DE19635347C1

DE19635347C1 - Sequentielle Hybridisierung von Pilzzellen-DNA sowie Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen in klinischem Material

Info

Publication number: DE19635347C1
Application number: DE19635347A
Authority: DE
Inventors: Juergen Loeffler; Hermann Dr Einsele
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 1996-08-31
Filing date: 1996-08-31
Publication date: 1997-12-18
Anticipated expiration: 2016-09-01
Also published as: CA2263992A1; CA2263992C; US6046006A; EP0922113A1; JP2000503547A; AU3622297A; AU727945B2; WO1998008972A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen in klinischem Material.

Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen in klinischem Material sind von großem Interesse, da insbesondere in den letzten Jahren Pilzspezies als bedeutende nosokomiale Pathogene eine erhebliche Bedeutung insbesondere für immunsupprimierte Patienten erlangt haben. Werden Pilzinfektionen bei solchen Patienten zu spät erkannt, so breiten sie sich im Patientenorganismus aus und führen zu einer hohen Mortalitätsrate. Der Behandlungserfolg kann nur durch eine frühzeitige Diagnose verbessert werden.

Die zum Nachweis von Pilzinfektionen bekannten Standardverfahren, die auf der Anzüchtung von isolierten Pilzen beruhen, sind kompliziert und langwierig. Demgegenüber können mit neuen, auf molekularbiologischen Verfahren beruhende Techniken Pilzin fektionen sensitiv und frühzeitig erkannt werden. Diese Verfahren setzen jedoch voraus, daß Pilz-spezifische Nucleinsäuren effizient aus klinischem Material extrahiert werden können. Um anhand dieser extrahierten Nucleinsäuren die der Infektion zugrundeliegende Pilzspezies zu identifizieren, müssen spezi fische Sequenzen verschiedener pathogener Pilzspezies bekannt sein. Dabei ist eine Differenzierung der verschiedenen Pilz spezies notwendig, da sich die jeweilige Therapie nach der individuellen Pilzinfektion richtet.

Vor diesem Hintergrund wurde ein Verfahren entwickelt, mit Hilfe dessen Pilz-DNA aus Patientenmaterial extrahiert, die Pilz-DNA nachgewiesen und verschiedene Pilzspezies anhand der extrahierten DNA identifiziert werden können. Dieses Verfahren ist in der nicht vorveröffentlichten DE 1 95 30 336.9 wie folgt beschrieben:

Zunächst wird die Pilz-DNA aus Vollblut von Patienten extrahiert. Dazu werden Pilzzellen zuerst aus Blutzellen isoliert. Danach werden die Pilzzellen lysiert und ihre DNA aus dem Lysat gereinigt. Aus der gewonnenen Pilzzellen-DNA werden Pilz spezifische DNA-Segmente in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Diese PCR-Reaktion wird mit zwei Primern durchgeführt, die einen ungefähr 500 Nukleotide umfassenden Bereich aus dem Gen für die 18ssu rRNA amplifizieren. Die Primer sind dabei so gewählt, daß nur der entsprechende Genbereich aus Pilzen, nicht jedoch Genbereiche aus anderen Organismen wie bspw. den körpereigenen Zellen des Patienten amplifiziert werden. Die Sequenzen dieser Primer sind unter der SEQ ID-No: 1 und 2 im angefügten Sequenzprotokoll enthalten.

In der PCR-Reaktion wird also nur dann ein DNA-Fragment amplifi ziert, wenn eine Pilzinfektion vorliegt. Die PCR-Reaktion für sich betrachtet dient somit dem Nachweis einer vorliegenden Infektion mit pathogenen Pilzen.

Um nun verschiedene Pilzspezies zu differenzieren, wird das amplifizierte 500 Basenpaar-Fragment mit einer oder mehreren von insgesamt sechs Sonden hybridisiert. Dabei ist jede Sonde für eine Pilzspezies spezifisch. Gemäß der DE 1 95 30 336.9 werden spezifische Sonden für insgesamt fünf Candida-Spezies sowie die Gattung Aspergillus angegeben. Die Sonden sind unter den SEQ ID-No: 3 bis 8 im hier angefügten Sequenzprotokoll ebenfalls aufgeführt.

