KR100915482B1 - 태반 줄기 세포의 회수 방법 - Google Patents

태반 줄기 세포의 회수 방법

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Abstract

혈액제거 태반을 응고방지액으로 관류시켜 잔류 세포를 분출시키고, 혈액제거 태반으로부터 잔류 세포 및 관류액을 회수하고, 잔류 세포 및 관류액으로부터 배아-유사 세포를 분리함으로써 잔류 제대혈을 제거하도록 처리된 태반으로부터 배아-유사 줄기 세포를 회수하는 방법. 외인성 세포를 태반 생물반응기에서 증식시킬 수 있으며 그로부터 생물활성 분자를 회수할 수 있다.

Description

태반 줄기 세포의 회수 방법{METHOD OF COLLECTING PLACENTAL STEM CELLS}
본 발명은 일반적으로 줄기 세포 회수 분야, 특히 태반으로부터 배아-유사 줄기 세포 및 기타 다능성 줄기 세포의 회수에 관한 것이다. 이 배아-유사 줄기 세포는 출산후 회수된 태반에서 유래한다. 이 배아-유사 줄기 세포는 배아 줄기 세포의 특성을 갖지만 배아에서 유래하지 않는다.
선행 가출원에 기초한 우선권의 주장
본 실용 특허출원은 발명자와 동일한 출원인, 즉, 하리리 로버트 제이(Robert J. Hariri)에 의해 2000년 12월 6일자로 출원된 동시 계류중인 선행 미국 가특허출원 제 60/251,900 호(발명의 명칭: "배아 줄기 세포의 회수 방법(Method of collecting embryonic stem cells)")의 우선권을 주장한다.
인간 줄기 세포는 다양한 성숙한 인간 세포계를 생성할 수 있는 전능성(totipotential) 또는 다능성 전구 세포이다. 이러한 능력은 기관 및 조직 발생에 필수적인 세포 분화 및 진화에 대한 토대가 된다. 최근 이러한 줄기 세포의 이식에 성공하여 질환, 독성 화학물질 또는 방사선에 노출됨으로 인한 골수제거후 골수를 재구성하고/하거나 보충하기 위한 새로운 임상적 도구가 제공되었다. 줄기 세포를 사용하여 전부는 아닐지라도 많은 조직을 재배치시키고 생리학적 및 해부학적 기능을 복원시킬 수 있음을 입증하는 또 다른 증거가 존재한다. 조직 공학, 유전자 치료제 전달 및 세포 치료에 줄기 세포를 적용하는 방법도 또한 급속히 진전되고 있다.
충분한 인간 줄기 세포를 수득하는 것은 여러 이유로 문제가 있었다. 첫째로, 성인 조직에서 정상적으로 발생하는 줄기 세포 개체군을 분리하는 것은 기술적으로 어렵고 비용이 많이 들고 양적으로 매우 제한되었다. 둘째로, 배아에서 또는 유산 태아를 포함하여 태아 조직에서 이들 세포를 수득하는 것은 많은 윤리학적 및 도덕적 논란을 야기하였다. 인간 배아 및 태아는 독립적인 생명을 이룬다는 만연된 믿음으로 인해 어떤 목적으로도 이들 공급원의 이용을 금지하는 것이 정당화되었다. 독립적인 생명의 존엄성을 침해하지 않는 대안적 공급원이 줄기 세포를 임상적으로 사용하는데 있어 추가의 진전을 위해 필수적이었다.
탯줄 혈액(제대혈)은 조혈 재구성에 사용하기 위해 냉동보존되는 조혈 다능성 전구 줄기 세포의 공지된 공급원이다. 이러한 목적에 제대혈을 사용하는 것은 공지되어 있으며 널리 이용되는 치료 절차가 되고 있다. 제대혈을 회수하기 위한 통상적인 기술은 태반으로부터 제대혈을 배출하기 위해 중력에 의해 이용되는 침 또는 캐뉼라의 사용을 기초로 한다. 통상적으로, 침 또는 캐뉼라를 제대 정맥에 배치하고 태반을 부드럽게 마사지하여 태반으로부터 제대혈의 배출을 용이하게 한다. 그런 다음, 혈액제거 태반은 이용하지 않는 것으로 간주되어 전형적으로 폐기되었다. 제대혈로부터 줄기 세포를 수득하는데 있어 주된 제한은 흔히 수득된 제대혈의 부피가 부적절하여 이식후 골수를 재구성하기에는 세포수가 불충분하게 되는 것이었다.
