KR100920853B1

KR100920853B1 - 프로브 세트, 프로브 고정화 담체 및 유전자 검사방법

Info

Publication number: KR100920853B1
Application number: KR1020080000537A
Authority: KR
Inventors: 토시후미 후쿠이; 노부히로 토마츠
Original assignee: 캐논 가부시끼가이샤
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2008-01-03
Publication date: 2009-10-09
Also published as: CN1978669B; EP1803823A2; KR100969399B1; EP1803823A3; KR20080011450A; KR20080068604A; KR20080011451A; KR20070061398A; KR100925569B1; US20070134702A1; KR100920851B1; KR20090033854A; CN1978669A; US7932028B2; JP2007159411A; KR100920852B1; EP1803823B1

Abstract

진균의 종에 의한 분류의 대상과 다른 종의 균을 구별하면서 동일 종의 균을 일괄적으로 검출가능한 프로브 및 프라이머가 개시되어 있다. 감염성 병인균 유전자 검출용의 올리고뉴클레오타이드 프로브는 이하의 제 3군 내지 제 9군 중의 하나의 군에 속하는 염기 서열로부터 선택된 적어도 1개의 염기 서열을 포함한다. 제 3군(서열번호: 11 내지 15); 제 4군(서열번호: 16 내지 21); 제 5군(서열번호: 22 내지 26); 제 6군(서열번호: 27 내지 31); 제 7군(서열번호: 32 내지 36); 제 8군(서열번호: 37 내지 41); 및 제 9군(서열번호: 42 내지 46).

Description

프로브 세트, 프로브 고정화 담체 및 유전자 검사방법{PROBE SET, PROBE IMMOBILIZED CARRIER AND GENE EXAMINATION METHOD}

본 발명은 감염성 질환의 병인균의 검출 및 동정에 유용한, 감염성 병인균으로부터 유래된 프로브 세트, 및 상기 프로브가 상부에 고정화된 프로브 고정화 담체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 프로브 세트를 이용해서 감염성 병인균 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은 상기 검출 방법에 사용되는 검체에서 핵산을 미리 효과적으로 증폭시키기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.

검체에서 병원성 진균을 신속하고 확실하게 검출하기 위한 시약 및 방법이 종래 제안되어 있다. 예를 들어, 일본국 공개특허 평 08-089254호에는 칸디다증 및 아스페르길루스증의 병인균을 검출하기 위해, 프로브 및 프라이머로서 유용한, 특정 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 이것을 이용해서 표적 균(표적 미생물)(target microorganism)을 검출하는 방법이 개시되어 있다. 또, 상기 특허 문헌에는 PCR에 의해 복수의 표적 균을 동시에 증폭하기 위한 프라이머 세트가 개시되어 있다. 게다가, 상기 프라이머 세트를 이용해서, 검체 중의 복수의 표적 진균을 PCR에 의해 증폭하고, 이어서 각 진균에 특이적인 서열부분을 각 진균에 특이적인 프로브를 이용한 하이브리다이제이션 에세이(hybridization assay)에 의해 검출하여, 검체 중의 진균 종을 동정하는 것도 개시되어 있다.

한편, 복수의 상이한 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 동시에 검출하는 방법으로서, 각 염기서열에 상보적인 서열을 지닌 프로브를 고상에 서로 떨어뜨려 고정화시킨 프로브 어레이를 이용하는 방법이 공지되어 있다(일본국 공개특허 제 2004-313181호 공보).

그러나, 프로브 어레이 등을 이용해서 서로간의 존재 정보 및 특이성에 대한 영향(교차 오염)을 조절하면서 복수의 진균을 동시에 검출가능한 프로브를 세트하는 것은 결코 용이하지 않다. 실제로, 동시에 검출할 복수의 표적 진균에 개별적으로 프로브를 세트하는 것은 달리 방법이 없었다. 이들 상황하에서, 본 발명자들은 교차 오염 레벨을 낮추면서 이하의 9개의 진균을 동시에 검출하는 데 바람직하게 이용될 수 있는 프로브를 연구하였다:

1) 칸디다 알비칸스(Candida albicans)

2) 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)

3) 칸디다 귤리에몬디(Candida guilliermondii)

4) 칸디다 크루세이(Candida krusei)

5) 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis)

6) 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)

7) 트리코스포론 바이겔리(Trichosporon beigelii)

8) 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)

9) 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger).

본 발명의 제 1 목적은 상기 9종의 진균으로부터 선택된 적어도 2종의 진균을 동시에 더욱 확실하게 동정가능한 프로브 세트를 제공하는 데 있다.

또, 본 발명의 다른 목적은 상기 9종의 진균으로부터 선택된 적어도 2종의 진균을 동시에 더욱 확실하게 동정하는 데 이용될 수 있는 프로브-고정화 담체를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브 세트를 형성하는 올리고뉴클레오타이드에 의해 검출가능한 레벨까지 상기 9종의 진균을 선택적으로 증폭가능한 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.

게다가, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 9종의 진균으로부터 선택된 적어도 2종의 진균이 검체 중에 함유된 경우 더욱 신속하고 정확하게 상기 9종의 진균을 검출가능한 감염성 병인균 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 감염성 병인균 검출용 프로브 세트는

(1) 이하의 제 1군 내지 제 9군으로부터 선택된 군에 속하는 제 1 프로브, 및 이하의 제 1군 내지 제 9군으로부터 선택된 군에 속하지만 상기 제 1 프로브의 군과는 다른 제 2 프로브를 포함하거나; 또는

(2) 상기 제 1 프로브와 상보적인 염기서열을 지닌 제 3 프로브 및 상기 제 2 프로브와 상보적인 염기서열을 지닌 제 4 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다:

제 1군:

(1) acgatacagggcccttttgggt(서열번호: 1)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(2) atctttttcgatgcgtactggaccag(서열번호: 2)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(3) gccatttatggcgaaccaggactt(서열번호: 3)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(4) aggacgttatggttctattgtgttggtt(서열번호: 4)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브; 및

(5) ggactatcgactccaagtcgatgga(서열번호: 5)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브.

제 2군:

(1) cggtccgattttttcgtgtactgga(서열번호: 6)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(2) aaccccaagtccttgtggcttg(서열번호: 7)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(3) tggaataatggaataggacgtttggttct(서열번호: 8)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(4) ttttagtgacccactcggcacct(서열번호: 9)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브; 및

(5) gctagcatttgctggttgtccact(서열번호: 10)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브.

제 3군:

(1) gatacagggccctttcgggtct(서열번호: 11)를 포함하는 염기서열을 지닌 프 로브;

(2) ttttggcgagtactggacccaac(서열번호: 12)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(3) ctaaccattcgcccttgtggtgtt(서열번호: 13)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(4) atcgggtgttgttctttttttgacgc(서열번호: 14)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브; 및

(5) aaatagtgctgctagcttttgctggt(서열번호: 15)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브.

제 4군:

(1) atataacgatacagggcctttggtcttg(서열번호: 16)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(2) ggcggacggtctacctatggtaa(서열번호: 17)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(3) accaggacgattactttgaggaaattaga(서열번호: 18)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(4) ggtggtgctactttgcccactc(서열번호: 19)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(5) agacttctcttgatcttacgggtggt(서열번호: 20)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브; 및

(6) aaatagggctgcgagcatctgc(서열번호: 21)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브.

제 5군:

(1) gccggtccatcttttttgatgcgta(서열번호: 22)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(2) tctggctagcctttttggcgaac(서열번호: 23)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(3) tcagtattcagtagtcagaggcgaaattc(서열번호: 24)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(4) tgttgttcttttattgacgcaatcggc(서열번호: 25)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브; 및

(5) tgctgctagcatttgctggtatagtc(서열번호: 26)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브.

제 6군:

(1) acaatacagggctcttttgggcc(서열번호: 27)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(2) ctggtggtcctgtatgctctttactg(서열번호: 28)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(3) ttgacggaagaccaacaactgcg(서열번호: 29)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(4) gatcggcccacgtcaatctctg(서열번호: 30)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브; 및

(5) cggcgtctagtcgacggaagtt(서열번호: 31)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브.