Die Pilzgattungen Candida und Aspergillus sind bei weitem am häufigsten in nosokomialen Infektionen involviert. Zunehmend gewinnen jedoch auch seltenere Pilzspezies an klinischer Bedeutung, für die bisher noch keine Nachweisverfahren zur Verfügung stehen.

Vor diesem Hintergrund werden durch die vorliegende Anmeldung für die bisher unbekannte rRNA-Genregion seltener Pilzspezies Spezies-spezifische Sonden bereitgestellt. Diese Sonden wurden bereits in Experimenten erfolgreich zum Nachweis der seltenen Pilzspezies eingesetzt.

Die Sequenzen dieser Sonden sind im angefügten Sequenzprotokoll unter den SEQ ID-No: 9, 10, 11 und 12 aufgeführt.

Die Sonde mit der Nukleotidsequenz SEQ ID-No: 9 wird zum Nachweis der Pilzspezies Pneumocystis carinii verwendet. Die Sonde mit der Nukleotidsequenz SEQ ID-No: 10 wird zum Nachweis der Spezies Malassezia furfur eingesetzt. Der Buchstabe K an Position 21 steht für "G oder T", d. h. es existieren Stämme, die hier die Base G und Stämme, die hier die Base T benötigen. Die Sonde mit der Nukleotidsequenz SEQ ID-No: 11 dient dem Nachweis der Spezies Trichosporon cutaneum und Trichosporon capitatum. Die Sonde mit der Sequenz SEQ ID-No: 12 wird schließlich zum Nachweis der Pilzspezies Fusarium solani und Fusarium oxysporum verwendet.

Mit Hilfe dieser spezifischen Sonden werden erstmals auch die seltenen pathogenen Pilzspezies Pneumocystis, Malassezia, Trichosporon und Fusarium einer frühzeitigen, sensitiven und unkompliziert durchzuführenden molekularbiologischen Nachweis methode zugänglich gemacht.

Dabei ist es bevorzugt, wenn diese Sonden in einem Verfahren von der in der oben zitierten DE 195 30 336.9 beschriebenen Art eingesetzt werden. Nach Extraktion der Pilz-DNA aus klinischem Material und Nachweis der extrahierten Pilz-DNA durch eine PCR-Reaktion mit den Primern SEQ ID-No: 1 und 2 können die hier vorgestellten Sonden SEQ ID-No: 9 bis 12 als Hybridisierungs sonden direkt auf dem in der PCR-Reaktion amplifizierten DNA-Fragment eingesetzt werden. Dabei ist es möglich, sie einzeln oder in einem sequentiellen Hybridisierungsverfahren zusammen mit den in der DE 195 30 336.9 beschriebenen Sonden einzusetzen.

Es versteht sich jedoch, daß die hier beschriebenen Sonden auch in anderen Nachweisverfahren, z. B. in einer direkten Hybridi sierung von Gesamt-Pilz-DNA oder Pilz-RNA, oder als Primer für PCR-Reaktionen eingesetzt werden können.

Es ist außerdem vorgesehen, die hier vorgestellten spezifischen Sonden in einen Kit zu integrieren, mit Hilfe dessen Pilzspezies identifiziert werden können. Hierbei können entweder nur die DNA-Sonden oder zusätzlich weitere erforderliche Lösungen im Kit vorhanden sein, wodurch sich der Nachweis und die Identi fizierung der jeweiligen Pilzspezies im Laboralltag erheblich vereinfachen.

Dabei ist es außerdem möglich, in einen Kit alle wesentlichen Lösungen zum Durchführen eines Verfahrens der oben genannten Art einzubeziehen. Es können nicht nur die für die seltenen Pilzspezies spezifischen Sonden, sondern auch die in der DE 195 30 336.9 beschriebenen Sonden zur Identifizierung von Candida- und Aspergillus-Spezies darin enthalten sein.

Die folgenden Beispiele illustrieren das gesamte Verfahren zur Extraktion der Pilz-DNA aus klinischem Material, den Nachweis der extrahierten Pilz-DNA mit PCR sowie die Bestimmung der Pilzspezies aus der extrahierten DNA.

