JP2002529073A - 三次元装置における造血前駆細胞からのリンパ様組織特異的細胞の生成 - Google Patents

三次元装置における造血前駆細胞からのリンパ様組織特異的細胞の生成

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、リンパ網内性基質細胞の存在下でのおよび外因的に加えられた成長因子の不存在下で、独特の三次元培養装置における造血前駆細胞からのリンパ様組織特異的細胞生成の方法に関する。得られるものは、分化した後代である。リンパ様組織特異的細胞を、分化のすべての連続的段階において単離し、さらに拡張させることができる。リンパ様組織特異的細胞はまた、プロセスのすべての段階において、遺伝子的に変化させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願 本出願は、１９９８年１１月１２日出願、発明の名称「三次元装置における造
血前駆細胞からのリンパ様組織特異的細胞の生成」の米国特許仮出願通番第６０
／１０７，９７２号から３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９に基づいて優先権を主張
する。この仮出願の内容は、本出願中に、参照により組み込まれる。
【０００２】発明の分野 本発明は、三次元装置における造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞を同
時培養(coculture)し、予測できない程度に多数のリンパ様組織特異的細胞の後
代を得ることに関する。
【０００３】発明の背景 免疫系の特徴は、抗原の特異的認識である。これは、自己的と非自己的抗原と
の間および以前に遭遇した抗原に対する迅速かつ特異的な反応を可能にする記憶
様能力を識別するポテンシャルを含む。脊椎動物の免疫系は、最終的に体液性の
および細胞により媒介された免疫応答を生じる分子的および細胞的事象のカスケ
ードをともなう外来の抗原と反応する。 抗原特異性認識を伴う免疫防御の主要な経路は、抗原の抗原提示細胞（ＡＰＣ
）、例えば樹状細胞またはマクロファージによる捕捉およびこれらの細胞のリン
パ器官（例えば胸腺）へのその後の移動で開始する。ここで、ＡＰＣは、成熟Ｔ
ヘルパー細胞として分類されるＴ細胞のサブクラスに抗原を提示する。提示され
た抗原の特異的な認識により、成熟Ｔヘルパー細胞は誘発されて、活性化Ｔヘル
パー細胞となる。活性化Ｔヘルパー細胞は、形質細胞を生成する抗体への成熟Ｂ
細胞の分化を誘発することによる体液性免疫応答および成熟した細胞傷害性Ｔ細
胞の活性化による細胞媒介免疫応答を共に調節する。
【０００４】 胸腺は、造血細胞のＴ細胞分化における必須の因子であることが示されている
。マウスモデルに基づいて、胸腺および三次元構造を含まないインビトロモデル
が、Ｔ細胞リンパ球生成を支持しないため(Owen JJ等、Br Med Bull., 1989, 45
:350-360)、三次元器官の存在は、必要であると考えられている。しかし、分化
のプロセスは、胸腺に接する前駆細胞の前に開始するようである。
【０００５】 胎児肝臓または骨髄における原始的な造血前駆体は、Ｔリンパ様リネージ(lin
eage)に方向づけられた前駆体を含むリネージ委任細胞(lineage committed cell
s)を生じる。これらのほとんどの未成熟な細胞は、ＣＤ３４の表面発現により同
定される。Ｔ細胞リネージ委任細胞は、ＣＤ３４を発現するが、Ｔ細胞前駆体上
のみに見出される他のエピトープの別個の発現は、記載されていない。さらに、
Ｔリンパ球分化は、通常一連の別個の発生段階を通じて生じる。リンパ球特異的
細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ ＣＤ３− ＣＤ４− ＣＤ８−）を発現しない
原始的な前駆細胞は、胸腺に移動し、ここでこれらは、一連の成熟事象により、
表現型ＣＤ３４− ＣＤ３− ＣＤ４＋ ＣＤ８−を獲得する。次に、これらの
細胞は二重陽性ＣＤ４＋ ＣＤ８＋細胞に成熟し、これらのほとんどはＣＤ３＋
であるが、ＣＤ３発現は一般に検出可能ではない。これらの細胞は、さらに、陽
性および陰性選択を共に受け、成熟して単一陽性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ ＣＤ８−ま
たはＣＤ４− ＣＤ８＋）に発育する。これらの細胞は、最終的に、実験されて
いないＴ細胞として、末梢循環中に移動する。
【０００６】 Ｔ細胞障害および疾患は、主要な健康問題を示す。近年の進行は、ＡＩＤＳを
含むＴリンパ球を伴う疾病を治療するために、遺伝子療法を用いて実施された。
これは、これらの疾病のための有力な遺伝子療法のインビトロ評価を可能にする
実験室手法の開発において増大した関連を促進した。 Ｔ細胞分化の理解は、インビトロＴ細胞分化を可能にする技術の限定された有
用性により妨げられていた。現在まで、Ｔ細胞分化の研究は、ＳＣＩＤ−ｈｕマ
ウスのインビボモデルに大いに限定されていた。インビトロ技術は、胸腺移植研
究および霊長類胸腺単層に基づいていた。最近の進行において、霊長類胸腺基質
培養は、Ｔ細胞の発育を試験するための、役立つがしかし非効率の系を提供し、
再現性のある様式でインビトロＴ細胞分化を可能にする。しかし、この方法およ
び培養の比較的短い半減期を発生するＴ細胞の純度および数は、一般的にＴ細胞
分化および機能の一層進化した研究に対する限定された利用性を発生させる。
【０００７】発明の要約 本発明は、１つの重要な部分において、外因性成長因子を加えずに、リンパ様
組織特異的リネージへの造血前駆細胞の発育に向けられた造血前駆細胞を培養す
るための改善された方法を含む。従って、本発明の１つの観点は、特異的なリネ
ージに方向づけられた後代を生成するための造血前駆細胞の培養である。他の観
点は、造血前駆細胞の試料から得ることができる分化した後代の割合および数の
改善である。
【０００８】 本発明者等は、ここで、生物適合性であり、開放孔の、三次元マトリックスを
利用し、ヒトおよび非ヒトリンパ網内性基質細胞を用いて、特定の細胞リネージ
に対するヒトおよび非ヒト造血前駆細胞の拡張および分化のための適切な条件を
提供する系を記載する。例えばこれらの培養から得られたＴリンパ球は、通常種
々の刺激に応答し、成熟Ｔ細胞の予期されたマーカーの相違を表す。 この系は、在来の手法と比較して顕著な利点を提供する。例えば、これは、有
効な遺伝子療法の方策またはインビボでの対象への再輸液を含む、実験室分析お
よび／または治療的使用に必要な多数の分化した後代の迅速な発生を提供するこ
とができる。マトリックス自体は、造血細胞成長のインビボ研究のために、対象
中に移植することができる。システムはまた、造血細胞の維持、拡張および／ま
たは特異的なリネージへの分化の複雑なプロセスを合理的に繰り返すことができ
る。
【０００９】 驚くべきことに、本発明において、外因性成長因子を加えずに多孔質固体足場
においてリンパ網内性基質細胞と同時培養された造血前駆細胞は、迅速な速度で
予期されない程度に高い数のリンパ様特異的リネージの機能的な分化した後代を
生じることが見出された。リンパ網内性基質細胞が由来するリンパ様組織は、リ
ネージ委任造血前駆細胞が保証するのを決定するのを補助し、分化した後代のリ
ネージ特異性を生じる。また、驚くべきことに、本発明において、在来の方法と
比較して、少ない量の非リンパ様細胞（即ち髄性単球細胞）が、本発明の多孔質
固体足場において造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞の同時培養から発生
することが見出された。従って、本発明は、比較的少数の造血前駆細胞からの多
数の分化したリンパ様特異性細胞の迅速な発生を可能にする。このような結果は
、既知の技術の方法（例えば、霊長類胸腺基質単層におけるＣＤ３＋細胞のイン
ビトロ分化を記載するJohnson等による米国特許第５，６７７，１３９号または
三次元骨髄細胞、および組織培養系を記載するNaughton等による米国特許第５，
５４１，１０７号のよ うに）を用いては、以前には決して実現されなかった。
【００１０】 本発明の１つの側面において、リンパ様組織特異的細胞のインビトロ生成のた
めの方法が提供される。この方法は、ある量の造血前駆細胞およびある量のリン
パ網内性基質細胞を、造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞がマトリックス
全体に成長するのに十分な孔の大きさの相互接続した孔を有する多孔質固体マト
リックス中に導入することを含む。次いで、造血前駆細胞およびリンパ網内性基
質細胞を同時培養する。用いられるリンパ網内性基質細胞の量は、造血前駆細胞
の成長および分化を支持するのに十分な量である。１つの実施態様において、同
時培養は、リンパ様起源細胞の数において少なくとも１０倍の増加を生じるのに
十分な条件下で生じる。好ましい実施態様において、同時培養は、リンパ様組織
起源細胞の数の少なくとも２０、５０、１００、２００、３００または４００倍
の増加を生じるのに十分な条件下で生じる。いくつか実施態様において、同時培
養の後に、リンパ様組織起源細胞の収穫を実施することができる。
【００１１】 ある実施態様において、造血前駆細胞は、多能性幹細胞、多能性前駆細胞およ
び／または特異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞とすることができる
。特異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞は、Ｔ細胞リネージ、Ｂ細胞
リネージ、樹状細胞リネージ、ランゲルハンス細胞リネージおよび／またはリン
パ様組織特異的マクロファージ細胞リネージとすることができる。
【００１２】 造血前駆細胞は、骨髄、末梢血液（動態化末梢血液を含む）、臍帯血、胎盤血
、胎児肝臓、胚細胞（胚幹細胞を含む）、大動脈−生殖腺−中腎由来細胞および
リンパ様柔軟組織等の組織から由来することができる。リンパ様柔軟組織には、
胸腺、脾臓、肝臓、リンパ節、皮膚、扁桃およびパイエル板が含まれる。他の実
施態様において、リンパ網内性基質細胞はまた、前述のリンパ様柔軟組織の少な
くとも１つから由来することができる。好ましい実施態様において、リンパ網内
性基質細胞は胸腺基質細胞であり、多能性前駆細胞および／または方向づけられ
た前駆細胞は、Ｔ細胞リネージに方向づけられている。他の実施態様において、
造血前駆細胞および／またはリンパ網内性基質細胞は、遺伝子的に変化させるこ
とができる。
【００１３】 本発明の１つの重要な実施態様において、造血前駆細胞は、ヒト起源であり、
リンパ網内性基質細胞もまた、ヒト起源である。他の実施態様において、造血前
駆細胞は、ヒト起源であり、リンパ網内性基質細胞は、非ヒト起源である。好ま
しい実施態様において、非ヒトリンパ網内性基質細胞は、マウス起源である。 ある実施態様において、リンパ網内性基質細胞は、造血前駆細胞と同時にマト
リックスに播種される。他の実施態様において、リンパ網内性基質細胞は、造血
前駆細胞を接種する前に、マトリックスに播種される。
【００１４】 多孔質マトリックスは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％の百
分率開放空間を有する開放セル多孔質マトリックスであるものとすることができ
る。１つの実施態様において、多孔質固体マトリックスは、平均で１５０μｍよ
り小さい中点における直径を有する相互接続する靭帯により規定された孔を有す
る。好ましくは、多孔質固体マトリックスは、炭素含有物質の金属被覆網状開放
セルフォーム(cell foam)であり、金属被覆は、タンタル、チタン、白金（白金
族の他の金属を含む）、ニオブ、ハフニウム、タングステンおよびこれらの組合
せから成る群から選択されている。好ましい実施態様において、多孔質固体マト
リックスが金属で被覆されているか否かにかかわらず、マトリックスは、コラー
ゲン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、血管形成因子、抗炎症因子
、グリコサミノグリカン、ビトロゲン(vitrogen)、抗体およびこれらのフラグメ
ント、これらの因子の機能的等価物（これらのフラグメントを含む）、およびこ
れらの組合せから成る群から選択された生物学的剤で被覆されている。最も好ま
しくは、金属被覆は、生物学的剤を塗布したタンタルである。他のある実施態様
において、造血前駆細胞およびその後代、並びにリンパ網内性基質細胞を播種し
た多孔質固体マトリックスは、マトリックスの孔を占有するゼラチン状薬剤で含
浸されている。
【００１５】 本発明の好ましい実施態様は、固体の一体の巨大構造であり、即ちビーズまた
はパックしたビーズではない。これらはまた、非生物分解性物質を含む。 前述の実施態様のすべてにおいて、本発明の方法は、造血前駆細胞生存および
増殖因子、例えばインターロイキン３、６および１１、幹細胞リガンドおよびＦ
ＬＴ−３リガンドが存在しない環境において細胞を培養することを含むことがで
きる。本発明の尚他の実施態様は、造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞の
、血清以外の造血細胞の維持、拡張および／または分化を促進する基質細胞条件
化培地および外因的に加えられた造血成長因子をすべて含まない環境における同
時培養を実施することである。
【００１６】 理解されるべきであるように、本発明において、現在、７日という短い期間の
間に、造血細胞の維持、拡張および／または分化を促進する外因的に加えられた
造血成長因子を含まない環境において、造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細
胞を同時培養することおよび多数の特異的なリネージの分化した後代を得ること
が、可能である。 前述の実施態様のすべてにおいて、本発明の方法は、基質細胞条件培地、およ
び造血細胞の維持、拡張および／または分化を促進し、細胞局所化に影響する造
血成長因子から成る群から選択された外因的に加えられた薬剤を有する造血前駆
細胞およびリンパ網内性基質細胞の同時培養を含むことができる。ある実施態様
において、造血細胞の維持、拡張および／または分化を促進し、細胞局所化に影
響する造血成長因子は、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロ
イキン７、インターロイキン１１、インターロイキン１２、幹細胞因子、ＦＬＫ
−２リガンド、ＦＬＴ−２リガンド、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、
オンコスタチンＭおよびＭＣＳＦを含む薬剤であることができる。
【００１７】 本発明の他の側面において、造血前駆細胞のインビボでの維持、拡張および／
または分化のための方法を提供する。この方法は、対象中に、造血前駆細胞（こ
れらの後代を含み得る）およびリンパ網内性基質細胞を播種した多孔質固体マト
リックスを移植することを含む。多孔質マトリックスは、細胞がマトリックスを
通じて成長するのに十分な孔の大きさの相互接続された孔を有し、少なくとも５
０％、好ましくは少なくとも７５％の百分率開放空間を有する開放セル多孔質マ
トリックスである。多孔質固体マトリックスが、前記したように、１つまたは２
つ以上の好ましい特徴を有する、種々の実施態様を提供する。
【００１８】 ある実施態様において、造血前駆細胞（後代を含み得る）およびリンパ網内性
基質細胞を、ある量の造血前駆細胞およびある量のリンパ網内性基質細胞を、多
孔質固体マトリックス中にインビトロで導入し、該造血前駆細胞を、血清以外の
造血細胞の維持、拡張および／または分化を促進する基質細胞条件化培地および
外因的に加えられた造血成長因子を含まない環境において同時培養することによ
り、マトリックスに付着させる。同時培養を前記した条件の下で実施する、種々
の他の実施態様を提供する。尚他の実施態様において、造血前駆細胞（後代を含
み得る）およびリンパ網内性基質細胞を播種した多孔質固体マトリックスは、マ
トリックスの孔を占有するゼラチン状薬剤で含浸されている。
【００１９】 本発明の１つの側面において、Ｔ細胞アネルギーをインビトロで誘発する方法
を提供する。この方法は、ある量の造血前駆細胞、ある量の抗原提示細胞および
ある量のリンパ網内性基質細胞を、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細
胞がマトリックス全体に成長するのに十分な孔の大きさの相互接続した孔を有す
る多孔質固体マトリックス中に導入し、該造血前駆細胞、該抗原提示細胞および
該リンパ網内性基質細胞を、Ｔ細胞および／またはＴ細胞前駆体の形成を誘発し
、生成したＴ細胞および／またはＴ細胞前駆体の活性化を阻害するのに十分な条
件下で少なくとも１種の抗原の存在下で同時培養することを含む。
【００２０】 ある例において、造血前駆細胞は、多能性幹細胞、多能性前駆細胞および／ま
たは特異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞であり得る。造血前駆細胞
は、骨髄、末梢血液（動態化末梢血液を含む）、臍帯血、胎盤血、胎児肝臓、胚
細胞（胚幹細胞を含む）、大動脈−生殖腺−中腎由来細胞およびリンパ様柔軟組
織等の組織から由来することができる。リンパ様柔軟組織には、胸腺、脾臓、肝
臓、リンパ節、皮膚、扁桃およびパイエル板が含まれる。他の実施態様において
、リンパ網内性基質細胞はまた、前述のリンパ様柔軟組織の少なくとも１つから
由来することができる。好ましい実施態様において、リンパ網内性基質細胞は胸
腺基質細胞であり、多能性前駆細胞および／または方向づけられた前駆細胞は、
Ｔ細胞リネージに方向づけられている。他の実施態様において、造血前駆細胞お
よび／またはリンパ網内性基質細胞は、遺伝子的に変化させることができる。他
