JP2009521930A - 胎盤幹細胞及び第２供給源由来幹細胞の共存培養 - Google Patents

Abstract

本発明は、胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞又は前駆細胞との組合せに関するものであり、該組合せは、胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独に比較して、改善された生着を示す。該組合せを、組合せ幹細胞集団と呼ぶ。本発明は、また、インビトロ及びインビボで組合せ幹細胞集団を確定及び産生させる方法、並びに生着のモデルを提供する。本発明によれば、胎盤幹細胞を、例えば、臍帯血由来幹細胞又は前駆細胞、胎児又は新生児の幹細胞又は前駆細胞、成人幹細胞又は前駆細胞、造血幹細胞又は前駆細胞、骨髄由来幹細胞又は前駆細胞などと組み合わせることができる。
【選択図】図１

Description

本出願は、そのそれぞれの開示が参照により本明細書に組み込まれる、2006年12月29日出願の米国特許仮出願第60/754692号による特典を請求する。

(1.序説)
本発明は、胎盤幹細胞の集団又は第2供給源由来幹細胞集団の単独を超える改善された生着可能性を有する組合せ幹細胞集団を生み出すために、胎盤由来幹細胞集団の第2供給源由来幹及び/又は前駆細胞集団に対する比率を最適にするインビトロ及びインビボでの方法を提供する。本発明は、また、胎盤由来幹細胞及び第2供給源由来幹細胞又は前駆細胞を含む組合せ幹細胞集団を提供し、ここで、該組合せは、胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独と比較して改善された生着を示す。本発明によれば、胎盤由来幹細胞は、例えば、臍帯血由来幹細胞又は前駆細胞、胎児又は新生児幹細胞若しくは前駆細胞、成人幹細胞又は前駆細胞、造血幹細胞又は前駆細胞、骨髄由来幹細胞又は前駆細胞などと組み合わせることができる。該組合せ幹細胞集団を、幹細胞の移植を必要とする個体、例えば、骨髄除去療法を受け、免疫及び造血系の再確立を必要とする個体、又は前記個体に幹細胞を導入することによって治療可能な疾患、障害又は状態を有する個体に移植できる。該組合せ幹細胞集団を使用して、貧血、神経障害、免疫障害などの血液障害を含む、幹細胞の投与から利益を得る任意の状態を治療できる。

(2.発明の背景)
ヒト幹細胞は、各種の成熟ヒト細胞系列を生み出す能力のある全能性、多能性又は多型潜在性のある前駆細胞である。幹細胞は、すべてではないが多くの組織を再形成(repopulate)し、生理学的及び解剖学的機能を修復するのに採用され得る。例えば、幹細胞を含む細胞集団は、除去療法を受けた患者における部分的又は完全な造血機能を修復するための移植で使用されている。

最近、Haririは、哺乳動物胎盤からの幹細胞の単離、及びそれらの幹細胞の特徴付けを報告している。Haririの米国特許出願公開第2002/0123141号「胎盤幹細胞の採集方法(Method of Collecting Placental Stem Cells)」、Haririの米国特許出願公開第2002/0160510号「幹細胞による非細胞化組織及び屍体組織の更新及び再形成(Renovation and Repopulation of Decellularized Tissues and Cadaveric Organs by Stem Cells)」、Haririの米国特許出願公開第2003/0032179号「分娩後哺乳動物胎盤、その使用及びそれに由来する胎盤幹細胞(Post-partum Mammalian Placenta,Its Use and Placental Stem Cells Therefrom)」、及びHaririの米国特許出願公開第2003/0180269号「分娩後哺乳動物胎盤に由来する胚様幹細胞、並びに使用及び前記細胞を使用する治療方法(Embryonic-like Stem Cells Derived From Post-partum Mammalian Placenta,and Uses and Methods of Treatment Using Said Cells)」を参照されたい。

多くの異なるタイプの哺乳動物幹細胞が特徴付けられている。例えば、Caplanらの米国特許第5486359号(ヒト間葉系幹細胞);Huらの国際公開第00/73421号(ヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存、及び治療的使用の方法);Boyseらの米国特許第5004681号(胎児及び新生児造血幹及び前駆細胞);Boyseらの米国特許第5192553号(同上);Beltramiらの論文、Cell 114(6):763〜766(2003)(心筋幹細胞);Forbesらの論文、J.Pathol.197(4):510〜518(2002)(肝幹細胞)を参照されたい。

幹細胞移植の成功は、投与される生着可能な細胞数に有意に関連する。例えば、単一のドナーから得ることのできる臍帯血の単位、及び臍帯血量中の生着可能な細胞数は、2桁の大きさで変動する場合がある。例えば、Gluckman「血液学、米国血液学会教育プログラムブック(Hematology,American Society of Hematology Education Program Book)」1〜14(1998)を参照されたい。したがって、特に移植前に、臍帯血の、臍帯血由来有核細胞の、又はその他幹細胞の単位の生着可能性を向上させる方法が求められている。

(3.発明の要旨)
本発明は、胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独と比べて、より多数のコロニー形成単位、又はインビボでの改善された生着を生じさせる幹細胞集団を産生させるための、胎盤由来幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を決定する方法を提供する。本発明は、培養物、又は幹細胞、前駆細胞の単位、或いは幹若しくは前駆細胞を含む組織、例えば、臍帯血、並びにこれらの組合せの生着可能性を高める及び/又は加速する方法を提供する。詳細には、本発明は、胎盤幹細胞と第2供給源(例えば臍帯血又は胎盤血)由来幹細胞の組合せ、或いはこれらに由来する幹細胞の組合せの生着可能性を高める及び/又は加速するための方法及び組成物を提供する。このような集団は、本明細書中で「組合せ幹細胞集団」と呼ばれる。本発明は、さらに、組合せ幹細胞集団のインビボでの使用を提供する。好ましい実施態様において、胎盤幹細胞は、胎盤潅流液から得られる細胞集団内に含まれる胎盤幹細胞である。

一実施態様において、本発明は、コロニー形成単位の形成を可能にするのに十分な時間及び条件下で前記の胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を一緒に培養した場合に、前記細胞総数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独に比べて、より多数のコロニー形成単位を産生させる、前記細胞総数中での胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定し、それによって前記組合せを組合せ幹細胞集団として確定する方法を提供する。特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、前記組合せ幹細胞集団を個体に移植すると、前記細胞数と同数の胎盤幹細胞又は前記細胞数と同数の第2供給源由来細胞の単独を移植するのに比較して、幹細胞を必要とする前記個体における生着を改善する。

別の実施態様において、本発明は、コロニー形成単位の形成を可能にする時間及び条件下で胎盤細胞を第2供給源由来幹細胞と複数の比率でインビトロで接触させること、及び前記複数の比率中で最も多数のコロニー形成単位を産生する比率を確定することを含む、組合せ幹細胞集団を確定する方法を提供し、ここで、前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞は、前記比率で組み合わされた場合に、組合せ幹細胞集団として確定される。特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、前記組合せ幹細胞集団を前記個体中に移植すると、幹細胞を必要とする個体における生着を改善する。

より特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、幹細胞を必要とする個体における生着を移植後の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21日の間、又はその時点で改善する。別のより特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、幹細胞を必要とする個体における生着を移植後の少なくとも21日、又は21日、21日以降に改善する。特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、幹細胞を必要とする個体における生着を移植後の少なくとも25、30、35、40、45、50、55週、又はその時点、それ以降、若しくは1年以上で改善する。
別の特定の実施態様において、前記の接触は、前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞を同一の物理的空間内で培養することを含む。別の特定の実施態様において、前記の接触は、前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞を別の物理的空間内の共有された培養培地中で培養することを含む。

別の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、臍帯血から得られる幹細胞である。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD34⁺細胞、例えば、CD34⁺CD38⁺細胞及び/又はCD34⁺CD38^-細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、マーカーCD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105の中の1種以上を発現し、且つマーカーCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4の中の1種以上を欠く細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105に対して陽性であり、且つCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4に対して陰性である細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、マーカーCD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73及びCD105の中の1種以上を含み、且つマーカーCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4の中の1種以上を欠く細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105に対して陽性であり、且つCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4に対して陰性である細胞を含む。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34^-細胞を含む。特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34^-CD38^-胎盤幹細胞である。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4⁺又はABC-p⁺である。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4⁺及びABC-p⁺である。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD33、CD44、CD73、CD105、CD117及びCD133に対して陽性であり、且つCD34又はCD45に対して陰性である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-ABC⁺である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-ABC^-である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-DR⁺である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-DR^-である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200⁺及びOCT-4⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺であり、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における胚様体の形成を、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養した場合に促進する細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、OCT-4⁺であり、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における胚様体の形成を、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養した場合に促進する細胞を含む。

特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は単一の胎盤から得られる。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は複数の胎盤から得られる。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は胎盤潅流液から得られる。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、前記胎盤から前記胎盤を潅流用溶液で潅流することによって得られる。より特定の実施態様において、前記潅流用溶液は、プロテアーゼ又はムコ多糖加水分解酵素を含む。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、胎盤又は胎盤の一部の物理的粉砕により得られる。より特定の実施態様において、前記の物理的粉砕は、前記胎盤をプロテアーゼ又はムコ多糖加水分解酵素と接触させることを含む。さらにより特定の実施態様において、前記プロテアーゼは、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、コラゲナーゼIV)、トリプシン(例えば、トリプシン-EDTA)、エラスターゼ、ディスパーゼ、又はこれらの組合せである。別のさらにより特定の実施態様において、前記ムコ多糖加水分解酵素は、ヒアルロニダーゼである。

別の特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は臍帯血由来幹細胞である。より特定の実施態様において、前記臍帯血由来細胞は造血幹細胞である。別のより特定の実施態様において、前記臍帯血由来細胞は非造血幹細胞である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は懸濁液状態で組み合わされる。別の特定の実施態様において、該方法は、前記組合せに生物活性分子を添加することをさらに含む。より特定の実施態様において、前記生物活性分子はサイトカイン又は増殖因子である。

本発明は、また、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞からなるいくつかの細胞をインビトロで含む組合せ幹細胞集団を提供し、ここで、前記組合せ幹細胞集団は、コロニー形成単位の形成を可能にする時間及び条件下で培養すると、組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は幹細胞集団中の細胞数と同数の第2供給源由来幹細胞の単独と比べて、より多数のコロニー形成単位を産生する。本発明は、さらに、インビトロでいくつかの胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を含む組合せ幹細胞集団を提供し、ここで、前記組合せ幹細胞集団の移植は、組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の前記胎盤幹細胞又は組合せ幹細胞集団中細胞数と同数の第2供給源由来幹細胞の単独での移植と比べて、前記幹細胞の生着を高める。別の特定の実施態様において、組合せ幹細胞集団は、コロニー形成単位の形成を可能にする条件下で培養した場合に、複数の比率の中で最も多数のコロニー形成単位を産生する比率で前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞を含む。特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、臍帯血幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、又は間葉系幹細胞である。より特定の実施態様において、前記造血幹細胞は臍帯血の造血幹細胞である。別のより特定の実施態様において、前記造血幹細胞はCD34⁺細胞である。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34⁺細胞を含む。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34^-細胞を含む。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT4⁺又はABC-p⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34⁺である細胞及びOCT4⁺又はABC-p⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、赤血球細胞及び細胞破片を実質的に欠く胎盤潅流液中に含まれる。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、胎盤潅流液から単離される胎盤幹細胞を含むか、該胎盤幹細胞である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、胎盤潅流液からの全有核細胞中に含まれる。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、胎盤潅流液から得られる細胞集団中に含まれる。別の特定の実施態様において、前記組成物は、酵素で消化された胎盤組織から単離される胎盤細胞を含む。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞は、同一個体から得られる。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞は、異なる個体から得られる。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は複数の胎盤に由来する。別の特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、複数の個体から得られる。

別の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団中の胎盤幹細胞は、CD34⁺細胞、例えば、CD34⁺CD38⁺細胞及び/又はCD34⁺CD38^-細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、マーカーCD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105の中の1種以上を発現し、且つマーカーCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4の中の1種以上を欠く細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105に対して陽性であり、且つCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4に対して陰性である細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、マーカーCD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73及びCD105の中の1種以上を含み、且つマーカーCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4の中の1種以上を欠く細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73及びCD105に対して陽性であり、且つCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4に対して陰性である細胞を含む。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34^-細胞を含む。特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34^-CD38^-胎盤幹細胞である。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4⁺又はABC-p⁺である。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4⁺及びABC-p⁺である。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD33、CD44、CD73、CD105、CD117及びCD133に対して陽性であり、且つCD34又はCD45に対して陰性である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-ABC⁺である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-ABC^-である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-DR⁺である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-DR^-である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200⁺及びOCT-4⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞集団を培養した場合に、前記胎盤細胞集団における胚様体の形成を促進する細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、OCT-4⁺であり、前記集団を、胚様体の形成を可能にする条件下で前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞集団を培養した場合に、前記胎盤細胞集団における胚様体の形成を促進する細胞を含む。

別の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団中の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)に対して陽性であるCD34⁺細胞を含む。このような細胞は、ALDHアッセイにおいて検出可能なレベルのALDH活性を示す。したがって、種々の実施態様において、本発明の組合せ幹細胞集団は、CD34⁺幹細胞を含み、そこで、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は少なくとも95%の幹細胞がADLH⁺である。

本発明は、また、医薬として許容し得る担体中に、組合せ幹細胞集団、例えば、胎盤潅流液、胎盤酵素消化物、又はそれらに由来する胎盤幹細胞を、臍帯血又は臍帯血由来幹細胞と組み合わされて含む医薬組成物を提供する。種々の特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団中の胎盤幹細胞は、単一ドナー又は複数のドナーから得ることができ;第2供給源由来幹細胞は、単一ドナー又は複数のドナーから得ることができ;或いは胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞の両方を単一ドナー又は複数のドナーから得ることができる。本発明の方法で有用な組合せ幹細胞集団は、意図した被移植者に対して部分的又は完全にHLA非適合性である幹細胞集団、及び意図した被移植者に対して完全にHLA適合性である幹細胞又は前駆細胞集団を含むことができる。

組合せ幹細胞集団、例えば、最適比率の胎盤潅流液又は胎盤潅流液由来幹及び/又は前駆細胞で補足された臍帯血は、予防、治療及び診断上の使用を含む多くの用途を有する。本発明の一実施態様において、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を含む組合せ幹細胞集団は、組織及び器官を更新及び再形成し、それによって病気にかかった組織、器官又はこれらの部分を置き換え且つ修復するのに使用される。別の実施態様において、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を含む組合せ幹細胞集団は、部分的又は完全な骨髄除去を受けた個体における造血の再確立を促進するのに使用される。別の実施態様において、組合せ幹細胞集団は、致死的又は致死に近い線量の放射線に曝露された個体における造血の再確立を促進するのに使用される。

本発明は、また、個体にある数の胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞とをある比率で移植することを含む、組合せ幹細胞集団の投与による移植方法及び移植を必要とする前記個体を治療する方法を提供し、ここで、前記組合せ幹細胞集団は、組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の第2供給源由来幹細胞の単独を移植することと比べて、改善された生着を示す。より特定の実施態様において、前記幹細胞集団の移植は、幹細胞を必要とする個体の生着を、組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の第2供給源由来幹細胞の単独を移植することに比べて、移植後の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21日の間又はその時点で改善する。別のより特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、幹細胞を必要とする個体における生着を、移植後の21日以降に改善する。

より特定の実施態様において、前記比率は、コロニー形成単位の形成を可能にする条件下で、前記細胞総数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独に比べてインビトロでより多数のコロニー形成単位を産生する、前記細胞総数中での比率である。別のより特定の実施態様において、前記比率は、コロニー形成単位の形成を可能にする条件下にインビトロで組み合わせた場合に、胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞との複数の比率の中で、最も多数のコロニー形成単位を産生する比率である。すなわち、Xが胎盤幹細胞+第2供給源由来幹細胞の個数であるなら、このような実施態様において、胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する該比率は、X個の胎盤幹細胞単独又はX個の第2供給源由来幹細胞単独に比べて、より多数のコロニー形成単位をインビトロで産生する。

本発明は、さらに、本発明の組合せ幹細胞集団を製造する際に使用するための、HLAで特徴付けられた胎盤由来幹細胞バンクの集合を提供する。一実施態様において、本発明は、複数単位の胎盤由来幹細胞から構成される幹細胞バンクを提供し、ここで、前記胎盤由来幹細胞は少なくとも1つのHLAマーカーで識別される。特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞は胎盤潅流液から単離される。別の特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞は、胎盤潅流液から単離される有核細胞の集団中に含まれる。別の特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞はCD34⁺幹細胞である。別の特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞は、CD73又はCD105に対して陽性であるか、或いは抗体SH2、SH3又はSH4によって結合する。別の特定の実施態様において、前記幹細胞バンクは、さらに、複数単位の胎盤血又は臍帯血から構成される。別の特定の実施態様において、前記複数単位の胎盤血又は臍帯血の中の少なくとも1つの単位は、前記複数単位の胎盤由来幹細胞の中の1つによって共有されるHLAマーカーによって識別される。別の特定の実施態様において、前記複数単位の胎盤血又は臍帯血中の大部分の単位は、前記複数単位の胎盤由来幹細胞中の大部分の単位によって共有されるHLAマーカーによって識別される。

