JP2002223766A

JP2002223766A - 微生物の検出方法、及び微生物の検出用プライマーセット

Info

Publication number: JP2002223766A
Application number: JP2001023742A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Ezaki; 孝行江崎
Original assignee: RAKAN KK; Gifu University NUC
Current assignee: RAKAN KK; Gifu University NUC
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2002-08-13

Abstract

(57)【要約】【課題】複数種類の微生物を検出対象として、各微生
物の遺伝子を共通の条件で増幅させて検出することがで
きる微生物の検出方法、及びその方法に用いられるプラ
イマーセットを提供する。【解決手段】ＰＣＲ法の増幅反応における温度サイク
ル条件を予め一定条件に設定するとともに、設定された
温度サイクル条件下で、標的とされる遺伝子領域が増幅
されるように設計されたプライマーセットを、検出対象
とする複数種類の微生物のそれぞれについて準備する工
程と、検出対象とされる少なくとも１種類の微生物を含
むと思われる試料につき、準備された複数種類のプライ
マーセットをそれぞれに用いて、設定された共通の温度
サイクル条件下で増幅反応を行う工程とを備える。ま
た、高感度の検出を目的とする場合には、ネステッドＰ
ＣＲ法を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の遺伝子を
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法で増幅して検出する
微生物の検出方法に関し、詳しくは、複数種類の微生物
の遺伝子を対象として共通の条件で増幅させる微生物の
検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、細菌などの微生物を検出し同定
するためには、選択培地による分離培養、顕微鏡による
形態観察、あるいは培養菌を用いた生理学的性状や薬剤
感受性などの試験が行われる。しかし、培養を前提とす
るこれらの手法は、培養が困難なレジオネラなどの場合
には適用することが困難である。また、培養時間が必須
であり、その他にも時間のかかる操作が含まれることか
ら、結果が得られるまでには通常数日間を要し、培養期
間が長い結核菌などの場合は数週間という期間が必要と
なる。このような時間的な制約は、赤痢や敗血症などの
急性感染症を引き起こす病原体や薬剤耐性菌など、迅速
な同定が求められる場合においては、大きな障害となっ
ている。

【０００３】そこで、近年では、遺伝子を分析すること
によって微生物を検出し同定する遺伝子検査法が、臨床
検査の現場などに広く導入されつつある。この遺伝子検
査法では、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を組み合
わせて微生物の遺伝子を増幅させることにより、検出感
度を飛躍的に向上させることができる。しかも、培養期
間を待つ必要がないため短時間で結果を得ることがで
き、培養困難な微生物も検出対象とすることができる。
ＰＣＲ法では、プライマーと呼ばれる一対のＤＮＡ断片
を必要とし、増幅したい遺伝子領域の５'末端部分に相
当する塩基配列（センス側）と、３'末端部分に相当す
る相補的な塩基配列（アンチセンス側）とを用いる。し
たがって、ある微生物に特異的な遺伝子を標的とするプ
ライマーを用いて増幅すれば、その微生物を同定するこ
とも可能である。

【０００４】ＰＣＲ法の増幅反応は、ＤＮＡの熱変性、
プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼ伸長反応
のそれぞれの温度条件で反応液をインキュベートするこ
とによって進行し、この三つのステップからなる温度サ
イクルを繰り返すことで所望の増幅産物が得られる。増
幅反応の至適条件は使用するプライマーの種類によって
異なり、中でも温度サイクルのアニーリング条件はプラ
イマーの塩基配列や鎖長に大きく影響される。したがっ
て、ＰＣＲ法により高感度で目的とする増幅産物を得る
には、プライマーの至適条件を予備実験などによって確
認し、その条件に基づいて増幅反応を行うことが重要と
される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ところで、微生物の検
出試験は、特定の微生物の検出を目的とする以外に、不
特定の微生物の検出、あるいは複数種類の微生物の同時
検出を目的として行われることが多い。このような試験
においてＰＣＲ法を適用する場合には、広範囲の微生物
の間、例えば細菌全般に普遍的な遺伝子を標的とするプ
ライマー（ユニバーサルプライマー）や、検出対象とす
る各微生物に特異的な遺伝子を標的とする複数種類のプ
ライマーが用いられる。しかし、ユニバーサルプライマ
ーを用いる方法は、増幅反応の段階で微生物を特定する
ことができないため、同定のための後操作が必要とな
る。一方、複数種類のプライマーを用いる方法は、増幅
反応の段階である程度の種の特定が可能であるが、各プ
ライマーについて温度サイクル条件を設定する必要が生
じる。

【０００６】ＰＣＲ法における温度サイクルの制御は、
一般に、反応液を入れた容器をＰＣＲ装置（サーマルサ
イクラー）を用いて加熱又は冷却し、反応液の温度を設
定された温度サイクル条件に基づき変動させることによ
り行われる。ところが、ＰＣＲ装置では基本的に一種類
の温度サイクル条件しか制御することができないため、
異なる温度サイクル条件を設定しようとする場合には、
それぞれの増幅反応を順次行う必要があった。このた
め、複数種類のプライマーセットを用いる場合には、た
とえ試料が一種類のみであっても、それぞれの増幅反応
を同時に行うことが困難であり、迅速性というＰＣＲ法
による利益を十分に享受することができなかった。ま
た、プライマー毎に異なる温度サイクル条件を適用する
必要があることから、その操作が煩雑であり、温度サイ
クル条件の設定ミスなどの誤操作を誘発する要因にもな
っていた。

【０００７】したがって、本発明の課題は、複数種類の
微生物を検出対象として、各微生物の遺伝子を共通の条
件で増幅させて検出することができる微生物の検出方
法、及びその方法に用いられるプライマーセットを提供
することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】請求項１に記載の発明に
係る微生物の検出方法は、所定の分類範囲において特異
的かつ普遍的な塩基配列を持つ微生物の遺伝子を標的と
するプライマーを用いて、当該分類範囲に属する微生物
の遺伝子をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により増
幅して検出する方法であって、前記ＰＣＲ法の増幅反応
における温度サイクル条件を予め一定条件に設定すると
ともに、その設定条件下で、標的とされる前記遺伝子が
増幅されるように設計されたプライマーセットを、検出
対象とする複数種類の前記微生物のそれぞれについて調
製する工程と、検出対象とされる前記微生物のうち少な
くとも１種類を含むと思われる試料につき、調製された
複数種類の前記プライマーセットをそれぞれに用いて、
設定された前記温度サイクル条件に基づいて増幅反応を
行う工程とを備える。