の実施態様において、抗原提示細胞は、樹状細胞、単球／マクロファージ、ラン
ゲルハンス細胞、クッペル細胞、ミクログリア、肺胞マクロファージおよびＢ細
胞等の細胞を含む。他の実施態様において、抗原提示細胞は、インビトロで造血
前駆細胞から由来する。多孔質固体マトリックスが、前記したように、１種また
は２種以上の好ましい特徴を有する、種々の実施態様を提供する。
【００２１】 本発明の他の観点において、インビトロでのＴ細胞反応性を誘発する方法を提
供する。この方法は、ある量の造血前駆細胞、ある量の抗原提示細胞およびある
量のリンパ網内性基質細胞を、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細胞が
マトリックス全体に成長するのに十分な孔の大きさの相互接続した孔を有する多
孔質固体マトリックス中に導入し、該造血前駆細胞、該抗原提示細胞および該リ
ンパ網内性基質細胞を、少なくとも１種の抗原に対する特異性を有する造血前駆
細胞からのＴ細胞および／またはＴ細胞前駆態の形成を誘発するのに十分な条件
下で、少なくとも１種の抗原の存在下で同時培養することを含む。造血前駆細胞
、リンパ網内性基質細胞および多孔質固体マトリックスが、前記したように１種
以上の好ましい特徴を有する、および細胞が前述のように培養される、種々の実
施態様を提供する。ある実施態様において、抗原提示細胞は、樹状細胞、単球／
マクロファージ、ランゲルハンス細胞、クッペル細胞、ミクログリア、肺胞マク
ロファージおよびＢ細胞等の細胞を含む。他の実施態様において、抗原提示細胞
は、インビトロで造血前駆細胞から由来する。他の実施態様において、この方法
は、さらに、同時刺激薬剤を同時培養に投与することを含む。好ましい同時刺激
薬剤には、リンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８
０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２が含ま
れる。
【００２２】 本発明の尚他の観点において、後代を含むかまたは含まない造血前駆体および
リンパ網内性基質細胞を固体多孔質マトリックスに付着させた、固体多孔質マト
リックスを提供する。リンパ網内性基質細胞は、造血前駆細胞の成長および分化
を支持するのに十分な量で存在する。ある実施態様において、造血前駆細胞を、
リンパ網内性基質細胞に付着させる。多孔質マトリックスは、少なくとも５０％
、好ましくは少なくとも７５％の百分率開放空間を有する開放セル多孔質マトリ
ックスであるものとすることができる。１つの実施態様において、多孔質固体マ
トリックスは、平均で１５０μｍより小さい中点における直径を有する相互接続
する靭帯により規定された孔を有する。好ましくは、多孔質固体マトリックスは
、炭素含有物質の金属被覆網状開放セルフォームであり、金属被覆は、タンタル
、チタン、白金（白金族の他の金属を含む）、ニオブ、ハフニウム、タングステ
ンおよびこれらの組合せから成る群から選択されている。好ましい実施態様にお
いて、多孔質固体マトリックスが金属で被覆されているか否かにかかわらず、マ
トリックスは、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、血管
形成因子、抗炎症因子、グリコサミノグリカン、ビトロゲン、抗体およびこれら
のフラグメント、これらの因子の機能的等価物、およびこれらの組合せから成る
群から選択された生物学的剤で被覆されている。最も好ましくは、金属被覆は、
生物学的剤を塗布したタンタルである。他のある実施態様において、造血前駆細
胞およびリンパ網内性基質細胞を播種した多孔質固体マトリックスは、マトリッ
クスの孔を占有するゼラチン状薬剤で含浸されている。
【００２３】 本発明の他の側面において、造血細胞の発育に影響することが疑われる剤を同
定する方法を提供する。この方法は、ある量の造血前駆細胞およびある量のリン
パ網内性基質細胞を、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細胞がマトリッ
クス全体に成長するのに十分な孔の大きさの相互接続した孔を有する多孔質固体
マトリックス中に導入し、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細胞を、造
血細胞の発育に影響することが疑われる少なくとも１種の候補薬剤の存在下で同
時培養し（試験同時培養において）、試験同時培養造血細胞の発育を対照の同時
培養と比較することにより、該少なくとも１種の候補薬剤が、試験同時培養にお
ける造血細胞の発育に影響しているか否かを決定し、これにより、造血前駆細胞
およびリンパ網内性基質細胞を、該少なくとも１種の候補薬剤の不存在下で同時
培養することを含む。造血前駆細胞、リンパ網内性基質細胞および多孔質固体マ
トリックスが、前記した１種または２種以上の好ましい特徴を有し、細胞を前記
のようにして培養する、種々の実施態様を提供する。ある実施態様において、造
血前駆細胞の発育は、造血前駆細胞の維持、拡張、特定の細胞リネージへの分化
および／または細胞死（断片化を含む）を含む。好ましい実施態様において、リ
ンパ網内性基質細胞は、胸腺基質細胞である。
【００２４】 本発明の他の観点において、細胞培養から造血細胞の発育に影響することが疑
われる剤を単離する方法を提供する。この方法は、ある量の造血前駆細胞および
ある量のリンパ網内性基質細胞を、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細
胞がマトリックス全体に成長するのに十分な孔の大きさの相互接続した孔を有す
る多孔質固体マトリックス中に導入し、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基
質細胞を同時培養し、該同時培養から試験上清液を得、該試験上清液を対照上清
液と比較し、該対照上清液から欠けている造血細胞の発育に影響することが疑わ
れる剤を含む該試験上清液のサブフラクションを得ることを含む。ある実施態様
において、造血細胞の発育に影響することが疑われる剤は、対照上清液中に存在
し、試験上清液中には存在しない。他の実施態様において、一方の上清液におい
て造血細胞の発育に影響することが疑われる剤は、他方の上清液において造血細
胞の発育に影響することが疑われる剤とは異なり得る（例えば、大きさにおいて
、翻訳後修飾により、代わりに接合した変種形態において等）。造血前駆細胞、
リンパ網内性基質細胞および多孔質固体マトリックスが、前記した１種または２
種以上の好ましい特徴を有し、細胞を前記のようにして培養する、種々の実施態
様を提供する。ある実施態様において、造血前駆細胞の発育は、造血前駆細胞の
維持、拡張、特定の細胞リネージへの分化および／または細胞死（断片化を含む
）を含む。好ましい実施態様において、リンパ網内性基質細胞は、胸腺基質細胞
である。他のある実施態様において、従来技術の対照培養系（ここで対照上清液
が得られ得る）は、Johnson等による米国特許第５，６７７，１３９号に記載さ
れたものである。 本発明のこれらのおよび他の観点並びに種々の利点および有用性は、好ましい
実施態様の詳細な説明を参照して、一層明らかになる。
【００２５】発明の詳細な説明 本発明は、外因性成長剤を加えずに、多孔質固体足場においてリンパ網内性基
質細胞と同時培養した造血前駆細胞は、迅速な速度で、リンパ様組織特異的リネ
ージの予測されない程度に多数の機能的な分化した後代を発生するという予測さ
れない発見を伴う。また、驚くべきことに、本発明において、在来の技術と比較
した際に、少量の非リンパ様細胞（即ち髄性単球細胞）は、本発明の多孔質固体
足場における造血前駆細胞とリンパ網内性基質細胞との同時培養から発生するこ
とが見出された。従って、本発明は、以前に業界において達成されたものと比較
して、比較的少数の造血前駆細胞から多数の分化したリンパ様特異性細胞の迅速
な発生を可能にする。 従って、本発明の方法は、特に、免疫不全症、例えばＴ細胞またはＢ細胞不全
症、例えば胸腺に基づく免疫不全症、例えば胸腺形成不全症または機能不全によ
る先天性免疫不全症、後天性免疫疾患、例えばＡＩＤＳ、腫瘍の病気から生じる
免疫不適格性、または医学的手順、例えば化学療法から生じる免疫不適格性、抗
原に対する応答における免疫競合性等を患っている患者における免疫競合性を達
成するのに有用である。
【００２６】 本発明は、１つの側面において、外因性成長剤の不存在下で、多孔質固体マト
リックスにおいて造血細胞を培養して、リンパ様組織起源（リンパ様組織特異的
）細胞を得ることを含む。 多孔質固体マトリックスは、相互接続するネットワークを形成する「スポンジ
状」連続孔を有する三次元構造として定義される。マトリックスは、硬質または
弾性であり、これは、細胞がこれを通じて成長することができる足場を提供する
。この孔は、相互接続されており、マトリックスを通して延在するチャネルの連
続的ネットワークを提供し、これを通して栄養素の流れを可能にする。好ましい
マトリックスは、少なくとも５０％、好ましくは７５％の百分率開放空間を有す
る開放セルフォームマトリックスである。従って、開放空間が、マトリックスの
大部分を構成するのが好ましい。これは、細胞移動、細胞−細胞接触、細胞成長
のための空間および栄養素への接近可能性を最大にすると考えられている。多孔
質マトリックスは、中心点において直径が１５０μｍ、好ましくは６０μｍより
小さい靭帯の網状のマトリックスで形成され、これにより細胞が、靭帯の部分上
に滞留するかまたはこれと相互作用するのが好ましい。好ましくは、平均孔直径
は、約３００μｍであり、これは、海綿質の骨と同様である。適切なマトリック
スは、多くの種々の方法を用いて得られる。このような方法の例には、重合体の
溶媒キャスティングまたは抽出、種々の材料のトラックエッチング、重合体の発
泡、ヒドロキシアパタイトの生体諸器官の骨格組織複製工程、および当業者に十
分知られている他の方法が含まれる。用いられる材料は、生体材料、例えばタン
パク質、ヒアルロン酸、合成重合体、例えばポリビニルピロリドン、ポリメチル
メタクリレート、メチルセルロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリウレ
タン、セラミック、例えばリン酸三カルシウム、アルミン酸カルシウム、カルシ
ウムヒドロキシアパタイトおよびセラミック補強または被覆重合体を含む天然物
または合成物とすることができる。足場の出発物質が、金属ではない場合には、
金属被覆を、三次元マトリックスに塗布することができる。金属被覆は、他の構
造支持および／または細胞成長および接着特性をマトリックスに付与する。被覆
として用いられる好ましい金属は、タンタル、チタン、白金および白金と同一の
元素群の金属、ニオブ、ハフニウム、タングステンおよびこれらの合金の組合せ
を含む。金属の被覆方法には、ＣＶＤ（化学蒸着）等の方法が含まれる。
【００２７】 本明細書を通してセルフォーム(Cellfoam)(Cytomatrix, Woburn, MA)と言及さ
れる好ましいマトリックスは、米国特許第５，２８２，８６１号に詳細に記載さ
れており、これを参照として本明細書中に組み込む。さらに特に、好ましいマト
リックスは、相互接続するネットワークにより定義された開放空間を有する炭素
含有物質の軽量であり、実質的に硬質のフォームにより形成された網状開放セル
基板であり、ここで前述のフォーム材料は、相互接続した連続的チャネル、およ
び網状の開放セル基板上に堆積し、相互接続するネットワークのほぼすべてを覆
う金属材料の薄膜を有して、天然の海綿質骨のものに類似する多孔質微細構造を
形成する合成多孔質生物適合性材料を形成する。
【００２８】 さらに、このようなマトリックスは、培養した造血前駆細胞の細胞接着を促進
し、改善された移動、成長および増殖を可能にする生物学的剤で被覆されている
ことができる。さらに、これらのマトリックスを、造血前駆細胞のインビボでの
維持、拡張および／または分化のために用いる際（即ち、細胞を有するマトリッ
クスを、対象に移植した際、以下の討議をも参照）には、血管形成（血管新生）
を促進する生物学的剤および炎症を防止／減少する生物学的剤はまた、マトリッ
クスの被覆に用いることができる。好ましい生物学的剤は、コラーゲン、フィブ
ロネクチン、ラミニン、インテグリン、血管形成因子、抗炎症因子、グリコサミ
ノグリカン、ビトロゲン(vitrogen)、抗体およびこれらのフラグメント、これら
の薬剤の機能的等価物、およびこれらの組合せを含む。
【００２９】 血管形成因子には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（Ｖ
ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ−２、レプチン、
プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ、ｕＰＡ）、血管形成、糖タンパク質
Ａ、形質転換成長因子β、ブラジキニン、血管形成オリゴ糖（例えばヒアルロナ
ン、ヘパラン硫酸）、トロンボスポンジン、肝細胞増殖因子（また散乱因子とし
て知られている）およびＣＸＣケモカイン受容体族の要素が含まれる。抗炎症因
子は、ステロイドおよび非ステロイド化合物を含み、例は以下のものを含む：ア
ルクロフェナック；アルクロメタソンジプロピオネート；アルゲストンアセトニ
ド；アルファアミラーゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アムフェナックナ
トリウム；アミプリロース塩酸塩；アナキンラ；アニロラック；アニトラザフェ
ン；アパゾン；バルサアジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン
；ベンジダミン塩酸塩；ブロメレインス；ブロペラモール；ブデソニド；カープ
ロフェン；チクロプロフェン；チンタゾン；クリプロフェン；クロベタゾールプ
ロピオネート；クロベタゾンブチレート；クロピラック；クロチカゾンプロピオ
ネート；コルメタソンアセテート；コルトドキソン；デフラザコルト；デソニド
；デソキシメタゾン；デキサメタゾンジプロピオネート；ジクロフェナックカリ
ウム；ジクロフェナックナトリウム；ジフロラゾンジアセテート；ジフルミドン
ナトリウム；ジフルニザール；ジフルプレドネート；ジフタロン；ジメチルスル
ホキシド；ドロシノニド；エンドリゾン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム
；エピリゾール；エトドラック；エトフェナメート；フェルビナック；フェナモ
ール；フェンブフェン；フェンクロフェナック；フェンクロラック；フェンドザ
ル；フェンピパロン；フェンチアザック；フラザロン；フルアザコート；フルフ
ェナミン酸；フルミゾール；フルニソリドアセテート；フルニキシン；フルニキ
シンメグルミン；フルオコルチンブチル；フルオロメトロンアセテート；フルク
アゾン；フルビプロフェン；フルエトフェン；フルチカゾンプロピオネート；フ
ラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；ハロベタゾールプロピオネート；
ハロプレドンアセテート；イブフェナック；イブプロフェン；イブプロフェンア
ルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；イン
ドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；
イソフルプレドンアセテート；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン
；ロフェミゾール塩酸塩；ローノキシカム；ロテプレドノールエタボネート；メ
クロフェナメートナトリウム；メクロフェナミン酸；メクロリソンジブチレート
；メタフェナミン酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニソロンスレプ
タネート；モーニフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリ
ウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オ
ルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；パラニリン塩酸塩；ペ
ントサンポリスルフェートナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセレート
；ピルフェニドン；ピロキシカム；ピロキシカムシナメート；ピロキシカムオラ
ミン；ピルプロフェン；プレドナゼート；プリフェロン；プロドリン酸；プロク
アゾン；プロキサゾール；プロキサゾールシトレート；リメキソロン；ロマザリ
ット；サルコレックス；サルナセジン；サルサレート；サングイナリウムクロリ
ド；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダック；スプロフェン；
タルメタシン；タルニフルメート；タロサレート；テブフェロン；テニダップ；
テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チ
オピナック；チキソコルトールピルベート；トルメチン；トルメチンナトリウム
；トリクロニド；トリフルミデート；ジドメタシン；ゾメピラックナトリウム。
【００３０】 本発明のある実施態様において、後代を含むかまたは含まない造血前駆細胞お
よびリンパ網内性基質細胞を播種した多孔質固体マトリックスは、マトリックス
の孔を占有するゼラチン状薬剤で含浸されている。後代を含むかまたは含まない
造血前駆細胞および／またはリンパ網内性基質細胞は、ゼラチン状薬剤を含浸す
る（または浸潤させる）前、ほぼ同時および後に播種することができる。例えば
、細胞を薬剤と混合し、マトリックスにこの薬剤を含浸させるのと同時に播種す