(3.1 定義)
本明細書中で使用する場合、用語「採血された」又は「採血」は、胎盤に関して使用する場合、胎盤から実質上すべての臍帯血を取り出す及び/又は抜き取ることを指す。
本明細書中で使用する場合、「継代」は、細胞培養に関して、ある培養物からの複数細胞のアリコートを別の容器中に等分して新たな細胞培養を開始することを意味する。典型的には、継代することは、ある容器中のある培養物から例えば10⁴〜10⁵個の細胞を別の容器中の新鮮な培地中に等分することを含む。細胞は、典型的には、細胞培養物が集密に達する場合に、すなわち、接着細胞の単層が、増殖に利用できる全領域に渡って単一層を形成する場合に継代される。

本明細書中で使用する場合、用語「潅流する」又は「潅流」は、複数の胎盤細胞を採集するのに十分な力を用いて流体を胎盤の脈管構造を通過させる行為を指す。本明細書中で使用する場合、用語「胎盤潅流液」は、潅流中に胎盤から採集された細胞を含むその流体の胎盤通過に伴って採集された流体を指す。
本明細書中で使用する場合、用語「胎盤血」及び「臍帯血」は同意である。
本明細書中で使用する場合、用語「胎盤幹細胞」及び「胎盤由来幹細胞」は同意である。

本明細書中で使用する場合、用語「胎盤幹細胞」は、組織形態、細胞表面マーカーなどとは無関係に、哺乳動物の胎盤又はその部分(例えば、羊膜、漿膜など)から得られる又は由来する幹細胞を指すが、栄養膜を包含しない。該表現は、胎盤から、例えば、胎盤潅流液中の胎盤細胞集団又は消化された胎盤組織(消化物)の一部として直接的に得られる幹細胞、或いは1回以上増殖(expanded)及び/又は継代した胎盤細胞集団の一部である幹細胞を包含する。しかし、該用語は、別の組織、例えば、胎盤血又は臍帯血からのみ由来する幹細胞を包含しない。胎盤は、例えば、別個のマーカー集合を有し、それによって互いに区別できる幹細胞集団を含む。

本明細書中で使用する場合、用語「陽性」は、幹細胞マーカーに関して、該マーカーが、参照の非幹細胞、例えば繊維芽細胞中での前記マーカーの量又は濃度に比べて、検出可能なより多量又は検出可能なより高濃度で存在することを意味する。より一般的には、細胞は、該細胞中又は細胞上のそのマーカーの存在に基づいて、該細胞を1種以上の他の細胞型から区別できる場合に、該マーカーに対して「陽性」である。
本明細書中で使用する場合、「第2供給源由来幹細胞」は、哺乳動物の胎盤以外の供給源からの任意の哺乳動物幹細胞(前駆細胞を含む)を意味する。
本明細書中で使用する場合、「幹細胞」は、幹細胞及び前駆細胞を包含する。

本明細書中で使用する場合、用語「単位」は、臍帯血又は胎盤血に適用するなら、単一ドナーからの個々の血液採集物、或いはこのような1つの採集物から得ることのできる有核細胞又は幹細胞を指す。典型的には、単一ドナーからの血液量は、約50mL〜約150mLの範囲である。用語「単位」は、胎盤潅流液に適用するなら、ある単一の胎盤から胎盤幹及び前駆細胞を採集するのに使用される潅流流体の容積、又はこのようなある容積の潅流溶液から得ることのできる幹細胞を意味する。1単位の胎盤潅流液の容積は、典型的には約100mL〜500mLから約1000mLである。

(5. 発明の詳細な説明)
本発明は、ある細胞総数の中での、(1)胎盤幹細胞、例えば、ヒト胎盤潅流液中の胎盤幹細胞、胎盤酵素消化物中の胎盤幹細胞、単離された胎盤幹及び/又は前駆細胞などと(2)第2供給源由来幹細胞との組合せを提供し、ここで、前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、該組合せ中に、前記細胞総数に等しい胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独によって産生されるコロニー形成単位の数に比較して、より多数のコロニー形成単位を産生する比率で存在する。本発明は、さらに、前記組合せ中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は前記組合せ中の細胞数と同数の第2供給源由来幹細胞の単独によって産生されるコロニー形成単位の数に比較してインビボでの生着を高める、胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞との組合せを提供する。本発明は、さらに、このような比率、及びこのような組合せを確定する方法、及び該組合せ幹細胞集団の使用方法を提供する。

(5.1 胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞との組合せの最適化)
(5.1.1 インビトロアッセイ)
本発明は、前記組合せ中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹若しくは前駆細胞に比較して改善された生着可能性を有する、胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞との組合せを確定するためのインビトロでの共存培養方法を提供する。かくして、インビトロでの共存培養アッセイは、コロニー形成単位及び生着の数を細胞数に依存しない方式で改善する、胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定する。

一実施態様において、例えば、本発明は、コロニー形成単位の形成を可能にする時間及び条件下で胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を一緒に培養した場合に、前記細胞総数中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独に比べて、より多数のコロニー形成単位を産生する、前記細胞総数中での胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定することを含む、胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定する方法を提供する。別の実施態様において、いくつかの比率を比較した場合に、本発明は、コロニー形成単位の形成を可能にするのに十分な時間及び条件下で前記胎盤幹細胞集団をインビトロで前記第2供給源由来幹細胞集団と複数の比率で接触させること、及び前記複数の比率の中で最も多数のコロニー形成単位をもたらす比率を確定すること含む、細胞総数中での胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞又は前駆細胞との比率を確定する方法を提供する。特定の実施態様において、前記比率は、前記細胞総数中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独による生着に比較して、被移植者中での生着を改善する。より特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、幹細胞を必要とする個体における生着を、移植後少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21日間改善する。別のより特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、幹細胞を必要とする個体における生着を、移植後21日を超える時点で改善する。

(5.1.1.1 胎盤由来幹細胞)
本発明の方法及び組成物で有用な胎盤由来幹細胞には、例えば、胎盤からの胚様細胞、多能性細胞、多型潜在性細胞、行き先の決まった(committed)前駆細胞、造血前駆細胞、及び間葉系様幹細胞が含まれる。一実施態様において、胎盤由来幹細胞は、胎盤潅流液中に含まれ、或いは胎盤潅流液から得られる。

本発明の方法で使用される胎盤由来幹細胞は、単一の胎盤から、又は複数の胎盤から得ることができ、且つ任意の方法で得ることができる。胎盤由来幹細胞は、そのそれぞれの開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2002/0123141号及び2003/0032179号に開示されているように、例えば、潅流によって得ることができる。このような潅流は、潅流流体を、胎盤脈管構造を強制的に通過させ、且つ胎盤、典型的には母側から滲出する潅流流体を、胎盤を含むパン中に採集するパン法による潅流でよい。潅流は、潅流流体を通過させ、胎盤の胎児脈管構造のみから採集する閉回路潅流でもよい。特定の実施態様において、このような潅流は、連続的でよく、すなわち、胎盤を通過し、且つ複数の胎盤細胞を含む潅流流体を、胎盤細胞の単離に先立ってもう1回又は複数回通過させてもよい。

胎盤由来幹細胞は、例えば、胎盤の多細胞構造を破壊するためのプロテアーゼ及び/又はその他の組織破壊酵素を使用する、胎盤の物理的又は酵素的破壊によって得ることもできる。このようなプロテアーゼとしては、中性プロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、エラスターゼなどを挙げることができる。胎盤幹細胞は、例えば、ムコ多糖加水分解酵素、例えばヒアルロニダーゼを使用する、胎盤の物理的破壊によって得ることもできる。

本発明の単離され潅流される胎盤は、CD34⁺幹細胞、例えば、CD34⁺CD38^-幹細胞、例えば、CD34⁺、CD38^-、lin^-幹細胞、及びCD34^-幹細胞、例えばCD34^-CD38⁺幹細胞に富む大量の幹細胞の供給源を提供する。胎盤からの最初の血液採集は、主にCD34⁺CD38⁺造血前駆細胞を含む臍帯血と呼ばれる。分娩後潅流の最初の24時間以内に、多数(例えば、1×10⁵〜約2×10⁷個)のCD34⁺CD38^-造血前駆細胞を、胎盤から高濃度のCD34^-CD38⁺細胞と一緒に単離できる。約24時間の潅流の後に、多数(例えば、100万〜1000万個)のCD34^-CD38^-細胞を、胎盤から前述の細胞と一緒に単離できる。24時間又はそれ以上潅流された単離胎盤は、CD34^-CD38^-幹細胞に富む大量の幹細胞の供給源を提供する。

別の実施態様において、本発明の組合せ幹細胞集団は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)に対して陽性であるCD34⁺胎盤幹細胞を含む。このような細胞は、ALDHアッセイで検出可能なレベルのALDH活性を示す。このようなアッセイは、当技術分野で周知である(例えば、Bostian及びBettsの論文、Biochem.J.,173,787(1978)を参照されたい)。特定の実施態様において、前記ALDHアッセイは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとしてALDEFLUOR(登録商標)(Aldagen社、Ashland, Oregon(オレゴン)州)を使用する。したがって、種々の実施態様において、本発明の組合せ幹細胞集団は、CD34⁺幹細胞を含み、ここで該CD34⁺幹細胞の少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は少なくとも95%はALDH⁺である。

ヒト胎盤幹細胞の少なくとも1つの部類は、胚性幹又は生殖細胞の特性を有する。例えば、この部類の幹細胞は、SSEA3^-(時期特異的胎児性抗原3)、SSEA4^-、OCT-4⁺(幹細胞転写因子)及びABC-p⁺(ATP結合カセット(ABC)輸送体タンパク質)、まだ分化を受けていない多能性幹細胞によって提示されるマーカープロフィールである。したがって、本発明の方法及び組成物は、例えば、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺又はABC-p⁺である非胚性胎盤幹細胞を使用又は含むことができる。好ましくは、胎盤幹細胞は、OCT-4⁺ABC-p⁺であり、さらにより好ましくはSSEA3^-SSEA4^-OCT-4⁺ABC-p⁺である。別の実施態様において、本発明は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105の中の少なくとも1つに対して陽性であるか、或いはCD34、CD38又はCD45の中の少なくとも1つに対して陰性である胎盤幹細胞の使用を包含する。別の実施態様において、本発明の方法及び組成物は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105を有するかそれらに対して陽性であり、且つCD34、CD38又はCD45を欠くかそれらに対して陰性である胎盤幹細胞を使用又は含むことができる。別の実施態様において、本発明の方法及び組成物は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105の中の少なくとも1つに対して陽性であるか、或いはCD34、CD38又はCD45の中の少なくとも1つに対して陰性である胎盤幹細胞を使用又は含むことができる。別の実施態様において、本発明の方法及び組成物は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105を有するかそれらに対して陽性であり、且つCD34、CD38又はCD45を欠くかそれらに対して陰性である胎盤幹細胞の使用を包含する。

一実施態様において、本発明の方法及び組成物で使用される胎盤幹細胞は、マーカーCD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD105(SH2)、CD73(SH3、SH4)、OCT-4及び/又はABC-pの存在、並びに/或いはマーカーCD34、CD38、CD45、SSEA3又はSSEA4の不在によって同定される。特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺及びABC-p⁺である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺である。この文脈で、「SH2⁺」、「SH3⁺」及び「SH4⁺」は、幹細胞がそれぞれ抗体SH2、SH3又はSH4に結合されることを意味する。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200⁺及びOCT-4⁺である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺であり、胚様体の形成を可能にする条件下で胎盤幹細胞集団を培養すると、前記幹細胞を含む単離された該胎盤細胞集団中での胚様体の形成を促進する。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、OCT-4+であり、胚様体の形成を可能にする条件下で胎盤幹細胞集団を培養すると、前記幹細胞を含む単離された該胎盤細胞集団中での胚様体の形成を促進する。本明細書中で使用する場合、「胚様体」は、接着幹細胞層から現われる分化中の、及び分化済みの細胞の三次元クラスターをいう。
別の実施態様において、ヒト胎盤幹細胞は、MHCクラス2抗原を発現しない。

胎盤潅流液由来幹細胞の集団は、一実施態様において、栄養芽細胞を含む。

細胞マーカー、例えば、幹細胞マーカー及び細胞表面マーカーは、当技術分野で周知の方法により、例えば、洗浄すること及び適切なフルオロフォアで標識された抗-細胞表面マーカー抗体で染色することによる蛍光フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞分類(FACS)分析によって定形的に測定できる。例えば、CD34又はCD38の存在を判定するために、細胞を、PBSで洗浄し、次いで抗-CD34フィコエリトリン及び抗-CD38イソチオシアン酸フルオレセイン(Becton Dickinson社、Mountain View、CA(カリフォルニア)州)で二重染色できる。次いで、標準的なフローサイトメーターを使用して細胞を分析する。別法として、標準的方法を使用して細胞内マーカーを試験することもできる。特定のマーカーに対する抗体/フルオロフォアの組合せには、限定はされないが、HLA-G(Serotec社、Raleigh、North Caroline(ノースカロライナ)州から入手できる)、CD10(BD Immunocytometry Systems社、San Jose、California(カリフォルニア)州から入手できる)、CD44(BD Biosciences Pharmingen社、San Jose、California(カリフォルニア)州から入手できる)、及びCD105(R & D Systems社、Minneapolis、Minnesota(ミネソタ)州から入手できる)対するイソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)複合モノクロナール抗体;CD44、CD200、CD117及びCD13に対するフィコエリトリン(PE)複合モノクロナール抗体(BD Biosciences Pharmingen社);CD33及びCD10に対するフィコエリトリン-Cy7(PECy7)複合モノクロナール抗体(BD Biosciences Pharmingen社);CD38に対するアロフィコシアニン(APC)複合ストレプトアビジン及びモノクロナール抗体(BD Biosciences Pharmingen社);並びにビオチン化CD90(BD Biosciences Pharmingen社)が含まれる。使用できるその他の抗体/標識の組合せには、限定はされないが、CD133-APC(Miltenyi社)、KDR-ビオチン(CD309、Abcam社)、サイトケラチンK-Fitc(Sigma社又はDako社)、HLA ABC-Fitc(BD社)、HLA DRDQDP-PE(BD社)、β-2-ミクログロブリン-PE(BD社)、CD80-PE(BD社)及びCD86-APC(BD社)、CD45-PerCP(ペリジンクロロフィルタンパク質)；CD44-PE；CD19-PE；CD10-F(フルオレセイン)；HLA-G-F及び7-アミノ-アクチノマイシン-D(7-AAD)；HLA-ABC-F；などが含まれる。

胎盤幹細胞、例えば、胎盤潅流液中に含まれる胎盤幹細胞は、採集後直ちに使用することもできるが、アッセイ又は個体への投与前に、ある時間、組合せ幹細胞集団の状態で培養することもできる。例えば、一実施態様では、幹細胞を、ノッチ(Notch)アゴニスト、例えば、ノッチタンパク質の細胞内領域から本質的にはなるノッチタンパク質の欠失形態、又はデルタタンパク質を含む培地中で培養できる。米国特許出願公開第2004/0067583号を参照されたい。

(5.1.1.2 第2供給源由来幹細胞)
本明細書に記載の方法及び組成物は、胎盤幹細胞を、第2供給源由来の幹細胞、すなわち哺乳動物胎盤以外の任意の供給源からの幹細胞と組み合わせて使用する。第2供給源由来幹細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、成体幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、非造血幹細胞、骨髄由来幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞、眼幹細胞、上皮幹細胞、内皮幹細胞、肝幹細胞、肺幹細胞、筋幹細胞、腸幹細胞などの、1種以上のタイプの幹細胞を含むことができる。第2供給源由来幹細胞は、第2の非胎盤性供給源から単離される幹細胞でよく、或いは幹細胞を含む組織でよい。胎盤について言えば、幹細胞は、該幹細胞を含む器官(群)の潅流によって、或いは該幹細胞を含む組織の破壊及び/又は器官(群)の酵素的消化によって単離できる。第2供給源由来幹細胞は、例えば、臍帯血のみに由来する、又は羊膜液のみに由来する幹細胞でよい。

第2供給源由来幹細胞は、関連する組織のサンプルを準備すること、及び1種以上の細胞表面マーカーを使用して該組織から幹細胞を単離することによって得ることができる。例えば、造血幹細胞は、血液(例えば、末梢血、胎盤血、臍帯血)又は骨髄から、血液又は骨髄のサンプルを得ること、該血液又は骨髄から単核細胞を単離すること、及び該単離された単核細胞からCD34+細胞を分離することによって得ることができる。このような分離は、例えば、アフェレシス(apherisis)に続いて磁気ビーズ、又は細胞表面マーカー例えばCD34若しくはCD200に対する1種以上の抗体を含むカラムを使用する分離を利用する当技術分野で定形的な方法;蛍光活性化細胞分類法(FACS)；などによって完遂できる。血液の場合、幹細胞は、血液、例えば、末梢血、胎盤血、臍帯血などからの全有核細胞(TNC)集団で準備できる。

他の組織からの幹細胞も、類似の方式で単離できる。間葉系幹細胞は、例えば、骨髄からCD73、CD105及び/又はCD45に対して陽性である細胞を単離することによって単離できる(例えば、米国特許第6387367号を参照されたい)。眼(角膜縁)幹細胞は、角膜から、角膜細胞を得ること及びSSEA-4⁺細胞を単離することによって得ることができる(例えば、米国特許出願公開第2005/0186672号を参照されたい)。肝幹細胞は、肝臓、特に胎児性肝臓サンプルから、CD14、CD34、CD38、ICAM、CD45、CD117、グリコホリンA、コネキシン32、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、コラーゲンI、コラーゲンII、コラーゲンIII、コラーゲンIV、又はこれらの組合せを発現する細胞を選択することによって得ることができる(例えば、米国特許出願公開第2005/0148072号を参照されたい)。心筋幹細胞は、心筋組織から、他の造血細胞マーカーを発現しないCD34⁺CD45^-を選択することによって得ることができる(例えば、米国特許出願公開第2005/0079606号を参照されたい)。心筋幹細胞は、心筋組織から、c-kit^-CD31⁺CD38⁺細胞を選択することによって単離できる(例えば、米国特許出願公開第2004/0126879号を参照されたい)。幹細胞の単離は、さらに、その他既知の特性又はマーカーを使用して完遂できる。

