CN102988959B - Nkg2d的调节 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防自身免疫性和/或炎性疾病的方法和组合物。具体地讲，本发明提供了通过调节NKG2D减弱自身反应性T细胞和/或NK细胞的扩增和功能的治疗剂。

Description

NKG2D的调节

本申请是申请号为200580017932.6、申请日为2005年4月5日、发明名称为“NKG2D的调节”的中国发明专利申请的分案申请。

本申请要求申请日为2005年3月7日的美国临时申请60/659,678，申请日为2004年6月1日的60/576,242，和申请日为2004年4月5日的60/559,919的优先权。

本发明是在得到政府的部分资助的条件下完成的，来自NationalInstitutes Health的授权文号为CA89189，CA95137，P30 DK26743和P60 DK63720。因此，美国政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及用于治疗和/或预防炎性综合征的方法和组合物，特别是通过削弱自身反应性T细胞的增殖和功能来治疗和/或预防炎性综合征的方法和组合物，以及与它相关的任何其他发明特征。另外，本发明提供了用于预防NK细胞-介导的移植排斥的方法和组合物。

发明背景

NKG2D是在人类和小鼠中在NK细胞和某些类型的T细胞上表达的激活受体。NKG2D能识别人体中的UL16结合蛋白（ULBP1）、ULBP2、ULBP3，ULBP4和I型MHC链-相关分子（MICA和MICB）和小鼠体内的次要组织相容性抗原60（H60）、视黄酸早期可诱导转录物（RAE-1）和鼠ULBP-样转录物1（MULT-1）。NKG2D同型二聚体与接头分子DAP10结合，它包括共有的p85磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3-K）结合基序Tyr-Ile-Asn-Met（YINM，参见SEQ ID NO：9）。NKG2D和DAP 10在它们的生物合成途径上在早期相互作用，并且这种相互作用是将NKG2D转移到细胞表面上所必需的。

发明概述

本发明提供了治疗或预防与N的KG2D-介导的激活相关的综合征方法和组合物。

一方面，所述方法是通过在适合治疗或预防所述综合征的条件下使表达NKG2D的白细胞与能减弱所述细胞的配体诱导的NKG2D激活的制剂接触进行的。在某些实施方案中，所述接触导致与对照相比配体诱导的NKG2D激活降低至少大约30%；在其他实施方案中，所述降低为至少大约40%、50%、60%、70%、80%或90%。

所述制剂能够，但不局限于减弱NKG2D与DAP10的相互作用；降低细胞表面上的NKG2D的数量；增加表面NKG2D内在化的比率；通过NKG2D-NKG2D配体复合体减弱信号传导；和/或减弱NKG2D-编码核酸的转录或翻译。在某些实施方案中，所述制剂能在某些症状下增强表面NKG2D多肽的内在化（例如，在慢性炎性综合征中出现的症状），在所述症状中，MICA、MI CB、ULBP1、ULBP2、ULBP 3或ULBP4中的一种或多种不能减少细胞表面NKG2D的数量到提供治疗效果所必需的程度（对于治疗剂而言）。

在某些实施方案中，用于本发明提供的组合物和方法中的制剂包括能结合NKG2D的抗体或它的NKG2D-结合片段。所述抗体可以是单克隆抗体，例如，人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在实施本发明时，靶白细胞可以是NKG2D+CD8⁺T细胞、NKG2D+CD4+T细胞、NKG2D+γδT细胞中的一种或多种；和NKG2D+NK细胞；或靶细胞可以包括巨噬细胞。

一方面，本发明的方法可用于在诸如人类患者的哺乳动物中治疗和/或预防与NKG2D-介导的激活相关的炎性综合征。所述人类患者可以被诊断为患有或者具有发生所述炎性综合征的较大风险。在特定方面，本发明的方法涉及在人类患者中治疗诊断的症状。

另一方面，本发明还提供了用于治疗或预防类风湿性关节炎、多发性硬化、乳糜泻、炎性肠病，如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、牛皮癣或移植排斥包括骨髓移植排斥的方法。还可以使用本发明的综合征包括，但不局限于I型糖尿病、***性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、重症肌无力、传染性神经元炎、自身免疫眼色素层炎、夏科氏肝硬变、自身免疫性肝炎、自身免疫溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性血小板减少症、Grave's病、自身免疫性***、自身免疫性***、颞动脉炎、抗-磷脂综合征、韦格内氏肉芽肿症、贝切特氏综合征、硬皮病、多肌炎、皮肤肌炎、关节强硬性脊椎柱炎、Sjogren's综合征、疱疹样皮炎、慢性天疱疮、白癫风、牛皮癣关节炎、骨关节炎、类固醇抗性哮喘、慢性阻塞性肺病和动脉粥样硬化。在特定方面，所述综合征不是I型糖尿病。

另一方面，本发明提供了包括NKG2D调节剂，例如，抗-NKG2D抗体或抗体片段的药用制剂和试剂盒。在一个系列的实施方案中，所述试剂盒包括NKG2D调节剂和有关使白细胞与NKG2D调节剂在适合治疗或预防白细胞的与NKG2D介导的激活相关的综合征的条件下接触的说明。

本发明还提供了鉴定NKG2D调节剂的方法，包括：使NKG2D+白细胞与检验试剂接触；和测定由所述白细胞表达的NKG2D。在某些优选实施方案中，测定NKG2D表达包括测定NKG2D转录、翻译和内在化中的一种或多种。所述实施方案的亚类还包括按照FDA的指南临床检测所述检验试剂。

