KR100898384B1 - 내열성 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소 및 이를이용한 분지 사이클로덱스트린의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래 당전이효소 및 이를 이용한 분지 사이클로덱스트린 제조방법에 관한 것으로서, 특히, 본 발명의 당전이효소인 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 내열성 당전이효소를 이용하면, 말토오실-베타-사이클로덱스트린으로부터 수용성이 증가된 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조할 수 있어 산업상으로 매우 유용하다.
당전이효소, 베타-사이클로덱스트린
Description
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 유전자 서열이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터인 p6xHSGDE의 개열지도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터 p6xHSGDE로 형질전환시킨 E. coli MC1061에서 생산된 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 정제단계별 시료의 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 당전이효소의 온도에 따른 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 당전이효소의 pH에 따른 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 기질에 대한 당전이효소의 반응 결과를 박막 크로마토그래피(TLC)를 이용하여 분석한 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 반응시간에 따른 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 대한 당전이효소의 반응 결과를 박막 크로마토그래피를 이용하여 분석한 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 당전이효소를 처리한 후, 추가로 아이소아밀라제와 글루코아밀라제를 반응시킨 결과를 박막 크로마토그래피를 이용하여 분석한 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 당전이효소를 처리하여 얻어진 생성물의 분자량을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 당전이효소를 처리한 후, 추가로 글루코아밀라제를 반응시켜 글루코오스를 제거한 결과물의 분자량을 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린의 반응시간에 따른 최적 생산조건을 측정한 결과이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 당전이효소가 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 생성하는 기작을 나타낸 공정도이다.
[산업상 이용 분야]
본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소, 더욱 자세하게는 설펄 로버스 설파타리쿠스 유래 내열성 당전이효소 및 이를 이용한 분지 사이클로덱스티린 제조방법에 관한 것이다.
[종래 기술]
사이클로덱스트린은 글루코오스 분자가 각기 6개, 7개 및 8개로 환상형 구조를 이루고 있으며, 각각 글루코오스 분자수에 따라 통상 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린이라고 한다. 사이클로덱스트린은 환상형으로 환의 내부는 소수성이고 외부는 친수성의 특성을 갖고 있다. 내부가 소수성이어서 소수성 물질을 포접할 수 있어 휘발성이 강한 물질 또는 불쾌치를 포접하거나 불안정한 물질을 포접하여 안정성을 향상하는데 많이 이용되고 있다. 그러나 이러한 특성에도 불구하고 낮은 온도에서는 수용성이 낮아 다양한 용도로의 이용이 제한되고 있는 실정이다.
상기한 사이클로덱스트린의 특성에 의한 제한적인 용도를 넓히기 위하여 사이클로덱스트린의 유도체를 만드는 방법이 제공되어 왔다. 상기한 사이클로덱스트린 유도체를 만드는 방법 중의 하나가 사이클로덱스트린에 당을 붙여 수용성을 높이는 방법이다. 상기한 사이클로덱스트린에 당을 붙여 수용성을 높인 사이클로덱스트린을 분지 사이클로덱스트린(branched cyclodextrin)이라고 한다.
상기한 분지 사이클로덱스트린을 만드는 방법으로 과량의 말토오스와 사이클로덱스트린을 이용하여 풀루란네이즈(pullulanase) 혹은 아이소아밀라제 (isoamylase)를 처리하여 말토오실-사이클로덱스트린 또는 말토트라이오실-사이클로덱스트린을 제조하는 방법이나 분지 말토올리고당과 사이클로덱스트린에 디브랜 칭 효소를 처리하여 말토오실-사이클로덱스트린 또는 말토트라이오실-사이클로덱스트린을 제조하는 방법이 제공되어 왔다.
상기한 방법들에 의해서도 소량의 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조할 수는 있지만, 말토오실-사이클로덱스트린 및 말토트라이오실-사이클로덱스트린이 포함되어 있는 혼합물에서 이를 분리해야 하는 번거로움이 있다.
본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus sulfataricus)에서 유래한 내열성 당전이효소(α-glycosyl transferase)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 당전이효소를 생산하는 방법 및 이를 생산하는 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠스에서 유래한 당전이효소를 이용하여 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린으로부터 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래한 당전이효소가 열 및 pH에 대한 우수한 안정성을 가질 뿐만 아니라, 글루코시드 결합의 가수분해활성 및 당전이활성을 가지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 설펄로버스 설파타리쿠 스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래한 당전이효소를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 당전이효소를 생산하는 방법 및 이를 생산하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 또한, 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 상기 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소를 처리하여 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서 제공하는 당전이효소는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래한 내열성이 우수한 당전이효소일 수 있다.
상기 당전이효소는 75℃에서 최적 활성을 나타내고, 70℃ 내지 80℃에서 최적 활성의 80% 이상의 활성을 나타낸다. 또한, 상기 당전이효소는 pH 5.5에서 최적 활성을 나타내고, pH 6.0 내지 pH 6.5에서 최적 활성의 80% 이상의 활성을 나타낸다. 바람직하게는 상기 당전이효소는 70℃ 내지 80℃ 및 pH 5.5 내지 pH 6.5에서 높은 활성을 나타낸다.
또한, 상기 당전이효소는 열안정성 및 pH 안정성이 우수한 효소이다. 상세하게는, 상기 당전이효소는 60℃ 내지 95℃ 및 pH 3 내지 11에서도 안정성이 있는 효소이다.
본 발명의 당전이효소는 718개의 아미노산으로 이루어지고, 분자량이 82kDa 내지 84kDa이고, 바람직하게는 83kDa이며, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 당전이효소는 알파-1,4-글루코시드 결합 및 알파-1,6-글루코시드 결합 당전이 활성 뿐만 아니라, 알파-1,4-글루코시드 결합 및 알파-1,6-글루코시드 결합 가수분해 활성을 갖는다.
상세하게는, 본 발명의 당전이효소는 말토트라이오스(maltotriose), 말토테트라오스(maltotetraose), 말토펜타오스(maltopentaose), 말토헥사오스(maltohexaose) 및 말토헵타오스(maltoheptaose) 등의 말토올리고당을 기질로 하는 경우, 알파-1,4 글루코시드 결합을 잘라 각각의 기질에 알파-1,4 글루코시드 결합으로 전이하는 재배열 활성(disproportionation activity)을 나타내어 여러 가지 소당류를 생성할 수 있다. 또한, 본 발명의 당전이효소는 풀루란(pullulan)을 기질로 하는 경우, 알파-1,6 글루코시드 결합을 분해하는 가수분해활성을 나타내어 말토트라이오스(maltotriose)을 생성할 수 있다. 또한, 전분의 구성성분인 아밀로펙틴과 세포내의 저장체인 글라이코젠을 기질로 하는 경우 본 발명의 당전이효소는 알파-1,6 글루코시드 결합의 가수분해활성과 알파-1,4 글루코시드 당전이 활성을 나타내어 여러 가지 직쇄형의 말토올리고당을 생성할 수 있다.
또한, 본 발명의 당전이효소는 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가질 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 당전이효소는 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린의 치환당이 결합되어 있지 아니한 다른 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린 에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가질 수 있다. 상기 측쇄 치환당은 말토올리고당일 수 있고, 바람직하게는 글루코오스 분자수 2 내지 5개로 이루어진 말토올리고당일 수 있으며, 바람직하게는 말토오스 또는 말토트라이오스일 수 있다.