줄기 세포는 결정적으로 부족하다. 이들 줄기 세포는 악성종양, 선천적 대사 장애, 혈색소병증 및 면역결핍증을 포함하여 매우 다양한 질환의 치료에 중요하다. 보다 많은 배아 줄기 세포의 공급원을 찾는 것이 매우 유리하게 된다.
따라서, 본 발명의 주 목적은 혈액이 제거된 태반으로부터 조혈 줄기 세포를 추출하고 회수하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈액이 제거된 태반 추출물로부터 다른 배아-유사 및/또는 전능성 줄기 세포를 단리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 조혈 다능성 전구 줄기 세포의 가장 우수한 공급원인 제대 정맥으로부터 줄기 세포를 회수하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈액이 제거된 태반으로부터 추가의 배아-유사 줄기 세포를 고농도로 수득할 수 있는 방법 및 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 림프구 및 줄기 세포(이들로 한정되지는 않는다)를 포함하는 내인성 세포의 증식에 양호한 환경을 제공하는 생물반응기로서 단리되고 관류된 태반을 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 출산 및 자궁으로부터 태반 배출후 여러 시간 후에 줄기 세포를 수득할 수 있는 방법 및 수단을 제공하는 것이다.
발명의 요약
혈액제거후 인간 태반의 회수 및 잔류 혈액의 수거시, 제대 동맥 및 제대 정맥중 어느 하나 또는 둘 다를 이용하는 관류 기술에 의해 혈액제거 태반으로부터 배아-유사 줄기 세포를 추출하는 방법을 개발하였다. 이어서, 유조직 및 혈관외 공간 내에 내재하는 줄기 세포가 보충되고 비어 있는 미세순환 중으로 이동되어 여기서 이들 세포들은 관류에 의해 회수 용기 중으로 씻어낼 수 있도록 하는 생체외, 천연 생물반응기 환경을 확립하는 방식으로 태반을 처리한다.
도 1은 태반을 관류시킨 다음 관류액을 수거하기 위해 태반의 정맥 및 동맥에 캐뉼라를 삽입하는 단면도이다.
도 2a 내지 도 2e는 혈액을 제거하고 관류시킨 태반의 회수, 클램핑, 관류, 회수 및 저장을 나타내는 개요도이다.
도 3은 생물반응기로 사용하기 위한 장치 내의 관류된 태반의 단면도이다.
도 4는 관류된 태반으로부터 회수된 세포를 분류하기 위한 선별 개요도이다.
I. 태반의 혈액제거 및 추출 방법
제대혈의 배출 및 신선한 태반의 보관
본 방법은 태반으로부터 제대혈을 거의 전부 배출시켜 통상적인 제대혈 회수 공정에 적용된 새로 혈액이 제거된 인간 태반에 대한 접근방법을 필요로 한다. 태반은 배아 줄기 세포의 적합한 공급원이 되는 경우 적절히 보관하고 혈액을 제거하는 것이 중요하다. 일반적으로, 태반은 제대혈 회수에 앞서 48시간 이하동안 5 내지 25℃의 온도에서 응고방지액 중에 보관되어야 한다. 적합한 응고방지액은 공지되어 있다. 바람직한 응고방지액은 헤파린 용액(1:1000 용액 중 1%(w/w))을 포함한다. 일반적으로, 혈액이 제거된 태반은 배아-유사 줄기 세포를 회수하기 전에 36시간 이하동안 보관해야 한다.
세포 추출
바람직한 배아-유사 줄기 세포 추출 방법은 적합한 수성 유체, 예를 들면, 0.9N 염화나트륨 용액과 같은 임의의 적합한 수성 등장성 유체에 용해된 응고방지제로 혈액제거 태반을 관류시킴을 기초로 한다. 관류액으로 사용하기 위한 응고방지제는 헤파린 또는 와파린 나트륨을 임의의 잔류 제대혈의 응혈 형성을 방지하기에 충분한 농도로 포함할 수 있다. 일반적으로, 100 내지 1000 유니트의 헤파린을 사용할 수 있다.