제 7군:

(1) gaggaacggtctgccttacggta(서열번호: 32)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(2) ttcattgagtgtgcggtggaacc(서열번호: 33)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(3) cttagatttacggaagactaacaactgcg(서열번호: 34)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(4) tcggtccacgttattttctgactgga(서열번호: 35)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브; 및

(5) ggactaacagcgtttagctgttggaa(서열번호: 36)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브.

제 8군:

(1) ttctggggaacctcatggcctt(서열번호: 37)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(2) atagggatagtcgggggcgtca(서열번호: 38)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(3) aaagcattcgccaaggatgttttcattaa(서열번호: 39)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(4) cggtgtttctatgatgacccgctc(서열번호: 40)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브; 및

(5) cttcttagggggactatcggctca(서열번호: 41)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브.

제 9군:

(1) ggggctcttttgggtctcgtaatt(서열번호: 42)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(2) ctggggaatctcatggccttcac(서열번호: 43)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(3) ggatagtcgggggcgtcagtatt(서열번호: 44)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

(4) gtgtttctattatgacccgttcggca(서열번호: 45)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브; 및

(5) agacctcggcccttaaatagccc(서열번호: 46)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브.

본 발명의 프로브-고정화 담체는 상기 프로브 세트를 구성하는 복수의 프로브가 서로 떨어져서 고상 담체(solid phase carrier) 상에 배치되어 있는 것을 특징으로 한다.

프로브-고정화 담체를 이용해서 검체 중의 감염성 병인균 유전자를 검출하는 본 발명의 방법은

(i) 상기 프로브-고정화 담체를 검체와 반응시키는 공정; 및

(ii) 검체 중의 핵산과 반응한 올리고뉴클레오타이드의 반응 강도를 검출하는 공정을 포함한다.

본 발명의 프라이머 세트는 상기 구성을 지닌 프로브-고정화 담체를 이용해서 감염성 병인균을 검출할 때, 검체에서 핵산을 미리 증폭시키기 위한 것이다. 이 프라이머 세트는 gccctatcaactttcgatggtaggatag(서열번호: 47)의 염기서열을 포함하는 프라이머와, 이하의 (1) 및 (2)의 2종의 프라이머 중 적어도 1종의 프라이머를 지닌다:

(1) aatgctctatccccagcacgac(서열번호: 48)를 포함하는 프라이머; 및

(2) tcggcaccttacgagaaatcaaagt(서열번호: 49)를 포함하는 프라이머.

본 발명에 의하면, 검체가 상기 9종의 감염성 질환의 병인균으로부터 선택된 적어도 2종의 균이 배합되어 감염된 경우, 그 2종 이상의 균이 동시에 검체로부터 검출될 수 있다. 따라서, 검체가 복수의 진균에 의해 감염되었는지의 여부에 대한 판정, 그리고 배합 감염의 경우, 병인균의 동정은 신속하고 정확하게 수행될 수 있다. 또, 배합 감염으로 의심되는 검체를 본 발명의 프로브 세트에 의해 검사할 때, 상기 9종의 감염성 병인균은 본 발명의 프라이머 세트를 사용함으로써 프로브 세트를 구성하는 프로브에 의한 반응 특이성을 손실시키는 일없이 선택적으로 증폭 될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 프로브 세트 또는 프로브-고정화 담체에 의한 검체의 검사는 검체의 증폭용의 본 발명의 프라이머 세트를 이용함으로써 더욱 신속하고 정확하게 수행될 수 있다.

본 발명의 추가의 특성은 첨부 도면을 참조한 이하의 예시적인 실시형태의 설명으로부터 명백해질 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해서 상세히 설명한다.

이하의 실시형태에 있어서, 감염성 병인균을 동정하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브(이하 간단히 "프로브"라 칭함)의 세트가 표시되어 있다. 이 프로브 세트를 이용하면, 그들의 감염에 의한 염증을 일으키는 이하의 9종의 진균 중의 1종 또는 그들의 복수의 종류가 검출될 수 있다:

1) 칸디다 알비칸스

2) 칸디다 글라브라타

3) 칸디다 귤리에몬디

4) 칸디다 크루세이

5) 칸디다 파라프실로시스

6) 크립토콕쿠스 네오포르만스

7) 트리코스포론 바이겔리

8) 아스페르길루스 푸미가투스

9) 아스페르길루스 니게르

즉, 상기 9종의 감염성 병인균의 유전자 중 18S rRNA 유전자 서열을 과·부족 없이 검출하기 위한 핵산 프로브 세트가 개시되어 있다.

본 실시형태에 의하면, 감염성 병인균의 유전자 자체 또는 상기 균의 유전자에 특이적인 염기 서열을 지닌 핵산을 함유하는 검체(조사용 용액)와 그 자체를 반응시키는 프로브 세트용의 프로브는 이하의 제 1군 내지 제 9군 중 적어도 2개의 군의 각각으로부터 선택될 수 있다:

제 1군:

제 2군:

제 3군:

(1) gatacagggccctttcgggtct(서열번호: 11)를 포함하는 염기서열을 지닌 프로브;

제 4군:

제 5군:

(4) tgttgttcttttattgacgcaatcggc(서열번호: 25)를 포함하는 염기서열을 지 닌 프로브; 및

제 6군:

제 7군:

제 8군:

제 9군:

(2) ctggggaatctcatggccttcac(서열번호: 43)를 포함하는 염기서열을 지닌 프 로브;

상기 각 군은 적어도 5종류의 프로브를 지니고, 상기 제 1군 내지 제 9군으로부터 선택된 적어도 2개의 군의 각각으로부터의 적어도 1종의 프로브를 이용해서, 프로브 세트를 형성할 수 있다. 따라서, 본 실시형태의 프로브 세트는 최소 2종류의 프로브, 그리고 최대 46종류의 프로브를 함유할 수 있다.

여기서, 각 군은 이하의 검출 기능을 지닌다:

제 1군: 칸디다 알비칸스의 검출

제 2군: 칸디다 글라브라타의 검출

제 3군: 칸디다 귤리에몬디의 검출

제 4군: 칸디다 크루세이의 검출

제 5군: 칸디다 파라프실로시스의 검출

제 6군: 크립토콕쿠스 네오포르만스의 검출

제 7군: 트리코스포론 바이겔리의 검출

제 8군: 아스페르길루스 푸미가투스의 검출

제 9군: 아스페르길루스 니게르의 검출

이들 프로브 서열에 대한 상보적인 서열도 동일한 기능을 지니며, 이에 따라, 이들은 프로브 서열로서 유효하다. 이들 상보 서열을 지닌 프로브도 프로브 세트를 형성하는 데 이용가능하다.

즉, 프로브 세트는

(1) 상기 제 1군 내지 제 9군으로부터 선택된 군에 속하는 제 1 프로브, 및 상기 제 1군 내지 제 9군으로부터 선택된 군에 속하지만 상기 제 1 프로브의 군과는 다른 제 2 프로브를 포함하거나; 또는

(2) 상기 제 1 프로브와 상보적인 염기서열을 지닌 제 3 프로브 및 상기 제 2 프로브와 상보적인 염기서열을 지닌 제 4 프로브를 포함하도록 구성되어 있다.

각각의 균에 대한 프로브는 이들이 대응하는 균에 대해서 매우 높은 특이성을 지닐 수 있고 또한 프로브 염기서열 간에 편차가 없는 충분한 하이브리다이제이션 감도가 기대될 수 있도록 18S rRNA 유전자로부터 설계되었다.

