JP2010148407A - METHOD FOR CONVERTING GLUCOSE TO alpha-1,4-GLUCAN - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for efficiently producing α-1,4-glucan from glucose. <P>SOLUTION: The method includes a step of producing α-1,4-glucan by reacting a solution containing glucose, a polyphosphoric acid, a primer, a polyphosphate glucokinase, a phosphoglucomutase and α-1,4-glucan phosphorylase. The glucose concentration in the solution at the start of the reaction is 100-2,000 mM, the pH of the solution at the start of the reaction is 5.7-12, and the ratio (Pi/Glc) of the molar concentration of the free phosphoric acid to the molar concentration of the glucose in the solution at the start of the reaction is ≤0.15. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、グルコースからα−グルカンを製造する方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、セロビオースからα−グルカンを製造する方法に関する。   The present invention relates to a method for producing α-glucan from glucose. In certain embodiments, the present invention relates to a method for producing α-glucan from cellobiose.

人間は、デンプンなどのα−グルカンを消化してエネルギー源として利用している。そのため、α−グルカンは、人類にとってエネルギー源として非常に重要である。さらに、α−グルカンは、食品産業をはじめ、医薬、化粧品、化学工業、製紙、繊維などにおける原料としても幅広く利用されている。特に、アミロースは、種々の機能を有するので、幅広い分野での利用が期待されている。   Humans digest α-glucan such as starch and use it as an energy source. Therefore, α-glucan is very important as an energy source for human beings. Furthermore, α-glucan is widely used as a raw material in the food industry, pharmaceuticals, cosmetics, chemical industry, papermaking, fiber and the like. In particular, amylose has various functions and is expected to be used in a wide range of fields.

近年、人口増加により食糧危機が問題視されており、植物の生産するデンプンだけでは将来エネルギー源が不足すると予想されている。   In recent years, the food crisis has been regarded as a problem due to population growth, and it is expected that energy sources will be insufficient in the future only with starch produced by plants.

一方、人間は、セルロースなどのβ−グルカンを消化できないので、エネルギー源として利用することができず、β−グルカンは、食物繊維成分としてのみ利用されている。それゆえ、β−グルカンを食糧危機問題の解決には利用できない。しかし、β−グルカンの年間生産量は、デンプンの約２万倍と推定されており、枯渇の心配はない。そのため、β−グルカンを、人間がエネルギー源とし得る物質に変換する種々の試みが行われている。   On the other hand, since humans cannot digest β-glucan such as cellulose, they cannot be used as an energy source, and β-glucan is used only as a dietary fiber component. Therefore, β-glucan cannot be used to solve the food crisis problem. However, the annual production of β-glucan is estimated to be about 20,000 times that of starch, and there is no worry of depletion. Therefore, various attempts have been made to convert β-glucan into a substance that humans can use as an energy source.

例えば、セルロースをグルコースまで分解し、エタノール醗酵に利用することが検討されている。グルコースは、セルロース以外にも、種々の糖類を変換することにより入手することができる。グルコースは安価で大量に入手可能な原料である。グルコースは人間によって代謝され得るが、甘すぎるため、エネルギー源として大量に摂取することができない。また、グルコースは極めて水溶性が高いため、水分を含む食品中では固形物としてのテクスチャー（食感）を持つことができない。   For example, it has been studied that cellulose is decomposed to glucose and used for ethanol fermentation. Glucose can be obtained by converting various sugars in addition to cellulose. Glucose is an inexpensive and available raw material. Although glucose can be metabolized by humans, it is too sweet to take in large quantities as an energy source. In addition, since glucose is extremely water-soluble, it cannot have a texture (texture) as a solid in a food containing moisture.

他方、α−グルコースの直鎖状ポリマーであるα−グルカン（例えば、デンプン）は、通常人間によって摂食されており、大量摂取することが可能である。それゆえ、グルコースを原料として、α−グルカンのようなテクスチャーを持ちかつ甘くない素材を合成することができれば、非常に有用である。   On the other hand, α-glucan (eg, starch), which is a linear polymer of α-glucose, is usually eaten by humans and can be consumed in large quantities. Therefore, it is very useful if a raw material having a texture like α-glucan and not sweet can be synthesized using glucose as a raw material.

さらに、上記のように、セルロースはバイオマス資源として豊富に存在し、枯渇の心配がない。そのため、セルロース資源を原料としたα−グルコースポリマーの合成技術が開発されれば食糧危機問題の解決に大きな貢献ができる。しかし、これまでにそのような技術は開示されていない。   Furthermore, as described above, cellulose is abundant as a biomass resource and there is no fear of depletion. Therefore, if an α-glucose polymer synthesis technique using cellulose resources as a raw material is developed, it can greatly contribute to solving the food crisis problem. However, no such technique has been disclosed so far.

本願発明で利用する種々の酵素反応の従来技術について以下に説明する。   Conventional techniques of various enzyme reactions used in the present invention will be described below.

図１の（１）に示すように、グルコースおよびポリリン酸にポリホスフェートグルコキナーゼ（ＰＧＫ）を作用させると、グルコース−６−リン酸（Ｇ６−Ｐ）が生成する。この反応は公知であり、例えば、非特許文献１および２に記載されている。   As shown in FIG. 1 (1), when polyphosphate glucokinase (PGK) is allowed to act on glucose and polyphosphate, glucose-6-phosphate (G6-P) is produced. This reaction is known and is described in, for example, Non-Patent Documents 1 and 2.

図１の（２）に示すように、グルコースまたはグルコース−１，６−ビスホスフェートをコファクターとし、Ｇ６−Ｐにホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）が作用することによりグルコース−１−リン酸（Ｇ１−Ｐ）が生成する。この反応は公知であるが、これは、植物体内におけるデンプン合成反応や動物の肝臓や筋肉細胞あるいは微生物におけるグリコーゲン合成反応の一部であり、進行するためにエネルギーを必要とし、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧ１−Ｐ合成方法としての先行技術はない。逆にＧ１−ＰにＰＧＭを作用させることによりＧ６−Ｐを生成する技術は多く存在する。ＰＧＭによる酵素反応は平衡反応であるが、Ｇ６−Ｐが非常に安定であるために、９９％以上がＧ６−Ｐとなる（非特許文献３を参照のこと）。すなわち、（２）の反応は、Ｇ６−Ｐ生成側に非常に大きく傾いている。このことを利用して、Ｇ１−Ｐ濃度をＧ６−Ｐ経由で測定する方法が確立されている（非特許文献４を参照のこと）。しかし、Ｇ６−ＰからＧ１−Ｐを生成することはｉｎ ｖｉｔｒｏでは行なわれていなかった。Ｇ６−Ｐから得られたＧ１−Ｐを基質としてアミロースを合成することはまったく考えられてこなかった。   As shown in FIG. 1 (2), glucose or glucose-1,6-bisphosphate is used as a cofactor, and phosphoglucomutase (PGM) acts on G6-P to cause glucose-1-phosphate (G1- P) is generated. This reaction is well known, but it is part of the starch synthesis reaction in plants and glycogen synthesis reaction in animal liver, muscle cells or microorganisms, requires energy to proceed, and in vitro G1- There is no prior art as a P synthesis method. Conversely, there are many techniques for producing G6-P by causing PGM to act on G1-P. The enzyme reaction by PGM is an equilibrium reaction, but G6-P is very stable, so 99% or more becomes G6-P (see Non-Patent Document 3). That is, the reaction (2) is very greatly inclined toward the G6-P production side. Utilizing this fact, a method for measuring the G1-P concentration via G6-P has been established (see Non-Patent Document 4). However, generation of G1-P from G6-P has not been performed in vitro. It has never been considered to synthesize amylose using G1-P obtained from G6-P as a substrate.

図１の（３）に示すように、Ｇ１−ＰとプライマーにＧＰを作用させることによりアミロースが生産される。この技術は公知であり、例えば、非特許文献５および特許文献１に記載されている。特許文献１に記載される反応の概略を以下に示す：   As shown in (3) of FIG. 1, amylose is produced by allowing GP to act on G1-P and the primer. This technique is publicly known, and is described in, for example, Non-Patent Document 5 and Patent Document 1. The outline of the reaction described in Patent Document 1 is shown below:

この反応において、他の酵素が存在しなければ、α−グルカンはアミロースとなり、ブランチングエンザイム（ＢＥ）、ディスプロポーショネーティングエンザイム（ＭａｌＱ）などの他の酵素が存在すると、α−グルカンは、デンプン、グリコーゲンなどとなる。

In this reaction, if no other enzyme is present, α-glucan becomes amylose, and if other enzymes such as branching enzyme (BE), disposing enzyme (MalQ) are present, α-glucan is converted into starch. And glycogen.

グルコースを出発原料とし、ＰＧＫとＰＧＭとＧＰという３種類の酵素を同時に作用させる１つの反応系で直接アミロースを生産する方法は知られていない。   There is no known method for directly producing amylose in one reaction system in which glucose is used as a starting material and three types of enzymes, PGK, PGM, and GP, act simultaneously.

セロビオースの利用に関しては、セロビオースを原料に、１つの反応系でα−グルカンを製造する技術が知られている（特許文献２）。特許文献２の方法では、セロビオースの一部をＧ１−Ｐとグルコースに変換し、得られたＧ１−Ｐにα−１，４−グルカンホスホリラーゼを作用させてα−グルカンに変換している。特許文献２の方法では、２つの平衡反応をカップリングさせるため、リン酸はリサイクルされて蓄積しないが、グルコースは反応に利用されないため、反応中に蓄積し続ける。それゆえ、特許文献２の方法では、平衡反応をα−グルカン合成側に向かわせる目的で、グルコースをフラクトースに変換するかもしくはグルコースを反応系から消去する方法をとっている。そのため、特許文献２の方法では、α−グルカンに変換されるグルコース源はＧ１−Ｐに由来するグルコース部分のみであり、セロビオースに対するα−グルカン収率は最大でも５０％以下であった。
国際特許公開第０２／０９７１０７号パンフレット 国際特許公開第２００５／０５６８１号パンフレット Ｓｉｍｏｎ Ｊ． Ｐｉｌｋｉｓ， Ｉｒｅｎｅ Ｔ． Ｗｅｂｅｒ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｗ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｇｒａｅｍｅ Ｉ． Ｂｅｌｌ （１９９４） Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｊ． ｂｏｉｌ． ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ２６９． Ｎｏ． ３５． ｐｐ． ２１９２５−２１９２８ Ｓｈｏｔａｒｏ Ｔａｎａｋａ， Ｓｕｎ−Ｏｇ Ｌｅｅ， Ｋａｚｕｈｉｒｏ Ｈａｍａｏｋａ， Ｊｕｎｉｃｈｉ Ｋａｔｏ， Ｎｏｂｏｒｕ Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ， Ｋａｚｕｎｏｒｉ Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｈｉｓａｏ Ｏｈｔａｋｅ， Ａｋｉｏ Ｋｕｒｏｄａ （２００３） Ｓｔｒｉｃｔｌｙ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ ｉｎ ａ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｒｕｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． Ｖｏｌ． １８５． Ｎｏ． １８． ｐｐ． ５６５４−５６５６ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｊ． Ｒａｙ， Ｊｒ．， ａｎｄ Ｇｅｒｔｒｕｄｅ Ａ． Ｒｏｓｃｅｌｌｉ （１９６４）Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ． Ｊ． ｂｏｉｌ． ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ． ２３９． Ｎｏ． １１． ｐｐ． ３９３５−３９４１ Ｇ． Ｍｉｃｈａｅｌ （１９７４） Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ２ｎｄ Ｅｎｇｌｉｓｈ ｅｄ． （Ｈ． Ｕ． Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ， ｅｄ） Ｖｏｌ． ４， ｐｐ．１８５−１９１， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｍｉｃｈｅａｌ Ｊ． Ｇｉｄｌｅｙ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｖ． Ｂｕｌｐｉｎ （１９８９） Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌａｓｅ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｎ ｐｈａｓｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２２， ｐｐ． ３４１−３４６ Regarding the use of cellobiose, a technique for producing α-glucan from cellobiose as a raw material in one reaction system is known (Patent Document 2). In the method of Patent Document 2, part of cellobiose is converted into G1-P and glucose, and α-1,4-glucan phosphorylase is allowed to act on the obtained G1-P to convert it into α-glucan. In the method of Patent Document 2, since two equilibrium reactions are coupled, phosphoric acid is recycled and does not accumulate, but glucose is not used for the reaction, and thus continues to accumulate during the reaction. Therefore, in the method of Patent Document 2, glucose is converted to fructose or glucose is eliminated from the reaction system for the purpose of directing the equilibrium reaction to the α-glucan synthesis side. Therefore, in the method of Patent Document 2, the glucose source converted into α-glucan is only the glucose portion derived from G1-P, and the yield of α-glucan based on cellobiose was 50% or less at the maximum.
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本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、グルコースからα−グルカンを製造する方法を提供することを目的とする。   The present invention is intended to solve the above problems, and an object thereof is to provide a method for producing α-glucan from glucose.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ポリホスフェートグルコキナーゼおよびポリリン酸を用いてグルコースをほぼ１００％、Ｇ６−Ｐに変換し、生成したＧ６−ＰをＧ１−Ｐに変換することにより、これまでアミロース合成の阻害剤となっていた副産物グルコースを除去するのではなく、積極的に利用できることを見出した。本発明によれば、グルコースを基質としてアミロース合成に利用することができ、セロビオースを理論的に１００％アミロースに変換できる。本発明者らは、この知見に基づいて本発明を完成させた。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors converted glucose to G6-P using polyphosphate glucokinase and polyphosphate, and converted the produced G6-P to G1. It has been found that by converting to -P, by-product glucose, which has been an inhibitor of amylose synthesis so far, is not removed but can be actively used. According to the present invention, glucose can be used as a substrate for amylose synthesis, and cellobiose can theoretically be converted to 100% amylose. The present inventors have completed the present invention based on this finding.

本発明により、グルコースおよびポリリン酸を基質とし、３種類の酵素（ポリホスフェートグルコキナーゼ、ホスホグルコムターゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼ）を１つの反応溶液中で作用させることを含む、アミロースを合成する方法が提供される。   According to the present invention, an amylose comprising reacting three kinds of enzymes (polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase and α-1,4-glucan phosphorylase) in one reaction solution using glucose and polyphosphate as substrates. A method of synthesis is provided.

グルコースを原料としてアミロースを合成する技術はこれまでにない。従来の方法でグルコースからアミロースを合成するためには、（１）グルコースとポリリン酸にＰＧＫを作用させてＧ６−Ｐを得て；（２）得られたＧ６−ＰにＰＧＭを作用させてＧ１−Ｐを生成し、そして（３）得られたＧ１−ＰにＧＰを作用させてアミロースを合成する。この３段階の方法の理論上のアミロース合成収率は、主に（２）および（３）の平衡反応の収率に基づく。（２）の反応（ＰＧＭによるＧ６−Ｐ⇔Ｇ１−Ｐ平衡反応）は、Ｇ６−Ｐ側に大きく偏っており、その比率はＧ６−Ｐ ： Ｇ１−Ｐ ＝９４．２ ： ５．８である。（３）の反応（ＧＰによるアミロース合成反応）では、アミロース ： Ｇ１−Ｐ＝７３：２７である。また、（１）の反応は不可逆反応であり、ポリリン酸濃度を調節することにより、ほぼ１００％のグルコースがＧ６−Ｐに変換され得る。以上のことから、計算すると（１）の反応と、（２）の反応と、（３）の反応とをそれぞれ別個の工程で行なった場合の理論上のアミロース収率は、グルコースに対して約４．２％と算出される。   There has never been a technique for synthesizing amylose using glucose as a raw material. In order to synthesize amylose from glucose by conventional methods, (1) PGK is allowed to act on glucose and polyphosphate to obtain G6-P; (2) PGM is allowed to act on the obtained G6-P to obtain G1 -P is produced, and (3) GP is allowed to act on the obtained G1-P to synthesize amylose. The theoretical amylose synthesis yield of this three-step process is mainly based on the yields of the equilibrium reactions of (2) and (3). The reaction (2) (G6-P⇔G1-P equilibrium reaction by PGM) is greatly biased toward the G6-P side, and the ratio is G6-P: G1-P = 94.2: 5.8. . In the reaction (3) (amylose synthesis reaction by GP), amylose: G1-P = 73: 27. Further, the reaction (1) is an irreversible reaction, and almost 100% of glucose can be converted to G6-P by adjusting the polyphosphate concentration. From the above, when calculated, the theoretical amylose yield when the reaction of (1), the reaction of (2), and the reaction of (3) are performed in separate steps is about Calculated as 4.2%.

グルコースからアミロースができないかまたは収率が非常に低い原因は２点考えられる。１点目は、反応溶液中の遊離リン酸濃度とＧ１−Ｐ濃度との比率の影響である。２点目は、このグルコースからのアミロース合成が平衡収支に逆らった反応であることである。本発明ではグルコースからアミロースを合成するために、溶液中のグルコースと遊離リン酸との濃度比を調節することと、物質のポテンシャルエネルギーに逆らいアミロースを獲得するためにアミロースの老化（沈澱）を利用することで問題解決を図った。   There are two possible reasons why amylose cannot be produced from glucose or the yield is very low. The first point is the influence of the ratio between the free phosphoric acid concentration and the G1-P concentration in the reaction solution. The second point is that amylose synthesis from glucose is a reaction against the equilibrium balance. In the present invention, in order to synthesize amylose from glucose, the concentration ratio of glucose and free phosphoric acid in the solution is adjusted, and aging (precipitation) of amylose is used to acquire amylose against the potential energy of the substance. To solve the problem.

まず１点目について、アミロースが得られない原因は、（３）の反応（ＧＰによるアミロース合成反応）がＧ１−Ｐと遊離のリン酸との濃度比に大きく影響されることによる。アミロース合成反応に対するＧ１−Ｐ／リン酸濃度比の影響を検討したところ、遊離リン酸の濃度がＧ１−Ｐ濃度の４倍以上のときアミロースが合成されないことがわかった。本発明の方法においては、一般に、最初の反応液にリン酸を意図的に添加しない。しかし、一般に、通常の方法で工業的に製造されるポリリン酸、あるいは一般に工業的に市販されているポリリン酸には、重合していないモノマーのリン酸、すなわち遊離のリン酸が不純物として少量含まれている。そのため、リン酸を意図的に添加しなくても、（１）の反応で用いるポリリン酸として、工業的に入手可能なポリリン酸を用いると、その中に少量の不純物として遊離のリン酸が含まれていることが多い。この、ポリリン酸溶液由来の遊離リン酸の濃度がグルコースからアミロースを合成するときの中間生成物として生じるＧ１−Ｐ濃度の４倍を超えるとアミロースが合成されない。そのため、ポリリン酸溶液由来の遊離リン酸が生成されるＧ１−Ｐ濃度の４倍濃度より小さくなるようにグルコース濃度およびポリリン酸濃度を調節することが好ましい。   First, regarding the first point, the reason why amylose cannot be obtained is that the reaction (3) (amylose synthesis reaction by GP) is greatly influenced by the concentration ratio between G1-P and free phosphoric acid. When the influence of the G1-P / phosphate concentration ratio on the amylose synthesis reaction was examined, it was found that amylose was not synthesized when the concentration of free phosphoric acid was 4 times or more the G1-P concentration. In the method of the present invention, generally, phosphoric acid is not intentionally added to the initial reaction solution. However, in general, polyphosphoric acid that is industrially produced by a normal method, or generally commercially available polyphosphoric acid, contains a small amount of unpolymerized monomer phosphoric acid, that is, free phosphoric acid as an impurity. It is. For this reason, even if phosphoric acid is not intentionally added, if polyphosphoric acid that is industrially available is used as the polyphosphoric acid used in the reaction (1), free phosphoric acid is contained as a small amount of impurities therein. It is often done. If the concentration of the free phosphoric acid derived from the polyphosphoric acid solution exceeds 4 times the G1-P concentration produced as an intermediate product when synthesizing amylose from glucose, amylose is not synthesized. Therefore, it is preferable to adjust the glucose concentration and the polyphosphoric acid concentration so that the free phosphoric acid derived from the polyphosphoric acid solution is smaller than four times the concentration of G1-P that is generated.

２点目の原因はＧ６−Ｐが非常に安定であることに起因する。（２）の平衡反応は上記したようにＧ６−Ｐ側に大きく偏り、平衡反応は「酵素ハンドブック」丸尾文治、田宮信雄監修 朝倉書店によるとＧ６−Ｐ生成側に大きくよることが記載されている。それに対して（３）の平衡反応ではアミロース合成側に偏っている。従って、（２）の反応と（３）の反応を１つの溶液中で同時に行うと、Ｇ１−ＰからＧ６−Ｐへの転移反応と、Ｇ１−Ｐからアミロースへの合成反応が競合すると考えられる。（２）の反応および（３）の反応は平衡反応であり、同時に反応させた場合、ひとつの平衡反応と見ることができる。このときの平衡収支は、Ｇ６−Ｐとアミロースのポテンシャルエネルギーに依存する。実験例２に示すように、Ｇ６−Ｐとアミロースではどちらが安定しているのかを検討するために、低濃度アミロースの溶解液にＰＧＭ、ＧＰおよびリン酸を加えて反応させた。その結果、図６に示すように、アミロースの９５％以上がＧ６−ＰとＧ１−Ｐに分解された。この結果より、溶液に溶けている状態のアミロースでは、ＰＧＭとＧＰとの平衡反応により、Ｇ６−Ｐへの変換方向に強くシフトされることが確認され、アミロースと比べてもＧ６−Ｐが安定であると考えられる。   The second cause is due to the fact that G6-P is very stable. As described above, the equilibrium reaction of (2) is largely biased toward the G6-P side, and according to the “Enzyme Handbook” by Bunji Maruo and Nobuo Tamiya, Asakura Shoten, it is described that it greatly depends on the G6-P production side. . In contrast, the equilibrium reaction (3) is biased toward the amylose synthesis side. Therefore, when the reaction (2) and the reaction (3) are simultaneously performed in one solution, it is considered that the transfer reaction from G1-P to G6-P and the synthesis reaction from G1-P to amylose compete. . The reaction (2) and the reaction (3) are equilibrium reactions, and can be regarded as one equilibrium reaction when reacted at the same time. The equilibrium balance at this time depends on the potential energy of G6-P and amylose. As shown in Experimental Example 2, PGM, GP, and phosphoric acid were added to a low-concentration amylose solution to cause a reaction between G6-P and amylose. As a result, as shown in FIG. 6, 95% or more of amylose was decomposed into G6-P and G1-P. From this result, it is confirmed that amylose dissolved in the solution is strongly shifted in the conversion direction to G6-P by the equilibrium reaction between PGM and GP, and G6-P is more stable than amylose. It is thought that.

しかし、本願発明の方法においては、４００ｍＭのグルコースを原料とし、ポリリン酸および酵素の濃度、ｐＨ等を適切に調整することにより、７％程度のアミロース合成収率を得ることができた。この値は、ＰＧＭ−ＧＰ平衡状態におけるアミロースの割合を超える。この原因はアミロースの老化現象に起因すると考える。老化しやすい条件として基質濃度を５００ｍＭに上げアミロース合成反応をおこなうとアミロース収率は１９．６％にまで上昇した。さらにアミロース合成反応の経時的な測定によって酵素反応が平衡に達した後、老化によるものと考えられるアミロースの増加を測定できた。よって、グルコースからアミロースを合成するためには、合成したアミロースを老化させることが非常に有用であると考えられる。   However, in the method of the present invention, it was possible to obtain an amylose synthesis yield of about 7% by using 400 mM glucose as a raw material and adjusting the concentrations and pH of polyphosphoric acid and enzyme appropriately. This value exceeds the proportion of amylose in the PGM-GP equilibrium. The cause is considered to be due to the aging phenomenon of amylose. When the amylose synthesis reaction was carried out by increasing the substrate concentration to 500 mM as a condition that facilitates aging, the amylose yield increased to 19.6%. Furthermore, after the enzyme reaction reached equilibrium by measuring the amylose synthesis reaction over time, the increase in amylose, which is thought to be due to aging, could be measured. Therefore, in order to synthesize amylose from glucose, it is considered very useful to age the synthesized amylose.

さらに、本願発明の方法を使用することにより、セロビオースから効率よくα−グルカンに変換することが可能となった。上記のように、従来の方法では、セロビオースの一部をＧ１−Ｐとグルコースに変換し、得られたＧ１−Ｐにα−１，４−グルカンホスホリラーゼを作用させることにより、α−グルカンを得ていた。従来の方法では、グルコースは蓄積し続けるので、平衡反応をα−グルカン合成側に向かわせる目的で、グルコースをフラクトースに変換するかもしくは反応系から消去する方法をとっている。そのため、α−グルカンに変換されるグルコース源はＧ１−Ｐに由来するグルコース部分のみであり、セロビオースに対するα−グルカン収率は最大でも５０％以下であった。   Furthermore, by using the method of the present invention, it has become possible to efficiently convert cellobiose into α-glucan. As described above, in the conventional method, α-glucan is obtained by converting a part of cellobiose into G1-P and glucose and allowing α-1,4-glucan phosphorylase to act on the obtained G1-P. It was. In the conventional method, since glucose continues to accumulate, a method of converting glucose to fructose or eliminating it from the reaction system is used for the purpose of directing the equilibrium reaction to the α-glucan synthesis side. Therefore, the glucose source converted into α-glucan was only the glucose portion derived from G1-P, and the α-glucan yield based on cellobiose was 50% or less at maximum.

我々は、ポリホスフェートグルコキナーゼとポリリン酸を用いてグルコースを１００％Ｇ６−Ｐに変換して、生成したＧ６−ＰをＧ１−Ｐに変換することで、これまでアミロース合成の阻害となっていた副産物グルコースを消去するのではなく、積極的に基質としてアミロース合成に利用する技術を検討し、理論的にセロビオースを１００％アミロースに変換できる技術を完成させた。   We have heretofore inhibited amylose synthesis by converting glucose to 100% G6-P using polyphosphate glucokinase and polyphosphate, and converting the produced G6-P to G1-P. Instead of eliminating the by-product glucose, we studied a technology that actively uses it as a substrate for amylose synthesis, and completed a technology that could theoretically convert cellobiose to 100% amylose.

上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）
グルコースと、ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のグルコース濃度は、１００ｍＭ〜２０００ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ５．７〜ｐＨ１２であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）が０．１５以下である、方法。 In order to achieve the above object, the present invention provides, for example, the following means:
(Item 1)
The method includes a step of producing α-glucan by reacting a solution containing glucose, polyphosphate, primer, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase. And
The glucose concentration in the solution at the start of the reaction is 100 mM to 2000 mM,
The pH of the solution at the start of the reaction is pH 5.7 to pH 12,
A method in which a ratio (Pi / Glc) between a molar concentration of free phosphoric acid and a molar concentration of glucose in the solution at the start of the reaction is 0.15 or less.

（項目２）
前記反応開始時の前記溶液中のグルコース濃度が２００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項１に記載の方法。 (Item 2)
The method according to claim 1, wherein the glucose concentration in the solution at the start of the reaction is 200 mM to 2000 mM.

（項目３）
前記反応開始時の前記溶液中のグルコース濃度が５００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項１に記載の方法。 (Item 3)
The method according to claim 1, wherein a glucose concentration in the solution at the start of the reaction is 500 mM to 2000 mM.

（項目４）
前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ７．４〜ｐＨ１１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 (Item 4)
The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the pH of the solution at the start of the reaction is pH 7.4 to pH 11.

（項目５）
前記α−グルカンがアミロースである、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。 (Item 5)
Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the α-glucan is amylose.

（項目６）
前記溶液が、ゲスト化合物を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。 (Item 6)
The solution contains a guest compound, and the guest compound is a compound that can be included in the produced α-glucan,
Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein an inclusion compound of α-glucan obtained in the production step and the guest compound is formed.

（項目７）
前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、項目６に記載の方法。 (Item 7)
The guest compound is N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate or 3- (N, N-dimethylpalmityl- 7. A method according to item 6, which is ammonio) propane sulfonate.

（項目８）
グルコース−６−リン酸と、プライマーと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のグルコース−６−リン酸濃度は、２０ｍＭ〜２０００ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ６．７〜ｐＨ１１であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコース−６−リン酸のモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）が０．４以下である、方法。 (Item 8)
A method comprising producing α-glucan by reacting a solution containing glucose-6-phosphate, a primer, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase,
The concentration of glucose-6-phosphate in the solution at the start of the reaction is 20 mM to 2000 mM,
The pH of the solution at the start of the reaction is pH 6.7 to pH 11,
A method in which the ratio (Pi / G6-P) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of glucose-6-phosphate in the solution at the start of the reaction is 0.4 or less.

（項目９）
前記反応開始時の前記溶液中のグルコース−６−リン酸濃度が１００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項８に記載の方法。 (Item 9)
The method according to claim 8, wherein the concentration of glucose-6-phosphate in the solution at the start of the reaction is 100 mM to 2000 mM.

（項目１０）
前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ７．３〜ｐＨ１１である、請求項８または９に記載の方法。 (Item 10)
The method according to claim 8 or 9, wherein the pH of the solution at the start of the reaction is pH 7.3 to pH 11.

（項目１１）
前記α−グルカンがアミロースである、項目８〜１０のいずれか１項に記載の方法。 (Item 11)
Item 11. The method according to any one of Items 8 to 10, wherein the α-glucan is amylose.

（項目１２）
前記溶液が、ゲスト物質を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、項目８〜１１のいずれか１項に記載の方法。 (Item 12)
The solution contains a guest substance, and the guest compound is a compound that can be included in the produced α-glucan,
Item 12. The method according to any one of Items 8 to 11, wherein an inclusion compound of α-glucan obtained in the production step and the guest compound is formed.