【０００９】ここで「微生物」とは顕微鏡的な大きさの
生物を意味し、細菌や菌類、原生動物、ウイルスなどを
含む。また「分類範囲」とは、ある特定の種類に分類さ
れる微生物の集まりをいい、例えば、下位の種（specie
s）から属（genus）、科（family）などの上位に向かう
階層的な微生物の分類体系における、種としての大腸
菌、属としてのレジオネラ属、あるいはより上位の階層
での菌類、などを挙げることができる。

【００１０】したがって、請求項１に記載の発明による
と、ある微生物に特異的な遺伝子を標的とするプライマ
ーを用いてＰＣＲ法を行い、目的とする増幅産物の生成
を確認することにより、その試料中に当該微生物が含ま
れるか否かを判定する。これは、何らかの微生物が混入
している試料には、必然的に当該微生物に由来する遺伝
子ＤＮＡが含まれるという原理に基づいている。

【００１１】このＰＣＲ法では、複数種類のプライマー
セットを用いてそれぞれに増幅反応を行う。各プライマ
ーセットは、予め設定された一定の温度サイクル条件下
において、増幅反応が好適に進行するように設計された
ものであり、特にアニーリングの温度条件が共通するよ
うにその塩基配列や鎖長が設計されている。これによっ
て、広範囲の微生物を検出対象としながら、増幅条件に
おける温度サイクル条件を共通化できる微生物の検出系
が構築される。

【００１２】請求項２に記載の発明に係る微生物の検出
方法は、請求項１に記載の発明において、前記ＰＣＲ法
がネステッドＰＣＲ法である。このネステッドＰＣＲ
（Nested-PCR）法は、第１段階の増幅産物を鋳型とし、
その最初に用いたプライマーより内側に設定した別のプ
ライマー（ネステッドプライマー）を用いて、第２段階
の増幅反応を行うものであり、二段階ＰＣＲ法とも呼ば
れている。

【００１３】したがって、請求項２に記載の発明による
と、二段階の増幅反応を行うことにより、標的遺伝子の
増幅感度が向上する。また、第１段階の外側の増幅反応
で非特異的な増幅産物が生成された場合でも、第２段階
の内側の増幅反応ではその非特異的な増幅産物を鋳型と
しないため、最終的に特異性の高い増幅産物が得られ
る。

【００１４】請求項３に記載の発明に係る微生物の検出
方法は、請求項２に記載の発明において、前記ネステッ
ドＰＣＲ法は、第１段階の増幅反応における前記温度サ
イクル条件のアニーリング温度が４５〜５５℃の範囲内
に設定され、かつ、第２段階の増幅反応における前記温
度サイクルのアニーリング温度が５５〜６５℃の範囲内
に設定されるものである。

【００１５】請求項３に記載の発明によると、第１段階
の温度サイクル条件は、プライマーがアニーリングしや
すい比較的穏やかな条件に設定され、感度を優先した増
幅反応が行われる。一方、第２段階の温度サイクル条件
は、プライマーが非相補的な配列にアニーリングしにく
いストリンジェントな条件に設定され、特異性を優先さ
せた増幅反応が行われる。

【００１６】請求項４に記載の発明に係る微生物の検出
方法は、請求項１〜３のいずれか１つに記載の発明にお
いて、下記の表１に示す(Ａ)〜(Ｍ)からなるイ群、及び
表２に示す(ａ)〜(ｍ)からなるロ群より選択される複数
種類のプライマーセットを用いるものである。

【００１７】

【表１】

【００１８】

【表２】

【００１９】したがって、請求項４に記載の発明による
と、環境中の各種水系に存在し得る病原性微生物を検出
対象とした、複数種類のプライマーセットが用意され
る。これらのプライマーセットを組み合わせることで、
広範囲の微生物が検出対象として網羅される。これらの
プライマーセットはまた、一定の温度サイクル条件にお
いて標的とする遺伝子を増幅させるように設計されてい
る。具体的には、表１に示すイ群の各プライマーは４５
〜５５℃の温度範囲において、表２に示すロ群の各プラ
イマーは５５〜６５℃の温度範囲において、それぞれに
標的とする微生物の遺伝子に好適にアニーリングするよ
うに、その塩基配列や鎖長が設計されている。

【００２０】請求項５に記載の発明に係る微生物の検出
方法は、請求項４に記載の発明において、前記イ群より
選択されるプライマーセットとともに、前記ロ群より選
択されるプライマーセットをネステッドプライマーとし
て用いるものである。

【００２１】請求項５に記載の発明によると、表１に示
すプライマーセットと表２に示すプライマーセットとを
併用してネステッドＰＣＲ法を行うことにより、検出の
感度や特異性がより一層向上する。

【００２２】請求項６に記載の発明に係る微生物の検出
用プライマーセットは、請求項４に記載の各群より選択
される複数種類のプライマーセットで構成されるもので
ある。

【００２３】請求項６に記載の発明によると、複数種類
の病原性微生物を検出対象とするプライマーセットとし
て機能する。すなわち、これらのプライマーセットを用
いることにより、請求項４又は５に記載の発明の作用を
奏する。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物の検出方法は、所定の分類範囲において
特異的かつ普遍的な塩基配列を持つ微生物の遺伝子を標
的とするプライマーセットを用いて、当該分類範囲に属
する微生物の遺伝子をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
法により増幅して検出するものである。さらには、前記
ＰＣＲ法の増幅反応における温度サイクル条件を予め一
定条件に設定するとともに、その設定条件下で、標的と
される前記遺伝子が増幅されるように設計された前記プ
ライマーセットを、検出対象とする複数種類の微生物の
それぞれについて準備する工程と、検出対象とされる前
記微生物のうち少なくとも１種類を含むと思われる試料
につき、準備された複数種類の前記プライマーセットを
それぞれに用いて、設定された前記温度サイクル条件に
基づいて増幅反応を行う工程とを備えることにより、複
数種類の微生物を検出対象として、共通の条件で増幅反
応を行わせることを可能とするものである。