이들 올리고뉴클레오타이드 프로브는 안정한 하이브리드체가 검체와 담체 상에 결합된 2종 이상의 프로브 간의 하이브리다이제이션 반응에 의해 형성되도록 설계되어, 만족스러운 결과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 감염성 병인균 검출용 프로브가 상부에 고정화된 프로브-고정화 담체(예를 들어, DNA 칩)는, 담체의 소정의 위치에 본 실시형태의 프로브 세트를 구성하는 각 프로브를 공급해서 고정화시킴으로써 얻어질 수 있다. 프로브를 담체에 공급하기 위해서는, 각종 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 이하의 방법이 바람직하게 이용될 수 있다. 즉, 화학 결합(공유결합)에 의해 담체 상에 고정화되도록 프로브를 준비하고, 이 프로브를 함유하는 액체를 액체 토출 방법(예를 들어, 잉크젯 방법)에 의해 소정의 위치에 공급한다. 이것에 의해 담체로부터 프로브가 덜 박리될 수 있고, 또한 부가적인 효과로서 감도도 향상된다. DNA 칩이 스탠포드(Stanford) 방법으로 불리는 스탬핑 방법에 의해 제작될 경우, 상기 칩은 적용된 DNA가 쉽게 박리되는 결점을 지닌다. 또한, DNA 칩을 생산하는 방법으로서는, 담체의 표면상에 DNA 합성에 의해 프로브를 배치시킨다. 담체 상에 프로브를 합성시키는 방법에 있어서는, 각 프로브 서열의 합성량이 다르고, 따라서 고정된 프로브의 양도 각 프로브의 고정화 영역(스폿(spot))에 따라 상당히 다르다. 이러한 편차가 고정화된 프로브의 양에 존재할 경우, 이러한 담체를 이용해서 얻어진 검출 결과에 대해 신뢰성 있는 평가가 이루어질 수 없다. 이들 관점으로부터, 본 발명의 프로브-고정화 담체는 프로브가 거의 박리되지 않아 담체상에 안정적으로 고착되는 점; 및 고도로 민감하고 정확한 검출을 위한 프로브-고정화 담체가 효과적으로 제공되는 점에서 바람직하기 때문에 상기 잉크젯 방법을 이용해서 제조된다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 상세히 설명한다.

본 실시형태의 프로브-고정화 담체의 DNA칩에 이용되는 검사 대상으로서의 검체로는 균이 존재할 수 있는 검체라면 어느 것이라도 포함하고, 예를 들면, 인간 및 가축 등의 동물 유래의 혈액, 척수액, 객담, 위액, 질분비물 및 구강내 점액 등 의 체액; 소변 및 대변 등의 배설물 등을 들 수 있다. 또, 식중독을 일으킬 수 있는 식품이나, 음료수 및 온천수와 같은 환경 중의 물, 공기청정기 등의 필터를 포함하는, 세균에 의한 오염이 유발될 가능성이 있는 매체 전체도 검사대상으로 될 수 있다. 또, 전출입시에 있어서의 검역되는 동식물도 검체로서의 검사대상일 수 있다.

상기 검체가 아무런 처리 없이 DNA 칩과의 반응에 이용될 수 있는 경우, DNA 칩과 반응시켜서 그 결과를 분석한다. 또, 검체가 아무런 처리 없이 DNA 칩과의 반응에 이용될 수 없는 경우, 필요에 따라 표적 물질의 추출 및 정제 등의 처리를 검체에 대해 수행하여, 얻어진 시료를 DNA 칩과 반응시킬 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산이 검체에 함유된 경우, 표적 핵산을 함유하는 것으로 여겨지는 추출 분획을 검체로부터 제조하고, 필요에 따라 세정 혹은 희석 등의 추가의 처리를 행한다. 이어서, 제조된 시료 용액을 DNA 칩과 반응시킨다. 또한, 표적 핵산이 검체 내에 포함되어 있는 경우, PCR 증폭 처리를 포함한 각종 증폭 처리를 행하여 표적 핵산을 증폭시킴으로써, DNA 칩과 반응할 시료를 얻는다. 이러한 증폭된 핵산 시료의 예로는 18S rRNA 유전자를 검출하기 위해 설계된 PCR 반응 프라이머를 이용해서 제작된 증폭된 검체; PCR-증폭 산물의 PCR 반응 등을 행하여 제작된 검체; PCR 이외의 증폭 방법에 의해 제작된 검체; 시각화를 위해 각종 표지법에 의해 표지된 검체 등, 각종 방법에 의해 제작된 검체를 포함한다.

또한, 본 실시형태의 DNA칩에 이용되는 담체는, 유리기판, 플라스틱기판, 실리콘 웨이퍼 등의 평면기판, 3차원 패턴을 지닌 3차원 구조체, 비드(bead)와 같은 구형상의 것, 봉형상, 코드(cord)형상, 실형상의 구조체 등을 포함한 담체로서의 특징을 충족시키는 모든 종류의 담체를 포함한다. 또, 담체로는, 표면을 프로브 DNA가 고정될 수 있도록 처리한 기판도 포함한다. 특히, 표면에 화학반응이 가능하도록 작용기를 도입함으로써 제작된 담체는 하이브리다이제이션 반응과정에서 프로브가 안정적으로 결합하고 있으므로, 재현성의 점에서 바람직한 형태를 지닌다.

본 발명에 이용되는 고정화 방법의 예로서는, 말레이미드기와 티올기(-SH)기와의 조합을 이용한다. 더욱 구체적으로는, 핵산 프로브의 말단에 티올(-SH)기를 결합시키고, 담체 표면(고상)이 말레이미드기를 지니도록 처리한다. 따라서, 고상 표면에 공급된 핵산 프로브의 티올기와 고상 표면상의 말레이미드기가 반응해서 핵산 프로브를 고정화한다.

말레이미드기를 도입하기 위해서는, 먼저, 유리기판에 아미노실란 커플링제를 반응시킨다. 다음에 그 아미노기와 EMCS 시약(N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드: 도진사 제품)과의 반응에 의해 말레이미드기를 도입한다. DNA에의 SH기의 도입은, DNA자동합성기에서 DNA를 합성할 때에, 5'-티올-모디파이어 C6(글렌 리서치사 제품)을 이용함으로써 행하는 것이 가능하다.

고정화에 이용하는 작용기의 조합으로서는, 상기한 티올기와 말레이미드의 조합 이외에도, 예를 들면, 에폭시기(고상 위)와 아미노기(핵산 프로브 말단)의 조합 등을 들 수 있다. 또, 각종 실란커플링제를 이용한 표면처리도 유효하며, 해당 실란 커플링제에 의해 도입된 작용기와 반응가능한 작용기를 도입한 올리고뉴클레오타이드가 이용된다. 또, 작용기를 지닌 수지를 도포하는 방법도 이용가능하 다.

본 발명의 프로브-고정화 담체를 이용한 감염성 병인균 유전자의 검출은 감염성 병인균 유전자를 검출하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이 방법은 상기 구성을 지닌 프로브-고정화 담체를 검체와 반응시키는 단계; 프로브-고정화 담체 상의 프로브와 검체 중의 핵산과의 반응을 검출하는 단계(예를 들어, 그 반응의 유무를 검출하는 단계); 및 이들 간의 반응이 검출된 경우, 상기 핵산과의 반응을 지닌 프로브를 특정하여 프로브의 염기 서열에 의거해서 검체 중에 포함된 감염성 병인균 유전자를 동정하는 단계를 포함한다.

전술한 바와 같이, 검체에 포함된 18S rRNA 유전자 서열이 PCR에 의해 증폭되고, 얻어진 산물이 프로브 담체와 반응하는 시료로서 이용될 경우, 감염성 병인균 검출용의 프라이머 세트가 이용가능하다. 프라이머 세트로서는, 이하의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 함유하는 것이 바람직하다:

(1) 5' gccctatcaactttcgatggtaggatag 3'의 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드

(2) 5' aatgctctatccccagcacgac 3'의 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드.

실시예

이하, 본 발명을 진균을 검출하기 위한 감염성 병인균용의 프로브를 사용하는 실시예를 참조해서 상세히 설명한다.

( 실시예 1)

이하의 실시예에서는 2 단계 PCR 방법을 이용하는 균의 검출에 대해서 설명한다.

<1. 프로브 DNA의 준비>

칸디다 알비칸스의 검출에 이용되는 프로브로서 하기 표 1에 표시한 핵산 서열을 설계하여 합성하였다. 구체적으로는, 칸디다 알비칸스의 18S rRNA 유전자로부터 이하의 프로브 염기서열을 선택하였다. 이들 프로브 염기서열들은 대응하는 진균에 대해서 매우 특이성이 높고, 각각의 프로브 염기서열 간의 편차가 없이 충분한 하이브리다이제이션 감도가 기대될 수 있도록 설계되었다. 사용되는 프로브 염기서열은 하기 표 1에 표시한 것과 완전히 일치하는 것으로 한정될 필요는 없고, 프로브 염기서열을 포함하는 약 20 내지 30의 염기 길이를 지닌 프로브 염기서열도 표 1에 표시된 프로브 염기서열에 포함된다.