（項目１３）
前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、項目１２に記載の方法。 (Item 13)
The guest compound is N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate or 3- (N, N-dimethylpalmityl- 13. A method according to item 12, which is ammonio) propane sulfonate.

（項目１４）
セロビオースと、ポリリン酸と、プライマーと、セロビオースホスホリラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のセロビオース濃度は、１００ｍＭ〜３５０ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ１１であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）が２．０以下である、方法。 (Item 14)
Includes the step of producing α-glucan by reacting a solution containing cellobiose, polyphosphate, primer, cellobiose phosphorylase, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase A way to
The cellobiose concentration in the solution at the start of the reaction is 100 mM to 350 mM,
The pH of the solution at the start of the reaction is pH 5 to pH 11,
A method in which the ratio (Pi / CB) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of cellobiose in the solution at the start of the reaction is 2.0 or less.

（項目１５）
前記反応開始時の前記溶液中のセロビオース濃度が１２０ｍＭ〜３５０ｍＭである、請求項１４に記載の方法。 (Item 15)
The method according to claim 14, wherein the cellobiose concentration in the solution at the start of the reaction is 120 mM to 350 mM.

（項目１６）
前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ５．６〜ｐＨ１１である、請求項１４または１５に記載の方法。 (Item 16)
The method according to claim 14 or 15, wherein the pH of the solution at the start of the reaction is pH 5.6 to pH 11.

（項目１７）
前記α−グルカンが、アミロースである、項目１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。 (Item 17)
Item 17. The method according to any one of Items 14 to 16, wherein the α-glucan is amylose.

（項目１８）
前記溶液が、ゲスト物質を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、項目１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。 (Item 18)
The solution contains a guest substance, and the guest compound is a compound that can be included in the produced α-glucan,
Item 18. The method according to any one of Items 14 to 17, wherein an inclusion compound of α-glucan obtained in the production step and the guest compound is formed.

（項目１９）
前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、項目１８に記載の方法。 (Item 19)
The guest compound is N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate or 3- (N, N-dimethylpalmityl- Item 19. The method according to Item 18, which is ammonio) propane sulfonate.

本願発明の方法により、大量摂取が不可能なグルコースを、大量摂取可能な食品へと変換できる。また、本発明は、食糧危機問題の解決にも大きく貢献する。   By the method of the present invention, glucose that cannot be consumed in large quantities can be converted into a food that can be consumed in large quantities. The present invention also greatly contributes to solving the food crisis problem.

特定の実施形態では、本願発明の方法により、非消化性のセルロースを、可食性の食品へと変換できる。また、本発明は、食糧危機問題およびゴミ問題の解決にも大きく貢献する。   In certain embodiments, the method of the present invention can convert non-digestible cellulose into edible food. The present invention also greatly contributes to solving the food crisis problem and the garbage problem.

グルコースとアミロースとでエネルギー状態を比較すると、アミロースの方がエネルギー準位が高い。そのため、グルコースからアミロースを合成するのは、エネルギー論的に困難である。   When energy states are compared between glucose and amylose, amylose has a higher energy level. Therefore, it is energetically difficult to synthesize amylose from glucose.

図１の（１）、（２）、（３）の反応を個別に反応させた場合、（１）の収率はほぼ１００％であり、（２）の収率は約７％であり、（３）の収率は約７０％である。そのため、グルコースからのアミロースの理論収率は、約５％である（１００×０．０５８×（０．７３）＝４．２（％））である。それに対して、（１）〜（３）の反応を１つの溶液中で同時に反応させた場合、（ａ）溶液のｐＨを調整することおよび（ｂ）溶液中の基質の濃度を高くすること、によって、高いアミロース収率を上げることができる。   When the reactions (1), (2), and (3) in FIG. 1 are individually reacted, the yield of (1) is almost 100%, the yield of (2) is about 7%, The yield of (3) is about 70%. Therefore, the theoretical yield of amylose from glucose is about 5% (100 × 0.058 × (0.73) = 4.2 (%)). On the other hand, when the reactions of (1) to (3) are simultaneously reacted in one solution, (a) adjusting the pH of the solution and (b) increasing the concentration of the substrate in the solution, Can increase the yield of amylose.

詳細には、反応溶液の初期ｐＨ（反応開始時の溶液のｐＨ）を好ましくはｐＨ７．４〜ｐＨ１１に、さらに好ましくはｐＨ７．４〜８．５にする。反応で使用する各酵素の代表的な至適ｐＨは、ＰＧＫが約ｐＨ７．０であり、ＰＧＭが約ｐＨ７．５であり、そしてＧＰが約ｐＨ５．６である。初期ｐＨが低すぎるとアミロース合成収率が低くなるかまたはアミロースが合成されない。反応溶液の初期ｐＨをｐＨ７．５からｐＨ１１に調整することにより、約１５％以上のアミロース収率を得られる。   Specifically, the initial pH of the reaction solution (pH of the solution at the start of the reaction) is preferably adjusted to pH 7.4 to pH 11, more preferably pH 7.4 to 8.5. A typical optimum pH for each enzyme used in the reaction is about pH 7.0 for PGK, about pH 7.5 for PGM, and about pH 5.6 for GP. If the initial pH is too low, the amylose synthesis yield will be low or amylose will not be synthesized. By adjusting the initial pH of the reaction solution from pH 7.5 to pH 11, an amylose yield of about 15% or more can be obtained.

さらに、基質濃度を高くすることにより、アミロースが老化して沈澱し、反応系から外れやすくなる。アミロースが沈澱すると反応系内のアミロース濃度が低下し、その結果、ＧＰによるアミロース合成が促進される。それに伴い、ＰＧＭ平衡反応によってＧ１−Ｐが生成される。合成アミロースを効率よく老化させることにより、Ｇ１−Ｐが連続的に供給され、アミロース収率を約２０％程度まで向上させることができる。これは、３つの反応を個別に反応させた場合の理論上のアミロース収率の約５倍であり、極めて顕著な効果である。   Furthermore, when the substrate concentration is increased, amylose is aged and precipitates, and is easily removed from the reaction system. When amylose precipitates, the amylose concentration in the reaction system decreases, and as a result, amylose synthesis by GP is promoted. Accordingly, G1-P is generated by the PGM equilibrium reaction. By efficiently aging synthetic amylose, G1-P is continuously supplied, and the amylose yield can be improved to about 20%. This is about 5 times the theoretical amylose yield when the three reactions are reacted individually, which is a very remarkable effect.

さらに、ゲスト物質の存在下で合成反応を行なうことにより、アミロースの沈澱形成が促進される。特定のゲスト物質の存在下では、アミロース収率を約３５％まで向上させることができた。   Furthermore, by performing the synthesis reaction in the presence of a guest substance, the formation of amylose precipitates is promoted. In the presence of certain guest materials, the amylose yield could be increased to about 35%.

特許文献２に記載される方法では、セロビオースにセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を作用させると、目的の生成物Ｇ１−Ｐの他に同量の副生成物グルコース（Ｇｌｃ）が生成される。そのため、特許文献２に記載の方法では、アミロースの収率の理論的上限は、５０％であった。実際にはＣＢＰの平衡反応がセロビオース合成側に有利であるため、アミロースの収率は１６％程度であり、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼをグルコースに作用させて副生成物のＧｌｃを除去することでアミロースの最大収率は３２．４％まであがった。   In the method described in Patent Document 2, when cellobiose phosphorylase (CBP) is allowed to act on cellobiose, the same amount of byproduct glucose (Glc) is produced in addition to the target product G1-P. Therefore, in the method described in Patent Document 2, the theoretical upper limit of the yield of amylose was 50%. Actually, since the equilibrium reaction of CBP is advantageous to the cellobiose synthesis side, the yield of amylose is about 16%. By allowing mutarotase, glucose oxidase and peroxidase to act on glucose, the by-product Glc is removed. The maximum yield of amylose was up to 32.4%.

それに対して、本願発明において、セロビオースからのアミロースの合成反応と（１）および（２）の反応を組み合わせた場合、グルコースをアミロース合成に利用することが可能となり、その結果、アミロース収率の理論的上限を１００％にすることができる。本明細書中に記載した実施例においては、反応溶液の初期ｐＨを調整することにより、実際に最大６６．８％のアミロース収率を得ることができた。   On the other hand, in the present invention, when the synthesis reaction of amylose from cellobiose and the reactions (1) and (2) are combined, glucose can be used for amylose synthesis. As a result, the theory of amylose yield The target upper limit can be 100%. In the examples described herein, it was possible to actually obtain an amylose yield of up to 66.8% by adjusting the initial pH of the reaction solution.

以下、本発明を詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。   Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified.

本明細書中では「α−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、α−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。α−グルカンは、直鎖状、分岐状または環状の分子であり得る。直鎖状α−グルカンとα−１，４−グルカンとは同義語である。直鎖状α−グルカンでは、α−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。α−１，６−グルコシド結合を１つ以上含むα−グルカンは、分岐状α−グルカンである。α−グルカンは、好ましくは、直鎖状の部分をある程度含む。分岐のない直鎖状α−グルカンがより好ましい。本発明で製造されるα−グルカンは、好ましくは、アミロース、環状構造を有するグルカンまたは分岐構造を有するグルカンであり、より好ましくはアミロースである。１分子のα−グルカンに含まれる糖単位の数を、このα−グルカンの重合度という。   In the present specification, “α-glucan” refers to a saccharide having D-glucose as a constituent unit and having at least two saccharide units linked by α-1,4-glucoside bonds. . The α-glucan can be a linear, branched or cyclic molecule. Linear α-glucan and α-1,4-glucan are synonymous. In a linear α-glucan, sugar units are linked only by α-1,4-glucoside bonds. An α-glucan containing one or more α-1,6-glucoside bonds is a branched α-glucan. The α-glucan preferably contains a linear portion to some extent. Non-branched linear α-glucan is more preferable. The α-glucan produced in the present invention is preferably amylose, glucan having a cyclic structure or glucan having a branched structure, and more preferably amylose. The number of sugar units contained in one molecule of α-glucan is called the degree of polymerization of this α-glucan.

α−グルカンは、場合によっては、分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）が少ないことが好ましい。このような場合、分岐の数は、代表的には０〜１００００個、好ましくは０〜１０００個、より好ましくは０〜５００個、さらに好ましくは０〜１００個、さらに好ましくは０〜５０個、さらに好ましくは０〜２５個、さらに好ましくは０個である。   In some cases, the α-glucan preferably has a small number of branches (that is, the number of α-1,6-glucoside bonds). In such a case, the number of branches is typically 0 to 10,000, preferably 0 to 1000, more preferably 0 to 500, still more preferably 0 to 100, still more preferably 0 to 50, More preferably, it is 0-25, and more preferably 0.

本発明の方法によって製造される分岐状α−グルカンでは、α−１，６−グルコシド結合を１としたときのα−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比は、好ましくは１〜１００００であり、より好ましくは１０〜５０００であり、さらに好ましくは５０〜１０００であり、さらに好ましくは１００〜５００である。   In the branched α-glucan produced by the method of the present invention, the number of α-1,4-glucoside bonds relative to the number of α-1,6-glucoside bonds when α-1,6-glucoside bond is 1. The ratio is preferably 1 to 10000, more preferably 10 to 5000, still more preferably 50 to 1000, and still more preferably 100 to 500.

α−１，６−グルコシド結合は、α−グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。α−グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。   The α-1,6-glucoside bond may be randomly distributed in the α-glucan or may be uniformly distributed. It is preferable that the distribution be such that 5 or more linear moieties are formed in the α-glucan in terms of sugar units.

α−グルカンは、Ｄ−グルコースのみから構成されていてもよいし、α−グルカンの性質を損なわない程度に修飾された誘導体であってもよい。修飾されていないことが好ましい。α−グルカンの性質を損なわない程度の修飾としては、エステル化、エーテル化、架橋などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの修飾は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る。   The α-glucan may be composed only of D-glucose, or may be a derivative modified to such an extent that the properties of α-glucan are not impaired. Preferably it is not modified. Examples of modifications that do not impair the properties of α-glucan include, but are not limited to, esterification, etherification, and crosslinking. These modifications can be performed according to methods known in the art.

α−グルカンは、代表的には約１×１０^３以上、好ましくは約５×１０^３以上、より好ましくは約１×１０^４以上、さらに好ましくは約５×１０^４以上、さらに好ましくは約１×１０^５以上の分子量を有する。α−グルカンは、代表的には約１×１０^６以下、好ましくは約５×１０^５以下、さらに好ましくは約１×１０^５以下の分子量を有する。 α- glucan, typically about 1 × 10 ³ or more, preferably about at least 5 × 10 ^3, more preferably about 1 × 10 ⁴ or more, more preferably about 5 × 10 ⁴ or more, more preferably about 1 It has a molecular weight of × 10 ⁵ or more. The α-glucan typically has a molecular weight of about 1 × 10 ⁶ or less, preferably about 5 × 10 ⁵ or less, more preferably about 1 × 10 ⁵ or less.

当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質（例えば、プライマー、グルコース、グルコース−６−リン酸、セロビオースなど）の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量のα−グルカンが得られることを容易に理解する。   Those skilled in the art can appropriately adjust the amount of a substrate (for example, primer, glucose, glucose-6-phosphate, cellobiose, etc.), amount of enzyme, reaction time, etc. used in the production method of the present invention. It is easily understood that α-glucan is obtained.

＜α−グルカンの製造に用いる材料＞
一つの実施形態では、本発明の製造方法では、例えば、グルコースと、ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を用いる。 <Material used for production of α-glucan>
In one embodiment, in the production method of the present invention, for example, a solution containing glucose, polyphosphate, primer, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase is used. .

別の実施形態では、本発明の製造方法では、例えば、グルコース−６−リン酸と、プライマーと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を用いる。   In another embodiment, in the production method of the present invention, for example, a solution containing glucose-6-phosphate, a primer, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase is used.

さらに別の実施形態では、本発明の製造方法では、例えば、セロビオースと、ポリリン酸と、プライマーと、セロビオースホスホリラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を用いる。   In still another embodiment, the production method of the present invention comprises, for example, cellobiose, polyphosphate, primer, cellobiose phosphorylase, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase. Use the containing solution.

これらの方法で用いる溶液の調製においては、例えば、これらの各物質と、緩衝剤および溶媒を主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加して添加してもよい。   In the preparation of the solution used in these methods, for example, each of these substances, a buffering agent, and a solvent are used as main materials. All of these materials are usually added at the start of the reaction, but any of these materials may be added during the reaction.

本発明の製造方法では、溶液中にゲスト化合物をさらに含み得る。   In the production method of the present invention, the guest compound may further be included in the solution.

本発明の製造方法では、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を用いることができる。枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素は、目的とするα−グルカンの構造に応じて、本発明の製造方法の最初から溶液中に添加してもよく、途中から溶液中に添加してもよい。   In the production method of the present invention, an enzyme selected from the group consisting of a debranching enzyme, a branching enzyme, 4-α-glucanotransferase, and a glycogen debranching enzyme can be used as necessary. The enzyme selected from the group consisting of debranching enzyme, branching enzyme, 4-α-glucanotransferase and glycogen debranching enzyme is selected from the beginning of the production method of the present invention, depending on the structure of the target α-glucan. You may add in a solution and may add in a solution from the middle.

（１．グルコース）
グルコースは、Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６で示される、分子量約１８０の単糖である。グルコースは、代表的なアルドヘキソースであり、天然に広く分布する単糖である。グルコースは、甘い果実および他の植物組織中に遊離型で多量に存在する。グルコースは、スクロース、マルトース、ラクトースなどのオリゴ糖；澱粉、セルロース、デキストラン、ラミナリン、グリコーゲンなどの多糖；種々の配糖体などの構成成分として多量に存在する。これらの物質を酸で加水分解するとＤ−グルコースを生じる。本発明で使用するグルコースは、純粋なものであってもよく、ある程度不純なものであってもよい。グルコースは、グルコースを構成成分とする種々の物質を分解することによって入手されたものであってもよい。例えば、セルロースは、グルコースがβ結合で連結したものであり、セルラーゼによって加水分解することにより、グルコースが生成される。例えば、デンプンをアミラーゼなどの酵素によって加水分解することにより、グルコースが生成される。さらに、フラクトースをグルコースイソメラーゼによって変換することにより、グルコースが生成される。本発明で使用されるグルコースは、特定の実施形態では、グルコースとして溶液に添加されることが好ましい。別の実施形態では、分解または変換されることによってグルコースを生じる物質を反応溶液中に添加することによって、グルコースが提供されてもよい。 (1. Glucose)
Glucose is a monosaccharide having a molecular weight of about 180, represented by C ₆ H ₁₂ O ₆ . Glucose is a typical aldohexose and is a monosaccharide widely distributed in nature. Glucose is present in large quantities in free form in sweet fruits and other plant tissues. Glucose is present in a large amount as a constituent component of oligosaccharides such as sucrose, maltose and lactose; polysaccharides such as starch, cellulose, dextran, laminarin and glycogen; and various glycosides. Hydrolysis of these materials with acids yields D-glucose. The glucose used in the present invention may be pure or impure to some extent. The glucose may be obtained by decomposing various substances containing glucose as a component. For example, cellulose is one in which glucose is linked by β bonds, and glucose is generated by hydrolysis with cellulase. For example, glucose is produced by hydrolyzing starch with an enzyme such as amylase. Furthermore, glucose is produced by converting fructose with glucose isomerase. In certain embodiments, the glucose used in the present invention is preferably added to the solution as glucose. In another embodiment, glucose may be provided by adding to the reaction solution a substance that yields glucose by being decomposed or converted.

（２．ポリリン酸）
本明細書において使用される場合、用語「ポリリン酸（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」とは、ポリリン酸（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）およびその塩をいう。酸である狭義のポリリン酸は、オルトリン酸の脱水縮合によって生じる直鎖状高分子リン酸である。狭義のポリリン酸は、一般式Ｈ_ｎ＋２Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１（ｎ＝２以上の整数）によって示される。塩であるポリリン酸（すなわち、ポリリン酸塩）は、一般式Ｍ^Ｉ _ｎ＋２Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１（ｎ＝２以上の整数）によって示される。本明細書において、特に断りの無い限り、「ポリリン酸」は、広義のポリリン酸、すなわち狭義のポリリン酸およびその塩を示す。狭義のポリリン酸の例としては、二リン酸、三リン酸、四リン酸、五リン酸などが挙げられる。狭義のポリリン酸は、例えば、（１）リン酸を加熱する方法、または（２）リン酸に五酸化二リンを添加する方法によって製造され得る。一般に、それぞれのポリリン酸を純品として製造することは困難であるので、種々の重合度のポリリン酸の混合物が市販されている。ポリリン酸の水溶液は容易に加水分解して低分子量のポリリン酸を経て、最終的にはオルトリン酸になる。本発明で使用されるポリリン酸の重合度は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上である。本発明で使用されるポリリン酸の重合度は、好ましくは２０以下であり、より好ましくは１２以下である。 (2. Polyphosphoric acid)
As used herein, the term “polyphosphate” refers to polyphosphoric acid and salts thereof. The narrowly defined polyphosphoric acid, which is an acid, is a linear polymeric phosphoric acid produced by dehydration condensation of orthophosphoric acid. Polyphosphoric acid in the narrow sense is represented by the general formula _{H n + 2 P n O 3n} + 1 (n = 2 or more integer). The salt, polyphosphoric acid (ie, polyphosphate), is represented by the general formula M ^I _{n + 2} P _n O _{3n + 1} (n = 2 or greater integer). In the present specification, unless otherwise specified, “polyphosphoric acid” refers to polyphosphoric acid in a broad sense, that is, polyphosphoric acid in a narrow sense and salts thereof. Examples of the narrowly defined polyphosphoric acid include diphosphoric acid, triphosphoric acid, tetraphosphoric acid, and pentaphosphoric acid. The narrowly defined polyphosphoric acid can be produced, for example, by (1) a method of heating phosphoric acid or (2) a method of adding diphosphorus pentoxide to phosphoric acid. In general, since it is difficult to produce each polyphosphoric acid as a pure product, mixtures of polyphosphoric acids having various degrees of polymerization are commercially available. The aqueous solution of polyphosphoric acid is easily hydrolyzed, passes through low molecular weight polyphosphoric acid, and finally becomes orthophosphoric acid. The degree of polymerization of the polyphosphoric acid used in the present invention is preferably 2 or more, more preferably 5 or more. The degree of polymerization of the polyphosphoric acid used in the present invention is preferably 20 or less, more preferably 12 or less.

ポリリン酸もまた、陽イオンを含む水溶液中で使用される。この場合、酸であるポリリン酸と塩であるポリリン酸とポリリン酸のイオンとが水溶液中で共存するので、酸であるポリリン酸と塩であるポリリン酸とは区別をしにくい。そのため、塩であるポリリン酸は、ポリリン酸と同様に使用され得る。本発明において、ポリリン酸塩は、好ましくはポリリン酸の任意の塩であり、より好ましくはポリリン酸の金属塩である。ポリリン酸塩の好ましい具体例としては、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ポリリン酸アンモニウム、ポリリン酸カルシウム、ポリリン酸第２鉄などが挙げられる。市販のポリリン酸ナトリウムは、一般に、トリポリリン酸ナトリウムを主成分とし、少量のピロリン酸塩、トリメタリン酸塩および非結晶性の高重合リン酸塩が混在する。市販のポリリン酸カリウムは、一般に、トリポリリン酸カリウム（Ｋ_５Ｐ_３Ｏ_１０）を主成分とする。 Polyphosphoric acid is also used in aqueous solutions containing cations. In this case, since the polyphosphoric acid that is an acid, the polyphosphoric acid that is a salt, and the ions of the polyphosphoric acid coexist in an aqueous solution, it is difficult to distinguish between the polyphosphoric acid that is an acid and the polyphosphoric acid that is a salt. Therefore, polyphosphoric acid that is a salt can be used in the same manner as polyphosphoric acid. In the present invention, the polyphosphate is preferably an arbitrary salt of polyphosphoric acid, more preferably a metal salt of polyphosphoric acid. Preferable specific examples of the polyphosphate include sodium polyphosphate, potassium polyphosphate, ammonium polyphosphate, calcium polyphosphate, ferric polyphosphate, and the like. Commercially available sodium polyphosphate generally contains sodium tripolyphosphate as a main component, and a small amount of pyrophosphate, trimetaphosphate, and non-crystalline highly polymerized phosphate are mixed. Commercially available potassium polyphosphate generally contains potassium tripolyphosphate (K ₅ P ₃ O ₁₀ ) as a main component.

ポリリン酸塩は、ポリリン酸ナトリウム単独で、ポリリン酸カリウム単独で、またはポリリン酸ナトリウムとポリリン酸カリウムとの混合物として用いられてもよい。   The polyphosphate may be used with sodium polyphosphate alone, potassium polyphosphate alone, or as a mixture of sodium polyphosphate and potassium polyphosphate.

（３．プライマー）
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」とは、α−１，４−グルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を１個以上有する分子をいう。プライマーは、α−グルカンの合成においてグリコシド残基を付加するための出発物質として作用する。なお、本明細書中では、グリコシド残基とグルコース残基とは交換可能に使用され得る。プライマーは、Ｇ１−Ｐのグリコシド残基のアクセプターとして作用する分子ともいうことができる。プライマーは、α−１，４−グルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を１個以上有すれば、他の部分は糖以外の部分によって形成されていてもよい。本発明の方法では、反応開始時に含まれるプライマーに対して１つのグリコシド残基がα−１，４結合で転移することによって、このプライマーよりも重合度が１大きいα−グルカンが形成される。形成されたこのα−グルカンは、同じ溶液中で再度アクセプターとして作用することができる。このようにして、本発明の方法では、プライマーに対してグリコシド残基がα−１，４−グルコシド結合で順次結合されて、任意の重合度のα−グルカンが合成される。プライマーとしては、α−１，４−グルカンホスホリラーゼによって糖単位が付加され得る任意の糖が挙げられる。 (3. Primer)
As used herein, the term “primer” refers to a molecule having one or more free moieties to which a saccharide unit can be bound by an α-1,4-glucoside bond. The primer acts as a starting material for adding glycoside residues in the synthesis of α-glucan. In the present specification, a glycoside residue and a glucose residue can be used interchangeably. A primer can also be referred to as a molecule that acts as an acceptor for a glycoside residue of G1-P. As long as the primer has at least one free part to which a saccharide unit can be bound by an α-1,4-glucoside bond, the other part may be formed by a part other than sugar. In the method of the present invention, an α-glucan having a degree of polymerization 1 larger than that of this primer is formed by transferring one glycoside residue with an α-1,4 bond to the primer contained at the start of the reaction. This formed α-glucan can again act as an acceptor in the same solution. Thus, in the method of the present invention, glycoside residues are sequentially bonded to the primer by α-1,4-glucoside bonds, and α-glucan having an arbitrary degree of polymerization is synthesized. The primer includes any saccharide to which a saccharide unit can be added by α-1,4-glucan phosphorylase.

プライマーは、本発明の反応の出発物質として作用し得ればよく、例えば、本発明の方法によって合成されたα−グルカンをプライマーとして用いて、本発明の方法によってα−１，４−グルコシド鎖を再度伸長することも可能である。   The primer only needs to be able to act as a starting material for the reaction of the present invention. For example, α-glucan synthesized by the method of the present invention is used as a primer, and α-1,4-glucoside chain is synthesized by the method of the present invention. It is also possible to extend again.

ただし、後述するゲスト化合物を用いる場合には、そのゲスト化合物を包接しない化合物をプライマーとして用いることが好ましい。   However, when using the guest compound mentioned later, it is preferable to use the compound which does not include the guest compound as a primer.

プライマーは、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンであっても、α−１，６−グルコシド結合を部分的に有してもよい。当業者は、所望のグルカンに応じて、適切なプライマーを容易に選択し得る。直鎖状のアミロースを合成する場合には、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンをプライマーとして用いれば、枝切り酵素などを用いずに直鎖状アミロースを合成できるので好ましい。   The primer may be an α-1,4-glucan containing only an α-1,4-glucoside bond or may partially have an α-1,6-glucoside bond. One skilled in the art can readily select appropriate primers depending on the desired glucan. When synthesizing linear amylose, if α-1,4-glucan containing only α-1,4-glucoside bond is used as a primer, linear amylose is synthesized without using a debranching enzyme or the like. It is preferable because it is possible.

プライマーの例としては、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉およびこれらの誘導体が挙げられる。   Examples of the primer include maltooligosaccharide, amylose, amylopectin, glycogen, dextrin, pullulan, coupling sugar, starch and derivatives thereof.

マルトオリゴ糖は、本明細書中では、約２個〜約１０個のグルコースが脱水縮合して生じた物質であって、α−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖は、好ましくは約３個〜約１０個の糖単位、より好ましくは約４個〜約１０個の糖単位、さらに好ましくは約５個〜約１０個の糖単位を有する。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。１つの実施形態では、マルトオリゴ糖は、好ましくはマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースであり、より好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースであり、さらに好ましくはマルトテトラオースである。マルトオリゴ糖は、単品であってもよいし、複数のマルトオリゴ糖の混合物であってもよい。コストが低いため、マルトオリゴ糖の混合物が好ましい。１つの実施態様では、マルトオリゴ糖の混合物は、重合度４以上のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有する。オリゴ糖は、直鎖状のオリゴ糖であってもよいし、分枝状のオリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、その分子内に、環状部分を有し得る。本発明では、直鎖状のオリゴ糖が好ましい。   As used herein, maltooligosaccharide refers to a substance formed by dehydration condensation of about 2 to about 10 glucoses and linked by α-1,4 bonds. The maltooligosaccharide preferably has about 3 to about 10 saccharide units, more preferably about 4 to about 10 saccharide units, and even more preferably about 5 to about 10 saccharide units. Examples of malto-oligosaccharides include malto-oligosaccharides such as maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose, maltooctaose, maltononaose, maltodekaose. In one embodiment, the maltooligosaccharide is preferably maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose or maltoheptaose, more preferably maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose or malto. Heptaose, more preferably maltotetraose. The maltooligosaccharide may be a single product or a mixture of a plurality of maltooligosaccharides. Due to its low cost, a mixture of maltooligosaccharides is preferred. In one embodiment, the mixture of maltooligosaccharides contains at least one of maltotriose, maltose and glucose in addition to maltooligosaccharides having a degree of polymerization of 4 or higher. The oligosaccharide may be a linear oligosaccharide or a branched oligosaccharide. An oligosaccharide can have a cyclic moiety in its molecule. In the present invention, a linear oligosaccharide is preferred.

アミロースとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子である。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。   Amylose is a linear molecule composed of glucose units linked by α-1,4 bonds. Amylose is contained in natural starch.

アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α１，６結合でグルコース単位が連結された、分枝状分子である。アミロペクチンは天然の澱粉中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。例えば、重合度が約１×１０^５程度以上のアミロペクチンが原料として用いられ得る。 Amylopectin is a branched molecule in which glucose units are linked by α-1,6 bonds to glucose units linked by α-1,4 bonds. Amylopectin is contained in natural starch. As amylopectin, for example, waxy corn starch made of 100% amylopectin can be used. For example, amylopectin having a degree of polymerization of about 1 × 10 ⁵ or more can be used as a raw material.

グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動植物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシの種子などに存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。また、α−１，６−結合で結合している分枝にも同様にグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。   Glycogen is a kind of glucan composed of glucose and is a glucan having a high frequency of branching. Glycogen is widely distributed in almost any cell as a storage polysaccharide for animals and plants. Glycogen is present in plants, for example, in corn seeds. Glycogen is typically a glucose chain having an average degree of polymerization of 12 to 18 at a ratio of about 1 every 3 glucose units to the α-1,4-linked sugar chain of glucose. 4-linked sugar chains are linked by α-1,6-linkages. Similarly, the α-1,6-linked sugar chains of the glucose are linked to the branches that are linked by α-1,6-linkages. Therefore, glycogen forms a network structure.