추출 절차는 제대 동맥 및 제대 정맥이 최고점에 존재하는 방식으로 현탁된 태반 중에 중력의 흐름을 이용하여 제대 동맥 및 제대 정맥중 어느 하나 또는 둘 다를 통해 관류액이 통과함을 기초로 한다. 도 1에 도시된 바와 같이 유연성 연결장치를 통해 관류액(관류액은 제대 정맥 및 동맥 내로 통과하여 임신중 모체의 자궁에 부착되었던 태반의 표면으로부터 적합한 개방 용기에 수거된다)의 저장기에 연결되어 있는 피펫에 제대 동맥 및 제대 정맥을 동시에 연결하는 것이 바람직하다.
회수 기술은 충분한 양의 관류액의 사용을 기초로 하며 이에 의해 제대혈 배출 후 남은 세포가 회수될 것이다. 관류액을 먼저 회수하는 경우, 관류액은 잔류하는 적혈구로 착색되고, 관류액이 태반을 통과함에 따라 투명해지는 경향이 있는 것으로 관찰되었다. 일반적으로 30 내지 100㎖의 관류액이 배아-유사 세포를 회수하는데 적합하지만, 관찰 결과에 따라 더 사용하거나 덜 사용할 수 있다.
II. 생물반응기로서 혈액을 제거하고 관류시킨 태반의 사용 방법
혈액이 제거된 태반의 관류
상기에서 논의했듯이, 도 2a 내지 2e에 도시된 바와 같이, 근위부 탯줄의 혈액제거 및 클램핑(태반 디스크내 삽입부의 4 내지 5cm 이내) 및 태반 혈액 회수 후에 태반을 무균 조건하에 회수하고 멸균 단열된(태반의 온도를 20 내지 28℃로 유지) 수송 장치에서, 예를 들면, 클램핑된 태반을 멸균 지퍼락 플라스틱 백에 넣은 다음 이 백을 단열 스티로포움(Styrofoam) 용기 또는 진공 단열 용기에 넣어서 처리를 위한 실험실로 수송한다.
생물반응기로서 태반의 사용
태반을 멸균 대야에 넣고 500㎖의 포스페이트-완충된 표준 식염수로 세척한다. 세척액을 폐기한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 관류 분기관에 연결되어 있는 멸균 배관에 연결된 테플론(Teflon) 또는 플라스틱 캐뉼라를 제대 정맥에 삽입한다. 이어서, 상기 대야를 덮고 태반을 실온(20 내지 25℃)에서 2 내지 24시간의 기간동안 유지한다. 그 다음, 태반을 주기적으로, 바람직하게는 4, 8, 12 및 24시간에, 일정 부피의 관류액, 바람직하게는 100㎖의 관류액(1000u/ℓ 헤파린 및/또는 EDTA 및/또는 CPDA(크레아틴 포스페이트 덱스트로즈)로 보충되거나 보충되지 않은 멸균 표준 식염수)으로 관류시킨다. 반대쪽 표면에서 태반을 빠져나오는 유출액을 회수하고 처리하여 문제의 줄기 세포를 단리한다. 태반이 유지되는 조건의 변화 및 관류액의 특성에 따라 유출물의 부피 및 조성을 조절할 수 있다.
그런 다음, 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 기술을 이용하여, 예를 들면, 밀도 구배 원심분리, 자기 세포 분리 또는 기타 허용되는 방법을 이용하여 유출물로부터 줄기 세포를 단리하고, 예를 들면, 도 4에 나타낸 도식에 따라 분류한다.
본 방법의 변형으로, 태반내 세포를 면역글로불린과 같은 생물활성 분자 또는 기타 분자를 생성하도록 자극하거나 또는, 예를 들면, 에리트로포이에틴을 투여함으로써 증식하도록 자극할 수 있다. 또한, 이 세포를 여전히 생물반응기 내에서 수확전에 유전학적으로 처리하거나, 또는 수확시에, 예를 들면, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 이용하거나 또는 리포좀 또는 화학적으로 매개된 DNA의 흡수와 같은 기계적 수단을 이용하여 유전학적으로 처리할 수 있다.
이를 위한 절차는 다음과 같다:
1. 태반을 완전히 혈액을 제거하고 임의의 부착성 응집 오염물 및 비부착성 세포 오염물을 제거한다.
2. 태반을 배양하고 응고방지제의 존재 또는 부재하에 및/또는 항미생물제의 존재 또는 부재하에 관류 용액(예를 들면, 표준 식염수 용액)으로 관류시킨다.