균 명	프로브 번호	서열번호	서열
칸디다 알비칸스	CA-1	1	5' acgatacagggcccttttgggt 3'
	CA-2	2	5' atctttttcgatgcgtactggaccag 3'
	CA-3	3	5' gccatttatggcgaaccaggactt 3'
	CA-4	4	5' aggacgttatggttctattgtgttggtt 3'
	CA-5	5	5' ggactatcgactccaagtcgatgga 3'

표 1에 표시한 각 프로브에 대해서, DNA 마이크로어레이에 프로브를 고정하기 위한 작용기로서, 통상의 방법에 따라서 합성 후 핵산의 5'말단에 티올기를 도입하였다. 작용기의 도입후, 정제하고, 동결건조를 행하였다. 내부 표준용의 동결건조한 프로브는 -30℃의 냉동고에 보존하였다.

<2. PCR 프라이머의 준비>

<2-1. 검체 증폭용 PCR 프라이머의 준비>

상기 병인균 검출을 위한 18S rRNA 유전자(표적 유전자) 증폭용 PCR 프라이머로서, 이하의 표 2에 표시한 핵산 서열을 설계하였다. 구체적으로는, 18S rRNA 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트, 즉, 약 1,700의 염기 길이의 18S rRNA 유전자 부호화 영역의 양단부분에서, 특이적인 융점을 가능한 한 균일하게 한 프라이머를 설계하였다. 또, 상이한 진균 균주를 동시에 증폭시키기 위하여, 진균 간의 공통 영역으로부터 프라이머를 설계하였다.

	프라이머 번호	서열번호	서열
포워드 프라이머	F-1	47	5' gccctatcaactttcgatggtaggatag 3'
리버스 프라이머	R-1	48	5' aatgctctatccccagcacgac 3'

상기 표 2에 표시한 프라이머는 합성 후 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제하고, 각각의 프라이머를 최종농도가 10 pmol/㎕로 되도록 TE 완충액에 용해시켰다.

<2-2. 표지용 PCR 프라이머의 준비>

표지용 프라이머는 전술한 검체 증폭용 프라이머와 마찬가지 방법으로 하기 표 3에 표시된 바와 같이 설계하였다.

	프라이머 번호	서열 번호	서열
Cy3-표지된 프라이머	R-2	49	5' tcggcaccttacgagaaatcaaagt 3'

표 3에 표시된 프라이머에 대해서 형광 색소로서 Cy3을 이용해서 표지화를 수행하였다.

합성 후, 상기 프라이머는 HPLC에 의해 정제하고, 해당 프라이머를 최종농도가 10 pmol/㎕로 되도록 TE 완충액에 용해시켰다.

<3. 칸디다 알비칸스의 유전체 DNA(모델 검체)의 추출>

<3-1. 미생물 배양 및 유전체 DNA 추출>

먼저, 칸디다 알비칸스(ATCC 18804)의 표준 균주를 통상의 방법에 따라 배양하였다. 이 미생물 배양액으로부터, 유전체 DNA를 추출하고, 핵산 정제 키트(FastPrep FP100A·FastDNA Kit; 후나코시사(Funakoshi Co., Ltd.) 제품)를 이용해서 정제하였다.

<3-2. 회수한 유전체 DNA의 검사>

회수한 균(칸디다 알비칸스)의 유전체 DNA 상에, 통상의 방법에 따라서, 아가로스 전기영동과 260/280-㎚의 흡광도 측정을 행하여, 품질(저분자 핵산의 혼입량 및 분해의 정도)과 회수량을 검정하였다. 본 실시예에서는, 약 10 ㎍의 유전체 DNA가 회수되었고, 유전체 DNA의 분해나 rRNA의 혼입은 확인되지 않았다. 회수한 유전체 DNA는, 최종 농도가 50 ng/㎕로 되도록 TE 완충액에 용해시켜, 이하의 실시예에 사용하였다.

<4. DNA 마이크로어레이의 제작>

<4-1. 유리 기판의 세정>

합성 실리카로 이루어진 유리 기판(크기: 25㎜×75㎜×1㎜, 이이야마 토쿠슈 유리사(Iiyama Tokushu Glass) 제품)을, 내열·내알칼리성 랙(rack)에 놓고, 소정의 농도로 조제한 초음파 세정용의 세정액에 담갔다. 이 유리기판을 하룻밤 세정액중에 담근 후, 20분간 초음파 세정에 의해 세척하였다. 이어서 기판을 꺼내어, 가볍게 순수로 헹군 후, 초순수 속에서 20분간 초음파 세정에 의해 세척하였다. 다음에, 80℃로 가열한 1N 수산화나트륨 수용액 중에 10분간 상기 기판을 담갔다. 재차 순수 세정과 초순수 세정을 행하였다. 이와 같이 해서, DNA 칩용의 석영 유리 기판을 준비하였다.

<4-2. 표면 처리>

실란커플링제 KBM-603(신에츠 실리콘사 제품)을, 1 중량%의 농도로 되도록 순수중에 용해시키고, 2시간 실온에서 교반하였다. 이어서, 상기 세정한 유리기판을 실란커플링제 수용액에 담그고, 20분간 실온에서 방치하였다. 이 유리기판을 끌어올려, 가볍게 순수로 표면을 세정한 후, 질소가스를 기판의 양면에 분사해서 건조시켰다. 이 건조된 기판을 120℃로 가열한 오븐 중에서 1시간 소성하여, 커플링제 처리를 완결시킴으로써, 기판 표면에 아미노기를 도입하였다. 이어서, N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미도(이하, "EMCS"라 약칭함)를 디메틸술폭사이드와 에탄올의 혼합용매(용적비 = 1:1) 중에 최종농도가 0.3 ㎎/㎖로 되도록 용해시켜, EMCS 용액을 준비하였다. EMCS는 도진도 연구소(Dojindo Laboratories)에서 제조된 N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미도였다.

소성된 유리기판을 방냉하고, 조제한 EMCS 용액 중에 실온에서 2시간 담갔다. 이 처리에 의해, 실란커플링제에 의해서 표면에 도입된 아미노기와 EMCS의 숙신이미드기가 반응해서, 유리기판 표면에 말레이미드기가 도입되었다. EMCS 용액으로부터 끌어올린 유리기판을, 전술한 EMCS를 용해시킨 혼합용매를 이용해서 세정하였다. 이 유리 기판을 에탄올에 의해 더욱 세정한 후, 질소가스분위기하에서 건조시켰다.

<4-3. 프로브 DNA>

상기 실시예 1의 <1. 프로브 DNA의 준비>에서 제작한 균 검출용 프로브를 순수에 용해시켰다. 이 용액을 최종농도(잉크용해시)가 10μM로 되도록 분주(分注)하였다. 이어서, 이 용액을 동결건조시켜 수분을 제거하였다.

<4-4. BJ 프린터에 의한 DNA 토출 및 기판에의 결합>

글리세린 7.5 중량%, 티오디글리콜 7.5 중량%, 요소 7.5 중량% 및 아세틸레놀 EH(카와켄 파인 케미컬사 제품) 1.0 중량%를 함유하는 수용액을 준비하였다. 이어서, 앞서 준비한 5종류의 프로브(표 1)의 각각을 상기 용매 혼합액에 규정농도로 되도록 용해시켰다. 얻어진 DNA 용액을 버블젯 프린터(상품명: BJF-850; 캐논사 제품)용 잉크탱크에 충전하고, 이 탱크를 인자헤드에 장착하였다.

또, 여기서 이용한 버블젯 프린터는 평판에의 인쇄가 가능하도록 미리 개조를 실시하였다. 또한, 이 버블젯 프린터는, 소정의 파일작성방법에 따라서 인자 패턴을 입력함으로써, 약 5 pℓ의 DNA 용액을 약 120 ㎛ 피치로 스폿팅하는 것이 가능하게 되어 있었다.