Die Beispiele 1 und 2 zeigen, wie Pilzzellen aus in Vollblut enthaltenen Blutzellen gewonnen werden können. In Beispiel 3 wird erläutert, wie überwiegend intakte Pilzzellen von zellulärer menschlicher DNA abgetrennt werden können, wobei Beispiel 4 zeigt, wie Pilzzellen aufgeschlossen werden und Beispiel 5 zeigt, wie die Pilz-DNA anschließend isoliert wird. In Beispiel 6 wird beschrieben, wie das oben genannte Pilz-spezifische 500 Basen paar-Fragment aus dem Genbereich für die 18ssu rRNA durch PCR amplifiziert wird. Die Beispiele 7 und 8 demonstrieren, wie mit Hilfe der Pilz-spezifischen Sonden individuelle Pilzspezies identifiziert werden können.

Beispiel 1 Lysis roter Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse

Die Lyse der roten Blutkörperchen erfolgt mit Hilfe einer hypotonen Lösung. Dazu wird folgender Puffer mit folgenden Endkonzentrationen verwendet:

Tris pH 7,6 10 mM
MgCl₂ 5 mM
NaCl 10 mM

Die Lösung wird für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, und danach zentrifugiert.

Für diesen ersten Schritt ist eine Menge von 3 ml Vollblut ausreichend.

Beispiel 2 Enzymatisches Aufschließen weißer Blutkörperchen

Die weißen Blutkörperchen, die ggf. Pilzzellen enthalten, werden vorsichtig aufgebrochen, indem die Zellen mit Proteinase K (200 µg/ml) der Firma Boehringer, Mannheim in folgendem Puffer mit den angegebenen Endkonzentrationen enzymatisch angedaut werden, in dem das Pellet aus Beispiel 1 aufgenommen wird:

Tris pH 7,6 10 mM
EDTA pH 8,0 10 mM
NaCl 50 mM
SDS 0,2%
Proteinase K 200 µg/ml

Dieser Puffer wird für zwei Stunden bei 65°C inkubiert.

Beispiel 3 Trennung überwiegend intakter Pilzzellen vor allem von zellulärer DNA

Nachdem wie in den Beispielen 1 und 2 angegeben die Blutzellen aufgeschlossen wurden, so daß die zelluläre DNA freigegeben wurde, erfolgt ein Zentrifugationsschritt bei 5000 Um drehungen/min, der zu einem erheblichen Verlust an zellulärer DNA führt, die bei dieser Zentrifugationsgeschwindigkeit nicht sedimentiert.

Im Sediment befinden sich jetzt vollständig die freien oder freigesetzten Pilzzellen, die für die weitere Verarbeitung in NaOH aufgenommen werden.

Beispiel 4 Aufschließen der Pilzzellen

Als nächstes werden die Pilzzellen alkalisch lysiert und enzymatisch behandelt, um die Pilz-DNA freizusetzen.

Dazu erfolgt zunächst eine Alkalilyse mit 200 µl 50 mM NaOH für 10 min bei 95°C.

Daraufhin erfolgt ein Neutralisationsschritt mit 1 M Tris-HCl pH 7,0 und eine Zentrifugation bei 5000 upm für 10 min.

Als nächstes werden 500 µl Zymolyase von JCN (300 µg/ml) zugegeben und die Lösung für 60 min bei 37°C inkubiert, um die Pilzzellen enzymatisch aufzuschließen.

Daraufhin werden 500 µl Tris/EDTA und 50 µl 10%iger SDS zugegeben und die Lösung bei 65°C für 20 min inkubiert, um das Protein zu denaturieren.

Beispiel 5 Isolation der Pilz-DNA

In der nunmehr vorliegenden Lösung befinden sich Trümmer der Pilzzellen sowie freie Pilz-DNA, die nun isoliert werden muß.

Hierzu erfolgt zunächst eine Proteinpräzipitation mit 5 M Kaliumacetat, woraufhin der Überstand abgenommen und die DNA dann durch Zugabe von eiskaltem Isopropanol ausgefällt wird. Dieses Fällungsprodukt wird dann für die weiteren Verfahrens schritte verwendet.

Durch die in den Beispielen 1-5 angegebenen Verfahrensschritte ist es also möglich, aus Vollblut hoch-selektiv Pilz-DNA zu extrahieren, die nun als Präzipitat vorliegt und nur gering mit zellulärer DNA verunreinigt ist, wodurch der jetzt erfolgende Nachweis sehr sensitiv und hochspezifisch erfolgen kann.