一実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、臍帯血幹細胞である。特定の実施態様において、臍帯血幹細胞は、CD34⁺幹細胞、例えば、CD34⁺、CD38⁺幹細胞、CD34⁺、CD38^-幹細胞、CD34⁺、CD38^-、lin^-幹細胞などである。特定の実施態様において、CD34⁺第2供給源由来幹細胞は、ALDH⁺である。本発明の方法では、臍帯血から得られる臍帯血自体或いは幹及び/又は前駆細胞を使用できる。特定の実施態様において、前記臍帯血由来細胞は造血幹細胞を含み、ここで、組合せ幹細胞集団は、造血系生着のために使用できるはずである。第2供給源由来幹細胞は、単一のドナーから、又は複数のドナーから等量又は等しくない量で得ることができる。複数の第2供給源(すなわち、非胎盤)由来幹細胞を、胎盤幹細胞と組み合わせて、本発明の方法及び組成物のために使用できる。

第2供給源由来幹細胞、例えば第2供給源由来造血幹細胞は、採集後直ちに使用することもできるが、アッセイ又は個体への投与前に、ある時間、組合せ幹細胞集団の状態で培養することもできる。例えば、一実施態様では、幹細胞を、ノッチ(Notch)アゴニスト、例えば、ノッチタンパク質の細胞内領域から本質的にはなるノッチタンパク質の欠失形態、又はデルタタンパク質を含む培地中で培養できる。米国特許出願公開第2004/0067583号を参照されたい。

(5.1.1.3アッセイパラメーター)
胎盤幹細胞集団及び第2供給源由来幹細胞集団が得られたら、該細胞を、インビトロでの共存培養、又はコロニー形成アッセイの際に混合し、特定組合せの幹細胞数が、前記組合せ中の細胞数と同数の胎盤幹細胞数又は第2供給源由来幹細胞の単独に比べて、より多数のコロニー形成単位を産生するかどうかを判定することができる。同じ細胞数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独に比べて、より多くのコロニー形成単位を生じさせる比率での胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞との任意のこのような組合せは、本発明の組合せ幹細胞集団として確定される。

組合せ幹細胞集団の確定には、そのアッセイが、胎盤由来及び第2供給源由来幹細胞の増殖及び分化を可能にする限り、当技術分野で一般的に使用され周知である任意のコロニー形成単位アッセイ、例えば、StemCell Technologies社によって提供されるコロニー形成アッセイを使用できる。このようなアッセイには、例えば、MESENCULT(商標)培地(StemCell Technologies社、Vancouver British Columbia(ブリティッシュコロンビア)州)を使用できる。組合せ幹細胞集団の確定には、新たに調製された又は凍結在庫品から解凍された細胞、或いは両方の細胞を使用できる。好ましくは、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞の両方とも、共存培養に向けて混合される場合には、懸濁液の状態である。胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を、その生存率、増殖能、及び寿命について、トリパンブルー排除アッセイ、フルオレセインジアセテート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ(生存率を評価するため);及びチミジン取込みアッセイ、MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)細胞増殖アッセイ(増殖を評価するため)などの、当技術分野で周知の標準的な技術を使用して評価できる。寿命は、増殖(expanded)培養における***回数(population doubling)の最大数を測定することなど、当技術分野で周知の方法で測定できる。

インビトロ法の一実施態様において、胎盤幹細胞及び臍帯血由来幹細胞を使用するコロニー形成単位アッセイは、次のように行われる。新たな又は解凍したHLA/ドナー適合性胎盤潅流液及び臍帯血単位を得て、それぞれの中の全有核細胞数をヘマサイトメーターで測定する。解凍した単位を使用する場合には、臍帯血サンプルをヘタスターチで分離することができ、胎盤潅流液の単位は、好ましくはフィコールで分離される。各供給源からの有核細胞の少量サンプルを、共存培養において2種以上の比率で、懸濁状態で一緒に播種し、増殖させる。共存培養は、胎盤細胞の第2供給源由来幹細胞に対する1種以上の比率に関して例えば同じものを3回、例えば、35mmの皿中、適切な細胞培養培地(例えば、2〜10%のウシ胎児血清及び任意選択により1%Stemspanサイトカインカクテルで補足されたRPMI1640培地;Methocult GF⁺H4435培地など)中で実施できる。造血幹細胞は、GM-CSF、IL-3、IL-6、SCF及びflt-3リガンドを含む培養培地中で増殖できる。

共存培養アッセイに使用する容器は、幹細胞の組織培養に適しているのが好ましい。例えば、共存培養は、ガラス又はプラスチック製のペトリ皿、16穴プレート、32穴プレート、96穴プレート、128穴プレート中などで実施できる。典型的には、各共存培養において各供給源からの有核細胞の総数は、1×10⁴個から1×10⁶個まで変化する。細胞は、ミクロパターン化された配置の中で共存培養することもできる。米国特許第6221663号を参照されたい。

ある数の胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞とを含む細胞集団における胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を決定する場合、好ましい比率は、同一条件下で前記胎盤幹細胞数又は前記第2供給源由来幹細胞数によって生み出される単位に比べて、より多くのコロニー形成単位を生み出す任意の比率である。より好ましくは、該比率は、試験された他のすべての比率に比べて、より多数のコロニー形成単位を生み出す比率である。試験された比率の間の統計的有意性が望ましいが、必須ではない。より多数のコロニー形成単位は、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞の両方、主として胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞のみ、或いは主として第2供給源由来幹細胞又は第2供給源由来幹細胞のみに帰することができるか、或いはそれらに由来することができる。

組合せ幹細胞集団は、コロニー形成単位が形成されるのに十分な時間、典型的に10〜20日間培養される。増殖(expansion)中の細胞培養は、幹細胞又は前駆細胞培養の技術分野で周知の標準的プロトコールに従い、例えば、毎日の又は1日に2回の培地交換;加湿インキュベーター中、5%CO₂、約37℃での培養などを含む。10〜20日後、共存培養中のコロニー形成単位の数及び組織形態を測定する(例えば、造血幹細胞の場合、CFU-GM、CFU-L、CFU-M、CFU-G、CFU-DC、CFU-GEMM、CFU-Eの個数)。

共存培養アッセイの具体例において、胎盤潅流液からの有核細胞及び臍帯血からの有核細胞は、Methocult GF⁺H4435培地中、1:1、1:3及び3:1(1は、例えば1×10⁵個の細胞に相当)の比率で組み合わされる。次いで、共存培養物を組織培養で約14日間増殖させる。共存培養した細胞の組織形態及びコロニー形成単位の個数を測定する。最も多数のコロニー形成単位を提供する、2種の供給源からの有核細胞サンプルの比率を、最適比率と称し、該2つの単位、若しくは該単位の一方又は両方からの幹及び/又は前駆細胞を、幹細胞の移植を必要とする被移植者に投与するための最適比率で組み合わせる。このような最適比率は、同数の細胞を投与すると、どちらかの単位、或いはどちらかの単位からの幹及び/又は前駆細胞を単独で投与するのを超えるインビボでの優れた生着を提供する。

共存培養中に、胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞とを互いに直接又は関節的に接触させる。少なくとも、このことは、幹細胞の一方のタイプを、他のタイプの幹細胞が培養されていた培養培地とある期間接触させること、例えば、幹細胞の一方のタイプを、他のタイプの幹細胞で慣らされた培地と接触させることを含む。例えば、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を、コロニー形成単位の形成のための培養中、同一の物理的空間内、例えば、同一の培養皿又はマルチウェルプレート中のウェル内で一緒に培養できる。胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を、別個の物理的空間ではあるが共通の培養培地中で(例えば、膜で隔離された、又は培養培地がウェル間で能動的若しくは受動的に移動できるが、細胞は混合できないマルチウェルプレートの2つのウェル中で)培養することによって互いに接触させることもできる。別の実施態様において、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、別個の物理的空間内で、共通の培養培地を使用せず、一方の幹細胞培地からの培養培地の一部又は全部を他方の培地と交換することによって幹細胞を互いに接触させて培養することができる。別の実施態様において、共存培養中の細胞は、細胞を物理的に隔離するが、生体分子が2つの培養物間を拡散することを可能にする方式で培養される。例えば、米国特許第5665596号「細胞の共存培養のためのデバイス及び細胞培養におけるその使用方法(Device for Cell Co-culture and Method for Its Use in Culturing Cells)」を参照されたい。幹細胞の培養が別々である場合、別々で対をなした培養物中のコロニー形成単位の個数は、上記のように、比率の各再現、及び決定された最適比率について総計される。

方法に関する別の実施態様では、アッセイ中に幹細胞及び第2供給源由来幹細胞に生物活性分子が添加され、ある総細胞数の場合に、前記組合せ中の前記細胞総数と同数の胎盤幹細胞数又は第2供給源由来幹細胞数の単独と比べて、より多くのコロニー形成単位、又は高められた生着をもたらす胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率が確定される。このような生物活性分子は、50kDa、30kDa、20kDa、10kDa、5kDa、3kDa、2kDa、1kDa、500Da、300Da、200Da、100Da未満又はそれより小さな小型有機分子でよい。特定の実施態様において、前記小型有機分子は、合成又は非天然性であり、すなわち、天然供給源に由来しない。別の特定の実施態様において、前記生物活性分子は、サイトカイン又は増殖因子である。共存培養に添加できる生物活性分子には、限定はされないが、Ca²⁺、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角質細胞増殖因子(KGF)、TGF-β、サイトカイン(例えば、IL-1α、IL-1β、IFN-γ、TFN)、レチノイン酸、トランスフェリン、ホルモン(例えば、アンドロゲン、エストロゲン、インスリン、プロラクチン、トリヨードチロニン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン)、酪酸ナトリウム、TPA、DMSO、NMF、DMF、マトリックス要素(例えば、コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸、MATRIGEL(商標))、又はこれらの組合せなどの分化誘導剤が含まれる。分化抑制剤である生物活性分子、例えば、限定はされないがヒトDelta-1及びヒトSerrate-1ポリペプチド(2002年1月8日発行の「分化抑制ポリペプチド(Differentiation-suppressive polypeptide)」と題するSakanoらの米国特許第6337387号を参照されたい)、白血病阻害因子(LIF)、及び幹細胞因子などを添加できる。

共存培養に生物活性分子を添加する場合には、共存培養アッセイを使用して生着の陽性エフェクターを確定できる。したがって、一実施態様において、本発明は、組合せ幹細胞集団を前記生物活性分子と接触させることを含む、生着の陽性エフェクターである生物活性分子を確定する方法を提供し、ここで、前記生物活性分子は、前記組合せ幹細胞集団による生着が、前記生物活性分子と接触されていない組合せ幹細胞集団による生着と比較して検出可能なほど高められるなら、生着の陽性エフェクターとして確定される。別の実施態様において、本発明は、前記生物活性分子の存在下で胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞とを1種以上の比率で、インビトロで組み合わせること;前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞をコロニー形成単位を形成するのに十分な時間培養すること;前記1種以上の比率のそれぞれについてコロニー形成単位の個数を測定すること;及び前記1種以上の比率中の少なくとも1種について、前記生物活性分子の存在下におけるコロニー形成単位の個数が、前記生物活性分子の不在下におけるコロニー形成単位の個数に比べて、より多いかどうかを測定し、もし多いなら、前記生物活性分子を生着の陽性エフェクターとして確定すること；を含む、生着の陽性エフェクターを確定する方法を提供する。
インビトロアッセイを、任意の胎盤幹細胞集団及び第2供給源由来幹細胞集団に関して実施して、生着のための最適比率を決定できる。この態様では、インビトロでの共存培養アッセイを、移植に先立って幹細胞集団を特徴付けるための標準的、定型的方法として使用できる。

(5.1.2インビボアッセイ)
上記のインビトロでのアッセイ結果を、インビボでの生着アッセイを使用して確認できる。インビトロでのアッセイなしで、インビボでのアッセイを実施して、生着を最大にするような胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞との最適比率を決定することもできる。
インビボアッセイの一実施態様では、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を複数のモデル動物に移植し、生着するのに十分な時間(典型的には6〜10週間)を与える。続いて、動物を屠殺し、各動物における生着の度合いを少なくとも1つの組織について判定する。したがって、一実施態様において、本発明は、動物中に移植した場合に、前記細胞総数中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独の移植に比較して高められた生着をもたらす、前記細胞総数中での胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定することを含む、被移植者中での生着のための胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞又は前駆細胞との比率を確定する方法を提供する。別の実施態様において、胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する前記比率を確定することは、ある数の胎盤幹細胞数及び第2供給源由来幹細胞数を複数の動物に複数の比率で移植すること;前記動物の少なくとも1つの組織において前記複数の比率のそれぞれについて生着した細胞の個数を測定すること;及び前記複数の比率の中で最も多数の生着細胞をもたらす比率を確定すること；を含む。

インビトロアッセイの場合と同様、胎盤幹細胞は、任意の手段で得られる又は任意の使用可能な形態で存在する胎盤幹細胞でよい。例えば、胎盤幹細胞は、胎盤潅流液中に含まれてよく、又は胎盤潅流液から単離される全有核細胞中に含まれてよく、又は全有核細胞から単離される幹細胞の集団でよく、又は酵素で消化された胎盤組織中に含まれる胎盤幹細胞でよく、又は酵素で消化された胎盤組織から単離される胎盤幹細胞でよく、或いは培養中に増殖及び/又は継代された胎盤幹細胞などでよい。

インビボでの共存培養アッセイでは、任意の標準的なモデル動物を使用できる。好ましくは、モデル動物は、異種移植片の生着を容易に完遂できる動物である。マウス及びラットのような標準的な実験室用げっし動物などの小型動物は、生着を示すのに必要な幹細胞の投与量が少なくて済むので、好ましい。モデル動物は免疫不全であることが極めて好ましい。インビボアッセイで使用できる動物モデルには、限定はされないが、NOD/SCID(非肥満性糖尿病/重症複合型免疫不全)マウス(Hoganらの論文、Blood 90(1):85〜96(1997)を参照されたい);ベージュ/ヌード/x連鎖免疫不全(BNX)マウス(例えば、Kamal-Reidらの論文、Science 242:1706(1988)を参照されたい);SCIDマウス(例えば、Kamal-Reidらの論文、Science 246:1597(1989)を参照されたい)が含まれる。生着は、ヒツジ胎児などのその他の動物で完遂できる(例えば、Shimizuらの論文、Blood 91(10):3688〜3692(1998);Zanjaniらの論文、Int'l J.Hematol 63(3):179〜182(1996)を参照されたい)。

被移植動物からの組織中での生着細胞数の測定は、当技術分野で周知の任意の手段で完遂できる。例えば、生着細胞の検出は、生着細胞に特異的な核酸を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出することによって、又は生着細胞に特異的なタンパク質を、例えば、免疫組織化学によって検出することによって完遂できる。インビボでの生着の確認は、サンプル、例えば、移植後に被移植者から1つ以上の場所において1つ以上の時点で採取された生検標本の使用により判定できる。

一実施態様において、胎盤幹細胞及び/又は臍帯血由来幹細胞の生着の証明は、生検材料(例えば、骨髄吸引液又は末梢血サンプル)を採取すること、及びPCRを実施して生着を示唆する任意の非被移植者の遺伝子マーカーが存在するかどうかを判定することによって完遂できる。別の実施態様において、生着細胞の確認は、生着細胞によって発現されるマーカーを認識する1種以上の抗体を選択することによって完遂される。特定の実施態様において、生着される細胞は、ヒトであり、1種以上の抗体が、1種以上のヒト細胞マーカーを特異的に認識する。抗体を使用して、当技術分野で容認された任意の方法、例えば免疫組織化学的方法によってマーカーを検出できる。例えば、細胞表面マーカーの存在の判定は、非ヒト宿主動物の屠殺、所望の組織を得ること、該組織をパラフィン中又は類似のマトリックス中に固定及び包埋すること、該組織を薄く切断すること、続いて任意選択で染色すること、及び該組織を、マーカーを認識する1種以上の抗体と接触させることを含むことができる。同様の方式で、生着した幹細胞から分化できる細胞によって発現されるマーカーを認識する抗体を使用できる。例えば、胎盤幹細胞又は臍帯血由来幹細胞は、CD45及びビメンチンを発現する細胞に分化し、したがって、CD45及びビメンチンに対する抗体を使用して、生着している及び分化している幹細胞数を測定できる。宿主細胞マーカー、例えばマウス細胞表面マーカーに優先して例えばヒト細胞表面マーカーを認識する抗体は、当技術分野で周知である。

