KR100898384B1 - Thermostable sulfolobus sulfataricus-derived ?-glycosyl transferase and preparation method of branched cyclodextrin with the same - Google Patents

Abstract

본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래 당전이효소 및 이를 이용한 분지 사이클로덱스트린 제조방법에 관한 것으로서, 특히, 본 발명의 당전이효소인 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 내열성 당전이효소를 이용하면, 말토오실-베타-사이클로덱스트린으로부터 수용성이 증가된 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조할 수 있어 산업상으로 매우 유용하다.The present invention relates to a sugar transferase derived from Sulfolobus solfataricus , and a method for producing a branched cyclodextrin using the same, and particularly, to a heat-resistant glycotransferase derived from a sulfur transferase, which is the sugar transferase of the present invention. When used, dimaltosyl-beta-cyclodextrin with increased water solubility can be prepared from maltosyl-beta-cyclodextrin, which is very useful industrially.

당전이효소, 베타-사이클로덱스트린 Glycotransferase, beta-cyclodextrin

Description

내열성 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소 및 이를 이용한 분지 사이클로덱스트린의 제조방법{THERMOSTABLE SULFOLOBUS SULFATARICUS-DERIVED α-GLYCOSYL TRANSFERASE AND PREPARATION METHOD OF BRANCHED CYCLODEXTRIN WITH THE SAME}Thermosulfurbus sulfataricus-derived glycotransferase and a method for preparing branched cyclodextrins using the same

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 유전자 서열이다. 1 is a gene sequence of a sulfa robus sulfataricus derived glycotransferase according to an embodiment of the present invention.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터인 p6xHSGDE의 개열지도이다.Figure 2 is a cleavage map of the recombinant vector p6xHSGDE according to an embodiment of the present invention.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터 p6xHSGDE로 형질전환시킨 E. coli MC1061에서 생산된 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 정제단계별 시료의 전기영동 사진이다.FIG. 3 is an electrophoretic photograph of a sample of each step of purifying sulparobus sulfataricus-derived sugar transferase produced in E. coli MC1061 transformed with a recombinant vector p6xHSGDE according to an embodiment of the present invention.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 당전이효소의 온도에 따른 활성을 나타낸 것이다.Figure 4 shows the activity according to the temperature of the sugar transferase according to an embodiment of the present invention.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 당전이효소의 pH에 따른 활성을 나타낸 것이다.Figure 5 shows the activity according to the pH of the sugar transferase according to an embodiment of the present invention.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 기질에 대한 당전이효소의 반응 결과를 박막 크로마토그래피(TLC)를 이용하여 분석한 사진이다. Figure 6 is a photograph analyzed by the thin film chromatography (TLC) the results of the reaction of the sugar transferase to various substrates according to an embodiment of the present invention.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 반응시간에 따른 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 대한 당전이효소의 반응 결과를 박막 크로마토그래피를 이용하여 분석한 사진이다.FIG. 7 is a photograph analyzing the reaction result of the glycotransferase to maltosyl-beta-cyclodextrin according to the reaction time according to an embodiment of the present invention using thin layer chromatography.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 당전이효소를 처리한 후, 추가로 아이소아밀라제와 글루코아밀라제를 반응시킨 결과를 박막 크로마토그래피를 이용하여 분석한 사진이다.FIG. 8 is a photograph of the maltosyl-beta-cyclodextrin treated with a sugar transferase according to an embodiment of the present invention, followed by further reaction of isoamylase and glucoamylase using thin layer chromatography.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 당전이효소를 처리하여 얻어진 생성물의 분자량을 측정한 결과이다.9 is a result of measuring the molecular weight of the product obtained by treating the sugar transferase to maltosyl-beta-cyclodextrin according to an embodiment of the present invention.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 당전이효소를 처리한 후, 추가로 글루코아밀라제를 반응시켜 글루코오스를 제거한 결과물의 분자량을 측정한 결과이다. 10 is a result of measuring the molecular weight of the resultant obtained by removing glucose by treating glucose transferase to maltosyl-beta-cyclodextrin according to an embodiment of the present invention, and then reacting glucoamylase.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린의 반응시간에 따른 최적 생산조건을 측정한 결과이다.11 is a result of measuring the optimal production conditions according to the reaction time of the dimaltosyl-beta-cyclodextrin according to an embodiment of the present invention.

도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 당전이효소가 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 생성하는 기작을 나타낸 공정도이다.12 is a process chart showing the mechanism by which the sugar transferase according to an embodiment of the present invention produces dimaltosyl-beta-cyclodextrin.

[산업상 이용 분야][Industrial use]

본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소, 더욱 자세하게는 설펄 로버스 설파타리쿠스 유래 내열성 당전이효소 및 이를 이용한 분지 사이클로덱스티린 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a sugar transfer enzyme derived from sulfulverse sufataricus, and more particularly, to a heat resistant sugar transfer enzyme derived from sulfulrobus sulfataricus, and to a branched cyclodextrin using the same.

[종래 기술][Prior art]

사이클로덱스트린은 글루코오스 분자가 각기 6개, 7개 및 8개로 환상형 구조를 이루고 있으며, 각각 글루코오스 분자수에 따라 통상 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린이라고 한다. 사이클로덱스트린은 환상형으로 환의 내부는 소수성이고 외부는 친수성의 특성을 갖고 있다. 내부가 소수성이어서 소수성 물질을 포접할 수 있어 휘발성이 강한 물질 또는 불쾌치를 포접하거나 불안정한 물질을 포접하여 안정성을 향상하는데 많이 이용되고 있다. 그러나 이러한 특성에도 불구하고 낮은 온도에서는 수용성이 낮아 다양한 용도로의 이용이 제한되고 있는 실정이다. Cyclodextrins have a circular structure of 6, 7, and 8 glucose molecules, respectively, and are called alpha-cyclodextrin, beta-cyclodextrin, and gamma-cyclodextrin, respectively, depending on the number of glucose molecules. Cyclodextrins are cyclic, and the inside of the ring is hydrophobic and the outside is hydrophilic. Since the interior is hydrophobic and can contain a hydrophobic material, it is widely used to improve stability by inclusion of a highly volatile material or an unpleasant or unstable material. However, despite these characteristics, the low water solubility is low, the use of various applications is limited.

상기한 사이클로덱스트린의 특성에 의한 제한적인 용도를 넓히기 위하여 사이클로덱스트린의 유도체를 만드는 방법이 제공되어 왔다. 상기한 사이클로덱스트린 유도체를 만드는 방법 중의 하나가 사이클로덱스트린에 당을 붙여 수용성을 높이는 방법이다. 상기한 사이클로덱스트린에 당을 붙여 수용성을 높인 사이클로덱스트린을 분지 사이클로덱스트린(branched cyclodextrin)이라고 한다. In order to broaden the limited use by the properties of the cyclodextrins described above, methods for making derivatives of cyclodextrins have been provided. One of the methods for making the cyclodextrin derivatives described above is a method of adding sugar to the cyclodextrin to increase water solubility. Cyclodextrins, which are sugars attached to the cyclodextrins to increase water solubility, are called branched cyclodextrins.

상기한 분지 사이클로덱스트린을 만드는 방법으로 과량의 말토오스와 사이클로덱스트린을 이용하여 풀루란네이즈(pullulanase) 혹은 아이소아밀라제 (isoamylase)를 처리하여 말토오실-사이클로덱스트린 또는 말토트라이오실-사이클로덱스트린을 제조하는 방법이나 분지 말토올리고당과 사이클로덱스트린에 디브랜 칭 효소를 처리하여 말토오실-사이클로덱스트린 또는 말토트라이오실-사이클로덱스트린을 제조하는 방법이 제공되어 왔다. Method of making the branched cyclodextrin as a method of producing maltoosyl-cyclodextrin or maltotriosyl-cyclodextrin by treating pullulanase or isoamylase using excess maltose and cyclodextrin There has been provided a process for producing maltoosyl-cyclodextrin or maltotriosyl-cyclodextrin by treating branched maltooligosaccharides and cyclodextrins with debranching enzymes.

상기한 방법들에 의해서도 소량의 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조할 수는 있지만, 말토오실-사이클로덱스트린 및 말토트라이오실-사이클로덱스트린이 포함되어 있는 혼합물에서 이를 분리해야 하는 번거로움이 있다.Small amounts of dimaltosyl-beta-cyclodextrin can also be produced by the methods described above, but there is a hassle to separate them from mixtures containing maltosyl-cyclodextrins and maltotriosyl-cyclodextrins.

본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus sulfataricus)에서 유래한 내열성 당전이효소(α-glycosyl transferase)를 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art, the present invention is sulfulrobus Sulfataricus ( Sulfolobus It is an object to provide a heat-resistant glycotransferase (α-glycosyl transferase) derived from sulfataricus ).

또한, 본 발명은 상기 당전이효소를 생산하는 방법 및 이를 생산하는 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a method for producing the sugar transferase and a transformant for producing the same.

또한, 본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠스에서 유래한 당전이효소를 이용하여 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린으로부터 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. The present invention also provides a branched cyclodextrin having a branched chain substituted sugar in two ring-constituting glucose of cyclodextrin from a branched cyclodextrin having one side chain substituted sugar using a sugar transferase derived from sulfalobus sulfataricus. It aims to provide a way to.

본 발명자는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래한 당전이효소가 열 및 pH에 대한 우수한 안정성을 가질 뿐만 아니라, 글루코시드 결합의 가수분해활성 및 당전이활성을 가지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다. The present inventors have confirmed that the glycotransferase derived from Sulfolobus solfataricus has not only excellent stability to heat and pH, but also has hydrolytic and sugar transfer activity of glucoside bonds. Was completed.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠 스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래한 당전이효소를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a sugar transferase derived from Sulfolobus solfataricus .

본 발명은 또한, 상기 당전이효소를 생산하는 방법 및 이를 생산하는 형질전환체를 제공한다.The present invention also provides a method for producing the sugar transferase and a transformant producing the same.

본 발명은 또한, 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 상기 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소를 처리하여 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing dimaltosyl-beta-cyclodextrin by treating maltoosyl-beta-cyclodextrin with the above-mentioned sulfolabus sulfataricus derived glycotransferase.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서 제공하는 당전이효소는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래한 내열성이 우수한 당전이효소일 수 있다. The glycotransferase provided by the present invention may be a sugar transfer enzyme having excellent heat resistance derived from Sulfolobus solfataricus .

상기 당전이효소는 75℃에서 최적 활성을 나타내고, 70℃ 내지 80℃에서 최적 활성의 80% 이상의 활성을 나타낸다. 또한, 상기 당전이효소는 pH 5.5에서 최적 활성을 나타내고, pH 6.0 내지 pH 6.5에서 최적 활성의 80% 이상의 활성을 나타낸다. 바람직하게는 상기 당전이효소는 70℃ 내지 80℃ 및 pH 5.5 내지 pH 6.5에서 높은 활성을 나타낸다. The glycotransferase exhibits optimal activity at 75 ° C. and at least 80% of optimal activity at 70 ° C. to 80 ° C. In addition, the glycotransferase exhibits optimal activity at pH 5.5 and at least 80% of optimal activity at pH 6.0 to pH 6.5. Preferably the glycotransferase shows high activity at 70 ℃ to 80 ℃ and pH 5.5 to pH 6.5.

또한, 상기 당전이효소는 열안정성 및 pH 안정성이 우수한 효소이다. 상세하게는, 상기 당전이효소는 60℃ 내지 95℃ 및 pH 3 내지 11에서도 안정성이 있는 효소이다. In addition, the sugar transferase is an enzyme having excellent thermal stability and pH stability. Specifically, the sugar transferase is an enzyme that is stable at 60 ° C to 95 ° C and pH 3 to 11.

본 발명의 당전이효소는 718개의 아미노산으로 이루어지고, 분자량이 82kDa 내지 84kDa이고, 바람직하게는 83kDa이며, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. The glycotransferase of the present invention is a polypeptide consisting of 718 amino acids, having a molecular weight of 82 kDa to 84 kDa, preferably 83 kDa, and having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

본 발명의 당전이효소는 알파-1,4-글루코시드 결합 및 알파-1,6-글루코시드 결합 당전이 활성 뿐만 아니라, 알파-1,4-글루코시드 결합 및 알파-1,6-글루코시드 결합 가수분해 활성을 갖는다. Glycotransferases of the present invention are not only alpha-1,4-glucoside binding and alpha-1,6-glucoside binding sugar transfer activity, but also alpha-1,4-glucoside binding and alpha-1,6-glucoside Has a binding hydrolytic activity.

상세하게는, 본 발명의 당전이효소는 말토트라이오스(maltotriose), 말토테트라오스(maltotetraose), 말토펜타오스(maltopentaose), 말토헥사오스(maltohexaose) 및 말토헵타오스(maltoheptaose) 등의 말토올리고당을 기질로 하는 경우, 알파-1,4 글루코시드 결합을 잘라 각각의 기질에 알파-1,4 글루코시드 결합으로 전이하는 재배열 활성(disproportionation activity)을 나타내어 여러 가지 소당류를 생성할 수 있다. 또한, 본 발명의 당전이효소는 풀루란(pullulan)을 기질로 하는 경우, 알파-1,6 글루코시드 결합을 분해하는 가수분해활성을 나타내어 말토트라이오스(maltotriose)을 생성할 수 있다. 또한, 전분의 구성성분인 아밀로펙틴과 세포내의 저장체인 글라이코젠을 기질로 하는 경우 본 발명의 당전이효소는 알파-1,6 글루코시드 결합의 가수분해활성과 알파-1,4 글루코시드 당전이 활성을 나타내어 여러 가지 직쇄형의 말토올리고당을 생성할 수 있다. Specifically, the glycotransferase of the present invention may be a malto oligosaccharide such as maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose and maltoheptaose. In the case of a substrate, various polysaccharides can be produced by exhibiting a disproportionation activity of cleaving alpha-1,4 glucoside bonds and transferring them to alpha-1,4 glucoside bonds. In addition, when the glycotransferase of the present invention is based on pullulan (pullulan), it exhibits a hydrolytic activity that breaks down alpha-1,6 glucoside bonds, thereby producing maltotriose. In addition, in the case of using amylopectin, a component of starch, and glycogen, which is an intracellular storage medium, the glycotransferase of the present invention has a hydrolytic activity of alpha-1,6 glucoside bond and alpha-1,4 glucoside sugar transfer. It can be active to produce various linear maltooligosaccharides.