【００２５】本発明の微生物の検出方法は、微生物に由
来する遺伝子ＤＮＡが、試料中に一定の基準を超えて存
在しているか否かを判定するものである。すなわち、Ｐ
ＣＲ法による増幅反応の後、試料中にその遺伝子を鋳型
とする増幅産物が生成していれば、当該微生物が含まれ
る「陽性」と判定し、一方、増幅産物が生成していなけ
れば、当該微生物は含まれない「陰性」と判定する。そ
の判定の基準、すなわち増幅反応の感度は、検出の目的
や検体の種類などに応じて調整することができる。具体
的には、増幅反応のサイクル数や使用するプライマー量
を調整することや、後述するネステッドＰＣＲ法を適用
することなどによって行うことができる。また、本方法
では、検出対象とされる微生物に特異的な塩基配列を含
む領域を標的とするプライマーセットを用いて、その微
生物の遺伝子を特異的に増幅させるため、微生物の同
定、すなわち、微生物の属する所定の分類範囲を増幅反
応の段階で特定することができる。

【００２６】本方法の特徴の一つは、ＰＣＲ法の温度サ
イクル条件を予め一定条件に設定するとともに、設定さ
れた温度サイクル条件に適するプライマーを、検出対象
とする複数種類の微生物について設計することにある。
ＰＣＲ法の温度サイクル条件とは、増幅反応におけるＤ
ＮＡの熱変性による一本鎖化、プライマーのアニーリン
グ、及びポリメラーゼ伸長からなる増幅反応の各ステッ
プの温度条件をいう。この中で、熱変性及び伸長反応の
温度条件は、主にTaqポリメラーゼの種類によって設定
されるが、アニーリングの温度条件は主にプライマーの
種類によって設定される。詳しくは、通常アニーリング
温度はプライマーＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）値を基準に
設定され、Ｔｍ値から５℃程度下げた値を設定すること
が多い。したがって、本発明では、アニーリング温度を
多種類のプライマーで汎用可能な温度領域内に設定する
とともに、その設定されたアニーリング温度に適するＴ
ｍ値を逆算して、その値に近似するＴｍ値を持つような
プライマーを設計するという手順を踏まえるとよい。

【００２７】検出対象とする微生物の種類は、測定しよ
うとする試料の種類などに応じて選定し、例えば、その
測定対象の試料に存在し得る各種微生物を広く網羅する
ようにして選定することが好ましい。本方法に供する試
料には特に制限はないが、環境試料や生体試料などが好
適であると考えられる。環境試料としては、具体的に
は、例えば水道水の配管や浴槽、プール、冷却塔などの
各種水系、あるいは土壌などから採取される試料を挙げ
ることができる。一方、生体試料としては、具体的に
は、例えば喀痰や血液などの各種臨床試料を挙げること
ができる。

【００２８】本方法で用いるプライマーの設計に際して
は、上述したようにそのＴｍ値に留意する必要がある。
Ｔｍ値は正確には実験により求められるが、プライマー
の塩基配列から推算することが可能であり、例えば、Ａ
又はＴを２℃、Ｇ又はＣを４℃として合計を求める方法
がよく用いられている。検出対象とする各微生物につい
て、特異的な塩基配列を持つ標的遺伝子から、目標とす
るＴｍ値を有するプライマーを選択するのは意外と難し
いが、プライマーの鎖長を変えることで、そのＴｍ値を
ある程度調整することができる。なお、この他にも一般
的なプライマーの条件を満たす必要がある。具体的に
は、１５〜３０塩基程度の鎖長を有すること、センスプ
ライマーとアンチセンスプライマーのＴｍ値が近似する
こと、プライマーが二次構造をとったり自己アニールを
起こすような自己相補的配列を含まないこと、二本のプ
ライマー同士がアニールしてプライマーダイマーを形成
しないこと、部分的にＧＣリッチあるいはＡＴリッチな
塩基配列が連ならないようにすること、などが挙げられ
る。

【００２９】本方法で用いるプライマーは、常法にした
がって調製すればよい。例えば、ＤＮＡ合成装置などを
用いて所定の塩基配列を有するＤＮＡ断片を合成した
後、液体クロマトグラフィーなどによって精製して調製
することができる。

【００３０】本方法では、ネステッドＰＣＲ法を用いて
増幅反応を行うことが好ましい。ネステッドＰＣＲ法は
二段階ＰＣＲ法とも呼ばれ、第１段階の増幅産物を鋳型
とし、その最初に用いたプライマーセットより内側に設
定した別のプライマー（ネステッドプライマー）を用い
て、第２段階の増幅反応を行うものである。また、この
ネステッドＰＣＲ法を適用する場合には、第１段階と第
２段階のそれぞれの温度サイクル条件を異ならせて増幅
反応を行うとよい。具体的には、第１段階のアニーリン
グ温度は４５〜５５℃、好ましくは４８〜５５℃の範囲
内で設定するとともに、第２段階のアニーリング温度は
５５〜６５℃、好ましくは５５〜６２℃の範囲内で設定
するとよい。この場合、第１段階では、プライマーがア
ニーリングしやすい比較的穏やかな条件に設定されるこ
とから、標的遺伝子を確実に捕捉して感度を優先した増
幅反応を行うことができる。一方、第２段階では、プラ
イマーが非相補的な配列にアニーリングしにくいストリ
ンジェントな条件に設定されることから、特異性を優先
させた増幅反応を行うことができる。

【００３１】続いて、本発明の微生物の検出方法を、環
境中の各種水系より採取される試料を測定対象とする微
生物の検出系に具体化した一実施形態に基づいて、より
詳細に説明する。

