1. A/quail/Hong Kong/G1/1997	AF156378	Guan & Webster et al., 1999
2. A/duck/Hokkaido/31/1997	AY330336	Liu & Kida et al., 2003
3. A/duck/Germany/113/1995	AF218100	Banks & Alexander et al., 2000
4. A/duck/Hong Kong/Y439/1997	AF156377	Guan & Webster et al., 1999
5. A/duck/Hong Kong/Y280/1997	AF156376	Guan & Webster et al., 1999
6. A/duck/Shantou/2144/2000	AF523372	Li & Guan et al., 2003
7. A/chicken/Hong Kong/G9/1997	AF156373	Guan & Webster et al., 1999
8. A/chicken/Beijing/1/1997	AF461530	Liu & Huang et al., 2003
9. A/chicken/Korea/ms96/1996	AF203008	Lee & Kim et al., 1999
10. A/chicken/Korea/96323/1996	AF156384	Guan & Webster et al., 1999
11. A/chicken/Korea/96006/1996	AF156384	Guan & Webster et al., 1999
12. A/Hong Kong/1073/1999	NC_004908	Lin 등, 2000
13. A/quail/Hong Kong/A28945/1988	AY206675	Perez 등, 2002
14. A/duck/Hong Kong/552/1979	AY206679	Perez 등, 2002
15. A/turkey/Wisconsin/1966	D90305	Nobusawa 등, 1991
16. A/Hong Kong/448/1978	AY206673	Perez 등, 2002
17. A/chicken/Korea/S1/2004	AY790313	Kim 등, 2004
18. A/chicken/Korea/S4/2003	AY862599	Choi 등, 2005
19. A/chicken/Korea/S18/2003	AY862606	Choi 등, 2005

상기에서 얻어진 아미노산 서열을 이용하여 클러스탈 법 (Higgins D., Thompson J., Gibson T.Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J.(1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 참조)으로 다중 배열하여, 단백질 분해효소 인식부위(821-826), 수용기 결합부위의 중요 아미노산 서열 및 158번 아미노산의 당 결합 유무를 비교하여, 그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

[표 5] 혈구응집(HA) 단백질의 아미노산 분석

*: 단백분해효소 인식위치.

표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 KBNP-0028 균주는 염기성 잔기를 갖는 아미노산을 한 개 가지고 있어서 비병원성 바이러스로 분류되었고, 수용기 결합부위의 아미노산은 조류의 세포에 흔하게 분포하는 α2-3 결합 시알산에 친화성을 보이는 것으로 알려진 아미노산을 가지고 있어서, 포유류 세포 감염능력은 낮을 것으로 판단되어, 포유류에 안전할 것으로 판단되었다. 또한, 당 결합이 일어나는 경우 수용기 결합력이 약화되는 것으로 알려진 158번 위치에 당 결합이 가능한 아미노산 서열(158-아스파라긴-아스파라긴-세린-160)을 가지고 있어서, 상기 위치의 아미노산이 당화되어 수용기 결합력이 약화됨을 알 수 있고, 이는 역시 본 발명의 균주가 병원성이 낮다는 것을 보여주는 것이다.

또한, 아미노산 서열 유사성을 측정한 결과, 본 발명의 KBNP-0028의 HA 아미노산 서열은 홍콩 및 미국 분리주들의 HA와는 87 내지 92%의 유사성을 보였으나, 1996년과 2003년 분리된 국내 분리주의 HA와는 모두 96%의 상동성을 보여, 국내 저병원성 조류인플루엔자에 특히 효과적인 예방용 백신 후보주로 바람직하다는 것이 입증되었다.