또한, 본 발명의 당전이효소는 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가질 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 당전이효소는 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린의 치환당이 결합되어 있지 아니한 다른 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린 에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가질 수 있다. 상기 측쇄 치환당은 말토올리고당일 수 있고, 바람직하게는 글루코오스 분자수 2 내지 5개로 이루어진 말토올리고당일 수 있으며, 바람직하게는 말토오스 또는 말토트라이오스일 수 있다. In addition, the glycotransferase of the present invention hydrolyzes the sugar transfer activity of binding maltooligosaccharide to the cyclic glucose of branched cyclodextrin and the glucoside linkage of the branched cyclodextrin bound branched cyclodextrin and the cyclic glucose of branched cyclodextrin. It may have an activity to. Preferably, the sugar transferase of the present invention has a sugar transfer activity that binds maltooligosaccharides to another ring-constituting glucose to which branched cyclodextrins having one side chain substituted sugar are not bound and side chain substitutions bound to branched cyclodextrins. It can have the activity of hydrolyzing the glucoside bond of the ring-constituting glucose of sugar and branched cyclodextrin. The side chain substituted sugar may be maltooligosaccharide, preferably maltooligosaccharide having 2 to 5 glucose molecules, and preferably maltose or maltotriose.

구체적으로는, 말토오스가 알파-1,6-글루코시드 결합으로 베타-사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 연결되어 있는 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 기질로 하는 경우, 말토오실-베타-사이클로덱스트린으로부터 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조할 수 있다. 상기 말토오실-베타-사이클로덱스트린으로부터 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 생성하는 기작은 도 12에 나타내었다. 상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 당전이효소는 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 치환당과 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스간의 알파-1,6-글루코시드 결합을 분해하여 말토오스와 베타-사이클로덱스트린을 형성함과 동시에 말토오스를 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 알파-1,6-글루코시드 결합으로 전이하여, 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조할 수 있는 활성을 갖는다. Specifically, when maltose is based on maltoosyl-beta-cyclodextrin, which is linked to cyclic glucose of beta-cyclodextrin by alpha-1,6-glucoside bond, dies from maltosyl-beta-cyclodextrin Maltosyl-beta-cyclodextrin can be prepared. The mechanism for generating dimaltosyl-beta-cyclodextrin from the maltosyl-beta-cyclodextrin is shown in FIG. 12. As shown in FIG. 12, the glycotransferase degrades maltose and beta-cyclodextrin by decomposing alpha-1,6-glucosidic bonds between substituted sugars of maltosyl-beta-cyclodextrin and cyclic glucose of cyclodextrin. At the same time, maltose is transformed into an alpha-1,6-glucoside bond to the ring-constituting glucose of maltosyl-beta-cyclodextrin, thereby having the activity to prepare dimaltosyl-beta-cyclodextrin.

또한, 본 발명의 당전이효소는 말토트라이오스가 존재하는 조건 및 pH 5.5 및 75℃의 조건에서 아밀로오스 분해반응을 수행하는 경우, 1분당 1 μg의 아밀로오스를 분해하는 효소량을 1 단위(unit, U)로 정하였을 때, 본 발명의 당전이효소의 역가(unit)는 6 U/mg(unit/효소량)이고, 분지 사이클로덱스트린에 상기 당전이효소 0.6 U/mg(unit/분지 사이클로덱스트린량)을 첨가하여 반응시키는 경우, 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린으로부터 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조할 수 있는 바람직한 반응시간이 15 내지 30분인 당전이효소일 수 있다.In addition, the glycotransferase of the present invention is 1 unit (unit, U) to decompose amylose per minute when the amylose decomposition reaction in the presence of maltotriose and pH 5.5 and 75 ℃ conditions ), The titer of the sugar transferase of the present invention is 6 U / mg (unit / enzyme amount), and branched cyclodextrin is 0.6 U / mg (unit / branch cyclodextrin amount). In the case of addition reaction, a sugar transfer agent having a preferred reaction time of 15 to 30 minutes from branched cyclodextrin having one side chain substituted sugar to branched cyclodextrin having side chain substituted sugar in two branched cyclodextrins of branched cyclodextrin is prepared. It may be an enzyme.

상기 당전이효소의 역가의 측정은 기질용액에 당전이효소를 첨가하고 75℃에서 반응을 수행한 후에, 루골 용액(Lugol's solution) 1 ml를 반응액 100 μl에 첨가하고 혼합하여 반응을 중단시키고, 상기 반응이 중단된 반응액을 620 nm에서 흡광도를 측정하고 상기 측정된 흡광도를 아밀로오스 표준 곡선과 비교하여 역가를 측정하였다(Tachibana, Y., Takaha, T., Fujiwara, S., Takagi, M., and Imanaka, T., Acceptor specificity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus kodakaraensis KOD1, and synthesis of cycloamylose. J. Biosci. Bioeng., 90, 406-409(2000).; Tang, S.Y., Yang, S.J., Cha, H., Woo, E.J., Park, C., and Park, K.H., Contribution of W229 to the transglycosylation activity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus furiosus. Biochim. Biophys. Acta, 1764, 1633-1638(2006).).To measure the titer of the glycotransferase, after adding the glycotransferase to the substrate solution and performing the reaction at 75 ° C., 1 ml of Lugol's solution was added to 100 μl of the reaction solution and mixed to stop the reaction. The reaction solution was stopped at the reaction was measured for absorbance at 620 nm and the titer was measured by comparing the measured absorbance with the amylose standard curve (Tachibana, Y., Takaha, T., Fujiwara, S., Takagi, M.). , and Imanaka, T., Acceptor specificity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus kodakaraensis KOD1, and synthesis of cycloamylose.J . Biosci.Bioeng ., 90, 406-409 (2000) .; Tang, SY, Yang, SJ, Cha, H., Woo, EJ, Park, C., and Park, KH, Contribution of W229 to the transglycosylation activity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus furiosus . Biochim. Biophys. Acta, 1764, 1633-1638 (2006).).

상기 기질용액은 바람직하게는 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 0.2%(w/v)로 용해된 아밀로오스 250 μl, 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 용해된 200 mM 말토트라이오스 50 μl 및 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5) 600 μl을 혼합하여 제조할 수 있으며, 아밀로오스 분해 산물 수용체인 말토트라이오스를 첨가하지 않는 경우에는, 상기 말토트라이오스 용액 50 μl 대신에 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액 50 μl을 첨가하여 제조할 수 있다.The substrate solution is preferably 200 mM maltotriose dissolved in 250 μl of amylose, 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 0.2% (w / v). It can be prepared by mixing 50 μl and 600 μl of 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5), and in case of not adding maltotriose, an amylose degradation product receptor, 50 mM sodium instead of 50 μl of the maltotriose solution. It can be prepared by adding 50 μl of acetate buffer.

상기 흡광도의 측정은 일정 시간 반응을 진행시키면서, 매 분마다 반응액을 분리한 후에, 반응을 중단시키고 흡광도를 측정할 수 있으며, 상기 반응의 중단은 바람직하게는 루골 용액을 첨가하여 수행할 수 있다.The measurement of the absorbance can be carried out for a certain time while the reaction solution is separated every minute, the reaction can be stopped and the absorbance can be measured, and the reaction can be stopped by adding a Lugol solution. .

상기 루골 용액은 바람직하게는 0.2 g의 요오드(I₂)와 2.0 g의 요오드화칼륨(KI)을 1000 ml의 정제수에 녹여 제조할 수 있다.The Lugol solution may be prepared by dissolving 0.2 g of iodine (I ₂ ) and 2.0 g of potassium iodide (KI) in 1000 ml of purified water.

상기 측정된 흡광도를 기준으로 정하여진 본 발명의 당전이효소의 역가 즉, 1 단위(unit, U)는 1분당 1 μg의 아밀로오스를 분해하는 효소량이다. The titer, ie, 1 unit (U), of the sugar transferase of the present invention determined based on the measured absorbance is the amount of enzyme that degrades 1 μg of amylose per minute.

상기 당전이효소의 역가를 기준으로 할 때, 본 발명의 당전이효소는 말토트 라이오스를 첨가하지 않은 경우에는 0.35 U/mg(unit/효소량), 말토트라이오스를 첨가한 경우에는 6 U/mg(unit/효소량)의 역가가 있는 것으로 확인되었다. 즉, 말토트라이오스를 첨가하는 경우에 본 발명의 당전이효소 1mg은 1분에 아밀로오스 6 μg의 아밀로오스를 분해하는 것으로 확인되었다.Based on the titer of the sugar transferase, the sugar transferase of the present invention is 0.35 U / mg (unit / enzyme amount) without adding maltotriose, and 6 U / mg with addition of maltotriose It was confirmed that there is a titer of (unit / enzyme amount). That is, when maltotriose was added, 1 mg of the sugar transferase of the present invention was found to degrade 6 μg of amylose in one minute.

본 발명의 당전이효소의 유전자는 서열번호 4의 단백질을 암호하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 상기 서열번호 4의 단백질을 암호하는 핵산 서열의 예로는 서열번호 3으로 기재한 핵산 서열이 있다. 상기 서열번호 3의 유전자 서열은 도 1에 나타내었다.The gene of the glycotransferase of the present invention is composed of a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a protein of SEQ ID NO: 4. An example of a nucleic acid sequence encoding the protein of SEQ ID NO: 4 is a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. The gene sequence of SEQ ID NO: 3 is shown in FIG. 1.

본 발명의 당전이효소는 설펄로버스 설파타리쿠스로부터 분리되거나 유전공학적인 방법으로 제조될 수 있다. 상기 유전공학적인 방법은 통상의 공지된 방법일 수 있고, 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물에서 유래된 진핵세포를 이용하여 단백질을 생산하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 당전이효소를 제조하 는 방법은 미생물 발현 생산시스템을 통하여 생산할 수 있다.Glycotransferases of the present invention can be isolated from sulfalobus sulfataricus or prepared by genetic engineering methods. The genetic engineering method may be a conventionally known method, and may be a method for producing a protein using eukaryotic cells derived from prokaryote, eukaryote or eukaryote. Preferably the method for producing a sugar transferase of the present invention can be produced through a microbial expression production system.

일 예로, 본 발명의 당전이효소를 제조하는 방법은 (a) 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 분리된 당전이효소를 암호하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체를 배양하여 당전이효소를 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다.In one embodiment, the method for producing a glycotransferase of the present invention comprises the steps of: (a) preparing a recombinant vector by inserting a DNA sequence encoding a glycotransferase isolated from Sulfolobus solfataricus into a vector; (b) introducing the recombinant vector into a host cell to prepare a transformant; And (c) it can be produced by a method comprising culturing the transformant to produce a sugar transferase.

상기 (a) 단계에서, 상기 재조합 벡터는 상기 당전이효소를 암호하는 유전자가 공지의 벡터에 발현가능하도록 삽입되는 재조합 벡터일 수 있다. 상기 공지의 벡터는 미생물, 바람직하게는 효모, 대장균 또는 곰팡이에서 이종 단백질을 발현하기 위하여 제안된 모든 종류의 벡터일 수 있으며, 통상의 선별마커, 리포터 유전자 또는 재조합 단백질의 분리를 용이하게 하기 위한 수단을 더욱 포함할 수 있다. 상기 선별마커는 항생제 내성 유전자 또는 옥소트로피에 관련된 유전자일 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 벡터는 p6xHis119(김태집, 박사학위논문, 서울대학교, 1988), pUC119 또는 pET29(b)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 p6xHis119일 수 있다. In the step (a), the recombinant vector may be a recombinant vector is inserted so that the gene encoding the glycotransferase can be expressed in a known vector. The known vector may be any kind of vector proposed for expressing a heterologous protein in a microorganism, preferably in yeast, E. coli or fungus, and means for facilitating the separation of conventional selection markers, reporter genes or recombinant proteins. It may further include. The selection marker may be an antibiotic resistance gene or a gene related to oxotropy. The vector may be selected and used according to the type of host cell. More preferably, the vector may be p6xHis119 (Kim Tae-jib, Ph.D. dissertation, Seoul National University, 1988), pUC119 or pET29 (b), and most preferably p6xHis119.

상기 (a) 단계에서 제조된 재조합 벡터는 본 발명의 일실시예에 따른 서열번호 4의 당전이효소를 암호하는 DNA와 p6xHis119를 결합하여 제조한 p6xHSGDE 벡터일 수 있다. 상기 재조합 벡터 p6xHSGDE의 개열지도는 도 2에 나타내었다.The recombinant vector prepared in step (a) may be a p6xHSGDE vector prepared by combining p6xHis119 with DNA encoding a glycotransferase of SEQ ID NO: 4 according to an embodiment of the present invention. A cleavage map of the recombinant vector p6xHSGDE is shown in FIG. 2.

상기 (b) 단계는 형질전환체를 제조하는 단계로 상기 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 바람직하게는 대장균, 유산균, 효모 또는 곰팡이일 수 있다. 형질전환체를 제조하는 방법은 통상의 방법일 수 있으며, 바람직하게는 CaCl₂ 및 열충격(heat-shock)을 이용하는 방법으로 형질전환체를 제조할 수 있다.The step (b) is to prepare a transformant, the host cell may be a prokaryote, eukaryote or eukaryote-derived cells, preferably E. coli, lactic acid bacteria, yeast or fungi. The method for preparing the transformant may be a conventional method, and preferably, the transformant may be prepared by using CaCl ₂ and heat-shock.

상기 (c) 단계는 형질전환체를 배양하여 당전이효소를 생산하는 단계로 형질전화체를 배양하는 배지는 숙주세포에 따라 적합한 배지를 선택할 수 있으며, 배양 조건 역시 숙주세포에 따라 적합한 조건을 선택할 수 있다.The step (c) is a step of culturing the transformant to produce a glycotransferase. The medium for culturing the transformant may select a suitable medium according to the host cell, and the culture conditions may also be selected according to the host cell. Can be.

본 발명은 또한, 상기 당전이효소를 생산하는 형질전환체를 제공한다.The present invention also provides a transformant for producing the sugar transferase.

상기 형질전환체는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래되고, pH 5.5 내지 pH 6.5 및 70℃ 내지 80℃에서 최적활성을 갖고, pH 3 내지 pH 11 및 60℃ 내지 95℃에서 안정성이 있으며, 분자량이 82kDa 내지 84kDa이고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가지는 당전이효소를 생산하는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물에서 유래된 진핵세포일 수 있으며, 바람직하게는 원핵생물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 효모, 대장균 또는 곰팡이일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균(E. coli)일 수 있다. The transformant is derived from Sulfolobus solfataricus , has an optimum activity at pH 5.5 to pH 6.5 and 70 to 80 ℃, stability at pH 3 to pH 11 and 60 to 95 ℃ Hydrolysing the glycosylation activity of the branched cyclodextrin bound to branched cyclodextrin and branched cyclodextrin bound to the glucoside bond of branched cyclodextrin and glycotransferase activity of the molecular weight of 82 kDa to 84 kDa It may be a prokaryote, eukaryote, or eukaryote derived from a eukaryotes producing a glycotransferase having an activity, preferably a prokaryote, more preferably yeast, E. coli or fungi, most Preferably it may be E. coli .