グリコーゲンの分子量は代表的には約１×１０^５〜約１×１０^８であり、好ましくは約１×１０^６〜約１×１０^７である。 The molecular weight of glycogen is typically about 1 × 10 ⁵ ~ about 1 × 10 ^8, preferably about 1 × 10 ⁶ ~ about 1 × 10 ^7.

プルランは、マルトトリオースが規則正しく、階段状にα−１，６−結合した、分子量約１０万〜約３０万（例えば、約２０万）のグルカンである。プルランは、例えば、澱粉を原料として黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓを培養することにより製造される。プルランは、例えば、林原商事から入手され得る。   Pullulan is a glucan having a molecular weight of about 100,000 to about 300,000 (for example, about 200,000) in which maltotriose is regularly and α-1,6-bonded in a stepwise manner. Pullulan is produced, for example, by culturing black yeast Aureobasidium pullulans using starch as a raw material. Pullulan can be obtained from Hayashibara Corporation, for example.

カップリングシュガーは、ショ糖、グルコシルスクロース、マルトシルスクロースを主成分とする混合物である。カップリングシュガーは、例えば、ショ糖と澱粉との混合溶液にＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなどが産生するサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることにより製造される。カップリングシュガーは、例えば、林原商事から入手され得る。   Coupling sugar is a mixture mainly composed of sucrose, glucosyl sucrose, and maltosyl sucrose. The coupling sugar is produced, for example, by allowing a cyclodextrin glucanotransferase produced by Bacillus megaterium or the like to act on a mixed solution of sucrose and starch. Coupling sugar can be obtained from Hayashibara Corporation, for example.

澱粉は、アミロースとアミロペクチンとの混合物である。澱粉としては、通常市販されている澱粉であればどのような澱粉でも用いられ得る。澱粉に含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。   Starch is a mixture of amylose and amylopectin. As the starch, any starch that is commercially available can be used. The ratio of amylose and amylopectin contained in starch varies depending on the type of plant producing starch. Most of the starches such as glutinous rice and glutinous corn are amylopectin. On the other hand, starch consisting only of amylose and not containing amylopectin cannot be obtained from ordinary plants.

澱粉は、天然の澱粉、澱粉分解物および化工澱粉に区分される。   Starch is classified into natural starch, starch degradation products, and modified starch.

天然の澱粉は、原料により、いも類澱粉および穀類澱粉に分けられる。いも類澱粉の例としては、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、およびわらび澱粉などが挙げられる。穀類澱粉の例としては、コーンスターチ、小麦澱粉、および米澱粉などが挙げられる。天然の澱粉の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースの含量を５０％〜７０％まで高めたハイアミロース澱粉（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）である。天然の澱粉の別の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースを含まないワキシー澱粉である。   Natural starch is divided into potato starch and cereal starch depending on the raw material. Examples of potato starch include potato starch, tapioca starch, sweet potato starch, waste starch, and warabi starch. Examples of cereal starches include corn starch, wheat starch, and rice starch. An example of a natural starch is high amylose starch (eg, high amylose corn starch) that has increased the amylose content to 50% to 70% as a result of breeding of the starch producing plant. Another example of a natural starch is a waxy starch that does not contain amylose as a result of breeding of the plant that produces the starch.

可溶性澱粉は、天然の澱粉に種々の処理を施すことにより得られる、水溶性の澱粉をいう。   Soluble starch refers to water-soluble starch obtained by subjecting natural starch to various treatments.

化工澱粉は、天然の澱粉に加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせた澱粉である。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工澱粉が入手可能である。化工澱粉の種類には種々ある。このような澱粉の例は、澱粉の糊化温度以下において澱粉粒子を酸に浸漬することにより、澱粉分子は切断するが、澱粉粒子は破壊していない澱粉である。   The modified starch is a starch obtained by subjecting natural starch to treatment, such as hydrolysis, esterification, or pregelatinization, to make it easier to use. A wide variety of modified starches having various combinations of gelatinization start temperature, glue viscosity, glue transparency, and aging stability are available. There are various types of modified starches. An example of such starch is starch in which starch molecules are cleaved but starch particles are not broken by immersing starch particles in an acid below the gelatinization temperature of starch.

澱粉分解物は、澱粉に酵素処理または加水分解などの処理を施して得られる、処理前よりも分子量が小さいオリゴ糖もしくは多糖である。澱粉分解物の例としては、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物および澱粉部分加水分解物が挙げられる。   The starch degradation product is an oligosaccharide or polysaccharide obtained by subjecting starch to a treatment such as enzymatic treatment or hydrolysis, and having a lower molecular weight than before the treatment. Examples of starch degradation products include starch debranching enzyme degradation products, starch phosphorylase degradation products and starch partial hydrolysis products.

澱粉枝切り酵素分解物は、澱粉に枝切り酵素を作用させることによって得られる。枝切り酵素の作用時間を種々に変更することによって、任意の程度に分岐部分（すなわち、α−１，６−グルコシド結合）が切断された澱粉枝切り酵素分解物が得られる。枝切り酵素分解物の例としては、糖単位数４〜１００００のうちα−１，６−グルコシド結合を１個〜２０個有する分解物、糖単位数３〜５００のα−１，６−グルコシド結合を全く有さない分解物、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。澱粉枝切り酵素分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解物の分子量の分布が異なり得る。澱粉枝切り酵素分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。   A starch debranching enzyme degradation product is obtained by allowing a debranching enzyme to act on starch. By changing the action time of the debranching enzyme variously, a starch debranching enzyme degradation product in which the branching portion (that is, α-1,6-glucoside bond) is cleaved to an arbitrary degree is obtained. Examples of debranching enzyme degradation products include degradation products having 1 to 20 α-1,6-glucoside bonds among 4 to 10,000 sugar units, and α-1,6-glucosides having 3 to 500 sugar units. Examples include degradation products having no bond, maltooligosaccharides, and amylose. In the case of a starch debranching enzyme degradation product, the molecular weight distribution of the degradation product obtained may vary depending on the type of degraded starch. The starch debranching enzyme degradation product can be a mixture of sugar chains of various lengths.

澱粉ホスホリラーゼ分解物は、澱粉にα−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ホスホリラーゼともいう）を作用させることによって得られる。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、澱粉の非還元性末端からグルコース残基を１糖単位ずつ他の基質へと転移させる。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、α−１，６−グルコシド結合を切断することができないので、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを澱粉に充分に長時間作用させると、α−１，６−グルコシド結合の部分で切断が終わった分解物が得られる。本発明では、澱粉ホスホリラーゼ分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。   A starch phosphorylase degradation product is obtained by allowing α-1,4-glucan phosphorylase (also referred to as phosphorylase) to act on starch. α-1,4-glucan phosphorylase transfers glucose residues from the non-reducing end of starch to other substrates one sugar unit at a time. Since α-1,4-glucan phosphorylase cannot cleave the α-1,6-glucoside bond, α-1,4-glucan phosphorylase is allowed to act on starch for a sufficiently long period of time. -A degradation product in which cleavage at the glucoside bond part is finished is obtained. In the present invention, the number of sugar units contained in the decomposed product of starch phosphorylase is preferably about 10 to about 100,000, more preferably about 50 to about 50,000, and still more preferably about 100 to about 10,000. In the starch phosphorylase degradation product, the molecular weight distribution of the degradation product obtained may vary depending on the type of degraded starch. The starch phosphorylase degradation product can be a mixture of sugar chains of various lengths.

デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、澱粉を、酸、アルカリ、酵素などの作用によって部分的に分解して得られる分解物をいう。本発明では、デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、種々の長さを持つ糖鎖の混合物であり得る。   Dextrin and starch partial hydrolyzate refers to a decomposition product obtained by partially decomposing starch by the action of acid, alkali, enzyme and the like. In the present invention, the number of sugar units possessed by dextrin and starch partial hydrolyzate is preferably from about 10 to about 100,000, more preferably from about 50 to about 50,000, and even more preferably from about 100 to about 10,000. It is. In the case of dextrin and starch partial hydrolyzate, the molecular weight distribution of the resulting degradation product may vary depending on the type of degraded starch. The dextrin and starch partial hydrolyzate can be a mixture of sugar chains having various lengths.

澱粉は、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることが好ましい。   The starch is preferably selected from the group consisting of soluble starch, waxy starch, high amylose starch, starch debranching enzyme degradation product, starch phosphorylase degradation product, starch partial hydrolyzate, modified starch, and derivatives thereof.

本発明の方法では、上記各種糖の誘導体は、プライマーとして用いられ得る。例えば、上記糖のアルコール性水酸基の少なくとも１つが、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、あるいはリン酸化された誘導体などが用いられ得る。さらに、これらの２種以上の誘導体の混合物が原料として用いられ得る。   In the method of the present invention, the above-mentioned various sugar derivatives can be used as primers. For example, a derivative in which at least one of the alcoholic hydroxyl groups of the sugar is hydroxyalkylated, alkylated, acetylated, carboxymethylated, sulfated, or phosphorylated can be used. Furthermore, a mixture of these two or more derivatives can be used as a raw material.

（４．ポリホスフェートグルコキナーゼ）
ポリホスフェートグルコキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．６３）とは、重合度ｎのポリリン酸（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のリン酸基をＤ−グルコースに転移して重合度ｎ−１のポリリン酸とグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素をいう。この反応は以下のように記載される：
（リン酸）_ｎ＋Ｄ−グルコース→（リン酸）_ｎ−１＋Ｄ−グルコース−６−リン酸
ポリホスフェートグルコキナーゼは、ポリホスフェート−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ポリホスフェート：Ｄ−グルコース６−ホスホトランスフェラーゼまたはＰＧＫとも呼ばれる。 (4. Polyphosphate glucokinase)
Polyphosphate glucokinase (EC: 2.7.1.63) is a transfer of a phosphoric acid group of polyphosphate having a polymerization degree of n to D-glucose, and polyphosphoric acid having a polymerization degree of n-1 and glucose- An enzyme that catalyzes the reaction that produces 6-phosphate. This reaction is described as follows:
(Phosphate) _n + D-glucose → (phosphate) _n-1 + D-glucose-6-phosphate Polyphosphate glucokinase is also polyphosphate-glucose phosphotransferase, polyphosphate: D-glucose 6-phosphotransferase or PGK. be called.

ポリホスフェートグルコキナーゼは、多くの微生物に存在する。ポリホスフェートグルコキナーゼを産生する微生物の例としては、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌（例えば、Ｍ．ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌(例えばＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ)、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒなどが挙げられる。本発明においては、任意の生物由来のポリホスフェートグルコキナーゼを使用し得る。本発明においては、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓ由来のポリホスフェートグルコキナーゼを用いることが好ましい。   Polyphosphate glucokinase is present in many microorganisms. Examples of microorganisms that produce polyphosphate glucokinase include Microlunas phosphovolas, Mycobacterium bacteria (eg, M. phlei, M. tuberculosis, M. bovis), Corynebacterium bacteria (eg, C. diphtheriae, C. xer). efficiens), Propionibacterium shermanii, Streptomyces coelicolor, and the like. In the present invention, polyphosphate glucokinase derived from any organism can be used. In the present invention, it is preferable to use a polyphosphate glucokinase derived from Microlunatus phosphovolas.

また、至適ｐＨの観点からは、約５．５以上の至適ｐＨを有するポリホスフェートグルコキナーゼが好ましい。ポリホスフェートグルコキナーゼの至適ｐＨは、より好ましくは約６．０以上であり、さらに好ましくは約６．５以上である。また、約１０以下の至適ｐＨを有するポリホスフェートグルコキナーゼが好ましい。ポリホスフェートグルコキナーゼの至適ｐＨは、より好ましくは約８．０以下であり、さらに好ましくは約７．５以下である。   From the viewpoint of the optimum pH, polyphosphate glucokinase having an optimum pH of about 5.5 or more is preferable. The optimum pH of polyphosphate glucokinase is more preferably about 6.0 or more, and still more preferably about 6.5 or more. Polyphosphate glucokinase having an optimum pH of about 10 or less is preferred. The optimum pH of polyphosphate glucokinase is more preferably about 8.0 or less, and further preferably about 7.5 or less.

また、ポリホスフェートグルコキナーゼの反応至適温度は、可能な限り高いことが好ましい。至適温度の観点からは、約３５℃以上の至適温度を有するポリホスフェートグルコキナーゼが好ましい。ポリホスフェートグルコキナーゼの至適温度は、より好ましくは約４０℃以上であり、さらに好ましくは約４５℃以上である。当該分野においては、至適温度の高い種々のポリホスフェートグルコキナーゼが公知である。高温条件で生育する細菌の有する酵素は、一般的に反応至適温度が高温である。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａの生育温度は、約５０℃であるので、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａの有する酵素は一般的に、反応至適温度が約５０℃であるか、または少なくとも約５０℃での反応性が非常に高い。Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａの好適な生育条件は、約５０℃にてｐＨ７．４であり、このポリホスフェートグルコキナーゼを産生するＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａは、ＡＴＣＣから購入することができる。Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ由来のポリホスフェートグルコキナーゼのヌクレオチド配列を配列番号９に示し、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ由来のポリホスフェートグルコキナーゼのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。ポリホスフェートグルコキナーゼの至適温度に特に上限はなく、至適温度は例えば、約８０℃以下、約７５℃以下、約７０℃以下、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、約５０℃以下、約４５℃以下、約４０℃以下などであり得る。至適温度が非常に高い酵素については、その酵素を入手することが困難である場合がある。   Further, the optimum reaction temperature of polyphosphate glucokinase is preferably as high as possible. From the viewpoint of the optimum temperature, polyphosphate glucokinase having an optimum temperature of about 35 ° C. or higher is preferable. The optimum temperature of polyphosphate glucokinase is more preferably about 40 ° C. or higher, and further preferably about 45 ° C. or higher. Various polyphosphate glucokinases having a high optimum temperature are known in the art. Enzymes possessed by bacteria that grow under high temperature conditions generally have a high optimum reaction temperature. For example, since the growth temperature of Thermobifida fusca is about 50 ° C., the enzyme possessed by Thermobifida fusca generally has an optimum reaction temperature of about 50 ° C., or is highly reactive at least at about 50 ° C. high. The preferred growth conditions for Thermobifida fusca is pH 7.4 at about 50 ° C., and Thermobifida fusca producing this polyphosphate glucokinase can be purchased from ATCC. The nucleotide sequence of polyphosphate glucokinase derived from Thermobifida fusca is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of polyphosphate glucokinase derived from Thermobifida fusca is shown in SEQ ID NO: 10. There is no particular upper limit to the optimum temperature of polyphosphate glucokinase, and the optimum temperature is, for example, about 80 ° C. or less, about 75 ° C. or less, about 70 ° C. or less, about 65 ° C. or less, about 60 ° C. or less, about 55 ° C. or less, It may be about 50 ° C. or lower, about 45 ° C. or lower, about 40 ° C. or lower, and the like. For an enzyme with a very high optimum temperature, it may be difficult to obtain the enzyme.

反応開始時の溶液中に含まれるポリホスフェートグルコキナーゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるポリホスフェートグルコキナーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコース１ｇに対して、好ましくは約１Ｕ以上であり、より好ましくは約１０Ｕ以上であり、さらに好ましくは約５０Ｕ以上であり、特に好ましくは約１００Ｕ以上であり、最も好ましくは約１５０Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるポリホスフェートグルコキナーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコースに対して、好ましくは約１５００Ｕ以下であり、より好ましくは約１０００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約５００Ｕ以下であり、特に好ましくは約３００Ｕ以下であり、最も好ましくは約２００Ｕ以下である。ポリホスフェートグルコキナーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。   The amount of polyphosphate glucokinase contained in the solution at the start of the reaction may be an amount sufficient to cause the target reaction to proceed. In a preferred embodiment, the amount of polyphosphate glucokinase contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 1 U or more, more preferably about 10 U or more, based on 1 g of glucose in the solution at the start of the reaction. More preferably about 50 U or more, particularly preferably about 100 U or more, and most preferably about 150 U or more. In a preferred embodiment, the amount of polyphosphate glucokinase contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 1500 U or less, more preferably about 1000 U or less, based on the glucose in the solution at the start of the reaction. More preferably, it is about 500 U or less, particularly preferably about 300 U or less, and most preferably about 200 U or less. If the weight of polyphosphate glucokinase is too large, the enzyme denatured during the reaction may easily aggregate. If the amount used is too small, the reaction itself may occur, but the glucan yield may decrease.

（５．ホスホグルコムターゼ）
ホスホグルコムターゼ（ＥＣ：２．７．５．１）とは、α−Ｄ−グルコース１，６−二リン酸とα−Ｄ−グルコース１−リン酸から、α−Ｄ−グルコース６−リン酸とα−Ｄ−グルコースを生成する反応を触媒する酵素をいう。この反応は以下のように記載される： (5. Phosphoglucomutase)
Phosphoglucomutase (EC: 2.7.5.1) is α-D-glucose 6-phosphate from α-D-glucose 1,6-diphosphate and α-D-glucose 1-phosphate. And an enzyme that catalyzes the reaction to produce α-D-glucose. This reaction is described as follows:

ホスホグルコムターゼは、α−ホスフェートグルコムターゼ、α−Ｄ−グルコース−１，６−ビスホスフェート：α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートホスホトランスフェラーゼまたはＰＧＭとも呼ばれる。

Phosphoglucomutase is also called α-phosphate glucomutase, α-D-glucose-1,6-bisphosphate: α-D-glucose-1-phosphate phosphotransferase or PGM.

ホスホグルコムターゼは、糖代謝の主経路に位置する酵素のためほとんどすべての生物に存在する。ホスホグルコムターゼは、微生物、動物および植物に存在する。ホスホグルコムターゼを産生する生物の例としては、例えば、ウサギ、ヒラメ、サメ、ウシ、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、馬鈴薯（Ｐｏｔａｔｏ）が挙げられる。本発明においては、任意の生物由来のホスホグルコムターゼを使用し得る。本発明においては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホスホグルコムターゼを使用することが好ましい。   Phosphoglucomutase is present in almost all organisms because it is an enzyme located in the main pathway of sugar metabolism. Phosphoglucomutase is present in microorganisms, animals and plants. Examples of organisms producing phosphoglucomutase include, for example, rabbits, flounder, sharks, cows, E. coli. E. coli, yeast, potato (Potato). In the present invention, phosphoglucomutase derived from any organism can be used. In the present invention, E.I. It is preferable to use phosphoglucomutase derived from E. coli.

また、至適ｐＨの観点からは、約６．０以上の至適ｐＨを有するホスホグルコムターゼが好ましい。ホスホグルコムターゼの至適ｐＨは、より好ましくは約６．５以上であり、さらに好ましくは約７．０以上である。また、約１０以下の至適ｐＨを有するホスホグルコムターゼが好ましい。ホスホグルコムターゼの至適ｐＨは、より好ましくは約８．５以下であり、さらに好ましくは約８．０以下である。   Further, from the viewpoint of the optimum pH, phosphoglucomutase having an optimum pH of about 6.0 or more is preferable. The optimum pH of phosphoglucomutase is more preferably about 6.5 or more, and further preferably about 7.0 or more. A phosphoglucomutase having an optimum pH of about 10 or less is preferred. The optimum pH of phosphoglucomutase is more preferably about 8.5 or less, and still more preferably about 8.0 or less.

また、至適温度の観点からは、約３５℃以上の至適温度を有するホスホグルコムターゼが好ましい。ホスホグルコムターゼの至適温度は、より好ましくは約４０℃以上であり、さらに好ましくは約４５℃以上である。当該分野においては、至適温度の高い種々のホスホグルコムターゼが公知である。高温条件で生育する細菌の有する酵素は、一般的に、反応至適温度が高温である。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの生育温度は、約７５℃であるので、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの有する酵素は、一般的に、反応至適温度が約７５℃であるか、または少なくとも約７５℃での反応性が非常に高い。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの好適な生育条件は、約７５℃にてｐＨ７．５であり、このホスホグルコムターゼを産生するＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、ＡＴＣＣから購入することができる。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列を配列番号１１に示し、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のホスホグルコムターゼのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ生育温度は、約６５℃であるので、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅの有する酵素は、一般的に、反応至適温度が約６５℃であるか、または少なくとも約６５℃での反応性が非常に高い。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅの好適な生育条件は、約６５℃にてｐＨ７．５であり、このホスホグルコムターゼを産生するＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅは、ＡＴＣＣから購入することができる。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ由来のホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列を配列番号１３に示し、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ由来のホスホグルコムターゼのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。ホスホグルコムターゼの至適温度に特に上限はなく、至適温度は例えば、約８０℃以下、約７５℃以下、約７０℃以下、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、約５０℃以下、約４５℃以下、約４０℃以下などであり得る。至適温度が非常に高い酵素については、その酵素を入手することが困難である場合がある。   From the viewpoint of the optimum temperature, phosphoglucomutase having an optimum temperature of about 35 ° C. or higher is preferable. The optimum temperature of phosphoglucomutase is more preferably about 40 ° C. or higher, and further preferably about 45 ° C. or higher. Various phosphoglucomutases having a high optimum temperature are known in the art. Enzymes possessed by bacteria that grow under high-temperature conditions generally have a high optimum reaction temperature. For example, since the growth temperature of Thermus thermophilus is about 75 ° C., the enzyme possessed by Thermus thermophilus generally has an optimum reaction temperature of about 75 ° C., or is highly reactive at least at about 75 ° C. Very expensive. The preferred growth conditions for Thermus thermophilus is pH 7.5 at about 75 ° C., and Thermus thermophilus producing this phosphoglucomutase can be purchased from ATCC. The nucleotide sequence of the phosphoglucomutase derived from Thermus thermophilus is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of the phosphoglucomutase derived from Thermus thermophilus is shown in SEQ ID NO: 12. Since the growth temperature of Thermotoga lettingae is about 65 ° C., the enzyme possessed by Thermotoga lettingae generally has an optimum reaction temperature of about 65 ° C., or at least about 65 ° C. is highly reactive. The preferred growth conditions for Thermotoga lettingae is pH 7.5 at about 65 ° C., and Thermotoga lettingae producing this phosphoglucomutase can be purchased from ATCC. The nucleotide sequence of the phosphoglucomutase derived from Thermotoga lettingae is shown in SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence of the phosphoglucomutase derived from Thermotolettingae is shown in SEQ ID NO: 14. There is no particular upper limit to the optimum temperature of phosphoglucomutase, and the optimum temperature is, for example, about 80 ° C. or less, about 75 ° C. or less, about 70 ° C. or less, about 65 ° C. or less, about 60 ° C. or less, about 55 ° C. or less, about It may be 50 ° C. or lower, about 45 ° C. or lower, about 40 ° C. or lower, and the like. For an enzyme with a very high optimum temperature, it may be difficult to obtain the enzyme.

反応開始時の溶液中に含まれるホスホグルコムターゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるホスホグルコムターゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコース１ｇに対して、好ましくは約１Ｕ以上であり、より好ましくは約１０Ｕ以上であり、さらに好ましくは約５０Ｕ以上であり、特に好ましくは約１００Ｕ以上であり、最も好ましくは約１５０Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるホスホグルコムターゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコースに対して、好ましくは約１５００Ｕ以下であり、より好ましくは約１０００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約５００Ｕ以下であり、特に好ましくは約３００Ｕ以下であり、最も好ましくは約２００Ｕ以下である。ホスホグルコムターゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。   The amount of phosphoglucomutase contained in the solution at the start of the reaction may be an amount sufficient to cause the target reaction to proceed. In a preferred embodiment, the amount of phosphoglucomutase contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 1 U or more, more preferably about 10 U or more with respect to 1 g of glucose in the solution at the start of the reaction. More preferably, it is about 50 U or more, particularly preferably about 100 U or more, and most preferably about 150 U or more. In a preferred embodiment, the amount of phosphoglucomutase contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 1500 U or less, more preferably about 1000 U or less, with respect to glucose in the solution at the start of the reaction, More preferably, it is about 500 U or less, particularly preferably about 300 U or less, and most preferably about 200 U or less. If the weight of phosphoglucomutase is too large, the enzyme denatured during the reaction may easily aggregate. If the amount used is too small, the reaction itself may occur, but the glucan yield may decrease.

（６．α−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
α−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．１）とは、α−１，４−グルカン（重合度ｎ）の加リン酸分解による、α−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）とα−Ｄ−グルコース−１−リン酸との産生を触媒する酵素の総称であり、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応である、α−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）およびα−Ｄ−グルコース−１−リン酸からα−１，４−グルカン（重合度ｎ）を合成する反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、α−１，４−グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。本発明の方法では、無機リン酸は、β−１，４−グルカンの加リン酸分解に使われ、反応溶液中に含まれる無機リン酸の量が少ないので、α−グルカンの合成の方向に反応が進む。 (6. α-1,4-glucan phosphorylase)
α-1,4-glucan phosphorylase (EC: 2.4.1.1) is α-1,4-glucan (polymerization) by phosphorolysis of α-1,4-glucan (degree of polymerization n). This is a generic term for enzymes that catalyze the production of (degree n-1) and α-D-glucose-1-phosphate, and is sometimes called phosphorylase, starch phosphorylase, glycogen phosphorylase, maltodextrin phosphorylase, and the like. α-1,4-glucan phosphorylase is a reverse reaction of phosphorolysis, from α-1,4-glucan (degree of polymerization n-1) and α-D-glucose-1-phosphate to α-1, A reaction for synthesizing 4-glucan (degree of polymerization n) can also be catalyzed. Which direction the reaction proceeds depends on the amount of substrate. In vivo, since the amount of inorganic phosphate is large, the reaction of α-1,4-glucan phosphorylase proceeds in the direction of phosphorolysis. In the method of the present invention, inorganic phosphoric acid is used for phosphorolysis of β-1,4-glucan, and since the amount of inorganic phosphoric acid contained in the reaction solution is small, it is in the direction of synthesis of α-glucan. The reaction proceeds.

α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。   α-1,4-glucan phosphorylase is believed to be ubiquitous in various plants, animals and microorganisms capable of storing starch or glycogen.

α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ（馬鈴薯ともいう）、サツマイモ（甘藷ともいう）、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。   Examples of plants that produce α-1,4-glucan phosphorylase include algae, potatoes (also called potatoes), sweet potatoes (also called sweet potatoes), potatoes such as yams, taros, cassava, and vegetables such as cabbage and spinach. Cereals such as corn, rice, wheat, barley, rye and millet, and beans such as peas, soybeans, red beans and quail beans.

α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類などが挙げられる。   Examples of animals that produce α-1,4-glucan phosphorylase include mammals such as humans, rabbits, rats, and pigs.

α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物の例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．などが挙げられる。α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。 Examples of microorganisms that produce α-1,4-glucan phosphorylase include Thermus
aquaticus, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Thermococcus lithalis, Streptomyces coelicolor, Pyrococcus
horikoshi, Mycobacterium tuberculosis, Thermotoga maritimima, Aquifex aerumicus, Methanococcus Jannaschii, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia
pasteurianum, Klebsiella pneumoniae, Synecoccus sp. Synechocystis sp. , E.C. E. coli, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, Chlamydomonas sp. Etc. The organism that produces α-1,4-glucan phosphorylase is not limited to these.

本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、ジャガイモに由来することがより好ましい。特定の実施形態では、本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。   The α-1,4-glucan phosphorylase used in the present invention is preferably derived from potato, Thermus aquaticus, Bacillus stearothermophilus, and more preferably derived from potato. In a specific embodiment, the α-1,4-glucan phosphorylase used in the present invention preferably has a high optimum reaction temperature. Α-1,4-glucan phosphorylase having a high optimum reaction temperature can be derived from, for example, a highly thermophilic bacterium.

また、至適ｐＨの観点からは、約４．０以上の至適ｐＨを有するα−１，４−グルカンホスホリラーゼが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨは、より好ましくは約４．５以上であり、さらに好ましくは約５．０以上である。また、約７．０以下の至適ｐＨを有するα−１，４−グルカンホスホリラーゼが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨは、より好ましくは約６．５以下であり、さらに好ましくは約６．０以下である。   From the viewpoint of the optimum pH, α-1,4-glucan phosphorylase having an optimum pH of about 4.0 or higher is preferable. The optimum pH of α-1,4-glucan phosphorylase is more preferably about 4.5 or more, and further preferably about 5.0 or more. Further, α-1,4-glucan phosphorylase having an optimum pH of about 7.0 or less is preferable. The optimum pH of α-1,4-glucan phosphorylase is more preferably about 6.5 or less, and even more preferably about 6.0 or less.

本発明においては、後述するとおり、反応開始時点における反応溶液のｐＨを弱アルカリ性側にすることが好ましいが、その場合、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨと比較して、多少の差が生じることになる。反応開始時点における反応溶液のｐＨと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨとの差は、約０．５以上とすることが可能であり、約１．０以上とすることも可能であり、さらには約１．５以上とすることも可能である。反応開始時点における反応溶液のｐＨと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨとの差は、好ましくは約５．５以下であり、より好ましくは約４．０以下であり、さらに好ましくは約２．５以下である。   In the present invention, as described later, it is preferable to set the pH of the reaction solution at the start of the reaction to a weakly alkaline side, but in that case, the pH of the α-1,4-glucan phosphorylase is slightly higher than the optimum pH. There will be a difference. The difference between the pH of the reaction solution at the start of the reaction and the optimum pH of α-1,4-glucan phosphorylase can be about 0.5 or more, and can be about 1.0 or more. Furthermore, it can be about 1.5 or more. The difference between the pH of the reaction solution at the start of the reaction and the optimum pH of α-1,4-glucan phosphorylase is preferably about 5.5 or less, more preferably about 4.0 or less, and still more preferably Is about 2.5 or less.