3. 흘러나오는 관류액 및 순환되는 관류액을 모두 멸균 용기에 수거한다.
4. 예를 들면, 밀도 구배 원심분리, 자기 세포 분리, 친화성 세포 분리 또는 시차 부착 기술(이로 한정되지는 않는다)과 같이 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 기술을 이용하여 회수된 관류액으로부터 세포 유형들을 단리한다.
본 발명의 한 태양에 있어서, 태반을 48시간동안 관류 용액과 함께 배양함으로써 태반을 림프구 및 다양한 종류의 다능성 및/또는 전능성 줄기 세포(이들로 한정되지는 않는다)를 포함하는 내인성 세포용 생물반응기로 사용한다.
또 다른 태양에서, 태반은 모든 내인성 세포를 제거하고 외래 세포를 도입시켜 관류된 태반 환경에서 증식되도록 처리된다. 특정 태양에서, 관류된 태반에 전자기선, UV, X-선, 감마-선 또는 베타-선을 조사하여 남아 있는 모든 생존 내인성 세포를 박멸한다. 이어서, 조사된 태반 생물반응기에서 증식될 문제의 외래 세포를 도입한다.
관류 용액 내에 영양물 및 성장 인자들을 도입하여 외인성 세포가 증식하도록 유도한다. 혈청 및 다른 성장 인자들을 증식 관류 용액 또는 배지에 첨가한다. 성장 인자는 통상적으로 단백질이며 사이토카인, 림포카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자(CSF), 케모카인 및 인터류킨을 포함하나 이들로 한정되지는 않는다. 다른 성장 인자로는 리간드, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴(Tpo), 인터류킨 및 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF)를 포함하여 재조합 인간 조혈 성장인자가 포함된다. 관류 용액 내에 도입된 성장 인자는 미분화 줄기 세포 또는 분화된 조혈 세포의 증식을 자극하고, 면역글로불린, 호르몬 또는 전술한 바와 같은 다른 성장 인자(이들로 한정되지는 않는다)를 포함하는 생물활성 분자들의 생성을 자극할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
실시예 1: 혈액이 제거된 태반의 관류
20㎖의 포스페이트 완충된 식염수 용액(PBS)을 관류액에 가하고 10㎖ 분량을 회수하여 3000rpm(분당 회전수)에서 25분간 원심분리하였다. 유출물을 4개의 시험관에 나누어 얼음 욕조에 넣었다. PBS중의 1% 소 태아 혈청(FCS) 용액 2.5㎖를 가하고 시험관을 원심분리(140분x10g(중력에 의한 가속))하였다. 펠릿을 5㎖의 1% FCS에 재현탁시키고 2개의 시험관을 합하였다. 총 림프구와 총 단핵세포를 합하고 이것을 총 세포 현탁 부피로 곱하여 총 단핵구를 계산하였다.
실시예 2: 태반의 관류 및 배양에 의해 수득된 세포의 분석
WBC(1000/㎖) Lym(%) MID(%) GRA(%) 총 부피 세포수
CB(제대혈) 10.5 43.2 8 48.8 60㎖ 6.3x108
PP(태반 관류액, 실온) 12.0 62.9 18.2 18.9 15㎖ 1.8x108
PP2 (태반 관류액, 37℃) 11.7 56.0 19.2 24.8 30㎖ 3.5x108
PP 샘플은 피콜(Ficoll) 분리후에 얻은 것임.피콜 분리후 PP의 총 세포수는 5.3x108이고, 처리전 CB의 수는 6.3x108이다.Lym(%)는 림프구의 백분율이고; MID(%)는 중간범위 백혈구의 백분율이며; GRA(%)는 과립구의 백분율이다.
세포 단리는 자기 세포 분리, 예를 들면, 오토 맥스(Auto Macs; 밀테니(Miltenyi))를 이용하여 수행하였다. CD 34＋ 세포 단리를 먼저 수행하는 것이 바람직하다.
재료 및 방법
사설 제대혈 은행 프로그램에 등록된 예비 엄마들로부터 태반 기증자를 모집하고 연구 목적의 제대혈을 회수한 후 혈액제거 태반의 사용을 허용하는 고지에 의한 동의를 받았다. 이들 기증자들은 또한 그들의 냉동보존용 제대혈 시편을 표준 처리하여 산출된 무기명 데이터의 사용을 승인하였다. 이로써 회수된 제대혈과 하기에 기술하는 본 실험 방법을 이용하여 회수된 유출물 관류액의 조성 비교가 가능하였다. 모든 기증자의 데이터는 비밀이 보장된다.