ることができる。いくつかの実施態様において、細胞を、薬剤を適用する前に多
孔質固体マトリックス上に播種する。ある実施態様において、リンパ網内性基質
細胞を、同様の方法において播種する。当業者は、播種条件を容易に決定するこ
とができる。好ましくは、リンパ網内性基質細胞を、造血前駆細胞の前および前
述の薬剤での含浸の前に播種する。
【００３１】 ゲル状薬剤での「含浸」は、特に、マトリックス内に細胞を含有させるかまた
はマトリックス上への細胞付着を維持および／または増強させるのを補助する役
割を有し得る。「ゲル状」薬剤は、最初は流体状態に維持され得（即ちゲル化可
能）、これをマトリックスに塗布した後に、マトリックス中でその場でゲル化す
ることができるものであり得る。このようなゼラチン化は、薬剤の温度の変化、
薬剤のエネルギー源（例えば光）での照射等を含む多くの種々の方法により生じ
る。「ゼラチン状」薬剤はまた、成長培地の栄養素をマトリックス中の細胞に到
達させるこの能力を特徴とする。例示的な「ゼラチン状」薬剤は、セルロース系
多糖類（例えばセルロース、ヘミセルロース、メチルセルロース等）、寒天、ア
ガロース、アルブミン、藻類のムチン、ムチン、ムチン質、コラーゲン、グリコ
サミノグリカンおよびプロテオグリカン（これらの硫酸化された形態を含む）を
含む。ある実施態様において、ゼラチン状薬剤は、マトリックスを完全に含浸し
得、いくつかの実施態様において部分的に、および他の実施態様において最小に
、マトリックスの外面のすべてまたはいくつかの被覆としてのみ作用する。ゼラ
チン状薬剤を用いる重要な実施態様において、「ゼラチン状」薬剤はメチルセル
ロースであり、含浸は完全である。
【００３２】 本発明において、造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞を、外因性成長剤
の不存在下で、前述の多孔質固体マトリックスの１つにおいて同時培養して、リ
ンパ様組織起源（リンパ様組織特異的）細胞を生成する。本明細書中で用いる「
リンパ様組織起源」（リンパ様組織特異的）細胞は、本発明においてインビボま
たはインビトロで生成し得、骨髄、胸腺、リンパ節、脾臓および粘膜関連リンパ
様組織（呼吸、食事性および尿生殖器管を配列させる未封入組織）を含む器官お
よび組織からインビボで天然的に生じる細胞と実質的に同様である（例えば特性
および機能において）細胞をいう。
【００３３】 本明細書中で用いる「造血前駆細胞」は、自己新生し、一層成熟した血液細胞
（また本明細書においては「後代」という）に分化する能力を有する未成熟細胞
をいい、これには、顆粒球（例えば前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤
血球（例えば網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば巨核芽球、巨核球を生成す
る血小板、血小板）および単球（例えば単球、マクロファージ）が含まれる。業
界においては、このような細胞はＣＤ３４＋細胞を含み得るかまたは含み得ない
ことが知られている。ＣＤ３４＋細胞は、以下に記載する「血液生成物」中に存
在する未成熟細胞であり、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現し、前記に定義した
「前駆細胞」特性を含む細胞のサブ集団を含むと考えられる。造血前駆細胞は、
多能性幹細胞、多能性前駆細胞（例えばリンパ様幹細胞）および／または特定の
造血リネージに方向づけられた前駆細胞を含むことは、業界において十分知られ
ている。特定の造血リネージに方向づけられた前駆細胞は、Ｔ細胞リネージ、Ｂ
細胞リネージ、樹状細胞リネージ、ランゲルハンス細胞リネージおよび／または
リンパ様組織特異的マクロファージ細胞リネージのものとすることができる。
【００３４】 造血前駆細胞は、血液生成物から得ることができる。本発明において用いられ
る「血液生成物」は、造血起源の細胞を含む体または体の器官から得られた生成
物を定義する。このようなソースは、未分別骨髄、臍帯血、末梢血液、肝臓、胸
腺、リンパおよび脾臓を含む。当業者には、前述の粗製のおよび未分別の血液生
成物のすべてが、多くの方法で「造血前駆細胞」特性を有する細胞に富み得るこ
とは、明らかである。例えば、血液生成物は、一層分化された後代から除去され
得る。一層成熟した分化した細胞は、これらが発現する細胞表面を通して選択さ
れ得る。さらに、血液生成物は、ＣＤ３４＋細胞を選択して分別することができ
る。前に述べた通り、ＣＤ３４＋細胞は、業界において、自己再生および多能性
が可能な細胞のサブ集団を含むと考えられる。このような選択は、例えば、市場
で入手できる磁性抗ＣＤ３４ビーズ(Dynal, Lake Success, NY)を用いて達成す
ることができる。未分別血液生成物は、提供者から直接得るかまたは低温保存貯
蔵から回収することができる。
【００３５】 本発明の方法により造血前駆細胞と同時培養される細胞は、リンパ網内性基質
細胞である。本明細書中で用いる「リンパ網内性基質細胞」は、リンパ球または
リンパ球前駆体または前駆体ではないリンパ様組織中に存在するすべての細胞型
、例えば上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、樹状細胞、脾細胞およびマクロファー
ジを含むが、これらには限定されない。リンパ網内性基質細胞はまた、リンパ網
内性基質細胞、例えば線維芽細胞として通常は機能しない細胞を含み、これは、
遺伝子的に変化して、細胞表面上にこの後代を含み、造血前駆細胞の維持、成長
および／または分化に必要な因子を分泌または発現した。リンパ網内性基質細胞
は、リンパ様組織の一片の分解に由来する（以下の討議および例を参照）。本発
明において、このような細胞は、後代を含めて、造血前駆細胞のインビトロでの
維持、成長および／または分化を支持することができる。「リンパ様組織」によ
り、骨髄、末梢血液（動態化された末梢血液を含む）、臍帯血、胎盤血、胎児肝
臓、胚細胞（胚幹細胞を含む）、大動脈−生殖腺−中腎由来細胞およびリンパ様
柔軟組織を含むことを意味する。本明細書中で用いる「リンパ様柔軟組織」は、
胸腺、脾臓、肝臓、リンパ節、皮膚、扁桃、アデノイドおよびパイエル板並びに
これらの混合物を含むが、これらには限定されない。
【００３６】 リンパ網内性基質細胞は、後代を含めて、造血前駆細胞の維持、成長および／
または分化のための完全なリンパ様組織において支持する微細環境を提供する。
微細環境は、リンパ網内性基質を含む種々の細胞の種類により発現された可溶性
のおよび細胞表面因子を含む。一般的に、リンパ網内性基質細胞が提供する支持
は、接触依存性および非接触依存性の両方として特徴付けられ得る。 リンパ網内性基質細胞は、造血前駆細胞に対して同種異形、同系または異種発
生性であることができる。リンパ網内性基質細胞は、器官／組織が、これが造血
前駆細胞の維持、成長および／または分化を支持することができる段階（即ち成
熟段階）に発育した後のいずれの時点においてもヒトまたは非ヒト対象のリンパ
様組織から得ることができる。段階は、器官／組織間および対象間で変化する。
霊長類において、例えば、胸腺発育の成熟段階は、第２の３ヵ月の間に達成され
る。発育のこの段階において、胸腺は、サイムリン(thymulin)、α１およびβ４ −サイモシンおよびサイモポエチン等のペプチドホルモン並びにＴ細胞分化のた
めの適切な微細環境を提供するのに必要な他の因子を生成することができる。異
なる器官／組織および異なる対象の間の異なる成熟段階は、業界において十分知
られている。
【００３７】 リンパ網内性基質細胞が由来するリンパ様組織は、通常リネージ委任造血前駆
細胞が保証するのを決定し、分化した後代のリネージ特異性を生じる。ある実施
態様において、リンパ網内性基質細胞は、胸腺基質細胞であり、多能性前駆細胞
および／または方向づけられた前駆細胞は、Ｔ細胞リネージに方向づけられる。
他の実施態様において、リンパ網内性基質細胞は、脾臓基質細胞であり得、多能
性前駆細胞および／または方向づけられた前駆細胞は、Ｂ細胞リネージに方向づ
けられる。また、驚くべきことに、本発明において、分化した後代の最高の収量
は、ヒト造血前駆細胞が、異種発生性（非ヒト）リンパ網内性基質細胞の存在下
で培養した際に生じることが見出された。好ましくは、異種発生性基質細胞は、
マウス起源である。
【００３８】 予期されないことに、在来の方法と比較した際に、少ない量の非リンパ様特異
性細胞（即ち髄性単球細胞）が、前述の同時培養から得られることが見出された
。言いかえると、一層少ない汚染細胞種類（非リンパ様）を有する細胞の一層同
質な分化が、セルフォーム上で本発明の培養から観察され、一層成熟したＴ後代
の分化を促進する一方未成熟後代（ＣＤ３４＋細胞）の保存を可能にする。 リンパ網内性基質細胞を遺伝子的に変化させ得る種々の他の実施態様を提供す
る。リンパ網内性基質細胞は、例えば前述の造血成長因子の１つをコードする外
因性ＤＮＡでトランスフェクトされ得る（前述の線維芽細胞の討議を参照）。
【００３９】 前に述べたように、リンパ網内性基質細胞は、細胞懸濁液を生成する一片のリ
ンパ様組織の分解から由来する。好ましくは、単一の細胞懸濁液が生じる。これ
らのリンパ網内性基質細胞懸濁液は、直接用いるかまたは、組織培養技術におい
て標準的な手順により非有糸***とすることができる。このような方法の例には
、リンパ網内性基質細胞のγ線源での照射または、細胞を有糸***的に不活性に
するのに十分な時間の量にわたり細胞をマイトマイシンＣと共にインキュベート
することである。有糸***的不活性化は、リンパ網内性基質細胞がヒト起源であ
る際に好ましい（懸濁液中に存在し得る前駆細胞を除去するために）。次に、リ
ンパ網内性基質細胞を、本発明の三次元マトリックス中に播種し、多孔質固体マ
トリックスの表面に付着させることができる。あるいはまた、リンパ網内性基質
細胞は、後の使用または貯蔵および離間した位置への輸送のために、例えばキッ
トの販売に関連して用いるために、低温保存することができることに注意するべ
きである。インビトロで培養された細胞の低温保存は、業界において十分確立さ
れている。細胞試料の単離（および／または有糸***的不活性化）に続いて、細
胞を、先ず低温保存培地中に懸濁し、次に細胞懸濁液を次第に凍結することによ
り、低温保存することができる。凍結細胞は、代表的には、液体窒素中で、また
は血清および低温保存剤、例えばジメチルスルホキシドを含む培地中で、同等の
温度において貯蔵する。
【００４０】 造血前駆細胞（およびこの後代）とリンパ網内性基質細胞との同時培養は、好
ましくは、造血前駆細胞から由来するリンパ様起源細胞の数の百分率の増加を生
じるのに十分な条件下で生じる。用いられる条件は、業界において知られている
条件の組合せである（例えば温度、ＣＯ２およびＯ２含量、栄養素培地、時間の
長さ等）。細胞の数を増加させるのに十分な時間は、当業者により容易に決定さ
れ得る時間であり、播種する細胞の最初の数に依存して変化し得る。最初に多孔
質固体マトリックス中に導入（およびその後播種）される造血前駆細胞およびリ
ンパ網内性基質細胞の量は、実験の必要性に依存して変化し得る。理想的な量は
、所要に応じて当業者により容易に決定され得る。好ましくは、リンパ網内性基
質細胞は、マトリックス上に融合性層を形成する。造血前駆細胞を、種々の数で
加えることができる。例として、ある時間にわたる培地の脱色を、融合性の指標
として用いることができる。あるいはまた、およびさらに正確に、種々の数の造
血前駆細胞または種々の容量の血液生成物を、同一の条件下で培養することがで
き、細胞を収穫し、所定の時間間隔で計数し、これにより「対照曲線」を得るこ
とができる。これらの「対照曲線」を用いて、その後の機会における細胞の数を
見積もることができる（例のセクション参照）。
【００４１】 コロニー形成ポテンシャルを決定する条件を、同様に決定する。コロニー形成
ポテンシャルは、細胞が後代を形成する能力である。このためのアッセイは、当
業者に十分知られており、細胞を半固体マトリックス中に播種し、これらを成長
因子で処理し、コロニーの数を計数することを含む。 本発明の好ましい実施態様において、造血前駆細胞を収穫することができる。
造血前駆細胞の「収穫」は、細胞のマトリックスからの除去または分離として定
義される。これは、多くの方法、例えば酵素的および非酵素的、遠心分離、電気
的または大きさにより、あるいは、細胞をインキュベートする培地を用いて細胞
を洗浄することによる本発明において好ましい方法を用いて達成することができ
る。細胞を、さらに採集、分離、およびさらに分化した後代の尚大きい集団を発
生して拡張させることができる。
【００４２】 前述のように、造血前駆細胞およびその後代を、遺伝子的に変化させることが
できる。造血前駆細胞の遺伝子的変化は、外因性遺伝子物質を加えることにより
発生する細胞遺伝子物質の一時的かつ安定な変化を含む。遺伝子的変化の例は、
すべての遺伝子療法手順、例えば機能的遺伝子を導入して突然変異または非発現
遺伝子を置換すること、優性陰性遺伝子生成物をコードするベクターの導入、リ
ボザイムを発現するように工作されたベクターの導入および治療遺伝子生成物を
コードする遺伝子の導入を含む。天然の遺伝子的変化、例えば薬剤を何も導入し
ないＴ細胞受容体遺伝子の自発的再配列は、この概念に含まれない。外因性遺伝
子物質は、造血前駆細胞中に導入される天然または合成の核酸またはオリゴヌク
レオチドを含む。外因性遺伝子物質は、細胞中に天然に存在するもののコピーで
あり得るか、またはこれは、細胞中に天然に見出され得ない。これは、代表的に
は、ベクター構成物中のプロモーターの作動可能な（operable）制御の下で置換
される天然に存在する遺伝子の少なくとも一部分である。 本発明は、造血前駆細胞が前述のように固体多孔質マトリックス上またはこの
内部にある一方で、遺伝子的変化が発生する場合には、造血前駆細胞を、一層効
率的に遺伝子的に変化させることができるという予測されない発見を伴う。
【００４３】 核酸を細胞中に導入するために、種々の技術を用いることができる。このよう
な技術は、核酸−ＣａＰＯ４沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと関連す
る核酸のトランスフェクション、関連する核酸を含むレトロウィルスでのトラン
スフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション等を含む。ある使用につ
いて、核酸を特定の細胞に標的するのが好ましい。このような例において、本発
明の核酸を細胞中に送達するのに用いられるビヒクル（例えばレトロウィルスま
たは他のウィルス；リポソーム）は、標的分子がこれに付着していることができ
る。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体等の分子または標的
細胞上の受容体に対するリガンドは、核酸送達ビヒクルに結合するかまたはこの
内部に含有されることができる。例えば、リポソームを用いて、本発明の核酸を
送達する場合において、細胞内取り込みに関連する表面膜に結合するタンパク質
を、標的化のため、および／または取り込みを促進するために、リポソーム配合
物中に導入することができる。このようなタンパク質は、特定の細胞の種類につ
いて屈性のタンパク質またはこのフラグメント、サイクル化において内面化を受
けるタンパク質、細胞内局所化を標的し、細胞内半減期を増強するタンパク質を
含む。また、当業者に知られているように、重合体送達系を好首尾に用いて、核
酸を細胞中に送達した。このような系は、さらに核酸の経口送達を可能にする。
【００４４】 本発明において、外因性遺伝子物質を造血細胞中に導入する好ましい方法は、
複製欠乏レトロウィルスを用いてマトリックス上でその場で細胞を形質導入する
ことによる。複製欠乏レトロウィルスは、すべてのビリオンタンパク質の合成に
向けることができるが、感染性粒子を作成することはできない。従って、これら
の遺伝子的に変化したレトロウィルスベクターは、培養した細胞における遺伝子
の高効率形質導入のための一般的有用性および本発明の方法において用いるため
の特別の有用性を有する。レトロウィルスは、遺伝子的物質を細胞中に移動させ
るために、広範囲に用いられた。複製欠乏レトロウィルスを生成するための標準
的なプロトコル（外因性物質のプラスミド中への導入、包装細胞系のプラスミド
でのトランスフェクション、包装細胞系による組換えレトロウィルスの生成、組
織培養培地からのウィルス粒子の採集および標的細胞のウィルス粒子での感染の
ステップを含む）は、業界において提供されている。
【００４５】 レトロウィルスを用いることの主な利点は、ウィルスが、治療剤をコードする
遺伝子の単一のコピーを、ホスト細胞ゲノム中に効率的に挿入し、これにより外
因性遺伝子物質が、これが分割する際に細胞の後代上に通過することを可能にす
る。さらに、ＬＴＲ領域における遺伝子プロモーター配列は、種々の細胞の種類
において挿入されたコード配列の発現を増強する。レトロウィルス発現ベクター
を用いることの主要な欠点は、（１）挿入突然変異生成、即ち治療遺伝子の標的
細胞ゲノムにおける所望でない位置中への挿入（これは、例えば調節されていな
い細胞成長に至る）、（２）ベクターにより運搬された治療遺伝子が、標的ゲノ
ム中に統合されるための標的細胞増殖の必要性である。これらの明らかな限定に
かかわらず、レトロウィルスを介しての治療剤の治療的に有効な量の送達は、形
質導入の効率が高く、および／または形質導入に有用な標的細胞の数が大きい場
合に、能率的であり得る。
【００４６】 造血細胞の形質転換のための発現ベクターとして有用な尚他のウィルス候補は
、アデノウィルス、二重らせんＤＮＡウィルスである。レトロウィルスと同様に
、アデノウィルスゲノムは、即ちウィルス自体の生成を制御する遺伝情報を除去
することにより、遺伝子形質導入のための発現ベクターとして用いるのに適合可