また、至適温度の観点からは、約３０℃以上の至適温度を有するα−１，４−グルカンホスホリラーゼが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適温度は、より好ましくは約３５℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上である。当該分野においては、至適温度の高い種々のα−１，４−グルカンホスホリラーゼが公知である。例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のα−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適温度は約９０℃であり、至適ｐＨは５．６である。このα−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生するＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓは、例えば、ＡＴＣＣから入手可能である。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適温度に特に上限はなく、至適温度は例えば、約８０℃以下、約７５℃以下、約７０℃以下、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、約５０℃以下、約４５℃以下、約４０℃以下などであり得る。至適温度が非常に高い酵素については、その酵素を入手することが困難である場合がある。   From the viewpoint of the optimum temperature, α-1,4-glucan phosphorylase having an optimum temperature of about 30 ° C. or higher is preferable. The optimum temperature of α-1,4-glucan phosphorylase is more preferably about 35 ° C. or more, and further preferably about 40 ° C. or more. In this field, various α-1,4-glucan phosphorylases having a high optimum temperature are known. For example, the optimum temperature of α-1,4-glucan phosphorylase derived from Aquifex aeolicus is about 90 ° C., and the optimum pH is 5.6. Aquifex aeolicus that produces this α-1,4-glucan phosphorylase is available, for example, from ATCC. There is no particular upper limit to the optimum temperature of α-1,4-glucan phosphorylase, and the optimum temperature is, for example, about 80 ° C. or less, about 75 ° C. or less, about 70 ° C. or less, about 65 ° C. or less, about 60 ° C. or less, about It may be 55 ° C. or less, about 50 ° C. or less, about 45 ° C. or less, about 40 ° C. or less. For an enzyme with a very high optimum temperature, it may be difficult to obtain the enzyme.

反応開始時の溶液中に含まれるα−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるα−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコース１ｇに対して、好ましくは約１Ｕ以上であり、より好ましくは約１０Ｕ以上であり、さらに好ましくは約５０Ｕ以上であり、特に好ましくは約１００Ｕ以上であり、最も好ましくは約１５０Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるα−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコースに対して、好ましくは約１５００Ｕ以下であり、より好ましくは約１０００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約５００Ｕ以下であり、特に好ましくは約３００Ｕ以下であり、最も好ましくは約２００Ｕ以下である。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。   The amount of α-1,4-glucan phosphorylase contained in the solution at the start of the reaction may be an amount sufficient to cause the target reaction to proceed. In a preferred embodiment, the amount of α-1,4-glucan phosphorylase contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 1 U or more, more preferably 1 g of glucose in the solution at the start of the reaction. It is about 10 U or more, more preferably about 50 U or more, particularly preferably about 100 U or more, and most preferably about 150 U or more. In a preferred embodiment, the amount of α-1,4-glucan phosphorylase contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 1500 U or less, more preferably about 1500 U, based on the glucose in the solution at the start of the reaction. 1000 U or less, more preferably about 500 U or less, particularly preferably about 300 U or less, and most preferably about 200 U or less. If the α-1,4-glucan phosphorylase is too heavy, the enzyme denatured during the reaction may easily aggregate. If the amount used is too small, the reaction itself may occur, but the glucan yield may decrease.

（７．ゲスト化合物）
アミロースなどの直鎖状α−グルカン、および分岐状α−グルカンのうちの直鎖状の部分がゲスト化合物を包接することが公知である。すなわち、これらのα−グルカンは、ホスト化合物として作用することが公知である。これらのα−グルカンは、ゲスト化合物を包接すると沈澱しやすくなる。そのため、本発明の方法においては、反応溶液中にゲスト化合物を含むことが好ましい。ゲスト化合物は、反応開始時から溶液中に含有されてもよく、あるいは、ある程度反応が進んでから溶液中に添加されてもよい。 (7. Guest compound)
It is known that a linear α-glucan such as amylose and a linear portion of a branched α-glucan include a guest compound. That is, these α-glucans are known to act as host compounds. These α-glucans are likely to precipitate when the guest compound is included. Therefore, in the method of this invention, it is preferable that a guest compound is included in the reaction solution. The guest compound may be contained in the solution from the start of the reaction, or may be added to the solution after the reaction has progressed to some extent.

本明細書中で使用される場合、用語「ゲスト化合物」とは、アミロースによって包接される化合物をいう。ゲスト化合物がアミロースによって包接された場合に得られる包接化合物が難溶性または不溶性であるものが好ましい。   As used herein, the term “guest compound” refers to a compound that is included by amylose. The inclusion compound obtained when the guest compound is included by amylose is preferably insoluble or insoluble.

ゲスト化合物は、好ましくは、プライマーによって包接されない化合物である。   The guest compound is preferably a compound that is not included by the primer.

本発明で好ましく使用され得るゲスト化合物の例としては、デカン酸（カプリン酸）、ラウリン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートなどが挙げられる。ゲスト化合物は、好ましくは、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートであり、より好ましくは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである。   Examples of guest compounds that can be preferably used in the present invention include decanoic acid (capric acid), lauric acid, sodium dodecyl sulfate, N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3- ( N, N-dimethylmyristylammonio) propane sulfonate and 3- (N, N-dimethylpalmityl-ammonio) propane sulfonate. The guest compound is preferably N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate or 3- (N, N-dimethylpal). Methyl-ammonio) propane sulfonate, more preferably 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propane sulfonate or 3- (N, N-dimethylpalmityl-ammonio) propane sulfonate.

（８．グルコース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、または無機リン酸）
本発明において、出発物質としてグルコース−６−リン酸を使用することが可能である。本明細書において使用される場合、用語「グルコース−６−リン酸（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とは、グルコース−６−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ；ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）およびその塩をいう。グルコース−６−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−６−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。狭義のグルコース−６−リン酸は、グルコースの６位の炭素にリン酸基が結合している物質である。グルコース−６−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−６−リン酸二ナトリウム、グルコース−６−リン酸二カリウム、グルコース−６−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、特に断りの無い限り、グルコース−６−リン酸は、広義のグルコース−６−リン酸、すなわち狭義のグルコース−６−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ）およびその塩を示す。 (8. Glucose-6-phosphate, glucose-1-phosphate, or inorganic phosphate)
In the present invention, glucose-6-phosphate can be used as a starting material. As used herein, the term “glucose-6-phosphate” refers to glucose-6-phosphate (C ₆ H ₁₃ O ₉ P; glucose-6-phosphoric acid) and refers to a salt thereof. glucose-6-phosphate is preferably a any metal salt of a narrow sense of glucose-6-phosphate _{(C 6 H 13 O 9 P} ), more preferably glucose-1-phosphate ( C ₆ H ₁₃ O ₉ P) An arbitrary alkali metal salt of glucose-6-phosphate in a narrow sense is a substance in which a phosphate group is bonded to the carbon at the 6-position of glucose. Preferable specific examples of phosphoric acid include disodium glucose-6-phosphate, dipotassium glucose-6-phosphate, glucose-6-phosphate (C ₆ H _{1 3} O ₉ P), etc. Unless otherwise specified, glucose-6-phosphate is defined as glucose-6-phosphate in a broad sense, that is, glucose-6-phosphate (C ₆ H ₁₃ O ₉ P) and salts thereof.

反応開始時の反応溶液は、１種類のグルコース−６−リン酸を含有してもよく、複数種類のグルコース−６−リン酸を含有してもよい。   The reaction solution at the start of the reaction may contain one type of glucose-6-phosphate or a plurality of types of glucose-6-phosphate.

本明細書において使用される場合、用語「グルコース−１−リン酸（ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」とは、グルコース−１−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ；ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_９Ｐ）およびその塩を示す。 As used herein, the term “glucose-1-phosphate” refers to glucose-1-phosphate (C ₆ H ₁₃ O ₉ P; gluco-6-phosphoric acid). And its salts. Glucose-1-phosphate is preferably any metal salt of glucose-1-phosphate (C ₆ H ₁₃ O ₉ P) in the narrow sense, more preferably glucose-1-phosphate (C ₆ H ₁₃ O). ₉ P) any alkali metal salt. Specific examples of preferable glucose-1-phosphate include disodium glucose-1-phosphate, dipotassium glucose-1-phosphate, glucose-1-phosphate (C ₆ H ₁₃ O ₉ P), and the like. It is done. In the present specification, glucose-1-phosphate not having a chemical formula in parentheses means glucose-1-phosphate in a broad sense, that is, glucose-1-phosphate in a narrow sense (C ₆ H ₁₃ O ₉ P) and its Indicates salt.

反応開始時の反応溶液は、１種類のグルコース−１−リン酸を含有してもよく、複数種類のグルコース−１−リン酸を含有してもよい。   The reaction solution at the start of the reaction may contain one type of glucose-1-phosphate or may contain a plurality of types of glucose-1-phosphate.

本明細書において使用される場合、用語「無機リン酸」とは、リン酸のあらゆる種類のイオンおよび塩の総称である。例えば、無機リン酸は、セロビオースからグルコース−１−リン酸を合成する反応においてリン酸基質を供与する。すなわち、無機リン酸は、この反応においてリン酸源として作用する。ここでリン酸基質とは、グルコース−１−リン酸のリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ）の原料となる物質をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒されるβ−１，４−グルカン加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。本発明において、無機リン酸は好ましくは、リン酸の任意の金属塩であり、より好ましくはリン酸のアルカリ金属塩である。無機リン酸の好ましい具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどが挙げられる。 As used herein, the term “inorganic phosphoric acid” is a generic term for all kinds of ions and salts of phosphoric acid. For example, inorganic phosphate provides a phosphate substrate in a reaction that synthesizes glucose-1-phosphate from cellobiose. That is, inorganic phosphoric acid acts as a phosphoric acid source in this reaction. Here, the phosphate substrate refers to a substance that is a raw material for the phosphate moiety of glucose-1-phosphate. In β-1,4-glucan phosphorolysis catalyzed by β-1,4-glucan phosphorylase, inorganic phosphate is considered to act as a substrate in the form of phosphate ions. Since this substrate is conventionally referred to as inorganic phosphoric acid in this field, this substrate is also referred to as inorganic phosphoric acid in this specification. Inorganic phosphoric acid includes phosphoric acid and inorganic salts of phosphoric acid. Usually, inorganic phosphoric acid is used in water containing cations such as alkali metal ions. In this case, since phosphoric acid, phosphate, and phosphate ions are in an equilibrium state, it is difficult to distinguish between phosphoric acid and phosphate. Therefore, for convenience, phosphoric acid and phosphate are collectively referred to as inorganic phosphoric acid. In the present invention, the inorganic phosphoric acid is preferably any metal salt of phosphoric acid, more preferably an alkali metal salt of phosphoric acid. Preferable specific examples of inorganic phosphoric acid include sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, trisodium phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, tripotassium phosphate, phosphoric acid (H ₃ PO ₄ ), ammonium dihydrogen phosphate, diammonium hydrogen phosphate, and the like.

反応開始時の反応溶液は、１種類の無機リン酸を含有してもよく、複数種類の無機リン酸を含有してもよい。   The reaction solution at the start of the reaction may contain one type of inorganic phosphoric acid or may contain a plurality of types of inorganic phosphoric acid.

無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。ポリリン酸は、通常、少量の無機リン酸を不純物として含有する。そのため、α−グルカンの合成には無機リン酸が必要であるが、市販のポリリン酸を添加すれば、無機リン酸を添加する必要がない場合がある。   Inorganic phosphoric acid reacts, for example, a phosphoric acid condensate such as polyphosphoric acid (for example, pyrophosphoric acid, triphosphoric acid and tetraphosphoric acid) or a salt thereof decomposed by physical, chemical or enzymatic reaction. It can be provided by adding to the solution. Polyphosphoric acid usually contains a small amount of inorganic phosphoric acid as an impurity. Therefore, inorganic phosphoric acid is required for the synthesis of α-glucan, but if commercially available polyphosphoric acid is added, it may not be necessary to add inorganic phosphoric acid.

（９．グルコースイソメラーゼ（ＥＣ：５．３．１．５））
本発明の方法において、出発物質としてフルクトースを使用することも可能である。他の酵素反応の副産物としてフルクトースが得られる場合、本発明ではこのフルクトースを有効に利用することができる。 (9. Glucose isomerase (EC: 5.3.1.5))
It is also possible to use fructose as a starting material in the process of the present invention. When fructose is obtained as a by-product of other enzyme reaction, the fructose can be effectively used in the present invention.

出発物質としてフルクトースを使用する実施形態では、反応溶液中にグルコースイソメラーゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にグルコースイソメラーゼを含むことにより、フルクトースをグルコースへと変換できる。   In embodiments where fructose is used as the starting material, it is preferred to further include glucose isomerase in the reaction solution. By including glucose isomerase in the solution, fructose can be converted to glucose.

本発明の製造方法で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの相互変換を触媒し得る酵素である。グルコースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースとの相互変換をも触媒し得るので、キシロースイソメラーゼとも呼ばれる。   The glucose isomerase that can be used in the production method of the present invention is an enzyme that can catalyze the interconversion of D-glucose and D-fructose. Glucose isomerase is also referred to as xylose isomerase because it can also catalyze the interconversion of D-xylose and D-xylulose.

グルコースイソメラーゼは、微生物、動物および植物に存在する。グルコースイソメラーゼを産生する微生物の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓおよびＰａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｇｅｎｏｉｄｅｓが挙げられる。グルコースイソメラーゼを産生する動物の例としては、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉが挙げられる。グルコースイソメラーゼは、植物由来であってもよい。グルコースイソメラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。   Glucose isomerase is present in microorganisms, animals and plants. Examples of microorganisms that produce glucose isomerase include Streptomyces rubigonosus, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces violetaceoniger, Streptomyces violaceoniger, Streptomyces violaceoniger Escherichia coli, Bacteroides xylanolyticus, Arthrobacter sp. , Candida bodyinii, Clostridium thermosulfurogenes, Clostridium thermohydrosulfuricum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobacter sp. , Thermotoga neapolitana, Thermus aquaticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus xylosus, Agrobacterium tumefaciens, Bacillus sp. , Actinoplanes missouriensis and Paracobacterium aerogenoides. Examples of animals that produce glucose isomerase include Trypanosoma brucei. The glucose isomerase may be derived from a plant. The organism that produces glucose isomerase is not limited to these.

本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に由来することが好ましく、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルコースイソメラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルコースイソメラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。   Glucose isomerase that can be used in the present invention is Streptomyces rubiginosus or Bacillus sp. It is preferably derived from Streptomyces rubiginosus. The glucose isomerase used in the present invention preferably has a high optimum reaction temperature. Glucose isomerase having a high optimal reaction temperature can be derived from, for example, a highly thermophilic bacterium.

反応開始時の溶液中に含まれるグルコースイソメラーゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中のフルクトース１ｇに対して、好ましくは約０．０１Ｕ以上であり、より好ましくは約０．０５Ｕ以上であり、さらに好ましくは約０．１Ｕ以上であり、特に好ましくは約０．５Ｕ以上であり、最も好ましくは約１Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中のフルクトース１ｇに対して、好ましくは約５００Ｕ以下であり、より好ましくは約１００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約５０Ｕ以下であり、特に好ましくは約１０Ｕ以下であり、最も好ましくは約５Ｕ以下である。グルコースイソメラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。   The amount of glucose isomerase contained in the solution at the start of the reaction may be an amount sufficient to cause the target reaction to proceed. In a preferred embodiment, it is preferably about 0.01 U or more, more preferably about 0.05 U or more, further preferably about 0.1 U or more, with respect to 1 g of fructose in the solution at the start of the reaction. Particularly preferred is about 0.5 U or more, and most preferred is about 1 U or more. In a preferred embodiment, it is preferably about 500 U or less, more preferably about 100 U or less, further preferably about 50 U or less, particularly preferably about 10 U or less, with respect to 1 g of fructose in the solution at the start of the reaction. And most preferably about 5 U or less. If the weight of glucose isomerase is too large, the enzyme denatured during the reaction may easily aggregate. If the amount used is too small, the reaction itself may occur, but the glucan yield may decrease.

（１０．β−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
本発明において、出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用することも可能である。出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用する実施形態では、反応溶液中にβ−１，４−グルカンホスホリラーゼを含むことが好ましい。 (10. β-1,4-glucan phosphorylase)
In the present invention, it is also possible to use β-1,4-glucan as a starting material. In an embodiment using β-1,4-glucan as a starting material, it is preferable to include β-1,4-glucan phosphorylase in the reaction solution.

本明細書中では、「β−１，４−グルカンホスホリラーゼ」とは、β−１，４−グルカンの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるβ−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存するが、この反応は、β−１，４−グルカン合成反応の方向に進みやすい傾向がある。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：   In the present specification, “β-1,4-glucan phosphorylase” means any phosphorolysis by transferring a glucose residue at the non-reducing terminal of β-1,4-glucan to a phosphate group. An enzyme. β-1,4-glucan phosphorylase can also catalyze a β-1,4-glucan synthesis reaction that is the reverse reaction of phosphorolysis. The direction in which the reaction proceeds depends on the amount of the substrate, but this reaction tends to proceed in the direction of β-1,4-glucan synthesis reaction. The reaction catalyzed by β-1,4-glucan phosphorylase is shown by the following formula:

なお、この式において、出発時のβ−１，４−グルカンの重合度が２の場合、β−１，４−グルカンの代わりにグルコースが得られる。

In this formula, when the degree of polymerization of β-1,4-glucan at the start is 2, glucose is obtained instead of β-1,4-glucan.

β−１，４−グルカンホスホリラーゼは好ましくは、セロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．２０）またはセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．４９）である。   The β-1,4-glucan phosphorylase is preferably cellobiose phosphorylase (EC: 2.4.2.10) or cellodextrin phosphorylase (EC: 2.4.4.19).

セロビオースホスホリラーゼは、セロビオースの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロビオースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：   Cellobiose phosphorylase is an enzyme that undergoes phosphorolysis by transferring the non-reducing terminal glucose residue of cellobiose to a phosphate group. The reaction catalyzed by cellobiose phosphorylase is shown by the following formula:

セロデキストリンホスホリラーゼは、重合度３以上のセロオリゴ糖の非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロオリゴ糖は、セロデキストリンとも呼ばれる。セロデキストリンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：

Cellodextrin phosphorylase refers to an enzyme that undergoes phosphorolysis by transferring a non-reducing terminal glucose residue of a cellooligosaccharide having a degree of polymerization of 3 or more to a phosphate group. Cellooligosaccharides are also called cellodextrins. The reaction catalyzed by cellodextrin phosphorylase is shown by the following formula:

本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロビオースである場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においてはまた、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。この場合、セロデキストリンホスホリラーゼの作用によってセロオリゴ糖が分解されることによって生じたグルコース−１−リン酸がα−グルカン合成に使用され、かつ最終的に生じたセロビオースをセロビオースホスホリラーゼによって分解し得るので、セロオリゴ糖からα−グルカンの合成速度がより速くなる。

In the method of the present invention, when β-1,4-glucan is cellobiose, it is preferable to use cellobiose phosphorylase as β-1,4-glucan phosphorylase. In the method of the present invention, when β-1,4-glucan is a cellooligosaccharide, it is preferable to use cellodextrin phosphorylase as β-1,4-glucan phosphorylase. In the method of the present invention, when β-1,4-glucan is a cellooligosaccharide, it is preferable to use cellobiose phosphorylase and cellodextrin phosphorylase as β-1,4-glucan phosphorylase. In this case, glucose-1-phosphate generated by the decomposition of cellooligosaccharide by the action of cellodextrin phosphorylase is used for α-glucan synthesis, and the final cellobiose can be decomposed by cellobiose phosphorylase. The synthesis rate of α-glucan from cellooligosaccharide becomes faster.

出発物質としてβ−１，４−グルカンホスホリラーゼを使用する実施形態では、反応用液中に少なくともセロビオースホスホリラーゼを含有することが好ましい。セロビオースによって記載される上記反応によって生成されるグルコースは、ポリホスフェートグルコキナーゼおよびホスホグルコムターゼによって触媒される反応によりＧ１−Ｐへと変換されるため、β−１，４−グルカン（特に、セロビオース）を効率よく利用できる。   In the embodiment using β-1,4-glucan phosphorylase as a starting material, it is preferable to contain at least cellobiose phosphorylase in the reaction solution. Since glucose produced by the above reaction described by cellobiose is converted to G1-P by a reaction catalyzed by polyphosphate glucokinase and phosphoglucomutase, β-1,4-glucan (especially cellobiose) Can be used efficiently.

β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。   β-1,4-glucan phosphorylase is contained in various organisms in nature. Examples of organisms that produce β-1,4-glucan phosphorylase include organisms of the genus Clostridium (eg, Clostridium thermocellum and Clostridium suterocorarium), organisms of the genus Cellvibrio (eg, organisms of the genus Cellvibrio girmus, ther, neapolitana and Thermotoga maritima), organisms of the genus Ruminococcas (eg Ruminococcas flavfaciens), organisms of the genus Fomes (eg Fomes annos), organisms of the genus Cellulomonas and organisms of the genus Erwinia. Organisms that produce β-1,4-glucan phosphorylase are preferably Clostridium thermocellum, Clostridium sterocorariaum, Cellvibrio gilmorus, Thermotoga neapolitana, Thermotoga marico. Erwinia sp. Selected from the group consisting of β-1,4-glucan phosphorylase may be derived from a plant.

セロビオースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロビオースホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。セロビオースホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択され、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓであり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍである。セロビオースホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。 Cellobiose phosphorylase is contained in various organisms in nature. Examples of organisms that produce cellobiose phosphorylase include organisms of the genus Clostridium (eg, Clostridium thermocellum and Clostridium suterocorarium), organisms of the genus Cellvibrio (eg, organisms of Cellvibrio gilto),
neapolitana and Thermotoga maritima), organisms of the genus Ruminococcas (eg, Ruminococcas flavfaciens), organisms of the genus Fomes (eg, Fomes annos), organisms of the genus Cellulomonas and organisms of the genus Erwinia. Organisms that produce cellobiose phosphorylase are preferably Clostridium thermocellum, Clostridium suterocorarium, Cellvibrio gilvus, Thermotoga neapolitana, Thermotoga maritimi, Thermotoga maritima, Thermotoga marico. Erwinia sp. More preferably, it is Clostridium thermocellum or Cellvibrio gilvus, and most preferably is Clostridium thermocellum. Cellobiose phosphorylase may be derived from a plant.

セロデキストリンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択され、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍである。セロデキストリンホスホリラーゼホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。   Cellodextrin phosphorylase is contained in various organisms in nature. Examples of organisms that produce cellodextrin phosphorylase include organisms of the genus Clostridium (eg, Clostridium thermocellum and Clostridium sterocorariaum), organisms of the genus Cellvibrio (eg, Cellvibrio girvus, Thermotogium, Thermotogium, Thermotogium , Organisms of the genus Ruminococcas (eg Ruminococcas flavfaciens), organisms of the genus Fomes (eg Fomes annos), organisms of the genus Cellulomonas and organisms of the genus Erwinia. The organisms that produce cellodextrin phosphorylase are preferably Clostridium thermocellum, Clostridium suterocorarium, Cellvibrio gilvus, Thermotoga neapolitana, Thermotoga maritima, Thermotoga maritima, Thermotoga maritima. Erwinia sp. Selected from the group consisting of: Clostridium thermocellum or Cellulomonas sp. Most preferred is Clostridium thermocellum. The cellodextrin phosphorylase phosphorylase may be derived from a plant.

β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）を産生する任意の生物由来であり得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で５５℃にて２０分間加熱した場合に加熱前のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましく、６０％以上の活性を保持するものであることがより好ましく、７０％以上の活性を保持するものであることがさらに好ましく、８０％以上の活性を保持するものであることが特に好ましく、８５％以上の活性を保持するものであることが最も好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来である。   β-1,4-glucan phosphorylase (preferably cellobiose phosphorylase or cellodextrin phosphorylase, most preferably cellobiose phosphorylase) is β-1,4-glucan phosphorylase (preferably cellobiose phosphorylase or cellodextrin phosphorylase, most preferably cellobiose phosphorylase). From any organism that produces β-1,4-glucan phosphorylase preferably has a certain degree of heat resistance. β-1,4-glucan phosphorylase is more preferable as the heat resistance is higher. For example, when β-1,4-glucan phosphorylase is heated at 55 ° C. for 20 minutes in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 1.4 mM 2-mercaptoethanol, It preferably retains 50% or more of the activity of 4-glucan phosphorylase, more preferably retains 60% or more of activity, and retains 70% or more of activity. Is more preferable, it is particularly preferable to retain 80% or more activity, and most preferable to retain 85% or more activity. β-1,4-glucan phosphorylase is preferably Clostridium thermocellum, Clostridium sterocorariaum, Cellvibrio gilvus, Thermotoga neapolita, Thermotoga maritima, Thermotoga maritima, Thermotoga maritima. Erwinia sp. Derived from a bacterium selected from the group consisting of

β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。 When the β-1,4-glucan phosphorylase is a cellobiose phosphorylase, the cellobiose phosphorylase is preferably Clostridium thermocellum, Clostridium suterocorarium, Cellvibrio gilvus, Thermotoga neapolitan,
maritima, Ruminococcas flavofaciens, Fomes annos, Cellulomonas sp. Erwinia sp. It is derived from a bacterium selected from the group consisting of: More preferably, it is derived from Clostridium thermocellum or Cellvibrio gilvus, and most preferably it is derived from Clostridium thermocellum.

β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。 When the β-1,4-glucan phosphorylase is a cellobiose phosphorylase, the cellobiose phosphorylase is preferably Clostridium thermocellum, Clostridium suterocorarium, Cellvibrio gilvus, Thermotoga neapolitan,
maritima, Ruminococcas flavofaciens, Fomes annos, Cellulomonas sp. Erwinia sp. It is derived from a bacterium selected from the group consisting of: Clostridium thermocellum or Cellulomonas sp. And most preferably from Clostridium thermocellum.

反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンの１ｇに対して、好ましくは約０．０１Ｕ以上であり、より好ましくは約０．０５Ｕ以上であり、さらに好ましくは約０．１Ｕ以上であり、特に好ましくは約０．５Ｕ以上であり、最も好ましくは約１Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンの１ｇに対して、好ましくは約１，０００Ｕ以下であり、より好ましくは約５００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約１００Ｕ以下であり、特に好ましくは約５０Ｕ以下であり、最も好ましくは約７Ｕ以下である。β−１，４−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。   The amount of β-1,4-glucan phosphorylase contained in the solution at the start of the reaction may be an amount sufficient to cause the target reaction to proceed. In a preferred embodiment, the amount of β-1,4-glucan phosphorylase contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 0, relative to 1 g of β-1,4-glucan in the solution at the start of the reaction. 0.01 U or more, more preferably about 0.05 U or more, further preferably about 0.1 U or more, particularly preferably about 0.5 U or more, and most preferably about 1 U or more. In a preferred embodiment, the amount of β-1,4-glucan phosphorylase contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 1 to 1 g of β-1,4-glucan in the solution at the start of the reaction. 1,000 U or less, more preferably about 500 U or less, still more preferably about 100 U or less, particularly preferably about 50 U or less, and most preferably about 7 U or less. If the β-1,4-glucan phosphorylase is too heavy, the enzyme denatured during the reaction may easily aggregate. If the amount used is too small, the reaction itself may occur, but the glucan yield may decrease.

（１１．アミラーゼ）
本発明の方法において、出発物質としてデンプンを使用することも可能である。デンプンを出発物質として使用する実施形態では、アミラーゼなどのデンプン分解酵素は、アミロース合成を行う反応溶液とは別の溶液に含まれることが好ましい。生成したアミロースが分解されてしまうからである。アミラーゼを使用する場合は、デンプンをアミラーゼで分解してグルコースを得た後に、その反応液を加熱してアミラーゼを失活させることが好ましい。 (11. Amylase)
It is also possible to use starch as a starting material in the process of the present invention. In embodiments where starch is used as a starting material, amylolytic enzymes such as amylase are preferably included in a separate solution from the reaction solution that performs amylose synthesis. This is because the produced amylose is decomposed. When amylase is used, it is preferable to deactivate the amylase by decomposing starch with amylase to obtain glucose and then heating the reaction solution.

アミラーゼはデンプンを加水分解する酵素の総称である。アミラーゼには、非還元性末端から特定数のグルコース単位を切り離していくエキソ型と、ほぼランダムに近い分解様式をもつエンド型がある。本発明においてアミラーゼを使用する場合には、エキソ型およびエンド型のいずれのアミラーゼを使用してもよい。アミラーゼの例としては、エキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３；グルコシダーゼとも呼ばれる）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、エキソ−イソマルトトリヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９５）、エキソ−マルトテトラオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）、エキソ−マルトヘキサオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９８）が挙げられる。   Amylase is a general term for enzymes that hydrolyze starch. There are two types of amylases: an exo-type that separates a specific number of glucose units from the non-reducing end, and an endo-type that has a nearly random degradation mode. When amylase is used in the present invention, either exo-type or endo-type amylase may be used. Examples of amylases include exo-1,4-α-D-glucosidase (EC 3.2.1.3; also called glucosidase), β-amylase (EC 3.2.1.3), exo-isomalt trihydrolase. (EC 3.2.1.95), exo-maltotetraohydrolase (EC 3.2.1.60), exo-malto hexaohydrolase (EC 3.2.1.98).