본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 형질전환체인 Escherichia coli(E. coli) MC1061/p6xHSGDE는 2006년 11월 23일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은 동 52번지에 소재한 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였으며, 2006년 11월 23일자에 기탁번호 KCTC 11035BP를 부여받았다. Escherichia coli ( E. coli ) MC1061 / p6xHSGDE, a transformant prepared according to an embodiment of the present invention, was deposited on November 23, 2006, at the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank, located at 52, Yue-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea. On November 23, 2006, a deposit number KCTC 11035BP was assigned.

또한 상기 당전이효소의 생산방법은 상기 (c)단계 이후에, 형질전환체 균주로부터 당전이효소를 분리 또는 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 당전이효소의 분리 또는 정제는 통상의 방법에 의할 수 있으며, 일 예로는 원심분리 또는 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다. In addition, the production method of the sugar transferase may further comprise the step of separating or purifying the sugar transferase from the transformant strain after the step (c). Separation or purification of the sugar transferase may be by a conventional method, for example, it may be carried out by centrifugation or chromatography.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 형질전환체인 E. coli MC1061/p6xHSGDE를 암피실린이 첨가된 LB배지에서 30℃ 내지 37℃의 조건으로 10 내지 20시간, 바람직하게는 17시간 배양하여 다량의 당전이효소를 생산한 후에, 세포내 발현된 당전이효소를 균체수득, 균체 파쇄 또는 용혈(lysis), 상등액 분리 및 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다. 보다 상세하게는 상기 균체를 파쇄한 후에 원심분리를 하여 상등액을 취하고 열처리를 한 후에, 상기 열처리한 상등액에 대해 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, E. coli MC1061 / p6xHSGDE, which is the transformant, is cultured in LB medium to which ampicillin is added at a temperature of 30 ° C. to 37 ° C. for 10 to 20 hours, preferably 17 hours, to provide a large amount of sugar. After production of the transferase, intracellularly expressed glycotransferase may be purified through cell harvest, cell disruption or hemolysis, supernatant separation and chromatography. In more detail, after crushing the cells, the supernatant is collected by centrifugation and subjected to heat treatment, and then purified by chromatography on the heat treated supernatant.

상기 크로마토그래피는 상세하게는 Q-세파로즈 크로마토그래피, DEAE-toyopearl 크로마토그래피 또는 GPC(gel permeation chromatography)순으로 실시하는 이온교환 크로마토그래피 또는 니켈 친화성 크로마토그래피일 수 있으며, 바람직하게는 니켈 친화성 크로마토그래피일 수 있다. Specifically, the chromatography may be Q-sepharose chromatography, DEAE-toyopearl chromatography, or gel permeation chromatography (GPC), or ion exchange chromatography or nickel affinity chromatography, preferably nickel affinity chromatography. Chromatography.

상기 본 발명의 당전이효소 생산방법은 모균주를 이용한 생산방법에 비하여 배양온도를 낮추어 실시하므로써 미생물 배양비용을 줄일 수 있는 효과와 효소의 생산성을 증가시킬 수 있다는 장점이 있다.The method of producing a sugar transferase of the present invention has the advantage of reducing the microbial culture cost and increasing the productivity of the enzyme by lowering the culture temperature as compared with the production method using the parent strain.

본 발명은 또한 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 기질에 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래한 당전이효소를 첨가하고 반응시켜 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하는 단계를 포함하는 분지 사이클로덱스트린 제조방법을 제공한다. The present invention also adds and reacts a glycotransferase derived from Sulfolobus solfataricus to a substrate containing a branched cyclodextrin having one side chain substituted sugar, and reacts the side chain to two cyclic glucose of the cyclodextrin. It provides a branched cyclodextrin manufacturing method comprising the step of preparing a branched cyclodextrin having a substituted sugar.

보다 상세하게는, 본 발명의 제조방법은More specifically, the manufacturing method of the present invention

1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 기질에 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래되고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가지는 당전이효소를 첨가하며, It is derived from Sulfolobus solfataricus on a substrate containing branched cyclodextrins having one side chain substituted sugar, and the sugar transfer activity and branched cyclodextrins which bind maltooligosaccharides to the cyclic glucose of branched cyclodextrins. A sugar transferase having an activity of hydrolyzing the glucoside bond of the ring-side glucose of the branched cyclodextrin and the branched cyclodextrin is added,

pH 5.0 내지 pH 7.0 및 60℃ 내지 80℃에서 반응시켜, by reacting at pH 5.0 to pH 7.0 and 60 ° C. to 80 ° C.,

분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하는 단계를 포함하는 분지 사이클로덱스트린 제조방법일 수 있다.It may be a method of preparing branched cyclodextrins comprising the step of preparing branched cyclodextrins having side chain substituted sugars in two ring-constituting glucose of branched cyclodextrins.

상기 분지 사이클로덱스트린은 알파-분지 사이클로덱스트린(alpha-branched cyclodextrin), 분지 베타-사이클로덱스트린(beta-branched cyclodextrin) 또는 분지 감마-사이클로덱스트린(gamma-branched cyclodextrin)이거나 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 분지 사이클로덱스트린은 알파-분지 사이클로덱스트린, 분지 베타-사이클로덱스트린 또는 분지 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.The branched cyclodextrins may be alpha-branched cyclodextrins, branched beta-branched cyclodextrins or branched gamma-branched cyclodextrins or mixtures thereof, preferably The branched cyclodextrin may be any one selected from the group consisting of alpha-branched cyclodextrins, branched beta-cyclodextrins or branched gamma-cyclodextrins.

상기 측쇄 치환당은 말토올리고당일 수 있고, 바람직하게는 글루코오스 분자수 2 내지 7개로 이루어진 말토올리고당일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 글루코오스 분자 2 내지 5개로 이루어진 말토올리고당일 수 있고, 가장 바람직하게는 말토오스 또는 말토트라이오스일 수 있다. The side chain substituted sugar may be maltooligosaccharide, preferably maltooligosaccharide having 2 to 7 glucose molecules, more preferably maltooligosaccharide having 2 to 5 glucose molecules, and most preferably maltose or It may be maltotriose.

상기 제조방법의 기질은 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 수용액일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 %의 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 수용액일 수 있다.The substrate of the preparation method may be one containing a branched cyclodextrin having one side chain substituted sugar, preferably an aqueous solution containing a branched cyclodextrin having one side chain substituted sugar, more preferably from 0.5 to It may be an aqueous solution comprising branched cyclodextrins having 5% of one side chain substituted sugar.

상기 당전이효소는 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 기질에 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래되고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가지는 당전이효소일 수 있으며, 바람직하게는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus sulfataricus)에서 유래되고, pH 5.5 내지 pH 6.5 및 70℃ 내지 80℃에서 최적활성을 갖고, pH 3 내지 pH 11 및 60℃ 내지 95℃에서 안정성이 있고, 분자량이 82kDa 내지 84kDa이고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가지는 당전이효 소일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인 당전이효소일 수 있다.The glycotransferase is derived from Sulfolobus solfataricus on a substrate containing branched cyclodextrins having one side chain substituted sugar, and a sugar transfer activity that binds maltooligosaccharides to cyclic glucose of branched cyclodextrins. And a glycotransferase having the activity of hydrolyzing the glucosidic bond of the ring-forming glucose of the branched cyclodextrin and the branched cyclodextrin bound to the branched cyclodextrin, preferably in Sulfolobus sulfataricus Derived, having an optimum activity at pH 5.5 to pH 6.5 and 70 ° C. to 80 ° C., stable at pH 3 to pH 11 and 60 ° C. to 95 ° C., molecular weight of 82 kDa to 84 kDa, and cyclic glucose of branched cyclodextrins. Glycosylation activity that binds maltooligosaccharides to branched cyclodextrins It may be a glycotransferase having an activity of hydrolyzing the glucoside bond of the ring-constituting glucose of the branched chain substituted sugar and the branched cyclodextrin, and more preferably, it may be a glycotransferase which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

본 발명의 분지 사이클로덱스트린 제조방법은 상기 기질과 당전이효소를 pH 5.0 내지 pH 7.0, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 6.5 및 65℃ 내지 85℃ 및 , 바람직하게는 70℃ 내지 80℃에서 반응시키는 것일 수 있다. Branched cyclodextrin production method of the present invention is to react the substrate and the sugar transferase at pH 5.0 to pH 7.0, preferably pH 5.5 to pH 6.5 and 65 ℃ to 85 ℃ and, preferably 70 ℃ to 80 ℃ Can be.

상기 기질과 당전이효소의 반응시간은 10분 내지 60분, 바람직하게는 15분 내지 30분일 수 있다. The reaction time of the substrate and the sugar transferase may be 10 minutes to 60 minutes, preferably 15 minutes to 30 minutes.

본 발명의 분지 사이클로덱스트린 제조방법은 상기 기질과 당전이효소를 반응시킨 후에, 추가로 상기 반응액을 90℃ 내지 120℃, 바람직하게는 90℃ 내지 110℃에서 10분 내지 20분, 바람직하게는 15분간 가열하여 반응을 종결시키고, 반응을 종결시킨 상기 반응액에 대해 크로마토그래피를 수행하여 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In the method for preparing branched cyclodextrins of the present invention, the reaction solution is further reacted with the reaction solution at 90 ° C to 120 ° C, preferably at 90 ° C to 110 ° C, for 10 minutes to 20 minutes, preferably The reaction was terminated by heating for 15 minutes, and the reaction solution which terminated the reaction was subjected to chromatography to purify the branched cyclodextrin having branched-substituted sugars in two ring-constituting glucoses of the branched cyclodextrin. Can be.

또한, 본 발명의 당전이효소는 말토트라이오스가 존재하는 조건 및 pH 5.5 및 75℃의 조건에서 아밀로오스 분해반응을 수행하는 경우, 1분당 1μg의 아밀로오스를 분해하는 효소량을 1 단위(unit, U)로 정하였을 때, 본 발명의 당전이효소의 역가(unit)는 6U/mg(unit/효소량)이고, 상기 당전이효소의 함량은 1mg/ml 사이클로덱스트린에 상기 당전이효소 0.6U을 첨가하여 반응시키는 경우, 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린으로부터 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조할 수 있는 바람직 한 반응시간이 15분 내지 30분인 당전이효소일 수 있다.In addition, the sugar transferase of the present invention is 1 unit (unit U) to decompose 1 μg of amylose per minute when the amylose decomposition reaction is performed under conditions in which maltotriose is present and pH 5.5 and 75 ° C. When set to, the titre (unit) of the sugar transferase of the present invention is 6U / mg (unit / enzyme amount), the content of the sugar transferase is 1mg / ml cyclodextrin by adding 0.6U of the sugar transferase reaction In this case, a glycotransferase having a preferred reaction time of 15 minutes to 30 minutes can be prepared from branched cyclodextrins having one side chain substituted sugar to branched cyclodextrins having side chain substituted sugars in two ring-constituting glucoses of branched cyclodextrins. Can be.

또한, 상기 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성과 상기 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성을 고려하면, 상기 당전이효소의 함량이 6U 일 때, 상기 반응을 15분 내지 30분 수행하여 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조방법이 바람직하다.In addition, considering the activity of hydrolyzing the glucosidic bond of the ring-chain glucose of the branched cyclodextrin and the branched cyclodextrin bound to the branched cyclodextrin, and the sugar transfer activity of binding maltooligosaccharide to the ring-constituting glucose of the branched cyclodextrin When the content of the sugar transferase is 6U, the reaction is performed for 15 minutes to 30 minutes to prepare a branched cyclodextrin having a branched chain substituted sugar in two ring-constituting glucose of the branched cyclodextrin.

상기 반응을 15분 이하로 수행하는 경우, 충분한 반응을 수행하지 못하여 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린이 충분히 제조되지 아니하고, 상기 반응을 30분 이상으로 수행하는 경우, 상기 당전이효소가 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린의 측쇄 치환당을 가수분해하여 오히려 수율이 떨어지게 될 수 있다.When the reaction is carried out for 15 minutes or less, a sufficient reaction cannot be performed, and branched cyclodextrins having side chain substituted sugars in two ring-constituting glucose of branched cyclodextrins are not sufficiently prepared, and the reaction is performed for 30 minutes or more. In this case, the sugar transferase hydrolyzes the side chain substituted sugars of the branched cyclodextrins having side chain substituted sugars in two ring-constituting glucoses of the branched cyclodextrins, so that the yield may be lowered.

상기 크로마토그래피는 액체크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있으며, 바람직하게는 액체크로마토그래피일 수 있고, 더욱 바람직하게는 겔투과컬럼을 이용한 액체크로마토그래피일 수 있다.The chromatography may be liquid chromatography or anion exchange chromatography, preferably liquid chromatography, and more preferably liquid chromatography using a gel permeation column.

상기 액체크로마토그래피는 일 예로 겔투과컬럼을 이용하여 수행할 수 있으며, 유동속도(flow rate)는 1.8ml/min 내지 2.2ml/min, 바람직하게는 2.0ml/min일 수 있다.The liquid chromatography may be performed using, for example, a gel permeation column, and a flow rate may be 1.8 ml / min to 2.2 ml / min, preferably 2.0 ml / min.

보다 상세하게는, 본 발명의 분지 사이클로덱스트린 제조방법은 상기 분지 사이클로덱스트린 제조방법은 말토오실-베타-사이클로덱스트린 수용액에 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 당전이효소를 첨가하고 15분 내지 30분 반응시킨 후에, 90℃ 내지 120℃로 10분 내지 20분 가열하여 반응을 종결시키고, 반응을 종결시킨 상기 반응액에 대해 액체 크로마토그래피를 수행하여 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린를 정제하는 것일 수 있다.More specifically, the branched cyclodextrin production method of the present invention, the branched cyclodextrin production method is 15 minutes to 30 minutes after addition of a glycotransferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 to the aqueous solution of maltosyl-beta-cyclodextrin After the reaction, the reaction may be terminated by heating at 90 ° C. to 120 ° C. for 10 to 20 minutes, and purification of the dimaltosyl-beta-cyclodextrin may be performed by performing liquid chromatography on the reaction solution.