能である。アデノウィルスは、通常染色体外様式で機能するため、組換えアデノ
ウィルスは、挿入突然変異生成の理論的問題を有しない。一方、標的造血細胞の
アデノウィルス形質転換は、安定な形質導入を生じ得ない。しかし、一層最近に
は、あるアデノウィルス配列が、染色体内統合特異性を担体配列に付与し、従っ
て外因性遺伝子物質の安定な形質導入に至ることが報告されている。
【００４７】 従って、当業者に明らかなように、種々の適切なベクターが、造血細胞中に外
因性遺伝子物質を移動させるのに有用である。遺伝子置換療法に影響されやすい
特定の条件のための治療剤を送達する適切なベクターの選択および細胞中への選
択された発現ベクターの挿入のための条件の最適化は、過度の実験を必要とせず
に当業者の範囲内である。プロモーターは、転写を開始するのに必要な特定のヌ
クレオチド配列を特徴的に有する。随意に、外因性遺伝子物質はさらに、所望の
遺伝子転写活性を得るために必要な追加の配列（即ちエンハンサー）を含む。こ
の討議のために、「エンハンサー」は、単に、コード配列（シスにおいて）と隣
接して作動してプロモーターにより支配される基底の転写レベルを変化させるす
べての翻訳されていないＤＮＡ配列である。好ましくは、外因性遺伝子物質は、
プロモーターからすぐ下流の造血細胞ゲノム中に導入されて、プロモーターおよ
びコード配列は、作動可能に結合されて、コード配列の転写を可能にする。好ま
しいレトロウィルス発現ベクターは、挿入された外因性遺伝子の転写を制御する
外因性プロモーター要素を含む。このような外因性プロモーターは、構成的およ
び誘発性プロモーターを共に含む。
【００４８】 天然に存在する構成プロモーターは、本質的な細胞機能の発現を制御する。こ
の結果、構成プロモーターの制御下の遺伝子は、細胞成長のすべての条件下で発
現する。例示的な構成プロモーターは、若干の構成または「ハウスキーピング」
機能をコードする以下の遺伝子のためのプロモーターを含む：ヒポキサンチンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロフォレートレダクター
ゼ（ＤＨＦＲ）(Scharfmann等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4626-4630 (19
91))、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピル
ベートキナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター(Lai等、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10006-10010 (1989))、および当業者に知られ
ている他の構成プロモーター。さらに、多くのウィルスプロモーターは、真核細
胞において、構成的に機能する。これらは、次のものを含む：ＳＶ４０の初期お
よび後期プロモーター；モロネー白血病ウィルスの長末端繰り返し（ＬＴＲＳ）
および他のレトロウィルス；並びに特に、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナ
ーゼプロモーター。従って、上記で言及した構成プロモーターのすべてを用いて
、異種の遺伝子挿入の転写を制御することができる。
【００４９】 誘発性プロモーターの制御下の遺伝子は、誘発剤の存在下で、唯一または一層
大きい程度に発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下での
転写は、若干の金属イオンの存在下で大いに増大する）。誘発性プロモーターに
は、これらの誘発性因子が結合する際に転写を刺激する応答性要素（ＲＥ）が含
まれる。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸およびサイクリ
ックＡＭＰのためのＲＥがある。特定のＲＥを含むプロモーターを選択して、誘
発性応答を得ることができ、および若干の場合において、ＲＥ自体を、異なるプ
ロモーターに付着させ、これにより組換え遺伝子に対する誘発性を付与すること
ができる。従って、適切なプロモーター（構成的対誘発性；強い対弱い）を選択
することにより、遺伝子的に変更された造血細胞において、治療剤の発現の存在
およびレベルの両方を制御することができる。特定の治療剤の治療的に有効な用
量の送達のためのこれらの因子の選択および最適化は、前記に開示した因子およ
び患者の臨床的プロフィルを考慮して、過度の実験を伴わずに当業者の範囲内で
あると見なされる。
【００５０】 少なくとも１つのプロモーターおよび治療剤をコードする少なくとも１つの異
種の核酸に加えて、発現ベクターは、好ましくは、選択遺伝子、例えばネオマイ
シン耐性遺伝子を、発現ベクターと共にトランスフェクトされたかまたは形質導
入された造血細胞の選択を促進するために、含む。あるいはまた、造血細胞は、
２つまたは３つ以上の発現ベクターと共にトランスフェクトされ、少なくとも１
つのベクターは、治療剤（単数または複数）をコードする遺伝子（単数または複
数）を含み、他のベクターは、選択遺伝子を含む。適切なプロモーター、エンハ
ンサー、選択遺伝子および／または信号配列の選択（以下に記載する）は、過度
の実験を伴わずに、当業者の範囲内であると見なされる。
【００５１】 単離した造血細胞の特定の遺伝子生成物を発現するための特定の発現ベクター
の選択および最適化は、好ましくは１つまたは２つ以上の適切な対照領域（例え
ばプロモーター、挿入配列）を有する遺伝子を得；遺伝子が挿入されるベクター
を含むベクター構成物を調製し；ベクター構成物でインビトロで培養した造血細
胞をトランスフェクトするかまたは形質導入し；および遺伝子生成物が培養した
細胞中に存在するか否かを決定することにより、達成される。 表１．ＲＡＣ：１９９０〜１９９４により承認されたヒト遺伝子療法プロトコル
【表１】
【００５２】 前記（表１）は、本発明の方法により送達され得る遺伝子の例のみを示す。こ
のような遺伝子のための適切なプロモーター、エンハンサー、ベクター等は、前
述の試験に関連する文献中に刊行されている。一般的に、有用な遺伝子は、機能
を置換するかまたは補完し、この遺伝子には、ＡＤＡ欠乏症を治療するために臨
床試験において用いられたアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）等の欠失酵素をコ
ードする遺伝子並びにインシュリンおよび凝固因子ＶＩＩＩ等の補助因子が含ま
れる。調節に影響する遺伝子はまた、単独でまたは特定の機能を補完または置換
する遺伝子と組合せて投与することができる。例えば、特定のタンパク質コード
遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子を、投与することができ
る。本発明は、ウィルス抗原、腫瘍抗原、サイトカイン（例えば腫瘍壊死因子）
およびサイトカインのインデューサー（例えばエンドトキシン）をコードする遺
伝子を含む、免疫応答を刺激する遺伝子を送達するのに、特に有用である。
【００５３】 以下に一層詳細に記載する培養条件を用いて、本発明において造血前駆細胞を
保存し、造血前駆細胞数および／またはコロニー形成ユニットポテンシャルの拡
張を刺激することが可能である。拡張した後に、例えば細胞を、体に戻して、患
者の造血前駆細胞集団を補完、補充等することができる。これは、例えば、個体
が化学療法を受けた後に適切である。造血前駆細胞数を減少させる若干の遺伝条
件があり、本発明の方法を、これらの状態において同様に用いることができる。 また、本発明により生成した増大した数の造血前駆細胞を採取し、これを、細
胞維持、拡張および／または分化を促進し、細胞局所化に影響する造血成長剤で
刺激して、一層成熟した血液細胞をインビトロで得ることも可能である。血液細
胞のこのような拡張した集団を、前述のようにインビボで用いるか、または当業
者により認識されているように実験的に用いることができる。このような分化し
た細胞は、前記したもの、並びにＴ細胞、血漿細胞、赤血球、巨核芽球、好塩基
体、多形核球、単球、マクロファージ、好酸球および血小板を含む。
【００５４】 本発明の培養方法のすべてにおいて、他に提供するものを除いて、用いる培地
は、細胞を培養するのに一般的なものである。例には、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、イ
スコーブズ(Iscove's)等が含まれる。代表的には、これらの培地には、ヒトまた
は動物血漿または血清が補完されている。このような血漿または血清は、少量の
造血成長因子を含むことができる。しかし、本発明において用いる培地は、従来
技術において一般的に用いられているものとは別であることができる。特に、驚
くべきことに、造血前駆細胞は、外因性成長剤（血漿または血清中に含まれ得る
もの、以下で「血清」と呼ぶもの以外）を何も加える必要なく、基質細胞との培
養の環境を接種せずに、および基質細胞条件化培地を用いずに、長期間前記した
マトリックス上で培養することができることが見出された。本発明の前に、少な
くとも１種の前述の薬剤は、造血前駆細胞を培養するのに必要であると考えられ
ている。
【００５５】 本発明に関連して特定の関連がある成長剤は、造血成長因子である。造血成長
因子により、造血前駆細胞の生存、増殖または分化に影響する因子を意味する。
生存および増殖にのみ影響するが、分化を促進すると考えられていない成長剤に
は、インターロイキン３、６および１１、幹細胞因子およびＦＬＴ−３リガンド
が含まれる。分化を促進する造血成長因子には、コロニー刺激因子、例えばＧＭ
ＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＭＣＳＦ、Ｔｐｏ、Ｅｐｏ、オンコスタチンＭ、およびＩＬ
−３，６および１１以外のインターロイキンが含まれる。前述の因子は、当業者
に十分知られている。ほとんどは、市場で入手できる。これらは、組換え方法に
よる精製により得られるかまたは、合成的に誘導するかまたは合成することがで
きる。
【００５６】 「基質細胞条件化培地」は、前述のリンパ網内性基質細胞をインキュベートし
た培地をいう。インキュベーションは、基質細胞が培地中に因子を分泌するよう
にするのに十分な期間実施する。次に、このような「基質細胞条件化培地」を用
いて、これらの増殖および／または分化を促進する造血前駆細胞の培養を補完す
ることができる。 従って、細胞を、前述の薬剤を何も加えずに培養する際に、本明細書中では、
血清、通常の栄養培地または造血前駆細胞を含む未分別のまたは分別した血液生
成物単離内に存在し得るものを除いて、このような薬剤の添加をせずに細胞を培
養することを意味する。
【００５７】 本発明の他の観点において、造血前駆細胞のインビボでの維持、拡張および／
または分化方法を提供する。この方法は、対象中に、造血前駆細胞、造血前駆細
胞後代およびリンパ網内性基質細胞を播種した多孔質固体マトリックスを移植す
ることを含む。本発明のマトリックスに類似したマトリックスの移植は、業界に
おいて十分知られている(Stackpool, GJ,等、Combined Orthopaedic Research S
ocieties Meeting, Nov. 6-8, 1995, San Diego, CA, Abstract Book p. 45; Tu
mer, TM, 等、21st Annual Meeting of the Society for Biomaterials, March
18-22, San Francisco, CA, Abstract Book p 125)。このようなマトリックスは
生物適合性であり（即ち、免疫反応性なし、拒絶なし）、対象の多くの種々の組
織中に植付け、移植することができる。このような方法は、対象の多くの種々の
組織および／または異なる対象間における、インビボでの造血前駆細胞の維持、
拡張、分化および／または局所化の研究を含む、種々の方法で有用である。
【００５８】 本明細書において用いる対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒ
ツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯目である。ヒト造血前駆細胞およびヒト対
象は、特に重要な実施態様である。前記したように、本発明のマトリックスをこ
のようなインビボ移植研究に用いる際には、血管形成（血管新生）を促進し、お
よび／または炎症を防止／減少させる生物学的剤はまた、マトリックスの被覆に
用いることができる。好ましい生物学的剤は、前記した通りである。また、前記
したように、造血前駆細胞は、対象中に移植する前に、本発明に従って、多孔質
固体マトリックス上に予め播種され、インビトロで培養される。本発明において
、ある量の細胞は、多孔質固体マトリックス中にインビトロで導入され、リンパ
網内性基質細胞と、基質細胞条件化培地および血清以外の、造血細胞の維持、拡
張および／または分化を促進する外因的に加えられた造血成長因子を含まない環
境において同時培養される。次に、移植を実施する。若干の実施態様において、
基質細胞条件化培地および外因性造血成長因子を、移植前にインビトロ培養の間
に加えることができる。
【００５９】 本発明の１つの観点において、インビトロでＴ細胞の反応性／活性化を誘発す
る方法を提供する。Ｔ細胞の反応性／活性化の誘発は、造血前駆細胞およびリン
パ網内性基質細胞を、前述のマトリックスの１つにおいて、抗原提示細胞および
抗原の存在下で、抗原に対する特異性を有する造血前駆細胞からＴ細胞および／
またはＴ細胞前駆体の形成を誘発するのに十分な条件下で同時培養することを含
む。前述の条件は、過度の実験を伴わずに、当業者により容易に確立することが
できる（Sprent J, 等、J Immunother, 1998, 21(3):181-187; Berridge MJ, Cr
it Rev Immunol, 1997, 17(2):155-178; Owen MJ, 等、Curr Opin Immunol, 199
6, 8(2):191-198; Whitfield JF, 等、Mol Cell Biochem, 1979, 27(3):155-179
; Fauci AS, 等、Ann Intern Med, 1983, 99(1):61-75をも参照）。ＡＰＣの存
在におけるＴ細胞の抗原刺激は、増殖アッセイを用いて、または単にＩＬ−２生
成を測定することにより測定することができる抗原特異性応答を誘発する（以下
の討議を参照）。これらの細胞は、ＡＰＣの存在下で、適切な濃度（例えば０．
１〜１．０μＭテタヌス毒素）においてＴ細胞を抗原と共に培養することにより
検出することができる。抗原特異性Ｔ細胞が存在する場合には、これらは、自己
許容／アネルギーの下で、以下に記載するアッセイを用いて検出することができ
る。ＡＰＣの存在下でのＴ細胞の刺激は、同時刺激剤での同時刺激を含み得る。
同時刺激剤は、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、
ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２
を含む。同時刺激剤はまた、ＭＨＣクラスＩＩ分子および抗ＣＤ３抗体を、同時
刺激剤（単数または複数）で同時刺激する場合には、ＡＰＣの代わりに用いるこ
とができる。
【００６０】 １種または２種以上の抗原を、同時に、前述の培養系においてインキュベート
するために用いることができる。好ましくは、リンパ網内性基質細胞は、拡張さ
れる造血前駆細胞がヒトのものである際には、胸腺基質細胞であり、マウス起源
である。従って、多数の抗原特異性成熟Ｔ細胞および未成熟Ｔ細胞を、在来の技
術の方法を用いて以前には決して実現されなかった短い時間で得ることができる
。従って、本発明は、インビトロ感作Ｔ細胞での個体の予備暴露予防接種、腫瘍
標的Ｔ細胞免疫療法を用いた癌患者の治療、骨髄移植患者（日和見感染、例えば
ＣＭＶが問題であり、標的されたＴ細胞、例えばＣＭＶ標的細胞毒性リンパ球で
の治療を受けやすい患者）の治療、Ｔ細胞アジュバント療法による従来の予防接
種効率の増強、発現または再発現病原体の発生の治療等を含む広範囲の用途にお
いて有用になる。抗原提示細胞は、樹状細胞、単球／マクロファージ、ランゲル
ハンス細胞、クッペル細胞、ミクログリア、肺胞マクロファージおよびＢ細胞を
含み、これらの単離方法は、業界において十分知られている。抗原提示細胞はま
た、インビトロで造血前駆細胞から由来することができる。
【００６１】 免疫学的許容度は、他の方法で対象中に非自己抗原の導入に応答して発生する
、例えばドナー抗原に対する免疫応答を備える対象の能力の阻害をいう。許容度
は、体液性、細胞性または体液性と細胞性応答との両方を含み得る。胸腺培養の
結果、自己ＭＨＣであるが自己抗原のみではない意味での無数の外来の抗原に応
答することができるＴ細胞が発生する。これは、主に、自己制限の主題に基づく
計画された細胞の死からの適切な胸腺細胞の系統的な救助およびこれらの細胞を
末梢中に放出して自己許容性Ｔ細胞として作用することにより、達成される。
【００６２】 自己許容性は、ドナー（Ａ）から、他の個体（Ｂ）からの胸腺基質の存在下で
誘導されたＣＤ３４＋Ｔ前駆体を同時培養することを含む、業界において知られ
ている条件下でインビトロで確立することができる。要するに、胸腺基質は、コ
ラゲナーゼ（２０μｇ／ｍｌ、Sigma Chemical Co.）を用いる単一の細胞懸濁中
に消化される新たに単離された胸腺組織から確立される。胸腺基質細胞は、２ｍ
ｌのＲ１０（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）の容量でウェルあたり４×１０６個の生
存可能な細胞の濃度で２４ウェルプレートに細胞懸濁液を置くことにより確立さ
れる。培養を、５％ ＣＯ２を有する３７℃の標準湿潤化組織培養インキュベー