（１２．β−１，４−グルカン）
本発明において、出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用することが可能である。本明細書中では「β−１，４−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、β−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。β−１，４−グルカンは、直鎖状の分子であり得る。直鎖状β−グルカンとβ−１，４−グルカンとセルロースとは同義語である。直鎖状β−グルカンでは、β−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。１分子のβ−１，４−グルカンに含まれる糖単位の数を、このβ−１，４−グルカンの重合度という。β−１，４−グルカンの重合度は、好ましくは、約２〜約１０であり、より好ましくは約２〜約８であり、より好ましくは約２〜約５である。重合度が約２〜約１０のβ−１，４−グルカンを、セロオリゴ糖ともいう。重合度が２のβ−１，４−グルカンを特に、セロビオースという。重合度が３のβ−１，４−グルカンをセロトリオースという。重合度が４のβ−１，４−グルカンをセロテトラオースという。β−１，４−グルカンの重合度が低いほど溶解度が高く、取り扱いが容易であるので、重合度の低いβ−１，４−グルカンがより好ましい。β−１，４−グルカンは、あらゆる植物中に存在する。β−１，４−グルカンは、植物から単離されたまま未改変のものであってもよく、植物から単離したものを化学的または酵素的に処理することによって得られたものであってもよい。β−１，４−グルカンはまた、古紙、建材、古布などの廃棄物から再生されるセルロースまたはそれから調製されたものであってもよい。例えば、植物から単離した高分子量のセルロースに対してセルラーゼを作用させることによって、より低分子量のセロオリゴ糖が得られる。植物からセロオリゴ糖を大量に生産する方法は当該分野で公知である。このような文献の例としては、特開２００１−９５５９４号公報が挙げられる。β−１，４−グルカンは、β−１，４−グルカンを含む植物破砕液から精製β−１，４−グルカンに至るいずれの生成段階のものとして提供されてもよい。本発明の方法で使用されるβ−１，４−グルカンは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明で用いる酵素の作用を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。 (12. β-1,4-glucan)
In the present invention, β-1,4-glucan can be used as a starting material. In the present specification, “β-1,4-glucan” is a saccharide having D-glucose as a constituent unit, and saccharide units linked by β-1,4-glucoside bonds are at least two saccharide units or more. The sugar which has. β-1,4-glucan can be a linear molecule. Linear β-glucan, β-1,4-glucan and cellulose are synonymous. In a linear β-glucan, sugar units are linked only by β-1,4-glucoside bonds. The number of sugar units contained in one molecule of β-1,4-glucan is referred to as the degree of polymerization of this β-1,4-glucan. The degree of polymerization of β-1,4-glucan is preferably about 2 to about 10, more preferably about 2 to about 8, and more preferably about 2 to about 5. Β-1,4-glucan having a degree of polymerization of about 2 to about 10 is also referred to as cellooligosaccharide. Β-1,4-glucan having a degree of polymerization of 2 is particularly called cellobiose. Β-1,4-glucan having a polymerization degree of 3 is called cellotriose. Β-1,4-glucan having a degree of polymerization of 4 is called cellotetraose. The lower the degree of polymerization of β-1,4-glucan, the higher the solubility and the easier the handling. Therefore, β-1,4-glucan having a low degree of polymerization is more preferable. β-1,4-glucan is present in every plant. β-1,4-glucan may be unmodified as it is isolated from a plant, or obtained by chemically or enzymatically treating a product isolated from a plant. Also good. The β-1,4-glucan may also be cellulose regenerated from waste such as waste paper, building materials, waste cloth, or prepared therefrom. For example, a cellulooligosaccharide having a lower molecular weight can be obtained by allowing cellulase to act on a high molecular weight cellulose isolated from a plant. Methods for producing cellooligosaccharides in large quantities from plants are known in the art. An example of such a document is Japanese Patent Laid-Open No. 2001-95594. β-1,4-glucan may be provided in any production stage from plant disruption liquid containing β-1,4-glucan to purified β-1,4-glucan. The β-1,4-glucan used in the method of the present invention is preferably pure. However, any other impurities may be included as long as the action of the enzyme used in the present invention is not inhibited.

出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用する実施形態において、反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンの濃度は、好ましくは約０．１重量％以上であり、より好ましくは約０．５重量％以上であり、さらに好ましくは約１重量％以上であり、特に好ましくは約２重量％以上であり、最も好ましくは約３重量％以上である。出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用する実施形態において、反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンの濃度は、好ましくは約４０重量％以下であり、より好ましくは約３０重量％以下であり、さらに好ましくは約２０重量％以下であり、特に好ましくは約１５重量％以下であり、最も好ましくは約１２重量％以下である。なお、本明細書中でβ−１，４−グルカンの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（β−１，４−グルカンの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。β−１，４−グルカンの重量が多すぎると、溶液中に未反応のβ−１，４−グルカンが析出する場合がある。β−１，４−グルカンの使用量が少なすぎると、高温での反応において、反応自体は起こるものの、収率が低下する場合がある。 In embodiments using β-1,4-glucan as a starting material, the concentration of β-1,4-glucan contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 0.1 wt% or more, more Preferably it is about 0.5% by weight or more, more preferably about 1% by weight or more, particularly preferably about 2% by weight or more, and most preferably about 3% by weight or more. In embodiments where β-1,4-glucan is used as a starting material, the concentration of β-1,4-glucan contained in the solution at the start of the reaction is preferably about 40% by weight or less, more preferably About 30% by weight or less, more preferably about 20% by weight or less, particularly preferably about 15% by weight or less, and most preferably about 12% by weight or less. In the present specification, the concentration of β-1,4-glucan is Weight / Volume, that is,
(Weight of β-1,4-glucan) × 100 / (volume of solution)
Calculate with If the weight of β-1,4-glucan is too large, unreacted β-1,4-glucan may precipitate in the solution. If the amount of β-1,4-glucan used is too small, the reaction itself may occur in the reaction at a high temperature, but the yield may decrease.

（１３．枝切り酵素）
本発明の方法において、プライマーとしてα−１，６−グルコシド結合を含有するものを用いる場合などの、生成物に分岐が生じる場合には、必要に応じて、枝切り酵素を用いることができる。 (13. Debranching enzyme)
In the method of the present invention, a debranching enzyme can be used as necessary when the product is branched, such as when a primer containing an α-1,6-glucoside bond is used.

本発明で用いられ得る枝切り酵素は、α−１，６−グルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロペクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）と、アミロペクチン、グリコーゲンおよびプルランに作用するα−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ（プルラナーゼともいう）（ＥＣ ３．２．１．４１）との２つに分類される。   The debranching enzyme that can be used in the present invention is an enzyme that can cleave an α-1,6-glucoside bond. The debranching enzymes are isoamylase (EC 3.2.1.68), which acts well on both amylopectin and glycogen, and α-dextrin endo-1,6-α-glucosidase (also called pullulanase), which acts on amylopectin, glycogen and pullulan. Say) (EC 3.2.1.41).

枝切り酵素は、微生物および植物に存在する。枝切り酵素を産生する微生物の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウダイコンなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する生物はこれらに限定されない。 Debranching enzymes are present in microorganisms and plants. Examples of microorganisms that produce a debranching enzyme include Saccharomyces cerevisiae, Chlamydomonas
sp. , Bacillus brevis, Bacillus acidopululyticus, Bacillus macerans, Bacillus stearothermophilus, Bacillus circulans, Thermus
aquaticus, Klebsiella pneumoniae, Thermoactinomyces thalophilus, Thermoanaerobacter ethanolicus, Pseudomonas amyloderamosa and the like. Examples of plants that produce a debranching enzyme include potato, sweet potato, corn, rice, wheat, barley, oat, sugar beet, and the like. The organism that produces the debranching enzyme is not limited to these.

本発明で用いられ得る枝切り酵素は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することが好ましく、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することがより好ましい。本発明で用いられる枝切り酵素は、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い枝切り酵素は、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。   The debranching enzyme that can be used in the present invention is preferably derived from Klebsiella pneumoniae, Bacillus brevis, Bacillus acidopullulyticus, Pseudomonas amyroderamosa, and preferably from Klebsiella pneumoniae, Pseudomonamoe, Pleumoniae. The debranching enzyme used in the present invention preferably has a high optimum reaction temperature. A debranching enzyme having a high optimum reaction temperature can be derived, for example, from a highly thermophilic bacterium.

（１４．ブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．１８））
本発明の方法において、生成物に分岐を生じさせることが所望される場合には、必要に応じて、ブランチングエンザイムを用いることができる。 (14. Branching enzyme (EC 2.4.1.18))
In the method of the present invention, a branching enzyme can be used as needed when it is desired to cause branching in the product.

本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、α−１，４−グルカン鎖の一部をこのα−１，４−グルカン鎖のうちのあるグルコース残基の６位に転移して分枝を作り得る酵素である。ブランチングエンザイムは、１，４−α−グルカン分枝酵素、枝つくり酵素またはＱ酵素とも呼ばれる。   The branching enzyme that can be used in the present invention makes a branch by transferring a part of the α-1,4-glucan chain to the 6-position of a certain glucose residue in the α-1,4-glucan chain. It is an enzyme to obtain. The branching enzyme is also called 1,4-α-glucan branching enzyme, branching enzyme or Q enzyme.

ブランチングエンザイムは、微生物、動物、および植物に存在する。ブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｌｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、酵母などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する動物の例としてはヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。   The branching enzyme is present in microorganisms, animals and plants. Examples of microorganisms producing the branching enzyme, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus caldolyticus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus caldovelox, Bacillus thermocatenulatus, Bacillus smithii, Bacillus megaterium, Bacillus brevis, Alkalophillic Bacillus sp. , Streptomyces coelicolor, Aquifex aeolicus, Synechosystis sp. , E.C. E. coli, Agrobacterium tumefaciens, Thermus aquaticus, Rhodothermus obamesis, Neurospora crassa, yeast and the like. Examples of animals that produce the branching enzyme include mammals such as humans, rabbits, rats, and pigs. Examples of plants that produce branching enzymes include algae, potatoes, sweet potatoes, yams, cassava and other varieties, spinach and other vegetables, corn, rice, wheat, barley, rye, millet and other grains, peas , Beans such as soybeans, red beans and quail beans. The organism that produces the branching enzyme is not limited to these.

本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、ジャガイモ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することが好ましく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられるブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いブランチングエンザイムは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。   The branching enzyme that can be used in the present invention is preferably derived from potato, Bacillus stearothermophilus, Aquifex aeolicus, and more preferably derived from Bacillus stearothermophilus, Aquifex aeolicus. The branching enzyme used in the present invention preferably has a high optimum reaction temperature. A branching enzyme having a high optimum reaction temperature can be derived from, for example, a highly thermophilic bacterium.

（１５．４−α−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．１．２５））
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、４−α−グルカノトランスフェラーゼを用いることができる。 (15.4-α-glucanotransferase (EC 2.4.1.25))
In the method of the present invention, when a cyclic structure is generated in the product, 4-α-glucanotransferase can be used as necessary.

本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ディスプロポーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、アミロマルターゼ、不均化酵素などとも呼ばれ、マルトオリゴ糖の糖転移反応（不均一化反応）を触媒し得る酵素である。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基あるいは、マルトシルもしくはマルトオリゴシルユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。   The 4-α-glucanotransferase that can be used in the present invention is also called a disposing enzyme, D-enzyme, amylomaltase, disproportionating enzyme, etc., and performs a sugar transfer reaction (heterogeneous reaction) of maltooligosaccharide. An enzyme that can be catalyzed. 4-α-glucanotransferase is an enzyme that transfers a glucosyl group or a maltosyl or maltooligosyl unit from the non-reducing end of the donor molecule to the non-reducing end of the acceptor molecule. Thus, the enzymatic reaction results in a heterogeneity of the degree of polymerization of the initially given maltooligosaccharide. If the donor molecule and the acceptor molecule are the same, an intramolecular transition occurs, resulting in a product having a cyclic structure.

４−α−グルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆、などの豆類などが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。   4-α-glucanotransferase is present in microorganisms and plants. Examples of microorganisms producing the 4-alpha-glucanotransferase, Aquifex aeolicus, Streptococcus pneumoniae, Clostridium butylicum, Deinococcus radiodurans, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis, Thermococcus litralis, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Chlamydia psittaci, Pyrococcus sp. , Dictyoglomus thermophilum, Borrelia burgdorferi, Synechocystis sp. , E.C. E. coli, Thermus aquaticus and the like. Examples of plants that produce 4-α-glucanotransferase include potatoes, sweet potatoes, yams, cassava and other cereals, corn, rice, wheat, and other grains, peas, soybeans, and other beans. It is done. The organism producing 4-α-glucanotransferase is not limited to these.

本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｒａｌｉｓに由来することが好ましく、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い４−α−グルカノトランスフェラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。   The 4-α-glucanotransferase that can be used in the present invention is preferably derived from potato, Thermus aquaticus, Thermococcus litoralis, and more preferably derived from potato, Thermus aquaticus. The 4-α-glucanotransferase used in the present invention preferably has a high optimum reaction temperature. 4-α-glucanotransferase having a high optimum reaction temperature can be derived from, for example, a highly thermophilic bacterium.

（１６．グリコーゲンデブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．２５／ＥＣ．３．２．１．３３））
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、グリコーゲンデブランチングエンザイムを用いることができる。 (16. Glycogen debranching enzyme (EC 2.4.1.25/EC 3.2.1.33))
In the method of the present invention, a glycogen debranching enzyme can be used if necessary to produce a cyclic structure in the product.

本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、α−１，６−グルコシダーゼ活性と、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性との２種類の活性をもつ酵素である。グリコーゲンデブランチングエンザイムが持つ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性により、環状構造を持つ生成物が得られる。   The glycogen debranching enzyme that can be used in the present invention is an enzyme having two types of activities, α-1,6-glucosidase activity and 4-α-glucanotransferase activity. A product having a cyclic structure is obtained by the 4-α-glucanotransferase activity of the glycogen debranching enzyme.

グリコーゲンデブランチングエンザイムは、微生物および動物に存在する。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、酵母などが挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。   Glycogen debranching enzymes are present in microorganisms and animals. Examples of microorganisms that produce glycogen debranching enzymes include yeast. Examples of animals that produce glycogen debranching enzymes include mammals such as humans, rabbits, rats, and pigs. Organisms that produce glycogen debranching enzymes are not limited to these.

本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、酵母に由来することが好ましい。本発明で用いられるグリコーゲンデブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグリコーゲンデブランチングエンザイムは、例えば、タンパク質工学的手法により、中温で作用し得る酵素に改変を加えることで得られる。   The glycogen debranching enzyme that can be used in the present invention is preferably derived from yeast. The glycogen debranching enzyme used in the present invention preferably has a high optimum reaction temperature. A glycogen debranching enzyme having a high optimum reaction temperature can be obtained, for example, by modifying an enzyme that can act at an intermediate temperature by a protein engineering technique.

（１７．本発明で使用される酵素についての一般的説明）
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物が天然で有するその酵素のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有することをいう。ある生物の有するある酵素をその生物から直接単離した場合も、遺伝子組換え技術を用いてその生物の有するアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する酵素を別の生物から得た場合も、その生物に由来するという。人工合成された遺伝子であっても同じ配列を有する場合はその生物に由来するという。場合によっては、それらの場合を含めて、その生物から得られた酵素という。例えば、あの生物から入手したある酵素をコードする核酸分子を大腸菌に導入して、その大腸菌からその酵素を単離する場合も、その酵素は「その生物に由来する」または「その生物から得られた」という。 (17. General description of the enzyme used in the present invention)
In the present specification, “derived from” an organism having an enzyme means having the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the enzyme that the organism naturally has. Whether you have isolated an enzyme from one organism directly from that organism or obtained an enzyme from another organism that has the same amino acid sequence as that organism using genetic recombination technology, It comes from. Even an artificially synthesized gene is said to be derived from the organism if it has the same sequence. In some cases, including those cases, an enzyme obtained from the organism. For example, when a nucleic acid molecule encoding an enzyme obtained from the organism is introduced into E. coli and the enzyme is isolated from the E. coli, the enzyme is derived from the organism or obtained from the organism. "

本発明で用いられる各種酵素は、各酵素について記載したような、自然界に存在する、その酵素を産生する生物から直接単離された酵素であってよい。あるいは、本発明で用いられる各種酵素は、その酵素を産生する生物から単離した、その酵素をコードする核酸分子を用いて組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離した酵素であってもよい。   The various enzymes used in the present invention may be enzymes that are directly isolated from living organisms that produce the enzyme, as described for each enzyme, in nature. Alternatively, the various enzymes used in the present invention are enzymes isolated from microorganisms (for example, bacteria, fungi, etc.) that have been isolated from organisms that produce the enzymes and recombined with nucleic acid molecules that encode the enzymes. It may be.

本発明においては、天然の酵素と同等以上の酵素活性を有するのであれば、そのアミノ酸配列の一部が改変された酵素を使用してもよい。改変された酵素が使用される場合、この改変された酵素は、天然の酵素に対して、好ましくは少なくとも約８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、最も好ましくは約９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。好ましくは、この改変された酵素は、天然の酵素に対して１または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を有する。このような置換、欠失または付加は、保存的なものであることが好ましい。このような置換、欠失または付加は、酵素の非活性部位に存在することが好ましい。天然の酵素活性に悪影響を及ぼさずにアミノ酸の置換、欠失または付加をする方法は、当業者に公知である。好ましくは、この改変された酵素は、天然の酵素と比較して約９０％以上の活性を有し、より好ましくは約９５％以上の活性を有し、さらに好ましくは約１００％以上の活性を有する。このような改変された酵素は、当業者に公知の方法によって作製され得る。   In the present invention, an enzyme having a partially modified amino acid sequence may be used as long as it has an enzyme activity equivalent to or higher than that of a natural enzyme. When a modified enzyme is used, the modified enzyme preferably has at least about 80% or more amino acid sequence identity to the native enzyme, more preferably at least about 90% or more amino acids. Have sequence identity, most preferably about 95% or more amino acid sequence identity. Preferably, the modified enzyme has one or several amino acid substitutions, deletions or additions to the native enzyme. Such substitutions, deletions or additions are preferably conservative. Such substitutions, deletions or additions are preferably present in the inactive site of the enzyme. Methods for making amino acid substitutions, deletions or additions without adversely affecting the natural enzyme activity are known to those skilled in the art. Preferably, the modified enzyme has an activity of about 90% or more, more preferably about 95% or more, more preferably about 100% or more compared to the natural enzyme. Have. Such modified enzymes can be made by methods known to those skilled in the art.

本発明の方法で用いられる各種酵素は、例えば、以下のようにして調製され得る。まず、その酵素を産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）を培養する。この微生物は、その酵素を直接生産する微生物であってもよい。また、その酵素をコードする核酸分子をクローン化し、得られた核酸分子で、その酵素の発現に有利な微生物（例えば、細菌、真菌など）を組換えして、組換えされた微生物を得、得られた微生物からその酵素を得てもよい。   Various enzymes used in the method of the present invention can be prepared, for example, as follows. First, microorganisms (for example, bacteria, fungi, etc.) that produce the enzyme are cultured. This microorganism may be a microorganism that directly produces the enzyme. In addition, a nucleic acid molecule encoding the enzyme is cloned, and the obtained nucleic acid molecule is used to recombine a microorganism (for example, bacteria, fungi, etc.) advantageous for the expression of the enzyme to obtain a recombinant microorganism, The enzyme may be obtained from the obtained microorganism.

各種酵素をコードする核酸分子での組換えに用いられる微生物は、各種酵素の発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。アミラーゼは、生成されたグルカンを分解してしまうので、本発明のアミロース合成方法に使用される各種酵素は、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましい。従って、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。各種酵素の遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される各種酵素は、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。   Microorganisms used for recombination with nucleic acid molecules encoding various enzymes are easily selected in consideration of various conditions such as ease of expression of various enzymes, ease of culture, speed of growth, and safety. obtain. Since amylase degrades the produced glucan, it is preferable that the various enzymes used in the amylose synthesis method of the present invention do not contain amylase as a contaminant. Therefore, it is preferable to use a microorganism (eg, bacterium, fungus, etc.) that does not produce amylase or express only at a low level for genetic recombination. For gene recombination of various enzymes, mesophilic bacteria such as Escherichia coli or Bacillus subtilis are preferably used. Various enzymes produced using microorganisms that do not produce amylase or that are expressed only at low levels (eg, bacteria, fungi, etc.) are substantially free of amylase and are therefore preferred for use in the methods of the present invention.

クローン化した遺伝子での微生物（例えば、細菌、真菌など）の遺伝子組換えは、当業者に周知の方法に従って行われ得る。クローン化した遺伝子を用いる場合、この遺伝子を、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結することが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターと遺伝子とが、そのプロモーターによって遺伝子の発現が調節されるように連結されることをいう。誘導性プロモーターを用いる場合、培養を、誘導条件下で行うことが好ましい。種々の誘導性プロモーターは当業者に公知である。   Genetic recombination of microorganisms (eg, bacteria, fungi, etc.) with cloned genes can be performed according to methods well known to those skilled in the art. When using a cloned gene, it is preferred that this gene be operably linked to a constitutive or inducible promoter. “Operably linked” means that a promoter and a gene are linked so that expression of the gene is regulated by the promoter. When using an inducible promoter, culturing is preferably performed under inducing conditions. Various inducible promoters are known to those skilled in the art.

クローン化した遺伝子について、生産される各種酵素が菌体外に分泌されるように、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をこの遺伝子に連結し得る。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は当業者に公知である。   For the cloned gene, a nucleotide sequence encoding a signal peptide can be linked to this gene so that various enzymes produced are secreted outside the cell. Nucleotide sequences that encode signal peptides are known to those of skill in the art.

当業者は、各種酵素を生産するために、微生物（例えば、細菌、真菌など）の培養の条件を適切に設定し得る。微生物の培養に適切な培地、各誘導性プロモーターに適切な誘導条件などは当業者に公知である。   Those skilled in the art can appropriately set conditions for culturing microorganisms (eg, bacteria, fungi, etc.) in order to produce various enzymes. A medium suitable for culturing microorganisms, conditions for induction suitable for each inducible promoter, and the like are known to those skilled in the art.

例えば、発現された酵素が形質転換細胞内に蓄積する場合、形質転換細胞を適切な条件下で培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を回収し、次いで適切な緩衝液に懸濁する。次いで超音波処理などにより細胞を破砕した後、遠心分離もしくは濾過することによって上清を得る。あるいは、発現された酵素が形質転換細胞外に分泌される場合、このようにして形質転換細胞を培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を分離して上清を得る。目的の酵素が形質転換細胞内に蓄積する場合も、形質転換細胞外に分泌される場合も、このようにして得られた酵素含有上清を通常の手段（例えば、塩析法、溶媒沈澱、限外濾過）を用いて濃縮し、酵素を含む画分を得る。この画分を濾過、あるいは遠心分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液を、凍結乾燥、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせることによって、比活性が向上した粗酵素あるいは精製酵素が得られる。α−アミラーゼなどのグルカンを加水分解する酵素が含まれていなければ、粗酵素をそのまま、例えば、α−グルカンの製造に用い得る。   For example, if the expressed enzyme accumulates in the transformed cells, after culturing the transformed cells under appropriate conditions, the cells are harvested by centrifuging or filtering the culture, and then in an appropriate buffer. Suspend. Next, after disrupting the cells by sonication or the like, the supernatant is obtained by centrifugation or filtration. Alternatively, when the expressed enzyme is secreted outside the transformed cells, the transformed cells are cultured in this manner, and then the cells are separated by centrifuging or filtering the culture to obtain a supernatant. Whether the target enzyme accumulates in the transformed cell or is secreted to the outside of the transformed cell, the enzyme-containing supernatant thus obtained can be obtained by conventional means (for example, salting out, solvent precipitation, Concentrate using ultrafiltration to obtain a fraction containing the enzyme. This fraction is filtered or subjected to treatment such as centrifugation and desalting to obtain a crude enzyme solution. Furthermore, a crude enzyme or a purified enzyme having an improved specific activity can be obtained by appropriately combining the crude enzyme solution with conventional enzyme purification means such as freeze-drying, isoelectric focusing, ion exchange chromatography, and crystallization. . If an enzyme that hydrolyzes glucan such as α-amylase is not included, the crude enzyme can be used as it is, for example, for the production of α-glucan.

各種酵素は、精製されていても未精製であってもよい。各種酵素は、固定化されていても固定化されていなくともよい。各種酵素は、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。各種酵素は、担体上に固定化されていることが好ましい。   Various enzymes may be purified or unpurified. Various enzymes may or may not be immobilized. Various enzymes are preferably immobilized. Examples of the immobilization method include methods well known to those skilled in the art, such as a carrier binding method (for example, a covalent bonding method, an ionic bonding method, or a physical adsorption method), a crosslinking method, or an entrapment method (lattice type or microcapsule type). Can be used. Various enzymes are preferably immobilized on a carrier.

（１８．溶媒）
本発明の方法に用いる溶媒は、本発明で用いられる各種酵素の酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。 (18. Solvent)
The solvent used in the method of the present invention may be any solvent as long as it does not impair the enzyme activity of various enzymes used in the present invention.

なお、グルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の方法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、グルコースなどの反応材料も全てが溶解している必要はなく、反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。   In addition, as long as reaction which produces | generates glucan can advance, it is not necessary for a solvent to melt | dissolve the material used for the method of this invention completely. For example, when the enzyme is supported on a solid support, the enzyme does not need to be dissolved in a solvent. Furthermore, it is not necessary that all reaction materials such as glucose are dissolved, and it is sufficient that a part of the material capable of proceeding the reaction is dissolved.

代表的な溶媒は、水である。溶媒は、各種酵素を調製する際に得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。   A typical solvent is water. The solvent may be water in the cell disruption solution obtained when preparing various enzymes.

水は、軟水、中間水および硬水のいずれであってもよい。硬水とは、硬度２０°以上の水をいい、中間水とは、硬度１０°以上２０°未満の水をいい、軟水とは、硬度１０°未満の水をいう。水は、好ましくは軟水または中間水であり、より好ましくは軟水である。   The water may be any of soft water, intermediate water and hard water. Hard water refers to water having a hardness of 20 ° or more, intermediate water refers to water having a hardness of 10 ° to less than 20 °, and soft water refers to water having a hardness of less than 10 °. The water is preferably soft water or intermediate water, more preferably soft water.

（１９．他の成分）
本発明で使用される溶液中には、目的の反応を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、各種酵素を産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。 (19. Other ingredients)
The solution used in the present invention may contain any other substance as long as it does not interfere with the target reaction. Examples of such substances include buffers, components of microorganisms (eg, bacteria, fungi, etc.) that produce various enzymes, salts, medium components, and the like.

＜α−グルカンの製造＞
１つの実施形態では、本発明のα−グルカンは、グルコースと、ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法によって製造される。 <Production of α-glucan>
In one embodiment, the α-glucan of the present invention reacts with a solution containing glucose, polyphosphate, primer, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase. And α-glucan.

別の実施形態では、本発明のα−グルカンは、グルコース−６−リン酸と、プライマーと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法によって製造される。   In another embodiment, α-glucan of the present invention reacts with a solution containing glucose-6-phosphate, a primer, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase to react with α-glucan. Manufactured by a method including a manufacturing step.

別の実施形態では、本発明のα−グルカンは、セロビオースと、ポリリン酸と、プライマーと、セロビオースホスホリラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法によって製造される。   In another embodiment, the α-glucan of the present invention is a solution comprising cellobiose, polyphosphate, primer, cellobiose phosphorylase, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase. Is reacted to produce α-glucan.

別の実施形態では、本発明のα−グルカンは、フルクトースと、ポリリン酸と、プライマーと、グルコースイソメラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法によって製造される。   In another embodiment, the α-glucan of the present invention is a solution comprising fructose, polyphosphate, primer, glucose isomerase, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase. Is reacted to produce α-glucan.

別の実施形態では、本発明のα−グルカンは、デンプンをアミラーゼによってグルコースに分解する工程；アミラーゼを失活させる工程；ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法によって製造される。   In another embodiment, the α-glucan of the present invention comprises degrading starch into glucose by amylase; inactivating amylase; polyphosphate, primer, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, α It is produced by a method including a step of producing α-glucan by reacting a solution containing -1,4-glucan phosphorylase.

図１５に、これらの方法をまとめて記載する。本発明の最も基本的な方法は、Ｇ６−ＰからＧ１−Ｐを経てアミロース、デンプン、グリコーゲンなどのα−グルカンを製造する方法である。Ｇ６−Ｐは、グルコースおよびポリリン酸にＰＧＫを作用させることにより生成され得る。グルコースは、フルクトースにグルコースイソメラーゼを作用させることによって生成され得る。グルコースはまた、セルロースにセルラーゼ、セロビオースホスホリラーゼなどを作用させることによって生成され得る。グルコースはまた、デンプンにアミラーゼを作用させることによって生成され得る。生成物であるα−グルカンを分解してしまうアミラーゼを使用する方法を除けば、これらのグルコースを生成する方法は、グルコースからＧ６−Ｐを経て、次いでＧ１−Ｐを経てα−グルカンを製造する方法と同一の溶液中で同時に行われ得る。   FIG. 15 summarizes these methods. The most basic method of the present invention is a method for producing α-glucan such as amylose, starch and glycogen from G6-P via G1-P. G6-P can be produced by acting PGK on glucose and polyphosphate. Glucose can be produced by allowing glucose isomerase to act on fructose. Glucose can also be produced by allowing cellulase, cellobiose phosphorylase, etc. to act on cellulose. Glucose can also be produced by acting amylase on starch. Except for the method of using amylase that degrades the product α-glucan, these methods for producing glucose produce α-glucan from glucose via G6-P and then G1-P. It can be performed simultaneously in the same solution as the method.