【００３２】我が国では、強毒菌による感染症から、弱
毒性の微生物によるいわゆる日和見感染が主流となって
きている。宿主の免疫能力の低下に伴って病原性の弱い
微生物が感染症を引き起こすいわゆる日和見感染は、そ
の起因微生物の種類が多いことから、従来、ＰＣＲ法に
よる遺伝子増幅には不向きとされていた。そこで、本実
施形態では、これら日和見感染の病原体を主体とする複
数種類の微生物を検出するための系を構築することを試
みた。その具体的な手段は、表１及び表２に示す複数種
類のプライマーセットをそれぞれに用いて、一定の条件
下でＰＣＲ法の増幅反応を行うものである。さらに、本
実施形態ではネステッドＰＣＲ法を適用し、表１の(Ａ)
〜(Ｍ)を第１段階の増幅反応における外側のプライマー
として用いるとともに、表２の(ａ)〜(ｍ)を第２段階の
増幅反応における内側のネステッドプライマーとして用
いる。これらのプライマーセットが標的とする遺伝子、
及びその増幅産物の鎖長を下記の表３に示す。

【００３３】

【表３】

【００３４】各プライマーセットの標的遺伝子は、原則
としてリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に設定した。ただ
し、ｒＲＮＡには同種間で保存された塩基配列が多く存
在し、この領域にプライマーを設定したのではその識別
が困難となる場合があるため、特異的な検出を目的とす
る一部のプライマーセットでは、抗原（antigen）又は
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）をコードする遺伝子を
標的とした。

【００３５】次いで、表１及び表２に示すプライマーセ
ットが検出対象とする各微生物について説明する。な
お、以下の説明では便宜上、プライマーセット(Ａ)〜
(Ｍ)のみを表記しているが、ネステッドプライマーのセ
ット(ａ)〜(ｍ)を組み合わせて用いる場合を含むものと
する。

【００３６】プライマーセット(Ａ)は、レジオネラ（Le
gionella）属の細菌を検出対象とし、プライマーセット
(Ｂ)は、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pne
umophila）を検出対象とするものである。レジオネラ属
の細菌は、在郷軍人病などの呼吸器感染症の起因菌とし
て知られている。なお、ヒトにみられるレジオネラ感染
症の大部分は、レジオネラ・ニューモフィラによって占
められることから、この菌種を特定するためのプライマ
ーを別途用意したものである。

【００３７】プライマーセット(Ｃ)は、シュードモナス
・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa，緑膿菌）を
検出対象とする。この菌種は日和見感染症の代表的なも
ので、院内感染症として最も重要なものの一つとされて
おり、感染防御能が低下した宿主では、呼吸器感染症、
菌血症、骨髄炎などの原因となる。また、プライマーセ
ット(Ｄ)は、バークホルデリア・セパシア（Burkholder
ia cepacia）を検出対象とする。この菌種はシュードモ
ナスの類縁菌であり、同様に感染防御能が低下した宿主
において、肺炎や敗血症の原因となる。

【００３８】プライマーセット(Ｅ)は、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli，大腸菌）を検出対象とする。
この菌種は、健康なヒトの腸内細菌叢を構成する細菌の
一種であり、多種類の菌株が存在するが、その一部は病
原性大腸菌として下痢の原因となる。

【００３９】プライマーセット(Ｆ)は、アシネトバクタ
ー（Acinetobacter）属の細菌を検出対象とする。この
属の細菌は、自然界の土壌や水中などに広く分布し、免
疫不全患者などにおいては敗血症、髄膜炎、肺炎などの
起因菌となる。

【００４０】プライマーセット(Ｇ)は、マイコバクテリ
ウム（Mycobacterium）属の細菌を検出対象とする。こ
の属の細菌は抗酸菌とも呼ばれ、結核菌（Mycobacteriu
m tuberculosis）をはじめとして多くの種類が存在す
る。抗酸菌の分類には、結核菌群と非結核性（非定型）
抗酸菌に分類する方法の他に、遅発育菌と迅速発育菌に
分類する方法がある。臨床的に重要とされる菌種の多く
は、後者の分類法では遅発育菌に属するものであり、プ
ライマーセット(Ｇ)は、この遅発育菌に分類されるもの
を検出する。

【００４１】プライマーセット(Ｈ)は、マイコバクテリ
ウム・アビウム（Mycobacterium avium）及びマイコバ
クテリウム・イントラセルラー（Mycobacterium intrac
ellulare）からなる、マイコバクテリウム・アビウム・
コンプレックスを検出対象とする。これらの菌種は非結
核性の抗酸菌症の多くを占める起因菌であり、生化学的
性状によっては両者の分別が困難であることから、従来
一つのグループとして取り扱われていたものである。ま
た、プライマーセット(Ｉ)は、マイコバクテリウム・イ
ントラセルラーを検出対象とする。これは、上記の両菌
種の分別を可能とするために別途用意されたものであ
る。

【００４２】プライマーセット(Ｊ)は、細菌（bacteri
a）全般を検出対象とする。これは、細菌全般に普遍的
な遺伝子を標的とするユニバーサルプライマーであり、
上記(Ａ)〜(Ｉ)以外の細菌についても検出することがで
きるが、その種を特定することはできない。しかし、試
料中に何らかの細菌が混入していることが判明すれば、
その試料の危険性を認識することができる意味で有用で
ある。また、上記(Ａ)〜(Ｉ)の二重確認試験の意味を持
たせることもできる。例えば、プライマーセット(Ａ)〜
(Ｉ)で増幅産物が検出された一方で、このプライマーセ
ット(Ｊ)では増幅産物が検出されなかった試料について
は、いわゆる「擬陽性」の可能性が高いと判断すること
ができる。

【００４３】プライマーセット(Ｋ)は、菌類（fungi）
全般を検出対象とする。カビなどの真菌類をはじめとす
る菌類のうち一部の種類は、組織内に侵入・増殖してア
スペルギルス症、カンジダ症、クリプトコックス症など
の真菌症を発症させることが知られている。菌類は真核
生物に属し、原核生物である細菌とは大きく異なること
や、その種類が多いことから、ここでは菌類全般に普遍
的な遺伝子を標的とするユニバーサルプライマーを用い
たものである。