インビボ法の非制限的例において、複数のモデル動物、例えば、複数のMus musculus種のマウスに、ヒト胎盤幹細胞及び、例えば造血幹細胞を含む臍帯血から単離されたヒト有核細胞を複数の比率で移植する。数日〜数週間(すなわち、生着を可能にするのに十分な)の後、宿主動物を屠殺し、組織(例えば、脾臓、肺など)を調べ、CD45及び/又はビメンチンについて染色されている細胞数によって明示されるような生着したヒト細胞の近似数を測定する。CD45は、T-及びB-リンパ球、顆粒球、単球及びマクロファージを含む白血球に特異的なマーカーである。クローンT29/33(BioDesign社、Saco、Maine(メーン)州)などの特定のCD45抗体は、マウス抗原と交差反応しない。ビメンチンは、繊維芽細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、シュワン細胞、血管内皮細胞などの間葉系細胞に対するマーカーである。クローンV9(BioDesign、Saco、Maine(メーン)州)などの特定のビメンチン抗体は、マウス抗原と交差反応しない。したがって、これら2つのマーカーに対する抗体で染色すると、各種組織中での胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞の生着程度を一般的に確かめることができる。この例は、制約するものではなく、異なる抗体を使用してその他の細胞型の生着程度を判定することができる。長期生着モデルでは、一次生着動物、例えば、マウスから単離された骨髄細胞を二次生着モデル動物に移植できる。二次生着に関するアッセイは、上に挙げた通りであり、当業者に周知の方法が含まれる。

(5.2組合せ幹細胞集団)
本発明は、さらに、胎盤幹細胞(例えば胎盤幹細胞を含む胎盤潅流液からの細胞、例えば胎盤潅流液からの有核細胞)及び第2供給源由来幹細胞を含み、特定の細胞数の場合に、その胎盤幹細胞数又は第2供給源由来幹細胞数の単独に比べて、コロニー形成単位アッセイにおいて、より多数のコロニー形成単位を、又は被移植者における高められた生着をもたらす組合せ幹細胞組成物を提供する。上記方法で確定された組合せ幹細胞集団は、幹細胞供給源の特性、すなわち、例えば胎盤潅流液のある単位、臍帯血のある単位中に含まれる生着可能な細胞数などをベースにした生着の高められた幹細胞の組合せを代表する。

したがって、一実施態様において、本発明は、ある数の胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞をある比率で含む組合せ幹細胞組成物を包含し、ここで該組成物からの幹細胞は、前記組成物中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独に比較して、改善された生着を示す。特定の実施態様において、該比率は、コロニー形成単位の形成を可能にする時間及び条件下にインビトロで胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞とを複数の比率で混合すること;及び前記複数の比率の中で最も多数のコロニー形成単位を産生する比率を確定すること；によって確定される。より特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞又は前駆細胞は、臍帯血幹細胞又は前駆細胞、骨髄幹細胞又は前駆細胞、造血幹細胞又は前駆細胞、或いは間葉系幹細胞又は前駆細胞である。別のより特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞又は前駆細胞は、造血前駆細胞である。さらにより特定の実施態様において、前記造血幹細胞は、臍帯血造血幹細胞である。別のさらにより特定の実施態様において、前記造血細胞はCD34⁺細胞である。

別のより特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34⁺細胞、例えば、CD34⁺CD38⁺細胞及び/又はCD34⁺CD38^-細胞を含む。特定の実施態様において、前記CD34⁺CD38^-細胞はCD34⁺CD38^-lin^-幹細胞を含む。別の特定の実施態様において、前記CD34⁺胎盤幹細胞は、ALDH⁺である細胞、すなわちCD34⁺、ALDH⁺胎盤幹細胞を含む。
別のより特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4⁺又はABC-p⁺である。別のより特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、OCT-4⁺ABC-p⁺である細胞を含む。別のより特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34+である細胞、及びOCT-4⁺ABC-p⁺である細胞を含む。別のより特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、赤血球細胞及び細胞破片を実質的に欠く胎盤潅流液中に含まれる。別のより特定の実施態様において、前記組成物は、胎盤潅流液から単離された胎盤幹細胞を含む。

別の実施態様において、胎盤幹細胞は、マーカーCD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105の中の1種以上を発現し、且つマーカーCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4の中の1種以上を欠く細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73又はCD105に対して陽性であり、且つCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4に対して陰性である細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、マーカーCD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73及びCD105の中の1種以上を含み、且つマーカーCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4の中の1種以上を欠く細胞を含む。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、CD73及びCD105に対して陽性であり、且つCD34、CD38、CD45、SSEA3及びSSEA4に対して陰性である細胞を含む。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞はCD34^-細胞を含む。特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34^-CD38^-胎盤幹細胞を含む。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD33、CD44、CD73、CD105、CD117及びCD133の中の少なくとも1種に対して陽性であり、且つCD34又はCD45の中の少なくとも1種に対して陰性である細胞を含む。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD10、CD29、CD33、CD44、CD73、CD105、CD117及びCD133に対して陽性であり、且つCD34又はCD45に対して陰性である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-ABC⁺である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-ABC^-である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-DR⁺である細胞を含む。より特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、HLA-DR^-である細胞を含む。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD200⁺又はHLA-G⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD200⁺及びOCT-4⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺であり、且つ胚様体の形成を可能にする条件下で前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団を培養すると、前記集団中での胚様体の形成を促進する細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である細胞を含む。別の特定の実施態様において、胎盤幹細胞は、OCT-4+であり、且つ胚様体の形成を可能にする条件下で前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団を培養すると、前記集団中での胚様体の形成を促進する細胞を含む。

別の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、臍帯血から得られる幹細胞である。
本発明の組合せ幹細胞集団において、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、完全にHLA適合性でよく、すなわちそれらは同一個体から得ることができる。別の実施態様において、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、HLA不適合性でよく、すなわちそれらは異なる個体から得ることができる。臍帯血又は臍帯血由来幹細胞を含む組合せ幹細胞集団の場合、該組合せは、意図した被移植者に対してHLA適合性、部分的HLA適合性、又はHLA不適合性である幹細胞を含むこともできる。非臍帯血幹細胞を含む組合せ幹細胞集団の場合、少なくとも第2供給源由来幹細胞が、意図した被移植者に対してHLA適合性又は部分的にHLA適合性であることが好ましい。

種々の実施態様において、胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率は、各集団中での全有核細胞の個数を比較して、又は各集団中での幹細胞の総数を比較して、約100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:500、1:1,000、1:2,000、1:5,000、1:10,000、1:20,000、1:50,000、1:100,000、1:500,000、1:1,000,000、1:2,000,000、1:5,000,000、1:10,000,000、1:20,000,000、1:50,000,000、又は約1:100,000,000でよい。好ましい実施態様において、胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率は、約1:10〜約10:1でよい。他の好ましい実施態様において、胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率は、約3:1〜約1:3でよい。

本発明の組合せ幹細胞集団は、治療上有効な量の胎盤幹細胞、第2供給源由来幹細胞、又はその両方を含むことができる。本発明の組合せ幹細胞集団、及び組合せ幹細胞集団を含む医薬組成物は、少なくとも1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰又は1×10¹¹個の胎盤幹細胞、第2供給源由来幹細胞又はその両方を、或いは1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰又は1×10¹¹個以下の胎盤幹細胞、第2供給源由来幹細胞又はその両方を含むことができる。

他の実施態様において、前記幹細胞集団は、幹細胞を必要とする個体における生着を、移植後少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21日の間、又はその時点で改善する。別のより特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、幹細胞を必要とする個体における生着を、移植後少なくとも21日又はその時点、若しくは21日以降で改善する。特定の実施態様において、幹細胞を必要とする個体における生着を、移植後少なくとも25、30、35、40、45、50、55週間、その時点又はそれ以降、或いは1年以上で改善する。

本発明の組合せ幹細胞集団は、後の使用のために保存すること、例えば、凍結保存することができる。幹細胞などの細胞を凍結保存するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、凍結保存は、Boyesらの方法(1993年3月9日発行の米国特許第5192553号)又はHuらの方法(2000年12月7日発行の国際公開第00/73421号)を使用する。組合せ幹細胞集団を構成する、胎盤由来幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、凍結保存に先立って組み合わせることができ、或いは別個に凍結保存して、例えば使用の数時間以内に解凍して適切な比率で組み合わせることができる。

本発明の組合せ幹細胞集団は、個体に容易に投与できる形態で調製できる。例えば、組合せ幹細胞集団は、医療上の使用に適した容器内に収容することができる。このような容器は、例えば、滅菌したプラスチック製バッグ、フラスコ、ジャー、又は該組合せ幹細胞集団を容易に分配できるその他の容器でよい。好ましくは、容器は、組合せ幹細胞集団の静脈内投与を可能にする又は容易にする容器である。容器、例えば、バッグは、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を、例えば、混合された細胞集団として一緒に保持することができ、或いは2つの幹細胞集団を別々に保持できる。後者の実施態様において、バッグは、好ましくは、投与に先立って又は投与中に胎盤由来幹細胞と第2供給源由来幹細胞との混合を可能にするために相互に連結された複数の管腔又は区画を含む。容器は、好ましくは、組合せ幹細胞集団の凍結保存を可能にするものである。前記容器中の組合せ幹細胞集団は、少なくとも又は多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20回、或いは25、30、40回又はそれ以上継代された胎盤幹細胞、第2供給源由来幹細胞、又はその両方を含むことができる。

本発明は、また、使用前に、例えば、幹細胞を必要とする個体へ投与する前に、適切な比率で2つの集団を混合することに関する情報と組み合わせて、例えば胎盤幹細胞集団及び第2供給源由来幹細胞集団を別々幹細胞集団として含む(例えば、貯蔵又は保持する)組合せ幹細胞集団を提供する。この実施態様において、組合せ幹細胞集団は、第1容器中の胎盤由来幹細胞集団、第2容器中の第2供給源由来幹細胞、及び幹細胞を必要とする個体への投与前又は投与中における2つの集団の混合に関する説明書を含む。

したがって、一実施態様において、本発明は、容器中に組合せ幹細胞集団を含む組成物を提供し、ここで、前記組合せ幹細胞集団は、胎盤由来幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を含む。特定の実施態様において、容器は、バッグ、フラスコ、又はジャーである。より特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞は、前記バッグ中に一緒に収容される。別のより特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞は、前記バッグ内に別々に収容される。別の特定の実施態様において、組成物は、組合せ幹細胞集団の凍結保存を容易にする1種以上の化合物を含む。別の特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、生理学上許容し得る水性溶液中に含められる。より特定の実施態様において、前記の生理学上許容し得る水性溶液は、0.9%NaCl溶液である。別のより特定の実施態様において、前記バッグは、滅菌されたプラスチック製バッグである。より特定の実施態様において、前記バッグは、前記組合せ幹細胞集団の静脈内投与を可能又は容易にする。別の特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、前記第2供給源由来幹細胞に対してHLA適合性である胎盤細胞を含む。別の特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、前記第2供給源由来幹細胞に対して少なくとも部分的にHLA不適合性である胎盤細胞を含む。別の特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞は、複数のドナーから得られる。別の特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、複数のドナーから得られる。
組合せ幹細胞集団は、個体に投与する前のある期間培養され得る。例えば、一実施態様では、組合せ幹細胞集団中の幹細胞を、ノッチアゴニスト、例えば、本質的にノッチタンパク質の細胞内領域からなるノッチタンパク質の欠失形態、又はデルタタンパク質を含む培地中で培養できる。米国特許出願公開第2004/0067583号を参照されたい。

(5.3医薬組成物)
本発明は、本発明の組合せ幹細胞集団及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物を包含する。
この実施態様によれば、本発明の組合せ幹細胞集団は、注射可能物として製剤できる(例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、国際公開第96/39101号)。別の実施態様において、本発明の組合せ幹細胞集団は、例えば、米国特許第5709854号、5516532号、5654381号に記載のように、重合性又は架橋ヒドロゲルを使用して製剤できる。

別の実施態様において、本発明は、個体へ投与するまで、組合せ幹細胞集団中の各幹細胞集団を、逐次的に又は一緒に投与してインビボで組合せ幹細胞集団を創生するための分離した医薬組成物として維持することを提供する。各成分を、分離した容器、例えば、1つのバッグ(例えば、Baxter、Becton-Dickinson、Medcep、National Hospital Products、Termoなど)、又は単一タイプの細胞若しくは細胞集団を含む分離したシリンジ中に保存し、且つ/又はそれらの中で使用できる。特定の実施態様において、臍帯血、又は臍帯血由来有核若しくは幹細胞は、1つのバッグ中に収容され、胎盤潅流液、又は胎盤潅流液由来幹細胞は、第2のバッグ中に収容される。

胎盤幹細胞集団を富化することができる。具体的実施態様では、胎盤幹細胞を含む細胞集団を、標準的な方法により、赤血球細胞及び/又は顆粒球を除去することによって富化する。その結果、残存する有核細胞集団は、胎盤細胞に関して胎盤潅流液中のその他の細胞型に比較して富化される。このような富化された胎盤幹細胞集団は、非凍結で使用することができ、或いは後の使用のため凍結することができる。細胞集団を凍結する予定の場合は、それを凍結する前に、富化された細胞集団に標準的な凍結保存剤(例えば、DMSO、グリセロール、EPILIFE(商標)細胞凍結培地(Cascade Biologics社))を添加する。

本発明の医薬組成物は、細胞分化を誘導する1種以上の薬剤を含むことができる。ある実施態様において、分化を誘導する薬剤には、限定はされないが、Ca²⁺、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角質細胞増殖因子(KGF)、TGF-β、サイトカイン(例えば、IL-1α、IL-1β、IFN-γ、TFN)、レチノイン酸、トランスフェリン、ホルモン(例えば、アンドロゲン、エストロゲン、インスリン、プロラクチン、トリヨードチロキシン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン)、酪酸ナトリウム、TPA、DMSO、NMF、DMF、マトリックス要素(例えば、コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸、MATRIGEL(商標))、又はこれらの組合せが含まれる。

別の実施態様において、本発明の医薬組成物は、細胞分化を抑制する1種以上の薬剤を含むことができる。ある実施態様において、分化を抑制する薬剤には、限定はされないが、ヒトDelta-1及びヒトSerrate-1ポリペプチド(Sakanoらの米国特許第6337387号を参照されたい)、白血病阻害因子(LIF)、幹細胞因子、又はこれらの組合せが含まれる。
本発明の医薬組成物を、個体への投与に先立って、TNF-αの活性を調節する化合物で処理することができる。このような化合物は、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2003/0235909号に詳細に開示されている。好ましい化合物は、IMiD(免疫調節化合物)及びSelCID(選択的サイトカイン阻害薬)と呼ばれ、特に好ましい化合物は、ACTIMID(商標)、REVIMID(商標)及びREVLIMID(商標)の商品名で入手できる。

(5.4幹細胞の移植方法)
(5.4.1移植方法)
組合せ幹細胞集団の上記確定方法(5.1節参照)を、例えば、胎盤潅流液又は胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞(例えば臍帯血、臍帯血幹細胞など)との対になった単位に関して実施して、幹細胞を必要とする個体を治療するための組合せ幹細胞集団を作り出すことができる。一実施態様では、個体を1以上の組合せ幹細胞集団と接触させる。特定の実施態様において、前記接触は、前記個体中への前記組合せ幹細胞集団の導入、例えば、移植である。したがって、組合せ幹細胞集団を作り出す方法は、幹細胞を必要としている任意の個体中に幹細胞を導入するための手順における最初のステップとして実施できる。このような手順は、上記のような組合せ幹細胞集団を含む医薬組成物の使用を含むことができる。

具体的実施態様では、それを必要とする個体に投与するのに先立って、前記細胞総数と同数の前記胎盤幹細胞又は前記第2供給源由来幹細胞の単独を超える改善された又は高められた生着を提供する比率で、本発明の胎盤幹細胞集団を第2供給源由来幹細胞集団と組み合わせる。別の特定の実施態様では、本発明の胎盤幹細胞集団を第2供給源由来幹細胞集団と、それを必要とする患者に投与する間に又は投与と同時に最適の比率で混合し、ここで、前記比率は、複数の比率の中から、コロニー形成単位の形成を可能にするのに十分な時間及び条件下で前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を培養する場合に最も多数の前記コロニー形成単位を産生する、胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定することによって確定される。別の特定の実施態様において、本発明の胎盤幹細胞集団及び臍帯血細胞集団は、それを必要とする患者に最終の最適比率まで逐次的に投与される。一実施態様では、胎盤幹細胞集団を最初に投与し、次に、第2供給源由来幹細胞集団を投与する。別の実施態様では、第2供給源由来幹細胞集団を最初に投与し、次に、胎盤幹細胞集団を投与する。

特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、1つのバッグ又は容器内に収容される。別の実施態様において、本発明は、移植における、別々のバッグ又は容器内に収容された胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞の集団の使用を提供する。ある実施態様では、2つのバッグ内に収容された幹細胞集団を、それを必要とする患者への投与前に、特に直前に、又は投与時点で混合できる。他の実施態様では、各バッグの内容物を、患者に別々に投与することができ、ここで、2つの幹細胞集団は、インビボで随伴的に使用される。

胎盤幹細胞と、第2供給源由来幹細胞、例えば、預託された又は凍結保存された臍帯血を含む臍帯血由来幹若しくは前駆細胞、又は臍帯血との組合せ集団は、移植前に任意の医学上許容し得る手段によって混合できる。一実施態様において、2つの集団は物理的に混合される。方法に関する別の実施態様において、前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、前記個体に投与する直前に(すなわち、投与の1、2、3、4、5、7、10分以内)混合される。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、前記個体に投与する前の5分を超える時点で混合される。方法に関する別の実施態様において、胎盤幹細胞及び/又は第2供給源由来幹細胞は、凍結保存され、前記個体に投与する前に解凍される。別の実施態様において、前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、前記個体に投与する前の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24時間を超える時点で混合されて組合せ幹細胞集団を形成し、ここで、前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞の一方又は両方は、凍結保存され、前記投与の前に解凍される。別の実施態様では、組合せ幹細胞集団を、1回を超えて投与できる。