ター中でインキュベートする。１〜２日後、非付着性細胞を、Ｒ１０で３回洗浄
することにより除去する。基質は、融合性になるのにさらに７〜１０日を必要と
する。基質を、１週間あたり少なくとも２回交換するＲ１０中に維持する。培養
において７〜１０日後、Ｒ１０中のＣＤ３４＋細胞を、ウェルあたり１〜３×１
０５個の細胞の濃度で基質に加える。培養を、これらの培養に外因性サイトカイ
ンを加えずに、Ｒ１０での部分的培地交換を用いて隔週で供給する。１４〜２１
日後、非付着性細胞を、培養から除去する。残りの付着した細胞は、インビトロ
で発育した自己許容性Ｔ細胞である。
【００６３】 許容度がインビトロで確立されたか否かを決定する方法はまた、当業者に知ら
れており、次のものへの増殖応答の測定を含む：自己（Ａ）、並びに胸腺ドナー
（Ｂ）に対して、および第三者（Ｃ）、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）。要する
に、Ａ、ＢおよびＣからのＰＢＭＣは、フィコール(Ficoll)勾配遠心分離により
調製される。 １×１０５個のレスポンダー細胞（Ａからのインビトロ発生Ｔ細胞）を、複数
の複製において９６ウェルプレート中に置いた。刺激細胞（Ａ、ＢおよびＣから
のＰＢＭＣ）を照射し（３０００Ｒａｄｓ）、１２の複製においてウェルあたり
１×１０５個の細胞で加えた。Ｃｏｎ−Ａ（５μｇ／ｍｌ）を、正の対照として
用いる。４日後、１μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに加え、プレートを、１
８〜２４時間後に収穫する。許容度が確立された場合には、インビトロで発生し
たＴ細胞は、未関連第三者（Ｃ）と混合した際には、応答し、増殖するが、自己
（Ａ）または胸腺ドナー（Ｂ）からのＰＢＭＣと混合した際には増殖しない。
【００６４】 本発明の他の観点において、インビトロでＴ細胞アネルギーを誘発する方法を
提供する。Ｔ細胞アネルギーの誘発は、造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細
胞を、前述のマトリックスの１つにおいて、抗原の存在下で、Ｔ細胞および／ま
たはＴ細胞前駆体の形成を誘発し、形成したＴ細胞および／またはＴ細胞前駆体
の活性化を阻害するのに十分な条件下で同時培養することを含む。
【００６５】 アネルギーは、Ｔ細胞の非応答性状態として定義される（即ち、これらは、再
刺激に対してＩＬ−２を生成しないかまたは再刺激した際に増殖しない）(Zamoy
ska R, Curr Opin Immunol, 1998, 10(1):82-87; Van Parijs L.等、Science, 1
998, 280(5361):243-248; Schwartz RH, Curr Opin Immunol, 1997, 9(3):351-3
57; Immunol Rev, 1993, 133:151-76)。しかし、アネルギーは、不可逆的であり
得る。アネルギーは、同時刺激の不存在下で抗原特異性Ｔ細胞刺激により誘発さ
れ得る（１つの信号対２つの信号の仮説）。あるいはまた、同時刺激の存在にお
いても、低い親和性のペプチドまたは極めて高い濃度のペプチドは、アネルギー
を誘発し得る。アネルギーは、抗原提示細胞（Ｂ細胞、マクロファージまたは樹
状細胞）の不存在下でＴ細胞を培養することにより、インビトロで誘発すること
ができる。これらのＴ細胞を、次に、抗原、例えばテタヌス毒素（例えば０．１
〜１．０μＭ）に暴露する。Ｔ細胞のアリコートを用いて、抗原を提示すること
ができる。これは、同時刺激を伴わずに抗原提示を構成し、アネルギーを誘発す
る(Nelson A, 等、In Immuno, 1998, 10(9):1335-46)。あるいはまた、Ｔ細胞を
、非応答性の状態を誘発する極めて高い（１０〜１００μＭ）または極めて低い
（０．０１〜０．０５μＭ）テタヌス毒素の状況においてＡＰＣと同時培養する
ことができる。
【００６６】 アネルギーは、前述のＴ細胞を採取し、これを抗原（例えば０．１〜１．０μ
Ｍのテタヌス毒素）で、ＡＰＣの存在下で再刺激することにより、測定すること
ができる。細胞がアネルギー性である場合には、細胞は、ＡＰＣの状況において
適切な濃度で抗原に応答しない。アネルギーは、このように、３〜５日にわたり
細胞を培養し、増殖またはこの欠乏を以下のようにして測定することにより、測
定される。要するに、ＡＰＣを、照射（３０００Ｒａｄｓ）の後に９６ウェルの
プレート中に複数の複製において置く。これらの細胞を、抗原（例えば０．１〜
１．０μＭ）で２時間パルス標識し、次にＴ細胞を、１２の複製においてウェル
あたり１×１０５／細胞で加える。Ｃｏｎ−Ａ（５μｇ／ｍｌ）を正の対照とし
て用いる。４日後、１μＣｉの３Ｈ−チミジンを、各ウェルに加え、細胞を１８
〜２４時間後に収穫する。細胞がアネルギー性である場合には、これは、抗原刺
激に応答して増殖しない。あるいはまた、ＩＬ−２の生成は、前述のように、培
養の上清液において測定することができる。上清液を毎日採集し、ＩＬ−２の生
成を、市場的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定する。追加の方法は、ヒト形態
のこれらの因子(Becton Dickinson)に特異的な抗体を用いて、サイトカインＩＬ
−２、γＩＦＮおよびＴＮＦαの細胞内発現に特異的な染色に基づくフローサイ
トメトリーを含む。さらに、これらの因子のためのｍＲＮＡの半定量的なＲＴ−
ＰＣＲもまた、用いることができる。
【００６７】 本発明の他の観点において、造血細胞の発育に影響することが疑われる剤を同
定する方法を提供する。この方法は、ある量の造血前駆細胞およびある量のリン
パ網内性基質細胞を、本発明の多孔質固体マトリックス中に導入し、試験同時培
養において、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細胞を、造血細胞の発育
に影響することが疑われる少なくとも１種の候補薬剤の存在下で同時培養するこ
とを含む。「造血細胞の発育」により、造血前駆細胞の維持、拡張、分化および
／または細胞死断片化（計画された細胞死）を含むことを意味する。「維持」は
、この多能性を維持する造血前駆細胞の能力を含む。「拡張」は、造血前駆細胞
の***および成長の能力を含み、「分化」は、特定の細胞リネージへの造血前駆
細胞の分化能力を含む。「細胞死」はまた、計画された細胞死（断片化）を含む
。従って、造血細胞の発育に「影響する」により、造血前駆細胞の維持、拡張、
分化および／または細胞死に対する影響を含むことを意味する。このような効果
（または影響）は、本質的に正または負／阻害性のいずれかであり得る。例えば
、正の影響は、前駆細胞の多能性の維持および／または多能性前駆細胞の数の増
加である。負の影響は、前駆細胞の分化および多能性の損失またはさらに前駆細
胞の死に至る。特定の細胞集団に対する負の影響はまた、異なる細胞集団に対し
て正の影響を有し得る。例えば、Ｂ細胞リネージに対する阻害影響は、例えばＴ
細胞リネージに対する正の影響に至り得る。造血細胞の発育に影響することが疑
われる剤を、リンパ網内性基質細胞中にトランスフェクトした核酸の形態で投与
し、および培地中に直接加えることができる。
【００６８】 少なくとも１種の候補薬剤が、試験同時培養において造血細胞の発育に影響す
るか否かを決定するために、試験同時培養において発生した造血細胞の表現型お
よび／または遺伝子型（並びに数）を、対照の同時培養において発生した造血細
胞の表現型および／または遺伝子型（並びに数）と比較する。対照の同時培養を
、試験同時培養の同一の条件（即ち、同一のマトリックス、同一の培養培地等に
おける同一の初期数および造血前駆細胞とリンパ網内性基質細胞との両方の型）
の下で実施するが、細胞造血細胞の発育に影響することが疑われる少なくとも１
種の候補薬剤を、対照同時培養から省略する。造血細胞の表現型および／または
遺伝子型を決定する方法は、業界において十分知られており、若干の例が、本出
願を通して見出される。
【００６９】 尚他の本発明の観点において、細胞培養から、造血細胞の発育に影響すること
が疑われる剤を単離する方法もまた提供する。この方法は、ある量の造血前駆細
胞およびある量のリンパ網内性基質細胞を、本発明の多孔質固体マトリックス中
に導入し、造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞を同時培養し、同時培養か
ら試験上清液（またはこのフラクション）を得ることを含む。次に、試験上清液
（またはこのフラクション）を、対照の上清液（またはこのフラクション）と比
較する。「比較」により、試験上清液中に存在し、同時培養の細胞から分泌され
る薬剤（造血細胞の発育に影響することが疑われる）のプロフィルを、対照の上
清液中に存在し、対照の培養または同時培養の細胞から分泌される薬剤の同様の
プロフィルと比較する。分泌された薬剤のこのようなプロフィルを得る方法は、
業界において十分知られており、二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動を含む。他の方
法もまた、種々の型のＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィーを含む。
【００７０】 「対照の培養または同時培養」は、本発明の同時培養系において達成された結
果に相当する（即ち近似する）結果を得るための、業界において知られている（
例えばJohnson等による米国特許第５，６７７，１３９号）平行する培養系にお
ける造血前駆細胞の培養を含み得る。例えば、ヒト造血前駆細胞とマウス胸腺か
らのリンパ網内性基質細胞との同時培養を含む本発明の試験同時培養は、Ｔ細胞
リネージに方向づけられたヒトリンパ様細胞の別個の（種々のサブ種の）集団を
生じる。次に、このような同時培養から得られた試験上清液を、Ｔ細胞リネージ
に方向づけられたヒトリンパ様細胞の集団を生じる従来技術の（前記したように
）平行な系におけるヒト造血前駆細胞の培養から得られた対照の上清液と比較す
る。対照の培養または同時培養の他の例は、本発明のマトリックスの試験同時培
養において用いられるものに対する異なる組織起源のリンパ網内性基質細胞との
造血前駆細胞の同時培養を含み得る。さらに、組織は、リンパ様起源であり得る
かまたはあり得ない。当業者は、このような培養または同時培養を容易に選択し
、確立することができる。造血細胞の発育に影響することが疑われる剤のプロフ
ィルが得られた後、次に、異なるかまたは対照の上清液から欠けていると考えら
れる造血細胞の発育に影響することが疑われる剤を含む試験上清液のサブフラク
ションを単離し、さらに特徴づけすることができる。例えば、試験上清液の２−
Ｄゲル電気泳動ブロットにおいて異なって移動すると考えられる候補の薬剤を、
精製し、タンパク質配列決定および質量分析法等の方法を用いてさらに特徴づけ
することができる。２−Ｄゲル電気泳動ブロット中に見られるが試験上清液のブ
ロットからは欠けている薬剤はまた、造血細胞の発育に影響することが疑われ、
さらに精製することができる。
【００７１】 本発明は、以下の例を参照して、さらに十分に理解される。しかし、これらの
例は、単に本発明の実施態様を例示することを意図するものであり、本発明の範
囲を限定するものと解釈するべきではない。
【００７２】例 実験手順 ヒトＣＤ３４＋細胞の単離 ５〜１０ｍｌの静脈臍帯血（ＵＣＢ）を、ヒト胚のシーゼレアン(Caeserean)
セクション放出の間に臍帯を切断する前に、ヘパリン化シリンジを用いて抽出し
た。臍帯を切断し、胎児を放出した後に、臍帯静脈を基部に締め、胎盤に対して
遠位に切断することにより、胎盤を除去した。胎盤を除去した直後に、臍帯静脈
を開放し、胎盤中に含まれる血液を、適切なヘパリン化容器中に排出した。加工
する前に、臍帯および胎盤の血液を混ぜ合わせた。抽出後に、臍帯／胎盤血液を
、洗浄培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌ
のストレプトマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミン）で洗浄して２：１に希釈した
。次に、試料（単数または複数）を、希釈した試料容積の半分に等しい容量のフ
ィコール−ハイパック（１．０７７ｇ／ｍｌ）で下に置き、これにより別個の試
料／フィコール界面を形成した。４００×ｇで４５分間遠心分離した後に、単核
細胞を含む界面を除去した。次に細胞を、培養培地中に再懸濁し、４００×ｇで
１０分間遠心分離することにより洗浄した。得られたペレットを、６ｍｌの塩化
アンモニウム溶菌緩衝液（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｍＭ ＫＨＣＯ３、
０．１Ｍ Ｎａ２ＥＤＴＡ）中に３分間再懸濁して、すべての残りの赤血球を溶
菌した。次に、懸濁液を、培地で希釈し、さらに２回洗浄した。最後の洗浄の後
、細胞を１〜２ｍｌの培地中に再懸濁し、生存細胞の数をトリパンブルー排除に
より決定した。 また、ヒトＣＤ３４＋前駆細胞を、１６〜２２週齢堕胎児から得られた分解し
たヒト胎児胸腺から調製した。分解手順については、下記のマウス胸腺基質を参
照。
【００７３】 表面抗原ＣＤ３４を発現する細胞を、ダイナル(Dynal)ＣＤ３４前駆細胞選択
システム(Dynal, Lake Success, N.Y.)またはミニマックス(MiniMACS)システム(
Miltenyl Biotec, Bergisisch Gladbach, Germany)を用いて単離した。ＵＣＢ（
または骨髄）から単離された単核細胞を、２．５×１０７細胞／ｍｌの濃度で単
離緩衝液（ＰＢＳ、２％熱不活性化胎児ウシ血清、１０ＩＵ／ｍｌペニシリン、
１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中に懸濁した。次に、懸濁液を、丸底管中
で懸濁液１ｍｌあたり４．０×１０７個のビーズの比率で磁性抗ヒトＣＤ３４ビ
ーズ（ダイナルＭ−４５０ ＣＤ３４）に加えた。（ダイナビーズＭ−４５０
ＣＤ３４は、ＣＤ３４に特異的なモノクローナル抗体に結合した超常磁性ビーズ
である。）混合物を、穏やかにかきまぜ、ダイナル試料ミキサーを用いて穏やか
に傾斜回転させながら４℃で４５分間インキュベートした。インキュベーション
の後に、ビーズ／細胞混合物を、大量の単離緩衝液中に再懸濁し、２分間磁性分
離装置中に置いて、細胞／ビーズ複合体を管の壁に蓄積させた。薬剤に尚暴露さ
せながら、磁性ビーズに結合していない細胞を含む懸濁液を、吸引した。細胞／
ビーズ複合体を、この方法でさらに３回洗浄し、ＣＤ３４陰性細胞を含む懸濁液
を同一の管中にプールした。次に、放出された細胞（ＣＤ３４−）を含有する管
を、磁性分離器上に配置して、すべての残留するビーズを除去し、この上清液を
、新たな円錐形管に移送した。ビーズに付着したＣＤ３４＋細胞をすべて、２０
００ｒｐｍで８分間遠心分離しながら、最少量の１０ｍｌの単離緩衝液で２回洗
浄した。次に、磁性ビーズに結合した細胞を、１００μｌの最小容積で、用いた
４×１０７個のビーズあたり１００μｌの単離緩衝液中に再懸濁した。次に、Ｃ
Ｄ３４陽性細胞を、等しい容量の抗イディオタイプ抗体（ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡ
Ｄ ＣＤ３４、ダイナル）を加え、かきまぜ、ダイナル試料ミキサーを用いて１
時間室温で穏やかに混合することにより、ビーズから脱着した。細胞を細胞／ビ
ーズ懸濁液から、単離緩衝液を加えることにより単離し、磁性分離装置中に２分
間管を置いた。ビーズが管壁に移動した後、ＣＤ３４陽性細胞を含む懸濁液を、
新たな管に移送した。ビーズを、同一の管中にプールした放出された細胞を含む
懸濁液でさらに３回洗浄した。次に、放出されたＣＤ３４＋細胞を含有する管を
、磁性分離器上に配置して、すべての残留ビーズを除去し、上清液を、新たな円
錐形の管に移送した。細胞を、２０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離して、
最少の１０ｍｌの分離緩衝液で２回洗浄した。
【００７４】 あるいはまた、ヒト骨髄を、制度上の再検討局ガイドラインに従って、および
インフォームドコンセントを施した後に、健康な成人の志願者から後方の腸骨稜
吸引により得た。１０〜１５ｍＬのヒト骨髄を、ヘパリン化した無菌のシリンジ
中に採集し、室温で移送し、６時間以内に使用した。骨髄を、５倍容量のＰＢＳ
で希釈し、フィコール−ハイパック(Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ)
のカラム上での密度勾配遠心分離により、単核細胞（ＭＮＣ）を分離した。この
ように得られたＭＮＣを、１０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、残りの赤血球を、Ａ
ＣＫ溶菌緩衝液(Bio Whittaker, Walkersville, MD)での溶菌により除去した。
【００７５】 ＣＤ３４＋集団内の前駆細胞の一層多くの未成熟表現型を選択するために、本
発明者等は、抗体を新規な細胞抗原ＡＣ１３３に対して用いて、免疫磁性ビーズ
選択系を用いることを選択した。ＡＣ１３３は、ＣＤ３８ｎｅｇ／ｄｉｍサブセ
ット（非リネージ委任前駆体を表す）を含むが、成熟白血球上に発現しない（Yi
n AH,等、Blood, 1997. 90:5002-12; Nfiraglia S,等、Blood, 1997, 90:5013-2
1; Buhring HJ, 等、Ann N Y Acad Sci, 1999, 872:25, 討議３８〜９）２０〜
６０％のヒトＣＤ３４＋細胞上に発現する５−膜透過細胞表面抗原である。少数
の成熟ＣＤ２＋Ｔ細胞がＡＣ１３３＋前駆体との本発明者等の同時培養中に移送
されたが、本発明者等は、この系において発生したＴ細胞が、ＣＤ２＋成熟リン