【００４４】プライマーセット(Ｌ)，(Ｍ)は、各種の原
生動物（protozoa）を検出対象とする。原生動物は菌類
と同じく真核生物に属し、その形態や性質も多種多様で
あり、病原性を持つものも多く知られている。ここで
は、その代表的なものを選定し、各原生動物を対象とす
るプライマーセットを用意した。プライマーセット(Ｌ)
は、アカントアメーバ（Acanthamoeba）属の原生動物を
検出対象とする。この属の原生動物は、原発性アメーバ
性髄膜脳炎の起炎虫として知られている。また、プライ
マーセット(Ｍ)は、クリプトスポリジウム・パルブム
（Cryptosporidiumparvum）を検出対象とする。この種
は、水系の汚染を感染源として下痢を主徴とするクリプ
トスポリジウム症を起こす病原虫として知られている。

【００４５】次いで、上記の各プライマーセットを用い
る微生物の検出方法の操作手順を、図１を参照しながら
説明する。本実施形態では、図１に示すように、ＤＮＡ
の抽出、ＰＣＲ法（ネステッドＰＣＲ）による増幅反
応、及び増幅産物の検出の三段階によって、微生物の検
出操作を行う。すなわち、ＰＣＲ増幅反応を主として、
その前後の工程で必要な処理を行う。

【００４６】まず、ＰＣＲの実施に先立ち、試料中に含
まれる（と思われる）微生物の細胞から、遺伝子ＤＮＡ
を抽出するための操作が行われる。具体的には、タンパ
ク質分解酵素（プロテアーゼ）処理や変性剤などによっ
て化学的に細胞を破壊し、あるいはビーズや超音波処理
などによって物理的に細胞を破壊することなどにより、
ＤＮＡを抽出する。

【００４７】続いて、ネステッドＰＣＲ法による二段階
の増幅反応が行われる。第１段階では、先にＤＮＡを抽
出した試料について、表１に示す外側のプライマーセッ
ト(Ａ)〜(Ｍ)をそれぞれに用いて増幅反応を行う。詳し
くは、図１に示すように、反応液Ｒ１ａ，Ｒ１ｂ，Ｒ１
ｃ…には、 (Ａ)，(Ｂ)，(Ｃ)…のプライマーセットが
添加されており、これらの反応液を共通の温度サイクル
条件Ｔ１下で制御することによって増幅反応を行う。こ
こで温度サイクル条件Ｔ１は、そのアニーリング温度が
４５〜５５℃、好ましくは４８〜５５℃の範囲内で設定
される。

【００４８】次の第２段階では、第１段階の各反応液Ｒ
１ａ，Ｒ１ｂ，Ｒ１ｃ…を一部採取し、これを試料とし
て、表２に示す内側のプライマー（ネステッドプライマ
ー）のセット(ａ)〜(ｍ)をそれぞれに用いる。詳しく
は、反応液Ｒ２ａ，Ｒ２ｂ，Ｒ２ｃ…には、 (ａ)，
(ｂ)，(ｃ)…のプライマーセットが添加されており、こ
れらの反応液を共通の温度サイクル条件Ｔ２下で制御す
ることによって、再度増幅反応を行う。ここで温度サイ
クル条件Ｔ２は、そのアニーリング温度が５５〜６５
℃、好ましくは５５〜６２℃の範囲内で設定される。

【００４９】このように、複数種類のプライマーセット
を用いることにより、各プライマーセットについて特異
性の高い検出が可能となる。また、温度サイクル条件Ｔ
１，Ｔ２が、各プライマーセット間で共通化されている
ことから、その増幅反応を同時に行わせることができ、
検出操作の能率を向上させることができる。

【００５０】生成した増幅産物の検出は、電気泳動法又
はハイブリダイゼーション法により行う。電気泳動法で
は、エチジウムブロマイドなどにより泳動後のゲルを染
色し、表３に示す鎖長を持つ増幅産物を検出することに
より、目的とする遺伝子が増幅されているかを確認する
ことができる。また、ハイブリダイゼーション法では、
その増幅産物に特異的なＤＮＡプローブを用いることに
よって検出することができる。

【００５１】以上のように、本実施形態の微生物の検出
方法によれば、広範囲の微生物を検出対象としながら、
複数種類のプライマーセットを用いて共通の条件下で同
時に増幅させることができる。また、ネステッドＰＣＲ
を適用することによって、きわめて高感度の検出が可能
であり、およそ１〜１０cell／ｍｌという低濃度の微生
物の遺伝子を捕捉することができる。これらについて
は、後述する実施例における実験結果によって証明す
る。

【００５２】本実施形態の微生物の検出方法は、本来無
菌であるべき試料について、微生物の存在（汚染）を検
出するといった目的に、とりわけ好適に用いることがで
きる。すなわち、水道水の配管や浴槽、プール、冷却塔
などの水が微生物の汚染を受けているか否かを、簡便な
操作によって調べることができ、しかも、同時にその微
生物の同定が可能である点で、きわめて有用である。

【００５３】ところで、上述した実施形態では、高感度
の検出を必要としない場合、例えば、微生物が高濃度に
含まれる試料について、その同定を主目的とするような
場合は、通常のＰＣＲ法による一段階のみの増幅反応で
十分である。したがって、まず第１段階の外側の増幅反
応を行い、ここで目的とする微生物の遺伝子が良好に増
幅されていると判断されれば、その後の第２段階を省略
しても差し支えない。この場合は、表３における外側の
増幅産物の鎖長を基に確認することによって、目的とす
る増幅産物の確認を行うことができる。

【００５４】また、(Ａ)〜(Ｍ)及び(ａ)〜(ｍ)のいずれ
か一方の組み合わせのプライマーセットにより、通常の
（一段階のみの）ＰＣＲ法を行うようにしてもよい。こ
の場合、いずれの組み合わせのプライマーセットを用い
るかによって、温度サイクル条件を変更する必要があ
る。すなわち、前者の場合はそのアニーリング温度を４
５〜５５℃の範囲内で、後者の場合は５５〜６５℃の範
囲内で設定する。

【００５５】また、(Ａ)〜(Ｍ)（又は(ａ)〜(ｍ)）の１
３種類全てのプライマーセットを同時に使用する必要は
ない。その都度、必要とされるプライマーセットを取捨
選択して使用すればよく、あるいは他種類の微生物を検
出するためのプライマーセットをさらに組み合わせても
構わない。