본 발명의 제조방법에 의할 경우, 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린에 본 발명의 당전이효소를 반응시켜 분지 사이클로덱스트린에 결합되어 있는 말토올리고당을 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린에 추가로 전이시켜 2개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하여 사이클로덱스트린의 수용성을 높일 수 있다. 구체적으로, 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린 기질에 본 발명의 당전이효소를 반응시키는 경우, 기질 중 일부의 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스와 측쇄 치환당의 글루코시드 결합을 가수분해하고, 상기 가수분해에 의해 얻어진 측쇄 치환당 즉, 말토올리고당을 기질 중 측쇄 치환당이 결합되어 있는 일부의 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 중 말토올리고당이 결합되어 있지 아니한 글루코스에 추가로 결합시켜, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하여, 수용성이 증가된 사이클로덱스트린을 제조할 수 있다. According to the preparation method of the present invention, the sugar transferase of the present invention is reacted with a branched cyclodextrin having one side chain substituted sugar, and maltooligosaccharides bound to the branched cyclodextrin are added to the branched cyclodextrin having side chain substituted sugars. The branched cyclodextrin having two side chain substituted sugars can be prepared to increase the water solubility of the cyclodextrin. Specifically, when the glycotransferase of the present invention is reacted with a branched cyclodextrin substrate having one side chain substituted sugar, hydrolysis of the glucoside linkage between the cyclic glucose of the branched cyclodextrin of the substrate and the side chain substituted sugar is performed. The branched chain substituted sugar obtained by hydrolysis, that is, maltooligosaccharide, is further bound to glucose which is not bound to maltooligosaccharide in the ring-constituting glucose of branched cyclodextrin to which side chain substituted sugar is bound in the substrate. Branched cyclodextrins having side chain substituted sugars in two ring-constituting glucoses can be prepared to produce cyclodextrins with increased water solubility.

상기한 바와 같이, 분지 사이클로덱스트린에 결합되어 있는 상기 측쇄 치환당은 말토올리고당일 수 있고, 바람직하게는 글루코오스 분자수 2개 내지 5개로 이루어진 말토올리고당일 수 있으며, 바람직하게는 말토오스 또는 말토트라이오스일 수 있다. As described above, the side chain substituted sugars bound to the branched cyclodextrin may be maltooligosaccharides, preferably maltooligosaccharides having 2 to 5 glucose molecules, preferably maltose or maltotriose. have.

일 예로, 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 기질로 본 발명의 당전이효소를 반응시키는 경우, 상기 당전이효소는 기질 중 일부 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 말토오실기를 가수분해하고, 상기 가수분해에 의해 분리된 말토오스가 기질 중 일부 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 중 말토오실기가 결합되어 있지 아니한 글루코스에 결합되어 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조하여, 베타-사이클로덱스트린 또는 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 비하여 수용성이 현저하게 증가된 분지 베타-사이클로덱스트린을 제조할 수 있다For example, when the glycotransferase of the present invention is reacted with maltosyl-beta-cyclodextrin as a substrate, the glycosylase hydrolyzes the maltosyl group of some maltosyl-beta-cyclodextrin in the substrate, and the hydrolysis is performed. Maltose separated by is bound to glucose in which no maltoosyl group is bound in the ring-constituting glucose of some maltoosyl-beta-cyclodextrins in the substrate to prepare dimaltosyl-beta-cyclodextrin, thereby producing beta-cyclodextrin or maltose. Branched beta-cyclodextrins can be prepared with significantly increased water solubility compared to oscill-beta-cyclodextrins.

또한, 본 발명의 제조방법은 효소를 이용한 생촉매반응에 의해 반응을 진행함으로써, 수용성이 높아진 분지 사이클로덱스트린을 용이하게 얻을 수 있으며, 종래기술과 비교하여 반응 결과물 즉, 분지 사이클로덱스트린의 순도가 높아, 반응 결과물에서 이를 분리하는 것이 용이하다는 장점이 있다.In addition, the production method of the present invention can easily obtain a branched cyclodextrin with high water solubility by proceeding the reaction by a biocatalytic reaction using an enzyme, the purity of the reaction product, that is, the branched cyclodextrin compared to the prior art The advantage is that it is easy to separate it from the reaction product.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하게 나타내기 위하여 본 발명의 일 예를 기재한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, examples of the present invention will be described. The following examples are only examples of the present invention in order to more clearly show the present invention, the protection scope of the present invention is not limited to the following examples.

[[ 실시예Example ]]

실시예 1: 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 내열성 당전이효소 유전자 클로닝 및 생산Example 1 Cloning and Production of Heat-Resistant Glycotransferase Gene Derived from Sulfur Rover Sulfataricus

1-1. 당전이효소 유전자 클로닝1-1. Glycotransferase Gene Cloning

설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus, ATCC 35092)의 염색체 DNA는 QIAmp Tissue Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 균주로부터 Genomic DNA를 Kit을 이용하여 분리한 후에 그것으로부터 아래의 PCR 방법을 이용하여 유전자를 분리하였다.The chromosomal DNA of Sulfolobus solfataricus (ATCC 35092) was isolated from the strain using the QIAmp Tissue Kit (Qiagen, Germany) from the strain using the kit, and the gene was isolated using the following PCR method. Was separated.

상기 내열성 당전이효소 유전자를 분리하기 위하여 정방향 프라이머 SS2094-NdeI(5'-GTTAAGTACACATATGGCATTATTCTTCAG-3') 및 역방향 프라이머 SS2094-HindIII(5'-CCTATACGAAGCTTTTATCATAATTCTATC-3')를 각각 제작하였으며, 상기 프라이머는 하기 표 1과 같다.In order to isolate the heat-resistant glycotransferase gene, a forward primer SS2094-NdeI (5'-GTTAAGTACACATATGGCATTATTCTTCAG-3 ') and a reverse primer SS2094-HindIII (5'-CCTATACGAAGCTTTTATCATAATTCTATC-3') were prepared, respectively. Is the same as

[표 1]TABLE 1

서열order 서열번호SEQ ID NO: 정방향 프라이머 SS2094-NdeIForward primer SS2094-NdeI 5'-GTTAAGTACACATATGGCATTATTCTTCAG-3'5'-GTTAAGTACACATATGGCATTATTCTTCAG-3 ' 1One 역방향 프라이머 SS2094-HindIIIReverse primer SS2094-HindIII 5'-CCTATACGAAGCTTTTATCATAATTCTATC-3'5'-CCTATACGAAGCTTTTATCATAATTCTATC-3 ' 22

설펄로버스 설파타리쿠스 염색체 DNA에 대해 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 PCR 산물을 수득하였으며, 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 약 2.2 kb임을 확인하였다. 상기 PCR의 조건은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.PCR products were obtained by PCR using the forward primers and the reverse primers on the sulfaphorus sulfataricus chromosomal DNA. PCR products were obtained by electrophoresis, and the size of the PCR products was about 2.2 kb. It was. The conditions of the PCR are as described in Table 2 below.

[표 2]TABLE 2

단계(step)Step 온도Temperature 반응시간Reaction time First(1^st) denaturationFirst (1 ^st ) denaturation 95℃95 ℃ 5 min5 min Second(2^st) denaturationSecond (2 ^st ) denaturation 95℃95 ℃ 30 sec30 sec AnnealingAnnealing 55℃55 ℃ 30 sec30 sec ExtensionExtension 72℃72 ℃ 2 min2 min CycleCycle go to denaturationgo to denaturation 33 cycle33 cycle Final extensionFinal extension 72℃72 ℃ 7 min7 min

상기 PCR 산물을 37℃에서 6시간 동안 제한효소 Nde I과 Hind III(New England Biolabs(NEB), USA)로 처리하고, 이를 동일한 제한 효소로 동일한 조건에서 처리한 p6XHis119(김태집, 박사학위논문, 서울대학교, 1988) 발현벡터와 ligase(New England Biolabs(NEB), USA)를 이용하여 12시간동안 16℃에서 라이게이션하여 p6xHSGDE를 제조하였다. 상기 p6xHSGDE의 벡터 맵을 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 PCR산물과 벡터는 Nde I과 Hind III의 제한효소 부위에 의해 결합되어 있으며, 당전이효소 유전자와 5'말단에 6개의 부가적인 히스티딘 잔기를 포함하고 있다. The PCR product was restriction enzyme Nde for 6 hours at 37 ℃. I and Hind III (New England Biolabs (NEB), USA), and p6XHis119 (Tae-Gwi Kim, Ph.D. Thesis, Seoul National University, 1988) expression vector and ligase (New England Biolabs () NEB), USA) was ligated at 16 ° C. for 12 hours to prepare p6xHSGDE. The vector map of the p6xHSGDE is shown in FIG. 1. As shown in FIG. 1, the PCR product and the vector are bound by restriction sites of Nde I and Hind III, and include glycotransferase genes and six additional histidine residues at the 5 'end.

상기 재조합 벡터 p6xHSGDE를 숙주세포에 형질전환 시키기 위하여, 5ml LB 액체 배지에 숙주 세포인 E. coli MC1016(New England Biolabs(NEB), USA)를 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0ml을 새로운 LB 액체 배지 50ml에 접종하여 600nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 상기 흡광도를 확인한 배양액 1.5ml를 4℃에서 7000 x g의 조건으로 5분간 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 0.75ml의 형질전환용액I(50mM CaCl₂)으로 현탁하고 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 이후 4℃에서 6000 x g의 조건으로 2분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수된 균체를 0.15ml의 형질전환용액II(100mM CaCl₂)로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다. In order to transform the recombinant vector p6xHSGDE into host cells, 5 ml LB liquid medium was inoculated with E. coli MC1016 (New England Biolabs (NEB), USA), which is a host cell, and incubated at 37 ° C. for 12 hours, and 1.0 ml of the culture solution was inoculated. 50 ml of fresh LB liquid medium was inoculated and incubated at 600 nm until the absorbance was 0.5. The cells were recovered by centrifugation of 1.5 ml of the culture solution having confirmed the absorbance at 4 ° C. under 7000 × g for 5 minutes, and then suspended with 0.75 ml of Transfection Solution I (50 mM CaCl ₂ ) and left for 30 minutes in ice. Thereafter, the cells were recovered by centrifugation at 4 ° C. under 6000 × g for 2 minutes, and the recovered cells were suspended in 0.15 ml of transformation solution II (100 mM CaCl ₂ ) and left in ice for 30 minutes.

현탁액 0.15ml와 500ng의 상기 라이게이션한 용액을 혼합하고, 얼음 속에서 1시간 방치한 후 42℃에서 2분간 열 충격을 주었다. 상기 열 충격을 준 혼합액에 0.8ml의 LB 액체 배지를 혼합한 후, 37℃에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 암피실린(최종농도 100μg/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다. 0.15 ml of the suspension and 500 ng of the ligated solution were mixed and allowed to stand for 1 hour in ice, followed by thermal shock at 42 ° C. for 2 minutes. 0.8 ml of LB liquid medium was mixed with the thermal shock mixture, followed by incubation at 37 ° C for 1 hour. The cultures incubated for 1 hour were plated on LB agar medium containing ampicillin (final concentration 100 μg / ml) to select strains showing resistance.

1차 선별된 균주를 암피실린이 포함된 LB 액체 배지 5ml에 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 플라스미드 분리키트(Qiagen, USA)로 회수된 균체로부터 플라스미드를 분리하고 상기와 동일한 Nde I과 Hind III제한 효소를 이용하여 상기와 동일한 조건에서 절단하여, 약 2.2kb의 크기의 유전자가 있는지 여부를 확인하였다.The first selected strains were inoculated in 5 ml of LB liquid medium containing ampicillin, incubated at 37 ° C. for 12 hours, and centrifuged to obtain cells. The plasmid was separated from the cells recovered by the plasmid separation kit (Qiagen, USA) and cleaved under the same conditions using the same Nde I and Hind III restriction enzymes as above, and the presence of a gene of about 2.2 kb was confirmed. It was.

1-2. 내열성 당전이효소의 생산 및 정제1-2. Production and Purification of Heat-resistant Glycotransferase

상기에서 제조한 p6xHSGDE 벡터를 E. coli MC1061에 상기와 동일한 방법으로 형질전환 시킨 후 암피실린 내성여부를 확인하여 형질전환체를 선별하였다. 상기 선별된 형질전환체I은 암피실린이 함유된 LB 액체 배지 2.5L에 접종하여 37℃에서 17시간 배양한 후, 4℃에서 7,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 300mM NaCl과 10mM 이미다졸이 함유된 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 현탁한 후 초음파 분쇄하였다. 상기 초음파 분쇄를 수행한 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 70℃에서 20분간 열처리한 다음, 10,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 수득된 상등액은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 주입하여, 정제하였다.The p6xHSGDE vector prepared above was transformed into E. coli MC1061 in the same manner as above, and the transformants were selected by confirming the ampicillin resistance. The selected transformant I was inoculated in 2.5 L of LB liquid medium containing ampicillin and incubated for 17 hours at 37 ° C., followed by centrifugation at 4 ° C. for 7,000 xg for 30 minutes to recover the cells. The recovered cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 300 mM NaCl and 10 mM imidazole, and then ultrasonically pulverized. The supernatant was collected by centrifugation of the culture solution subjected to the ultrasonic grinding, heat-treated at 70 ° C. for 20 minutes, and then centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes to obtain a supernatant. The obtained supernatant was purified by injection into Ni-NTA affinity chromatography.

재조합 벡터 p6xHSGDE로 형질전환 시킨 E. coli MC1061에서 생산된 설펄로버 스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 정제단계별 시료의 전기영동 사진을 도 3에 나타내었다. 상기 도 3의 M은 사이즈 마커이고, lane 1은 E. coli MC1061/p6xHSGDE 형질전환체를 초음파 분쇄하여 수득한 상등액이고, lane 2는 상기 초음파 분쇄 후 수득한 상득액의 시료를 65℃에서 20분간 열처리한 것이고, lane 3은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제한 당전이효소이다. Electrophoresis photographs of the samples of each step of purification of the sugar peroxidase-derived sugar transferase produced in E. coli MC1061 transformed with the recombinant vector p6xHSGDE are shown in FIG. 3. 3, M is a size marker, lane 1 is a supernatant obtained by ultrasonic grinding of an E. coli MC1061 / p6xHSGDE transformant, and lane 2 is a sample of the supernatant obtained after the ultrasonic grinding for 20 minutes at 65 ° C. Lane 3 is a sugar transferase purified by Ni-NTA affinity chromatography.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE상에서 상기 당전이효소의 크기는 약 83,000Da의 분자량을 나타내었으며, 이것은 아미노산 서열로부터 유추된 이론적 분자량인 83,090Da과 거의 유사한 값이었다.As shown in FIG. 3, the size of the glycotransferase on the SDS-PAGE showed a molecular weight of about 83,000 Da, which was almost similar to the theoretical molecular weight 83,090 Da inferred from the amino acid sequence.