구체적으로는, 말토오스가 알파-1,6-글루코시드 결합으로 베타-사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 연결되어 있는 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 기질로 하는 경우, 말토오실-베타-사이클로덱스트린으로부터 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조할 수 있다. 상기 말토오실-베타-사이클로덱스트린으로부터 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 생성하는 기작은 도 12에 나타내었다. 상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 당전이효소는 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 치환당과 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스간의 알파-1,6-글루코시드 결합을 분해하여 말토오스와 베타-사이클로덱스트린을 형성함과 동시에 말토오스를 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 알파-1,6-글루코시드 결합으로 전이하여, 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조할 수 있는 활성을 갖는다.
또한, 본 발명의 당전이효소는 말토트라이오스가 존재하는 조건 및 pH 5.5 및 75℃의 조건에서 아밀로오스 분해반응을 수행하는 경우, 1분당 1 μg의 아밀로오스를 분해하는 효소량을 1 단위(unit, U)로 정하였을 때, 본 발명의 당전이효소의 역가(unit)는 6 U/mg(unit/효소량)이고, 분지 사이클로덱스트린에 상기 당전이효소 0.6 U/mg(unit/분지 사이클로덱스트린량)을 첨가하여 반응시키는 경우, 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린으로부터 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조할 수 있는 바람직한 반응시간이 15 내지 30분인 당전이효소일 수 있다.
상기 당전이효소의 역가의 측정은 기질용액에 당전이효소를 첨가하고 75℃에서 반응을 수행한 후에, 루골 용액(Lugol's solution) 1 ml를 반응액 100 μl에 첨가하고 혼합하여 반응을 중단시키고, 상기 반응이 중단된 반응액을 620 nm에서 흡광도를 측정하고 상기 측정된 흡광도를 아밀로오스 표준 곡선과 비교하여 역가를 측정하였다(Tachibana, Y., Takaha, T., Fujiwara, S., Takagi, M., and Imanaka, T., Acceptor specificity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus kodakaraensis KOD1, and synthesis of cycloamylose. J. Biosci. Bioeng., 90, 406-409(2000).; Tang, S.Y., Yang, S.J., Cha, H., Woo, E.J., Park, C., and Park, K.H., Contribution of W229 to the transglycosylation activity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus furiosus. Biochim. Biophys. Acta, 1764, 1633-1638(2006).).
상기 기질용액은 바람직하게는 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 0.2%(w/v)로 용해된 아밀로오스 250 μl, 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 용해된 200 mM 말토트라이오스 50 μl 및 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5) 600 μl을 혼합하여 제조할 수 있으며, 아밀로오스 분해 산물 수용체인 말토트라이오스를 첨가하지 않는 경우에는, 상기 말토트라이오스 용액 50 μl 대신에 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액 50 μl을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 흡광도의 측정은 일정 시간 반응을 진행시키면서, 매 분마다 반응액을 분리한 후에, 반응을 중단시키고 흡광도를 측정할 수 있으며, 상기 반응의 중단은 바람직하게는 루골 용액을 첨가하여 수행할 수 있다.
상기 루골 용액은 바람직하게는 0.2 g의 요오드(I2)와 2.0 g의 요오드화칼륨(KI)을 1000 ml의 정제수에 녹여 제조할 수 있다.
상기 측정된 흡광도를 기준으로 정하여진 본 발명의 당전이효소의 역가 즉, 1 단위(unit, U)는 1분당 1 μg의 아밀로오스를 분해하는 효소량이다.
상기 당전이효소의 역가를 기준으로 할 때, 본 발명의 당전이효소는 말토트 라이오스를 첨가하지 않은 경우에는 0.35 U/mg(unit/효소량), 말토트라이오스를 첨가한 경우에는 6 U/mg(unit/효소량)의 역가가 있는 것으로 확인되었다. 즉, 말토트라이오스를 첨가하는 경우에 본 발명의 당전이효소 1mg은 1분에 아밀로오스 6 μg의 아밀로오스를 분해하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 당전이효소의 유전자는 서열번호 4의 단백질을 암호하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 상기 서열번호 4의 단백질을 암호하는 핵산 서열의 예로는 서열번호 3으로 기재한 핵산 서열이 있다. 상기 서열번호 3의 유전자 서열은 도 1에 나타내었다.
본 발명의 당전이효소는 설펄로버스 설파타리쿠스로부터 분리되거나 유전공학적인 방법으로 제조될 수 있다. 상기 유전공학적인 방법은 통상의 공지된 방법일 수 있고, 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물에서 유래된 진핵세포를 이용하여 단백질을 생산하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 당전이효소를 제조하 는 방법은 미생물 발현 생산시스템을 통하여 생산할 수 있다.
일 예로, 본 발명의 당전이효소를 제조하는 방법은 (a) 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 분리된 당전이효소를 암호하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체를 배양하여 당전이효소를 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다.
상기 (a) 단계에서, 상기 재조합 벡터는 상기 당전이효소를 암호하는 유전자가 공지의 벡터에 발현가능하도록 삽입되는 재조합 벡터일 수 있다. 상기 공지의 벡터는 미생물, 바람직하게는 효모, 대장균 또는 곰팡이에서 이종 단백질을 발현하기 위하여 제안된 모든 종류의 벡터일 수 있으며, 통상의 선별마커, 리포터 유전자 또는 재조합 단백질의 분리를 용이하게 하기 위한 수단을 더욱 포함할 수 있다. 상기 선별마커는 항생제 내성 유전자 또는 옥소트로피에 관련된 유전자일 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 벡터는 p6xHis119(김태집, 박사학위논문, 서울대학교, 1988), pUC119 또는 pET29(b)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 p6xHis119일 수 있다.
상기 (a) 단계에서 제조된 재조합 벡터는 본 발명의 일실시예에 따른 서열번호 4의 당전이효소를 암호하는 DNA와 p6xHis119를 결합하여 제조한 p6xHSGDE 벡터일 수 있다. 상기 재조합 벡터 p6xHSGDE의 개열지도는 도 2에 나타내었다.
상기 (b) 단계는 형질전환체를 제조하는 단계로 상기 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 바람직하게는 대장균, 유산균, 효모 또는 곰팡이일 수 있다. 형질전환체를 제조하는 방법은 통상의 방법일 수 있으며, 바람직하게는 CaCl2 및 열충격(heat-shock)을 이용하는 방법으로 형질전환체를 제조할 수 있다.
상기 (c) 단계는 형질전환체를 배양하여 당전이효소를 생산하는 단계로 형질전화체를 배양하는 배지는 숙주세포에 따라 적합한 배지를 선택할 수 있으며, 배양 조건 역시 숙주세포에 따라 적합한 조건을 선택할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 당전이효소를 생산하는 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환체는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래되고, pH 5.5 내지 pH 6.5 및 70℃ 내지 80℃에서 최적활성을 갖고, pH 3 내지 pH 11 및 60℃ 내지 95℃에서 안정성이 있으며, 분자량이 82kDa 내지 84kDa이고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가지는 당전이효소를 생산하는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물에서 유래된 진핵세포일 수 있으며, 바람직하게는 원핵생물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 효모, 대장균 또는 곰팡이일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균(E. coli)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 형질전환체인 Escherichia coli(E. coli) MC1061/p6xHSGDE는 2006년 11월 23일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은 동 52번지에 소재한 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였으며, 2006년 11월 23일자에 기탁번호 KCTC 11035BP를 부여받았다.