本発明の製造方法においては例えば、まず、溶液を調製する。溶液は、例えば、適切な溶媒に、反応に使用する各種物質を添加することにより調製され得る。あるいは、溶液は、反応に使用する各種物質をそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、溶液は、反応に使用する各種物質のうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。本発明の製造方法で用いられる溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この溶液のｐＨは、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意のｐＨであり得る。ｐＨ値は、好ましくは約５．７〜約１１であり、より好ましくは約７．４〜約８．５である。ｐＨは、反応に用いる酵素の至適ｐＨに合わせて適切に設定され得る。溶液の塩濃度もまた、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意の塩濃度であり得る。ＰＧＭはＭｇイオンを必要とするため、ＭｇＣｌ_２などのＭｇイオンを放出する物質を溶液に添加することが好ましい。Ｍｇイオンを放出する物質の、反応開始時の溶液中での濃度は、好ましくは約２０ｍＭ以上であり、より好ましくは約３０ｍＭ以上であり、さらに好ましくは約４０ｍＭ以上である。Ｍｇイオンを放出する物質の、反応開始時の溶液中での濃度は、好ましくは約１００ｍＭ以下であり、より好ましくは約８０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約６０ｍＭ以下である。 In the production method of the present invention, for example, first, a solution is prepared. The solution can be prepared, for example, by adding various substances used for the reaction to an appropriate solvent. Alternatively, the solution may be prepared by mixing solutions each containing various substances used for the reaction. Alternatively, the solution may be prepared by mixing other solid components with a solution containing some of the various materials used in the reaction. Any buffer may be added to the solution used in the production method of the present invention for the purpose of adjusting the pH, if necessary, as long as the enzyme reaction is not inhibited. The pH of this solution can be any pH as long as it does not excessively inhibit the enzyme reaction. The pH value is preferably about 5.7 to about 11, and more preferably about 7.4 to about 8.5. The pH can be appropriately set according to the optimum pH of the enzyme used for the reaction. The salt concentration of the solution can also be any salt concentration as long as it does not unduly inhibit the enzyme reaction. Since PGM requires Mg ions, it is preferable to add a substance that releases Mg ions such as MgCl ₂ to the solution. The concentration of the substance that releases Mg ions in the solution at the start of the reaction is preferably about 20 mM or more, more preferably about 30 mM or more, and further preferably about 40 mM or more. The concentration of the substance that releases Mg ions in the solution at the start of the reaction is preferably about 100 mM or less, more preferably about 80 mM or less, and even more preferably about 60 mM or less.

また、この溶液には、必要に応じて枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。これらの酵素は、α−グルカン合成反応の開始時に添加されてもよく、反応の途中に添加されてもよく、また、反応が終了した後に添加されてもよい。   Moreover, you may add the enzyme selected from the group which consists of a debranching enzyme, a branching enzyme, 4-alpha-glucanotransferase, and a glycogen debranching enzyme to this solution as needed. These enzymes may be added at the start of the α-glucan synthesis reaction, may be added during the reaction, or may be added after the reaction is completed.

さらに、この溶液には、ゲスト化合物を添加してもよい。ゲスト化合物は、反応開始時にこの溶液中に含有されてもよく、あるいは、反応がある程度進んだ時点で反応溶液に添加されてもよい。ゲスト化合物としてＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度は、好ましくは約０．１ｍＭ以上であり、より好ましくは約１ｍＭ以上であり、さらに好ましくは約１０ｍＭ以上であり；この化合物の濃度は、好ましくは約５０ｍＭ以下であり、より好ましくは約２０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約１５ｍＭ以下である。ゲスト化合物としてＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度が１０ｍＭであると、コントロール（ゲスト化合物を添加しない場合）の約１．５倍の収率を得ることができるという顕著な効果が得られる。   Further, a guest compound may be added to this solution. The guest compound may be contained in this solution at the start of the reaction, or may be added to the reaction solution when the reaction has progressed to some extent. When N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate is used as a guest compound, the concentration of this compound is preferably about 0.1 mM or more, more preferably about 1 mM or more. More preferably about 10 mM or more; the concentration of this compound is preferably about 50 mM or less, more preferably about 20 mM or less, and even more preferably about 15 mM or less. When N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate is used as a guest compound, if the concentration of this compound is 10 mM, about 1.5 of the control (when no guest compound is added) is used. The remarkable effect that a double yield can be obtained is obtained.

ゲスト化合物として３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度は、好ましくは約０．１ｍＭ以上であり、より好ましくは約１ｍＭ以上であり、さらに好ましくは約１０ｍＭ以上であり；この化合物の濃度は、好ましくは約５０ｍＭ以下であり、より好ましくは約２０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約１５ｍＭ以下である。ゲスト化合物として３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度が１ｍＭ〜１０ｍＭであると、コントロール（ゲスト化合物を添加しない場合）の約１．８倍〜約２倍の収率を得ることができるという顕著な効果が得られる。   When 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate is used as the guest compound, the concentration of this compound is preferably about 0.1 mM or more, more preferably about 1 mM or more, and still more preferably The concentration of the compound is preferably about 50 mM or less, more preferably about 20 mM or less, and even more preferably about 15 mM or less. When 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate is used as a guest compound, if the concentration of this compound is 1 mM to 10 mM, about 1.8 times the control (when no guest compound is added) The remarkable effect that the yield of about 2 times can be obtained is acquired.

ゲスト化合物として３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度は、好ましくは約０．１ｍＭ以上であり、より好ましくは約１ｍＭ以上であり、さらに好ましくは約１０ｍＭ以上であり；この化合物の濃度は、好ましくは約５０ｍＭ以下であり、より好ましくは約２０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約１５ｍＭ以下である。ゲスト化合物として３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度が１０ｍＭであると、コントロール（ゲスト化合物を添加しない場合）の約２．７倍の収率を得ることができるという顕著な効果が得られる。   When 3- (N, N-dimethylpalmityl-ammonio) propanesulfonate is used as the guest compound, the concentration of this compound is preferably about 0.1 mM or more, more preferably about 1 mM or more, and further preferably The concentration of the compound is preferably about 50 mM or less, more preferably about 20 mM or less, and even more preferably about 15 mM or less. When 3- (N, N-dimethylpalmityl-ammonio) propane sulfonate is used as a guest compound, the concentration of this compound is 10 mM, which is about 2.7 times the control (when no guest compound is added). The remarkable effect that the rate can be obtained is obtained.

次いで、溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。溶液の温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり、添加した酵素がその活性を示す温度である。例えば、耐熱性酵素を用い、反応温度をその耐熱酵素に最適な温度にすることによって、添加した耐熱性酵素以外の混入した酵素の活性を抑え得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれる各種酵素の活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。反応に使用する各種酵素の反応至適温度がいずれも約３０℃〜４０℃の範囲内である場合、反応温度は、好ましくは約２５℃以上であり、より好ましくは約３０℃以上であり；反応温度は、好ましくは約５０℃以下であり、より好ましくは約４０℃以下である。反応に使用する各種酵素がいずれも耐熱性酵素である場合、反応温度は、その耐熱性酵素の反応至適温度の±１０℃以内にあることが好ましく、±５℃以内にあることが好ましい。反応に使用する各種酵素の反応至適温度が幅広い範囲にわたる場合、反応温度は、その範囲内で適切に設定され得る。反応に使用する各種酵素の反応至適温度が±５℃以内にあることが好ましく、ほぼ同じであることが好ましい。   The solution is then reacted by heating as necessary by methods known in the art. The temperature of the solution is an arbitrary temperature as long as the effect of the present invention is obtained, and is a temperature at which the added enzyme exhibits its activity. For example, the activity of a mixed enzyme other than the added thermostable enzyme can be suppressed by using a thermostable enzyme and setting the reaction temperature to an optimum temperature for the thermostable enzyme. The temperature of the solution in this reaction step is preferably a temperature at which activity of about 50% or more, more preferably about 80% or more of the activity of various enzymes contained in this solution before the reaction remains after a predetermined reaction time. When the optimal reaction temperature of various enzymes used in the reaction is within the range of about 30 ° C. to 40 ° C., the reaction temperature is preferably about 25 ° C. or higher, more preferably about 30 ° C. or higher; The reaction temperature is preferably about 50 ° C. or lower, more preferably about 40 ° C. or lower. When each of the various enzymes used for the reaction is a thermostable enzyme, the reaction temperature is preferably within ± 10 ° C., and preferably within ± 5 ° C. of the optimum temperature of the thermostable enzyme. When the optimum reaction temperature of various enzymes used in the reaction covers a wide range, the reaction temperature can be appropriately set within the range. The optimum reaction temperature of various enzymes used in the reaction is preferably within ± 5 ° C., and preferably about the same.

グルコースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨ（反応開始時の溶液のｐＨ）は、好ましくは約５．７以上であり、より好ましくは約７．４以上である。グルコースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約１２．０以下であり、より好ましくは約１１．０以下であり、さらに好ましくは約８．５以下である。反応で使用する各酵素の代表的な至適ｐＨは、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓ由来のＰＧＫが約ｐＨ７．０であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＰＧＭが約ｐＨ７．５であり、そしてＧＰが約ｐＨ５．５である。初期ｐＨが低すぎるとアミロース合成収率が低くなるかまたはアミロースが合成されない。反応溶液の初期ｐＨを適切に調整することにより、約２０％程度のアミロース収率を得られる。   In an embodiment starting with glucose, the initial pH of the reaction solution (the pH of the solution at the start of the reaction) is preferably about 5.7 or higher, more preferably about 7.4 or higher. In embodiments where glucose is the starting material, the initial pH of the reaction solution is preferably about 12.0 or less, more preferably about 11.0 or less, and even more preferably about 8.5 or less. A typical optimum pH for each enzyme used in the reaction is about pH 7.0 for PGK from Microlunatus phosphovolas, about 7.5 for PGM from Escherichia coli, and about pH 5.5 for GP. . If the initial pH is too low, the amylose synthesis yield will be low or amylose will not be synthesized. By appropriately adjusting the initial pH of the reaction solution, an amylose yield of about 20% can be obtained.

Ｇ６−Ｐを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約７．３以上であり、より好ましくは約７．５以上である。Ｇ６−Ｐを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約１２．０以下であり、より好ましくは約１１．０以下であり、さらに好ましくは約８．５以下である。初期ｐＨが低すぎるとアミロース合成収率が低くなるかまたはアミロースが合成されない。反応溶液の初期ｐＨを適切に調整することにより、約２５％以上のアミロース収率を得られる。   In embodiments starting with G6-P, the initial pH of the reaction solution is preferably about 7.3 or higher, more preferably about 7.5 or higher. In an embodiment starting with G6-P, the initial pH of the reaction solution is preferably about 12.0 or less, more preferably about 11.0 or less, and even more preferably about 8.5 or less. . If the initial pH is too low, the amylose synthesis yield will be low or amylose will not be synthesized. By appropriately adjusting the initial pH of the reaction solution, an amylose yield of about 25% or more can be obtained.

セロビオースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約５．６以上であり、より好ましくは約７．５以上である。セロビオースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約１２以下であり、より好ましくは約８．５以下である。初期ｐＨが低すぎるとアミロース合成収率が低くなるかまたはアミロースが合成されない。反応溶液の初期ｐＨを適切に調整することにより、約６２％以上のアミロース収率を得られる。   In embodiments starting from cellobiose, the initial pH of the reaction solution is preferably about 5.6 or higher, more preferably about 7.5 or higher. In embodiments where cellobiose is the starting material, the initial pH of the reaction solution is preferably about 12 or less, more preferably about 8.5 or less. If the initial pH is too low, the amylose synthesis yield will be low or amylose will not be synthesized. By appropriately adjusting the initial pH of the reaction solution, an amylose yield of about 62% or more can be obtained.

グルコースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期グルコース濃度（反応開始時の溶液のグルコース濃度）は、好ましくは約１００ｍＭ以上であり、より好ましくは約２００ｍＭ以上であり、特に好ましくは約４００ｍＭ以上であり、最も好ましくは約５００ｍＭ以上である。グルコースを出発材料として用いる場合、溶液中に含まれるグルコースの濃度に特に上限はないが、例えば、約２．５Ｍ以下、約２Ｍ以下、約１．５Ｍ以下、約１Ｍ以下、約７５０ｍＭ以下などであり得る。グルコースの量が多すぎると、反応に適切な量のポリリン酸を溶解することができず、収率が低下する場合がある。グルコースの使用量が少なすぎると、アミロース合成の方向に反応が進まない場合がある。   In an embodiment starting with glucose, the initial glucose concentration of the reaction solution (the glucose concentration of the solution at the start of the reaction) is preferably about 100 mM or more, more preferably about 200 mM or more, and particularly preferably about 400 mM. Or more, and most preferably about 500 mM or more. When glucose is used as a starting material, there is no particular upper limit on the concentration of glucose contained in the solution. For example, the concentration is about 2.5 M or less, about 2 M or less, about 1.5 M or less, about 1 M or less, about 750 mM or less. possible. If the amount of glucose is too large, an amount of polyphosphoric acid appropriate for the reaction cannot be dissolved, and the yield may decrease. If the amount of glucose used is too small, the reaction may not proceed in the direction of amylose synthesis.

グルコース−６−リン酸を出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期グルコース−６−リン酸濃度（反応開始時の溶液のグルコース−６−リン酸濃度）は、好ましくは約２０ｍＭ以上であり、より好ましくは約１００ｍＭ以上であり、特に好ましくは約２００ｍＭ以上である。グルコース−６−リン酸を出発材料として用いる場合、溶液中に含まれるグルコース−６−リン酸の濃度に特に上限はないが、例えば、約２Ｍ以下、約１．５Ｍ以下、約１Ｍ以下、約７５０ｍＭ以下などであり得る。グルコース−６−リン酸の量が多すぎると溶解することができず、収率が低下する場合がある。グルコース−６−リン酸の使用量が少なすぎると、アミロース合成の方向に反応が進まない場合がある。   In embodiments starting with glucose-6-phosphate, the initial glucose-6-phosphate concentration of the reaction solution (the glucose-6-phosphate concentration of the solution at the start of the reaction) is preferably about 20 mM or more. More preferably, it is about 100 mM or more, and particularly preferably about 200 mM or more. When glucose-6-phosphate is used as a starting material, there is no particular upper limit to the concentration of glucose-6-phosphate contained in the solution. For example, about 2M or less, about 1.5M or less, about 1M or less, It can be 750 mM or less. When there is too much quantity of glucose-6-phosphate, it cannot melt | dissolve and a yield may fall. If the amount of glucose-6-phosphate used is too small, the reaction may not proceed in the direction of amylose synthesis.

セロビオースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期セロビオース濃度（反応開始時の溶液のセロビオース濃度）は、好ましくは約１００ｍＭ以上であり、より好ましくは約１５０ｍＭ以上であり、特に好ましくは約１７５ｍＭ以上である。セロビオースを出発材料として用いる場合、溶液中に含まれるセロビオースの濃度に特に上限はないが、例えば、約１．０Ｍ以下、約７５０ｍＭ以下、約５００ｍＭ以下、約２５０ｍＭ以下、約１２５ｍＭ以下などであり得る。セロビオースの量が多すぎると、セロビオースそのものや反応に適切な量のポリリン酸を溶解することができず、収率が低下する場合がある。セロビオースの使用量が少なすぎると、アミロース合成の方向に反応が進まない場合がある。   In an embodiment starting from cellobiose, the initial cellobiose concentration of the reaction solution (cellobiose concentration of the solution at the start of the reaction) is preferably about 100 mM or more, more preferably about 150 mM or more, particularly preferably about 175 mM. That's it. When cellobiose is used as a starting material, there is no particular upper limit to the concentration of cellobiose contained in the solution, but it may be, for example, about 1.0 M or less, about 750 mM or less, about 500 mM or less, about 250 mM or less, about 125 mM or less. . If the amount of cellobiose is too large, cellobiose itself or an amount of polyphosphoric acid suitable for the reaction cannot be dissolved, and the yield may be reduced. If the amount of cellobiose used is too small, the reaction may not proceed in the direction of amylose synthesis.

グルコースを出発物質とする実施形態では、反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）が、好ましくは約０．１５以下であり、より好ましくは約０．０３以下である。   In embodiments where glucose is the starting material, the ratio (Pi / Glc) between the molar concentration of free phosphate and the molar concentration of glucose in the solution at the start of the reaction is preferably about 0.15 or less, more Preferably it is about 0.03 or less.

Ｇ６−Ｐを出発物質とする実施形態では、反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）が、好ましくは約０．４以下であり、より好ましくは約０である。   In an embodiment starting with G6-P, the ratio (Pi / G6-P) between the molar concentration of free phosphate and the molar concentration of glucose in the solution at the start of the reaction is preferably about 0.4 or less. And more preferably about 0.

セロビオースを出発物質とする実施形態では、反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）が、好ましくは約０〜４であり、より好ましくは約０．００８〜２であり、更に好ましくは０．０２８〜０．８１０であり、最も好ましくは０．０５６〜０．１６２である。   In embodiments starting with cellobiose, the ratio of the molar concentration of free phosphate to the molar concentration of glucose (Pi / CB) in the solution at the start of the reaction is preferably about 0 to 4, more preferably Is about 0.008 to 2, more preferably 0.028 to 0.810, and most preferably 0.056 to 0.162.

反応時間は、反応温度、反応により生産されるグルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、好ましくは約１時間以上であり、より好ましくは約２時間以上であり、さらに好ましくは約３時間以上である。反応時間は、好ましくは約１００時間以下であり、より好ましくは約７２時間以下であり、さらに好ましくは約５４時間以下であり、特に好ましくは約３６時間以下であり、最も好ましくは約２４時間以下である。   The reaction time can be set at any time in consideration of the reaction temperature, the molecular weight of glucan produced by the reaction, and the residual activity of the enzyme. The reaction time is preferably about 1 hour or longer, more preferably about 2 hours or longer, and further preferably about 3 hours or longer. The reaction time is preferably about 100 hours or less, more preferably about 72 hours or less, even more preferably about 54 hours or less, particularly preferably about 36 hours or less, and most preferably about 24 hours or less. It is.

加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。   The heating may be performed using any means, but it is preferable to perform the heating while stirring so that the heat is uniformly transferred to the entire solution. The solution is stirred in, for example, a stainless steel reaction tank equipped with a hot water jacket and a stirring device.

本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、各種原料のうちの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。   In the method of the present invention, at least one of various raw materials may be added to the reaction solution after the reaction has progressed to some extent.

このようにして、α−グルカンを含有する溶液が生産される。   In this way, a solution containing α-glucan is produced.

反応終了後、溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産されたグルカンを単離するために処理されてもよい。   After completion of the reaction, the solution can be deactivated as necessary, for example, by heating at 100 ° C. for 10 minutes. Or you may perform a next process, without performing the process which inactivates an enzyme. The solution may be stored as is or may be processed to isolate the produced glucan.

＜精製方法＞
生産されたα−グルカンは、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、グルコースである。α−グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。 <Purification method>
The produced α-glucan can be purified as necessary. An example of an impurity that is removed by purification is glucose. Examples of the purification method of α-glucan include a method using an organic solvent (TJ Schoch et al., J. American Chemical Society, 64, 2957 (1942)) and a method using no organic solvent.

有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。   Examples of organic solvents that can be used for purification using organic solvents include acetone, n-amyl alcohol, pentazole, n-propyl alcohol, n-hexyl alcohol, 2-ethyl-1-butanol, 2-ethyl-1-hexanol. , Lauryl alcohol, cyclohexanol, n-butyl alcohol, 3-pentanol, 4-methyl-2-pentanol, d, l-borneol, α-terpineol, isobutyl alcohol, sec-butyl alcohol, 2-methyl-1- Examples include butanol, isoamyl alcohol, tert-amyl alcohol, menthol, methanol, ethanol and ether.

有機溶媒を用いない精製方法の例を、以下に示す。   The example of the purification method which does not use an organic solvent is shown below.

（１）α−グルカン生産反応後、反応溶液を冷却することによりα−グルカンを沈澱させ、そして沈澱したα−グルカンを、膜分画、濾過、遠心分離などの一般的な固液分離方法により精製する方法；
（２）α−グルカン生産反応の間もしくはα−グルカン生産反応後に反応溶液を冷却してα−グルカンをゲル化し、ゲル化したα−グルカンを回収し、そしてゲル化したα−グルカンから、グルコースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過などの操作によって除去する方法；ならびに
（３）α−グルカン生産反応後、水に溶解しているα−グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してグルコースを除去する方法。 (1) After the α-glucan production reaction, the reaction solution is cooled to precipitate α-glucan, and the precipitated α-glucan is separated by a general solid-liquid separation method such as membrane fractionation, filtration, and centrifugation. Purification method;
(2) The reaction solution is cooled during the α-glucan production reaction or after the α-glucan production reaction to gel the α-glucan, and the gelled α-glucan is recovered. (3) After the α-glucan production reaction, an ultrafiltration membrane is used without precipitating α-glucan dissolved in water. A method of removing glucose by subjecting it to membrane fractionation or chromatography.

精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１，０００〜約１００，０００、好ましくは約５，０００〜約５０，０００、より好ましくは約１０，０００〜約３０，０００の限外濾過膜（ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。   Examples of ultrafiltration membranes that can be used for purification include a fractional molecular weight of about 1,000 to about 100,000, preferably about 5,000 to about 50,000, more preferably about 10,000 to about 30, 000 ultrafiltration membrane (Daicel UF membrane unit).

クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。   Examples of carriers that can be used for chromatography include gel filtration chromatography carriers, ligand exchange chromatography carriers, ion exchange chromatography carriers, and hydrophobic chromatography carriers.

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。   The following examples illustrate the invention in more detail. The present invention is not limited only to the following examples.

（１．測定方法および計算方法）
本発明における各種酵素の活性および得られるα−グルカンの収率を、以下の測定方法によって測定した。 (1. Measurement method and calculation method)
The activity of various enzymes in the present invention and the yield of α-glucan obtained were measured by the following measuring methods.

（１．１ ポリホスフェートグルコキナーゼの活性測定法）
２００ｍＭ グルコース、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、８％ポリリン酸の混合液２５μｌと適切に希釈した酵素液２５μｌを加えて５０μｌの混合溶液として反応を開始させる。この混合溶液を４５℃で１５分間インキュベートして反応させた後、１００℃で１０分間保持することにより酵素を失活させる。続いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７） ５５０μｌおよび３ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３ｍＭ ＥＤＴＡ、６．１６μｇ／ｍｌ グルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７）を含む混合溶液３００μｌを酵素反応溶液に添加して混合する。この溶液を３０℃、３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−６−リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−６−リン酸濃度を求める。この方法により、１分間に１μｍｏｌのグルコース−６−リン酸を生成する活性をポリホスフェートグルコキナーゼ１単位とする。 (1.1 Method for measuring activity of polyphosphate glucokinase)
The reaction is started as a mixed solution of 50 μl by adding 25 μl of a mixture of 200 mM glucose, 100 mM MgCl ₂ , 8% polyphosphoric acid and 25 μl of an appropriately diluted enzyme solution. This mixed solution is incubated at 45 ° C. for 15 minutes to react, and then kept at 100 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme. Subsequently, 550 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 7) and 300 μl of a mixed solution containing 3 mM NADP +, 15 mM MgCl ₂ , 3 mM EDTA, 6.16 μg / ml glucose-6-phosphodehydrogenase, 200 mM Tris-HCl (pH 7) were added to the enzyme reaction solution. Add and mix. After holding this solution at 30 ° C. for 30 minutes, the absorbance at 340 nm is measured using a spectrophotometer. Absorbance is measured in the same manner using glucose-6-phosphate having a known concentration, and a standard curve is prepared. The absorbance obtained in the sample is applied to this standard curve to determine the glucose-6-phosphate concentration in the sample. According to this method, the activity of producing 1 μmol of glucose-6-phosphate per minute is defined as 1 unit of polyphosphate glucokinase.

（１．２ ホスホグルコムターゼの活性測定法）
２００ｍＭ グルコース−１−リン酸、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ Ｃｏｆａｃｔｏｒ （グルコース またはグルコース−１，６−ビスホスフェート）の混合液２５μｌと適切に希釈した酵素液２５μｌを加えて５０μｌの混合溶液として反応を開始させる。この混合溶液を４５℃で１５分間インキュベートして反応させた後、１００℃で１０分間保持することにより酵素を失活させる。続いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７） ５５０μｌおよび３ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３ｍＭ ＥＤＴＡ、６．１６μｇ／ｍｌ グルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７）を含む混合溶液３００μｌを酵素反応溶液に添加して混合する。この溶液を３０℃、３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−６−リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−６−リン酸濃度を求める。この方法により、１分間に１μｍｏｌのグルコース−６−リン酸を生成する活性をホスホグルコムターゼ１単位とする。 (1.2 Method for measuring phosphoglucomutase activity)
Add 25 μl of a mixture of 200 mM glucose-1-phosphate, 100 mM MgCl ₂ , 20 mM Cofactor (glucose or glucose-1,6-bisphosphate) and 25 μl of an appropriately diluted enzyme solution to start the reaction as a 50 μl mixed solution. . This mixed solution is incubated at 45 ° C. for 15 minutes to react, and then kept at 100 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme. Subsequently, 550 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 7) and 300 μl of a mixed solution containing 3 mM NADP +, 15 mM MgCl ₂ , 3 mM EDTA, 6.16 μg / ml glucose-6-phosphodehydrogenase, 200 mM Tris-HCl (pH 7) were added to the enzyme reaction solution. Add and mix. After holding this solution at 30 ° C. for 30 minutes, the absorbance at 340 nm is measured using a spectrophotometer. Absorbance is measured in the same manner using glucose-6-phosphate having a known concentration, and a standard curve is prepared. The absorbance obtained in the sample is applied to this standard curve to determine the glucose-6-phosphate concentration in the sample. By this method, the activity to produce 1 μmol of glucose-6-phosphate per minute is defined as 1 unit of phosphoglucomutase.

（１．３ α−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性測定法）
５０μｌの４％クラスターデキストリン水溶液と５０μｌの５０ｍＭグルコース−１−リン酸ナトリウム水溶液とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液１００μｌを加えて２００μｌの混合物として反応を開始させる。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートして反応を進行させた後、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ 酢酸亜鉛）を混合し、反応を停止させる。続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この方法により、１分間に１μｍｏｌの無機リン酸を生成する活性を、α−１，４−グルカンホスホリラーゼ１単位とする。 (1.3 Method for measuring activity of α-1,4-glucan phosphorylase)
50 μl of 4% cluster dextrin aqueous solution and 50 μl of 50 mM glucose-1-sodium phosphate aqueous solution are mixed, and further 100 μl of appropriately diluted enzyme solution is added to start the reaction as a 200 μl mixture. This mixture is incubated at 37 ° C. for 15 minutes to allow the reaction to proceed, and then 800 μl of a molybdenum reagent (15 mM ammonium molybdate, 100 mM zinc acetate) is mixed to stop the reaction. Subsequently, 200 μl of 568 mM ascorbic acid (pH 5.0) is added and stirred to obtain a reaction system. The reaction system is held at 30 ° C. for 20 minutes, and then the absorbance at 850 nm is measured using a spectrophotometer. Absorbance is measured in the same manner using inorganic phosphoric acid with a known concentration, and a standard curve is prepared. The absorbance obtained in the sample is applied to this standard curve, and the inorganic phosphoric acid in the sample is obtained. By this method, the activity to produce 1 μmol of inorganic phosphate per minute is defined as 1 unit of α-1,4-glucan phosphorylase.

（１．４ セロビオースホスホリラーゼの活性測定法）
２５μｌの４０ｍＭセロビオース水溶液と２５μｌの４０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液（試料）５０μｌを加えて１００μｌの混合物として反応を開始させる。この混合物を３７℃で１０分間インキュベートすることにより反応を進行させた後、１００℃で１０分間保持することによって酵素を失活させる。続いて６００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）および３００μｌの発色試薬（ＣＩＩ発色試薬（和光純薬社製））をこの混合液に添加して混合し、３０℃で２０分間保持した後、５０５ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース水溶液を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース量を求める。セロビオースホスホリラーゼ１単位とは、上記方法により２０ｍＭセロビオースから１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量と定義する。 (1.4 Cellobiose phosphorylase activity measurement method)
25 μl of 40 mM cellobiose aqueous solution and 25 μl of 40 mM sodium phosphate aqueous solution (pH 7.5) are mixed, and 50 μl of an appropriately diluted enzyme solution (sample) is added to start the reaction as a 100 μl mixture. The reaction is allowed to proceed by incubating the mixture at 37 ° C. for 10 minutes, and then the enzyme is inactivated by holding at 100 ° C. for 10 minutes. Subsequently, 600 μl of 1M Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.0) and 300 μl of a coloring reagent (CII coloring reagent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) were added to the mixed liquid, mixed, and kept at 30 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the absorbance at 505 nm is measured. Absorbance is measured in the same manner using an aqueous glucose solution with a known concentration, and a standard curve is created. The absorbance obtained in the sample is applied to this standard curve to determine the amount of glucose in the sample. One unit of cellobiose phosphorylase is defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of glucose per minute from 20 mM cellobiose by the above method.