이어서, 이 개조된 버블젯 프린터를 이용해서, 1매의 유리기판에 대해서 인자조작을 행하여, 어레이를 제작하였다. 인자가 확실하게 행해진 것을 확인한 후, 30분간 가습실 내에 정치하여, 유리기판 표면의 말레이미드기와 핵산 프로브말단의 티올기를 반응시켰다.

<4-5. 세정>

30분간의 반응 후, 100 mM의 NaCl을 함유하는 10mM의 인산 완충액(pH 7.0)에 의해 표면에 잔류하는 DNA용액을 세정함으로써, 유리기판 표면에 1본쇄 DNA가 고정된 DNA 마이크로어레이를 얻었다.

<5. 검체의 증폭 및 표지화>

<5-1. 검체의 증폭: 1차 PCR>

검체로서의 미생물 유전자의 증폭(1차 PCR)을 이하의 표 4에 표시한다

cAmpliTaq Gold (5U/㎕)	0.5 ㎕
템플레이트 유전체 DNA	가변
dNTP 믹스 (2.5 mM/각각)	4.0 ㎕
×10 PCR 완충액	5.0 ㎕
25 mM MgCl₂	7.0 ㎕
포워드 프라이머	0.25 ㎕
리버스 프라이머	0.25 ㎕
H₂O	가변
합계	50 ㎕

상기 조성을 지닌 반응액의 증폭 반응을, 도 1에 표시한 프로토콜에 따라서 시판의 유전자 증폭기(thermal cycler)를 이용해서 행하였다.

반응 종료후, 정제용 컬럼(QIAquick PCR 정제 키트; 퀴아겐사(QIAGEN) 제품)을 이용해서 프라이머를 정제한 후, 증폭산물을 분석평가하였다.

<5-2. 표지화 반응: 2차 PCR>

하기 표 5에 표시한 조성을 지닌 반응액의 증폭용의 2차 PCR 반응을 도 2에 표시한 프로토콜에 따라서 시판의 유전자 증폭기를 이용해서 행하였다.

프레믹스 PCR 시약 (TAKARA ExTaq)	25 ㎕
템플레이트 DNA (1차 PCR 산물)	가변 (30 ng/tube)
Cy3-표지된 리버스 프라이머	5 ㎕
H₂O	가변
합계	50 ㎕

반응 종료후, 정제용 컬럼(QIAquick PCR 정제 키트; 퀴아겐사(QIAGEN) 제품)을 이용해서 정제를 행하여 표지화된 검체를 얻었다.

<6. 하이브리다이제이션>

상기 <4. DNA 마이크로어레이의 제작>에서 제작한 DNA 마이크로어레이와 상기 <5. 검체의 증폭 및 표지화> 과정에서 제작한 표지화된 검체를 이용해서 검출반응을 행하였다.

<6-1. DNA 마이크로어레이의 블로킹>

BSA(소혈청 알부민, Fraction V; 시그마사 제품)를 1 중량%의 농도로 되도록 100 mM NaCl/10-mM 인산 완충액에 용해시켰다. 다음에, 이 용액에 <4. DNA마이크로어레이의 제작> 과정에서 제작한 DNA 마이크로어레이를 실온에서 2시간 침지해서, 블로킹을 행하였다. 블로킹 종료 후, 이하의 세정액에 의한 세정에 이어, 순수로 헹구고, 회전건조장치에서 탈수시켰다.

세정액:

0.1 중량% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 함유하는 2×SSC 용액(NaCl 300mM, 구연산 나트륨(trisodium citrate dihydrate, C₆H₅Na₃·2H₂O) 30mM, pH 7.0).

<6-2. 하이브리다이제이션>

탈수시킨 DNA 마이크로어레이를 하이브리다이제이션 장치(Hybridization Station; Genomic Solutions Inc.사 제품)에 세트하고, 이하에 표시한 조건하에서 하이브리다이제이션 용액을 이용해서 하이브리다이제이션 반응을 행하였다.

<6-3. 하이브리다이제이션 용액>

6×SSPE/10% 포름 아마이드/표적(모두 2차 PCR 산물)/0.05% SDS

(6×SSPE: NaCl 900mM, NaH₂PO₄·H₂O 50mM, EDTA 6mM, pH 7.4)

<6-4. 하이브리다이제이션 조건>

65℃ 3분 → 92℃ 2분 → 45℃ 3시간 → 2×SSC/0.1중량% SDS, 25℃ 세정 → 2×SSC, 20℃ 세정 → (H₂O에 의한 헹굼: 수동) →회전 건조.

<7. 균 검출(형광 측정)>

상기 하이브리다이제이션 반응 종료 후의 DNA 마이크로어레이를 DNA 마이크로어레이용 형광검출장치(GenePix 4000B; Axon사 제품)를 이용해서 형광측정을 행하였다. 그 결과, 칸디다 알비칸스는 재현성 높게 충분한 시그널에 의해 검출되었다. 또, 다른 균으로부터의 프로브에 대한 명백한 하이브리드체는 검출되지 않았다.

<8. 기타 균의 검출>

하기에 열거된 각 균을 검출하기 위한 프로브 세트를 설계하여 제작하고, 전술한 바와 마찬가지 방법에 의해 검사(하이브리다이제이션 반응)를 행하였다. 이하의 표 6 내지 14에 있어서, 프로브 세트에 이용되는 프로브의 서열이 서열번호로 표시되어 있다.

(1) 칸디다 글라브라타

(2) 칸디다 귤리에몬디

(3) 칸디다 크루세이

(4) 칸디다 파라프실로시스

(5) 크립토콕쿠스 네오포르만스

(6) 트리코스포론 바이겔리

(7) 아스페르길루스 푸미가투스

(8) 아스페르길루스 니게르

<9. 결과>

결과는 이하의 표 6 내지 14에 표시되어 있다. 실험으로부터 얻어진 강도 값의 SN비에 있어서, 하이브리다이제이션 이후의 반응강도의 지표로서 이하의 부호를 이용하였다. SN 비가 3보다 큰 경우에는 "+++"를 이용하였다. 또, SN 비가 2보다 크고 3 이하인 경우에는 "++", 1보다 크고 2 이하인 경우에는 "+", 그리고 1 이하인 경우에는 "-"를 각각 이용하였다.

칸디다 알비칸스

균 명 명	서열번호: 1	서열번호: 2	서열번호: 3	서열번호: 4	서열번호: 5
칸디다 알비칸스	+++	+++	+++	+++	+++
칸디다 글라브라타	-	-	-	-	-
칸디다 귤리에몬디	++	-	+	+	++
칸디다 크루세이	++	-	+	+	-
칸디다 파라프실로시스	++	++	++	++	++
크립토콕쿠스 네오포르만스	-	-	-	-	-
트리코스포론 바이겔리	-	-	-	-	-
아스페르길루스 푸미가투스	-	-	+	-	-
아스페르길루스 니게르	-	-	+	-	-
인간 18S rRNA	-	-	-	-	-

칸디다 글라브라타

균 명	서열번호: 6	서열번호: 7	서열번호: 8	서열번호: 9	서열번호: 10
칸디다 알비칸스	-	-	+	-	+
칸디다 글라브라타	+++	+++	+++	+++	+++
칸디다 귤리에몬디	-	-	++	+	-
칸디다 크루세이	-	-	-	+	-
칸디다 파라프실로시스	-	-	++	-	+
크립토콕쿠스 네오포르만스	-	-	-	-	-
트리코스포론 바이겔리	-	-	+	-	-
아스페르길루스 푸미가투스	-	-	++	-	-
아스페르길루스 니게르	-	-	++	-	-
인간 18S rRNA	-	-	-	-	-

칸디다 귤리에몬디

균 명	서열번호: 11	서열번호: 12	서열번호: 13	서열번호: 14	서열번호: 15
칸디다 알비칸스	-	+	-	-	++
칸디다 글라브라타	+	-	-	-	-
칸디다 귤리에몬디	+++	+++	+++	+++	+++
칸디다 크루세이	+	-	-	-	-
칸디다 파라프실로시스	+++	+	-	-	++
크립토콕쿠스 네오포르만스	-	-	-	-	-
트리코스포론 바이겔리	-	-	-	-	-
아스페르길루스 푸미가투스	-	+	-	-	-
아스페르길루스 니게르	-	+	-	-	-
인간 18S rRNA	-	-	-	-	-