또한 상기 당전이효소의 생산방법은 상기 (c)단계 이후에, 형질전환체 균주로부터 당전이효소를 분리 또는 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 당전이효소의 분리 또는 정제는 통상의 방법에 의할 수 있으며, 일 예로는 원심분리 또는 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 형질전환체인 E. coli MC1061/p6xHSGDE를 암피실린이 첨가된 LB배지에서 30℃ 내지 37℃의 조건으로 10 내지 20시간, 바람직하게는 17시간 배양하여 다량의 당전이효소를 생산한 후에, 세포내 발현된 당전이효소를 균체수득, 균체 파쇄 또는 용혈(lysis), 상등액 분리 및 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다. 보다 상세하게는 상기 균체를 파쇄한 후에 원심분리를 하여 상등액을 취하고 열처리를 한 후에, 상기 열처리한 상등액에 대해 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다.
상기 크로마토그래피는 상세하게는 Q-세파로즈 크로마토그래피, DEAE-toyopearl 크로마토그래피 또는 GPC(gel permeation chromatography)순으로 실시하는 이온교환 크로마토그래피 또는 니켈 친화성 크로마토그래피일 수 있으며, 바람직하게는 니켈 친화성 크로마토그래피일 수 있다.
상기 본 발명의 당전이효소 생산방법은 모균주를 이용한 생산방법에 비하여 배양온도를 낮추어 실시하므로써 미생물 배양비용을 줄일 수 있는 효과와 효소의 생산성을 증가시킬 수 있다는 장점이 있다.
본 발명은 또한 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 기질에 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래한 당전이효소를 첨가하고 반응시켜 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하는 단계를 포함하는 분지 사이클로덱스트린 제조방법을 제공한다.
보다 상세하게는, 본 발명의 제조방법은
1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 기질에 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래되고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가지는 당전이효소를 첨가하며,
pH 5.0 내지 pH 7.0 및 60℃ 내지 80℃에서 반응시켜,
분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하는 단계를 포함하는 분지 사이클로덱스트린 제조방법일 수 있다.
상기 분지 사이클로덱스트린은 알파-분지 사이클로덱스트린(alpha-branched cyclodextrin), 분지 베타-사이클로덱스트린(beta-branched cyclodextrin) 또는 분지 감마-사이클로덱스트린(gamma-branched cyclodextrin)이거나 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 분지 사이클로덱스트린은 알파-분지 사이클로덱스트린, 분지 베타-사이클로덱스트린 또는 분지 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.
상기 측쇄 치환당은 말토올리고당일 수 있고, 바람직하게는 글루코오스 분자수 2 내지 7개로 이루어진 말토올리고당일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 글루코오스 분자 2 내지 5개로 이루어진 말토올리고당일 수 있고, 가장 바람직하게는 말토오스 또는 말토트라이오스일 수 있다.
상기 제조방법의 기질은 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 수용액일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 %의 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 수용액일 수 있다.
상기 당전이효소는 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 기질에 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래되고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가지는 당전이효소일 수 있으며, 바람직하게는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus sulfataricus)에서 유래되고, pH 5.5 내지 pH 6.5 및 70℃ 내지 80℃에서 최적활성을 갖고, pH 3 내지 pH 11 및 60℃ 내지 95℃에서 안정성이 있고, 분자량이 82kDa 내지 84kDa이고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 가지는 당전이효 소일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인 당전이효소일 수 있다.
본 발명의 분지 사이클로덱스트린 제조방법은 상기 기질과 당전이효소를 pH 5.0 내지 pH 7.0, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 6.5 및 65℃ 내지 85℃ 및 , 바람직하게는 70℃ 내지 80℃에서 반응시키는 것일 수 있다.
상기 기질과 당전이효소의 반응시간은 10분 내지 60분, 바람직하게는 15분 내지 30분일 수 있다.
본 발명의 분지 사이클로덱스트린 제조방법은 상기 기질과 당전이효소를 반응시킨 후에, 추가로 상기 반응액을 90℃ 내지 120℃, 바람직하게는 90℃ 내지 110℃에서 10분 내지 20분, 바람직하게는 15분간 가열하여 반응을 종결시키고, 반응을 종결시킨 상기 반응액에 대해 크로마토그래피를 수행하여 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 당전이효소는 말토트라이오스가 존재하는 조건 및 pH 5.5 및 75℃의 조건에서 아밀로오스 분해반응을 수행하는 경우, 1분당 1μg의 아밀로오스를 분해하는 효소량을 1 단위(unit, U)로 정하였을 때, 본 발명의 당전이효소의 역가(unit)는 6U/mg(unit/효소량)이고, 상기 당전이효소의 함량은 1mg/ml 사이클로덱스트린에 상기 당전이효소 0.6U을 첨가하여 반응시키는 경우, 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린으로부터 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조할 수 있는 바람직 한 반응시간이 15분 내지 30분인 당전이효소일 수 있다.
또한, 상기 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성과 상기 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성을 고려하면, 상기 당전이효소의 함량이 6U 일 때, 상기 반응을 15분 내지 30분 수행하여 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조방법이 바람직하다.
상기 반응을 15분 이하로 수행하는 경우, 충분한 반응을 수행하지 못하여 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린이 충분히 제조되지 아니하고, 상기 반응을 30분 이상으로 수행하는 경우, 상기 당전이효소가 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린의 측쇄 치환당을 가수분해하여 오히려 수율이 떨어지게 될 수 있다.
상기 크로마토그래피는 액체크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있으며, 바람직하게는 액체크로마토그래피일 수 있고, 더욱 바람직하게는 겔투과컬럼을 이용한 액체크로마토그래피일 수 있다.
상기 액체크로마토그래피는 일 예로 겔투과컬럼을 이용하여 수행할 수 있으며, 유동속도(flow rate)는 1.8ml/min 내지 2.2ml/min, 바람직하게는 2.0ml/min일 수 있다.
보다 상세하게는, 본 발명의 분지 사이클로덱스트린 제조방법은 상기 분지 사이클로덱스트린 제조방법은 말토오실-베타-사이클로덱스트린 수용액에 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 당전이효소를 첨가하고 15분 내지 30분 반응시킨 후에, 90℃ 내지 120℃로 10분 내지 20분 가열하여 반응을 종결시키고, 반응을 종결시킨 상기 반응액에 대해 액체 크로마토그래피를 수행하여 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린를 정제하는 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의할 경우, 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린에 본 발명의 당전이효소를 반응시켜 분지 사이클로덱스트린에 결합되어 있는 말토올리고당을 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린에 추가로 전이시켜 2개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하여 사이클로덱스트린의 수용성을 높일 수 있다. 구체적으로, 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린 기질에 본 발명의 당전이효소를 반응시키는 경우, 기질 중 일부의 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스와 측쇄 치환당의 글루코시드 결합을 가수분해하고, 상기 가수분해에 의해 얻어진 측쇄 치환당 즉, 말토올리고당을 기질 중 측쇄 치환당이 결합되어 있는 일부의 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 중 말토올리고당이 결합되어 있지 아니한 글루코스에 추가로 결합시켜, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하여, 수용성이 증가된 사이클로덱스트린을 제조할 수 있다.
상기한 바와 같이, 분지 사이클로덱스트린에 결합되어 있는 상기 측쇄 치환당은 말토올리고당일 수 있고, 바람직하게는 글루코오스 분자수 2개 내지 5개로 이루어진 말토올리고당일 수 있으며, 바람직하게는 말토오스 또는 말토트라이오스일 수 있다.