（１．５ 得られるα−グルカンの収率の計算方法）
本発明の製造方法によるα−グルカンの収率を、得られたα−グルカン中に取り込まれたグルコース残基のモル数が、最初に添加された初発物質のグルコース当量でのモル数（Ｓ；グルコース当量のモル数）（例えば、グルコースを出発物質とする場合はグルコースのモル数、Ｇ６−Ｐを出発物質とする場合はＧ６−Ｐのモル数、二糖のセロビオースを出発物質とする場合はセロビオースのモル数の２倍量）の何％にあたるかによって計算した。反応終了後、反応溶液を１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。次いで、反応溶液を適切に希釈し、充分量のα−アミラーゼと充分量のグルコアミラーゼを添加して４０℃で６時間インキュベートすることによって溶液中のα−グルカンをグルコースにまで分解した。α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼによる処理を行った溶液のグルコース量（Ｇ_１；モル数）、およびこの処理を行ってない溶液のグルコース量（Ｇ_２；モル数）を測定した。グルコース当量でＧ_３モルのプライマーを使用したとすると、Ｇ_ｘ＝（Ｇ_１−Ｇ_２−Ｇ_３）によって、α−グルカンに取り込まれたグルコース量（収量；モル数）が計算できる。このグルコース量を初発物質のモル数で除算して１００倍することにより、収率を計算した。この計算式を次式に示す。 (1.5 Calculation method of yield of α-glucan obtained)
The yield of α-glucan according to the production method of the present invention was determined based on the number of moles of glucose residues incorporated into the obtained α-glucan in terms of the number of moles (S; The number of moles of glucose equivalent) (for example, when glucose is used as the starting material, the number of moles of glucose, when G6-P is used as the starting material, the number of moles of G6-P, and when the disaccharide cellobiose is used as the starting material It was calculated based on what percentage of the cellobiose (2 times the number of moles of cellobiose). After completion of the reaction, the reaction solution was heated at 100 ° C. for 10 minutes to deactivate the enzyme. Next, the reaction solution was appropriately diluted, a sufficient amount of α-amylase and a sufficient amount of glucoamylase were added, and the mixture was incubated at 40 ° C. for 6 hours to decompose the α-glucan in the solution into glucose. The amount of glucose (G ₁ ; number of moles) of the solution treated with α-amylase and glucoamylase and the amount of glucose (G ₂ ; number of moles) of the solution not treated with this treatment were measured. When using _{G 3} moles of primer glucose equivalents _{by = G x (G 1 -G 2} -G 3), the amount of glucose incorporated into α- glucan (yield; moles) can be calculated. The yield was calculated by dividing this amount of glucose by the number of moles of starting material and multiplying by 100. This calculation formula is shown below.

（１．６ グルコース濃度測定方法）
適切に希釈した試料１００μｌに６００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）および３００μｌの発色試薬（ＣＩＩ発色試薬（和光純薬社製））を添加して混合し、３７℃、２０分間保持した後、５０５ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース水溶液を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース量を求める。

(1.6 Method for measuring glucose concentration)
To 100 μl of appropriately diluted sample, add 600 μl of 1M Tris-HCl buffer (pH 7.0) and 300 μl of color reagent (CII color reagent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries)), mix, and hold at 37 ° C. for 20 minutes After that, the absorbance at 505 nm is measured. Absorbance is measured in the same manner using an aqueous glucose solution with a known concentration, and a standard curve is created. The absorbance obtained in the sample is applied to this standard curve to determine the amount of glucose in the sample.

（１．７ リン酸濃度測定方法）
適切に希釈した試料２００μｌに８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ 酢酸亜鉛）および２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。 (1.7 Method for measuring phosphoric acid concentration)
To 200 μl of appropriately diluted sample, 800 μl of molybdenum reagent (15 mM ammonium molybdate, 100 mM zinc acetate) and 200 μl of 568 mM ascorbic acid (pH 5.0) were added, stirred, held at 30 ° C. for 20 minutes, and then a spectrophotometer Is used to measure the absorbance at 850 nm. Absorbance is measured in the same manner using inorganic phosphoric acid with a known concentration, and a standard curve is prepared. The absorbance obtained in the sample is applied to this standard curve, and the inorganic phosphoric acid in the sample is obtained.

（１．８ Ｇ１−Ｐ濃度測定方法）
適切に希釈した試料５０μｌに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７） ５５０μｌおよび３ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１５μＭ グルコース−１，６−ビスホスフェート、３μｇ／ｍｌ ウサギ筋肉由来ホスホグルコムターゼ、６．１６μｇ／ｍｌ グルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７）を含む混合溶液３００μｌを添加して混合する。この混合溶液を３０℃、３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−１−リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−１−リン酸濃度を求める。 (1.8 G1-P concentration measurement method)
550 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 7) and 3 mM NADP +, 15 mM MgCl ₂ , 3 mM EDTA, 15 μM glucose-1,6-bisphosphate, 3 μg / ml rabbit muscle-derived phosphoglucomutase, 6.16 μg / ml Add 300 μl of a mixed solution containing ml glucose-6-phosphodehydrogenase and 200 mM Tris-HCl (pH 7) and mix. After holding this mixed solution at 30 ° C. for 30 minutes, the absorbance at 340 nm is measured using a spectrophotometer. Absorbance is measured in the same manner using glucose-1-phosphate having a known concentration, and a standard curve is prepared. The absorbance obtained in the sample is applied to this standard curve to determine the glucose-1-phosphate concentration in the sample.

（１．９ Ｇ６−Ｐ濃度測定方法）
適切に希釈した試料５０μｌに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７） ５５０μｌおよび３ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３ｍＭ ＥＤＴＡ、６．１６μｇ／ｍｌ グルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７）を含む混合溶液３００μｌを添加して混合する。この混合溶液を３０℃、３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−６−リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−６−リン酸濃度を求める。 (1.9 G6-P concentration measurement method)
300 μl of a mixed solution containing 550 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 7) and 3 mM NADP +, 15 mM MgCl ₂ , 3 mM EDTA, 6.16 μg / ml glucose-6-phosphodehydrogenase, 200 mM Tris-HCl (pH 7) in 50 μl of appropriately diluted sample Add and mix. After holding this mixed solution at 30 ° C. for 30 minutes, the absorbance at 340 nm is measured using a spectrophotometer. Absorbance is measured in the same manner using glucose-6-phosphate having a known concentration, and a standard curve is prepared. The absorbance obtained in the sample is applied to this standard curve to determine the glucose-6-phosphate concentration in the sample.

（２．酵素の調製）
本発明の実験例および実施例で用いた各種酵素を、以下の方法によって調製した。 (2. Preparation of enzyme)
Various enzymes used in the experimental examples and examples of the present invention were prepared by the following methods.

（２．１ 組換えポリホスフェートグルコキナーゼ（ＰＧＫ）の調製方法）
Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのヌクレオチド配列（配列番号１）を合成し、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＰＧＫを得た。このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。 (2.1 Method for preparing recombinant polyphosphate glucokinase (PGK))
A nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of polyphosphate glucokinase derived from Microlunatus phosphovolas was synthesized and incorporated into an expression vector pET28a (manufactured by STRATAGENE) to obtain a plasmid pET28a-PGK. This plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by STRATAGENE) by the competent cell method.

その後、得られた大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で大腸菌の増殖したコロニーを選択することにより、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓ由来ポリホスフェートグルコキナーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。それらの大腸菌についてポリホスフェートグルコキナーゼを発現していることを酵素活性測定によって確認した。   Thereafter, the obtained Escherichia coli was put on a plate containing LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract (both from Difco), 1% sodium chloride, 1.5% agar)) containing the antibiotic kanamycin. And incubated overnight at 37 ° C. By selecting colonies on which E. coli had grown on this plate, E. coli into which the microphosphate phosphovolas-derived polyphosphate glucokinase gene was introduced was obtained. It was confirmed by enzyme activity measurement that polyphosphate glucokinase was expressed in these E. coli.

この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＴＢ培地（１．２％トリプトン、２．４％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、０．２３１％リン酸二水素カリウム、１．２５４％リン酸水素二カリウム、０．４％グリセリン）６００ｍＬに接種し、１００ｒｐｍで振盪させながら３７℃、２４時間培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、１８０ｍＬの５０ｍＭ ＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７）中に懸濁し、次いで１％リゾチームを２０ｍＬ加え溶菌させた。溶菌後、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、ポリホスフェートグルコキナーゼを含む沈澱を得た。この沈澱を再度１８０ｍＬの５０ｍＭ ＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）中に懸濁し、酵素保持のため２０ｍＬグリセリン（ｆｉｎａｌ１０％）を加えた。この懸濁液中には３５７Ｕ／ｍＬのポリホスフェートグルコキナーゼが含まれていた。   This E. coli was treated with TB medium containing the antibiotic kanamycin (1.2% tryptone, 2.4% yeast extract (both from Difco), 0.231% potassium dihydrogen phosphate, 1.254% dipotassium hydrogen phosphate. , 0.4% glycerin) was inoculated into 600 mL, and cultured at 37 ° C. for 24 hours while shaking at 100 rpm. Subsequently, this culture solution was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes to collect E. coli cells. The obtained cells were suspended in 180 mL of 50 mM MOPS buffer (pH 7), and then 20 mL of 1% lysozyme was added for lysis. After lysis, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to obtain a precipitate containing polyphosphate glucokinase. This precipitate was again suspended in 180 mL of 50 mM MOPS buffer (pH 7), and 20 mL of glycerin (final 10%) was added to retain the enzyme. This suspension contained 357 U / mL polyphosphate glucokinase.

なお、得られた組換えポリホスフェートグルコキナーゼの反応至適温度は６５℃であり、反応至適ｐＨは約７．０である。   In addition, the reaction optimal temperature of the obtained recombinant polyphosphate glucokinase is 65 degreeC, and reaction optimal pH is about 7.0.

（２．２ 組換えホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）の調製方法）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列（配列番号３）を合成し、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＰＧＫを得た。このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。 (2.2 Preparation Method of Recombinant Phosphoglucomutase (PGM))
A nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of phosphoglucomutase derived from Escherichia coli was synthesized and incorporated into an expression vector pET28a (manufactured by STRATAGENE) to obtain a plasmid pET28a-PGK. This plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by STRATAGENE) by the competent cell method.

その後、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で大腸菌の増殖したコロニーを選択することにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ホスホグルコムターゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。それらの大腸菌についてホスホグルコムターゼを発現していることを酵素活性測定によって確認した。   Thereafter, the LB medium containing antibiotic kanamycin (1% tryptone, 0.5% yeast extract (both from Difco), 1% sodium chloride, 1.5% agar)) was plated at 37 ° C. Incubated overnight. By selecting colonies on which E. coli had grown on this plate, Escherichia coli-derived phosphoglucomutase gene was obtained. It was confirmed by enzyme activity measurement that phosphoglucomutase was expressed in these E. coli.

この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＴＢ培地（１．２％トリプトン、２．４％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、０．２３１％リン酸二水素カリウム、１．２５４％リン酸水素二カリウム、０．４％グリセリン）６００ｍＬに接種し、１００ｒｐｍで振盪させながら３７℃、２４時間培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、１８０ｍＬの５０ｍＭ ＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７）中に懸濁し、次いで１％リゾチームを２０ｍＬ加え溶菌させた。溶菌後、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、ホスホグルコムターゼを含む酵素溶液を得た。この酵素溶液には５００Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼが含まれていた。   This E. coli was treated with TB medium containing the antibiotic kanamycin (1.2% tryptone, 2.4% yeast extract (both from Difco), 0.231% potassium dihydrogen phosphate, 1.254% dipotassium hydrogen phosphate. , 0.4% glycerin) was inoculated into 600 mL, and cultured at 37 ° C. for 24 hours while shaking at 100 rpm. Subsequently, this culture solution was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes to collect E. coli cells. The obtained cells were suspended in 180 mL of 50 mM MOPS buffer (pH 7), and then 20 mL of 1% lysozyme was added for lysis. After lysis, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to obtain an enzyme solution containing phosphoglucomutase. This enzyme solution contained 500 U / mL phosphoglucomutase.

なお、得られた組換えホスホグルコムターゼの反応至適温度は６０℃であり、反応至適ｐＨは約７．５である。   In addition, the optimal reaction temperature of the obtained recombinant phosphoglucomutase is 60 ° C., and the optimal reaction pH is about 7.5.

（２．３ 組換え馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）の調製方法）
馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子（Ｎａｋａｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）１０６（１９８９）６９１；配列番号５）を選択マーカー遺伝子Ａｍｐ^ｒとともに発現ベクターｐＥＴ３ｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ−ＰＧＰ１１３を得た。このプラスミドでは、α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がα−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がα−１，４−グルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。 (2.3 Preparation method of recombinant potato α-1,4-glucan phosphorylase (GP))
Potato alpha-1,4-glucan phosphorylase gene (Nakano et al., Journal of Biochemistry (Tokyo) 106 (1989) 691; SEQ ID NO: 5) built in the selection marker gene Amp ^r with the expression vector pET3d (manufactured by STRATAGENE Co.), the plasmid pET -PGP113 was obtained. In this plasmid, the α-1,4-glucan phosphorylase gene was operably linked under the control of an isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) inducible promoter. This plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by STRATAGENE) by the competent cell method. This E. coli was plated on a plate containing LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract (both from Difco), 1% sodium chloride, 1.5% agar)) containing the antibiotic ampicillin, Cultured overnight at 37 ° C. By selecting E. coli grown on this plate, E. coli into which the potato-derived α-1,4-glucan phosphorylase gene was introduced was obtained. It was confirmed by analyzing the sequence of the introduced gene that the obtained Escherichia coli contained the α-1,4-glucan phosphorylase gene. In addition, it was confirmed by activity measurement that the obtained Escherichia coli expressed α-1,4-glucan phosphorylase.

この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ、ピリドキシンを１ｍＭになるようにそれぞれこの培地に添加し、２２℃でさらに２０時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、４．７Ｕ／ｍｇのα−１，４−グルカンホスホリラーゼが含まれていた。   This E. coli is inoculated into 1 liter of LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract (both from Difco), 1% sodium chloride) containing the antibiotic ampicillin, and shaken at 120 rpm for 3 hours at 37 ° C. Cultured with shaking. Thereafter, IPTG was added to this medium to a concentration of 0.1 mM and pyridoxine to 1 mM, and the mixture was further cultured with shaking at 22 ° C. for 20 hours. Next, this culture solution was centrifuged at 5,000 rpm for 5 minutes to collect E. coli cells. The obtained bacterial cells were suspended in 50 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 0.05% Triton X-100, and then disrupted by sonication. Obtained. This disrupted solution contained 4.7 U / mg α-1,4-glucan phosphorylase.

この菌体破砕液を、５５℃で３０分間加熱した。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してα−１，４−グルカンホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換えα−１，４−グルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。   This cell disruption solution was heated at 55 ° C. for 30 minutes. After heating, the mixture was centrifuged at 8,500 rpm for 20 minutes to remove insoluble proteins and the like to obtain a supernatant. The obtained supernatant was passed through an anion exchange resin Q-Sepharose previously equilibrated to adsorb α-1,4-glucan phosphorylase to the resin. The resin was washed with a buffer containing 200 mM sodium chloride to remove impurities. Subsequently, the protein was eluted with a buffer containing 300 mM sodium chloride to obtain a recombinant α-1,4-glucan phosphorylase enzyme solution.

なお、得られた組換えα−１，４−グルカンホスホリラーゼの反応至適温度は４０℃であり、反応至適ｐＨは約５．６である。   In addition, the optimal reaction temperature of the obtained recombinant α-1,4-glucan phosphorylase is 40 ° C., and the optimal reaction pH is about 5.6.

（２．４ 組換えセロビオースホスホリラーゼの調製方法）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの染色体遺伝子を抽出し、これをテンプレートとした。以下の２種の合成ＤＮＡプライマー：
合成ＤＮＡプライマー１：５’ ａａａｃｔｃｔａｇａａａｔａａｔｔｔｔｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃｃａｔｇｇａｇｔｔｃｇｇｔｔｔｔｔｔｔｇａｔｇａｔ ３’（配列番号７）および
合成ＤＮＡプライマー２：５’ ａａａｃｔｃｇａｇａａｔｔａｃｔｔｃａａｃｔｔｔｇｔｇａｇｔｃｔｔｔ ３’（配列番号８）
を用い、
９８℃で１分間、５５℃で１分間、６８℃で３分間の順で３０サイクル加熱
の条件下でＰＣＲを行うことにより、ＣＢＰ遺伝子を含む領域を増幅させた。増幅した遺伝子を選択マーカー遺伝子Ｋｍ^ｒとともに発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＣＢＰ１を得た。このプラスミドでは、セロビオースホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。 (2.4 Preparation Method of Recombinant Cellobiose Phosphorylase)
A chromosome gene of Clostridium thermocellum was extracted and used as a template. Two synthetic DNA primers:
Synthetic DNA Primer 1: 5 ′ aaactctagaataattttgtttaactttaagagagagagataccataggagattcggttttttgatatgat 3 ′ (SEQ ID NO: 7) and Synthetic DNA Primer 2: 5 ′ aaactcgattagttattt
Use
A region containing CBP gene was amplified by performing PCR under conditions of 30 cycles of heating at 98 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 68 ° C. for 3 minutes in this order. The amplified gene along with a selectable marker gene Km ^r incorporated into an expression vector pET28a (STRATAGENE Co.), to obtain plasmid pET28a-CBP1. In this plasmid, the cellobiose phosphorylase gene was operably linked under the control of an isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) inducible promoter.

このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来セロビオースホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。   This plasmid was introduced into E. coli BL21 (DE3) pLysS (manufactured by STRATAGENE) by the competent cell method. The Escherichia coli was plated on a plate containing LB medium (1% tryptone (Difco), 0.5% yeast extract (Difco), 1% sodium chloride, 1.5% agar)) containing the antibiotic kanamycin. And incubated overnight at 37 ° C. By selecting E. coli grown on this plate, E. coli into which the cellobiose phosphorylase gene derived from Clostridium thermocellum was introduced was obtained.

得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。   It was confirmed by analyzing the sequence of the introduced gene that the obtained Escherichia coli contained the cellobiose phosphorylase gene. In addition, it was confirmed by activity measurement that the obtained Escherichia coli expressed cellobiose phosphorylase.

この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを１．０ｍＭになるようにこの培地に添加し、３７℃でさらに８時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、１３２Ｕ／ｍｌのセロビオースホスホリラーゼが含まれていた。   This Escherichia coli is inoculated into 1 liter of LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract (both from Difco), 1% sodium chloride) containing the antibiotic kanamycin and shaken at 120 rpm for 3 hours at 37 ° C. Cultured with shaking. Then, IPTG was added to this medium so that it might be set to 1.0 mM, and it culture | cultivated by shaking at 37 degreeC for further 8 hours. Next, this culture solution was centrifuged at 5,000 rpm for 5 minutes to collect E. coli cells. The obtained cells were suspended in 50 ml of a 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 1.4 mM 2-mercaptoethanol, and then disrupted by ultrasonic treatment to obtain 50 ml of a cell disruption solution. . This crushed liquid contained 132 U / ml of cellobiose phosphorylase.

この菌体破砕液を、５５℃で２０分間加熱した。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいたＨｉｓ−Ｔａｇ吸着樹脂Ｎｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に流してセロビオースホスホリラーゼをこの樹脂に吸着させた。この樹脂を、３００ｍＭ塩化ナトリウムと２０ｍＭイミダゾールおよび１．４ｍＭ２−メルカプトエタノール含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムと１５０ｍＭイミダゾールおよび１．４ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液で溶出させ、組換えセロビオースホスホリラーゼ酵素溶液とした。   This cell disruption solution was heated at 55 ° C. for 20 minutes. After heating, the mixture was centrifuged at 8,500 rpm for 20 minutes to remove insoluble proteins and the like to obtain a supernatant. The obtained supernatant was passed through a previously equilibrated His-Tag adsorption resin Ni-NTA agarose (manufactured by QIAGEN) to adsorb cellobiose phosphorylase to this resin. The resin was washed with a buffer containing 300 mM sodium chloride, 20 mM imidazole and 1.4 mM 2-mercaptoethanol to remove impurities. Subsequently, the protein was eluted with a buffer solution containing 300 mM sodium chloride, 150 mM imidazole and 1.4 mM 2-mercaptoethanol to obtain a recombinant cellobiose phosphorylase enzyme solution.

なお、得られた組換えセロビオースホスホリラーゼの反応至適温度は６０℃であり、反応至適ｐＨは６．０である。   In addition, the reaction optimal temperature of the obtained recombinant cellobiose phosphorylase is 60 degreeC, and the reaction optimal pH is 6.0.

（実施例１：グルコースからのアミロースの合成）
以下の表１に記載の組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを７．０に調整し、そして４５℃で２４時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、約２０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）は、約０．０４であった。 (Example 1: Synthesis of amylose from glucose)
Amylose was synthesized by preparing a solution having the composition described in Table 1 below, adjusting the pH of the solution to 7.0 at the start of the reaction, and incubating at 45 ° C. for 24 hours. When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was about 20 mM, and the ratio (Pi / Glc) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of glucose was about 0.04. .

グルコース（Ｇｌｃ）濃度、グルコース−６−リン酸（Ｇ６−Ｐ）濃度、グルコース−１−リン酸（Ｇ１−Ｐ）濃度、およびアミロース収率を経時的に測定した。結果を以下の表２および図２に示す。

The glucose (Glc) concentration, glucose-6-phosphate (G6-P) concentration, glucose-1-phosphate (G1-P) concentration, and amylose yield were measured over time. The results are shown in Table 2 below and FIG.

反応開始から１２時間以降Ｇ６−Ｐ濃度とＧ１−Ｐ濃度がほぼ一定になったことから、溶液中の酵素反応は、反応開始から１２時間で平衡に達したと考えられる。それに対して、アミロース収率は増加し、グルコース濃度が減少した。反応開始から１２時間以降のアミロースの増加はグルコース減少量にほぼ一致している。この結果は、酵素反応が平衡に達した後アミロースが老化することで反応系外に出てそれに伴い平衡状態を保つためにＧｌｃが消費され、反応がアミロース合成側にシフトすることによってアミロースが合成されたことを示すと考えられる。

Since the G6-P concentration and the G1-P concentration became substantially constant after 12 hours from the start of the reaction, it is considered that the enzyme reaction in the solution reached equilibrium in 12 hours from the start of the reaction. In contrast, the amylose yield increased and the glucose concentration decreased. The increase in amylose after 12 hours from the start of the reaction almost coincides with the decrease in glucose. This result shows that after the enzyme reaction reaches equilibrium, amylose ages out of the reaction system, so that Glc is consumed to maintain the equilibrium state, and the reaction shifts to the amylose synthesis side to synthesize amylose. It is thought that it was done.

表２および図２においては、反応開始時のグルコース濃度を１００％（ｍＭ／ｍＭ）とし、グルコース濃度、Ｇ６−Ｐ濃度、Ｇ１−Ｐ濃度およびアミロース収率をそれぞれ、反応開始時のグルコース濃度（ｍＭ）に対する比率として示した。   In Table 2 and FIG. 2, the glucose concentration at the start of the reaction is 100% (mM / mM), and the glucose concentration, the G6-P concentration, the G1-P concentration, and the amylose yield are respectively shown in the glucose concentration at the start of the reaction ( mM)).

（実施例２：反応開始時の反応溶液のｐＨ）
反応開始時の溶液のｐＨを５．２〜１２に変化させたこと以外は、上記表１の組成と同じ組成の溶液を調製し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成させた。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、いずれの条件でも約１２ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）は、いずれの条件でも約０．０３であった。 (Example 2: pH of the reaction solution at the start of the reaction)
A amylose was synthesized by preparing a solution having the same composition as that shown in Table 1 except that the pH of the solution at the start of the reaction was changed to 5.2 to 12 and incubating at 45 ° C. for 16 hours. It was. The concentration of synthesized amylose was measured and the yield was calculated. When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was about 12 mM under any condition, and the ratio (Pi / Glc) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of glucose (Pi / Glc) But it was about 0.03.

反応開始時点で測定したｐＨの値と、アミロースの収率の結果を以下の表３および図３に示す。   The pH values measured at the start of the reaction and the results of amylose yield are shown in Table 3 below and FIG.

反応溶液の初期ｐＨを弱アルカリ側以上にすることでアミロース合成収率が上がり、約２０％の値が得られた。初期ｐＨが５．６までの酸性側ではアミロースが酵素合成されず、弱酸性から中性付近では低収率でアミロースが得られた。初期ｐＨ７．１のとき収率９．１％であった。ｐＨ７．４からｐＨ１１ではアミロース収率１５％以上を示し、ｐＨ７．４からｐＨ８．５では約１９％のアミロース収率を示した。初期ｐＨ７．７のとき収率１９．６％であった。

By making the initial pH of the reaction solution higher than the weak alkali side, the amylose synthesis yield was increased, and a value of about 20% was obtained. Amylose was not enzymatically synthesized on the acidic side up to an initial pH of 5.6, and amylose was obtained in low yield from weakly acidic to neutral. The yield was 9.1% when the initial pH was 7.1. From pH 7.4 to pH 11, amylose yield was 15% or more, and from pH 7.4 to pH 8.5, amylose yield was about 19%. The yield was 19.6% when the initial pH was 7.7.

（実施例３：反応溶液中の遊離リン酸とグルコースとのモル比（Ｐｉ／Ｇｌｃ）の検討）
溶液中の遊離のリン酸濃度はアミロース合成反応に大きく影響を与える。直接的にはGP酵素の平衡反応に影響する。この平衡反応ではアミロースとともに副生成物としてリン酸が生成されるためリン酸濃度は高くなるとアミロース合成側への反応が進まなくなる。反応初期には溶液中にリン酸の存在しないことが望ましいが、ＧｌｃからＧ６−Ｐへの変換反応に必要なポリリン酸には遊離のリン酸が含まれてしまう。そのため、アミロース合成可能な初期遊離リン酸／Ｇｌｃ濃度比（Ｐｉ／Ｇｌｃ）を検討した。 (Example 3: Examination of molar ratio (Pi / Glc) of free phosphoric acid and glucose in reaction solution)
The concentration of free phosphate in the solution greatly affects the amylose synthesis reaction. It directly affects the equilibrium reaction of the GP enzyme. In this equilibrium reaction, phosphoric acid is produced as a by-product with amylose, so that the reaction toward the amylose synthesis side does not proceed when the phosphoric acid concentration increases. Although it is desirable that no phosphoric acid is present in the solution at the beginning of the reaction, the polyphosphoric acid required for the conversion reaction from Glc to G6-P contains free phosphoric acid. Therefore, the initial free phosphate / Glc concentration ratio (Pi / Glc) capable of synthesizing amylose was examined.

以下の表４に示す濃度の無機リン酸を添加したこと以外は表１の組成の溶液を作製して４５℃で１６時間反応させてアミロースを合成した。反応開始時点でのこの溶液のｐＨを約８に調整した。合成されたアミロースの量を測定し、収率を計算した。添加した無機リン酸の量、無機リン酸とグルコースとのモル比（Ｐｉ／Ｇｌｃ）、アミロースの合成濃度（ｍＭ）および収率（％）を以下の表４に示す。アミロースの収率（％）とＰｉ／Ｇｌｃとの関係を図４に示す。   A solution having the composition shown in Table 1 except that inorganic phosphoric acid having the concentration shown in Table 4 below was added was prepared and reacted at 45 ° C. for 16 hours to synthesize amylose. The pH of this solution at the start of the reaction was adjusted to about 8. The amount of synthesized amylose was measured and the yield was calculated. The amount of inorganic phosphoric acid added, the molar ratio of inorganic phosphoric acid to glucose (Pi / Glc), the synthesis concentration (mM) and the yield (%) of amylose are shown in Table 4 below. The relationship between amylose yield (%) and Pi / Glc is shown in FIG.

この結果、グルコースの約０．２倍濃度の遊離のリン酸が含まれるとアミロース合成が阻害された。

As a result, amylose synthesis was inhibited when free phosphoric acid having a concentration of about 0.2 times that of glucose was contained.

（実験例１：グルコースからのＧ６−Ｐの生成反応）
先行技術（１）の反応の方向を確認するために、以下の実験を行った。 (Experimental example 1: G6-P production reaction from glucose)
In order to confirm the direction of the reaction of the prior art (1), the following experiment was conducted.

以下の表５に記載の組成の溶液を作成し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを７に調整し、４５℃で２４時間インキュベートすることにより、Ｇ６−Ｐを生成させた。   A solution having the composition described in Table 5 below was prepared, and the pH of this solution at the start of the reaction was adjusted to 7, and incubated at 45 ° C. for 24 hours to generate G6-P.

生成されたＧ６−Ｐの濃度を測定し、Ｇ６−Ｐの収率（変換率）（％）を計算した。結果を図５に示す。この結果、先行技術の（１）の反応は不可逆反応であり、グルコースに対して９０％以上がＧ６−Ｐに変換されることが確認された。

The concentration of G6-P produced was measured, and the yield (conversion rate) (%) of G6-P was calculated. The results are shown in FIG. As a result, it was confirmed that the reaction (1) of the prior art is an irreversible reaction, and 90% or more of glucose is converted to G6-P.

（実験例２：Ｇ６−ＰとＧ１−Ｐとアミロースとの平衡反応）
アミロースをＭＯＰＳ（ｐＨ７）バッファーに加えて１００℃で熱処理して完全に溶解し、その後、４５℃に保ったまま、以下の表６に記載の組成になるようにＰＧＭ、ＧＰ、リン酸などを加え、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを７に調整し、そして４時間インキュベートして、平衡反応を行なった。 (Experimental example 2: Equilibrium reaction of G6-P, G1-P and amylose)
Amylose was added to MOPS (pH 7) buffer and heat-treated at 100 ° C. to completely dissolve it. Then, while maintaining at 45 ° C., PGM, GP, phosphoric acid, etc. were added so as to have the composition shown in Table 6 below. In addition, the pH of this solution at the start of the reaction was adjusted to 7 and incubated for 4 hours to carry out the equilibrium reaction.

反応途中でサンプリングした。アミロース、Ｇ１−ＰおよびＧ６−Ｐの濃度を測定し、反応開始時のアミロースのモル数を１００％としたときのアミロース、Ｇ１−Ｐ、Ｇ６−ＰおよびＧ１−Ｐ＋Ｇ６−Ｐの濃度を計算した。結果を図６に示す。その結果、アミロースの９５％以上がＧ６−ＰとＧ１−Ｐに分解された。２種類の酵素ＰＧＭ−ＧＰの平衡反応はＧ６−Ｐ側に非常に有利で、完全に溶解したアミロースに対してＰＧＭとＧＰを作用させたとき反応開始から４時間後ではＧ６−Ｐ：８８．５％、Ｇ１−Ｐ：６．８％、アミロース：４．７％の割合で存在した。

Sampling was performed during the reaction. The concentrations of amylose, G1-P, and G6-P were measured, and the concentrations of amylose, G1-P, G6-P, and G1-P + G6-P when the number of moles of amylose at the start of the reaction was taken as 100% were calculated. . The results are shown in FIG. As a result, 95% or more of amylose was decomposed into G6-P and G1-P. The equilibrium reaction between the two enzymes PGM-GP is very advantageous on the G6-P side. When PGM and GP are allowed to act on completely dissolved amylose, 4 hours after the start of the reaction, G6-P: 88. 5%, G1-P: 6.8%, amylose: 4.7%.