[표 6] 혈구응집단백질의 아미노산 서열 유사성 비교

바이러스 (H9N2)	KBNP-0028의 HA과의 아미노산 서열 유사성(%)	비교한 아미노산
A/chicken/Korea/S1/2003	96%	1-560
A/chicken/Korea/S4/2003	96%	1-560
A/chicken/Korea/S18/2003	96%	1-560
A/chicken/Korea/ms96/1996	96%	1-560
A/chicken/Hong Kong/G9/1997	89%	3-534
A/quail/Hong Kong/G1/1997	87%	1-543
A/duck/Hong Kong/Y439/1997	92%	1-513
A/Hong Kong/1073/1999	87%	1-560
A/duck/Hong Kong/448/1978	92%	1-560
A/quail/Hong Kong/A28945/1988	91%	1-560
A/duck/Hong Kong/552/1979	92%	1-560
A/turkey/Wisconsin/1966	89%	1-560

2-4. NA 아미노산 분석

인플루엔자 바이러스의 출아 시 중요한 뉴라미니다제의 목부분 아미노산 결손을 비교하기 위하여, 본 발명의 뉴라미니다제 (NA) 코딩 서열 (서열번호 13)와 하기의 표 7의 염기서열들을 멕 얼라인 패키지 (MegAlign package, Windows version 3.12e; DNASTAR, Madison, Wis, USA)의 번역 프로그램을 이용하여 얻은 아미노산 서열을 사용하였다.

표 7. 비교를 위하여 사용한 NA 유전자

균주(H9N2)	등록번호	출처
A/quail/Hong Kong/G1/1997	AF156396	Guan & Webster et al., 1999
A/ Hong Kong/1074/1999	AJ404628	Lin & Hay et al., 2000
A/duck/Germany/113/1995	AF508578	Li & Guan et al., 2002
A/duck/Hong Kong/Y280/1997	AF156394	Guan & Webster et al., 1999
A/swine/Hong Kong/10/1998	AF222813	Peiris & Shortridge et al., 2001
A/chicken/Pakistan/2/1999	AJ291393	Cameron & Lin et al., 2000
A/pheasant/Ireland/PV18/1997	AF508581	Li & Guan et al., 2002
A/chicken/Korea/99029/1999	AF508582	Li & Guan et al., 2002
A/ostrich/South Africa/9508103/1995	AF508575	Li & Guan et al., 2002
A/chicken/Korea/ms96/1996	AF203786	Lee & Kim et al., 1999
A/chicken/Korea/96323/1996	AF156400	Guan & Webster et al., 1999
A/chicken/Korea/S12/2003	AY862633	Webster, R. G. et al. 2005

상기에서 얻어진 아미노산 서열들을 클러스탈 법으로 다중배열 하여 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, A/Quail/Hong Kong/G1/97과 A/ Hong Kong/1074/99는 38번과 39번의 2개 아미노산의 결손이 확인되었고, A/Duck/Hong Kong/Y280/97과 A/Swine/Hong Kong/10/98은 63내지 65번에서의 3개 아미노산이 결손되었으며, A/Duck/Germany/113/95는 57 내지 81번에서의 25개 아미노산이 결손 되어 있었다. 반면, 본 발명의 KBNP-0028의 NA 단백질(서열번호 14)은 야생형과 비교하여 64번부터 79번까지의 16개 아미노산이 결손된 것으로 확인되어, 기존의 조류 인플루엔자 바이러스와는 확실하게 구별되는 독특한 결손 구조를 갖고 있는 것으로 나타났다.

이러한 아미노산 결손이 계대 중에 일어났는지를 알아보기 위하여, 정바향 프라이머로서 NAdelF(NA 유전자 ATG의 A를 1번으로 하였을 때 65부터 83까지의 염기서열) 5'-TCCTCATGCAGRTYGCYAT-3' (서열번호 28)와 역방향 프라이머로서 NAdelR (260부터 278까지의 염기서열) 5'-TGRCAYTGYGGTTTYGACC-3' (서열번호 29)를 이용하여 실시예의 2-1과 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. 얻어진 증폭산물을 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 15대 계대 바이러스부터 16개 아미노산의 결손으로 214bp의 증폭산물은 관찰되지 않고, 166bp의 증폭산물만 관찰되었다.