【００５６】本実施形態の微生物の検出方法を行ううえ
で必要な成分を、予めセットしたキットとして商業的に
供給することができる。例えば、表１及び表２に示す各
プライマーセットを別々の容器の内部に予め付着させ、
この状態でユーザーに供給する。この場合、ユーザーは
試料とともにＰＣＲ反応に必要な酵素（Taqポリメラー
ゼ）やｄＮＴＰなどを含む緩衝液（ＰＣＲ反応液）をこ
の容器に入れ、ＰＣＲ装置にセットするだけでよい。Ｐ
ＣＲ反応液としては、市販されている様々なＰＣＲキッ
トからユーザーが適宜選択して用いることができる。

【００５７】なお、本発明の微生物の検出方法は、上述
した実施形態に限定されるものではなく、請求項に記載
された範囲を逸脱しない限りにおいて変更が可能であ
る。例えば、プライマーセットは標的とする微生物の遺
伝子を特異的に検出可能であれば、異なる塩基配列を持
つものであってもよい。また、例えば、検出対象とする
微生物は、検出の目的や測定しようとする試料の種類
（環境試料及び生体試料）などに応じて任意に選択すれ
ばよい。すなわち、本発明に基づく方法論は、プライマ
ーの塩基配列や微生物の種類、測定試料などに制限はな
く、あらゆるものを対象として適用可能である。ただ
し、測定に供する試料の種類によっては、増幅反応を阻
害するような不純物が反応液に混入する可能性がある。
このような場合は、ＰＣＲの実施に先立ち、試料から核
酸成分を抽出するとともに不純物を除去する前処理を入
念に施すことで、本発明の特徴である高い検出感度を維
持することができる。

【００５８】また、例えば、ホットスタートＰＣＲやリ
アルタイムＰＣＲ、マイクロプレートＰＣＲ、キャピラ
リーＰＣＲなど、他種類のＰＣＲの変法・改良法を、試
験の目的に応じて適宜利用してもよい。これによって、
本発明の応用範囲を様々な分野に広げることができる。

【００５９】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明
するが、本発明はこの実施例で示す方法に限定されるも
のではない。本実施例では、表１及び表２に示すプライ
マーセットの性能を確認するための試験を行った。供試
試料としてのプライマーセットは、表１及び表２の塩基
配列を持つＤＮＡ断片を、定法にしたがって調製して用
いた。また、供試微生物としては、下記の表４に示す基
準株を用いた。これらを菌種に合わせた培地で培養し、
対数増殖期の菌体を滅菌超純水にて希釈して、所定の濃
度の菌液を調製した。

【００６０】

【表４】

【００６１】実験の操作手順は、図１に示すようにＤＮ
Ａの抽出、ＰＣＲ反応、増幅産物の検出の各工程の順序
にしたがって行った。以下、各工程毎にその条件を記
す。

【００６２】ＤＮＡの抽出は、各微生物の菌液１００μ
ｌに、タンパク質分解酵素（proteinase K）を終濃度５
０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃にて１０分間
インキュベートすることにより行った。この液を、さら
に１００℃にて３分間加熱したものを、次工程のＰＣＲ
の試料として用いた。

【００６３】ＰＣＲ法による増幅反応は、ＰＣＲキット
としてHotStarTaq DNA polymerase（株式会社キアゲ
ン）を用いて行った。反応液の組成は、第１段階の増幅
反応の場合、１０μｌの試料に、４μｌの１０×ＰＣＲ
緩衝液（ｐＨ８．７）と、プライマーセット（終濃度
０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（同０．２５ｍＭ）、Taqポリ
メラーゼ（同０．０１２５unit／μｌ）、及びＭｇＣｌ
₂（同１．５ｍＭ）の各成分とを加え、全液量が４０μ
ｌとなるように滅菌超純水で希釈して調製した。また、
第２段階の増幅反応の場合は、第１段階の増幅反応によ
る反応液を１μｌ採取して試料とし、第１段階の増幅反
応と同様の組成の反応液を調製して用いた。

【００６４】ＰＣＲ装置として、GeneAmp PCR System 9
700（Applied Biosystems）を用いて、次に示す温度サ
イクル条件にて制御することにより行った。第１段階の
温度サイクルは、熱変性：９４℃／１５秒，アニーリン
グ：５０℃／１５秒，伸長反応：７４℃／３０秒で行
い、第２段階の温度サイクルは、アニーリングを６０℃
／１５秒に変更して行った。また、この温度サイクル
を、第１段階及び第２段階のそれぞれについて３０サイ
クル繰り返して増幅反応を行った。

【００６５】ＰＣＲにより得られた増幅産物は、１％ア
ガロースゲルを用いた電気泳動法により泳動した後、エ
チジウムブロマイドにより染色してその鎖長を確認し
た。なお、各増幅産物の鎖長は表３に示す数値を基準と
した。

【００６６】本実施例では、微生物の検出感度及び特異
性をそれぞれ確認するための試験を行った。検出感度の
試験は、表４に示す各微生物の基準株について、４×１
０⁷〜４cell／ｍｌ（ＰＣＲ反応液として１０⁷〜１cell
／ｍｌ）となるように段階希釈した菌液を調製し、これ
を試料として、上記各工程の手順にしたがって検出操作
を行った。その実験の結果を表５に示す。ネステッドＰ
ＣＲ法を用いることにより、検出感度を飛躍的に向上さ
せることが可能であり、いずれの微生物においても、１
〜１０cell／ｍｌレベルでの検出が可能であった。

【００６７】

【表５】

【００６８】また、特異性の試験は、表４に示す各微生
物について同様に検出操作を行った。その実験の結果を
表６に示す。(Ａ)〜(Ｍ)の各プライマーセットにより、
特異性の高い検出が可能であった。すなわち、(Ａ)や
(Ｇ)，（Ｌ）などのように属のレベルで特異的なプライ
マーセットは、その属に属する種の間で普遍的な検出が
可能であり、(Ｂ)〜(Ｅ)，(Ｉ)，（Ｍ）などのように種
のレベルで特異的なプライマーセットは、その種のみに
特異的な検出が可能であること、などが確認できた。