일 예로, 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 기질로 본 발명의 당전이효소를 반응시키는 경우, 상기 당전이효소는 기질 중 일부 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 말토오실기를 가수분해하고, 상기 가수분해에 의해 분리된 말토오스가 기질 중 일부 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 중 말토오실기가 결합되어 있지 아니한 글루코스에 결합되어 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조하여, 베타-사이클로덱스트린 또는 말토오실-베타-사이클로덱스트린에 비하여 수용성이 현저하게 증가된 분지 베타-사이클로덱스트린을 제조할 수 있다
또한, 본 발명의 제조방법은 효소를 이용한 생촉매반응에 의해 반응을 진행함으로써, 수용성이 높아진 분지 사이클로덱스트린을 용이하게 얻을 수 있으며, 종래기술과 비교하여 반응 결과물 즉, 분지 사이클로덱스트린의 순도가 높아, 반응 결과물에서 이를 분리하는 것이 용이하다는 장점이 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하게 나타내기 위하여 본 발명의 일 예를 기재한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예 1: 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 내열성 당전이효소 유전자 클로닝 및 생산
1-1. 당전이효소 유전자 클로닝
설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus, ATCC 35092)의 염색체 DNA는 QIAmp Tissue Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 균주로부터 Genomic DNA를 Kit을 이용하여 분리한 후에 그것으로부터 아래의 PCR 방법을 이용하여 유전자를 분리하였다.
상기 내열성 당전이효소 유전자를 분리하기 위하여 정방향 프라이머 SS2094-NdeI(5'-GTTAAGTACACATATGGCATTATTCTTCAG-3') 및 역방향 프라이머 SS2094-HindIII(5'-CCTATACGAAGCTTTTATCATAATTCTATC-3')를 각각 제작하였으며, 상기 프라이머는 하기 표 1과 같다.
[표 1]
| 서열 | 서열번호 | |
| 정방향 프라이머 SS2094-NdeI | 5'-GTTAAGTACACATATGGCATTATTCTTCAG-3' | 1 |
| 역방향 프라이머 SS2094-HindIII | 5'-CCTATACGAAGCTTTTATCATAATTCTATC-3' | 2 |
설펄로버스 설파타리쿠스 염색체 DNA에 대해 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 PCR 산물을 수득하였으며, 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 약 2.2 kb임을 확인하였다. 상기 PCR의 조건은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
[표 2]
| 단계(step) | 온도 | 반응시간 |
| First(1st) denaturation | 95℃ | 5 min |
| Second(2st) denaturation | 95℃ | 30 sec |
| Annealing | 55℃ | 30 sec |
| Extension | 72℃ | 2 min |
| Cycle | go to denaturation | 33 cycle |
| Final extension | 72℃ | 7 min |
상기 PCR 산물을 37℃에서 6시간 동안 제한효소 Nde I과 Hind III(New England Biolabs(NEB), USA)로 처리하고, 이를 동일한 제한 효소로 동일한 조건에서 처리한 p6XHis119(김태집, 박사학위논문, 서울대학교, 1988) 발현벡터와 ligase(New England Biolabs(NEB), USA)를 이용하여 12시간동안 16℃에서 라이게이션하여 p6xHSGDE를 제조하였다. 상기 p6xHSGDE의 벡터 맵을 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 PCR산물과 벡터는 Nde I과 Hind III의 제한효소 부위에 의해 결합되어 있으며, 당전이효소 유전자와 5'말단에 6개의 부가적인 히스티딘 잔기를 포함하고 있다.
상기 재조합 벡터 p6xHSGDE를 숙주세포에 형질전환 시키기 위하여, 5ml LB 액체 배지에 숙주 세포인 E. coli MC1016(New England Biolabs(NEB), USA)를 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0ml을 새로운 LB 액체 배지 50ml에 접종하여 600nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 상기 흡광도를 확인한 배양액 1.5ml를 4℃에서 7000 x g의 조건으로 5분간 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 0.75ml의 형질전환용액I(50mM CaCl2)으로 현탁하고 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 이후 4℃에서 6000 x g의 조건으로 2분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수된 균체를 0.15ml의 형질전환용액II(100mM CaCl2)로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다.
현탁액 0.15ml와 500ng의 상기 라이게이션한 용액을 혼합하고, 얼음 속에서 1시간 방치한 후 42℃에서 2분간 열 충격을 주었다. 상기 열 충격을 준 혼합액에 0.8ml의 LB 액체 배지를 혼합한 후, 37℃에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 암피실린(최종농도 100μg/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.
1차 선별된 균주를 암피실린이 포함된 LB 액체 배지 5ml에 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 플라스미드 분리키트(Qiagen, USA)로 회수된 균체로부터 플라스미드를 분리하고 상기와 동일한 Nde I과 Hind III제한 효소를 이용하여 상기와 동일한 조건에서 절단하여, 약 2.2kb의 크기의 유전자가 있는지 여부를 확인하였다.
1-2. 내열성 당전이효소의 생산 및 정제
상기에서 제조한 p6xHSGDE 벡터를 E. coli MC1061에 상기와 동일한 방법으로 형질전환 시킨 후 암피실린 내성여부를 확인하여 형질전환체를 선별하였다. 상기 선별된 형질전환체I은 암피실린이 함유된 LB 액체 배지 2.5L에 접종하여 37℃에서 17시간 배양한 후, 4℃에서 7,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 300mM NaCl과 10mM 이미다졸이 함유된 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 현탁한 후 초음파 분쇄하였다. 상기 초음파 분쇄를 수행한 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 70℃에서 20분간 열처리한 다음, 10,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 수득된 상등액은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 주입하여, 정제하였다.
재조합 벡터 p6xHSGDE로 형질전환 시킨 E. coli MC1061에서 생산된 설펄로버 스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 정제단계별 시료의 전기영동 사진을 도 3에 나타내었다. 상기 도 3의 M은 사이즈 마커이고, lane 1은 E. coli MC1061/p6xHSGDE 형질전환체를 초음파 분쇄하여 수득한 상등액이고, lane 2는 상기 초음파 분쇄 후 수득한 상득액의 시료를 65℃에서 20분간 열처리한 것이고, lane 3은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제한 당전이효소이다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE상에서 상기 당전이효소의 크기는 약 83,000Da의 분자량을 나타내었으며, 이것은 아미노산 서열로부터 유추된 이론적 분자량인 83,090Da과 거의 유사한 값이었다.
실시예 2: 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 특성
2-1. 효소 역가
본 발명의 당전이효소의 역가는 아밀로오스 분해 산물의 수용체(acceptor)로 작용할 수 있는 말토트라이오스(G3)의 유무에 따라 구분하여 아밀로오스 분해활성을 이용하여 측정하였다(Tachibana, Y., Takaha, T., Fujiwara, S., Takagi, M., and Imanaka, T., Acceptor specificity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus kodakaraensis KOD1, and synthesis of cycloamylose. J. Biosci. Bioeng., 90, 406-409(2000).; Tang, S.Y., Yang, S.J., Cha, H., Woo, E.J., Park, C., and Park, K.H., Contribution of W229 to the transglycosylation activity of 4-α-glucanotransferase from Pyrococcus furiosus. Biochim. Biophys. Acta, 1764, 1633-1638(2006).).