실시예 2: 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 특성Example 2 Properties of Sulfur Rovers Sulfataricus Derived Glycotransferase

2-1. 효소 역가2-1. Enzyme titers

본 발명의 당전이효소의 역가는 아밀로오스 분해 산물의 수용체(acceptor)로 작용할 수 있는 말토트라이오스(G3)의 유무에 따라 구분하여 아밀로오스 분해활성을 이용하여 측정하였다(Tachibana, Y., Takaha, T., Fujiwara, S., Takagi, M., and Imanaka, T., Acceptor specificity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus kodakaraensis KOD1, and synthesis of cycloamylose. J. Biosci. Bioeng., 90, 406-409(2000).; Tang, S.Y., Yang, S.J., Cha, H., Woo, E.J., Park, C., and Park, K.H., Contribution of W229 to the transglycosylation activity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus furiosus. Biochim. Biophys. Acta, 1764, 1633-1638(2006).). The titer of the glycotransferase of the present invention was determined using amylose-degrading activity according to the presence or absence of maltotriose (G3), which may act as an acceptor of amylose degradation products (Tachibana, Y., Takaha, T , Fujiwara, S., Takagi, M., and Imanaka, T., Acceptor specificity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus kodakaraensis KOD1, and synthesis of cycloamylose.J . Biosci.Bioeng ., 90, 406-409 (2000 Tang, SY, Yang, SJ, Cha, H., Woo, EJ, Park, C., and Park, KH, Contribution of W229 to the transglycosylation activity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus furiosus . Biochim. Biophys. Acta, 1764, 1633-1638 (2006).).

상기 당전이효소의 역가를 측정하기 위한 기질용액은 다이메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 0.2%(w/v)로 용해된 아밀로오스 250μl, 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 용해된 200mM 말토트라이오스 50μl 및 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5) 600μl을 혼합하여 제조하였다. 아밀로오스 분해 산물 수용체인 말토트라이오스를 첨가하지 않는 기질용액의 경우, 상기 말토트라이오스 용액 50μl 대신에 50mM 소듐 아세테이트 완충용액 50μl을 첨가하였다.Substrate solution for measuring the activity of the sugar transferase is 200mM dissolved in 250μl, 50mM sodium acetate buffer solution (pH 5.5) dissolved in 0.2% (w / v) in dimethyl sulfoxide (DMSO) 50 μl of maltotriose and 600 μl of 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) were prepared by mixing. For the substrate solution without addition of the amylose degradation product receptor maltotriose, 50 μl of 50 mM sodium acetate buffer was added instead of 50 μl of the maltotriose solution.

상기 제조한 기질용액에 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 100μl를 넣고 75℃에서 20분 동안 반응을 수행하였다. 상기 반응을 수행한 반응액 중, 100μl를 분리한 것에 루골 용액(Lugol's solution) 1ml를 첨가하고 혼합하여 반응을 중단시켰다. 상기 루골 용액은 0.2g의 요오드(I₂)와 2.0g의 요오드화칼륨(KI)를 1000ml의 정제수에 녹여 제조하였다. 상기 반응을 중단시킨 후, 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도는 아밀로오스 표준 곡선과 비교하여 1분당 1μg의 아밀로오스를 분해하는 효소량을 1 단위(unit, U)로 정하였다. 100 μl of the sugar transferase purified in Example 1-2 was added to the prepared substrate solution, and the reaction was performed at 75 ° C. for 20 minutes. The reaction was stopped by adding 1 ml of Lugol's solution and mixing to 100 μl of the reaction solution. The lugol solution was prepared by dissolving 0.2 g of iodine (I ₂ ) and 2.0 g of potassium iodide (KI) in 1000 ml of purified water. After stopping the reaction, absorbance was measured at 620 nm. The measured absorbance was determined to be 1 unit (U) of an enzyme that degrades 1 μg of amylose per minute compared to the amylose standard curve.

상기 흡광도 측정에 의하여, 본 발명의 당전이효소는 말토트라이오스를 첨가하지 않은 경우에는 0.35U/mg(unit/효소량), 말토트라이오스를 첨가한 경우에는 6U/mg(unit/효소량)의 역가가 있는 것으로 확인되었다. 즉, 말토트라이오스를 첨가하는 경우에 본 발명의 당전이효소 1mg은 1분에 아밀로오스 6μg의 아밀로오스를 분해할 수 있는 것으로 확인되었다.By the above absorbance measurement, the sugar transferase of the present invention is 0.35 U / mg (unit / enzyme amount) when maltotriose is not added, and 6 U / mg (unit / enzyme amount) when maltotriose is added. It was confirmed that there is. That is, when maltotriose was added, it was confirmed that 1 mg of the sugar transferase of the present invention could degrade 6 μg of amylose in one minute.

2-2. 온도 특성2-2. Temperature characteristic

효소의 최적 온도를 결정하기 위해, 다양한 온도 범위에서 아밀로펙틴 용액에 대한 상대적 역가를 측정하였다. To determine the optimal temperature of the enzyme, the relative titers for amylopectin solution at various temperature ranges were measured.

50 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)에 용해된 2%(w/v) 아밀로펙틴 기질 용액 150 ㎕에 동일 완충용액 120 ㎕을 넣고 65℃ 내지 90℃ 범위의 다양한 온도에서 5분간 열처리한 후, 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 30㎕을 넣고 각각의 온도에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응된 반응액으로부터 상대적 효소활성을 DNS 법을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 75℃에서 최적 활성을 나타내었으며, 70℃ 내지 80℃에서 최적활성의 80 %의 역가를 유지하였다.120 μl of the same buffer was added to 150 μl of a 2% (w / v) amylopectin substrate solution dissolved in 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5), followed by heat treatment at various temperatures ranging from 65 ° C. to 90 ° C. for 5 minutes. 30 µl of the sugar transferase purified from 1-2 was added thereto and reacted at each temperature for 10 minutes. Relative enzymatic activity was measured from the reaction solution by using the DNS method, and the results are shown in FIG. 4. As shown in FIG. 4, the optimum activity was shown at 75 ° C., and the titer of 80% of the optimum activity was maintained at 70 ° C. to 80 ° C. FIG.

2-3. pH 특성2-3. pH characteristics

효소의 최적 pH를 결정하기 위해, 다양한 pH 범위에서 아밀로펙틴 용액에 대한 상대적 역가를 측정하였다. To determine the optimal pH of the enzyme, the relative titers for amylopectin solution at various pH ranges were measured.

50mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.5 내지 6.0) 또는 50mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.0 내지 7.5) 각각에 용해된 0.5%(w/v) 아밀로펙틴 기질 용액 150㎕에 각각의 완충용액 120㎕ 및 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 30㎕을 넣고 75℃에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응된 반응액으로부터 상대적 효소활성을 DNS 법을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.120 μl of each buffer in 150 μl of 0.5% (w / v) amylopectin substrate solution dissolved in 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.5 to 6.0) or 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0 to 7.5), respectively, and Example 1-2. 30 μl of the purified sugar transferase was added and reacted at 75 ° C. for 10 minutes. Relative enzymatic activity was measured from the reaction solution by using the DNS method, and the results are shown in FIG. 5.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 당전이효소는 pH 5.5에서 최적 활성을 나타 내었으며, pH 6.0 내지 pH 6.5에서 최적활성의 80% 이상의 역가를 유지하였다.As shown in FIG. 5, the glycotransferase showed an optimal activity at pH 5.5, and maintained a titer of 80% or more of optimal activity at pH 6.0 to pH 6.5.

2-4. 반응액의 TLC 분석2-4. TLC analysis of the reaction solution

다양한 기질에 대한 설펄로버스 설파타리쿠스 당전이효소의 산물을 분석하기 위해 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 말토트라이오스(maltotriose, G3), 말토테트라오스(maltotetraose, G4), 말토펜타오스(maltopentaose, G5), 말토헥사오스(maltohexaose, G6), 말토헵타오스(maltoheptaose, G7), 아밀로펙틴 (amylopectin), 글라이코젠(glycogen), 풀루란(pullulan), 말토오실-베타-사이클로덱스트린(maltosyl-β-cyclodextrin)을 녹인 후, 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 1단위(unit)를 첨가하고 70℃에서 12시간 반응시켰다. Maltotriose (maltotriose (G3), maltotetraose (G4), maltopentaose in 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) for the analysis of the products of sulfulrobus sulfataricus sugar transferase on various substrates (maltopentaose, G5), maltohexaose (G6), maltoheptaose (maltoheptaose, G7), amylopectin, glycogen, pullulan, maltoosyl-beta-cyclodextrin ( After dissolving maltosyl-β-cyclodextrin), one unit of sugar transferase purified in Example 1-2 was added and reacted at 70 ° C for 12 hours.

상기 반응을 시킨 반응산물을 박막크로마토그라피 (Thin Layer Chromatography, TLC)를 이용하여 분석하였다. 보다 상세하게는, 각 시료를 Whatman K5F TLC 플레이트(20cm X 20cm)에 1㎕씩 로딩하여 부탄올, 에탄올, 정제수가 5:3:3의 비(v/v/v)로 혼합된 전개액에서 2회 전개시켰다. 상기 전개액에서 전개 후에 플레이트를 잘 건조시켜 메탄올에 0.3(w/v)% N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5(v/v)% 황산을 용해시킨 발색액에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분 동안 발색시켜 그 결과를 도 6에 나타내었다.The reaction product subjected to the reaction was analyzed by thin layer chromatography (Thin Layer Chromatography, TLC). More specifically, each sample was loaded into a Whatman K5F TLC plate (20 cm × 20 cm) by 1 μl, and then, in a developing solution containing butanol, ethanol, and purified water in a ratio of 5: 3: 3 (v / v / v), 2 μl. Was developed twice. After development in the developing solution, the plate was well dried and soaked in a color developing solution in which 0.3 (w / v)% N- (1-naphthyl) -ethylenediamine and 5 (v / v)% sulfuric acid were dissolved in methanol. Color development was performed for 10 minutes in an 110 ° C. oven. The results are shown in FIG. 6.

상기 도 6의 M은 말토올리고당 표준 물질이고, lane 1, 2, 3, 4 및 5는 기질로 말토트라이오스, 말토테트라오스, 말토팬타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스를 사용한 것이고, lane 6은 풀루란, lane 7은 말토오실-베타-사이클로덱스트린, lane 8은 글라이코젠, lane 9는 아밀로펙틴, lane 10은 아밀로오스를 사용한 것이다. 6, M is a maltooligosaccharide standard material, lanes 1, 2, 3, 4, and 5 are maltotriose, maltotetraose, maltopantas, maltohexaose, and maltoheptaose as substrates. Silver pullulan, lane 7 is maltosyl-beta-cyclodextrin, lane 8 is glycogen, lane 9 is amylopectin and lane 10 is amylose.

상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소는 말토올리고당(G3 내지 G7)으로부터 직쇄형의 다양한 말토올리고당을 생산하였고, 아밀로펙틴(amylopectin)과 글라이코젠(glycogen)으로부터 여러 가지 직쇄형의 다양한 말토올리고당을 생산하였다. 풀란 (pullulan)으로부터는 말토트라이오스 (maltotriose, G3)를 주로 생산하였으며 말토오실-베타-사이클로덱스트린 (maltosyl-β-cyclodextrin)에서는 말토오스, 사이클로덱스트린 및 당전이 산물로 여겨지는 물질을 생산하였다. 상기 도 6에 나타난 결과로 보아 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소는 알파-1,4-글루코시드 결합 당전이능과 알파-1,6-글루코시드 결합 가수분해능이 있음이 확인되었다. As shown in FIG. 6, the sulfolabus sulfataricus-derived glycotransferase produced various maltooligosaccharides in linear form from maltooligosaccharides (G3 to G7), and several from amylopectin and glycogen (glycogen). Branched straight malto oligosaccharides were produced. Maltotriose (G3) was mainly produced from pullulan, and maltosyl-β-cyclodextrin produced maltose, cyclodextrin, and sugars considered to be products. From the results shown in FIG. 6, it was confirmed that sulfulverse sulphataricus-derived glycotransferase had alpha-1,4-glucoside-linked glycotransmitter and alpha-1,6-glucoside-bound hydrolysability.

실시예Example 3:  3: 말토오실Maltosil -베타--beta- 사이클로덱스트린Cyclodextrin ( ( maltosylmaltosyl -β--β- cyclodextrincyclodextrin )으로부터 From 다이말토오실Daimaltosil -베타-사이클로덱스트린(Beta-cyclodextrin ( dimaltosyldimaltosyl -β--β- cyclodextrincyclodextrin )의 제조 및 분리 정제) Preparation and Separation Purification

3-1. 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린 제조3-1. Preparation of dimaltosyl-beta-cyclodextrin

50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 용해된 2%(w/v) 말토오실-베타-사이클로덱스트린 기질 용액 500㎕에, 동일 완충용액 400㎕을 넣고 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 1.0mg/ml(0.6unit)을 넣고 75℃에서 10분 내지 720분 동안 시간별로 반응시켰으며, 정해진 시간별로 반응을 시킨 후에 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다.To 500 µl of 2% (w / v) maltosyl-beta-cyclodextrin substrate solution dissolved in 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5), 400 µl of the same buffer was added and the sugar transfer purified in Example 1-2 was performed. The enzyme was added 1.0mg / ml (0.6unit) and reacted at 75 ° C. for 10 minutes to 720 minutes, and the reaction was terminated by heating the reaction solution in boiling water for 15 minutes.

3-2. 반응액의 박막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석3-2. Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis of Reaction Liquid

실시예 3-1에서 반응을 종결시킨 반응액은 박막 크로마토그래피를 이용하여 반응산물을 분석하였다. The reaction solution was terminated in Example 3-1 was analyzed for the reaction product using thin film chromatography.

각 시료를 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에 1㎕씩 로딩하고, 부탄올, 에탄올 및 정제수가 5:3:3의 비(v/v/v)로 혼합된 전개액에서 1회 전개시킨 후, 건조시켜 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5%(w/v) 황산을 함유한 메탄올에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분 동안 발색시켜 그 결과를 도 7에 나타내었다.Each sample was loaded into 1 μl of Whatman K5F silica gel TLC plate, developed once in a developing solution mixed with butanol, ethanol and purified water in a ratio of 3: 3: 3 (v / v / v), and then dried to 0.3 After dipping in methanol containing% (w / v) N- (1-naphthyl) -ethylenediamine and 5% (w / v) sulfuric acid, the solution was removed and developed for 10 minutes in an oven at 110 ° C. Indicated.