칸디다 크루세이

균 명	서열번호: 16	서열번호: 17	서열번호: 18	서열번호: 19	서열번호: 20	서열번호: 21
칸디다 알비칸스	+	-	-	-	-	-
칸디다 글라브라타	-	-	-	-	-	-
칸디다 귤리에몬디	+	-	-	-	-	-
칸디다 크루세이	+++	+++	+++	+++	+++	+++
칸디다 파라프실로시스	+	-	-	-	-	-
크립토콕쿠스 네오포르만스	-	-	-	-	-	-
트리코스포론 바이겔리	-	-	-	-	-	-
아스페르길루스 푸미가투스	-	-	-	-	-	-
아스페르길루스 니게르	-	-	-	-	-	-
인간 18S rRNA	-	-	-	-	-	-

칸디다 파라프실로시스

균 명	서열번호: 22	서열번호: 23	서열번호: 24	서열번호: 25	서열번호: 26
칸디다 알비칸스	++	-	+	++	++
칸디다 글라브라타	-	-	-	-	+
칸디다 귤리에몬디	-	+	++	++	++
칸디다 크루세이	-	+	++	-	-
칸디다 파라프실로시스	+++	+++	+++	+++	+++
크립토콕쿠스 네오포르만스	-	-	-	-	-
트리코스포론 바이겔리	-	-	-	-	-
아스페르길루스 푸미가투스	-	-	+	-	-
아스페르길루스 니게르	-	-	+	-	-
인간 18S rRNA	-	-	-	-	-

크립토콕쿠스 네오포르만스

균 명	서열번호: 27	서열번호: 28	서열번호: 29	서열번호: 30	서열번호: 31
칸디다 알비칸스	-	-	-	-	-
칸디다 글라브라타	-	-	-	-	-
칸디다 귤리에몬디	-	-	-	-	-
칸디다 크루세이	-	-	-	-	-
칸디다 파라프실로시스	-	-	-	-	-
크립토콕쿠스 네오포르만스	+++	+++	+++	+++	+++
트리코스포론 바이겔리	-	-	-	-	-
아스페르길루스 푸미가투스	+	-	-	-	-
아스페르길루스 니게르	+	-	-	-	-
인간 18S rRNA	-	-	-	-	-

트리코스포론 바이겔리

균 명	서열번호: 32	서열번호: 33	서열번호: 34	서열번호: 35	서열번호: 36
칸디다 알비칸스	-	-	-	-	-
칸디다 글라브라타	-	-	-	-	-
칸디다 귤리에몬디	-	-	++	-	-
칸디다 크루세이	-	-	-	-	-
칸디다 파라프실로시스	-	-	-	-	-
크립토콕쿠스 네오포르만스	-	-	-	-	-
트리코스포론 바이겔리	+++	+++	+++	+++	+++
아스페르길루스 푸미가투스	-	-	-	-	-
아스페르길루스 니게르	-	-	-	-	-
인간 18S rRNA	-	-	-	-	-

아스페르길루스 푸미가투스

균 명	서열번호: 37	서열번호: 38	서열번호: 39	서열번호: 40	서열번호: 41
칸디다 알비칸스	-	-	+	-	-
칸디다 글라브라타	-	-	++	-	+
칸디다 귤리에몬디	-	-	++	-	-
칸디다 크루세이	+	-	++	-	-
칸디다 파라프실로시스	-	-	+	-	-
크립토콕쿠스 네오포르만스	-	-	-	-	-
트리코스포론 바이겔리	-	-	-	-	-
아스페르길루스 푸미가투스	+++	+++	+++	+++	+++
아스페르길루스 니게르	++	+++	+++	+	+++
인간 18S rRNA	-	-	++	-	-

아스페르길루스 니게르

균 명	서열번호: 42	서열번호: 43	서열번호: 44	서열번호: 45	서열번호: 46
칸디다 알비칸스	+	-	-	-	-
칸디다 글라브라타	-	-	-	-	-
칸디다 귤리에몬디	-	-	-	-	-
칸디다 크루세이	-	+	-	-	-
칸디다 파라프실로시스	-	-	-	-	-
크립토콕쿠스 네오포르만스	+	-	-	-	-
트리코스포론 바이겔리	-	-	-	-	-
아스페르길루스 푸미가투스	+++	++	+++	-	++
아스페르길루스 니게르	+++	+++	+++	+++	+++
인간 18S rRNA	-	-	-	-	-

상기 설명한 바와 같이, 상기 실시예에 의하면 표 6 내지 표 14의 9종의 균을 검출가능한 프로브 세트가 고정화된 DNA 마이크로어레이를 제작하였다. 또, 이 DNA 마이크로어레이의 사용에 의해 감염성 병인균의 동정이 가능해지고, 이에 따라, 균(미생물)으로부터 유래하는 DNA 프로브의 문제점을 해결하였다. 즉, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 덩어리로 화학적으로 합성될 수 있고, 정제 및 농축의 제어가 가능하다. 또, 진균의 종에 의한 분류 대상에 의하면, 다른 종의 균과 구별하면서 동종의 균을 일괄적으로 검출가능한 프로브 세트가 제공될 수 있다.

상기 실시예에 의하면, 감염성 병인균의 18S rRNA 유전자 서열은 과·부족되는 일없이 검출되고, 이에 따라 감염성 병인균의 존재는 효율 좋고 고정밀도로 판정될 수 있다.

또, 상기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 동일 군으로부터 2종 이상의 프로브, 예를 들어, 바람직하게는 3종 이상, 더욱 바람직하게는 5종 모두가 사용되고, 얻어진 각 신호에 대한 신호비의 분석에 의해 추정되는 반응강도의 지표를 통해 고도로 정확한 판정을 행할 수 있다.

( 실시예 2)

후술하는 실시예에 있어서는 실시예 1에서 사용된 9종의 균의 증폭에 대해서 설명한다.

<1. 검체 증폭용 PCR 프라이머의 제작>

검체 증폭을 위한 18S rRNA 유전자 (표적 유전자) 증폭용 PCR 프라이머로서 표 2에 표시된 핵산 서열을 설계하였다.

더욱 구체적으로는, 18S rRNA 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트, 즉 약 1,700의 염기 길이의 18S rRNA 유전자 부호화 영역의 양단 부분에서, 특이적인 융점을 가능한 한 균일하게 한 프라이머를 설계하였다. 또, 변형 균주 또는, 유전체에 존재하는 복수의 18S rRNA 유전자 부호화 영역을 동시에 증폭하도록 프라이머를 설계하였다.

또한, 특히 인간 유전체와 진균 유전체가 혼합되어 있는 실험계에서도 상기 프라이머는 진균 유전체만을 선택적으로 증폭하도록 설계되었다.

	프라이머 번호	서열번호	서열
포워드 프라이머	F-1	47	5' gccctatcaactttcgatggtaggatag 3'
리버스 프라이머	R-1	48	5' aatgctctatccccagcacgac 3'
리버스 프라이머	R-2	49	5' tcggcaccttacgagaaatcaaagt 3'

표 15에 표시된 프라이머는 합성 후 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제하고, 포워드 프라이머(Forward Primer)와 2종의 리버스 프라이머(Reverse Primer)를 모두 혼합하였다. 이때, 이들은 각각의 프라이머가 최종농도가 10 pmol/㎕로 되도록 TE 완충액에 용해시켰다. 본 실시예에서는 2종의 리버스 프라이머를 사용하였으나, 이들 중 어느 하나를 이용해도 된다.

<2. 칸디다 알비칸스의 유전체 DNA(모델 검체)의 추출>

<2-1. 미생물 배양 및 유전체 DNA 추출>

먼저, 통상의 방법에 따라 칸디다 알비칸스(ATCC18804)의 표준 균주를 배양하였다. 이 미생물 배양액으로부터 유전체 DNA를 추출하고, 핵산 정제 키트(FastPrep FP100A·FastDNA Kit; 후나코시사(Funakoshi Co., Ltd.) 제품)를 이용해서 정제하였다.