【００６９】

【表６】

【００７０】

【発明の効果】請求項１に記載の発明に係る微生物の検
出方法によれば、複数種類の微生物の遺伝子を共通の温
度サイクル条件で増幅することができる。そして、増幅
産物の生成の有無によって微生物の存在を確認すること
ができるとともに、その同定が増幅反応のレベルで可能
である。また、増幅反応の操作を共通化できるため、測
定操作の簡便性や経済性の点でも有利である。

【００７１】請求項２に記載の発明に係る微生物の検出
方法によれば、請求項１に記載の発明の効果に加え、増
幅反応の感度や特異性をさらに向上させることができ
る。

【００７２】請求項３に記載の発明に係る微生物の検出
方法によれば、請求項２に記載の発明の効果に加え、増
幅反応の温度サイクル条件を最適化して、その感度や特
異性をより一層向上させることができる。

【００７３】請求項４に記載の発明に係る微生物の検出
方法によれば、請求項１〜３のいずれか１つに記載の発
明の効果に加え、環境中の各種水系を被検体として、広
範囲かつ多種類の病原性微生物を対象とする検出系を構
築することができる。この検出系では各微生物を高感度
で検出することができ、しかもその検出操作を迅速かつ
簡便に行うことができる。

【００７４】請求項５に記載の発明に係る微生物の検出
方法によれば、請求項４に記載の発明の効果に加え、病
原性微生物の検出系において、その感度や特異性をさら
に向上させることができる。

【００７５】請求項６に記載の発明に係る微生物の検出
用プライマーセットによれば、これらのプライマーセッ
トを用いて病原性微生物の検出系を構築することによ
り、請求項４又は５に記載の発明の効果を奏することが
できる。

【００７６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RAKAN Co., Ltd. Ezaki, Takayuki Endoh, Katsumi <120> Method for detecting microorganisms. <130> P01006 <140> <141> <160> 52 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Legionella spp <400> 1 agcatggtct agcttgct 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Legionella spp <400> 2 tcctccccac tgaaagtg 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Legionella pneumophila <400> 3 gataagttgt cttatagcat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Legionella pneumophila <400> 4 tttcactgaa attaagtgaa 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Pseudomonas aeruginosa <400> 5 gagcttatga agggagct 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Pseudomonas aeruginosa <400> 6 gcaaggtatt aacttactgc 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Burkholderia cepacia group <400> 7 atacatcgga acatgtcc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Burkholderia cepacia group <400> 8 ccgactgtat tagagcca 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli group <400> 9 aatgtctggg aaactgcc 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli group <400> 10 acgtcaatga gcaaaggt 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Acinetobacter spp <400> 11 aatgcttagg aatctgcc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Acinetobacter spp <400> 12 tcctcctcgc ttaaagtg 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium (Slow) <400> 13 agtttgatcc tggctcag 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium (Slow) <400> 14 tcttctccac ctaccgtc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium avium complex <400> 15 taacacgtgg gcaatctg 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium avium complex <400> 16 cgtgagattt cacgaaca 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium intracellulare <400> 17 taacacgtgg gcaatctgcc 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium intracellulare <400> 18 tcttctccac ctaccgtc 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Universal Bacteria <400> 19 gagtttgatc mtggctcag 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Universal Bacteria <400> 20 gtattaccgc ggckgctg 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Fungal Universal <400> 21 gaaactcacc aggtccag 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Fungal Universal <400> 22 attcctcgtt gaagagca 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Acanthamoeba spp <400> 23 atggctcatt aaatcagtta 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Acanthamoeba spp <400> 24 cttagaagtg gtagccattt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 25 ctgctgtaca agctgctatc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 26 caacagcaga cacattcaag 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Legionella spp <400> 27 gagtaacgcg taggaatatg cct 23 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Legionella spp <400> 28 ctaatcggac gcaggctaat ct 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Legionella pneumophila <400> 29 gcatgcaaga cgctatgagt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Legionella pneumophila <400> 30 caccatttcc agcattgatt 20 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Pseudomonas aeruginosa <400> 31 ataacgtccg gaaacggc 18 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Pseudomonas aeruginosa <400> 32 cgccttggta ggcctttacc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Burkholderia cepacia group <400> 33 tacgatccac ggatgaaagc 20 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Burkholderia cepacia group <400> 34 tgctggatca ggctttcg 18 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli group <400> 35 gcataacgtc gcaagaccaa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Escherichia coli group <400> 36 ggtcatcctc tcagaccagc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Acinetobacter spp <400> 37 caacattccg aaaggaatgc 20 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Acinetobacter spp <400> 38 cccagtgtgg cggatcat 18 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium (Slow) <400> 39 gcctgggaaa ctgggtctaa 20 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium (Slow) <400> 40 tggccggaca ccctctca 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium avium complex <400> 41 ctcaagacgc atgtcttc 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium avium complex <400> 42 cggaccttcg tcgatggt 18 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium intracellulare <400> 43 taataccgga taggacctt 19 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Mycobacterium intracellulare <400> 44 cttctccacc taccgtcaat 20 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Universal Bacteria <400> 45 gagtttgatc mtggctcag 19 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Universal Bacteria <400> 46 cccactgctg cctcccgt 18 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Fungal Universal <400> 47 gcatggccgt tcttagttgg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Fungal Universal <400> 48 atgctctatc cccagcacga 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Acanthamoeba spp <400> 49 attctagagc taatacatgc g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Acanthamoeba spp <400> 50 gggcagaaat ttgaatgaat c 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 51 atggtgagca atcctctgcc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 52 ccgaggagat ggttatcctt 20

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施形態における微生物の検出操作
の概要を示す説明図である。

【符号の説明】

Ｒ１ａ，Ｒ１ｂ，Ｒ１ｃ，… ＰＣＲ反応液（第１段
階）Ｒ２ａ，Ｒ２ｂ，Ｒ２ｃ，… ＰＣＲ反応液（第２段
階）Ｔ１温度サイクル条件（第１段階）Ｔ２温度サイクル条件（第２段階）