상기 도 7의 M은 말토올리고당 표준 물질이고, lane 1은 기질로 베타-사이클로덱스트린을 사용한 것이고, lane 2는 기질로 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 사용한 것이며, lane 3 내지 lane 8은 각각 반응시간 10분, 30분, 60분, 180, 360 및 720분간 반응시킨 것이다.7 M is a maltooligosaccharide standard, lane 1 is a beta-cyclodextrin as a substrate, lane 2 is a maltoosyl-beta-cyclodextrin as a substrate, lanes 3 to lane 8 are reaction times, respectively. The reaction was carried out for 10 minutes, 30 minutes, 60 minutes, 180, 360 and 720 minutes.

상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 당전이효소는 기질인 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 가수분해하여 말토오스와 베타 사이클로덱스트린을 주 반응산물로 생성함과 동시에 새로운 생산물을 생성하였으며, 수율 및 순도를 고려할 때, 60분 내지 180분 더욱 바람직하게는 60분 내지 120분간 반응을 수행하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다.As shown in FIG. 7, the glycotransferase hydrolyzed the substrate maltosyl-beta-cyclodextrin to produce maltose and beta cyclodextrin as the main reaction products and simultaneously produced a new product, and yield and purity were considered. At this time, it was judged that it is preferable to carry out the reaction for 60 to 180 minutes, more preferably for 60 to 120 minutes.

실시예 4 : 당전이효소에 의한 반응 생성물의 구조 및 당전이효소의 최적 반응 조건 분석Example 4 Analysis of Structure of Reaction Product by Glycotransferase and Optimal Reaction Condition of Glycotransferase

4-1 생성물의 분리 및 정제4-1 Isolation and Purification of the Product

실시예 3-2에서 70℃에서 60분 동안 반응시켜 제조된 반응 생성물을 고성능 순환 액체 크로마토그래피(recycling liquid chromatography)를 이용하여 분리 및 정제 하였다.In Example 3-2, the reaction product prepared by reacting at 70 ° C. for 60 minutes was separated and purified using high performance recycling liquid chromatography.

겔투과컬럼(JAIGEL-W251, 2x50cm, JAI, Tokyo)을 정제수(distilled water)로 안정화 시키고, 실시예 3-2에서 60분 동안 반응시켜 얻은 반응액을 주입하였다. 이때 유동속도(flow rate)는 2.0ml/min이었다. 분리된 생성물의 순도 분석은 실시예 3-2의 박막 크로마토그래피와 동일한 방법으로 수행하였으며 그 결과를 도 8에 나타내었다. Gel permeation column (JAIGEL-W251, 2x50cm, JAI, Tokyo) was stabilized with distilled water, and the reaction solution obtained by reacting for 60 minutes in Example 3-2 was injected. At this time, the flow rate was 2.0 ml / min. Purity analysis of the separated product was carried out in the same manner as the thin layer chromatography of Example 3-2 and the results are shown in FIG.

4-2 생성물의 분자량 측정4-2 Molecular Weight Measurement of Products

상기 실시예 4-1에서 정제한 생성물의 분자량을 MALDI/TOF/MS법으로 측정하였다(김묘정 외, Biochemistry, 2002). 상기 분자량 측정을 위하여 Voager TM-DE Perceptive Biosystem(USA) 및 DHB/methanol을 사용하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.The molecular weight of the product purified in Example 4-1 was measured by MALDI / TOF / MS method (Kim, Mi-Jung et al., Biochemistry, 2002). Voager TM-DE Perceptive Biosystem (USA) and DHB / methanol were used to measure the molecular weight, and the results are shown in FIG. 9.

상기 도 9에 나타난 바와 같이, MALDI/TOF/MS 스펙트럼으로 측정된 생성물의 분자량은 1805.5로 측정되었으며 상기 분자량으로부터 상기 생성물이 글루코오스 11개로 구성되어 있는 것임이 확인되었다. 즉, 열한개의 글루코오스(약 162x11= 1782)와 소듐(23)분자가 결합된 것으로 확인되었으며, 7개의 글루코오스가 알파-1,4-글루코사이드로 결합된 베타-사이클로덱스트린에 글루코오스가 네 분자 결합되 어 열한개의 글루코오스를 이루는 것으로 예측되었다. As shown in FIG. 9, the molecular weight of the product measured in the MALDI / TOF / MS spectrum was measured to be 1805.5. From the molecular weight, it was confirmed that the product was composed of 11 glucoses. That is, eleven glucose (approximately 162x11 = 1782) and sodium (23) molecules were combined, and glucose was four molecules bound to beta-cyclodextrin, in which seven glucoses were bound to alpha-1,4-glucoside. It was predicted to form eleven glucose.

4-3 아이소아밀라제 (isoamylase)의 처리4-3 Treatment of isoamylase

실시예 4-2의 분자량 분석을 바탕으로 베타-사이클로덱스트린에 네분자 글루코오스의 결합 형태를 알아보기 위하여 알파-1,6-글루코시드 결합을 절단하는 아이소아밀라제를 처리하였다. 처리조건은 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.3)에 용해된 2%(w/v) 생성물 기질 용액 450㎕, 동일 완충용액 360㎕ 및 아이소아밀라제 90㎕(13 unit)를 넣고 60℃에서 60시간 동안 반응시켰다. 상기 반응시간이 경과된 후에, 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 상기 반응을 종결시킨 반응액은 실시예 3-2 박막 크로마토그래피와 동일한 방법으로 분석을 수행하였으며 그 결과를 도 8에 나타내었다. 상기 도 8의 lane M은 마커를 의미하고, G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7은 글루코오스, 말토오스, 말토트라이오스, 말토테트라오스, 말토팬타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스를 의미한다.Based on the molecular weight analysis of Example 4-2, isoamylase that cleaves alpha-1,6-glucoside bonds was treated to determine the binding form of four-molecule glucose to beta-cyclodextrin. Treatment conditions include 450 μl of 2% (w / v) product substrate solution dissolved in 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.3), 360 μl of the same buffer and 90 μl of isoamylase (13 units) at 60 ° C. for 60 hours. Reacted. After the reaction time had elapsed, the reaction solution was heated in boiling water for 15 minutes to terminate the reaction. The reaction solution that terminated the reaction was analyzed in the same manner as in Example 3-2 thin film chromatography, and the results are shown in FIG. 8. The lane M of FIG. 8 means a marker, and G1, G2, G3, G4, G5, G6, and G7 represent glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopantas, maltohexaos and maltoheptaose. it means.

상기 도 8의 lane 4는 실시예 3-2의 반응물을 고성능 순환(recycling) 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제한 생성물이고, lane 5는 상기 lane 4의 고성능 순환(recycling) 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리된 생성물에 아이소아밀라제를 처리한 것이다. The lane 4 of FIG. 8 is a product obtained by purifying the reaction product of Example 3-2 by using high performance recycling liquid chromatography, and lane 5 is separated by using the high performance recycling liquid chromatography of lane 4. The isoamylase to the resulting product.

상기 도 8에 나타낸 바와 같이, 아이소아밀라제 처리 후 생성물은 베타-사이클로덱스트린과 말토오스로 분해된 것과 같은 형태의 결과를 얻어, 생성물의 구성 분자중에 말토오스가 알파-1,6-글루코시드 결합되어있음을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 8, after the isoamylase treatment, the product was obtained in the form of decomposition into beta-cyclodextrin and maltose, indicating that maltose is alpha-1,6-glucoside-bonded in the constituent molecules of the product. I could confirm it.

4-4 글루코아밀라제 (glucoamylase)의 처리4-4 Treatment of Glucoamylase

말토오스의 알파-1,6-글루코시드 결합이 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 베타-사이클로덱스트린과 이루어졌는지 혹은 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 말토오실 분자와 이루어 졌는지 확인하기 위하여 비환원성 말단부분에서부터 알파-1,4-글루코시드결합을 절단하여 글루코오스를 생성할 수 있는 글루코아밀라제를 처리하였다. 상기 글루코아밀라제의 처리조건은 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 용해된 1%(w/v) 생성물 기질 용액 250 μl, 동일 완충용액 200 μl 및 글루코아밀라제 50 μl(0.22 unit)를 넣고 75℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 상기 시간이 경과한 후에, 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 상기 반응을 종결시킨 반응액은 실시예 3-2의 박막 크로마토그래피와 동일한 방법으로 분석을 수행하였으며 그 결과를 도 8 및 도 10에 나타내었다.Alpha-1,6-glucoside linkages of maltose were made with the beta-cyclodextrin of maltosyl-beta-cyclodextrin or with maltosyl molecules of maltosyl-beta-cyclodextrin from the non-reducing end Glucoamylase, which can cleave alpha-1,4-glucoside bonds to produce glucose, was treated. Treatment conditions for the glucoamylase were 250 μl of 1% (w / v) product substrate solution dissolved in 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.5), 200 μl of the same buffer solution, and 50 μl of glucoamylase (0.22 unit). The reaction was carried out at 12 ° C. for 12 hours. After this time elapsed, the reaction solution was heated in boiling water for 15 minutes to terminate the reaction. The reaction solution that terminated the reaction was analyzed in the same manner as the thin layer chromatography of Example 3-2 and the results are shown in Figures 8 and 10.

도 8의 lane 6는 고성능 순환 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리된 생성물에 글루코아밀라제를 처리한 것이고 lane 7은 글루코아밀라제를 처리한 후, 글루코오스를 제거하고 남은 물질을 분리한 것이다. Lane 6 of FIG. 8 is treated with glucoamylase to the product separated by high performance circulating liquid chromatography, and lane 7 is treated with glucoamylase, after which glucose is removed and the remaining material is separated.

상기 생성물에서 글루코오스를 제거하고 생성물의 분자량을 실시예 4-2와 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다. Glucose was removed from the product, and the molecular weight of the product was measured in the same manner as in Example 4-2, and the results are shown in FIG. 10.

상기 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 생성물의 분자량은 1481.6인 것으로 측정되었으며, 상기 분자량으로부터 상기 생성물이 글루코오스 9개로 구성되어 있는 것임을 확인할 수 있었다. 만일 말토오스의 α-1,6-글루코시드 결합이 말토오 실-베타-사이클로덱스트린의 말토오실 분자와 이루어 졌다면 글루코아밀라제 처리 후 남아있는 물질은 10개의 글루코오스로 구성이 되어있을 것이고, 말토오스의 α-1,6-글루코시드 결합이 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 베타-사이클로덱스트린과 이루어졌다면 글루코아밀라제 처리 후 남아있는 물질은 9개의 글루코오스로 구성이 되어있을 것이므로, 상기 도 10에서 나타낸 결과에 의해 상기 당전이효소에 의해 생성된 생성물은 9개의 글루코오스로 구성되어 있는 다이글루코실-베타-사이클로덱스트린 (diglucosyl-β-cyclodextrin)임이 확인되었다.As shown in FIG. 10, the molecular weight of the product was measured to be 1481.6. From the molecular weight, it was confirmed that the product was composed of nine glucose groups. If the α-1,6-glucoside bonds of maltose were made with the maltosyl molecules of maltosyl-beta-cyclodextrin, the remaining material after glucoamylase would consist of 10 glucose and α- of maltose If the 1,6-glucoside linkage was made with beta-cyclodextrin of maltosyl-beta-cyclodextrin, the substance remaining after glucoamylase treatment would consist of 9 glucose, and according to the results shown in FIG. The product produced by the glycotransferase was found to be diglucosyl-beta-cyclodextrin consisting of nine glucose.

4-5 최적반응조건의 분석4-5 Analysis of Optimal Reaction Conditions

상기 최적반응조건의 분석은 일정량의 효소를 첨가하였을 경우, 다이말토오실 베타 사이클로덱스트린을 가장 많이 생산하는 반응시간을 측정하는 것으로 수행하였다.Analysis of the optimum reaction conditions was performed by measuring the reaction time to produce the most dimaltosyl beta cyclodextrin when a certain amount of enzyme is added.

상기 반응시간의 측정은 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 용해된 최종농도가 1%인 말토오실-베타-사이클로덱스트린 기질 용액 1 ml에 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 1.0 mg/ml(6 unit)을 넣고 70℃에서 5 내지 50분 동안 시간별로 반응시켰으며, 정해진 시간별 즉, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 50 동안 반응을 시킨 후에 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다. The reaction time was measured by 1.0 mg of glycotransferase purified in Example 1-2 in 1 ml of maltosyl-beta-cyclodextrin substrate solution having a final concentration of 1% dissolved in 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5). / ml (6 units) was added and reacted at 70 ° C. for 5 to 50 minutes, and the reaction solution was boiled after reacting for a predetermined time, that is, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 and 50 hours. The reaction was terminated by heating in water for 15 minutes.

상기 반응을 종결시킨 후, 각 시간별로 반응액 중 각각 90μl 씩 취하였으며, 이를 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다. 상기 HPLC 분석에 사용된 검출기(detector)는 증기화광산란검출기(ELSD)를 사용하 였고, column은 C18 column을 사용하였다. 상기 분석에 사용된 유동액은 두가지 유동액 즉, A(DDW : formic acid = 100 : 0.1)와 B(DDW : MeOH : formic acid = 75 : 25 : 0.1)를 사용하였다. 상기 HPLC 분석의 유동속도는 1.0ml/min이었다. 상기 분석결과를 도 11에 나타내었다. After the reaction was terminated, each 90 μl of the reaction solution was taken for each hour, and analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography). The detector used in the HPLC analysis was a vaporized light scattering detector (ELSD), and the column was a C18 column. Two fluids, A (DDW: formic acid = 100: 0.1) and B (DDW: MeOH: formic acid = 75: 25: 0.1), were used for the analysis. The flow rate of the HPLC analysis was 1.0 ml / min. The analysis results are shown in FIG. 11.

상기 도 11에 나타낸 바와 같이, 1% 말토오실 베타 싸이클로덱스트린 용액에 1.0mg/ml 효소 즉, 효소 6unit을 처리하였을 경우, 15분 내지 30분에서 수율이 높은 것으로 확인되었고, 약 30분 반응을 시킨 경우에서 가장 좋은 수율을 나타내는 것으로 확인되었다. 상기 최적반응시간은 사용되어는 효소의 양과 기질의 농도에 따라 변화될 수 있으나, 상기 결과로부터, 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 30% 정도가 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린로 전환 되었을 때, 가장 좋은 수율 즉, 가장 많은 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다.As shown in FIG. 11, when 1.0 mg / ml enzyme, that is, 6 units of enzyme, was treated in 1% maltosyl beta cyclodextrin solution, it was confirmed that the yield was high in 15 to 30 minutes, and reacted for about 30 minutes. It was found that the best yield in the case. The optimum reaction time may vary depending on the amount of enzyme used and the concentration of the substrate. From the above results, when about 30% of maltoosyl-beta-cyclodextrin is converted to dimaltosyl-beta-cyclodextrin, It was found that the best yield, i.e. the most dimaltosyl-beta-cyclodextrin, could be obtained.