상기 당전이효소의 역가를 측정하기 위한 기질용액은 다이메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 0.2%(w/v)로 용해된 아밀로오스 250μl, 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 용해된 200mM 말토트라이오스 50μl 및 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5) 600μl을 혼합하여 제조하였다. 아밀로오스 분해 산물 수용체인 말토트라이오스를 첨가하지 않는 기질용액의 경우, 상기 말토트라이오스 용액 50μl 대신에 50mM 소듐 아세테이트 완충용액 50μl을 첨가하였다.
상기 제조한 기질용액에 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 100μl를 넣고 75℃에서 20분 동안 반응을 수행하였다. 상기 반응을 수행한 반응액 중, 100μl를 분리한 것에 루골 용액(Lugol's solution) 1ml를 첨가하고 혼합하여 반응을 중단시켰다. 상기 루골 용액은 0.2g의 요오드(I2)와 2.0g의 요오드화칼륨(KI)를 1000ml의 정제수에 녹여 제조하였다. 상기 반응을 중단시킨 후, 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도는 아밀로오스 표준 곡선과 비교하여 1분당 1μg의 아밀로오스를 분해하는 효소량을 1 단위(unit, U)로 정하였다.
상기 흡광도 측정에 의하여, 본 발명의 당전이효소는 말토트라이오스를 첨가하지 않은 경우에는 0.35U/mg(unit/효소량), 말토트라이오스를 첨가한 경우에는 6U/mg(unit/효소량)의 역가가 있는 것으로 확인되었다. 즉, 말토트라이오스를 첨가하는 경우에 본 발명의 당전이효소 1mg은 1분에 아밀로오스 6μg의 아밀로오스를 분해할 수 있는 것으로 확인되었다.
2-2. 온도 특성
효소의 최적 온도를 결정하기 위해, 다양한 온도 범위에서 아밀로펙틴 용액에 대한 상대적 역가를 측정하였다.
50 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)에 용해된 2%(w/v) 아밀로펙틴 기질 용액 150 ㎕에 동일 완충용액 120 ㎕을 넣고 65℃ 내지 90℃ 범위의 다양한 온도에서 5분간 열처리한 후, 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 30㎕을 넣고 각각의 온도에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응된 반응액으로부터 상대적 효소활성을 DNS 법을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 75℃에서 최적 활성을 나타내었으며, 70℃ 내지 80℃에서 최적활성의 80 %의 역가를 유지하였다.
2-3. pH 특성
효소의 최적 pH를 결정하기 위해, 다양한 pH 범위에서 아밀로펙틴 용액에 대한 상대적 역가를 측정하였다.
50mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.5 내지 6.0) 또는 50mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.0 내지 7.5) 각각에 용해된 0.5%(w/v) 아밀로펙틴 기질 용액 150㎕에 각각의 완충용액 120㎕ 및 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 30㎕을 넣고 75℃에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응된 반응액으로부터 상대적 효소활성을 DNS 법을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 당전이효소는 pH 5.5에서 최적 활성을 나타 내었으며, pH 6.0 내지 pH 6.5에서 최적활성의 80% 이상의 역가를 유지하였다.
2-4. 반응액의 TLC 분석
다양한 기질에 대한 설펄로버스 설파타리쿠스 당전이효소의 산물을 분석하기 위해 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 말토트라이오스(maltotriose, G3), 말토테트라오스(maltotetraose, G4), 말토펜타오스(maltopentaose, G5), 말토헥사오스(maltohexaose, G6), 말토헵타오스(maltoheptaose, G7), 아밀로펙틴 (amylopectin), 글라이코젠(glycogen), 풀루란(pullulan), 말토오실-베타-사이클로덱스트린(maltosyl-β-cyclodextrin)을 녹인 후, 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 1단위(unit)를 첨가하고 70℃에서 12시간 반응시켰다.
상기 반응을 시킨 반응산물을 박막크로마토그라피 (Thin Layer Chromatography, TLC)를 이용하여 분석하였다. 보다 상세하게는, 각 시료를 Whatman K5F TLC 플레이트(20cm X 20cm)에 1㎕씩 로딩하여 부탄올, 에탄올, 정제수가 5:3:3의 비(v/v/v)로 혼합된 전개액에서 2회 전개시켰다. 상기 전개액에서 전개 후에 플레이트를 잘 건조시켜 메탄올에 0.3(w/v)% N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5(v/v)% 황산을 용해시킨 발색액에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분 동안 발색시켜 그 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도 6의 M은 말토올리고당 표준 물질이고, lane 1, 2, 3, 4 및 5는 기질로 말토트라이오스, 말토테트라오스, 말토팬타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스를 사용한 것이고, lane 6은 풀루란, lane 7은 말토오실-베타-사이클로덱스트린, lane 8은 글라이코젠, lane 9는 아밀로펙틴, lane 10은 아밀로오스를 사용한 것이다.
상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소는 말토올리고당(G3 내지 G7)으로부터 직쇄형의 다양한 말토올리고당을 생산하였고, 아밀로펙틴(amylopectin)과 글라이코젠(glycogen)으로부터 여러 가지 직쇄형의 다양한 말토올리고당을 생산하였다. 풀란 (pullulan)으로부터는 말토트라이오스 (maltotriose, G3)를 주로 생산하였으며 말토오실-베타-사이클로덱스트린 (maltosyl-β-cyclodextrin)에서는 말토오스, 사이클로덱스트린 및 당전이 산물로 여겨지는 물질을 생산하였다. 상기 도 6에 나타난 결과로 보아 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소는 알파-1,4-글루코시드 결합 당전이능과 알파-1,6-글루코시드 결합 가수분해능이 있음이 확인되었다.
실시예
3:
말토오실
-베타-
사이클로덱스트린
(
maltosyl
-β-
cyclodextrin
)으로부터
다이말토오실
-베타-사이클로덱스트린(
dimaltosyl
-β-
cyclodextrin
)의 제조 및 분리 정제
3-1. 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린 제조
50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 용해된 2%(w/v) 말토오실-베타-사이클로덱스트린 기질 용액 500㎕에, 동일 완충용액 400㎕을 넣고 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 1.0mg/ml(0.6unit)을 넣고 75℃에서 10분 내지 720분 동안 시간별로 반응시켰으며, 정해진 시간별로 반응을 시킨 후에 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다.
3-2. 반응액의 박막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석
실시예 3-1에서 반응을 종결시킨 반응액은 박막 크로마토그래피를 이용하여 반응산물을 분석하였다.
각 시료를 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에 1㎕씩 로딩하고, 부탄올, 에탄올 및 정제수가 5:3:3의 비(v/v/v)로 혼합된 전개액에서 1회 전개시킨 후, 건조시켜 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5%(w/v) 황산을 함유한 메탄올에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분 동안 발색시켜 그 결과를 도 7에 나타내었다.
상기 도 7의 M은 말토올리고당 표준 물질이고, lane 1은 기질로 베타-사이클로덱스트린을 사용한 것이고, lane 2는 기질로 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 사용한 것이며, lane 3 내지 lane 8은 각각 반응시간 10분, 30분, 60분, 180, 360 및 720분간 반응시킨 것이다.
상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 당전이효소는 기질인 말토오실-베타-사이클로덱스트린을 가수분해하여 말토오스와 베타 사이클로덱스트린을 주 반응산물로 생성함과 동시에 새로운 생산물을 생성하였으며, 수율 및 순도를 고려할 때, 60분 내지 180분 더욱 바람직하게는 60분 내지 120분간 반응을 수행하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다.