別の実施態様において、組合せ幹細胞集団中に含まれる幹細胞は、移植の前にプレコンディショニングされる。好ましい実施態様において、プレコンディショニングは、細胞を気体透過性容器中に約-5℃〜約23℃、約0℃〜約10℃、又は好ましくは約4℃〜約5℃で一般にはある期間貯蔵することを含む。細胞は、18時間〜21日間、48時間〜10日間、好ましくは3日〜5日間貯蔵できる。細胞は、プレコンディショニングの前に凍結保存することができ、或いは投与の直前にプレコンディショニングできる。

胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する適切な比率を確立したら、胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の一方又は両方を、幹細胞を必要とする個体の導入する前に、分化させることができる。例えば、造血性生着の目的での導入の場合には、幹細胞を、造血系列の細胞に分化させることができる。幹細胞と分化した細胞との組合せ、又は両方の幹細胞供給源から分化した細胞の組合せは、用語「組合せ幹細胞集団」の範囲に包含される。したがって、本発明は、ある細胞総数中における胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞との比率(ここで、該比率は、前記細胞総数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独を導入することに比較して、生着を改善する)を決定すること;前記胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の一方又は両方を別の細胞型の細胞に分化させること;及び前記幹細胞及び/又は分化細胞を個体に導入すること；を含む、個体中に幹細胞を導入する方法を提供する。本発明のある実施態様において、組合せ幹細胞集団の移植方法は、(a)胎盤幹細胞の分化を誘導すること、(b)胎盤幹細胞を第2供給源由来幹細胞集団、例えば臍帯血幹細胞と混合して組合せ細胞集団を形成すること、及び(c)該組合せ細胞集団を、それを必要とする個体に投与することを含む。別の実施態様において、移植方法は、(a)第2供給源由来幹細胞の分化を誘導すること、(b)分化した細胞を胎盤幹細胞と混合して組合せ細胞集団を形成すること、及び(c)該組合せ細胞集団を、それを必要とする個体に投与することを含む。本発明の別の実施態様において、組合せ幹細胞集団の移植方法は、(a)胎盤幹細胞を臍帯血細胞集団と混合すること、(b)臍帯血細胞と胎盤幹細胞との混合物の分化を誘導すること、及び(c)該混合物を、それを必要とする個体に投与することを含む。

本発明の組合せ幹細胞集団は、注射、例えば、静脈内注射、筋内注射、腹腔内注射、眼内注射、特定組織への直接注射、輸注などを含む、任意の医薬として又は医療として許容し得る方式で患者に移植できる。例えば、組合せ幹細胞集団(例えば、臍帯血由来幹細胞と組み合わせた胎盤幹細胞)は、静脈内点滴によって移植できる。別の実施態様において、懸濁液の状態で胎盤幹細胞及び心筋幹細胞を含む組合せ幹細胞集団は、心筋組織、例えば、心臓の虚血領域に直接注射できる。組合せ幹細胞集団は、任意の医薬として許容し得る担体中に含めること、又は懸濁させることができる。組合せ幹細胞集団は、任意の医薬として又は医療として許容し得る容器、例えば、血液バッグ、移動バッグ、プラスチック製のチューブ又はバイアル瓶中に収容され、貯蔵され、又は輸送される。

移植後、ヒト被移植者における生着を、例えば、核酸又はタンパク質の検出、又は分析的方法を使用して評価できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、STR、SSCP、RFLP分析、AFLP分析などを使用して、被移植者からの組織サンプル中の、生着細胞に特異的なヌクレオチド配列を確認できる。このような核酸の検出及び分析方法は、当技術分野で周知である。一実施態様において、生着は、被移植者の組織サンプル中での生着細胞に特異的な核酸のバックグラウンドから区別できる発現によって判定できる。分析される組織サンプルは、例えば、生検(例えば、骨髄吸引液)又は血液サンプルでよい。

一実施態様において、末梢血のサンプルは、医療処置、例えば骨髄除去の直前に、患者から直接採取される。処置後、本発明の組合せ幹細胞集団を患者に投与する。投与後に少なくとも1回、次の末梢血サンプルを採取する。例えば、LabCorp(Laboratory Corporation of America)などから入手できるマーカー(対立遺伝子)用のPCRプライマーを使用して両方のサンプルに関してSTRプロフィールを得る。投与後のマーカー(対立遺伝子)の数又は特性の相違は、生着が起こったことを示す。
生着は、好中球の再出現を検出することによって立証することもできる。

別の例において、生着した細胞に特異的なマーカーは、移植された幹細胞、又は移植された幹細胞から分化すると予想される細胞に特異的なマーカーに向けられた抗体を使用して、被移植者からの組織サンプル中で検出できる。一実施態様では、胎盤幹細胞と臍帯血由来幹細胞との組合せの生着を、適切な抗体を添加すること及び細胞の結合を可能にすること;細胞を洗浄すること(例えば、PBSを用いて);細胞を固定すること(例えば、1%パラホルムアルデヒドを用いて);及び適切なFACS装置(例えば、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社))で分析することによるFACS分析で評価して、CD45⁺、CD19⁺、CD33⁺、CD7⁺及び/又はCD3⁺細胞の存在を判定できる。別の実施態様において、胎盤幹細胞と臍帯血由来幹細胞との組合せの生着をFACS分析で評価して、CD200⁺又はHLA-G⁺細胞の存在を判定できる。胎盤幹細胞及び/又は第2供給源由来幹細胞が、被移植者と性別を異にする個体に由来する場合、例えば、男性のドナーと女性の被移植者の場合には、生着は、性別に特異的なマーカー、例えば、Y-染色体に特異的なマーカーを検出することによって判定できる。胎盤幹細胞及び/又は第2供給源由来幹細胞を、遺伝子改変して、確認を容易にする独特のマーカー又は核酸配列、例えばRFLPマーカー、β-ガラクトシダーゼ又は緑色蛍光タンパク質の発現などを発現させることができる。

生着の度合いは、当技術分野で周知の任意の方法で評価できる。一実施態様において、生着の度合いは、次のような、被移植者からの固定され且つ抗体と結合した組織の薄切片を使用する等級化システムで評価される。この等級化システムの例において、生着は、次のように等級化される、すなわち、0=陽性細胞なし(すなわち、生着細胞に特異的な抗体と結合した細胞は存在しない)、0.5=多分陽性であろうがバックグラウンド若しくは非特異的な染色との区別が困難である、1つ又は2つの陽性細胞、1=2〜20個の散乱した陽性細胞、2=約20〜100個の組織全体に散乱した又はクラスター化した陽性細胞、3=組織の50%未満を構成する100個を超える陽性細胞、4=50%を超える細胞が陽性。特定の実施態様において、細胞の0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、10%、15%、20%を超える、又はそれ以上が明確に染色される場合に、生着と判定される。

別の実施態様において、生着の度合いは、生着細胞によって行われる1種以上の生物学的機能の獲得を分析することによって判定される。例えば、骨髄除去療法を受けた被移植者が、胎盤幹細胞及び臍帯血由来幹細胞を含む組合せ幹細胞集団の移植を受ける場合、生着の度合いは、正常な造血、血液細胞集団及び血液機能が正常に戻る度合いによって判定できる。
組合せ幹細胞集団が、意図した被移植者に対して全体又は部分的にHLA不適合である場合、ドナー細胞の免疫学的拒絶を低減するように被移植者を処置する必要性があり得る。免疫学的拒絶を低減する方法は、その両方とも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5800539号及び5806529号に開示されている。

(5.4.2投与量)
典型的には、例えば骨髄移植のために幹細胞点滴を受け入れる患者は、1単位の有核細胞を受け入れ、ここで1単位はほぼ1×10⁹個の有核細胞である(1〜2×10⁶個のCD34⁺幹細胞に相当する)。個体中への組合せ幹細胞集団の移植は、種々の実施態様において、胎盤幹細胞集団及び第2供給源由来幹細胞集団の両方からの少なくとも10万、100万、1000万、1億〜2億、10億、30億、50億、100億、150億、200億、300億、400億、500億個又はそれ以上の、或いは3、5、10、20、30、40、又は50単位又はそれ以上の全有核細胞の移植を含む。個体中への組合せ幹細胞集団の移植は、他の実施態様において、少なくとも1000万〜2000万、1億、3億、5億、10億、15億、20億、30億、40億、50億、60億、70億、80億、90億、100億又はそれ以上の幹細胞の移植を含む。別の実施態様において、個体に投与される有核細胞数は、骨髄置換において通常的に投与される細胞数の少なくとも5倍である。方法に関する別の特定の実施態様において、個体に投与される有核細胞数は、骨髄置換において通常的に投与される細胞数の少なくとも10倍である。別の特定の実施態様において、個体に投与される有核細胞数は、骨髄置換において通常的に投与される細胞数の少なくとも15倍である。方法に関する別の実施態様において、個体に投与される幹細胞を含む有核細胞の総数は、体重kg当たり1〜1000×10⁸個である。

(5.5組合せ幹細胞集団を使用する治療方法)
本発明の組合せ幹細胞集団を、生着可能な幹細胞を必要とする個体を治療するのに使用できる。このような個体は、例えば、造血再構成をもたらすための幹細胞の移植を必要とする可能性がある。各種の他の実施態様では、組合せ幹細胞集団を、血液癌、リソソーム蓄積症、炎症性障害、又は自己免疫障害を有する個体を治療するのに使用できる。他の実施態様では、組合せ幹細胞集団を、器官の再生又は修復を容易にするのに使用することができ、或いは導入遺伝子の担体として使用できる。

したがって、一実施態様において、本発明は、個体を本発明の組合せ幹細胞集団と接触させること(個体に投与すること)を含む、個体の治療方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、幹細胞集団を確定すること、及び前記個体を前記組合せ幹細胞集団と接触させることを含む、個体の治療方法を提供する。特定の実施態様において、組合せ幹細胞集団は、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を、ある細胞総数中で、前記細胞総数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独と比較して、生着を改善又は高める比率で含む。別の実施態様において、本発明は、個体に胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞をある比率で含む組成物を導入することを含む、個体の治療方法を提供し、ここで、前記比率は、コロニー形成単位の形成を可能にするのに十分な時間及び条件下にインビトロで培養した場合に、胎盤幹細胞数の第2供給源由来幹細胞数に対する複数の比率の中で、最も多数のコロニー形成単位、各条件において同等であるコロニー形成単位中の細胞数を産生する比率を確定することによって選択され、ここで、前記個体は、幹細胞を用いて治療可能な疾患、障害又は状態を有する。特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、臍帯血又は胎盤血の幹細胞である。別の特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は造血幹細胞である。別の特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は骨髄由来幹細胞である。別の特定の実施態様において、前記治療は予防的である。別の特定の実施態様において、前記治療は治療的である。各種の実施態様において、前記の疾患、障害又は状態は、後に列挙する疾患、障害、又は状態の1つである。本明細書中に示す疾患、障害及び状態のリストは、制約していると解釈されない。

組合せ幹細胞集団、特に、胎盤幹細胞、及び臍帯血又は臍帯血由来幹細胞を含む幹細胞集団の1つの用途は、例えば、抗癌治療計画の一部として部分的又は完全な骨髄除去療法を受けた患者における造血再構成である。典型的には、骨髄幹細胞は、造血再構成をもたらすために移植され、骨髄移植における生着のためには、患者の体重kg当たりほぼ1×10⁸〜2×10⁸個の骨髄単核細胞、又は約1〜8×10⁶個のCD34⁺幹細胞(すなわち、70kgのドナーで約70mLの骨髄)の投与量で点滴されるべきである。造血再構成は、個体に、例えば胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を含む組合せ幹細胞集団、例えば胎盤血又は臍帯血中の等しい数の全有核細胞を導入することによって完遂できる。

胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、被移植者に対して免疫学的に完全又は部分適合性でよく、或いは完全に関係のない個体に由来することができる。一実施態様において、組合せ幹細胞集団を受け入れる個体は、例えば、5/6HLA適合細胞については体重kg当たり例えば臍帯血からの≧3.5×10⁷個の全有核細胞(TNC)を、4/6HLA適合細胞については体重kg当たり≧5.0×10⁷個の全有核細胞(TNC)を受け入れる。例えばUCBからのTNCの点滴に続いて、例えば直ちに、胎盤潅流液からの体重kg当たり約5〜約30×10⁶個のTNCを点滴する。個体は、1回のこのような投与を、又は複数のこのような投与を受け入れることができる。
したがって、一実施態様において、造血幹細胞を含む組合せ幹細胞集団は、リンパ腫、白血病(慢性又は急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、ホジキン病など)、骨髄異形成、骨髄異形成症候群などの血液癌を有する患者を治療するのに使用できる。別の実施態様において、疾患、障害又は状態は慢性肉芽腫性疾患である。

造血再構成は、貧血の治療で使用することができ、本発明は、さらに、本発明の幹細胞の組合せを用いる、貧血又は血中ヘモグロビンの障害を有する個体の治療を包含する。貧血又は障害は、生来的(例えば、遺伝又は疾患で引き起こされる)である可能性もあり、或いは人工的に誘導される(例えば、偶発的又は故意の中毒、化学療法などによる)可能性もある。別の実施態様において、疾患又は障害は、骨髄機能不全症候群(例えば、再生不良性貧血、コストマン症候群、ダイアモンド-ブラックファン貧血、非巨核球性血小板減少症など)、骨髄障害、又は造血系の疾患若しくは障害である。

別の実施態様において、本発明の組合せ幹細胞集団は、インビボでの器官再生及び損傷修復のために傷害された組織中に導入できる。このような損傷は、限定はされないが、心筋梗塞、発作傷害、多発性硬化症、脳卒中、低血圧、心停止、虚血、炎症、加齢性認知機能喪失、脳性麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー病、AIDS痴呆、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、虚血性腎疾患、脳若しくは脊髄外傷、心-肺バイパス、緑内障、網膜虚血、又は網膜外傷を含む状態及び障害のためである可能性がある。

他の実施態様において、組合せ幹細胞集団を使用して治療可能な疾患、障害又は状態には、限定はされないが、テイ-サックス病、ニーマン-ピック病、ファブリー病、ゴーシュ病(例えば、グルコセレブロシダーゼ欠損)、ハンター及びハーラー症候群、マトロー-ラミー症候群、フコシドーシス(フコシダーゼ欠損)、バッテン病(CLN3)などのリソソーム蓄積症、並びにその他のガングリオシドーシス、ムコ多糖症及び糖原症が含まれる。
組合せ幹細胞集団は、また、限定はされないが、複合性免疫不全疾患(例えば、ウィスコット-アルドリッチ症候群、重症ディジョージ症候群など)を含む重症複合性免疫不全疾患を治療するのに使用できる。

他の実施態様において、組合せ幹細胞集団は、例えば、先天性代謝錯誤、副腎白質ジストロフィー (例えば、co-Aリガーゼ欠失)、異染性白質ジストロフィー(例えば、アリールサルファターゼA欠失)(例えば、症候性又は前駆症状性遅発乳児性又は若年性形態)、グロボイド細胞白質ジストロフィー(クラッベ病、ガラクトセレブロシダーゼ欠失)、酸リパーゼ欠失(ウォルマン病)、嚢胞性線維症、グリコーゲン蓄積病、甲状腺機能低下、鎌状赤血球貧血、サラセミア(例えば、ベータ-サラセミア)、ピアソン症候群、ポンペ病、フェニルケトン尿症(PKU)、ポルフィリン症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、ムコ多糖症、慢性肉芽腫性疾患及びチロシン尿症、並びにテイ−サックス病を修正するための、或いは固形癌又はその他の病理学的状態を治療するための遺伝子治療における自家性又は異種性の遺伝子導入担体として使用できる。

他の実施態様において、疾患、障害又は状態は、1つ以上の組織の置き換え又は修復を必要としている疾患、障害又は状態である。例えば、本発明の組合せ幹細胞集団は、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋肉系、骨、骨髄、胸腺、脾臓、粘膜組織、性腺、又は体毛を強化又は置き換えるための、治療的移植プロトコールで使用できる。本発明の組合せ幹細胞集団は、また、例えば、軟骨、腱又は靭帯の強化、修復又は置き換えのために使用できる。例えば、ある実施態様において、人工骨(例えば、股用人工骨)は、本発明の組合せ幹細胞集団から増殖させた置換軟骨組織構築物で被覆される。他の実施態様において、関節(例えば、膝)は、組合せ幹細胞集団から増殖させた軟骨組織構築物で再構築される。軟骨組織構築物は、また、様々なタイプの関節のための主な再構築手術で採用できる(プロトコールについては、例えば、Resnick,D.及びNiwayama,G.編、1998年「骨及び関節障害の診断(Diagnosis of Bone and Joint Disorders)」第2版、W.B.Saunders社を参照されたい)。本発明の組合せ幹細胞集団は、外傷、代謝障害、又は疾患に起因する組織及び器官の傷害を修復するのに使用できる。一実施態様では、疾患の結果として傷害された組織又は器官を再生又は修復するために、例えば心筋梗塞に続いて心組織を回復するために、患者に組合せ幹細胞集団を投与できる。