（実施例４：アミロース合成）
以下の表７に記載の組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、約１２ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）は、０．０３であった。 (Example 4: amylose synthesis)
Amylose was synthesized by preparing a solution with the composition described in Table 7 below, adjusting the pH of this solution to 8 at the start of the reaction, and incubating at 45 ° C. for 16 hours. When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was about 12 mM, and the ratio (Pi / Glc) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of glucose was 0.03.

アミロースの合成濃度を測定し、収率を計算した。その結果、収率は１９．６％であった。上記の実験例２によれば、平衡状態でのアミロース収率が約４．７％であった。これに対し、本実施例では、５００ｍＭのグルコースを基質としたアミロース合成の収率が１９．６％であった。この値は、本実施例によって得られるアミロースの収率が、ＰＧＭ−ＧＰ平衡反応によって得られるアミロース収率を大きく上回ることを示す。本実施例によってＰＧＭ−ＧＰ平衡反応によるアミロース収率よりも高い値が得られた理由は、アミロースの老化によって反応系外に出たアミロースが蓄積されたためであると考えられる。

The synthetic concentration of amylose was measured and the yield was calculated. As a result, the yield was 19.6%. According to Experimental Example 2 described above, the amylose yield in an equilibrium state was about 4.7%. On the other hand, in this example, the yield of amylose synthesis using 500 mM glucose as a substrate was 19.6%. This value shows that the yield of amylose obtained by this example greatly exceeds the amylose yield obtained by the PGM-GP equilibrium reaction. The reason why a higher value than the amylose yield by the PGM-GP equilibrium reaction was obtained in this example is considered to be that amylose that had come out of the reaction system was accumulated due to aging of amylose.

（実施例５：出発グルコース濃度を変えた場合のアミロース収率の変化）
グルコース濃度を変化させ、それに合わせて酵素量、プライマー濃度およびポリリン酸濃度を比例して増加させたこと以外は、表１と同じ組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。合成されたアミロース濃度を測定し、収率を計算した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、約０．５〜約５０．２であり、遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）は、約０．０３であった。 (Example 5: Change in amylose yield when starting glucose concentration is changed)
A solution having the same composition as in Table 1 was prepared except that the glucose concentration was changed and the enzyme amount, primer concentration, and polyphosphate concentration were increased proportionally, and the pH of the solution at the start of the reaction was adjusted. Amylose was synthesized by adjusting to 8 and incubating at 45 ° C. for 16 hours. The synthesized amylose concentration was measured and the yield was calculated. When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was about 0.5 to about 50.2, and the ratio (Pi / Glc) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of glucose was It was about 0.03.

結果を以下の表８および図７Ａおよび図７Ｂに示す。   The results are shown in Table 8 below and FIGS. 7A and 7B.

基質濃度を上昇させるとそれに伴い溶液中のアミロース濃度も上昇するので、アミロースが老化しやすい状態になる。そのため、高濃度基質からのアミロース合成ではアミロース収率が高くなる傾向にある（図７Ａ）。また、グルコース濃度が増加するに従ってアミロースの収量も増加した（図７Ｂ）。

When the substrate concentration is increased, the amylose concentration in the solution is increased accordingly, so that amylose tends to age. Therefore, the amylose yield tends to increase in amylose synthesis from a high concentration substrate (FIG. 7A). Moreover, the yield of amylose increased as the glucose concentration increased (FIG. 7B).

（実施例６：Ｇ６−Ｐを出発原料として使用した、ゲスト化合物の存在下でのアミロース合成）
以下の表９に記載の組成をベースとして以下の表１０に記載の量で各種ゲスト化合物を添加した組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とＧ６−Ｐのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）は、０であった。コントロールは、ゲスト化合物を添加しない比較例６である。合成されたアミロース量を測定し、収率を計算した。 (Example 6: Amylose synthesis in the presence of a guest compound using G6-P as a starting material)
Based on the composition shown in Table 9 below, a solution having a composition in which various guest compounds were added in the amounts shown in Table 10 below was prepared, the pH of the solution at the start of the reaction was adjusted to 8, and 45 Amylose was synthesized by incubating at 16 ° C. for 16 hours. When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was 0 mM, and the ratio (Pi / G6-P) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of G6-P was 0. . Control is the comparative example 6 which does not add a guest compound. The amount of synthesized amylose was measured and the yield was calculated.

結果を以下の表１０および図８に示す。

The results are shown in Table 10 below and FIG.

アミロースは脂肪酸などを包接する作用を持ち、包接される側の物質(ゲスト化合物)の種類によっては沈澱しやすくなる。アミロース合成反応溶液中にゲスト化合物を添加し、この沈澱促進作用を利用することで、アミロース収率を上げることができる。Ｇ６−Ｐからアミロースを合成するとき、アミロース収率は２０％程度であるが、ゲスト化合物を加えることで有意に収率が上昇した。ゲスト化合物ＳＢ３−１６を１０ｍＭ添加したときアミロース収率は５３．３％まで上がった。

Amylose has the effect of inclusion of fatty acids and the like, and it tends to precipitate depending on the type of substance (guest compound) on the side of inclusion. By adding a guest compound to the amylose synthesis reaction solution and utilizing this precipitation promoting action, the amylose yield can be increased. When amylose was synthesized from G6-P, the amylose yield was about 20%, but the yield was significantly increased by adding the guest compound. When 10 mM of guest compound SB3-16 was added, the amylose yield increased to 53.3%.

（実施例７−１〜７−３：セロビオースからのアミロース合成）
以下の表１１に記載の組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを約７．８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成させた。比較例７として、ＰＧＫ、ＰＧＭおよびポリリン酸を含まず、リン酸を含む組成でアミロースを合成させた。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、実施例７−１では約１５ｍＭであり、実施例７−２および７−３では約１０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）は、実施例７−１では約０．１５であり、実施例７−２では約０．１０、７−３では約０．０５７であった。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。 (Examples 7-1 to 7-3: Synthesis of amylose from cellobiose)
Amylose was synthesized by preparing a solution of the composition described in Table 11 below, adjusting the pH of this solution to about 7.8 at the start of the reaction, and incubating at 45 ° C. for 16 hours. As Comparative Example 7, amylose was synthesized with a composition containing phosphoric acid without PGK, PGM and polyphosphoric acid. When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was about 15 mM in Example 7-1 and about 10 mM in Examples 7-2 and 7-3. The ratio of cellobiose to the molar concentration (Pi / CB) was about 0.15 in Example 7-1, about 0.10 in Example 7-2, and about 0.057 in 7-3. The concentration of synthesized amylose was measured and the yield was calculated.

結果を以下の表１２に示す。

The results are shown in Table 12 below.

セロビオースを出発原料としたときのアミロース合成収率は従来の方法（比較例７）では１６．３％であったが、ＰＧＫ、ＰＧＭを共存させることで約４０％まで上昇し（実施例７−１）、さらに基質濃度を上げ、初期ｐＨを弱アルカリ側にすることでアミロース収率が６６．８％にあがった（実施例７−３）。

The amylose synthesis yield using cellobiose as a starting material was 16.3% in the conventional method (Comparative Example 7), but increased to about 40% by coexistence of PGK and PGM (Example 7- 1) The amylose yield was increased to 66.8% by further increasing the substrate concentration and setting the initial pH to the weak alkali side (Example 7-3).

（実施例８−１から８−３：種々のｐＨ条件下での、セロビオースを出発物質としたアミロース合成）
反応開始時のｐＨの影響を調べるために、以下の表１３に記載の組成の溶液を調製し、反応開始時の溶液のｐＨをそれぞれ５．６、７．０または７．８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成させた。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、実施例８−１から８−３では約１０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）は、実施例８−１および８−２では約０．１０であり、実施例３では約０．０５７であった。合成されたアミロースの量を測定し、収率を計算した。 (Examples 8-1 to 8-3: Synthesis of amylose starting from cellobiose under various pH conditions)
In order to investigate the influence of pH at the start of the reaction, a solution having the composition described in Table 13 below was prepared, and the pH of the solution at the start of the reaction was adjusted to 5.6, 7.0, or 7.8, respectively. And amylose was synthesize | combined by incubating at 45 degreeC for 16 hours. When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was about 10 mM in Examples 8-1 to 8-3, and the ratio between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of cellobiose (Pi / CB ) Was about 0.10 in Examples 8-1 and 8-2, and was about 0.057 in Example 3. The amount of synthesized amylose was measured and the yield was calculated.

反応開始時点で測定したｐＨの値と、収率の結果を以下の表１４および図９に示す。   The pH values measured at the start of the reaction and the yield results are shown in Table 14 below and FIG.

この結果、反応溶液の初期ｐＨ値が高くなるほど、アミロース収率が上がることがわかった。

As a result, it was found that the higher the initial pH value of the reaction solution, the higher the amylose yield.

（実施例９：反応溶液中の遊離リン酸とセロビオースとのモル比（Ｐｉ／ＣＢ）の検討）
以下の表１５に示す組成の溶液を作製して４５℃で１６時間反応させてアミロースを合成した。反応開始時点でのこの溶液のｐＨを約７．８に調整した。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。添加した無機リン酸の量、無機リン酸とセロビオースとのモル比（Ｐｉ／ＣＢ）、アミロースの収率（％）を以下の表１６に示す。結果を図１０に示す。 (Example 9: Examination of molar ratio (Pi / CB) of free phosphoric acid and cellobiose in reaction solution)
A solution having the composition shown in Table 15 below was prepared and reacted at 45 ° C. for 16 hours to synthesize amylose. The pH of this solution at the start of the reaction was adjusted to about 7.8. The concentration of synthesized amylose was measured and the yield was calculated. Table 16 below shows the amount of inorganic phosphoric acid added, the molar ratio of inorganic phosphoric acid to cellobiose (Pi / CB), and the yield (%) of amylose. The results are shown in FIG.

この結果、セロビオースの約４倍濃度の遊離のリン酸が含まれるとアミロース合成が阻害された。

As a result, amylose synthesis was inhibited when free phosphoric acid having a concentration about 4 times that of cellobiose was contained.

（実施例１０：出発セロビオース濃度を変えた場合のアミロース収率の変化）
セロビオース濃度を変化させ、それに合わせて酵素量およびプライマー濃度を比例して増加させたことと実施例１０−１のポリリン酸濃度が１％であること以外は、実施例７−２と同じ組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを７．８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。合成されたアミロース量を測定し、収率を計算した。実施例１０−２は、実施例７−２と同じ条件での反応であり、実施例１０−３は、実施例７−３と同じ条件での反応であった。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、実施例１０−１では約２．８であり、実施例１０−２および１０−３では約１１．２あり、遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）は、実施例１０−１では０．１４０であり、実施例１０−２では約０．１１２であり、実施例１０−３では０．０６４であった。 (Example 10: Change in amylose yield when starting cellobiose concentration is changed)
The composition of Example 7-2 was the same as that of Example 7-2 except that the cellobiose concentration was changed and the amount of the enzyme and the primer concentration were increased proportionally and the polyphosphate concentration of Example 10-1 was 1%. Amylose was synthesized by preparing a solution, adjusting the pH of this solution to 7.8 at the start of the reaction, and incubating at 45 ° C. for 16 hours. The amount of synthesized amylose was measured and the yield was calculated. Example 10-2 was a reaction under the same conditions as Example 7-2, and Example 10-3 was a reaction under the same conditions as Example 7-3. When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was about 2.8 in Example 10-1, and about 11.2 in Examples 10-2 and 10-3. The ratio of the molar concentration to the molar concentration of cellobiose (Pi / CB) is 0.140 in Example 10-1, about 0.112 in Example 10-2, and 0.001 in Example 10-3. 064.

結果を以下の表１７および図１１に示す。   The results are shown in Table 17 below and FIG.

基質濃度を上昇させるとそれに伴い溶液中のアミロース濃度も上昇するので、アミロースが老化しやすい状態になる。そのため、高濃度基質からのアミロース合成ではアミロース収率が高くなる傾向にある（図１１）。

When the substrate concentration is increased, the amylose concentration in the solution is increased accordingly, so that amylose tends to age. Therefore, the amylose yield tends to increase in amylose synthesis from a high concentration substrate (FIG. 11).

（実施例１１：種々のｐＨ条件下での、Ｇ６−Ｐを出発物質としたアミロース合成）
反応開始時の溶液のｐＨを６．７〜８．５に変化させたこと以外は上記表９と同じ組成の溶液を調製し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成させた。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、いずれの条件でも０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とＧ６−Ｐのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）は、いずれの条件でも０であった。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。 (Example 11: Synthesis of amylose starting from G6-P under various pH conditions)
Amylose was synthesized by preparing a solution having the same composition as in Table 9 except that the pH of the solution at the start of the reaction was changed to 6.7 to 8.5 and incubating at 45 ° C. for 16 hours. . When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was 0 mM under any condition, and the ratio (Pi / G6-P) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of G6-P was: It was 0 in all conditions. The concentration of synthesized amylose was measured and the yield was calculated.

反応開始時点で測定したｐＨの値と、収率の結果を以下の表１８および図１２に示す。   The pH values measured at the start of the reaction and the yield results are shown in Table 18 below and FIG.

反応溶液の初期ｐＨを弱アルカリ側以上にすることでアミロース合成収率があがり約３０％の値を得た。初期ｐＨが６．７までの酸性側ではアミロースがほとんど合成されず、弱酸性から中性付近では低収率でアミロースを得た。初期ｐＨ７．１のとき収率６．３７％であった。ｐＨ７．３からｐＨ８．５ではアミロース収率１０％以上を示し、ｐＨ７．６からｐＨ８．５では約２４％以上のアミロース収率を示した。初期ｐＨ８．４のとき収率３０．５１％であった。

By making the initial pH of the reaction solution higher than the weak alkali side, the amylose synthesis yield was increased and a value of about 30% was obtained. Almost no amylose was synthesized on the acidic side up to an initial pH of 6.7, and amylose was obtained in a low yield from weakly acidic to neutral. The yield was 6.37% when the initial pH was 7.1. From pH 7.3 to pH 8.5, the amylose yield was 10% or more, and from pH 7.6 to pH 8.5, the amylose yield was about 24% or more. The yield was 30.51% when the initial pH was 8.4.

（実施例１２：反応溶液中の遊離リン酸とグルコース−６−リン酸とのモル比（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）の検討）
以下の表１９に示す濃度の無機リン酸を添加したこと以外は表９の組成の溶液を作成して４５℃で１６時間反応させてアミロースを合成した。反応開始時点でのこの溶液のｐＨを約８に調整した。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。添加した無機リン酸の濃度、無機リン酸とグルコース−６−リン酸とのモル比（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）、アミロースの濃度（ｍＭ）および収率（％）を以下の表１９に示す。結果を図１３に示す。 (Example 12: Examination of molar ratio (Pi / G6-P) of free phosphoric acid and glucose-6-phosphoric acid in reaction solution)
Amylose was synthesized by preparing a solution having the composition shown in Table 9 and reacting at 45 ° C. for 16 hours except that inorganic phosphoric acid having a concentration shown in Table 19 below was added. The pH of this solution at the start of the reaction was adjusted to about 8. The concentration of synthesized amylose was measured and the yield was calculated. Table 19 below shows the concentration of the added inorganic phosphoric acid, the molar ratio of inorganic phosphoric acid to glucose-6-phosphate (Pi / G6-P), the concentration (mM) and the yield (%) of amylose. The results are shown in FIG.

この結果、グルコース−６−リン酸の約０．５倍濃度の遊離のリン酸が含まれるとアミロース合成が阻害された。また、遊離リン酸の濃度が高いほど、収率が下がった。従って、この反応では、遊離リン酸をできる限り添加しないことが好ましい。

As a result, amylose synthesis was inhibited when free phosphoric acid having a concentration about 0.5 times that of glucose-6-phosphate was contained. Moreover, the yield decreased as the concentration of free phosphoric acid increased. Therefore, in this reaction, it is preferable not to add free phosphoric acid as much as possible.

（実施例１３：出発グルコース−６−リン酸濃度を変えた場合のアミロース収率の変化）
グルコース−６−リン酸濃度を変化させ、それに合わせて酵素量およびプライマー濃度を比例して増加させたこと以外は、表９と同じ組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。合成されたアミロース濃度を測定し、収率を計算した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、約０であり、遊離リン酸のモル濃度とグルコース−６−リン酸のモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）は、約０であった。 (Example 13: Change in amylose yield when starting glucose-6-phosphate concentration was changed)
A solution having the same composition as in Table 9 was prepared except that the glucose-6-phosphate concentration was changed and the enzyme amount and the primer concentration were proportionally increased accordingly, and the pH of the solution at the start of the reaction was prepared. Was adjusted to 8 and incubated at 45 ° C. for 16 hours to synthesize amylose. The synthesized amylose concentration was measured and the yield was calculated. When the concentration of free phosphoric acid in the solution at the start of the reaction was measured, it was about 0, and the ratio (Pi / G6-P) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of glucose-6-phosphate was It was about 0.

結果を以下の表２０、図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。   The results are shown in Table 20 below, FIGS. 14A and 14B.

基質濃度を上昇させるとそれに伴い溶液中のアミロース濃度も上昇するので、アミロースが老化しやすい状態になる。そのため、高濃度基質からのアミロース合成ではアミロース収率が高くなる傾向にある（図１４Ａ）。

When the substrate concentration is increased, the amylose concentration in the solution is increased accordingly, so that amylose tends to age. Therefore, amylose yield tends to increase in amylose synthesis from a high concentration substrate (FIG. 14A).

本発明により、安価で容易に入手可能なグルコースからα−グルカンを効率よく製造することができる。   According to the present invention, α-glucan can be efficiently produced from inexpensive and easily available glucose.

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。   As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, this invention should not be limited and limited to this embodiment. It is understood that the scope of the present invention should be construed only by the claims. It is understood that those skilled in the art can implement an equivalent range based on the description of the present invention and the common general technical knowledge from the description of specific preferred embodiments of the present invention. Patents, patent applications, and documents cited herein should be incorporated by reference in their entirety, as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.

図１は、本願発明で利用する種々の酵素反応の概略を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing an outline of various enzyme reactions used in the present invention. 図２は、グルコースを出発物質とした場合の、グルコース（Ｇｌｃ）量、グルコース−６−リン酸（Ｇ６−Ｐ）量、グルコース−１−リン酸（Ｇ−１−Ｐ）量、およびアミロースの合成量の経時変化を示すグラフである。FIG. 2 shows the amounts of glucose (Glc), glucose-6-phosphate (G6-P), glucose-1-phosphate (G-1-P), and amylose when glucose is used as a starting material. It is a graph which shows the time-dependent change of a synthetic amount. 図３は、グルコースを出発物質とした場合の、種々のｐＨでのアミロースの合成量を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the amount of amylose synthesized at various pHs using glucose as a starting material. 図４は、グルコースを出発物質とした場合の、反応開始時の溶液中の無機リン酸濃度／グルコース濃度比によるアミロース収率の変化を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing changes in the amylose yield depending on the inorganic phosphate concentration / glucose concentration ratio in the solution at the start of the reaction when glucose is used as a starting material. 図５は、グルコースおよびポリホスフェートグルコキナーゼを含む溶液をインキュベートした場合にグルコース−６−リン酸に変換された割合を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the rate of conversion to glucose-6-phosphate when a solution containing glucose and polyphosphate glucokinase is incubated. 図６は、アミロース、ホスホグルコムターゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液をインキュベートした場合のアミロース量、グルコース−１−リン酸量、グルコース−６−リン酸量および（グルコース−１−リン酸量とグルコース−６−リン酸量との合計）を示すグラフである。FIG. 6 shows the amount of amylose, glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate and (glucose-1-) when a solution containing amylose, phosphoglucomutase and α-1,4-glucan phosphorylase is incubated. It is a graph which shows the total of phosphoric acid amount and glucose-6-phosphoric acid amount). 図７Ａは、グルコースを出発物質とした場合の、グルコース濃度とアミロースの収率（％）との関係を示すグラフである。FIG. 7A is a graph showing the relationship between glucose concentration and amylose yield (%) when glucose is used as a starting material. 図７Ｂは、グルコースを出発物質とした場合の、グルコース濃度とアミロースの収量（ｍＭ）との関係を示すグラフである。FIG. 7B is a graph showing the relationship between glucose concentration and amylose yield (mM) when glucose is used as a starting material. 図８は、種々の包接化合物を使用し、グルコースを出発物質とした場合の、アミロースの収率を示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing the yield of amylose when various inclusion compounds are used and glucose is used as a starting material. 図９は、セロビオースを出発物質とした場合の、種々のｐＨでのアミロースの合成量を示すグラフである。FIG. 9 is a graph showing the amount of amylose synthesized at various pHs using cellobiose as a starting material. 図１０は、セロビオースを出発物質とした場合の、反応開始時の溶液中の無機リン酸濃度／セロビオース濃度比によるアミロース収率の変化を示すグラフである。FIG. 10 is a graph showing the change in amylose yield depending on the ratio of inorganic phosphate concentration / cellobiose concentration in the solution at the start of the reaction when cellobiose is used as a starting material. 図１１は、Ｇ６−Ｐを出発物質とした場合の、セロビオース濃度とアミロースの収率（％）との関係を示すグラフである。FIG. 11 is a graph showing the relationship between cellobiose concentration and amylose yield (%) when G6-P is used as a starting material. 図１２は、Ｇ６−Ｐを出発物質とした場合の、種々のｐＨでのアミロースの合成量を示すグラフである。FIG. 12 is a graph showing the amount of amylose synthesized at various pHs using G6-P as a starting material. 図１３は、Ｇ６−Ｐを出発物質とした場合の、反応開始時の溶液中の無機リン酸濃度／Ｇ６−Ｐ濃度比によるアミロース収率の変化を示すグラフである。FIG. 13 is a graph showing the change in amylose yield depending on the ratio of inorganic phosphoric acid concentration / G6-P concentration in the solution at the start of reaction when G6-P is used as a starting material. 図１４Ａは、Ｇ６−Ｐを出発物質とした場合の、Ｇ６−Ｐ濃度とアミロースの収率（％）との関係を示すグラフである。FIG. 14A is a graph showing the relationship between G6-P concentration and amylose yield (%) when G6-P is used as a starting material. 図１４Ｂは、グルコースを出発物質とした場合の、Ｇ６−Ｐ濃度とアミロースの収量（ｍＭ）との関係を示すグラフである。FIG. 14B is a graph showing the relationship between G6-P concentration and amylose yield (mM) when glucose is used as a starting material. 図１５は、本発明で使用され得る種々の方法をまとめて示す模式図である。FIG. 15 is a schematic diagram collectively showing various methods that can be used in the present invention.

配列番号１：Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのヌクレオチド配列；
配列番号２：Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのアミノ酸配列；
配列番号３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列；
配列番号４：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するホスホグルコムターゼのアミノ酸配列；
配列番号５：馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列；
配列番号６：馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子のアミノ酸配列；
配列番号７：合成ＤＮＡプライマー１のヌクレオチド配列；
配列番号８：合成ＤＮＡプライマー２のヌクレオチド配列；
配列番号９：Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのヌクレオチド配列；
配列番号１０：Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのアミノ酸配列；
配列番号１１：Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列；
配列番号１２：Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するホスホグルコムターゼのアミノ酸配列；
配列番号１３：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅに由来するホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列；
配列番号１４：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ由来のホスホグルコムターゼのアミノ酸配列。 SEQ ID NO: 1: Nucleotide sequence of polyphosphate glucokinase derived from Microlunatus phosphovolas;
SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of polyphosphate glucokinase derived from Microlunatus phosphovolas;
SEQ ID NO 3: nucleotide sequence of phosphoglucomutase from Escherichia coli;
SEQ ID NO: 4: amino acid sequence of phosphoglucomutase derived from Escherichia coli;
SEQ ID NO: 5: Nucleotide sequence of potato α-1,4-glucan phosphorylase gene;
SEQ ID NO: 6: amino acid sequence of potato α-1,4-glucan phosphorylase gene;
SEQ ID NO: 7: nucleotide sequence of synthetic DNA primer 1;
SEQ ID NO: 8: nucleotide sequence of synthetic DNA primer 2;
SEQ ID NO: 9: Nucleotide sequence of polyphosphate glucokinase derived from Thermobifida fusca;
SEQ ID NO: 10: amino acid sequence of polyphosphate glucokinase derived from Thermobifida fusca;
SEQ ID NO: 11: Nucleotide sequence of phosphoglucomutase from Thermus thermophilus;
SEQ ID NO: 12 amino acid sequence of phosphoglucomutase derived from Thermus thermophilus;
SEQ ID NO: 13: Nucleotide sequence of phosphoglucomutase from Thermotoga lettingae;
SEQ ID NO: 14: Amino acid sequence of phosphoglucomutase from Thermotoga lettingae.

Claims (19)

グルコースと、ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のグルコース濃度は、１００ｍＭ〜２０００ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ５．７〜ｐＨ１２であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）が０．１５以下である、方法。 The method includes a step of producing α-glucan by reacting a solution containing glucose, polyphosphate, primer, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase. And
The glucose concentration in the solution at the start of the reaction is 100 mM to 2000 mM,
The pH of the solution at the start of the reaction is pH 5.7 to pH 12,
A method in which a ratio (Pi / Glc) between a molar concentration of free phosphoric acid and a molar concentration of glucose in the solution at the start of the reaction is 0.15 or less. 前記反応開始時の前記溶液中のグルコース濃度が２００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the glucose concentration in the solution at the start of the reaction is 200 mM to 2000 mM. 前記反応開始時の前記溶液中のグルコース濃度が５００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein a glucose concentration in the solution at the start of the reaction is 500 mM to 2000 mM. 前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ７．４〜ｐＨ１１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the pH of the solution at the start of the reaction is pH 7.4 to pH 11. 前記α−グルカンがアミロースである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the α-glucan is amylose. 前記溶液が、ゲスト化合物を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 The solution contains a guest compound, and the guest compound is a compound that can be included in the produced α-glucan,
The method according to any one of claims 1 to 5, wherein an inclusion compound of α-glucan obtained in the production step and the guest compound is formed. 前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、請求項６に記載の方法。   The guest compound is N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate or 3- (N, N-dimethylpalmityl- The process according to claim 6, which is ammonio) propane sulfonate. グルコース−６−リン酸と、プライマーと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のグルコース−６−リン酸濃度は、２０ｍＭ〜２０００ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ６．７〜ｐＨ１１であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコース−６−リン酸のモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）が０．４以下である、方法。 A method comprising producing α-glucan by reacting a solution containing glucose-6-phosphate, a primer, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase,
The concentration of glucose-6-phosphate in the solution at the start of the reaction is 20 mM to 2000 mM,
The pH of the solution at the start of the reaction is pH 6.7 to pH 11,
A method in which the ratio (Pi / G6-P) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of glucose-6-phosphate in the solution at the start of the reaction is 0.4 or less. 前記反応開始時の前記溶液中のグルコース−６−リン酸濃度が１００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項８に記載の方法。   The method according to claim 8, wherein the concentration of glucose-6-phosphate in the solution at the start of the reaction is 100 mM to 2000 mM. 前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ７．３〜ｐＨ１１である、請求項８または９に記載の方法。   The method according to claim 8 or 9, wherein the pH of the solution at the start of the reaction is pH 7.3 to pH 11. 前記α−グルカンがアミロースである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 8 to 10, wherein the α-glucan is amylose. 前記溶液が、ゲスト物質を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。 The solution contains a guest substance, and the guest compound is a compound that can be included in the produced α-glucan,
The method according to any one of claims 8 to 11, wherein an inclusion compound between the α-glucan obtained in the production step and the guest compound is formed. 前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、請求項１２に記載の方法。   The guest compound is N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate or 3- (N, N-dimethylpalmityl- The process according to claim 12, which is ammonio) propane sulfonate. セロビオースと、ポリリン酸と、プライマーと、セロビオースホスホリラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のセロビオース濃度は、１００ｍＭ〜３５０ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ１１であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）が２．０以下である、方法。 Includes a step of producing α-glucan by reacting a solution containing cellobiose, polyphosphate, primer, cellobiose phosphorylase, polyphosphate glucokinase, phosphoglucomutase, and α-1,4-glucan phosphorylase A way to
The cellobiose concentration in the solution at the start of the reaction is 100 mM to 350 mM,
The pH of the solution at the start of the reaction is pH 5 to pH 11,
A method in which the ratio (Pi / CB) between the molar concentration of free phosphoric acid and the molar concentration of cellobiose in the solution at the start of the reaction is 2.0 or less. 前記反応開始時の前記溶液中のセロビオース濃度が１２０ｍＭ〜３５０ｍＭである、請求項１４に記載の方法。   The method according to claim 14, wherein the cellobiose concentration in the solution at the start of the reaction is 120 mM to 350 mM. 前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ５．６〜ｐＨ１１である、請求項１４または１５に記載の方法。   The method according to claim 14 or 15, wherein the pH of the solution at the start of the reaction is pH 5.6 to pH 11. 前記α−グルカンが、アミロースである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 14 to 16, wherein the α-glucan is amylose. 前記溶液が、ゲスト物質を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。 The solution contains a guest substance, and the guest compound is a compound that can be included in the produced α-glucan,
The method according to any one of claims 14 to 17, wherein an inclusion compound of α-glucan obtained in the production step and the guest compound is formed. 前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、請求項１８に記載の方法。   The guest compound is N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate or 3- (N, N-dimethylpalmityl- 19. A process according to claim 18 which is ammonio) propane sulfonate.

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