실시예 4 : 당전이효소에 의한 반응 생성물의 구조 및 당전이효소의 최적 반응 조건 분석
4-1 생성물의 분리 및 정제
실시예 3-2에서 70℃에서 60분 동안 반응시켜 제조된 반응 생성물을 고성능 순환 액체 크로마토그래피(recycling liquid chromatography)를 이용하여 분리 및 정제 하였다.
겔투과컬럼(JAIGEL-W251, 2x50cm, JAI, Tokyo)을 정제수(distilled water)로 안정화 시키고, 실시예 3-2에서 60분 동안 반응시켜 얻은 반응액을 주입하였다. 이때 유동속도(flow rate)는 2.0ml/min이었다. 분리된 생성물의 순도 분석은 실시예 3-2의 박막 크로마토그래피와 동일한 방법으로 수행하였으며 그 결과를 도 8에 나타내었다.
4-2 생성물의 분자량 측정
상기 실시예 4-1에서 정제한 생성물의 분자량을 MALDI/TOF/MS법으로 측정하였다(김묘정 외, Biochemistry, 2002). 상기 분자량 측정을 위하여 Voager TM-DE Perceptive Biosystem(USA) 및 DHB/methanol을 사용하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
상기 도 9에 나타난 바와 같이, MALDI/TOF/MS 스펙트럼으로 측정된 생성물의 분자량은 1805.5로 측정되었으며 상기 분자량으로부터 상기 생성물이 글루코오스 11개로 구성되어 있는 것임이 확인되었다. 즉, 열한개의 글루코오스(약 162x11= 1782)와 소듐(23)분자가 결합된 것으로 확인되었으며, 7개의 글루코오스가 알파-1,4-글루코사이드로 결합된 베타-사이클로덱스트린에 글루코오스가 네 분자 결합되 어 열한개의 글루코오스를 이루는 것으로 예측되었다.
4-3 아이소아밀라제 (isoamylase)의 처리
실시예 4-2의 분자량 분석을 바탕으로 베타-사이클로덱스트린에 네분자 글루코오스의 결합 형태를 알아보기 위하여 알파-1,6-글루코시드 결합을 절단하는 아이소아밀라제를 처리하였다. 처리조건은 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.3)에 용해된 2%(w/v) 생성물 기질 용액 450㎕, 동일 완충용액 360㎕ 및 아이소아밀라제 90㎕(13 unit)를 넣고 60℃에서 60시간 동안 반응시켰다. 상기 반응시간이 경과된 후에, 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 상기 반응을 종결시킨 반응액은 실시예 3-2 박막 크로마토그래피와 동일한 방법으로 분석을 수행하였으며 그 결과를 도 8에 나타내었다. 상기 도 8의 lane M은 마커를 의미하고, G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7은 글루코오스, 말토오스, 말토트라이오스, 말토테트라오스, 말토팬타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스를 의미한다.
상기 도 8의 lane 4는 실시예 3-2의 반응물을 고성능 순환(recycling) 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제한 생성물이고, lane 5는 상기 lane 4의 고성능 순환(recycling) 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리된 생성물에 아이소아밀라제를 처리한 것이다.
상기 도 8에 나타낸 바와 같이, 아이소아밀라제 처리 후 생성물은 베타-사이클로덱스트린과 말토오스로 분해된 것과 같은 형태의 결과를 얻어, 생성물의 구성 분자중에 말토오스가 알파-1,6-글루코시드 결합되어있음을 확인할 수 있었다.
4-4 글루코아밀라제 (glucoamylase)의 처리
말토오스의 알파-1,6-글루코시드 결합이 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 베타-사이클로덱스트린과 이루어졌는지 혹은 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 말토오실 분자와 이루어 졌는지 확인하기 위하여 비환원성 말단부분에서부터 알파-1,4-글루코시드결합을 절단하여 글루코오스를 생성할 수 있는 글루코아밀라제를 처리하였다. 상기 글루코아밀라제의 처리조건은 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 용해된 1%(w/v) 생성물 기질 용액 250 μl, 동일 완충용액 200 μl 및 글루코아밀라제 50 μl(0.22 unit)를 넣고 75℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 상기 시간이 경과한 후에, 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 상기 반응을 종결시킨 반응액은 실시예 3-2의 박막 크로마토그래피와 동일한 방법으로 분석을 수행하였으며 그 결과를 도 8 및 도 10에 나타내었다.
도 8의 lane 6는 고성능 순환 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리된 생성물에 글루코아밀라제를 처리한 것이고 lane 7은 글루코아밀라제를 처리한 후, 글루코오스를 제거하고 남은 물질을 분리한 것이다.
상기 생성물에서 글루코오스를 제거하고 생성물의 분자량을 실시예 4-2와 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
상기 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 생성물의 분자량은 1481.6인 것으로 측정되었으며, 상기 분자량으로부터 상기 생성물이 글루코오스 9개로 구성되어 있는 것임을 확인할 수 있었다. 만일 말토오스의 α-1,6-글루코시드 결합이 말토오 실-베타-사이클로덱스트린의 말토오실 분자와 이루어 졌다면 글루코아밀라제 처리 후 남아있는 물질은 10개의 글루코오스로 구성이 되어있을 것이고, 말토오스의 α-1,6-글루코시드 결합이 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 베타-사이클로덱스트린과 이루어졌다면 글루코아밀라제 처리 후 남아있는 물질은 9개의 글루코오스로 구성이 되어있을 것이므로, 상기 도 10에서 나타낸 결과에 의해 상기 당전이효소에 의해 생성된 생성물은 9개의 글루코오스로 구성되어 있는 다이글루코실-베타-사이클로덱스트린 (diglucosyl-β-cyclodextrin)임이 확인되었다.
4-5 최적반응조건의 분석
상기 최적반응조건의 분석은 일정량의 효소를 첨가하였을 경우, 다이말토오실 베타 사이클로덱스트린을 가장 많이 생산하는 반응시간을 측정하는 것으로 수행하였다.
상기 반응시간의 측정은 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 용해된 최종농도가 1%인 말토오실-베타-사이클로덱스트린 기질 용액 1 ml에 실시예 1-2에서 정제한 당전이효소 1.0 mg/ml(6 unit)을 넣고 70℃에서 5 내지 50분 동안 시간별로 반응시켰으며, 정해진 시간별 즉, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 50 동안 반응을 시킨 후에 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다.
상기 반응을 종결시킨 후, 각 시간별로 반응액 중 각각 90μl 씩 취하였으며, 이를 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다. 상기 HPLC 분석에 사용된 검출기(detector)는 증기화광산란검출기(ELSD)를 사용하 였고, column은 C18 column을 사용하였다. 상기 분석에 사용된 유동액은 두가지 유동액 즉, A(DDW : formic acid = 100 : 0.1)와 B(DDW : MeOH : formic acid = 75 : 25 : 0.1)를 사용하였다. 상기 HPLC 분석의 유동속도는 1.0ml/min이었다. 상기 분석결과를 도 11에 나타내었다.