<2-2. 회수한 유전체 DNA의 검사>

회수한 균(칸디다 알비칸스)의 유전체 DNA 상에, 통상의 방법에 따라서, 아가로스 전기영동과 260/280-㎚의 흡광도 측정을 행하여, 품질(저분자 핵산의 혼입량 및 분해의 정도)과 회수량을 검정하였다. 본 실시예에서는, 약 10 ㎍의 유전체 DNA가 회수되었고, 유전체 DNA의 분해나 rRNA의 혼입은 확인되지 않았다. 회수한 유전체 DNA는 최종 농도가 50 ng/㎕로 되도록 TE 완충액에 용해시켜, 이하에 표시한 바와 같이 사용하였다.

상기 DNA를 이용해서, 하기 표 16에 표시한 반응액을 제조하였다.

프레믹스 PCR 시약 (TAKARA ExTaq)	25 ㎕
템플레이트 유전체 DNA	2 ㎕(100 ng)
포워드 프라이머	2 ㎕
리버스 프라이머 믹스	2 ㎕(20 pmol/tube each)
Cy-3 dUTP	2 ㎕(2 nmol/tube)
H₂O	17 ㎕
합계	50 ㎕

상기 조성을 지닌 반응액의 증폭 반응을, 도 1에 표시한 프로토콜에 따라서 시판의 유전자 증폭기를 이용해서 행하였다. 반응 종료후, 정제용 컬럼(QIAquick PCR 정제 키트; 퀴아겐사(QIAGEN) 제품)을 이용해서 정제를 행하고, 증폭 산물에 대해서 겔전기영동을 실시하였다. 그 결과, 9종의 균 모두로부터 1700 염기쌍 영역 부근에서 1개의 밴드가 검출되었고, 이것에 의해 PCR 반응이 양호하게 수행된 것이 확인되었다.

( 실시예 3)

이하의 실시예는 인간 유전체 중의 18S rRNA를 부호화하는 부분이 실시예 2에서 이용된 프라이머에 의해 증폭될 수 없는 것을 설명한다.

PCR 반응용의 템플레이트로서, 인간 유전체에 실시예 2와 마찬가지 방법으로 프라이머 세트를 이용해서 PCR 반응을 행하였다. 그 결과, PCR에 의해 증폭된 밴드가 검출되지 않았고, 이것으로 인해 실시예 2에 있어서 표 15의 프라이머 세트에 의해서는 인간 유전체의 증폭을 행할 수 없는 것이 확인되었다. 이것은 본 발명의 프라이머 세트가 인간 유전체와 진균 유전체가 혼합되어 있을 수 있는 임상적 검체로부터의 균 유전체의 18S rRNA 유전자만 선택적으로 증폭할 수 있는 것을 나타낸다.

( 실시예 4)

이하의 실시예는, 2종의 균이 검체에 포함된 경우, 이들 균을 모두 동시에 검출할 수 있는 것을 설명한다.

<1. 검체 모델의 제작>

실시예 1의 <3-1. 미생물 배양 및 유전체 DNA 추출>에 기재된 방법에 따라서, 칸디다 크루세이 및 아스페르길루스 푸미가투스를 배양하고, 유전체 DNA의 추출 및 정제를 행하였다.

<2. DNA 마이크로어레이의 제작>

실시예 1의 <4. DNA 마이크로어레이의 제작>에 기재된 방법에 따라서, DNA 마이크로어레이를 제작하였다. 본 실시예의 목적은 칸디다 크루세이 및 아스페르길루스 푸미가투스를 동시에 검출할 수 있는 것이고, 따라서, 이하의 표 17에 표시된 프로브만이 상부에 고정화된 DNA 마이크로어레이를 제작하였다.

서열번호	표적 균의 종류
서열번호: 5	칸디다 알비칸스
서열번호: 6	칸디다 글라브라타
서열번호: 7	칸디다 글라브라타
서열번호: 10	칸디다 글라브라타
서열번호: 13	칸디다 귤리에몬디
서열번호: 14	칸디다 귤리에몬디
서열번호: 17	칸디다 크루세이
서열번호: 18	칸디다 크루세이
서열번호: 19	칸디다 크루세이
서열번호: 22	칸디다 파라프실로시스
서열번호: 27	크립토콕쿠스 네오포르만스
서열번호: 28	크립토콕쿠스 네오포르만스
서열번호: 32	트리코스포론 바이겔리
서열번호: 33	트리코스포론 바이겔리
서열번호: 39	아스페르길루스 푸미가투스
서열번호: 40	아스페르길루스 푸미가투스
서열번호: 41	아스페르길루스 푸미가투스
서열번호: 45	아스페르길루스 니게르

<3. 검체의 증폭 및 표지화>

본 실시예의 <1. 검체 모델의 제작> 과정에서 추출되어 정제된 칸디다 크루세이 및 아스페르길루스 푸미가투스의 유전체 DNA를 혼합해서 템플레이트 DNA를 얻었다. 이 템플레이트 DNA를 실시예 1의 <5. 검체의 증폭 및 표지화>에 기재된 방법에 따라 증폭하고 표지화하였다.

<4. 하이브리다이제이션>

상기 <2. 검체의 증폭 및 표지화>에서 제작된 표지화된 검체 및 상기 실시예 1의 <4. DNA 마이크로어레이의 제작>에서 얻어진 DNA 마이크로어레이를 이용해서 실시예 1의 <6. 하이브리다이제이션>에 기재된 검출 반응을 행하였다.

<5. 균 검출 (형광 검출)>

상기 하이브리다이제이션 반응 후의 DNA 마이크로어레이를 DNA 마이크로어레이용 형광검출장치(GenePix 4000B; Axon사 제품)를 이용해서 형광측정을 행하였다. 동일한 실험을 2회 행하고, 얻어진 강도를 표준화하였다. 그 표준화 결과는 이하의 표 18에 표시되어 있다.

실험으로부터 얻어진 강도 값의 SN비에 있어서, 하이브리다이제이션 이후의 반응강도의 지표로서 이하의 부호를 이용하였다. SN 비가 3보다 큰 경우에는 "+++"를 이용하였다. 또, SN 비가 2보다 크고 3 이하인 경우에는 "++", 1보다 크고 2 이하인 경우에는 "+", 그리고 1 이하인 경우에는 "-"를 각각 이용하였다.

서열번호	제 1 실험	제 2 실험
서열번호: 5	++	++
서열번호: 6	-	-
서열번호: 7	-	-
서열번호: 10	-	-
서열번호: 13	-	-
서열번호: 14	+	+
서열번호: 17	+++	+++
서열번호: 18	+++	+++
서열번호: 19	+++	+++
서열번호: 22	-	-
서열번호: 27	-	-
서열번호: 28	-	-
서열번호: 32	-	-
서열번호: 33	-	-
서열번호: 39	+++	+++
서열번호: 40	+++	+++
서열번호: 41	+++	+++

상기 제 1 실험과 제 2 실험간의 강도의 절대치에 차이가 있었으나, 표준화의 결과, 서열번호: 17, 18, 19, 39, 40 및 41의 강도는 현저하게 높은 강도를 나타내었다. 이들 서열 번호의 프로브들은 표 17에 표시된 바와 같은 칸디다 크루세이 및 아스페르길루스 푸미가투스를 판정하기 위한 프로브들이다. 상기 결과에 비추어, 검체가 2종의 균의 유전체를 함유하더라도, 본 실시예의 DNA 칩은 각 균의 존재를 판정할 수 있다.

참고로, 본 실시예에서 이용된 표준 균주는 하기 표 19와 같다.

번호	진균명	표준 균주
1	칸디다 알비칸	ATCC 18804
2	칸디다 글라브라타	JCM 3761
3	칸디다 귤리에몬디	ATCC 6260
4	칸디다 크루세이	JCM 1609
5	칸디다 파라프실로시스	JCM 1618
6	크립토콕쿠스 네오포르만스	ATCC 32045
7	트리코스포론 바이겔리	JCM 1809
8	아스페르길루스 푸미가투스	JCM10253
9	아스페르길루스 니게르	JCM 10254

본 발명은 상기 실시예로 한정되지 않고, 본 발명의 정신과 범위 내에서 각종 변화와 변경이 수행될 수 있다. 본 발명의 범위를 공중에게 알리기 위해, 이하의 청구범위를 작성하였다.