パ球またはＣＤ２＋リンパ様充当前駆体のいずれかから由来するとは考えていな
い。本発明者等および他人(Fisher AG, 等、Int Immunol, 1990, 2:571-8)は、
同時培養中への成熟ヒトＴ細胞の計画的な導入は、増加した数のＴ細胞またはこ
の前駆体を生じないことを観察した。ＡＣ１３３＋ＭＮＣフラクションは、製造
者のプロトコルに従ってＡＣ１３３細胞単離キット(Mitenyl Biotec Inc., Aubu
rn, CA)を用いた免疫磁性ビーズ選択により単離された。
【００７６】マウス胸腺基質 胸腺を、新たに屠殺した６週齢Ｂ６（ＢＡＬＢ／Ｃ）マウスから得た。胸腺を
、手術はさみを用いて物理的に分解して、大きさが０．５ｍｍ３より小さい胸腺
組織のフラグメントを含む細胞懸濁液を生成した。胸腺フラグメントを含む細胞
懸濁液を、０．５ｃｍ×０．５ｃｍ×０．２ｃｍのセルフォーム（８０ｐｐｉ）
片上に置き、２４ウェルプレートの各ウェル中に置いた。各ウェルは、少なくと
も５×１０６個の細胞を含み、セルフォームブロックおよび細胞あたりの胎児胸
腺の４つのフラグメントを、完全に捕捉したＩＭＤＭ中で培養した。胸腺培養中
の培地を、最初は培養の確立後４８時間およびその後３日間隔において交換した
。平均して８０％の融合性胸腺基質単一層を、１０〜１４日においてセルフォー
ム上に確立した。培養の１０〜１４日において、各々が胸腺基質のサブ融合性層
を含むセルフォームブロックを、２４ウェルプレートから取りだし、新たな２４
ウェルプレートのウェル中に置き、ＣＤ３４＋細胞と共に同時培養した。
【００７７】ヒトＣＤ３４＋／マウス胸腺基質同時培養条件： 次に、ＵＣＢまたはヒト骨髄から由来する５０００個のＣＤ３４＋細胞を、照
射したマウス胸腺基質上に置いた。セルフォームを用いる場合において、ＣＤ３
４＋細胞を、２４ウェル組織培養皿の壁中のセルフォーム自体の上に直接置いた
。同時培養中の培地を、３日おきに交換し、外因性サイトカインで補完しなかっ
た。ＣＤ３４＋細胞から発生した細胞を、同時培養の７日後の確立において収穫
し、フローサイトメトリーおよび機能的研究を、得られた細胞について実施した
。
【００７８】同時培養から得られた細胞の免疫表現型および機能の評価 付着細胞を、非トリプシン単離溶液(Cell Dissociation Solution, Sigma, St
. Louis, MO)で収穫して、表面染色特性の変化を最小にした。セルフォームから
付着細胞を回収するために、ユニットを、ＰＢＳ中に浸漬することにより２回洗
浄し、過剰の細胞分解溶液中で短時間かきまぜ、３７℃で２０分間インキュベー
トし、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより飽和した。
【００７９】 細胞を、穏やかに吸引することにより収穫し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。収穫
した細胞を計数し、トリパンブルー排除により生存可能性について評価した。計
数後、細胞を、２％マウス血清(Dako, Carpentiera, CA)および次の蛍光色素結
合抗体：ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４
、ＣＤ３３およびＣＤ３４(Becton Dickinson, San Jose, CA)を有する１００μ
Ｌの最終容積において染色した。４種の蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＰＥ、ペリジニン
クロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＱ））
すべてについての共役イソタイプ対照抗体を、各培養について用いた。染色した
試料を、ＰＢＳで３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳカ
リバー(FACScalibur)フローサイトメーター(Becton Dickinson)で分析した。適
切な対照は、整合したイソタイプ抗体を含んで、正および負の象限を確立し、適
切な単色染色を含んで、補償を確立した。各試料について、少なくとも１０，０
００リストモードの事象を採集した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ１４を用いて、ＣＤ
３４＋選択ＭＣサブ集団において汚染Ｔ細胞および単球を検出した。
【００８０】 ヒト白血球は、ＣＤ４５＋集団におけるゲート化(gating)による免疫表現型分
析において、マウス細胞と区別可能であった。同時培養において１４日後、＞７
０％のＣＤ４５＋細胞が、ＣＤ３、ＣＤ４および／またはＣＤ８を同時発現した
。この系において、２週間にわたり、Ｔリンパ様前駆体の連続的分化を追跡する
ことが可能であった（図１）。ＣＤ３４＋前駆体は、三次元マトリックス（セル
フォーム）において、マウス胸腺基質細胞との同時培養中に加えられた。非付着
性細胞を、同時培養の確立の７、１４および２１日後に収穫し、これらの免疫表
現型を、ＦＡＣＳ分析により決定した。パネル（ａ）におけるデータは、ＣＤ２
の獲得および造血前駆細胞マーカー、ＣＤ３４の下方調節を例証する。細胞表面
ＣＤ４およびＣＤ８マーカーの獲得は、同時培養の１４日後に生じ；（ｂ）；Ｓ
Ｐ ＣＤ４＋およびＳＰ ＣＤ８＋の個別の集団は、これらのＤＰ ＣＤ４＋Ｃ
Ｄ８−前駆体を含めて例証される。１４日目のＣＤ４の獲得は、ＣＤ３の獲得と
関連し（ｃおよびｄ）：すべてのＣＤ４＋細胞は、ＣＤ３を同時発現した。ＣＤ
３は、大部分のＣＤ８＋細胞と共に同時発現し；ＣＤ３−ＣＤ８＋である細胞は
、ＴＣＲγδを発現することが見出された。ＴＣＲαβは、７８％のＣＤ３＋細
胞により発現されたが、ＴＣＲγδを発現するＣＤ３＋細胞の比較的小さい集団
（２０％）はまた、検出可能であった（６％ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＣＲγδ、１４
％ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＣＲγδ）。
【００８１】Ｔ細胞機能 ： Ｔ細胞機能を、マイトジェンに応答するＣＤ６９発現およびマイトジェンＣｏ
ｎ−Ａに応答する３Ｈ−チミジン取り込みを決定することにより、評価した。ま
た、同時培養系において発生したＴ細胞を、ＨＩＶ−１によるこれらの感染性お
よびＭＦＧマウスレトロウィルスベクターによる形質導入可能性について試験し
た。同時培養から発生したＴ細胞は、フローサイトメトリーにより決定されたよ
うに、マイトジェンＣｏｎ−Ａに応答する予期された高レベルの３Ｈ−チミジン
取り込み（対照非応答性細胞の１０倍）および活性化マーカーＣＤ６９の発現に
おける４倍の増大を示した。
【００８２】ＨＰＣ／胸腺基質同時培養から発生したＴ細胞のＨＩＶ−１攻撃 ＨＰＣから発生したＴ細胞を、１の感染の多様性においてＴ細胞屈性単離ＨＩ
ＶＩＩＩＢで攻撃した。ＨＩＶ−１の滴定したストックを、業界において十分知
られている標準的な方法により発生した。培養上清液の試料を、ＥＬＩＳＡ(Cou
lter, Miami, FL)によりＨＩＶ−１ ｐ２４抗原評価についてＨＩＶ攻撃の３、
６、９、１４および２８日後において培養から除去した。第２に、胸腺基質とＢ
Ｍ ＨＰＣとの同時培養から発生した分類したＣＤ４＋Ｔ細胞を、１の感染の多
様性においてＨＩＶＩＩＩＢで攻撃した。また、細胞生存性を、単球およびＴ細
胞のＨＩＶ−１での攻撃に続いて、トリパンブルー排除を用いて決定した。ＨＰ
Ｃを発生したＴ細胞は、ＨＩＶ−１で感染可能であり、１０日の培養により０．
６９ｎｇ／ｍｌまでのＨＩＶ−１ ｐ２４を生じた。未分類および分類Ｔ細胞の
両方は、セルフォーム上のマウス胸腺基質においてＨＰＣの同時培養から生じ、
暴露されて、ＨＩＶＩＩＩＢを熱不活性化し、検出不能なレベルのＨＩＶ−１
ｐ２４を生成した。Ｔ細胞の生存性はまた、感染ＨＩＶ−１の暴露に続いて顕著
に低減した。セルフォーム同時培養系から生じたＴ細胞のＨＩＶ−１ ｐ２４抗
原生成のレベルは、ヒト活性化末梢血液Ｔ細胞からのＨＩＶ−１ ｐ２４生成の
レベルと同様であった。
【００８３】アンフォトロピック(amphotropic)マウスレトロウィルスベクターとのＨＰＣ／
胸腺基質同時培養から発生したＴ細胞の形質導入 ＨＰＣから発生し、ＩＬ−２およびＰＨＡにおいて拡張したＴ細胞を、７２時
間にわたり３回の機会において１０のＭ．Ｏ．Ｉ．において核内局所化酵素β−
ガラクトシダーゼをコードするマウスレトロウィルスに基づくベクター、ＭＦＧ
に暴露した。滴定したレトロウィルスベクターを、ヒトに基づくＦＬＹＡ４包装
細胞系から標準的な方法により発生した。Ｔ細胞もまた暴露して、ＭＦＧを熱不
活性化した。形質導入した細胞を、レトロウィルス暴露に続いて７日において培
養から収穫し、β−ガラクトシダーゼトランスジーンの発現のための標準的な方
法により染色した。ＨＰＣのセルフォーム上で成長したマウス胸腺基質との同時
培養から発生したＴ細胞において、１２〜２６％の形質導入効率が観察された。
熱不活性化レトロウィルスベクターに暴露されたＴ細胞において、β−ガラクト
シダーゼ活性は検出可能ではなかった。セルフォーム同時培養系から発生したヒ
トＴ細胞の形質導入効率は、活性化末梢血液Ｔ細胞において見られる形質導入効
率と同様である。
【００８４】ｍＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成 ： また、発生した細胞を溶菌し、ＲＮＡを、ＲＮＡ ＰＣＲについて細胞から調
製して、Ｔ細胞受容体遺伝子発現を決定した。メッセンジャーＲＮＡを、胸腺単
層上に成長した細胞から抽出した。抽出は、グアニジニウムチオシアニンおよび
オリゴ−ｄＴスパンカラム(QuickPrep Micro mRNA Purification Kit;Pharmacia
, Piscataway, N.J.)を用いて、製造者の指示に従って実施した。ｍＲＮＡ試料
を、−７０℃で貯蔵した。第１らせんｃＤＮＡを、約２μｇのｍＲＮＡ、１μｇ
のランダムプライマーおよび６．２５単位のＡＭＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ／Ｂ
ＲＬ）を用いて、最終容積４０μｌに合成した。試料を、室温で１０分間、４２
℃で１時間、９５℃で５分および４℃で５分インキュベートした。多くのリンパ
様特異性遺伝子（ＲＡＧ−２を含む）についてのＲＴ−ＰＣＲを、ランダムプラ
イマーおよびモロニー(Moloney)ＭｕＬ Ｖ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、G
rand Island, NY）を用いて逆転写を用いて実施した。ｃＤＮＡを、遺伝子特異
性プライマーを用いて、例えばリンパ球分化、Ｖβ遺伝子発現等を受ける細胞に
よってのみ一時的に発現されるヒトＲＡＧ−２遺伝子について、増幅した。ＰＣ
Ｒ増幅を、業界において十分知られている条件を用いてＧｅｎｅＡｍｐ ９６０
０熱サイクラー(Perkin Elmer, Norwalk, CT)において実施した。
【００８５】例１ ：同時培養系において発生したヒト細胞の生存性、免疫表現型および機能 同時培養系において発生した生存細胞の数およびこの免疫表現型を、表２に示
す。最大ヒトＴ細胞増殖は、ヒト胎児胸腺ＣＤ３４＋細胞およびＵＣＢＣＤ３４
＋細胞を、セルフォーム上で成長させたマウス胎児胸腺基質と同時培養した際に
見られた。セルフォーム上でのマウス胸腺基質上でのＣＤ３４＋細胞の同時培養
対単純な単一層として成長したマウス基質上でのＣＤ３４＋細胞の同時培養の直
接的な比較から得られたデータもまた、表２に示す。 同時培養系において発生したＴ細胞はまた、Ｔ屈性ＨＩＶ−１ＩＩＩＢにより
感染可能であることが示され、これらの細胞はまた、ＭＦＧベクターで１２〜２
２％（ｎ＝３）の形質導入効率で、形質導入可能であった。
【００８６】例２ ：未成熟前駆細胞の維持 本発明において、胸腺基質細胞のセルフォーム培養が、ＣＤ３４＋前駆体のＴ
細胞分化を誘発し、尚ＣＤ３４＋細胞のフラクションを保存することができるこ
とが見出された。霊長類ＣＤ３４＋前駆体を、セルフォーム組織足場上に確立さ
れたヒトまたはブタ胸腺のいずれかの上で培養した。１４〜２１日後、ＣＤ３＋
ＣＤ４＋ＣＤ８＋三重陽性細胞並びにＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋
二重陽性細胞が、信頼性をもって回収される。さらに、ＣＤ３−細胞フラクショ
ンは、１４〜２１日後にＣＤ３４＋前駆細胞を含むことが見出された。これらの
ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３−であったのみならず、多くはＣＤ２＋でもあった。
これは、セルフォーム組織足場における胸腺培養を、長期間生存するＣＤ３４＋ 前駆細胞集団を同時に保存しながらＴ細胞分化を支持することができることを例
証する。当業者には明らかなように、この驚異的な発見は、未成熟前駆細胞を維
持しながらＴ後代の続行する分化がセルフォームにおいて可能であることを示す
。
【００８７】例３ ：Ｔ細胞機能（増殖／アネルギー）アッセイ Ｔ細胞機能を、標準的なアッセイを用いて、特異性および非特異性抗原に対す
る増殖的効力により評価した。特に、アッセイは、抗ＣＤ３抗体 (Becton Dicki
nson)を用いたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介増殖並びにコンカバリンＡ（Ｃｏｎ
−Ａ）を用いた基線非特異性増殖の応答を評価する。要するに、Ｔ細胞を洗浄し
、１０６個の細胞／ｍｌの濃度で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに再懸濁した。１
００μｌ（１０５個の細胞）を、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。細胞
を、Ｃｏｎ−Ａ（５μｇ／ｍｌ）（非特異性応答）またはＣＤ３に対するモノク
ローナル抗体のいずれかで、ＩＬ−２（２０ユニット／ｍｌ）および照射した単
核細胞（ＭＣ）（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１００ｍｌ中に１０５個の細胞／
ウェル）の存在下で刺激した。精製したヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２フラグメン
ト(Kirkegard and Perry Laboratories, Gaithersberg, MD)を、ＣＤ３に対する
モノクローナル抗体を用いる実験的条件について架橋剤として用いる。ウェルを
、３７℃で４５分間１．２５μｇ／ｍｌのヤギ抗マウス抗体で前処理し、ＣＤ３
およびＣＤ２８に対するモノクローナル抗体の添加の前に３回洗浄する。対照は
、Ｔ細胞のみ、Ｔ細胞＋照射したＭＣおよびＴ細胞＋ＩＬ−２または照射したＭ
Ｃを含まないマイトジェン刺激を含んでいた。３７℃での培養の７日後、放射活
性アッセイまたは市場で入手できる非放射活性のＥＬＩＳＡに基づくアッセイ（
例えばプロメガ(Promega)のいずれかを用いて、細胞増殖を評価する。細胞を、
５〜７日間同時培養して、Ｔ細胞の増殖を誘発する（刺激細胞もまた照射し、従
って非増殖的である）。刺激細胞のみを、対照とした。
【００８８】 Ｔ細胞機能を試験する追加の方法は、これらの因子のヒト形態に特異的な抗体
(Becton Dickinson)を用いるサイトカインＩＬ−２γＩＦＮおよびＴＮＦαの細
胞内発現のためのフローサイトメトリーに基づく染色を用いる。これらのサイト
カインは、抗原特異性インビトロ増殖アッセイにおけるＴ後代において生成する
。これは、ヒト後代を選択的に強調し、マウス細胞を除外する高い割合のマウス
細胞の中のヒト細胞の低レベルの検出を可能にする。さらに、これらの因子のた
めのｍＲＮＡの半定量的なＲＴ−ＰＣＲもまた、用いることができる。
【００８９】 １つの特定の例において、例えば、１４日後に同時培養から除去された細胞は
、完全培地およびＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍＬ）およびフィトヘマグルチニン（Ｐ
ＨＡ；２μｇ／ｍＬ）での液体培養中に置いた際に、顕著な増殖を示した。さら
に７日の培養の後に、細胞数の４５倍の増加があり：＞９０％はＣＤ３＋ＣＤ４ ＋ ＴＣＲαβ＋；３％ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＣＲαβ＋および３％ＣＤ３＋ＣＤ８ ＋ ＣＤ４＋ＴＣＲαβ＋であった。ＴＣＲγδを発現する細胞は、検出されなか
った。
【表２】
【００９０】例４ ：Ｔ細胞リンパ球生成アッセイ ＡＣ１３３＋前駆細胞を、ウェルあたり１×１０５、１×１０４または１×１
０３個の細胞の細胞密度で、マウス胸腺基質培養に加え、３７℃で５％のＣＯ２ 湿潤化雰囲気中でさらに２週間培養した。同時培養中の培地を、４日おきに交換
し、外因性サイトカインを捕捉しなかった。前駆体から発生した細胞を、同時培
養の確立の７および１４日後に収穫した。 選択したＡＣ１３３＋細胞は、高度に精製された前駆細胞集団を表した。免疫
表現分析は、＞９８％がＣＤ３４＋であり；いずれも、表面ＣＤ３、ＣＤ４また
はＣＤ８を同時発現しないことを示した。少数の汚染ＣＤ２＋細胞は、ＡＣ１３
３＋選択集団内のフローサイトメトリーにより検出可能であり：これは、選択さ
れた方法から得られた細胞の０．５７％±０．２９％（平均±ＳＥＭ；ｎ＝６）
のみを含んでいた。
【００９１】例５ ：最適なマトリックスの大きさおよび投入細胞数の決定 種々の寸法のマトリックスを試験して、本発明者等は、この系において用いる
のに最適な大きさのマトリックスは、直径１０ｍｍ×深さ１ｍｍの寸法であるこ
とを決定した。同様に、投入細胞密度は、最適なＴ細胞発生に臨界的に重要であ
ると考えられ：ウェルあたり１×１０４個の細胞より小さい投入細胞密度を用い