2-5. NS1 및 PB2 아미노산 분석

인플루엔자 바이러스의 병원성에 중요한 NS1 및 PB2의 아미노산 서열을 비교하기 위하여, 본 발명의 NS1 코딩 서열 (서열번호 7)과 PB2 코딩 서열(서열번호 19)의 염기서열을 멕 얼라인 패키지 (MegAlign package, Windows version 3.12e; DNASTAR, Madison, Wis, USA)의 번역 프로그램을 이용하여 얻어진 아미노산 서열을 사용하였으며, NS1의 92번 아미노산과 PB2의 627번 아미노산을 확인하였다. 그 결과 본 발명의 KBNP-0028의 NS1의 92번 아미노산은 면역반응을 억제하여 포유류(예컨대, 생쥐)에서 병원성을 보이는 것으로 알려진 글루탐산이 아닌 아스파탐산이었고, PB2의 627번 아미노산 또한 포유류 (생쥐) 병원성과 관련된 리신이 아닌 글루탐산이었다. 따라서, 본 발명의 KBNP-0028 균주는 계태아 뿐 아니라 인체를 포함하는 포유류에 병원성이 없는 안전한 인플루엔자 바이러스라는 것이 입증되었다.

실시예 3: KBNP-0028 균주와 최근 국내 H9N2 아형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 항원성 비교

3-1. 항혈청 생산

프로인트 완전 보조액 (Invitrogen Co., CA)과 상기 실시예 1-1에서 얻어진 혈구응집역가 1,024/25㎕인 요막액을 동량으로 혼합하여 유중수 에멀젼 백신을 만들어, SPF 닭 2 마리에 수당 200㎕ 씩 접종하였다. 상기 에멀젼 백신 접종 4주후 날개 정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하고, 냉장 또는 냉동하여 실험에 사용하였다. 음성 대조군으로 SPF 종란(Sunrise Co., NY)을 부화시켜 얻은 닭 2마리를 실험기간 동안 사육하며, 조류인플루엔자 항체 음성여부를 확인하였다.

3-2. 일방향-혈구응집억제 검사

일방향-혈구응집 억제검사를 위하여, 먼저 A/chicken/Korea/SNU5011/2005(H9N2)(국립수의과학검역원 분리 신고), A/chicken/Korea/SNU5012/2005(H9N2)(국립수의과학검역원 분리 신고), A/chicken/Korea/SNU5022/2005(H9N2)(국립수의과학검역원 분리 신고), 및 본 발명의 KBNP-0028의 혈구응집 역가를 측정하였다.

보다 구체적으로, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 인산완충용액 50 ㎕ 씩을 분주하고, 첫번째 웰에 상기 바이러스 50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 다시 50 ㎕를 채취하여 다음 웰에 첨가하여 섞어주는 과정을 반복하며 마지막 웰에서는 50 ㎕를 채취해 제거하는 방법으로 연쇄 희석(serial dilution)을 실시하여, 상기 바이러스 각각에 대한 희석액을 만들었다. 상기와 같이 바이러스가 2배 단위로 희석된 각 웰에 SPF 종란(Sunrise Co., NY)을 부화시켜 얻은 SPF 닭으로부터 채취한 0.5%(v/v) 닭 적혈구 50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 완벽한 혈구응집이 일어난 웰의 희석배수(2ⁿ, n=희석배수)를 혈구응집 역가로 하였다.

상기에서 설정한 역가에 기초하여 일방향-혈구응집 억제검사로 항-KBNP-0028 혈청내 항체의 최근 바이러스에 대한 혈구응집억제 능력을 검사하였다. 즉, 4-혈구응집단위의 바이러스 25 ㎕와 항-KBNP-0028 혈청 2개(A와 B) 25 ㎕를 혼합하여 실온에서 30분 간 반응시킨 후 상기 0.5% 닭 적혈구 50 ㎕를 첨가하여 4℃에서 30분경과 후 혈구응집이 완전히 억제된 웰의 수를 혈구응집 억제역가로 하였다. 상기 A와 B 혈청에 대해 2회 반복하여 얻어진 결과(A 혈청 반복: A-1, A-2; B혈청 반복: B-1, B-2)를 하기의 표 8에 나타내었다.