이상 본 발명은 예시적인 실시예를 참조해서 설명하였으나, 본 발명은 개시된 예시적인 실시예로 제한되지 않는다. 이하의 특허청구범위의 범주는 이러한 변형과 등가의 구성 및 기능을 망라하도록 최광의의 해석에 따를 필요가 있다.

도 1은 PCR 조건을 표시한 도면;

도 2는 PCR 조건을 표시한 도면.

<110> CANON KABUSHIKI KAISHA <120> PROBE SET, PROBE IMMOBILIZED CARRIER AND GENE EXAMINATION METHOD <150> JP2005-355977 <151> 2005-12-09 <160> 49 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida albicans <400> 1 acgatacagg gcccttttgg gt 22 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida albicans <400> 2 atctttttcg atgcgtactg gaccag 26 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida albicans <400> 3 gccatttatg gcgaaccagg actt 24 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida albicans <400> 4 aggacgttat ggttctattg tgttggtt 28 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida albicans <400> 5 ggactatcga ctccaagtcg atgga 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida glabrata <400> 6 cggtccgatt ttttcgtgta ctgga 25 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida glabrata <400> 7 aaccccaagt ccttgtggct tg 22 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida glabrata <400> 8 tggaataatg gaataggacg tttggttct 29 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida glabrata <400> 9 ttttagtgac ccactcggca cct 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida glabrata <400> 10 gctagcattt gctggttgtc cact 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida guilliermondii <400> 11 gatacagggc cctttcgggt ct 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida guilliermondii <400> 12 ttttggcgag tactggaccc aac 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida guilliermondii <400> 13 ctaaccattc gcccttgtgg tgtt 24 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida guilliermondii <400> 14 atcgggtgtt gttctttttt tgacgc 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida guilliermondii <400> 15 aaatagtgct gctagctttt gctggt 26 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida krusei <400> 16 atataacgat acagggcctt tggtcttg 28 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida krusei <400> 17 ggcggacggt ctacctatgg taa 23 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida krusei <400> 18 accaggacga ttactttgag gaaattaga 29 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida krusei <400> 19 ggtggtgcta ctttgcccac tc 22 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida krusei <400> 20 agacttctct tgatcttacg ggtggt 26 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Candida krusei <400> 21 aaatagggct gcgagcatct gc 22 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 22 gccggtccat cttttttgat gcgta 25 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 23 tctggctagc ctttttggcg aac 23 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 24 tcagtattca gtagtcagag gcgaaattc 29 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 25 tgttgttctt ttattgacgc aatcggc 27 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 26 tgctgctagc atttgctggt atagtc 26 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 27 acaatacagg gctcttttgg gcc 23 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 28 ctggtggtcc tgtatgctct ttactg 26 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 29 ttgacggaag accaacaact gcg 23 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 30 gatcggccca cgtcaatctc tg 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Cryptococcus neoformans <400> 31 cggcgtctag tcgacggaag tt 22 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Trichosporon beigelii <400> 32 gaggaacggt ctgccttacg gta 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Trichosporon beigelii <400> 33 ttcattgagt gtgcggtgga acc 23 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 34 cttagattta cggaagacta acaactgcg 29 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Trichosporon beigelii <400> 35 tcggtccacg ttattttctg actgga 26 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Trichosporon beigelii <400> 36 ggactaacag cgtttagctg ttggaa 26 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus fumigatus <400> 37 ttctggggaa cctcatggcc tt 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus fumigatus <400> 38 atagggatag tcgggggcgt ca 22 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus fumigatus <400> 39 aaagcattcg ccaaggatgt tttcattaa 29 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus fumigatus <400> 40 cggtgtttct atgatgaccc gctc 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus fumigatus <400> 41 cttcttaggg ggactatcgg ctca 24 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus niger <400> 42 ggggctcttt tgggtctcgt aatt 24 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus niger <400> 43 ctggggaatc tcatggcctt cac 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus niger <400> 44 ggatagtcgg gggcgtcagt att 23 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus niger <400> 45 gtgtttctat tatgacccgt tcggca 26 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Aspergillus niger <400> 46 agacctcggc ccttaaatag ccc 23 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 47 gccctatcaa ctttcgatgg taggatag 28 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 48 aatgctctat ccccagcacg ac 22 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 49 tcggcacctt acgagaaatc aaagt 25

Claims

1) 이하의 제 3군으로부터 선택된 제 1 프로브, 및 이하의 제 3군에 속하지만 상기 제 1 프로브와는 다른 제 2 프로브를 포함하거나; 또는

2) 상기 제 1 프로브와 상보적인 염기서열을 지닌 제 3 프로브 및 상기 제 2 프로브와 상보적인 염기서열을 지닌 제 4 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 병인균 유전자 검출용 프로브 세트:

제 3군:

(1) gatacagggccctttcgggtct(서열번호: 11)로 이루어진 염기서열을 지닌 프로브;

(2) ttttggcgagtactggacccaac(서열번호: 12)로 이루어진 염기서열을 지닌 프로브;

(3) ctaaccattcgcccttgtggtgtt(서열번호: 13)로 이루어진 염기서열을 지닌 프로브;

(4) atcgggtgttgttctttttttgacgc(서열번호: 14)로 이루어진 염기서열을 지닌 프로브; 및

(5) aaatagtgctgctagcttttgctggt(서열번호: 15)로 이루어진 염기서열을 지닌 프로브.

제 1항의 프로브 세트를 구성하는 복수의 프로브가 서로 떨어져서 고상 담체(solid phase carrier) 상에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 프로브-고정화 담체.

프로브-고정화 담체를 이용해서 검체 중의 감염성 병인균 유전자를 검출하는 방법에 있어서,

(i) 제 2항의 프로브-고정화 담체를 검체와 반응시키는 공정; 및

(ii) 검체 중의 핵산과 반응한 올리고뉴클레오타이드의 반응 강도를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 3항에 있어서, 상기 공정 (i) 전에, gccctatcaactttcgatggtaggatag(서열번호: 47)의 염기서열로 이루어진 프라이머와, 이하의 (A) 및 (B)의 2종의 프라이 머 중 적어도 1종의 프라이머를 지닌 프라이머 세트를 이용해서 검체에 증폭처리를 행하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

(A) aatgctctatccccagcacgac(서열번호: 48)로 이루어진 프라이머; 및

(B) tcggcaccttacgagaaatcaaagt(서열번호: 49)로 이루어진 프라이머.

삭제

제 1항의 프로브 세트; 및

이하의 프라이머 세트

를 포함하되,

상기 프라이머 세트는 gccctatcaactttcgatggtaggatag(서열번호: 47)의 염기서열로 이루어진 프라이머와, 이하의 (a) 및 (b)의 2종의 프라이머 중 적어도 1종의 프라이머를 지닌 것을 특징으로 하는 감염성 병인균 검출용 키트:

(a) aatgctctatccccagcacgac(서열번호: 48)로 이루어진 프라이머; 및

(b) tcggcaccttacgagaaatcaaagt(서열번호: 49)로 이루어진 프라이머.

1) gccctatcaactttcgatggtaggatag(서열번호: 47)의 염기서열로 이루어진 프라이머와, 이하의 (a) 및 (b)의 2종의 프라이머 중 적어도 1종의 프라이머를 이용해서 검체 중의 핵산을 증폭시키는 단계:

(a) aatgctctatccccagcacgac(서열번호: 48)로 이루어진 프라이머; 및

(b) tcggcaccttacgagaaatcaaagt(서열번호: 49)로 이루어진 프라이머; 및

2) 제 1항에 기재된 감염성 병인균 유전자 검출용 프로브 세트를 이용해서 상기 1) 단계에서 증폭된 감염성 병인균 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 병인균 유전자의 검출 방법.

제 2항의 프로브-고정화 담체; 및

이하의 프라이머 세트

를 포함하되,

(a) aatgctctatccccagcacgac(서열번호: 48)로 이루어진 프라이머; 및

(b) tcggcaccttacgagaaatcaaagt(서열번호: 49)로 이루어진 프라이머.