상기 도 11에 나타낸 바와 같이, 1% 말토오실 베타 싸이클로덱스트린 용액에 1.0mg/ml 효소 즉, 효소 6unit을 처리하였을 경우, 15분 내지 30분에서 수율이 높은 것으로 확인되었고, 약 30분 반응을 시킨 경우에서 가장 좋은 수율을 나타내는 것으로 확인되었다. 상기 최적반응시간은 사용되어는 효소의 양과 기질의 농도에 따라 변화될 수 있으나, 상기 결과로부터, 말토오실-베타-사이클로덱스트린의 30% 정도가 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린로 전환 되었을 때, 가장 좋은 수율 즉, 가장 많은 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 내열성이 우수한 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소의 알파-1,6-글루코시드 당전이활성을 이용하여, 말토오실-베타-사이클로덱스트린으로부터 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 고순도로 제조함으로써, 낮은 온도에서 수용성이 낮다는 베타-사이클로덱스트린의 단점을 보완하여 식, 의약품 분야에서 대체물질로서의 베타-사이클로덱스트린의 사용범위를 확대함으로써 특히 식,의약품 산업분야에서 그 활용도가 매우 클 것이다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION
<120> THERMOSTABLE SULFOLOBUS SULFATARICUS-DERIVED ALPHA-GLYCOSYL
TRANSFERASE AND PREPARATION METHOD OF BRANCHED CYCLODEXTRIN WITH
THE SAME
<130> dpp20064394kr
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SS2094-NdeI
<400> 1
gttaagtaca catatggcat tattcttcag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SS2094-HindIII
<400> 2
cctatacgaa gcttttatca taattctatc 30
<210> 3
<211> 2154
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SULFOLOBUS SULFATARICUS-DERIVED ALPHA-GLYCOSYL TRANSFERASE
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2154)
<400> 3
atg gca tta ttc ttc aga act aga gat agg cct ctt cgt ccc gga gat 48
Met Ala Leu Phe Phe Arg Thr Arg Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Asp
1 5 10 15
cca tat cca tta ggt tcg aat tgg ata gaa gat gat gat ggt gtg aat 96
Pro Tyr Pro Leu Gly Ser Asn Trp Ile Glu Asp Asp Asp Gly Val Asn
20 25 30
ttt tca tta ttc tca gaa aat gca gaa aaa gtc gaa tta ctc ctt tac 144
Phe Ser Leu Phe Ser Glu Asn Ala Glu Lys Val Glu Leu Leu Leu Tyr
35 40 45
tca ctg aca aac caa aag tac cca aag gag ata ata gag gtt aaa aac 192
Ser Leu Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Ile Glu Val Lys Asn
50 55 60
aaa acg gga gat att tgg cac gtc ttc gtc ccg gga ctg aga ccc ggg 240
Lys Thr Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Arg Pro Gly
65 70 75 80
caa ctt tac gca tat agg gtt tat ggc cca tat aaa ccg gag ttg gga 288
Gln Leu Tyr Ala Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Glu Leu Gly
85 90 95
tta agg ttt aat cca aat aag gtt tta ata gac cct tat gct aaa gcc 336
Leu Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala
100 105 110
ata aac ggt agt gta att tgg aac gac gcg gta ttt ggt tat aag ata 384
Ile Asn Gly Ser Val Ile Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile
115 120 125
gga gat caa aat caa gat ttg acc tat gac gag agg gat tcc ggc gaa 432
Gly Asp Gln Asn Gln Asp Leu Thr Tyr Asp Glu Arg Asp Ser Gly Glu
130 135 140
tat gtt cct aaa agt gtt gtg att aat cca tac ttt gag tgg gac gat 480
Tyr Val Pro Lys Ser Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp
145 150 155 160
gag gat ttc att aag gga aag aaa gtt cca tta aag gat aca gta att 528
Glu Asp Phe Ile Lys Gly Lys Lys Val Pro Leu Lys Asp Thr Val Ile
165 170 175
tac gaa gtt cac gta aaa ggg ttt aca aaa ctt agg ttg gat ttg ccg 576
Tyr Glu Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Leu Asp Leu Pro
180 185 190
gaa aac ata agg gga act tat gaa ggt ctt gcc tca gaa caa atg atc 624
Glu Asn Ile Arg Gly Thr Tyr Glu Gly Leu Ala Ser Glu Gln Met Ile
195 200 205
agc tat ctc aaa gat cta ggg att act act gtg gaa cta atg cca gtt 672
Ser Tyr Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr Thr Val Glu Leu Met Pro Val
210 215 220
ttc cat ttt atc gat caa aga ttt ctg aca gat aag ggg cta acg aat 720
Phe His Phe Ile Asp Gln Arg Phe Leu Thr Asp Lys Gly Leu Thr Asn
225 230 235 240
tac tgg ggg tat gac cca ata aat ttc ttc tct cct gaa tgt aga tat 768
Tyr Trp Gly Tyr Asp Pro Ile Asn Phe Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr
245 250 255
tcc agt act ggc tgt tta gga ggg caa gta tta agt ttc aaa aaa atg 816
Ser Ser Thr Gly Cys Leu Gly Gly Gln Val Leu Ser Phe Lys Lys Met
260 265 270
gta aac gaa tta cat aac gca gga att gag gtt ata atc gat gta gtt 864
Val Asn Glu Leu His Asn Ala Gly Ile Glu Val Ile Ile Asp Val Val
275 280 285
tat aat cac act gct gag ggg aat cat tta ggc cca acg tta agt ttc 912
Tyr Asn His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe
290 295 300
aga ggt att gat aat aca gca tat tac atg ctc caa cca gat aat aaa 960
Arg Gly Ile Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Met Leu Gln Pro Asp Asn Lys
305 310 315 320
aga tat tat tta gac ttt acc gga act ggc aat acg tta aat ctt agc 1008
Arg Tyr Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser
325 330 335
cat cct aga gtc atc cag atg gtc tta gat agc tta aga tat tgg gtt 1056
His Pro Arg Val Ile Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val
340 345 350
aca gag atg cac gta gat ggc ttt aga ttt gac tta gca gca gct tta 1104
Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu
355 360 365
gcc agg gaa tta tac agc gtt aat atg tta aat acg ttc ttc att gct 1152
Ala Arg Glu Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Asn Thr Phe Phe Ile Ala
370 375 380
cta cag caa gac cca ata ttg tca caa gta aaa ctg ata gct gag cct 1200
Leu Gln Gln Asp Pro Ile Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro
385 390 395 400
tgg gat gtg gga caa ggg gga tat caa gta ggg aat ttc cca tat caa 1248
Trp Asp Val Gly Gln Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Gln
405 410 415
tgg gca gag tgg aat gga aag tat agg gat tcg ata agg aga ttt tgg 1296
Trp Ala Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ser Ile Arg Arg Phe Trp
420 425 430
aga gga gaa gcg tta ccc tat agc gag att gct aac aga tta tta ggc 1344
Arg Gly Glu Ala Leu Pro Tyr Ser Glu Ile Ala Asn Arg Leu Leu Gly
435 440 445
tcg ccg gac att tac tta ggt aat aat aaa aca cca ttt gcc agt ata 1392
Ser Pro Asp Ile Tyr Leu Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile
450 455 460
aat tac gta act tct cat gat ggt ttc aca tta gag gat tta gtc agt 1440
Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser
465 470 475 480
tat aat caa aaa cac aat gaa gcg aat gga ttt aac aat caa gat gga 1488
Tyr Asn Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly
485 490 495
atg aac gag aac tat agt tgg aat tgt ggt gca gaa gga cca aca aat 1536
Met Asn Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Ala Glu Gly Pro Thr Asn
500 505 510
gac caa aac gtg gta ata tgc agg gag aaa caa aaa agg aac ttt atg 1584
Asp Gln Asn Val Val Ile Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Met
515 520 525
ata acg tta ctc gtt agt caa gga acc cct atg ata ttg gga gga gat 1632
Ile Thr Leu Leu Val Ser Gln Gly Thr Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp
530 535 540
gag cta agc agg aca caa aga gga aat aat aac gcg ttt tgt caa gac 1680