[표 8] 항-KBNP-0028 혈청을 이용한 일방혈구응집억제 검사 결과

* 혈구응집역가

그 결과 KBNP-0028에 대한 항 혈청은 최근 분리된 SNU5011, SNU5012, SNU5022에 대해 KBNP-0028에 비해 동등한 혈구응집역가를 보여 KBNP-0028은 최근 국내에서 유행하는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 방어효과가 높은 것으로 판단되었다.

반면, 음성 대조군에 대하여 동일한 실험을 수행한 결과, 혈구응집 억제를 위한 항체가 생성되지 않은 것으로 나타났다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형조류 인플루엔자 바이러스인 KBNP-0028 균주는 조류 뿐 아니라 인간을 포함하는 포유류에 안전하고, 발생란에서의 생산성이 우수할 뿐 아니라, 국내 유행하는 저병원성 조류 인플루엔자에 대하여 우수한 항원성을 가지므로, 이의 예방을 위한 백신주 또는 진단 용도로서 매우 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 게놈 유전자가 매트릭스 단백질 2 (M2, 서열번호 2)의 코딩 서열, 매트릭스 단백질 1 (M1, 서열번호 4)의 코딩 서열, 비구조단백질 2 (NS2, 서열번호 6)의 코딩 서열, 비구조단백질 1 (NS1, 서열번호 8)의 코딩 서열, 중합효소 A (PA, 서열번호 10)의 코딩 서열, 적혈구응집 단백질 아형 9 (HA9, 서열번호 12)의 코딩 서열, 뉴라미니다제 아형 2 (NA2, 서열번호 14)의 코딩 서열, 뉴클레오캡시드 단백질 (NP, 서열번호 16)의 코딩 서열, 중합효소 B1 (PB1, 서열번호 18)의 코딩 서열 및 중합효소 B2 (PB2, 서열번호 20)의 코딩 서열을 갖는,

   발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스.
2. 제 1항에 있어서, 상기 매트릭스 단백질 2 (M2)의 코딩 서열은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 매트릭스 단백질 1 (M1)의 코딩 서열은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 비구조단백질 2 (NS2)의 코딩 서열은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 비구조단백질 1 (NS1)의 코딩 서열은 서열번호 7의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 중합효소 A (PA)의 코딩 서열은 서열번호 9의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 적혈구응집 단백질 아형 9 (HA9)의 코딩 서열은 서열번호 11의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 뉴라미니다제 아형 2 (NA2)의 코딩 서열은 서열번호 13의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 뉴클레오캡시드 단백질 (NP)의 코딩 서열은 서열번호 15의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 중합효소 B1 (PB1)의 코딩 서열은 서열번호 17의 염기서열을 갖는 것이고, 상기 중합효소 B2 (PB2)의 코딩 서열은 서열번호 19의 염리서열을 갖는 것인, 조류 인플루엔자 바이러스.
3. 제1항에 있어서, 수탁번호가 KCTC10866BP인 조류 인플루엔자 바이러스.
4. 삭제
5. H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스인 SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/2000 (H9N2)] 세포주를 SPF (specific pathogen free) 계태아의 요막강에 접종하여 배양하고, 배양 3일 이후에 생존하는 계태아의 요막액을 수집하여 종란에 접종하는 단계를 15회 내지 19회 반복하여 계대배양하는 단계를 포함하는, 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 방법에 의하여 제조되며,

   게놈유전자가 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질(AAV52598)의 158번째 아미노산 위치에 당결합이 존재하는 HA 단백질의 코딩 서열과, 야생형 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 NA 단백질(ABC75113)의 64번부터 79번까지의 16개의 아미노산 결손을 갖는 변형된 NA 단백질의 코딩 서열을 포함하는 것인,

   발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스.
6. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 조류 인플루엔자 바이러스를 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스용 백신.
7. 제6항에 있어서, 조류 및 포유류로 이루어진 군 중에서 선택된 동물에 적용 가능한 것인 백신.
8. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 유래하는 것인 진단용 조성물.
10. 환자로부터 분리한 혈액 시료; 및

    제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 포함하는

    조류 인플루엔자 바이러스 진단용 키트.
11. 제10항에 있어서, 상기 환자는 조류 또는 포유류이고, 상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 유래하는 것인 진단용 키트.

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