Beispiel 6 Amplifikation eines pilzspezifischen DNA-Seg mentes

In diesem Verfahrensschritt soll zunächst nachgewiesen werden, ob in dem Präzipitat aus dem Verfahrensschritt in Beispiel 5 überhaupt Pilz-DNA vorhanden ist. Dabei wird ausgenutzt, daß die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 angegebenen DNA-Sequenzen spezifisch an Bindungsstellen auf dem Pilz-Gen für die 18ssu-rRNA vieler Pilzstämme und -spezies binden.

Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat nämlich erkannt, daß dieses Pilz-Gen bei den verschiedenen Pilz-Stämmen und -Gattungen ein derartiges Sequenzsegment aufweist, das einerseits von zwei Bindungsregionen für Primer flankiert wird, die für alle Pilz-Stämme und -Gattungen identisch sind, daß aber andererseits die Sequenz dieses Segmentes für die verschiedenen Pilz-Stämme und -Gattungen so verschieden ist, daß sie zum Nachweis der einzelnen Pilzspezies und -Gattungen verwenden werden kann.

Die DNA-Sequenz SEQ ID-No: 1 bindet dabei an den sense-Strang, während die DNA-Sequenz SEQ ID-No: 2 an den anti-sense-Strang bindet, wobei der Abstand zwischen den beiden Bindungsstellen ca. 500 Basenpaare beträgt. Diese beiden DNA-Sequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 eignen sich damit als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR), in der folglich Verstärkungs produkte (Amplicon) mit einer Länge von ca. 500 Basenpaaren in ausreichender Menge erzeugt werden.

Die PCR-Bedingungen sind dabei die folgenden:

Puffer (50 µl)
10 mM Tris pH 9,6
50 mM NaCl
10 mM MgCl₂
0,2 mg/ml BSA
Polymerase
je 0,5 mM Nukleotide
je 100 pM Primer
Anfängliche Denaturierung: 3 min bei 94°C
Zyklus-Denaturierung: 0,5 min bei 94°C
Annealing: 1 min bei 62°C
Extension: 2 min bei 72°C
Terminale Extension: 5 min bei 72°C
Zykluszahl: 34

Die hohe Magnesiumkonzentration im Puffer sorgt für eine hohe Spezifität der Polymerase, die mit 72°C im Extensions-Schritt bei ihrem Temperaturoptimum arbeiten kann.

Beispiel 7 Nachweis der Amplifikationsprodukte aus Beispiel 6

Im nächsten Schritt soll jetzt nachgewiesen werden, ob bei der PCR-Reaktion aus Beispiel 6 auch tatsächlich DNA-Segmente mit einer Länge von ca. 500 Basenpaaren hochverstärkt wurden. Diese Detektion der pilzspezifischen DNA-Segmente erfolgt durch Ethidiumbromid-Färbung der spezifischen Bande in einem 2%igen Agarose-Gel.

Ist hier die spezifische Bande zu erkennen, so kann von einer Pilzinfektion ausgegangen werden, da die Primer SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 an alle oben erwähnten Pilzstämme binden. Sollte also durch die Verfahrensschritte aus den Beispielen 1-5 Pilz-DNA extrahiert worden sein, so wird sie durch den PCR-Schritt des Beispiels 6 so weit hochverstärkt, daß sie hier durch Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen werden kann.

Beispiel 8 Zuordnung der Amplifikationsprodukte aus Beispiel 6 zu einzelnen Pilzspezies

Für eine spezifische Therapie ist es jetzt noch erforderlich, die im Schritt 7 bereits nachgewiesene Pilzinfektion genauer zu spezifizieren. Hier zeigt sich jetzt ein weiterer Vorteil des PCR-Schrittes aus Beispiel 6. Dort wurde nämlich so viel pilzspezifisches DNA-Segment erzeugt, daß jetzt weitere Nachweis verfahren zur Bestimmung der Pilzspezies möglich sind.

Hierzu werden die im Sequenzprotokoll angegebenen Nucleotid sequenzen SEQ ID-No: 3 bis SEQ ID-No: 12 herangezogen, die als Spezies-spezifische Sonden dienen, die mit einem Sequenzabschnitt des in Beispiel 6 erzeugten DNA-Segmentes spezifisch hybridi sieren.