別の実施態様において、本発明の組合せ幹細胞集団は、致死的又はほとんど致死に近い線量の放射線を被曝した個体を治療するのに使用できる。このような放射線は、業務-又は攻撃のいずれに関連するにしても、偶発的に例えば核事故で、或いは治療上で、例えば医療処置の部分として被曝される可能性がある。放射線の特定のタイプ(例えば、アルファー、ベータ、ガンマー)は、重要ではない。本発明の組合せ幹細胞集団は、放射線宿酔、例えば、悪心、食欲不振、嗜眠、呼吸困難、白血球数減少、慢性貧血、疲労、虚弱、蒼白、呼吸困難、不定愁訴などの1つ以上の症状を、このような症状が回復可能な又は致死的な放射線宿酔を示すかどうかにかかわらず、改善するのに使用できる。別の実施態様において、個体は、急性放射線症候群(ARS)に付随する1つ以上の症状を有する。本発明の組合せ幹細胞集団は、また、個体が、部分的又は完全にキメラ的になる致死的又はほとんど致死に近い線量の放射線に被曝した個体の造血系を部分的又は完全に再構成するのに使用できる。このようなキメラ現象は、一次的又は永続的(例えば、1、2、3週間、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11ヶ月又はそれ以上持続する)である可能性がある。好ましい実施態様において、本発明の組合せ幹細胞集団は、個体に対して曝露から最初の24時間以内に提供される。個体は、放射線への曝露から、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、9時間、12時間、15時間、18時間、又は21時間以内に本発明の組合せ幹細胞集団を投与されることができる。本発明の組合せ幹細胞集団は、また、放射線への曝露から、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、4週間又は5週間以内に投与することができる。

組合せ幹細胞集団は、炎症を経験している個体に投与すると、抗炎症効果を有することが期待される。好ましい実施態様において、本発明の組合せ幹細胞集団は、炎症に起因する又は付随する任意の疾患、状態又は障害を治療するのに使用できる。炎症は、任意の器官又は組織、例えば、筋肉;脳、脊髄及び末梢神経系を含む神経系;心筋組織を含む血管組織;膵臓;消化管の腸又はその他の器官;肺;腎臓;肝臓;生殖器官;内皮組織又は内胚葉組織；中に存在する可能性がある。

組合せ幹細胞集団は、また、自己免疫障害、又は炎症に関連したものを含む免疫系関連障害を治療するのに使用できる。したがって、ある実施態様において、本発明は、自己免疫疾患又は状態を有することを治療する方法を提供し、該方法はこのような個体に治療上有効な量の本発明の細胞又は補足的細胞集団を投与することを含み、ここで前記の疾患又は障害は、限定はされないが、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症、糖尿病性神経障害又は狼瘡でよい。関連する実施態様において、本発明の組合せ幹細胞集団は、慢性又は急性アレルギーなどの免疫関連障害を使用するのに使用できる。
組合せ幹細胞集団は、また、個体の全般的健康及び満足状態を増すために名目上健康な個体に投与できる。

組合せ幹細胞集団を用いる個体の治療的又は予防的治療は、疾患、障害又は状態をともかくも測定できるほど改善するなら、有効と考えることができる。このような改善は、いくつかの指標によって示すことができる。測定可能な指標には、例えば、特定の疾患、障害又は状態に関連したある生理学的状態又は生理学的状態の集合(限定はされないが、血圧、心拍数、呼吸数、各種血液細胞型の係数値、特定のタンパク質、炭水化物、脂質又はサイトカインの血中濃度、或いは疾患、障害又は状態に関連した遺伝子マーカーの調節発現を含む)の検出可能な変化が含まれる。本発明の幹細胞又は補足的細胞集団を用いる個体の治療は、このような指標の任意の1つが、このような治療に対して正常値の範囲内又は正常値により近い値まで変化することによって応答するなら、有効と考えられる。正常値は、各種の指標に関して当技術分野で周知である正常範囲によって、又はこのような値を対照と比較することによって確立できる。生着、例えば造血系生着の目的での本発明の組合せ幹細胞集団の導入は、組合せ幹細胞集団を導入した個体が生着のなんらかの徴候(例えば、生検若しくは組織サンプル、又は血液サンプル中に現われる生着細胞のマーカー;生着細胞によって実施される1つ以上の生化学的機能の検出)を提示したら、成功と考えられる。医科学では、治療の効力は、また、個体の印象、及び個体の健康状態に関する主観的感覚の観点から特徴付けられることが多い。したがって、改善は、また、本発明の幹細胞又は補足的細胞集団を投与した後の、個体の主観的改善感覚、満足状態の増加、健康状態の増大、活動力レベルの改善などの主観的指標によって特徴付けられる。

(5.6幹細胞バンク)
上記方法、特にインビトロでの方法(5.1.1節参照)を、例えば、胎盤潅流液、胎盤幹細胞、臍帯血、臍帯血幹細胞などの個々の単位に関して実施して、幹細胞を必要とする個体を治療するための組合せ幹細胞集団を作り出すことができる。かくして、該アッセイを、幹細胞を提供することがバンク業務の少なくとも一部である、臍帯血バンク業務を含む幹細胞バンク業務又は血液バンク業務の一部として使用することができる。該アッセイは、血液バンク、幹細胞登録所、又は類似の事業によって使用又は提供される、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞の複数の単位のそれぞれに関して実施できる。

例えば、一実施態様において、本発明は、ある数の胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を含む組合せ幹細胞集団の複数単位を提供することを含む幹細胞バンク業務の方法を提供し、ここで、前記組合せ幹細胞集団は、前記幹細胞集団の細胞数と同数の前記胎盤幹細胞又は前記第2供給源由来幹細胞の単独と比較して、改善された又は高められた生着を示す。特定の実施態様において、前記組合せ幹細胞集団は、胎盤幹細胞の複数単位を準備すること;第2の第2供給源由来幹細胞の複数単位を準備すること;胎盤幹細胞の各前記単位と第2供給源由来幹細胞の単位との適合性を調べること;及びコロニー形成単位の形成を可能にするのに十分な時間及び条件下で混合した場合に、ある細胞総数の中で、前記細胞総数と同数の前記胎盤幹細胞又は前記第2供給源由来幹細胞の単独に比べて、より多数のコロニー形成単位を産生する前記胎盤幹細胞の前記第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定することを含む方法によって生み出される。特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、臍帯血又は胎盤血幹細胞である。別の特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、末梢血幹細胞である。別の特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、骨髄幹細胞である。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞は、ランダムに適合性を調べられる。別の特定の実施態様において、前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞は、前記胎盤幹細胞単位及び前記第2供給源由来幹細胞単位の特性に基づいて適合性を調べられる。より特定の実施態様において、前記特性は、前記胎盤幹細胞単位中の、及び前記第2供給源由来幹細胞単位中の全有核細胞の数である。別のより特定の実施態様において、前記特性は、前記胎盤幹細胞単位中の、及び前記第2供給源由来幹細胞単位中の幹細胞数である。別のより特定の実施態様において、前記特性は、前記胎盤幹細胞によって、及び前記第2供給源由来幹細胞によって呈示される免疫学的マーカーである。

本発明は、さらに、胎盤由来幹細胞バンク、例えば胎盤由来幹細胞単位及び第2供給源由来幹細胞単位のバンクを提供し、ここで、ある数の前記胎盤由来幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、ある細胞総数中で、コロニー形成単位の形成を可能にする条件下で、前記細胞総数と同数の胎盤幹細胞又は前記第2供給源由来幹細胞の単独に比べて、より多くのコロニー形成単位を産生する比率で一緒に準備される。好ましい実施態様において、バンクは、その単位を組み合わせると、同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独に比較して、コロニー形成単位アッセイにおいて、より多数のコロニー形成単位、又は被移植者に移植された場合の改善された生着を示す、それぞれの単位に特異的な比率で第2供給源由来幹細胞の1以上の単位と適合した或いはそれと組合せ可能と確認された胎盤由来幹細胞の複数単位を含む。バンクは、胎盤由来幹細胞及び別々の適合性を調べた第2供給源由来幹細胞の単位、又は組合せ幹細胞集団の単位を含むことができる。

このようなバンク内、又はこのようなバンク内の組合せ幹細胞集団の単位内に含められた胎盤由来幹細胞は、例えば、胎盤から直接得られる潅流液、胎盤潅流液又は胎盤の酵素消化物から単離され、且つ有核細胞分画内に含まれる胎盤由来幹細胞、例えば、1つ以上の細胞表面マーカーによる胎盤細胞の残りから単離される胎盤由来幹細胞の集団、又は前記いずれかから培養及び/又は増殖された幹細胞の集団でよい。第2供給源由来幹細胞は、組織ホモジェネート又はその他の組織特異的細胞の採集物、例えば全臍帯血又は胎盤血、第2供給源から単離された幹細胞中にある程度まで、又は前記のいずれかから培養及び/又は増殖された幹細胞中に含まれることができる。

好ましくは、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞は、同一の個体から得られる。特定の実施態様において、前記第2供給源由来幹細胞は、臍帯血及び/又は胎盤からの胎盤血幹細胞であり、それから胎盤幹細胞が得られ又は引き出される。好ましい実施態様において、バンクは、同一個体からの胎盤幹細胞及び臍帯血由来幹細胞を含む組合せ幹細胞集団の複数単位、或いは胎盤血単位を、細胞総数に関して、被移植者に移植されると、ある細胞総数に関して前記細胞総数と同数の胎盤由来幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独に比較して、コロニー形成単位アッセイにおいて、より多数のコロニー形成単位又は改善された生着を生じさせるそれぞれの単位に特異的な比率で含む組合せ幹細胞集団の複数単位を含む。

好ましくは、幹細胞バンク中の胎盤由来幹細胞は、少なくとも1つのHLAマーカーによって特徴付けられる。好ましい実施態様において、バンクは、HLAで特徴付けられた胎盤由来幹細胞の複数単位を含む。一実施態様において、本発明は、胎盤由来幹細胞の複数単位を含む幹細胞バンクを提供し、ここで、前記胎盤由来幹細胞は、少なくとも1つのHLAマーカーによって同定される。特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞は、胎盤潅流液から単離される。別の特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞は、胎盤潅流液から単離される有核細胞の集団内に含まれる。別の特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞は、CD34⁺幹細胞である。別の特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞は、CD105又はCD73に対して陽性であるか、或いは抗体SH2、SH3及び/又はSH4に結合する。別の特定の実施態様において、前記胎盤由来幹細胞は、OCT-4及び/又はHLA-Gに対して陽性である。

一実施態様において、本発明の幹細胞バンクは、血液又は血液由来幹細胞の複数単位、例えば、胎盤血若しくは臍帯血、又は臍帯若しくは胎盤血から得られる幹細胞を含む。好ましくは、幹細胞バンク内に含まれる血液又は血液由来幹細胞の単位の少なくとも1つ又は大部分は、バンク内に含まれる胎盤由来幹細胞の単位の少なくとも1つ又は好ましくは大部分に対してHLA適合性でよい。したがって、別の特定の実施態様において、前記幹細胞バンクは、さらに、血液又は血液由来幹細胞の複数単位を含む。別の実施態様において、血液又は血液由来幹細胞の前記複数単位の少なくとも1つの単位は、胎盤由来幹細胞の前記複数単位の1つによって共有される少なくとも1つのHLAマーカーによって同定される。別の特定の実施態様において、胎盤血又は臍帯血の前記複数単位は、胎盤由来幹細胞の前記複数単位内の大部分の単位によって共有されるHLAマーカーによって同定される。

幹細胞バンク内に含まれる胎盤由来幹細胞の単位及び血液由来幹細胞の単位は、好ましくは、特定の個体中に導入するための容易な識別及び組合せのために指標化され且つ交差適合性を調べられる。例えば、特定のHLAマーカー、又はHLAマーカープロフィールを有する特定の個体は、胎盤由来幹細胞の1つ以上、及び好ましくは、血液由来幹細胞、例えば、臍帯血若しくは胎盤血の1つ以上の単位に対する適合性を調べることができる。好ましくは、前記個体に投与する前に、胎盤由来幹細胞及び血液幹細胞を組み合わせて本発明の組合せ幹細胞集団を形成する。このような組合せ幹細胞集団は、本明細書中の別の場所で説明される方法により作り出すことができる。

幹細胞バンクは、胎盤由来幹細胞及び/又は任意の数の個体から得られる血液の適合性を調べた単位を含むことができる。種々の実施態様において、本発明の幹細胞バンクは、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、700000、800000、900000、又は1000000、或いはそれ以上の個体から得られた胎盤幹細胞の単位及び/又は血液、例えば、胎盤血及び/又は臍帯血の単位を含むことができる。

(5.7キット)
本発明は、さらに、本発明の組合せ幹細胞集団を確定及び/調製するのに使用できるキットを提供する。このようなキットは、使用者が、組合せ幹細胞集団を調製するのに使用するための、胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞との適切な比率を決定することを可能にする。このようなキットは、組合せ幹細胞集団を作るのに使用される胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞の個々の単位又は単位群の生理学的状態を反映する組合せ幹細胞集団を調製するのに使用できる。特に、このようなキットは、使用者が、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を使用してコロニー形成単位アッセイを実施することを可能にする。

したがって、一実施態様において、本発明は、密閉容器中に、胎盤幹細胞集団及びコロニー形成アッセイを実施するのに適した複数の容器を含むキットを提供する。特定の実施態様において、前記複数の容器は、組織培養プレート中の複数のウェルである。前記プレートは、少なくとも8個、少なくとも12個、少なくとも24個、少なくとも48個、少なくとも96個、又は少なくとも128個のウェルを含むことができる。
別の特定の実施態様において、前記キットは、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞の共存培養に関する1組の説明書を含む。より特定の実施態様において、前記説明書は、コロニー形成単位の産生に向けて前記胎幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞を培養するための説明書を含む。別のより特定の実施態様において、前記説明書は、前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を複数の比率で共存培養するための、及び前記複数の比率の中の1つを選択するための説明を含む。

別の特定の実施態様において、前記キットは、幹細胞を単離するのに適した培地の入った1つ以上の容器を含む。別の特定の実施態様において、前記キットは、幹細胞のコロニー形成単位への培養及び/又は分化に適した培地を入れた1つ以上の容器を含む。より特定の実施態様において、前記培地は、メチルセルロースをベースにした又はデンプンをベースにした培地である。別のより特定の実施態様において、前記培地は、幹細胞を培養するのに適した培養培地である。さらにより特定の実施態様において、前記培地は、Methocult GF⁺H4435培地、2%ウシ胎児血清及び1%Stemspan CC100サイトカインカクテルで補足されたRPMI 1640培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)又はイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)である。

他の特定の実施態様において、キットは、コロニー形成単位の計数を容易にするスコアリング格子を含む。別のより特定の実施態様において、前記キットは血球計算器を含む。
別の特定の実施態様において、キットは、胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を上で説明したように確定された比率で混合し且つ貯蔵するのに適した容器を含む。より特定の実施態様において、前記容器は血液バッグである。
他の種々の実施態様において、キットは、1つ以上の使い捨て用品(例えば、手袋、ペーパータオルなど);結果記録具;容器用ラベルなどを含む。
別の特定の実施態様において、前記キットは、胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する複数の比率の中で、どの比率が、前記複数の比率中のどれよりも有意により多数のコロニー形成単位をもたらすかを判定するための統計用ソフトウェアを含む。

(6.実施例)
(6.1実施例1:インビトロでのコロニー形成単位アッセイ)
臍帯血の1つの単位から、ヘタスターチ分離によって全有核細胞を単離する。750mLの胎盤潅流液から、フィコール分離によって全有核細胞が得られる。胎盤及び臍帯血からの全有核細胞を、35mmの培養皿中のMethocult GF⁺H4435培地(Stem Cell Technologies、Vancouver、カナダ)、又は2%ウシ胎児血清及び1%Stemspan CC100サイトカインカクテルで補足されたRPMI 1640培地(Stem Cell Technologies、Vancouver、カナダ)中で混合する(繰り返し数3)。細胞を、少なくとも2種の比率(例えば、2×10⁵:2×10⁵、1×10⁵:3×10⁵、3×10⁵:1×10⁵)で混合し、14日間培養する。次いで、細胞の組織形態を位相差顕微鏡下で検査し、コロニー形成単位(例えば、CFU-GM、CFU-L、CFU-M、CFU-G、CFU-DC、CFU-GEMM、CFU-E)の総数を記録する。次いで、どの比率が最も多数のコロニー形成単位を産生するかについて判定する。

(6.2実施例2:造血幹細胞を使用する共存培養アッセイ)
10個のHLA/ドナー適合性胎盤潅流液及び臍帯血単位を解凍し、Cell-Dyn 1700(Abbott Laboratories、Abbott Park、IL(イリノイ)州)を用いて全有核細胞(TNC)を計数した。共存培養実験のCFUアッセイを、35mm皿中のMethocult GF⁺H4435培地(StemCell Technologies、Vancouver、カナダ)中で調べた(繰り返し数3)。単核細胞を、次のように、すなわち、胎盤潅流液由来幹細胞(PP)の単独を50(低播種群)、250(中播種群)及び5000(高播種群)×10³/mL/皿で;臍帯血由来幹細胞(CB)の単独を50×10³/mL/皿で;及び共存培養での胎盤潅流液由来幹細胞及び臍帯血由来幹細胞を、50×10³/mL/皿の臍帯血由来幹細胞を50、250及び5000×10³/mL/皿の胎盤潅流液由来幹細胞と組み合わせて播種した。コロニー形成単位アッセイは、播種の14日後に読みとった。コロニー形成単位総数の増加は、式:全コロニー形成単位の%増加=CB/PP-(CB+PP)/(CB/PP)×100に基づいて計算した。
全部で10の適合性のあるCB及びPPサンプルを共存培養した。10の共存培養物中の4つで、全CFU活性が、CB又はPP培養の単独に比較して、皿当たりの計数値が増加した。全コロニー形成単位活性のパーセント増加は、低播種群で7.1%から43.1%まで、中播種群で14.9%から42.1%まで、及び高播種群で24.4%から43.8%まで変化した。