てリンパ球は発生しなかった。しかし、１０×１ｍｍのマトリックスおよび１×
１０４または１×１０５の投入細胞密度を用いて、本発明者等は、１４日の同時
培養の後に、７１．２１％±９．８７％（平均ＳＥＭ；ｎ＝７）はＣＤ３＋であ
る大きい数のヒト細胞を発生することができた。
【００９２】例６ ：発生したＴ細胞の数における試料内および試料間可変性 所定の給源の前駆体内のＴ細胞放出の変化を決定するために、複数の同時培養
を、マウス胸腺基質の個別の１０×１ｍｍのマトリックス上で固定された細胞密
度（ウェルあたり１×１０４個の細胞）においてＡＣ１３３＋の単一の給源を用
いて確立した。発生したＴリンパ球の試料内変化を、トリパンブルー排除を用い
た細胞計数により、および免疫表現型分析により分析した。ヒト細胞を、ＣＤ４
５の表面発現により区別した。同時培養における７日後、検出された成熟Ｔ細胞
の数は、極めて低かった：ＣＤ３＋細胞は、２．０２％±０．８７％（平均±標
準偏差）のＣＤ４５＋でゲート調節した集団を示し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は
１．０％±０．５２％のゲート調節された集団を占め、ＣＤ３＋ＣＤ８＋は０．
５８％±０．１％の同一のゲート調節された集団を占める。しかし、１４日後に
、Ｔ細胞の数は、顕著に高かった：ＣＤ３＋細胞の集団は、６２．１６％±４．
５３％に上昇し；ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋の百分率は、それぞ
れ４２．７％±２．８７％および２２．３９％±１．２９％であった。これらの
データを、図式的に図２に示す。
【００９３】 試料間の変化は、個別のＣＤ３４＋前駆体の給源から発生したＴ細胞の数を比
較することにより計算した。各々の場合において、固定された数の細胞（ウェル
あたり１×１０４個の細胞）を、同時培養中に導入した。同時培養における７日
後に発生した細胞の免疫表現型分析は、ＣＤ４５ゲート調節集団の中で、１．５
７％±０．９７％の細胞はＣＤ３を発現し；２．２７％±２．７０％はＣＤ３お
よびＣＤ４を同時発現し；０．４６％±０．２３％は、ＣＤ３およびＣＤ８を共
に発現したことを示した。１４日後、図３に示すように、収穫された細胞の免疫
表現型は、７１．２１％±９．８７％はＣＤ３＋であり；３７．４４％±８．４
４％はＣＤ３＋ＣＤ４＋であり、３８．０６％±１９．１３％はＣＤ３＋ＣＤ８ ＋ であることを明らかにした。 これらのデータは、投入集団の比較分析におけるこの能力を提案する系内の高
レベルの再現性を例証する。
【００９４】例７ ；ＴＣＲ除去サークル（ＴＲＥＣ）についての分析 ＴＣＲ Ｖδ座は、ＴＣＲ ＶαとＴＣＲ Ｊαセグメントとの間にある。Ｔ
ＣＲα ＶＤ−Ｊ再配列を完全にするために、ＴＣＲ Ｖδセグメントを除去す
る：遺伝子の３’および５’末端を結合させて、ＴＣＲ除去サークル（ＴＲＥＣ
）(Berenson RJ,等、J Clin Invest, 1988, 81:951-5; Broxmeyer HE, 等、Proc
Natl Acad Sci USA, 1989, 86:3828-32)と呼ばれるＤＮＡの染色体外サークル
を形成する。ＴＲＥＣは、Ｔ細胞が分割される際には複製しない(Blom B., 等、
J, Immunol, 1997, 158:3571-7)。結果として、ＴＲＥＣレベルは、最近の胸腺
移出個体においては最高であるが、移出個体の後代の中で連続的に希釈される。
ＴＣＲδ ＴＲＥＣは、ＰＣＲ−新たにＴ細胞発生を監視するための信頼性のあ
る手段であることが示されたアッセイにより検出可能である(Tjormford GE, 等
、J Exp Med, 1993, 177:1531-9)。ＴＲＥＣ陽性細胞の絶対数は、分析する細胞
の合計数により変化する。本発明者等は、ＴＲＥＣ陽性の有意さは、検出された
ＴＲＥＣコピーの数対検出されたβ−アクチンコピーの数の比率を計算すること
により、最も正しく解釈されることを決定した。本発明者等は、１４日後の同時
培養から収穫されたＴ細胞において検出されるＴＲＥＣのレベルを、投入集団か
らの末梢血液単核細胞、Ｂ細胞、ＡＣ１３３＋細胞、およびヒト胎児胸腺細胞に
おけるＴＲＥＣレベルと比較した。最高のＴＲＥＣ：β−アクチン比は、１４日
後に同時培養から発生したＴ細胞において（０．５４）、続いて１６〜２２週齢
のヒト胎児からの胸腺細胞（０．０１７）において見出された。胎児および成人
ＰＢＭＣからの、およびＡＣ１３３＋骨髄単核細胞からのＴＲＥＣ：β−アクチ
ン比は、顕著に低かった。これらのデータを、以下の表３にまとめる。ＴＲＥＣ
は、試験したＢ細胞（ｎ＝６）の試料のいずれにおいても検出されなかった。
【００９５】
【表３】
【００９６】 これらのデータは、最終的に、ＴＣＲの再配列が、培養期間の経過の間に発生
することを例証する。ＴＲＥＣ陽性細胞の欠乏は、新鮮な胎児胸腺から見られる
ものと好適に整合し、Ｔ細胞分化のこの概念におけるインビトロ系の生理学的等
価を支持する。 当業者は、ルーチンの実験のみを用いて、本明細書中に記載した本発明の特定
の実施態様に対する多くの等価なものを認識するかまたは確認することができる
。このような等価なものは、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図
する。 本明細書中に開示したすべての参照文献は、全体を参照として本明細書中に加
入する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 三次元マトリックス上のマウス胸腺基質細胞との同時培養におけ
る、Ｔ細胞中へのヒトＣＤ３４＋前駆細胞の分化を示す；図１（ａ）のデータは
、ＣＤ２の獲得および造血前駆細胞マーカーＣＤ３４の下方調節を示す；図１（
ｂ）のデータは、これらのＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋前駆体を含むＳＰ ＣＤ４＋ およびＳＰ ＣＤ８＋細胞の別個の集団を示す；図１（ｃおよびｄ）のデータは
、すべてのＣＤ４＋（ｃ）およびＣＤ８＋（ｄ）細胞が、ＣＤ３を同時発現した
ことを示す。
【図２】 本発明の同時培養系において発生したＴ細胞の数における試料内
変化を示す。
【図３】 本発明の同時培養系において発生したＴ細胞の数における試料間
変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/26 Ａ６１Ｋ 35/28 35/28 35/36 35/36 35/37 35/37 35/407 35/407 35/44 35/44 35/48 35/48 47/02 47/02 47/42 47/42 47/48 47/48 Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 ローゼンツヴァイク，マイケル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01801、ウォバーン、カミングス パーク 50、サイトマトリックス，エルエルシー (72)発明者 ピケット，マーク ジェイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01801、ウォバーン、カミングス パーク 50、サイトマトリックス，エルエルシー (72)発明者 スキャッデン，デービッド ティー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02129、チャールズタウン、ビルディング 149、13ス ストリート、マサチューセ ッツ ゼネラル ホスピタル イースト (72)発明者 ポズナンスキー，マーク シー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02129、チャールズタウン、ビルディング 149、13ス ストリート、マサチューセ ッツ ゼネラル ホスピタル イースト Ｆターム(参考） 2G045 AA24 BB20 CA01 CA17 CA18 CA19 CA20 CB01 DA77 4B063 QA05 QQ04 QR77 QS39 QX01 4B065 AA94X BB12 BC42 CA44 CA46 4C076 CC07 DD21 EE41 EE43 EE58 EE59 GG50 4C087 AA02 AA03 BB34 BB44 BB48 BB49 BB52 BB57 BB59 BB63 ZB07 ZB08 ZB09

Claims (85)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リンパ様組織特異的細胞をインビトロで生成する方法であっ
    て： ある量の造血前駆細胞およびある量のリンパ網内性基質細胞を、造血前駆細胞
    およびリンパ網内性基質細胞がマトリックス全体に成長するのに十分な孔の大き
    さの相互接続した孔を有する多孔質固体マトリックス中に導入すること、ここで
    リンパ網内性基質細胞の量は、造血前駆細胞の成長および分化を支持するのに十
    分である、及び 造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞を同時培養すること を含む、前記方法。
  2. 【請求項２】 同時培養が、リンパ様組織起源細胞の数の少なくとも１０倍
    の増加を得るのに十分な条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 同時培養が、リンパ様組織起源細胞の数の少なくとも２０倍
    の増加を得るのに十分な条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 同時培養が、リンパ様組織起源細胞の数の少なくとも５０倍
    の増加を得るのに十分な条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 同時培養が、リンパ様組織起源細胞の数の少なくとも１００
    倍の増加を得るのに十分な条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 同時培養が、リンパ様組織起源細胞の数の少なくとも２００
    倍の増加を得るのに十分な条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 同時培養が、リンパ様組織起源細胞の数の少なくとも４００
    倍の増加を得るのに十分な条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 造血前駆細胞が、多能性幹細胞、多能性前駆細胞および特異
    的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞から成る群から選択される、請求項
    １記載の方法。
  9. 【請求項９】 特異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞が、Ｔ細胞
    リネージ、Ｂ細胞リネージ、樹状細胞リネージ、ランゲルハンス細胞リネージお
    よびリンパ様組織特異的マクロファージ細胞リネージから成る群から選択された
    リネージに方向づけられる、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 造血前駆細胞が、骨髄、末梢血、臍帯血、胎盤血、リンパ
    様柔軟組織、胎児肝臓、胚細胞および大動脈−生殖腺−中腎由来細胞から成る群
    から選択された組織に由来する、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 リンパ様柔軟組織が、胸腺、脾臓、肝臓、リンパ節、皮膚
    、扁桃およびパイエル板から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 リンパ網内性基質細胞が、胸腺基質細胞であり、特異的な
    造血リネージに方向づけられた前駆細胞が、Ｔ細胞リネージに方向づけられる、
    請求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 造血前駆細胞が、遺伝子的に変化した造血前駆細胞である
    、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 リンパ網内性基質細胞が、胸腺、脾臓、肝臓、リンパ節、
    皮膚、扁桃およびパイエル板並びにこれらの組合せから成る群から選択された少
    なくとも１種のリンパ様柔軟組織に由来する、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 リンパ網内性基質細胞が、遺伝子的に変化したリンパ網内
    性基質細胞である、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 リンパ網内性基質細胞が、造血前駆細胞を接種する前に播
    種される、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 リンパ網内性基質細胞が、造血前駆細胞と同時に播種され
    る、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 造血前駆細胞がヒト起源であり、リンパ網内性基質細胞が
    ヒト起源である、請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 造血前駆細胞がヒト起源であり、リンパ網内性基質細胞が
    非ヒト起源である、請求項１に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 非ヒト起源リンパ網内性基質細胞が、マウス起源である、
    請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 多孔質固体マトリックスが、少なくとも７５％の百分率開
    放空間を有する開放セル多孔質マトリックスである、請求項１〜２０のいずれか
    に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 多孔質固体マトリックスが、平均で１５０μｍより小さい
    中点における直径を有する相互接続する靭帯により規定された孔を有する、請求
    項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 多孔質固体マトリックスが、炭素含有物質の金属被覆網状
    開放セルフォームである、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 金属が、タンタル、チタン、白金、ニオブ、ハフニウム、
    タングステンおよびこれらの組合せから成る群から選択されており、該金属が、
    コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、血管形成因子、抗炎
    症因子、グリコサミノグリカン、ビトロゲン、抗体およびこれらのフラグメント
    並びにこれらの組合せから成る群から選択された生物学的薬剤で被覆されている
    、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 造血前駆細胞およびこの後代、並びにリンパ網内性基質細
    胞を播種した多孔質固体マトリックスが、マトリックスの孔を占有するゼラチン
    状薬剤で含浸されている、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 金属が、タンタルである、請求項２４に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞が、血清以外の
    造血細胞の維持、拡張および分化を促進する基質細胞条件化培地および外因的に
    加えられた造血成長因子を含まない環境において培養される、請求項１に記載の
    方法。
  28. 【請求項２８】 造血細胞の維持、拡張および分化を促進する造血成長因子
    が、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン１１、ＳＣＦ
    、ＦＬＴ／ＦＬＫリガンド成長因子から成る群から選択された剤である、請求項
    ２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞が、基質細胞条
    件化培地、並びに造血細胞の維持、拡張、分化を促進し、細胞局所化に影響する
    造血成長因子から成る群から選択された外因的に加えられた剤と共に培養される
    、請求項１に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 造血細胞の維持、拡張、分化を促進し、細胞局所化に影響
    する造血成長因子が、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイ
    キン７、インターロイキン１１、インターロイキン１２、幹細胞因子、ＦＬＫ−
    ２リガンド、ＦＬＴ−２リガンド、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、オ
    ンコスタチンＭおよびＭＣＳＦから成る群から選択された剤である、請求項２９
    に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 さらに、 同時培養段階の後に、リンパ様組織起源細胞が収穫されること を含む、請求項１に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 造血前駆細胞のインビボでの維持、拡張および／または分