상기한 바와 같이, 본 발명의 내열성이 우수한 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 알파-1,6-글루코시드 당전이활성을 이용하여, 말토오실-베타-사이클로덱스트린으로부터 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 고순도로 제조함으로써, 낮은 온도에서 수용성이 낮다는 베타-사이클로덱스트린의 단점을 보완하여 식, 의약품 분야에서 대체물질로서의 베타-사이클로덱스트린의 사용범위를 확대함으로써 특히 식,의약품 산업분야에서 그 활용도가 매우 클 것이다.As mentioned above, the dimaltosyl-beta from maltosyl-beta-cyclodextrin using the alpha-1,6-glucoside glycotransferase activity of the sugar peroxidase sulfataricus derived glycotransferase excellent in heat resistance of the present invention. -By manufacturing cyclodextrins with high purity, supplementing the shortcomings of beta-cyclodextrins with low water solubility at low temperatures, and expanding the use of beta-cyclodextrins as substitutes in the food and pharmaceutical fields, especially in the food and pharmaceutical industries. Its use will be very large.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION <120> THERMOSTABLE SULFOLOBUS SULFATARICUS-DERIVED ALPHA-GLYCOSYL TRANSFERASE AND PREPARATION METHOD OF BRANCHED CYCLODEXTRIN WITH THE SAME <130> dpp20064394kr <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS2094-NdeI <400> 1 gttaagtaca catatggcat tattcttcag 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS2094-HindIII <400> 2 cctatacgaa gcttttatca taattctatc 30 <210> 3 <211> 2154 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SULFOLOBUS SULFATARICUS-DERIVED ALPHA-GLYCOSYL TRANSFERASE <220> <221> CDS <222> (1)..(2154) <400> 3 atg gca tta ttc ttc aga act aga gat agg cct ctt cgt ccc gga gat 48 Met Ala Leu Phe Phe Arg Thr Arg Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Asp 1 5 10 15 cca tat cca tta ggt tcg aat tgg ata gaa gat gat gat ggt gtg aat 96 Pro Tyr Pro Leu Gly Ser Asn Trp Ile Glu Asp Asp Asp Gly Val Asn 20 25 30 ttt tca tta ttc tca gaa aat gca gaa aaa gtc gaa tta ctc ctt tac 144 Phe Ser Leu Phe Ser Glu Asn Ala Glu Lys Val Glu Leu Leu Leu Tyr 35 40 45 tca ctg aca aac caa aag tac cca aag gag ata ata gag gtt aaa aac 192 Ser Leu Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Ile Glu Val Lys Asn 50 55 60 aaa acg gga gat att tgg cac gtc ttc gtc ccg gga ctg aga ccc ggg 240 Lys Thr Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Arg Pro Gly 65 70 75 80 caa ctt tac gca tat agg gtt tat ggc cca tat aaa ccg gag ttg gga 288 Gln Leu Tyr Ala Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Glu Leu Gly 85 90 95 tta agg ttt aat cca aat aag gtt tta ata gac cct tat gct aaa gcc 336 Leu Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala 100 105 110 ata aac ggt agt gta att tgg aac gac gcg gta ttt ggt tat aag ata 384 Ile Asn Gly Ser Val Ile Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile 115 120 125 gga gat caa aat caa gat ttg acc tat gac gag agg gat tcc ggc gaa 432 Gly Asp Gln Asn Gln Asp Leu Thr Tyr Asp Glu Arg Asp Ser Gly Glu 130 135 140 tat gtt cct aaa agt gtt gtg att aat cca tac ttt gag tgg gac gat 480 Tyr Val Pro Lys Ser Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp 145 150 155 160 gag gat ttc att aag gga aag aaa gtt cca tta aag gat aca gta att 528 Glu Asp Phe Ile Lys Gly Lys Lys Val Pro Leu Lys Asp Thr Val Ile 165 170 175 tac gaa gtt cac gta aaa ggg ttt aca aaa ctt agg ttg gat ttg ccg 576 Tyr Glu Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Leu Asp Leu Pro 180 185 190 gaa aac ata agg gga act tat gaa ggt ctt gcc tca gaa caa atg atc 624 Glu Asn Ile Arg Gly Thr Tyr Glu Gly Leu Ala Ser Glu Gln Met Ile 195 200 205 agc tat ctc aaa gat cta ggg att act act gtg gaa cta atg cca gtt 672 Ser Tyr Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr Thr Val Glu Leu Met Pro Val 210 215 220 ttc cat ttt atc gat caa aga ttt ctg aca gat aag ggg cta acg aat 720 Phe His Phe Ile Asp Gln Arg Phe Leu Thr Asp Lys Gly Leu Thr Asn 225 230 235 240 tac tgg ggg tat gac cca ata aat ttc ttc tct cct gaa tgt aga tat 768 Tyr Trp Gly Tyr Asp Pro Ile Asn Phe Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr 245 250 255 tcc agt act ggc tgt tta gga ggg caa gta tta agt ttc aaa aaa atg 816 Ser Ser Thr Gly Cys Leu Gly Gly Gln Val Leu Ser Phe Lys Lys Met 260 265 270 gta aac gaa tta cat aac gca gga att gag gtt ata atc gat gta gtt 864 Val Asn Glu Leu His Asn Ala Gly Ile Glu Val Ile Ile Asp Val Val 275 280 285 tat aat cac act gct gag ggg aat cat tta ggc cca acg tta agt ttc 912 Tyr Asn His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe 290 295 300 aga ggt att gat aat aca gca tat tac atg ctc caa cca gat aat aaa 960 Arg Gly Ile Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Met Leu Gln Pro Asp Asn Lys 305 310 315 320 aga tat tat tta gac ttt acc gga act ggc aat acg tta aat ctt agc 1008 Arg Tyr Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser 325 330 335 cat cct aga gtc atc cag atg gtc tta gat agc tta aga tat tgg gtt 1056 His Pro Arg Val Ile Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val 340 345 350 aca gag atg cac gta gat ggc ttt aga ttt gac tta gca gca gct tta 1104 Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu 355 360 365 gcc agg gaa tta tac agc gtt aat atg tta aat acg ttc ttc att gct 1152 Ala Arg Glu Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Asn Thr Phe Phe Ile Ala 370 375 380 cta cag caa gac cca ata ttg tca caa gta aaa ctg ata gct gag cct 1200 Leu Gln Gln Asp Pro Ile Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro 385 390 395 400 tgg gat gtg gga caa ggg gga tat caa gta ggg aat ttc cca tat caa 1248 Trp Asp Val Gly Gln Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Gln 405 410 415 tgg gca gag tgg aat gga aag tat agg gat tcg ata agg aga ttt tgg 1296 Trp Ala Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ser Ile Arg Arg Phe Trp 420 425 430 aga gga gaa gcg tta ccc tat agc gag att gct aac aga tta tta ggc 1344 Arg Gly Glu Ala Leu Pro Tyr Ser Glu Ile Ala Asn Arg Leu Leu Gly 435 440 445 tcg ccg gac att tac tta ggt aat aat aaa aca cca ttt gcc agt ata 1392 Ser Pro Asp Ile Tyr Leu Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile 450 455 460 aat tac gta act tct cat gat ggt ttc aca tta gag gat tta gtc agt 1440 Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser 465 470 475 480 tat aat caa aaa cac aat gaa gcg aat gga ttt aac aat caa gat gga 1488 Tyr Asn Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly 485 490 495 atg aac gag aac tat agt tgg aat tgt ggt gca gaa gga cca aca aat 1536 Met Asn Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Ala Glu Gly Pro Thr Asn 500 505 510 gac caa aac gtg gta ata tgc agg gag aaa caa aaa agg aac ttt atg 1584 Asp Gln Asn Val Val Ile Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Met 515 520 525 ata acg tta ctc gtt agt caa gga acc cct atg ata ttg gga gga gat 1632 Ile Thr Leu Leu Val Ser Gln Gly Thr Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp 530 535 540 gag cta agc agg aca caa aga gga aat aat aac gcg ttt tgt caa gac 1680 Glu Leu Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp 545 550 555 560 aac gag ata act tgg ttt gat tgg aat tta gat gag aga aaa tca aaa 1728 Asn Glu Ile Thr Trp Phe Asp Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Ser Lys 565 570 575 ttt tta gag ttt gtt aaa aag atg atc caa ttt tat agg gca cat cca 1776 Phe Leu Glu Phe Val Lys Lys Met Ile Gln Phe Tyr Arg Ala His Pro 580 585 590 gca ttc aga agg gaa aga tat ttt caa gga aag aaa tta ttc ggc atg 1824 Ala Phe Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu Phe Gly Met 595 600 605 ccg tta aaa gat gtg acc ttc tat act cta gaa ggt agg gaa gtt gat 1872 Pro Leu Lys Asp Val Thr Phe Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Glu Val Asp 610 615 620 gag aaa aca tgg agt tcc ccg acg caa cta gtt att ttc gtg ttg gag 1920 Glu Lys Thr Trp Ser Ser Pro Thr Gln Leu Val Ile Phe Val Leu Glu 625 630 635 640 gga agt gtt atg gac gag att aat atg tat gga gag aga att gct gat 1968 Gly Ser Val Met Asp Glu Ile Asn Met Tyr Gly Glu Arg Ile Ala Asp 645 650 655 gat tcc ttc tta ata ata ctt aac gca aat ccc aat aac gta aag gtg 2016 Asp Ser Phe Leu Ile Ile Leu Asn Ala Asn Pro Asn Asn Val Lys Val 660 665 670 aaa ttc cca aaa ggt aaa tgg gaa cta gtt atc agt tct tat ttg aga 2064 Lys Phe Pro Lys Gly Lys Trp Glu Leu Val Ile Ser Ser Tyr Leu Arg 675 680 685 gaa ata aaa cca gaa gag aga atc ata gaa ggt gag aag gaa ctg gaa 2112 Glu Ile Lys Pro Glu Glu Arg Ile Ile Glu Gly Glu Lys Glu Leu Glu 690 695 700 ata gag gga agg acg gca tta gtt tat agg agg ata gaa tta 2154 Ile Glu Gly Arg Thr Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Glu Leu 705 710 715 <210> 4 <211> 718 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Met Ala Leu Phe Phe Arg Thr Arg Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Asp 1 5 10 15 Pro Tyr Pro Leu Gly Ser Asn Trp Ile Glu Asp Asp Asp Gly Val Asn 20 25 30 Phe Ser Leu Phe Ser Glu Asn Ala Glu Lys Val Glu Leu Leu Leu Tyr 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Ile Glu Val Lys Asn 50 55 60 Lys Thr Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Arg Pro Gly 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Ala Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Glu Leu Gly 85 90 95 Leu Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala 100 105 110 Ile Asn Gly Ser Val Ile Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile 115 120 125 Gly Asp Gln Asn Gln Asp Leu Thr Tyr Asp Glu Arg Asp Ser Gly Glu 130 135 140 Tyr Val Pro Lys Ser Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp 145 150 155 160 Glu Asp Phe Ile Lys Gly Lys Lys Val Pro Leu Lys Asp Thr Val Ile 165 170 175 Tyr Glu Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Leu Asp Leu Pro 180 185 190 Glu Asn Ile Arg Gly Thr Tyr Glu Gly Leu Ala Ser Glu Gln Met Ile 195 200 205 Ser Tyr Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr Thr Val Glu Leu Met Pro Val 210 215 220 Phe His Phe Ile Asp Gln Arg Phe Leu Thr Asp Lys Gly Leu Thr Asn 225 230 235 240 Tyr Trp Gly Tyr Asp Pro Ile Asn Phe Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr 245 250 255 Ser Ser Thr Gly Cys Leu Gly Gly Gln Val Leu Ser Phe Lys Lys Met 260 265 270 Val Asn Glu Leu His Asn Ala Gly Ile Glu Val Ile Ile Asp Val Val 275 280 285 Tyr Asn His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe 290 295 300 Arg Gly Ile Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Met Leu Gln Pro Asp Asn Lys 305 310 315 320 Arg Tyr Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser 325 330 335 His Pro Arg Val Ile Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val 340 345 350 Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu 355 360 365 Ala Arg Glu Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Asn Thr Phe Phe Ile Ala 370 375 380 Leu Gln Gln Asp Pro Ile Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro 385 390 395 400 Trp Asp Val Gly Gln Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Gln 405 410 415 Trp Ala Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ser Ile Arg Arg Phe Trp 420 425 430 Arg Gly Glu Ala Leu Pro Tyr Ser Glu Ile Ala Asn Arg Leu Leu Gly 435 440 445 Ser Pro Asp Ile Tyr Leu Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile 450 455 460 Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser 465 470 475 480 Tyr Asn Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly 485 490 495 Met Asn Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Ala Glu Gly Pro Thr Asn 500 505 510 Asp Gln Asn Val Val Ile Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Met 515 520 525 Ile Thr Leu Leu Val Ser Gln Gly Thr Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp 530 535 540 Glu Leu Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp 545 550 555 560 Asn Glu Ile Thr Trp Phe Asp Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Ser Lys 565 570 575 Phe Leu Glu Phe Val Lys Lys Met Ile Gln Phe Tyr Arg Ala His Pro 580 585 590 Ala Phe Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu Phe Gly Met 595 600 605 Pro Leu Lys Asp Val Thr Phe Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Glu Val Asp 610 615 620 Glu Lys Thr Trp Ser Ser Pro Thr Gln Leu Val Ile Phe Val Leu Glu 625 630 635 640 Gly Ser Val Met Asp Glu Ile Asn Met Tyr Gly Glu Arg Ile Ala Asp 645 650 655 Asp Ser Phe Leu Ile Ile Leu Asn Ala Asn Pro Asn Asn Val Lys Val 660 665 670 Lys Phe Pro Lys Gly Lys Trp Glu Leu Val Ile Ser Ser Tyr Leu Arg 675 680 685 Glu Ile Lys Pro Glu Glu Arg Ile Ile Glu Gly Glu Lys Glu Leu Glu 690 695 700 Ile Glu Gly Arg Thr Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Glu Leu 705 710 715 <110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION <120> THERMOSTABLE SULFOLOBUS SULFATARICUS-DERIVED ALPHA-GLYCOSYL          TRANSFERASE AND PREPARATION METHOD OF BRANCHED CYCLODEXTRIN WITH          THE SAME <130> dpp20064394kr <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS2094-NdeI <400> 1 gttaagtaca catatggcat tattcttcag 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS2094-HindIII <400> 2 cctatacgaa gcttttatca taattctatc 30 <210> 3 <211> 2154 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SULFOLOBUS SULFATARICUS-DERIVED ALPHA-GLYCOSYL TRANSFERASE <220> <221> CDS (222) (1) .. (2154) <400> 3 atg gca tta ttc ttc aga act aga gat agg cct ctt cgt ccc gga gat 48 Met Ala Leu Phe Phe Arg Thr Arg Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Asp   1 5 10 15 cca tat cca tta ggt tcg aat tgg ata gaa gat gat gat ggt gtg aat 96 Pro Tyr Pro Leu Gly Ser Asn Trp Ile Glu Asp Asp Asp Gly Val Asn              20 25 30 ttt tca tta ttc tca gaa aat gca gaa aaa gtc gaa tta ctc ctt tac 144 Phe Ser Leu Phe Ser Glu Asn Ala Glu Lys Val Glu Leu Leu Leu Tyr          35 40 45 tca ctg aca aac caa aag tac cca aag gag ata ata gag gtt aaa aac 192 Ser Leu Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Ile Glu Val Lys Asn      50 55 60 aaa acg gga gat att tgg cac gtc ttc gtc ccg gga ctg aga ccc ggg 240 Lys Thr Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Arg Pro Gly  65 70 75 80 caa ctt tac gca tat agg gtt tat ggc cca tat aaa ccg gag ttg gga 288 Gln Leu Tyr Ala Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Glu Leu Gly                  85 90 95 tta agg ttt aat cca aat aag gtt tta ata gac cct tat gct aaa gcc 336 Leu Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala             100 105 110 ata aac ggt agt gta att tgg aac gac gcg gta ttt ggt tat aag ata 384 Ile Asn Gly Ser Val Ile Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile         115 120 125 gga gat caa aat caa gat ttg acc tat gac gag agg gat tcc ggc gaa 432 Gly Asp Gln Asn Gln Asp Leu Thr Tyr Asp Glu Arg Asp Ser Gly Glu     130 135 140 tat gtt cct aaa agt gtt gtg att aat cca tac ttt gag tgg gac gat 480 Tyr Val Pro Lys Ser Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp 145 150 155 160 gag gat ttc att aag gga aag aaa gtt cca tta aag gat aca gta att 528 Glu Asp Phe Ile Lys Gly Lys Lys Val Pro Leu Lys Asp Thr Val Ile                 165 170 175 tac gaa gtt cac gta aaa ggg ttt aca aaa ctt agg ttg gat ttg ccg 576 Tyr Glu Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Leu Asp Leu Pro             180 185 190 gaa aac ata agg gga act tat gaa ggt ctt gcc tca gaa caa atg atc 624 Glu Asn Ile Arg Gly Thr Tyr Glu Gly Leu Ala Ser Glu Gln Met Ile         195 200 205 agc tat ctc aaa gat cta ggg att act act gtg gaa cta atg cca gtt 672 Ser Tyr Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr Thr Val Glu Leu Met Pro Val     210 215 220 ttc cat ttt atc gat caa aga ttt ctg aca gat aag ggg cta acg aat 720 Phe His Phe Ile Asp Gln Arg Phe Leu Thr Asp Lys Gly Leu Thr Asn 225 230 235 240 tac tgg ggg tat gac cca ata aat ttc ttc tct cct gaa tgt aga tat 768 Tyr Trp Gly Tyr Asp Pro Ile Asn Phe Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr                 245 250 255 tcc agt act ggc tgt tta gga ggg caa gta tta agt ttc aaa aaa atg 816 Ser Ser Thr Gly Cys Leu Gly Gly Gln Val Leu Ser Phe Lys Lys Met             260 265 270 gta aac gaa tta cat aac gca gga att gag gtt ata atc gat gta gtt 864 Val Asn Glu Leu His Asn Ala Gly Ile Glu Val Ile Ile Asp Val Val         275 280 285 tat aat cac act gct gag ggg aat cat tta ggc cca acg tta agt ttc 912 Tyr Asn His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe     290 295 300 aga ggt att gat aat aca gca tat tac atg ctc caa cca gat aat aaa 960 Arg Gly Ile Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Met Leu Gln Pro Asp Asn Lys 305 310 315 320 aga tat tat tta gac ttt acc gga act ggc aat acg tta aat ctt agc 1008 Arg Tyr Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser                 325 330 335 cat cct aga gtc atc cag atg gtc tta gat agc tta aga tat tgg gtt 1056 His Pro Arg Val Ile Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val             340 345 350 aca gag atg cac gta gat ggc ttt aga ttt gac tta gca gca gct tta 1104 Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu         355 360 365 gcc agg gaa tta tac agc gtt aat atg tta aat acg ttc ttc att gct 1152 Ala Arg Glu Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Asn Thr Phe Phe Ile Ala     370 375 380 cta cag caa gac cca ata ttg tca caa gta aaa ctg ata gct gag cct 1200 Leu Gln Gln Asp Pro Ile Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro 385 390 395 400 tgg gat gtg gga caa ggg gga tat caa gta ggg aat ttc cca tat caa 1248 Trp Asp Val Gly Gln Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Gln                 405 410 415 tgg gca gag tgg aat gga aag tat agg gat tcg ata agg aga ttt tgg 1296 Trp Ala Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ser Ile Arg Arg Phe Trp             420 425 430 aga gga gaa gcg tta ccc tat agc gag att gct aac aga tta tta ggc 1344 Arg Gly Glu Ala Leu Pro Tyr Ser Glu Ile Ala Asn Arg Leu Leu Gly         435 440 445 tcg ccg gac att tac tta ggt aat aat aaa aca cca ttt gcc agt ata 1392 Ser Pro Asp Ile Tyr Leu Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile     450 455 460 aat tac gta act tct cat gat ggt ttc aca tta gag gat tta gtc agt 1440 Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser 465 470 475 480 tat aat caa aaa cac aat gaa gcg aat gga ttt aac aat caa gat gga 1488 Tyr Asn Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly                 485 490 495 atg aac gag aac tat agt tgg aat tgt ggt gca gaa gga cca aca aat 1536 Met Asn Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Ala Glu Gly Pro Thr Asn             500 505 510 gac caa aac gtg gta ata tgc agg gag aaa caa aaa agg aac ttt atg 1584 Asp Gln Asn Val Val Ile Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Met         515 520 525 ata acg tta ctc gtt agt caa gga acc cct atg ata ttg gga gga gat 1632 Ile Thr Leu Leu Val Ser Gln Gly Thr Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp     530 535 540 gag cta agc agg aca caa aga gga aat aat aac gcg ttt tgt caa gac 1680 Glu Leu Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp 545 550 555 560 aac gag ata act tgg ttt gat tgg aat tta gat gag aga aaa tca aaa 1728 Asn Glu Ile Thr Trp Phe Asp Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Ser Lys                 565 570 575 ttt tta gag ttt gtt aaa aag atg atc caa ttt tat agg gca cat cca 1776 Phe Leu Glu Phe Val Lys Lys Met Ile Gln Phe Tyr Arg Ala His Pro             580 585 590 gca ttc aga agg gaa aga tat ttt caa gga aag aaa tta ttc ggc atg 1824 Ala Phe Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu Phe Gly Met         595 600 605 ccg tta aaa gat gtg acc ttc tat act cta gaa ggt agg gaa gtt gat 1872 Pro Leu Lys Asp Val Thr Phe Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Glu Val Asp     610 615 620 gag aaa aca tgg agt tcc ccg acg caa cta gtt att ttc gtg ttg gag 1920 Glu Lys Thr Trp Ser Ser Pro Thr Gln Leu Val Ile Phe Val Leu Glu 625 630 635 640 gga agt gtt atg gac gag att aat atg tat gga gag aga att gct gat 1968 Gly Ser Val Met Asp Glu Ile Asn Met Tyr Gly Glu Arg Ile Ala Asp                 645 650 655 gat tcc ttc tta ata ata ctt aac gca aat ccc aat aac gta aag gtg 2016 Asp Ser Phe Leu Ile Ile Leu Asn Ala Asn Pro Asn Asn Val Lys Val             660 665 670 aaa ttc cca aaa ggt aaa tgg gaa cta gtt atc agt tct tat ttg aga 2064 Lys Phe Pro Lys Gly Lys Trp Glu Leu Val Ile Ser Ser Tyr Leu Arg         675 680 685 gaa ata aaa cca gaa gag aga atc ata gaa ggt gag aag gaa ctg gaa 2112 Glu Ile Lys Pro Glu Glu Arg Ile Ile Glu Gly Glu Lys Glu Leu Glu     690 695 700 ata gag gga agg acg gca tta gtt tat agg agg ata gaa tta 2154 Ile Glu Gly Arg Thr Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Glu Leu 705 710 715 <210> 4 <211> 718 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Met Ala Leu Phe Phe Arg Thr Arg Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Asp   1 5 10 15 Pro Tyr Pro Leu Gly Ser Asn Trp Ile Glu Asp Asp Asp Gly Val Asn              20 25 30 Phe Ser Leu Phe Ser Glu Asn Ala Glu Lys Val Glu Leu Leu Leu Tyr          35 40 45 Ser Leu Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Ile Glu Val Lys Asn      50 55 60 Lys Thr Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Arg Pro Gly  65 70 75 80 Gln Leu Tyr Ala Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Glu Leu Gly                  85 90 95 Leu Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala             100 105 110 Ile Asn Gly Ser Val Ile Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile         115 120 125 Gly Asp Gln Asn Gln Asp Leu Thr Tyr Asp Glu Arg Asp Ser Gly Glu     130 135 140 Tyr Val Pro Lys Ser Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp 145 150 155 160 Glu Asp Phe Ile Lys Gly Lys Lys Val Pro Leu Lys Asp Thr Val Ile                 165 170 175 Tyr Glu Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Leu Asp Leu Pro             180 185 190 Glu Asn Ile Arg Gly Thr Tyr Glu Gly Leu Ala Ser Glu Gln Met Ile         195 200 205 Ser Tyr Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr Thr Val Glu Leu Met Pro Val     210 215 220 Phe His Phe Ile Asp Gln Arg Phe Leu Thr Asp Lys Gly Leu Thr Asn 225 230 235 240 Tyr Trp Gly Tyr Asp Pro Ile Asn Phe Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr                 245 250 255 Ser Ser Thr Gly Cys Leu Gly Gly Gln Val Leu Ser Phe Lys Lys Met             260 265 270 Val Asn Glu Leu His Asn Ala Gly Ile Glu Val Ile Ile Asp Val Val         275 280 285 Tyr Asn His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe     290 295 300 Arg Gly Ile Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Met Leu Gln Pro Asp Asn Lys 305 310 315 320 Arg Tyr Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser                 325 330 335 His Pro Arg Val Ile Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val             340 345 350 Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu         355 360 365 Ala Arg Glu Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Asn Thr Phe Phe Ile Ala     370 375 380 Leu Gln Gln Asp Pro Ile Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro 385 390 395 400 Trp Asp Val Gly Gln Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Gln                 405 410 415 Trp Ala Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ser Ile Arg Arg Phe Trp             420 425 430 Arg Gly Glu Ala Leu Pro Tyr Ser Glu Ile Ala Asn Arg Leu Leu Gly         435 440 445 Ser Pro Asp Ile Tyr Leu Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile     450 455 460 Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser 465 470 475 480 Tyr Asn Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly                 485 490 495 Met Asn Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Ala Glu Gly Pro Thr Asn             500 505 510 Asp Gln Asn Val Val Ile Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Met         515 520 525 Ile Thr Leu Leu Val Ser Gln Gly Thr Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp     530 535 540 Glu Leu Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp 545 550 555 560 Asn Glu Ile Thr Trp Phe Asp Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Ser Lys                 565 570 575 Phe Leu Glu Phe Val Lys Lys Met Ile Gln Phe Tyr Arg Ala His Pro             580 585 590 Ala Phe Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu Phe Gly Met         595 600 605 Pro Leu Lys Asp Val Thr Phe Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Glu Val Asp     610 615 620 Glu Lys Thr Trp Ser Ser Pro Thr Gln Leu Val Ile Phe Val Leu Glu 625 630 635 640 Gly Ser Val Met Asp Glu Ile Asn Met Tyr Gly Glu Arg Ile Ala Asp                 645 650 655 Asp Ser Phe Leu Ile Ile Leu Asn Ala Asn Pro Asn Asn Val Lys Val             660 665 670 Lys Phe Pro Lys Gly Lys Trp Glu Leu Val Ile Ser Ser Tyr Leu Arg         675 680 685 Glu Ile Lys Pro Glu Glu Arg Ile Ile Glu Gly Glu Lys Glu Leu Glu     690 695 700 Ile Glu Gly Arg Thr Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Glu Leu 705 710 715  