(6.3実施例3:SCID-再形成細胞活性を評価することによってヒト胎盤潅流液及び臍帯血の造血再構成活性を評価するための前臨床研究)
(6.3.1序言)
UCB及びHPSC中に存在する細胞の幹細胞特性を、免疫不全NOD/SCIDマウスを使用する異種移植モデルでの定量的評価を使用して評価した。本明細書では、UCB及びHPSC中のNOD/SCID再形成細胞の出現率及び絶対数を限界希釈移植研究によって測定するための初期実験の結果を報告する。

(6.3.2材料及び方法)
(6.3.2.1 UCB単位の採集及び凍結保存)
簡潔には、母親のインフォームドコンセントを得た後、UCBを、病院中でクエン酸塩/リン酸塩/デキストロース溶液を含むトリプルバッグ系中に採取した。単位を、室温で貯蔵し、採血から48時間以内に処理した。ヘタスターチをベースにした方法を使用して減容及びRBCの涸渇化を実施した。最終のTNCを、LN2タンク内の気相中で、40mLの10%DMSO及び自家血漿を含む凍結バック中で凍結した。

(6.3.2.2胎盤潅流及びHPSC単位の凍結保存)
そのそれぞれが参照によりその全体で本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2002/0123141号及び2003/0032179号に開示の方法による胎盤潅流によって胎盤幹細胞を採集した。簡潔には、臍帯血ドナーからの胎盤を、臍帯から取り外し、制御された圧力で0.9%NaCl溶液を用いて潅流した。全部で750mLの潅流液を得た。細胞を、勾配分離(Ficoll Hypaque)によって濃縮、分離して、RBC及び細胞破片を涸渇させた。

(6.3.2.3細胞の計数及び生存率)
細胞の計数は、自動細胞アナライザー(Cell-Dyn 1700又はCell Dyn 3200、Abbott、Wiesbaden、ドイツ)を用いて、及び手計数で実施した。細胞の生存率は、トリパンブルー排除法を使用して測定した。

(6.3.2.4臍帯血(UCB)及び胎盤潅流液(HPSC)単位の表現型化)
UCB及びHPSCの単一ドナーに適合する単位を液体窒素中に使用時まで保った。移植当日に該単位を解凍した。新たに解凍されたUCB及びHPSC単位の生存率を、トリパンブルーを使用して測定した。全有核細胞計数値の解凍後回収率も実施した。次いで、移植に先立って、新たに解凍された細胞のアリコート(0.5mL)を、次の細胞表面マーカー、CD34、CD38、CD33、CD14、CD7、CD3、CD56、CD10及びCD19についてのFACS分析に使用した。

(6.3.2.5限界希釈NOD/SCID再形成細胞アッセイ)
8〜10週齢のNOD/SCIDマウスを使用して、限界希釈SCID再形成細胞(SRC)アッセイを使用する定量的研究を実施した。移植に先立って、マウスを、20cGy/分の曝露線量率での線形加速器からの放射線を用いて325〜350cGyで照射した。次いで、マウスに、尾部側面静脈を経由する静脈内で、臍帯血又は胎盤潅流液、或いは臍帯血と胎盤潅流液との組合せから200μLの細胞を移植した。移植物は、kg当たりほぼ2〜10×10⁵個の幹細胞(非増殖(non-expanded))又はkg当たり1〜2×10⁶個の幹細胞(増殖)を含んでいた。再形成細胞の出現率を計算するために4種の細胞投与量を使用し、1群当たり6尾のマウスに移植した。次いで、移植の3週後及び10週後の時点で、マウスを、ヒト細胞の生着について分析した。大腿骨から採取された25μLの吸引骨髄から細胞を得て、FACS分析でヒトのリンパ系-骨髄系の生着について分析した。各吸引用に、口径28の針を備え約30〜40μLのPBSを入れたツベルクリン用シリンジを調製した。10週の時点で、マウスを屠殺し、生着分析のため両大腿骨、両脛骨及び胸腺から細胞を採取した。さらに、実施される2回目の実験で、最多細胞投与量群のすべてのマウスについて剖検を実施し、組織学及びヒト細胞の存在のために組織を採集した。採集した組織には、脾臓、肝臓、肺、脳、心臓、骨格筋、腎臓及び胸腺が含まれた。生着は、≧0.5%CD45⁺細胞として定義した。

(6.3.3結果)
(6.3.3.1実験で使用されるHPSC及びUCB単位のTNC、生存率及びTNC回収率)
HPSCの2つの適合性単位及びそれらの適合性UCB単位を、各実験に対して独立に使用した。表1に、これらの細胞のTNC及び解凍後の生存率及びTNC回収率を示す。2つのUCB単位は、1237×10⁶個及び778×10⁶個のTNC、並びにそれぞれ82%及び83%の生存率を有する。HPSC単位は、UCB単位に比較して、比較的より低いTNC計数値(752.5×10⁶個及び661.5×10⁶個)及び生存率(それぞれ67%及び66%)を有する。

(6.3.3.2 UCB及びHPSCの表現型分析)
表2に、移植前の臍帯血及び胎盤潅流液細胞の表現型分析の結果を要約する。予想されるように、CD34⁺細胞のパーセントに関して実験1及び実験2の臍帯血ドナー間で差があり、実験1では細胞の0.56%がCD34⁺であるのに対して、実験2では細胞の1.67%がCD34⁺である。これらの相違は、ドナー間における臍帯血中のTNC及びCD34⁺細胞数の自然な変動を反映している。どちらの場合においても、CD34⁺細胞のパーセントは、胎盤潅流液に比べて臍帯血においてより大きい。臍帯血は、骨髄系マーカー(CD33及びCD14)に関して低いが、リンパ系マーカー(CD3及びCD7)に関してより高い。HPSCでの有意に多い細胞数は、臍帯血中よりもCD10を発現する。

(6.3.3.3 NOD/SCIDマウスにおけるヒト細胞の生着)
表3に、2つの独立した実験(実験1及び2)でNOD/SCIDマウスに注入されるTNC細胞の投与量を示す。両方の場合とも、UCB又はHPSCを受け入れるすべてのマウスにおいて、UCB又はHPSCからの同数のCD34⁺細胞を使用した。したがって、CD34⁺細胞のその個数のために必要とされるTNC細胞の投与量をマウスに注入した。投与量群当たり6尾のマウスを使用した。

図1に、2つの独立した実験におけるマウス骨髄中で生着したヒト細胞の、CD45抗体を使用するFACS分析の概要を示す。3週及び10週の時点で、マウスの骨髄吸引液を、FACSによってヒトCD45⁺細胞の存在について分析した。胎盤細胞のみを受け入れたマウスでは、任意の細胞投与量の両時点で、極めて低い又は検出できない数のヒトCD45⁺細胞が見出された。対照的に、臍帯血のみを、及び臍帯血と胎盤潅流液との組合せを受け入れたマウスでは、両方の時点でヒト細胞の生着が観察された。3週の時点で、臍帯血と、臍帯血と胎盤潅流液との組合せの間でヒト(細胞の)生着レベルに関して有意差は観察されなかった。しかし、10週の時点で、ヒト細胞の生着度は、臍帯血幹細胞又は胎盤幹細胞の単独を受け入れたマウスにおける生着に比較して、臍帯血と胎盤潅流液の両方を受け入れたマウスにおいて有意に高められ(実験1でp=0.3、実験2でp=0.0002)、胎盤幹細胞は、第2供給源、例えば臍帯血由来幹細胞の生着を高めることを示している。

ヒト生着細胞がリンパ系骨髄系の系列を含んでいるかどうかを判定するために、さらに、FACS分析を使用して、マウス骨髄からのCD45⁺細胞中でのCD19、CD33及びCD7の同時発現を分析した。この実験から得られた結果を図2に示す。これらの結果は、UCB及びUCB+HPSCの両方を受け入れているマウスの骨髄は、生着したリンパ系及び骨髄系細胞を含んでいたことを示す。

(6.3.3.4 SCID再形成細胞(SRC)の出現率)
SCID再形成細胞の出現率は、生着して個体の造血系を再形成することのできる原始造血幹細胞の、移植された細胞の総数に対する比率である。該比率は、細胞集団が、例えば照射された個体に対して生着可能な細胞を提供できる相対的能力の指標を提供する。表4に、実験2(上記参照)からのSRC計算値を挙げる。これらの数値は、限界希釈移植、及びStemCell Technologies社からのL-Calcソフトウェアの適用によって計算した。これらの研究は、SRC出現率の増強を立証しなかったが、上で示したように、臍帯血と胎盤潅流液との同時注入での総合的なヒト(細胞の)生着の有意な増強を示した。したがって、該データは、この場合、胎盤潅流液とUCBとの同時注入が、幹細胞の総数を増加させることよりも幹細胞の生着を増強することを示している。

(6.3.3.5非骨髄組織中でのヒト細胞の生着)
UCB、HPSC又はUCB+HPSCからのヒト細胞が、骨髄以外のマウス細胞中で生着されるかどうかを判定するために、実験マウスの胸腺中でのヒト細胞の存在をFACS分析で判定し、且つマウスの脾臓組織で免疫組織化学的染色を実施した。
実験1で、マウス胸腺からの細胞のFACS分析は、UCB及びHPSCを同時注入された6尾中の1尾のマウスが0.8%のCD45⁺細胞を呈示することを示した。実験2で、UCB(投与2)を注入された6尾中の1尾のマウスが8%のCD45⁺細胞を呈示したが、CD3⁺又はCD7⁺細胞を呈示しなかった。しかし、UCB+HPSC群では、6尾すべてのマウスが、3〜23%のCD45⁺細胞でヒト(細胞の)生着を示し、これらのマウス中の1尾は、CD3/CD7陽性細胞を呈示した。
ヒト細胞の存在を検出するために、マウス脾臓の薄切片を、ヒトのタンパク質を認識するがマウスのタンパク質を認識しない抗-ビメンチン及び抗-CD45抗体で染色して調べた。ヒト及びマウスのタンパク質を認識する平滑筋アクチン抗体を陽性対照として使用し、IgG1及びIgG2aアイソタイプを陰性対照として使用した。各生着群からの染色の結果を表5に示す。

ヒトビメンチン、間葉系細胞マーカーを発現しているマウス脾臓中の細胞が、UCB細胞のみを受け入れているすべてのマウスで検出できた。ビメンチンの染色は、HPSCのみを受け入れているマウスでわずかに検出できた。しかし、有意により高レベルのビメンチン染色が、UCB及びHPSC細胞の両方を受け入れているマウスで検出された。同様の結果が、脾臓組織を造血細胞のマーカーであるCD45に対する抗体で染色した場合に見出された。マウス脾臓の平滑筋アクチン(陽性対照)染色は、すべての組織について均一なレベルの染色を示した。アイソタイプの陰性対照抗体は、組織を染色しなかった。

(6.3.4考察)
これらの実験において、胎盤細胞と同一ドナー由来臍帯血細胞との同時注入は、10週の時点で、臍帯血又は胎盤細胞の単独での注入を超える、マウス中でのヒト幹細胞生着のレベルを高めることがわかった。NOD/SCIDマウス中でのヒト細胞の高められた生着は、胸腺及び脾臓を含む組織中でも見出された。生着した細胞は、骨髄系及びリンパ系細胞の両方に含まれることがわかった。生着したヒト細胞は、マウス脾臓中のビメンチンで陽性に染色され、ヒト幹細胞の生着がUCB-HPSCの同時注入によって高められることを示している。

(6.4実施例4:NOD/SCIDマウス中での生着)
ヒトの臍帯血細胞と胎盤細胞との組合せを、ほとんど致死近くまで照射されたNOD/SCIDマウスに種々の比率で投与し、且つヒト細胞の生着及びヒト細胞による再形成の度合いを判定する、投与量範囲の予備的研究を実施した。
ヒトでの移植生着のモデルであるNOD/SCIDマウスからなる6群を、ほとんど致死近くまで400cGyで照射し、生存全有核細胞数をベースにして3:1又は1:1のどちらかの臍帯血細胞の胎盤細胞に対する比率で、臍帯血細胞及び胎盤細胞の3種の投与量中の1つを静脈内で投与する。混合及び注射に続いて細胞のFACS分析を実施した。マウスを、投与10週後の時点で血液及び骨髄をサンプリングしてヒト細胞の生着について観察した。
表6に示す臍帯血細胞及び胎盤細胞の組合せの1つをマウスに投与した。

(材料及び方法)
動物は、DHHS出版番号(NIH)86-23(1985年改訂)及び動物福祉法(7 U.S.C.2131)1985及び9 C.F.R.Part 3,1991中に組み込まれた動物福祉基準を介する米国農務省に従って扱った。
すべて7〜10週齢のNOD/SCID雄性マウス(Taconic Laboratories社、Germantown、New York(ニューヨーク)州)を、線量率が約171cGy/分の¹³⁷セシウム源を使用して400cGyでほとんど致死近くまで照射した。非麻酔の動物を、2.34分の照射間隔の間、Mark I Model 68Aセシウム照射器中に入れた。

ヒトの胎盤細胞及び臍帯血細胞を、陽圧採集(PPC)又は陰圧採集(NPC)で単離し、投与するまで凍結保存した。細胞を、37℃の水浴中で解凍し、希釈し、次いで氷水上に貯蔵した。細胞用希釈液には、5%のデキストラン(Baxter)及び2.5%のヒト血清アルブミン(Bayer)を含めた。細胞を計数し、生存率についてアッセイした。細胞を、各マウスの尾部静脈を通して単回投与で投与した。マウスを、標準的な条件下で収容し、照射後10週の時点で屠殺して生着を分析した。

ヒト細胞の生着を証明するための骨髄及び胸腺のFACS分析を、CD45⁺細胞の出現率、並びにCD34⁺、CD38⁺、CD19⁺、CD33⁺、CD7⁺及びCD3⁺細胞の出現率について評価することによって実施した。細胞を計数し、各サンプルにつき2つのウェルで、ウェルごとに約500,000個の細胞を染色した。マウスのFcブロック(精製マウスIgG)を100万細胞につき1μgで添加し、非特異的結合を低減した。抗体を100万細胞につき約1μgで添加した。一方のウェルには、CD45、CD34、CD38及びCD19に対する抗体を含め、次のウェルにはCD45、CD33、CD7及びCD3に対する抗体を含めた。また、各抗体に対するアイソタイプ対照を、100万細胞につき約1μgで使用した。抗体染色に続いて、細胞を、2〜8℃で30分間インキュベートし、リン酸緩衝化生理食塩水、1%ウシ胎児血清アルブミン及び0.05%アジ化ナトリウムで3回洗浄し、1%パラホルムアルデヒドで固定し、分析するまで2〜8℃の暗所に貯蔵した。破片及び塊を排除するために取り付けられた前方-及び側面散乱ゲートを備えたBecton-Dickinson FACSCaliburによってサンプルを分析した。最適な電圧の設定及び補償は、アイソタイプ対照によって決定した。

ビメンチンの免疫染色は、ヒト特異的ビメンチン抗体を使用してマウス胸骨のパラフィン切片について実施した。評点化は、次の尺度を使用して半定量的に実施した。すなわち、
評点=0:陽性細胞なし
評点=0.5:おそらく陽性であるがバックグラウンドとしての可能性を排除できない、1つ又は2つの陽性細胞、
評点=1:2〜20個の散乱した陽性細胞
評点=2:約20〜100個の組織全体中に散乱又は密集した陽性細胞
評点=3:100個を超えるが組織の50%未満を構成する陽性細胞
評点=4:50%を超える骨髄細胞が陽性。

(結果)
再形成のデータを表7に要約し、FACSのデータを表8に要約する。再形成は、すべての群である程度まで明らかであり、効果は用量依存性であると思われる。各マーカーに対して陽性である細胞の平均パーセントを2つの異なる比率で比較した。CD7、CD33及びCD34は、2つの比率の間で統計的に有意な差を示し、1:1の比率は、3:1の比率に比べて陽性細胞のより低いパーセンテージを示す。

ビメンチン染色。胸骨切片のほとんどすべては、大きさ及び形状の若干の変化を示し、骨及び軟骨組織に取り囲まれた、形状がおおよそ矩形の5〜6個の骨髄空洞で構成されていた。すべてのビメンチン陽性細胞は、骨髄内に、様々な段階又は成熟状態の赤血球及び骨髄前駆体と一緒に観察された。ビメンチン陽性細胞は、陰性対照中で観察されなかった。各骨髄空洞を独立に評点化した。一般に、ビメンチンの評点は、注入される細胞の投与量と十分に関連していた。最も多数の幹細胞を有する群3及び6の両方とも、類似の高い評点3.4を有した。低及び中度の投与量レベルで、同数の細胞を注入された群の間でわずかな相違が存在した。例えば、群4(臍帯細胞の胎盤細胞に対する比率が3:1)に対する平均評点は、群1(1:1の比率)よりもわずかに高く、群5(3:1の比率)の平均評点は、群2(1:1)よりもわずかに高かった。

(結論)
骨髄のフローサイトメトリー及び免疫組織化学的評価は、細胞投与量に依存的な形での実質的再形成を立証した。2種の細胞比率間での差異は、CD7、CD33及びCD34の生着に関して統計的に有意なレベルまで高まった。有意差が存在する場合、3:1の臍帯血対胎盤細胞比率を受け入れている動物は、1:1の比率で処理された動物よりも高い再形成度を有した。