탯줄 및 태반의 혈액제거 후, 태반을 실온에서 멸균 단열 용기에 넣고 출산후 4시간 이내에 실험실로 운반하였다. 정밀검사시 기관의 분절화 또는 제대 혈관의 적출과 같은 물리적 손상의 징후를 나타낼 경우 태반을 폐기하였다. 태반은 멸균 용기에서 2 내지 20시간동안 실온(23±2℃)에서 유지시키거나 또는 냉장보관(4℃)하였다. 주기적으로, 태반을 25±3℃에서 멸균 식염수에 침지시키고 세척하여 임의의 가시적 표면 혈액 또는 파편을 제거하였다. 탯줄을 태반내의 그의 삽입부로부터 약 5cm에서 절개하고 제대 혈관에 태반의 이방향성 관류 및 유출액의 회수를 가능하게 하는 멸균 유체 경로에 연결된 테플론 또는 폴리프로필렌 카테터를 삽입하였다. 본 발명에 사용된 시스템은 컨디셔닝, 관류 및 유출물 회수의 모든 태양이 제어된 주의 대기 조건하에서 수행될 수 있게 할 뿐 아니라, 혈관내 압력 및 유량, 코어 및 관류액 온도 및 회수된 유출물 부피의 실시간 모니터를 가능하게 하였다. 일련의 컨디셔닝 프로토콜을 24시간의 산후 기간동안 평가하였으며, 유출액의 세포 조성을 유세포 분석법, 광 현미경검사 및 콜로니 형성 유니트 분석법에 의해 분석하였다.
태반 컨디셔닝
잔류 세포의 증식 및 보충을 위한 생리적으로 양립가능한 환경을 자극하고 유지하기 위한 시도로 태반을 다양한 조건하에서 유지시켰다. 캐뉼라를 2U/㎖의 헤파린(미국 뉴저지주 소재의 이제이킨스-신(EJkins-Sinn))을 함유하는 IMDM 혈청-비함유 배지(미국 뉴욕 소재의 깁코비알엘(GibcoBRL))로 분출시켰다. 약 150㎖의 관류액이 회수될 때까지 50㎖/분의 속도로 태반의 관류를 계속하였다. 이 부피의 관류액을 "초기 분획"으로 식별하였다. 동일한 속도에서 계속 태반을 관류한 결과 약 150㎖의 제 2 분획 회수가 이루어졌고 "후기 분획"으로 식별하였다. 절차 진행동안, 태반을 부드럽게 마사지하여 관류 공정을 용이하게 하고 세포 물질의 회수를 도왔다. 중력에 의한 혈액제거 및 동맥 캐뉼라를 통한 흡인 둘 다에 의해 관류 회로로부터 유출액을 회수하였다.
부모의 서면 동의를 얻은 후 제대혈과 함께 태반을 분만실에서 수득하고 분만후 12 내지 24시간 이내에 실온에서 처리하였다. 처리전에, 막을 제거하고 모체 쪽의 잔류 혈액을 깨끗이 세척하였다. 제대 혈관에 혈액 시료 수거용 20 게이지 버터플라이(Butterfly) 침을 이용하여 카테터를 삽입하였다. 이어서, 10 분간 15㎖/분의 속도로 헤파린화(2U/㎖) 둘베코의 변형된 이글 배지(heparinized Dulbecco's modified Eagle Medium, H.DMEM)로 태반을 관류시키고 관류액을 1시간 이내에 모체 쪽으로부터 회수하고 핵형성된 세포를 계수하였다. 회수된 핵형성 세포의 수가 100/㎕ 미만으로 떨어질 때까지 관류 및 회수 절차를 1회 또는 2회 반복하였다. 관류액을 모아서 경량 원심분리하여 혈소판, 파편 및 핵제거된 세포막들을 제거하였다. 이어서, 핵형성된 세포를 피콜-하이패크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리로 단리하고, 세척한 후 H.DMEM에 재현탁하였다. 부착성 세포를 단리하기 위해, 5 내지 10x106 세포의 분취량을 여러개 T-75 플라스크 각각에 넣고 바이오 휘태커(Bio Whittaker) 사에서 구입한 상업적으로 시판되는 간엽 줄기 세포 성장 배지(MSCGM)로 배양하고, 조직 배양기(37℃, 5% CO2)에 넣었다. 10 내지 15일후에, 비-부착성 세포를 PBS로 세척하여 제거한 다음 PBS를 MSCGM으로 교체하였다. 플라스크를 매일 다양한 부착성 세포 유형의 존재에 대해, 특히 섬유아세포종 세포군의 동정 및 확장에 대해 조사하였다.