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:385）Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1:385）Ｃ１２Ｒ 1:325） 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1:325）Ｃ１２Ｒ 1:645） 1:645）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】所定の分類範囲において特異的かつ普遍
的な塩基配列を持つ微生物の遺伝子を標的とするプライ
マーを用いて、当該分類範囲に属する微生物の遺伝子を
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により増幅して検出
する微生物の検出方法であって、前記ＰＣＲ法の増幅反応における温度サイクル条件を予
め一定条件に設定するとともに、その設定条件下で、標
的とされる前記遺伝子が増幅されるように設計されたプ
ライマーセットを、検出対象とする複数種類の前記微生
物のそれぞれについて調製する工程と、検出対象とされる前記微生物のうち少なくとも１種類を
含むと思われる試料につき、調製された複数種類の前記
プライマーセットをそれぞれに用いて、設定された前記
温度サイクル条件に基づいて増幅反応を行う工程とを備
えることを特徴とする微生物の検出方法。
【請求項２】前記ＰＣＲ法がネステッドＰＣＲ法であ
ることを特徴とする請求項１に記載の微生物の検出方
法。
【請求項３】前記ネステッドＰＣＲ法は、第１段階の
増幅反応における前記温度サイクル条件のアニーリング
温度が４５〜５５℃の範囲内に設定され、かつ、第２段
階の増幅反応における前記温度サイクル条件のアニーリ
ング温度が５５〜６５℃の範囲内に設定されることを特
徴とする請求項２に記載の微生物の検出方法。
【請求項４】下記の(Ａ)〜(Ｍ)からなるイ群、及び
(ａ)〜(ｍ)からなるロ群より選択される複数種類のプラ
イマーセットを用いることを特徴とする請求項１〜３の
いずれか１つに記載の微生物の検出方法。イ群： (Ａ)レジオネラ（Legionella）属を検出するための、配
列番号１及び配列番号２に示す塩基配列をそれぞれに持
つプライマーセット，(Ｂ)レジオネラ・ニューモフィラ
（Legionella pneumophila）を検出するための、配列番
号３及び配列番号４に示す塩基配列をそれぞれに持つプ
ライマーセット，(Ｃ)シュードモナス・エルギノーサ
（Pseudomonas aeruginosa）を検出するための、配列番
号５及び配列番号６に示す塩基配列をそれぞれに持つプ
ライマーセット，(Ｄ)バークホルデリア・セパシア（Bu
rkholderia cepacia）を検出するための、配列番号７及
び配列番号８に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマ
ーセット，(Ｅ)エシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）を検出するための、配列番号９及び配列番号１０に
示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット，(Ｆ)
アシネトバクター（Acinetobacter）属を検出するため
の、配列番号１１及び配列番号１２に示す塩基配列をそ
れぞれに持つプライマーセット，(Ｇ)マイコバクテリウ
ム（Mycobacterium）属を検出するための、配列番号１
３及び配列番号１４に示す塩基配列をそれぞれに持つプ
ライマーセット，(Ｈ)マイコバクテリウム・アビウム
（Mycobacterium avium）・コンプレックスを検出する
ための、配列番号１５及び配列番号１６に示す塩基配列
をそれぞれに持つプライマーセット，(Ｉ)マイコバクテ
リウム・イントラセルラー（Mycobacterium intracellu
lare）を検出するための、配列番号１７及び配列番号１
８に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット，
(Ｊ)細菌全般を検出するための、配列番号１９及び配列
番号２０に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセ
ット，(Ｋ)菌類全般を検出するための、配列番号２１及
び配列番号２２に示す塩基配列をそれぞれに持つプライ
マーセット，(Ｌ)アカントアメーバ（Acanthamoeba）属
を検出するための、配列番号２３及び配列番号２４に示
す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット，(Ｍ)ク
リプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parv
um）を検出するための、配列番号２５及び配列番号２６
に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセットロ群： (ａ)レジオネラ属を検出するための、配列番号２７及び
配列番号２８に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマ
ーセット，(ｂ)レジオネラ・ニューモフィラを検出する
ための、配列番号２９及び配列番号３０に示す塩基配列
をそれぞれに持つプライマーセット，(ｃ)シュードモナ
ス・エルギノーサを検出するための、配列番号３１及び
配列番号３２に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマ
ーセット，(ｄ)バークホルデリア・セパシアを検出する
ための、配列番号３３及び配列番号３４に示す塩基配列
をそれぞれに持つプライマーセット，(ｅ)エシェリヒア
・コリを検出するための、配列番号３５及び配列番号３
６に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマーセット，
(ｆ)アシネトバクター属を検出するための、配列番号３
７及び配列番号３８に示す塩基配列をそれぞれに持つプ
ライマーセット，(ｇ)マイコバクテリウム属を検出する
ための、配列番号３９及び配列番号４０に示す塩基配列
をそれぞれに持つプライマーセット，(ｈ)マイコバクテ
リウム・アビウム・コンプレックスを検出するための、
配列番号４１及び配列番号４２に示す塩基配列をそれぞ
れに持つプライマーセット，(ｉ)マイコバクテリウム・
イントラセルラーを検出するための、配列番号４３及び
配列番号４４に示す塩基配列をそれぞれに持つプライマ
ーセット，(ｊ)細菌全般を検出するための、配列番号４
５及び配列番号４６に示す塩基配列をそれぞれに持つプ
ライマーセット，(ｋ)菌類全般を検出するための、配列
番号４７及び配列番号４８に示す塩基配列をそれぞれに
持つプライマーセット，(ｌ)アカントアメーバ属を検出
するための、配列番号４９及び配列番号５０に示す塩基
配列をそれぞれに持つプライマーセット，(ｍ)クリプト
スポリジウム・パルブムを検出するための、配列番号５
１及び配列番号５２に示す塩基配列をそれぞれに持つプ
ライマーセット
【請求項５】前記イ群より選択されるプライマーセッ
トとともに、前記ロ群より選択されるプライマーセット
をネステッドプライマーとして用いることを特徴とする
請求項４に記載の微生物の検出方法。
【請求項６】請求項４に記載の各群より選択される複
数種類のプライマーセットで構成されることを特徴とす
る微生物の検出用プライマーセット。