(6.5実施例5:NOD/SCIDマウス中での造血再構成)
CD34⁺胎盤由来幹細胞(HPDSC)を用いて実施されるコロニー形成アッセイは、胎盤潅流液中の機能性造血幹及び前駆細胞の存在を立証した。加えて、HPDSCが臍帯血(UCB)に比較してより未成熟な性質をもつ他の新たな幹細胞集団を含むことを示唆するデータが存在する。
免疫不全NOD/SCIDマウスを使用して、異種移植モデルにおける胎盤潅流液幹細胞の生着能を判定するための実験を実施した。研究の第一部では、精製CD34⁺細胞を受け入れている対照群を用いて、胎盤潅流液細胞及び臍帯血細胞の単独、或いは組合せの生着能を評価した。研究の次の部分では、胎盤潅流液幹細胞の高められた生着に対する影響が、再形成細胞数の増加によるものなのか或いは促進細胞の存在によるものなのかを評価した。この実験で、マウスの3つの群は、UCBのみ、HPDSCのみ、又はHPDSCとUCBとの組合せのいずれかを受け入れた。各群でマウスは同数のCD34⁺細胞を受け入れた。別群のマウスは、また、その中のHPDSC又はUCB細胞が、再形成能力を妨害はするがなんらかの促進効果を保存するように照射された、HPDSCとUCBとの組合せを受け入れた。臍帯血及び胎盤潅流液の個々の単位間にはSCID再形成能力に周知の変動性が存在するので、これらの実験では複数のプールした単位を使用した。

(方法及び実験計画)
8〜10週齢の雄性NOD/SCIDマウスをJackson Laboratoryから入手した。マウスは、無菌的に取り扱い、実験室業務基準に従ったミクロ隔離飼育器中に収容した。マウスには水及び食餌を制約なしに与えた。
HPDSCの凍結バッグ及びヒト臍帯血(UCB)の凍結バッグは、Celgene Cellular Therapeutics社によって供給された。

移植当日に、HPDSC及びUCBの単位を液体窒素から取り出し、解凍した。洗浄後、全有核細胞数(TNC)及び生存率を各単位について測定した。次の再形成研究の部では、HPDSC及びUCB細胞を、いくつかの線量群でHPDSC又はUCBを照射したこと以外は第一部と類似の方式で解凍、調製した。HPDSCとUCB細胞調合物との組合せは、適切な量のHPDSCとUCB細胞とを混合することによって調製した。
細胞の計数は、自動細胞アナライザー(Cell-Dyne 1700又はCell Dyne 320、Abbot、Wiesbaden、ドイツ)を用いて実施した。細胞調合物の生存率は、トリパンブルー排除法によって測定した。

SCID再形成細胞アッセイは、8〜10週齢のNOD/SCIDマウス中で実施した。マウスを、移植に先立って、20cGy/分での曝露率の線形加速器からの照射を用い325〜350cGyで照射した。次いで、マウスに、側面尾部静脈を経由する静脈内で、200μLのUCB又はヒト胎盤潅流液細胞、或いはUCBとヒト胎盤潅流液細胞との組合せを移植した。生着の分析は、移植後4週及び12週の時点で実施した。

ヒト細胞の生着の分析は、フローサイトメトリー分析で実施した。簡潔には、サンプルを、抗体で染色し、1%パラホルムアルデヒドで固定し、Becton Dickson FACSCaliburを使用してヒトCD45、並びにCD34、CD7、CD33、CD10、CD7及びCD3を含む他系列の細胞表面マーカーのパネルについて分析した。最適な電圧設定及び補償は、アイソタイプ対照によって決定した。4週での生着分析を、麻酔したマウスから得られた骨髄吸引液を用いて実施し、且つ12週の時点で動物を屠殺し、大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を抜き取った。ヒトCD45の割合が＞0.5%なら、マウスは生着されたと考えた。
実験計画。移植当日に動物を照射し、表9及び10に示すように様々な処理群に無作為化した。

(結果)
解凍後の細胞生存率。UDB及びHPDSCの解凍後の細胞生存率は、再形成研究で使用した単位に関して70%を超えていた。
NOD/SCIDマウスでのヒト細胞の生着。注入4週後に、HPDSC単独を含むすべての群でヒト細胞の生着(＞0.5%CD45)が観察され、UCB群では6尾中2尾のマウスが(平均でCD45の%は0.62%)、HPDSC群では8尾中2尾のマウスが(平均でCD45の%は0.52%)、及びUCBとHPDSCとの両方を受け入れた群では9尾中8尾のマウスが(平均でCD45の%は2.84%)生着に関して陽性であった。HPDSC群単独をUCB+HPDSC群と(p=0.006)、及びUCB群をUCB+HPDSC群と(p=0.02)比較した場合に観察される、ヒト(細胞の)生着の有意な増加が存在した。移植後12週の時点で、HPDSC単独群での維持された生着は観察されず、8尾の動物中1尾のみが、＞0.5%CD45で生着された。対照的に、UCBのみを受け入れたマウス間でのヒト(細胞の)生着の総合的レベルで観察されるUCB+HPDSC群(平均でCD45の%はそれぞれ15.1%及び13.1%、p=0.82)に対する統計的差異は存在せず、UCB+HPDSC群におけるマウス9尾中9尾に比較して、UCB群中ではマウス6尾中3尾のみが生着した。ヒト細胞と生着したマウスは、また、リンパ系骨髄系及びその他の系列細胞型(表11及び12)の生着を示した。これらのデータは、HPDSC及びUCBの同時注入が、HPDSC又はUCBの単独と比較して、短期及び長期の両方でのヒト(細胞の)生着の有意な向上をもたらすことを示している。

促進効果。UCB又はHPDSC群の単独に比較してUCB+HPDSC群で、高められたヒト(細胞の)生着が観察された(表13及び14)。さらに、UCBと共に被照射HPDSCを受け入れたマウス群は、CB単独又はCB+PP1を受け入れたマウス群に比べてマウス当たり半数の機能性CD34細胞を受け入れたが、この群中には同等のヒト(細胞の)生着が存在し、これはHPDSCの促進機能を示唆している。
臍帯血移植に続く生着の遅延は、好中球生着の中位時間が約23日である二重単位骨髄除去臍帯血移植の場合でさえ、相変わらず重大な臨床上の問題である。これらの結果は、また、より急速な生着を促進するための潜在的方法としての移植のための、HPDSCと単一又は二重の臍帯血単位との同時注入の臨床的研究を提案している。

(6.6実施例6:組合せ幹細胞集団を使用する筋萎縮性側索硬化症の治療)
ルーゲーリッグ病とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、皮質、脳幹及び脊髄の運動ニューロンを襲う致死的な神経変性疾患である。ALSは、2万人ほどの米国人を襲い、米国では毎年5千人の新たな患者が発生する。ALS患者の大部分は散発性(S-ALS)であるが、約5〜10%は遺伝性(家族性-F-ALS)である。ALSは、随意運動を制御する脳及び脊髄中の特定神経細胞が徐々に変性する場合に発生する。ALSの基本的特徴は、脊髄運動ニューロンの欠失であり、それは、それらのニューロンの制御下にある筋肉を弱化させ、消耗させ、麻痺に至らしめる。ALSは、どの筋肉が最初に弱化するかに応じて、それ自体種々の道筋で現われる。ALSは中年を襲い、男性は女性のおそらく1.5倍以上その疾患に罹患する。ALSは、診断後5年以内に死に至るのが通常である。

ALSは、家族性及び散発性の双方の形態を有し、家族性形態は、現在、いくつかの明白な遺伝子座に関連付けられている。ALS患者のほんの約5〜10%が家族性である。これらの中で、15〜20%は、Cu/Znスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)をコードする遺伝子中の突然変異のためである。これらの変異は、酵素に対して毒性を付与する「機能獲得型」突然変異であると思われる。ALSの原因としてのSOD突然変異の発見は、該疾患の理解におけるいくつかの進歩の道を切り開き、今日では該疾患のための動物モデルが利用可能であり、細胞死に至る分子事象に関して、仮説が展開され、試験されている。

ALSを有する個体を組合せ幹細胞集団で治療する典型的な方法を下記で提供する。該方法は、末梢の一時的血管カテーテルを介する静脈内点滴を含む。
ALSを有する個体を、まず、標準的な実験室内分析を実施することによって評価する。このような分析としては、代謝プロフィール、区分CBC、脂質プロフィール、フィブリノゲン濃度、血液のABOrH型分類、肝機能検査、及びBUN/クレアチン濃度の測定を挙げることができる。個体は、次の薬剤、すなわち、ジフェンヒドラミン(BENADRYL(商標))25mgを1日に3回、及びプレドニゾン10mgを服用するように移植日前日に指示される。

組合せ幹細胞集団は、胎盤潅流液単位及び適合性を調べた臍帯血単位から作られる(すなわち、潅流液は、臍帯血が得られるのと同一の胎盤から採取される)。潅流液及び臍帯血から全有核細胞集団を単離し、最も多数のコロニー形成単位を産生する比率を決定するために、インビトロでそれぞれのサンプルを複数の比率で試験する。2つの集団を、ほぼその比率で組み合わせて、組合せ幹細胞集団を創生する。この幹細胞集団は、移植前のほぼ2日間、約5℃の温度で維持される。

個体は、静脈内点滴、生理学的監視及び身体的観察に必要なすべての設備を有する外来臨床センターで移植される。移植のほぼ1時間前に、個体は、ジフェンヒドラミン(BENADRYL(商標))25mgを経口で、及びプレドニゾン10mgを経口で服用する。これは、予防のためであり、急性アレルギー反応の可能性を低減することを意味する。輸血の時点で、18Gの留置末梢静脈ラインを、個体の手足の1つに配置し、KTO速度でのD5 1/2規定生理食塩水+20mEqKClの点滴によって解放して維持する。移植に先立って、個体を調べ、特に、心拍数、呼吸数、体温に留意する。心電図及び血圧測定値などのその他の監視を実施できる。

次いで、組合せ幹細胞集団を、ほぼ1〜2×10⁹全有核細胞/時間の速度で60mLの総送達流体容積で点滴する。マウスでの前臨床研究からのデータをベースにして、体重kg当たり全部で2.0〜2.5×10⁸個の細胞を投与すべきである。例えば、70kgの個体は、14〜18×10⁹個の全有核細胞を受け入れる。個体を、点滴の即時中止のためのシグナルであるアレルギー反応又は過敏症の徴候について監視すべきである。
点滴後、個体を、彼又は彼女が正常な活動性を取り戻すであろう少なくとも60分の間、横臥位で監視すべきである。

本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様に限定されるものではない。実際、本明細書に記載の実施態様に加えて、種々の修飾が、前記の説明から明らかになるであろう。このような修飾は、添付した特許請求の範囲に包含されると解釈される。
本明細書中で引用されたすべての参照文献は、各個々の刊行物、特許又は特許出願が、すべての目的のためにその全体で参照により組み込まれることを具体的且つ個別的に示すかのごとく、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
任意の刊行物の引用は、提出日に先立つその開示のためであり、本発明が、先行発明によってこのような刊行物に実際よりも前に日付を付ける権利を与えるためではないことの容認として解釈されるべきではない。

図1A〜1Dは、CD45抗体を使用する2つの独立した実験における、マウス骨髄中の生着ヒト細胞のFACS分析の要約である。(A)：第1の実験、臍帯血細胞のみ(UCB)、胎盤潅流液細胞のみ(PP)、又は胎盤潅流液と組み合わせた臍帯細胞(UCB+PP)の場合に、3週の時点で骨髄中に存在するCD45⁺細胞。X-軸:移植ごとの細胞数。(B)：第1の実験、移植後10週の時点で骨髄中に存在するCD45⁺細胞。(C)：第2の実験、移植後3週の時点で骨髄中に存在するCD45⁺細胞。(D)：第2の実験、移植後10週の時点で骨髄中に存在するCD45⁺細胞。

NOD/SCIDマウス中でリンパ系骨髄系細胞マーカーを発現している生着ヒト細胞のFACS分析。CD45⁺の、CD19(各範疇で左側バー)、CD33(中央バー)、又はCD7(右側バー)との共存培養。X-軸:移植ごとの細胞数。UCB=臍帯血細胞のみの移植;PP=胎盤潅流液細胞のみの移植;UCB+PP=胎盤潅流液細胞と組み合わせた臍帯細胞の移植。

Claims (33)

1. 胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定する方法であって、コロニー形成単位の形成を可能にするのに十分な時間及び条件下で、ある数の前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を一緒に培養した場合に、前記細胞総数と同数の胎盤幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独と比べて、より多数のコロニー形成単位を産生する、前記細胞総数中での胎盤幹細胞の第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定することを含む、前記方法。
2. 前記比率が、コロニー形成単位の形成を可能にするのに十分な時間及び条件下で前記胎盤幹細胞及び第2供給源由来幹細胞を複数の比率で培養すること;及び前記複数の比率の中で最も多数のコロニー形成単位を産生する比率を確定すること；によって確定される、請求項1記載の方法。
3. 前記胎盤幹細胞が、単一の胎盤から得られる、請求項1記載の方法。
4. 前記胎盤幹細胞が、複数の胎盤から得られる、請求項1記載の方法。
5. 前記胎盤幹細胞が、胎盤潅流液からの幹細胞である、請求項1記載の方法。
6. 前記第2供給源由来幹細胞が、臍帯血由来幹細胞である、請求項1記載の方法。
7. 前記臍帯血由来細胞が、造血幹細胞である、請求項1記載の方法。
8. 前記幹細胞と第2供給源由来幹細胞又は前駆細胞とが、懸濁状態で組み合わされる、請求項1記載の方法。
9. 前記組合せに生物活性分子を添加することをさらに含む、請求項1記載の方法。
10. 前記生物活性分子が、サイトカイン又は増殖因子である、請求項9記載の方法。
11. 前記胎盤幹細胞が、単一の個体から得られる、請求項1記載の方法。
12. 前記胎盤幹細胞が、複数の個体から得られる、請求項1記載の方法。
13. 胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞との比率を確定する方法であって、複数の動物において胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞とを複数の比率で組み合わせること;及び前記複数の比率の中で前記複数の動物中の少なくとも1種の組織中で最も多数の生着細胞を産生する比率を確定すること；を含む、前記方法。
14. 胎盤由来幹細胞と第2供給源由来幹細胞とを、コロニー形成単位アッセイにおいて、組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の胎盤由来幹細胞又は組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の第2供給源由来幹細胞の単独と比べて、より多数のコロニー形成単位を産生する比率で含む、幹細胞バンク。
15. 前記胎盤幹細胞が、胎盤潅流液からの幹細胞である、請求項14記載の幹細胞バンク。
16. 前記胎盤由来幹細胞が、前記第2供給源由来幹細胞から隔離されて保たれる、請求項14記載の幹細胞バンク。
17. 前記比率が、胎盤由来幹細胞又は第2供給源由来幹細胞の単独に比較して、インビボでの生着を改善する、請求項14記載の幹細胞バンク。
18. 前記比率が、コロニー形成単位アッセイを使用して決定される、請求項14記載の幹細胞バンク。
19. 前記第2供給源由来幹細胞が、成人幹細胞である、請求項14記載の幹細胞バンク。
20. 前記第2供給源由来幹細胞が、臍帯血幹細胞、骨髄幹細胞、又は間葉系幹細胞である、請求項14記載の幹細胞バンク。
21. 前記第2供給源由来幹細胞が、造血幹細胞である、請求項13記載の幹細胞バンク。
22. 組合せ幹細胞集団の準備方法であって、第1の複数単位の胎盤由来幹細胞と第2の複数単位の第2供給源由来幹細胞とを、コロニー形成単位アッセイにおいて、組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の胎盤由来幹細胞又は組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の第2供給源由来幹細胞の単独と比べて、より多数のコロニー形成単位をもたらす比率で準備することを含む、前記方法。
23. 幹細胞バンク業務の方法であって、ある数の胎盤幹細胞と第2供給源由来幹細胞とを含む複数単位の幹細胞集団を準備することを含み、前記組合せ幹細胞集団が、該組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は該組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の第2供給源由来幹細胞の単独と比較して、改善された又は高められた生着を提示する、前記方法。
24. 前記複数単位の幹細胞集団が、複数単位の胎盤幹細胞を準備すること;第2の複数の第2供給源由来幹細胞を準備すること;胎盤幹細胞の前記単位のそれぞれと第2供給源由来幹細胞のある単位との適合性を調べること;及びある細胞数で組み合わせた場合に、コロニー形成単位の形成を可能にする時間及び条件下で、組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の胎盤幹細胞又は組合せ幹細胞集団中の細胞数と同数の前記幹細胞の単独と比べて、より多数のコロニー形成単位を産生する、前記胎盤幹細胞の前記第2供給源由来幹細胞に対する比率を確定することを含む方法によって生み出される、請求項23記載の方法。
25. 前記胎盤幹細胞が、胎盤潅流液からの胎盤幹細胞である、請求項23記載の方法。
26. 前記第2供給源由来幹細胞が、臍帯血又は胎盤血の幹細胞である、請求項23記載の方法。
27. 前記第2供給源由来幹細胞が、末梢血幹細胞である、請求項23記載の方法。
28. 前記第2供給源由来幹細胞が、骨髄幹細胞である、請求項23記載の方法。
29. 前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞が、ランダムに適合性を調べられる、請求項23記載の方法。
30. 前記胎盤幹細胞及び前記第2供給源由来幹細胞が、胎盤幹細胞の前記単位及び第2供給源由来幹細胞の前記単位の特性に基づいて適合性を調べられる、請求項23記載の方法。
31. 前記特性が、胎盤幹細胞の前記単位中の、及び第2供給源由来幹細胞の前記単位中の全有核細胞の個数である、請求項30記載の方法。
32. 前記特性が、胎盤幹細胞の前記単位中の、及び第2供給源由来幹細胞の前記単位中の幹細胞の個数である、請求項30記載の方法。
33. 前記特性が、前記胎盤幹細胞によって、及び前記第2供給源由来幹細胞によって呈示される免疫学的マーカーである、請求項30記載の方法。

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