    化のための方法であって： 対象中に、造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞を播種した多孔質固体マ
    トリックスを移植することを含み、 該多孔質固体マトリックスが、少なくとも７５％の百分率開放空間を有する開
    放セル多孔質マトリックスである、 前記方法。
  33. 【請求項３３】 造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞を： ある量の造血前駆細胞およびある量のリンパ網内性基質細胞を、多孔質固体マ
    トリックス中にインビトロで導入すること、 該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細胞を、血清以外の造血細胞の維持
    、拡張および／または分化を促進する基質細胞条件化培地および外因的に加えら
    れた造血成長因子を含まない環境において同時培養すること、 の各工程により播種した多孔質固体マトリックスをさらに含む、請求項３２に記
    載の方法。
  34. 【請求項３４】 同時培養が、少なくとも１０倍と４００倍の間でリンパ様
    組織起源細胞の数の増大を生じるのに十分な条件下で行われる、請求項３３に記
    載の方法。
  35. 【請求項３５】 造血前駆細胞が、多能性幹細胞、多能性前駆細胞および特
    異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞から成る群から選択される、請求
    項３２に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 特異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞が、Ｔ細
    胞リネージ、Ｂ細胞リネージ、樹状細胞リネージ、ランゲルハンス細胞リネージ
    およびリンパ様組織特異的マクロファージ細胞リネージから成る群から選択され
    たリネージに方向づけられる、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 リンパ網内性基質細胞が、胸腺基質細胞であり、特異的な
    造血リネージに方向づけられた前駆細胞が、Ｔ細胞リネージに方向づけられる、
    請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 多孔質固体マトリックスが、平均で１５０μｍより小さい
    中点における直径を有する相互接続する靭帯により規定された孔を有する、請求
    項３２に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 多孔質固体マトリックスが、炭素含有物質の金属被覆網状
    開放セルフォームである、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 金属が、タンタル、チタン、白金、ニオブ、ハフニウム、
    タングステンおよびこれらの組合せから成る群から選択されており、該金属が、
    コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、血管形成因子、抗炎
    症因子、グリコサミノグリカン、ビトロゲン、抗体およびこれらのフラグメント
    並びにこれらの組合せから成る群から選択された生物学的薬剤で被覆されている
    、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 金属が、タンタルである、請求項４０に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞を播種した多孔
    質固体マトリックスが、マトリックスの孔を占有するゼラチン状薬剤で含浸され
    ている、請求項３２〜４１のいずれかに記載の方法。
  43. 【請求項４３】 Ｔ細胞アネルギーを誘発する方法であって： ある量の造血前駆細胞、ある量の抗原提示細胞およびある量のリンパ網内性基
    質細胞を、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細胞がマトリックス全体に
    成長するのに十分な孔の大きさの相互接続した孔を有する多孔質固体マトリック
    ス中に導入すること、 該造血前駆細胞、該抗原提示細胞および該リンパ網内性基質細胞を、Ｔ細胞お
    よび／またはＴ細胞前駆体の形成を誘発し、生成した細胞の活性化を阻害するの
    に十分な条件下で少なくとも１種の抗原の存在下で同時培養すること を含む、 前記方法。
  44. 【請求項４４】 造血前駆細胞が、多能性幹細胞、多能性前駆細胞および特
    異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞から成る群から選択される、請求
    項４３に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 リンパ網内性基質細胞が胸腺基質細胞であり、特異的な造
    血リネージに方向づけられた前駆細胞がＴ細胞リネージに方向づけられる、請求
    項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 Ｔ細胞反応性を誘発する方法であって： ある量の造血前駆細胞、ある量の抗原提示細胞およびある量のリンパ網内性基
    質細胞を、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細胞がマトリックス全体に
    成長するのに十分な孔の大きさの相互接続した孔を有する多孔質固体マトリック
    ス中に導入すること、及び 該造血前駆細胞、該抗原提示細胞および該リンパ網内性基質細胞を、該造血前
    駆細胞から、Ｔ細胞および／または前記少なくとも１つの抗原に対する特異性を
    有するＴ細胞前駆体の形成を誘発するのに十分な条件下で、少なくとも１種の抗
    原の存在下で同時培養すること を含む、 前記方法。
  47. 【請求項４７】 造血前駆細胞が、多能性幹細胞、多能性前駆細胞および特
    異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞から成る群から選択される、請求
    項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 リンパ網内性基質細胞が胸腺基質細胞であり、特異的な造
    血リネージに方向づけられた前駆細胞がＴ細胞リネージに方向づけられる、請求
    項４７に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 抗原提示細胞が、樹状細胞、単球／マクロファージ、ラン
    ゲルハンス細胞、クッペル細胞、ミクログリア、肺胞マクロファージおよびＢ細
    胞から成る群から選択された細胞である、請求項４６に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 抗原提示細胞が、インビトロで造血前駆細胞から由来する
    、請求項４６に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 さらに同時刺激分子を同時培養に投与することを含む、請
    求項４６に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 同時刺激分子が、リンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３）
    、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、Ｃ
    Ｄ７０およびＣＤ８２から成る群から選択されている、請求項５１に記載の方法
    。
  53. 【請求項５３】 少なくとも７５％の百分率開放空間および細胞をマトリッ
    クスを通じて成長させるのに十分な孔の大きさの孔を有する多孔質固体マトリッ
    クス、 該固体マトリックスに付着したある量のリンパ網内性基質細胞、ここで該量は
    、造血前駆細胞の成長および分化を支持するのに十分である、および マトリックスに付着したある量の造血前駆細胞 を含む、組成物。
  54. 【請求項５４】 造血前駆細胞が、リンパ網内性基質細胞に付着している、
    請求項５３に記載の組成物。
  55. 【請求項５５】 多孔質固体マトリックスが、平均で１５０μｍより小さい
    中点における直径を有する相互接続する靭帯により規定された孔を有する、請求
    項５３または５４に記載の組成物。
  56. 【請求項５６】 多孔質固体マトリックスが、炭素含有物質の金属被覆網状
    開放セルフォームである、請求項５５に記載の組成物。
  57. 【請求項５７】 金属が、タンタル、チタン、白金、ニオブ、ハフニウム、
    タングステンおよびこれらの組合せから成る群から選択されており、ここで該金
    属は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、血管形成因子
    、抗炎症因子、グリコサミノグリカン、ビトロゲン、抗体およびこれらのフラグ
    メント並びにこれらの組合せから成る群から選択された生物学的剤で被覆されて
    いる、請求項５６に記載の組成物。
  58. 【請求項５８】 金属が、タンタルである、請求項５６に記載の組成物。
  59. 【請求項５９】 造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞を播種した多孔
    質固体マトリックスが、マトリックスの孔を占有するゼラチン状薬剤で含浸され
    ている、請求項５３に記載の組成物。
  60. 【請求項６０】 造血前駆細胞が、多能性幹細胞、多能性前駆細胞および特
    異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞から成る群から選択される、請求
    項５３に記載の組成物。
  61. 【請求項６１】 特異的な造血リネージに方向づけられた前駆細胞が、Ｔ細
    胞リネージ、Ｂ細胞リネージ、樹状細胞リネージ、ランゲルハンス細胞リネージ
    およびリンパ様組織特異的マクロファージ細胞リネージから成る群から選択され
    たリネージに方向づけられる、請求項６０に記載の組成物。
  62. 【請求項６２】 リンパ網内性基質細胞が胸腺基質細胞であり、特異的な造
    血リネージに方向づけられた前駆細胞がＴ細胞リネージに方向づけられる、請求
    項６０に記載の組成物。
  63. 【請求項６３】 造血細胞の発育に影響することが疑われる剤を同定する方
    法であって： ある量の造血前駆細胞およびある量のリンパ網内性基質細胞を、該造血前駆細
    胞および該リンパ網内性基質細胞がマトリックス全体に成長するのに十分な孔の
    大きさの相互接続した孔を有する多孔質固体マトリックス中に導入すること、 試験同時培養において、該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細胞を、造
    血細胞の発育に影響することが疑われる少なくとも１種の候補薬剤の存在下で同
    時培養すること、及び 試験同時培養造血細胞の発育を対照の同時培養と比較することにより、該少な
    くとも１種の候補薬剤が、該試験同時培養における造血細胞の発育に影響してい
    るか否かを決定し、これにより、造血前駆細胞およびリンパ網内性基質細胞を、
    該少なくとも１種の候補薬剤の不存在下で同時培養すること、 ここで該多孔質固体マトリックスは、少なくとも７５％の百分率開放空間を有
    する開放セル多孔質マトリックスである、 を含む、前記方法。
  64. 【請求項６４】 造血前駆細胞の発育が、造血前駆細胞の維持を含む、請求
    項６３に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 造血前駆細胞の発育が、造血前駆細胞の拡張を含む、請求
    項６３に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 造血前駆細胞の発育が、特異的細胞リネージへの造血前駆
    細胞の分化を含む、請求項６３に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 造血前駆細胞の発育が、造血前駆細胞の死を含む、請求項
    ６３に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 リンパ網内性基質細胞が、胸腺基質細胞である、請求項６
    ３に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 多孔質固体マトリックスが、平均で１５０μｍより小さい
    中点における直径を有する相互接続する靭帯により規定された孔を有する、請求
    項６３に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 多孔質固体マトリックスが、炭素含有物質の金属被覆網状
    開放セルフォームである、請求項６３に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 金属が、タンタル、チタン、白金、ニオブ、ハフニウム、
    タングステンおよびこれらの組合せから成る群から選択されており、該金属が、
    コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、血管形成因子、抗炎
    症因子、グリコサミノグリカン、ビトロゲン、抗体およびこれらのフラグメント
    並びにこれらの組合せから成る群から選択された生物学的剤で被覆されている、
    請求項６９に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 金属が、タンタルである、請求項７０に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 細胞培養から造血細胞の発育に影響することが疑われる剤
    を単離する方法であって、 ある量の造血前駆細胞およびある量のリンパ網内性基質細胞を、該造血前駆細
    胞および該リンパ網内性基質細胞がマトリックス全体に成長するのに十分な孔の
    大きさの相互接続した孔を有する多孔質固体マトリックス中に導入すること、 該造血前駆細胞および該リンパ網内性基質細胞を同時培養すること、 該同時培養から試験上清液を得ること、 該試験上清液を対照上清液と比較すること、 該対照上清液から欠けている造血細胞の発育に影響することが疑われる剤を含
    む該試験上清液のサブフラクションを得ること を含み、 ここで該多孔質固体マトリックスは、少なくとも７５％の百分率開放空間を有
    する開放セル多孔質マトリックスである、 前記方法。
  74. 【請求項７４】 剤が、対照上清液中に存在し、試験上清液中には存在しな
    い、請求項７３記載の方法。
  75. 【請求項７５】 試験上清液中の剤が、対照上清液中の薬剤とは異なる、請
    求項７３に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 剤がさらに、試験上清液の他のサブフラクションを調製す
    ることにより単離される、請求項７３に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 造血前駆細胞の発育が、造血前駆細胞の維持を含む、請求
    項７３に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 造血前駆細胞の発育が、造血前駆細胞の拡張を含む、請求
    項７３に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 造血前駆細胞の発育が、特異的細胞リネージへの造血前駆
    細胞の分化を含む、請求項７３に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 造血前駆細胞の発育が、造血前駆細胞の死を含む、請求項
    ７３に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 リンパ網内性基質細胞が、胸腺基質細胞である、請求項７
    ３に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 多孔質固体マトリックスが、平均で１５０μｍより小さい
    中点における直径を有する相互接続する靭帯により規定された孔を有する、請求
    項７３に記載の方法。
  83. 【請求項８３】 多孔質固体マトリックスが、炭素含有物質の金属被覆網状
    開放セルフォームである、請求項７３に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 金属が、タンタル、チタン、白金、ニオブ、ハフニウム、
    タングステンおよびこれらの組合せから成る群から選択されており、該金属が、
    コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、血管形成因子、抗炎
    症因子、グリコサミノグリカン、ビトロゲン、抗体およびこれらのフラグメント
    並びにこれらの組合せから成る群から選択された生物学的剤で被覆されている、
    請求項８３に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 金属が、タンタルである、請求項８３に記載の方法。
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