Es wurde gefunden, daß die Sonde SEQ ID-No: 3 mit Candida albicans, SEQ ID-No: 4 mit Candida glabrata, SEQ ID-No: 5 mit Candida krusei, SEQ ID-No: 6 mit Candida tropicalis, SEQ ID-No: 7 mit Candida parapsilosis und SEQ ID-No: 8 mit Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. versiculor, A. niger, A. nidulans und A. terreus hybridisieren. Die Nucleotidsequenz SEQ ID-No: 8 ist also eine allgemeine Aspergillus-Sonde, während die Nucleotidsequenzen SEQ ID-No: 3-SEQ ID-No: 5 Pilzspezies der Gattung Candida voneinander unterscheiden können.

Die Sonde SEQ ID-No: 9 hybridisiert mit Pneumocystis carinii, die Sonde SEQ ID-No: 10 mit Malassezia furfur, die Sonde SEQ ID-No: 11 mit Trichosporon cutaneum und Trichosporon capitatum und die Sonde SEQ ID-No: 12 mit Fusarium solani und Fusarium oxysporum. Es sei noch bemerkt, daß bei SEQ ID-No: 10 K für "G oder T" steht.

Um die erfolgte Hybridisierung nachweisen zu können, werden die Sonden mit dem Transferase-Kit der Firma Boehringer, Mannheim mit Digoxigenin markiert, wobei der Nachweis nach dem Southern Blot-Verfahren mit der üblichen Farbreaktion erfolgt.

Auf diese Weise ist es also möglich, an Hand der im Schritt beispiel 6 erzeugten Amplifikationsprodukte durch sequentielles Hybridisieren die Pilzspezies zu identifizieren und anschließend eine gezielte Therapie einzuleiten.

SEQUENZ PROTOKOLL

Claims

1. Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID-No: 9 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll: ATTACCGGCT GCCCTTCGCT GGGTGTGCCG.

2. Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID-No: 10 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll: AGAGTGTTCA AAGCAGGCTT KACGCC.

3. Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID-No: 11 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll: AGGCCGTATG CCCTTCATTG GGTGTGCGGT.

4. Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID-No: 12 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll: TGCTCCAGGC AGGCCTATGC TCGA.

5. Verwendung des Oligonukleotids aus Anspruch 1 zum Nachweis der Pilzspezies Pneumocystis carinii.

6. Verwendung des Oligonukleotids aus Anspruch 2 zum Nachweis der Pilzspezies Malassezia furfur.

7. Verwendung des Oligonukleotids aus Anspruch 3 zum Nachweis der Pilzspezies Trichosporon cutaneum und Trichosporon capitatum.

8. Verwendung des Oligonukleotids aus Anspruch 4 zum Nachweis der Pilzspezies Fusarium solani und Fusarium oxysporon.

9. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Pilzen in klinischem Material, mit den Schritten:

a) Extraktion der Pilz-DNA aus klinischem Material;
b) Nachweis der extrahierten Pilz-DNA;
c) Bestimmen der Pilzspezies durch Hybridisierung der extrahierten DNA mit Pilz-spezifischen Sonden,

dadurch gekennzeichnet, daß als DNA-Sonden eines oder mehrere der Oligonukleotide gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 verwendet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der extrahierten Pilz-DNA durch Amplifikation eines DNA-Segmentes durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Einsatz der Primer mit der Nukleotidsequenz SEQ ID-No: 1 (ATTGGAGGGC AAGTCTGGTG) und 2 (CCGATCCCTA GTCGGCATAG) erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) als DNA-Sonden zusätzlich eines oder mehrere der Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen
SEQ ID No: 3: TCTGGGTAGC CATTTATGGC GAACCAGGAC,
SEQ ID No: 4: TTCTGGCTAA CCCCAAGTCC TTGTGGCTTG,
SEQ ID No: 5: GTCTTTCCTT CTGGCTAGCC TCGGGCGAAC,
SEQ ID No: 6: GTTGGCCGGT CCATCTTTCT GATGCGTACT,
SEQ ID No: 7: TTTCCTTCTG GCTAGCCTTT TTGGCGAACC, oder
SEQ ID No: 8: CATGGCCTTC ACTGGCTGTG GGGGGAACCA
eingesetzt werden.

12. Kit zum Identifizieren von Pilzspezies, dadurch gekenn zeichnet, daß eines oder mehrere der Oligonukleotide aus den Ansprüchen 1 bis 4 als Sonden enthalten sind.