Claims (9)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 기질에 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래되고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 갖으며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인 당전이효소를 첨가하며, It is derived from Sulfolobus solfataricus on a substrate containing branched cyclodextrins having one side chain substituted sugar, and the sugar transfer activity and branched cyclodextrins which bind maltooligosaccharides to the cyclic glucose of branched cyclodextrins. Adding a glycotransferase which is a polypeptide having an activity of hydrolyzing the glucoside bond of the ring-side glucose of the branched cyclodextrin and the branched cyclodextrin, and consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, pH 5.0 내지 pH 7.0 및 60℃ 내지 80℃에서 반응시켜, by reacting at pH 5.0 to pH 7.0 and 60 ° C. to 80 ° C., 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하는 단계를 포함하는 분지 사이클로덱스트린 제조방법.A method for producing a branched cyclodextrin, comprising the step of preparing a branched cyclodextrin having a side chain substituted sugar in two ring-constituting glucose of the branched cyclodextrin. 제5항에 있어서, 상기 분지 사이클로덱스트린은 분지 알파-사이클로덱스트린, 분지 베타-사이클로덱스트린 및 분지 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 분지 사이클로덱스트린 제조방법.The method of claim 5, wherein the branched cyclodextrin is any one selected from the group consisting of branched alpha-cyclodextrin, branched beta-cyclodextrin, and branched gamma-cyclodextrin. 제5항에 있어서, 상기 측쇄 치환당은 말토오스 또는 말토트라이오스인 분지 사이클로덱스트린 제조방법.The method of claim 5, wherein the branched substituted sugar is maltose or maltotriose. 삭제delete 제5항에 있어서, 상기 당전이효소는 상기 당전이효소의 역가(unit)가 6U/mg(unit/효소량)이고, 상기 당전이효소의 함량은 0.6U/mg/ml(unit/분지 사이클로덱스트린량)/반응부피)이며, 상기 반응시간이 15분 내지 30분인 분지 사이클로덱스트린 제조방법.The method of claim 5, wherein the sugar transferase has a titer of 6U / mg (unit / enzyme amount) of the sugar transferase, and the content of the sugar transferase is 0.6U / mg / ml (unit / branched cyclodextrin). Amount) / reaction volume), wherein the reaction time is 15 to 30 minutes.

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