세포 회수 및 단리
실온에서 15분간 X00xg으로 원심분리하여 관류액으로부터 세포를 회수하였다. 이 절차에 의해 오염 파편 및 혈소판으로부터 세포를 분리하였다. 세포 펠릿을 2U/㎖의 헤파린 및 2mM EDTA를 함유하는 IMDM 혈청-비함유 배지(미국 뉴욕, 깁코비알엘)에 재현탁하였다. 전체 단핵 세포 분획을 제조업자가 추천한 절차에 따라 림포프레프(Lymphoprep; 노르웨이 오슬로 소재의 니코메드 파르마(Nycomed Pharma))를 이용하여 단리하고 단핵 세포 분획을 재현탁하였다. 혈구계수기를 이용하여 세포를 계수하였다. 트립판 블루 배제법으로 생존율을 평가하였다. 간엽 세포의 단리는 0.2% EDTA 함유 0.05% 트립신 용액(시그마(Sigma))을 이용하여 "시차 트립신화"에 의해 수행하였다. 시차 트립신화는 섬유아세포종 세포가 약 5분 이내에 플라스틱 표면으로부터 분리된 반면 다른 부착성 개체군은 20 내지 30분 이상의 배양을 필요로 했기 때문에 가능하였다. 분리된 섬유아세포종 세포는 트립신화, 및 트립신 중화 용액(TNS, 바이오 휘태커)을 사용한 트립신 중화 후에 수확하였다. 세포를 H.DMEM으로 세척하고 MSCGM에 재현탁하였다. 벡톤-디킨슨 팩스캘리버(Becton-Dickinson FACSCalibur) 기기를 이용하여 유세포 분석법을 수행하였으며, 골수-유래 MSC(간엽 줄기 세포)에 대한 공지된 마커를 기준으로 선택된 FITC 및 PE 표지된 단클론성 항체는 비.디. 앤드 칼택(B.D. and Caltag) 실험실(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)로부터 구입하였고, SH2, SH3 및 SH4 항체 생성 하이브리도마는 암. 컬.(AM. Cul.)로부터 수득하였으며, 그 배양 상등액 중의 MoAb의 반응성은 FITC 또는 PE 표지된 F(ab)'2 염소 항-마우스 항체로 검출하였다. 계통 분화는 제조업자의 지시에 따라 사용되는 상업적으로 시판되는 유도 및 보존 배지(바이오 휘태커)를 이용하여 수행하였다.
태반 줄기 세포의 단리
배양 플라스크 내의 부착성 세포의 현미경 검사 결과 형태학적으로 상이한 세포 유형들을 나타내었다. 방추형 세포, 거대 핵 및 많은 핵주위 소포를 가진 원형 세포, 및 그중 하나를 통해 세포가 플라스크에 부착된 여러 돌출부를 가진 별모양 세포. 이들 부착성 세포를 더 특성화하려고 시도하지는 않았지만, 골수, 탯줄 및 말초혈의 배양액에서 유사한 세포들이 관찰되었으므로, 특성상 비-줄기 세포인 것으로 간주하였다. 군락으로 마지막에 나타나는 섬유아세포종 세포가 MSC일 것으로 지목되어 시차 트립신화에 의해 단리하고 제 2의 플라스크에서 2차 배양하였다. 트립신화 후, 고도로 과립화될 원형 세포의 상 현미경검사 결과, 실험실에서 생성되거나 바이오 휘태커에서 구입한 골수-유래 MSC와 구별할 수 없었다. 2차 배양할 때, 태반-유래 세포는 그의 초기 상과 대조적으로 수시간 이내에 부착되어 특징적인 섬유아세포종 형태가 추정되었으며 표준 골수-유래 MSC와 동일한 성장 패턴을 이루었다. 더욱이, 2차 배양 및 재생육 동안, 느슨하게 결합된 단핵 세포를 세척하였으며, 배양액은 균질하고 어떤 가시적인 비-섬유아세포종 세포 오염물도 없이 유지되었다.