Glu Leu Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp
545 550 555 560
aac gag ata act tgg ttt gat tgg aat tta gat gag aga aaa tca aaa 1728
Asn Glu Ile Thr Trp Phe Asp Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Ser Lys
565 570 575
ttt tta gag ttt gtt aaa aag atg atc caa ttt tat agg gca cat cca 1776
Phe Leu Glu Phe Val Lys Lys Met Ile Gln Phe Tyr Arg Ala His Pro
580 585 590
gca ttc aga agg gaa aga tat ttt caa gga aag aaa tta ttc ggc atg 1824
Ala Phe Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu Phe Gly Met
595 600 605
ccg tta aaa gat gtg acc ttc tat act cta gaa ggt agg gaa gtt gat 1872
Pro Leu Lys Asp Val Thr Phe Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Glu Val Asp
610 615 620
gag aaa aca tgg agt tcc ccg acg caa cta gtt att ttc gtg ttg gag 1920
Glu Lys Thr Trp Ser Ser Pro Thr Gln Leu Val Ile Phe Val Leu Glu
625 630 635 640
gga agt gtt atg gac gag att aat atg tat gga gag aga att gct gat 1968
Gly Ser Val Met Asp Glu Ile Asn Met Tyr Gly Glu Arg Ile Ala Asp
645 650 655
gat tcc ttc tta ata ata ctt aac gca aat ccc aat aac gta aag gtg 2016
Asp Ser Phe Leu Ile Ile Leu Asn Ala Asn Pro Asn Asn Val Lys Val
660 665 670
aaa ttc cca aaa ggt aaa tgg gaa cta gtt atc agt tct tat ttg aga 2064
Lys Phe Pro Lys Gly Lys Trp Glu Leu Val Ile Ser Ser Tyr Leu Arg
675 680 685
gaa ata aaa cca gaa gag aga atc ata gaa ggt gag aag gaa ctg gaa 2112
Glu Ile Lys Pro Glu Glu Arg Ile Ile Glu Gly Glu Lys Glu Leu Glu
690 695 700
ata gag gga agg acg gca tta gtt tat agg agg ata gaa tta 2154
Ile Glu Gly Arg Thr Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Glu Leu
705 710 715
<210> 4
<211> 718
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Met Ala Leu Phe Phe Arg Thr Arg Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Asp
1 5 10 15
Pro Tyr Pro Leu Gly Ser Asn Trp Ile Glu Asp Asp Asp Gly Val Asn
20 25 30
Phe Ser Leu Phe Ser Glu Asn Ala Glu Lys Val Glu Leu Leu Leu Tyr
35 40 45
Ser Leu Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Ile Glu Val Lys Asn
50 55 60
Lys Thr Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Arg Pro Gly
65 70 75 80
Gln Leu Tyr Ala Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Glu Leu Gly
85 90 95
Leu Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala
100 105 110
Ile Asn Gly Ser Val Ile Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile
115 120 125
Gly Asp Gln Asn Gln Asp Leu Thr Tyr Asp Glu Arg Asp Ser Gly Glu
130 135 140
Tyr Val Pro Lys Ser Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp
145 150 155 160
Glu Asp Phe Ile Lys Gly Lys Lys Val Pro Leu Lys Asp Thr Val Ile
165 170 175
Tyr Glu Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Leu Asp Leu Pro
180 185 190
Glu Asn Ile Arg Gly Thr Tyr Glu Gly Leu Ala Ser Glu Gln Met Ile
195 200 205
Ser Tyr Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr Thr Val Glu Leu Met Pro Val
210 215 220
Phe His Phe Ile Asp Gln Arg Phe Leu Thr Asp Lys Gly Leu Thr Asn
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Tyr Asp Pro Ile Asn Phe Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr
245 250 255
Ser Ser Thr Gly Cys Leu Gly Gly Gln Val Leu Ser Phe Lys Lys Met
260 265 270
Val Asn Glu Leu His Asn Ala Gly Ile Glu Val Ile Ile Asp Val Val
275 280 285
Tyr Asn His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe
290 295 300
Arg Gly Ile Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Met Leu Gln Pro Asp Asn Lys
305 310 315 320
Arg Tyr Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser
325 330 335
His Pro Arg Val Ile Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val
340 345 350
Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu
355 360 365
Ala Arg Glu Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Asn Thr Phe Phe Ile Ala
370 375 380
Leu Gln Gln Asp Pro Ile Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro
385 390 395 400
Trp Asp Val Gly Gln Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Gln
405 410 415
Trp Ala Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ser Ile Arg Arg Phe Trp
420 425 430
Arg Gly Glu Ala Leu Pro Tyr Ser Glu Ile Ala Asn Arg Leu Leu Gly
435 440 445
Ser Pro Asp Ile Tyr Leu Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile
450 455 460
Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser
465 470 475 480
Tyr Asn Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly
485 490 495
Met Asn Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Ala Glu Gly Pro Thr Asn
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Asp Gln Asn Val Val Ile Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Met
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Ile Thr Leu Leu Val Ser Gln Gly Thr Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp
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Glu Leu Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp
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Ile Glu Gly Arg Thr Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Glu Leu
705 710 715
Claims (9)
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- 1개의 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 포함하는 기질에 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서 유래되고, 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스에 말토올리고당을 결합시키는 당전이 활성과 분지 사이클로덱스트린에 결합된 측쇄 치환당과 분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코오스의 글루코시드 결합을 가수분해하는 활성을 갖으며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인 당전이효소를 첨가하며,pH 5.0 내지 pH 7.0 및 60℃ 내지 80℃에서 반응시켜,분지 사이클로덱스트린의 환 구성 글루코스 2개에 측쇄 치환당을 가지는 분지 사이클로덱스트린을 제조하는 단계를 포함하는 분지 사이클로덱스트린 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 분지 사이클로덱스트린은 분지 알파-사이클로덱스트린, 분지 베타-사이클로덱스트린 및 분지 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 분지 사이클로덱스트린 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 측쇄 치환당은 말토오스 또는 말토트라이오스인 분지 사이클로덱스트린 제조방법.
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- 제5항에 있어서, 상기 당전이효소는 상기 당전이효소의 역가(unit)가 6U/mg(unit/효소량)이고, 상기 당전이효소의 함량은 0.6U/mg/ml(unit/분지 사이클로덱스트린량)/반응부피)이며, 상기 반응시간이 15분 내지 30분인 분지 사이클로덱스트린 제조방법.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| KR1020070043213A KR100898384B1 (ko) | 2007-05-03 | 2007-05-03 | 내열성 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소 및 이를이용한 분지 사이클로덱스트린의 제조방법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104870464A (zh) * | 2012-07-24 | 2015-08-26 | 国家科研中心 | 多聚甘露糖苷及其制备方法和它们作为药物的用途 |
| KR20160122513A (ko) | 2015-04-14 | 2016-10-24 | 한림대학교 산학협력단 | CGTase 변이효소를 이용한 α-사이클로덱스트린의 수득방법 |
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2007
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 염기서열1: AAK42273* |
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