유세포 분석법
초기 및 후기 분획의 정제된 단핵 세포 상에 CD-34, CD-38 및 기타 줄기 세포-결합 표면 마커의 발현을 유세포 분석법으로 평가하였다. 간단하게, 세포를 PBS로 세척한 다음 항-CD34 피코에리트린 및 항-CD38 플루오레세인 이소티오시아네이트(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 벡톤 디킨슨)로 이중-염색하였다.
본 발명의 특정 태양을 본원에서 예시를 위해 기술하였지만, 당해 분야에 숙련된 자에게 첨부한 청구의 범위에 정의된 바와 같은 본 발명으로부터 벗어나지 않고 본 발명의 상세한 내용의 많은 변형을 이룰 수 있음은 명백할 것이다.

Claims (43)

  1. 분리되고 방혈된 포유류 태반으로부터 태반 줄기 세포를 수집하는 방법으로서,
    상기 태반으로부터 검출가능한 양의 줄기 세포를 수집하기에 충분한 양과 시간 동안 관류 용액으로 상기 태반을 관류시키고 상기 태반으로부터 상기 줄기 세포 및 관류 용액을 수집하는 것을 포함하고,
    상기 태반은 상기 관류 전에 제대혈이 배출되고 잔류 혈액을 제거하기 위하여 분출된 것이며, 상기 관류는 상기 태반의 제대 정맥 및 제대 동맥중 하나 또는 둘 모두에 상기 관류 용액을 통과시켜 수행되는 것인 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 관류 용액으로부터 상기 줄기 세포를 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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  25. 제 1 항에 있어서,
    상기 태반 줄기 세포가 CD34+ 태반 줄기 세포인 방법.
  26. 제 1 항에 있어서,
    상기 태반 줄기 세포가 CD34- 태반 줄기 세포인 방법.
  27. 제 1 항에 있어서,
    상기 태반을 상기 잔류 혈액의 제거 후 및 상기 관류 전에 4시간 동안 배양하는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서,
    상기 태반을 상기 잔류 혈액의 제거 후 및 상기 관류 전에 12시간 동안 배양하는 방법.
  29. 제 1 항에 있어서,
    상기 태반을 상기 잔류 혈액의 제거 후 및 상기 관류 전에 24시간 동안 배양하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서,
    상기 관류가 상기 관류 용액을 30ml 내지 150ml의 제 1 부피로 사용하여 수행되는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 관류 용액을 30ml 내지 150ml의 제 2 부피로 사용하여 상기 관류를 계속하는 것을 추가로 포함하고 상기 제 2 부피가 상기 제 1 부피와 별도로 수집되는 방법.
  32. 제 1 항에 있어서,
    상기 관류가 여러번 수행되는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    매번 상기 관류가 30ml 내지 150ml 부피의 상기 관류 용액을 사용하여 수행되는 방법.
  34. 제 1 항에 있어서,
    상기 관류 용액이 항응고제를 포함하는 방법.
  35. 제 1 항에 있어서,
    상기 관류 용액이 헤파린, 에틸렌 다이아민 4차 아세트산(EDTA) 또는 크레아틴 포스페이트 덱스트로스(CPDA)를 포함하는 방법.
  36. 제 1 항에 있어서,
    상기 관류 용액이 증식 인자 또는 사이토카인을 포함하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 증식 인자 또는 사이토카인이 콜로니-자극 인자, 인터페론, 에리트로포이에틴, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴, 인터루킨, 과립구 콜로니-자극 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  38. 제 1 항에 있어서,
    상기 분리된 포유류 태반이 성공적인 분만 후에 남은 산후 태반인 방법.
  39. 제 1 항에 있어서,
    상기 줄기 세포가 다능성인 방법.
  40. 제 1 항에 있어서,
    상기 줄기 세포가, 태반이 2 내지 24 시간 동안 실온에서 유지된 후 4, 8, 12 또는 24 시간에 수집되는 방법.
  41. 제 1 항에 있어서,
    상기 관류가 상기 잔류 혈액의 제거 후 4 시간에 수행되는 방법.
  42. 제 1 항에 있어서,
    상기 관류가 상기 잔류 혈액의 제거 후 12 시간에 수행되는 방법.
  43. 제 1 항에 있어서,
    상기 관류가 상기 잔류 혈액의 제거 후 24 시간에 수행되는 방법.
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