另外，本发明提供了鉴定NKG2D调节剂的方法，包括：使NKG2D+白细胞与检验试剂接触；并且测定配体诱导的白细胞的NKG2D激活。在某些优选实施方案中，测定配体诱导的NKG2D激活包括测定DAP10磷酸化、p85 PI3激酶活性、Akt激酶活性、IFN-γ产量和NKG2D+靶细胞细胞溶解中的一种或多种。所述实施方案的亚类还包括按照FDA指南临床检测所述检验试剂。

另一方面，本发明提供了鉴定用于治疗或预防与NKG2D激活相关的炎性症状和/或自身免疫疾病的治疗或预防制剂的方法。该方法包括筛选在细胞群体中特异性结合NKG2D并且削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的增殖，而又不会明显耗尽这些细胞的能力的潜在制剂（例如，抗体或抗体片段）、合适的模型、宿主或患者（例如，通过使用本文所披露的实验方法分析所述抗体）。所述筛选还可以包括或可替代地筛选诱导NKG2D+T细胞或NK细胞表面上的NKG2D内在化的能力。

另一方面，本发明涉及将对NKG2D特异并且能够削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增而又不会耗尽所述细胞的制剂（例如，抗体或抗体片段）制备用于治疗类风湿性关节炎的药品的用途。

另一特别方面，本发明涉及将对NKG2D特异并且能够削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增而又不会耗尽所述细胞的制剂（例如，抗体或抗体片段）制备用于治疗多发性硬化的药品的用途。

在另一示例性方面，本发明涉及将对NKG2D特异并且能够削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增而又不会耗尽所述细胞的制剂（例如，抗体或抗体片段）制备用于治疗炎性肠病的药品的用途。

本发明的另一示例性方面涉及将对NKG2D特异并且能够削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增而又不会耗尽所述细胞的制剂（例如，抗体或抗体片段）制备用于治疗牛皮癣的药品的用途。

本发明的另一方面涉及将对NKG2D特异并且能够削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增而又不会耗尽所述细胞的制剂（例如，抗体或抗体片段）制备用于治疗移植排斥的药品的用途。

附图的简要说明

图1是在前驱糖尿病的NOD小鼠的胰腺细胞上RAE-1表达的图。图1（a）表示在12-16周大的NOD和BALB/c小鼠的胰腺组织中通过定量RT-PCR测定的RAE-1mRNA。图1（b）表示通过在4-6周和12-16周大的NOD和NOD重度联合免疫缺陷（NOD.scid）小鼠的胰腺组织中通过定量RT-PCR测定的RAE-1mRNA。图1（c）表示在前驱糖尿病的NOD的不同组织中通过定量RT-PCR测定的RAE-1mRNA。示出了典型数据，并且表示为RAE-1转录的诱导倍数（fold-induction）。诱导倍数是根据以下公式计算的：诱导倍数=标准化为HPRT的前驱糖尿病的NOD器官中RAE-1转录物的数量除以标准化为HPRT的幼小NOD器官中RAE-1转录物的数量。图1（d）表示通过流式细胞测量术使用抗-CD45和抗-RAE-1mAb分析的在CD45-NOD胰腺细胞上的RAE-1表达。图1（e）表示在从NOD小鼠的胰腺中分离的CD45-胰岛细胞上（上部图片）和胰腺引流***（PLN）（下部图片）中的RAE-1表达，用抗-CD45和抗-RAE-1mAb染色。

图2（a）是在CD8⁺T细胞上NKG2D表达的图。从10周和25周大的NOD小鼠脾、肝、胰***（PLN）和胰腺中分离白细胞，并且通过标准方法，使用抗CD8和NKG2D的单克隆抗体染色。示出了所标明的NKG2D+CD8⁺T细胞的百分比（表示为总CD8⁺T细胞的百分比）。图2（b）是CD44和Ly-6C在胰腺和PLN NKG2D+CD8⁺T细胞上表达的图。用抗CD8、NKG2D和CD44或Ly6C的单克隆抗体对细胞进行染色，并且示出了分选的CD8⁺T细胞的结果。图2（c）是NKG2D和CD44在胰腺和PLN NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8⁺T细胞上表达的图。用NRP-V7/H-2K^d四聚体和抗CD8和CD44或NKG2D的单克隆抗体对细胞进行染色。示出了所标明的NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8⁺T细胞（对CD8⁺T细胞的分选）的标明的百分比。图2（d）是蓄积在胰岛附近的NKG2D+CD8⁺T细胞的显微照片。随后用抗-CD8、抗-CD68（巨噬细胞标记）、抗-NKG2D和抗胰岛素抗体对从16周大的前驱糖尿病的NOD小鼠中分离的胰腺的连续冷却切片进行染色。左侧：相差微分图像，中央：CD8（红色），NKG2D（绿色）和胰岛素（蓝色）；右侧：CD68（红色），NKG2D（绿色）和胰岛素（蓝色）。双-阳性CD8⁺NKG2D+T细胞和CD68+NKG2D+巨噬细胞是黄色的。

图3（a）是用抗-NKG2D mAb治疗7-25周大的发生糖尿病的NOD小鼠的效果的图。黑色圆圈：用抗-NKG2D mAb处理的NOD小鼠（n=7）（每两周一次，剂量为200μg/小鼠IP）；浅色圆圈，用无菌的非致热PBS处理的NOD小鼠（n=7）。当连续两次测定血糖含量超过300mg/dL时就诊断为糖尿病。图3（b）是每周一次从6周至40周在图3a中所示出的动物中测定的血糖含量的图。图3（c）是在晚期前驱糖尿病阶段用抗-NKG2D mAb处理之后NOD小鼠出现糖尿病比例的图。用抗-NKG2D mAb（每两周一次，剂量为200μg/小鼠IP，黑色圆圈；n=14）或对照Ig（浅色圆圈；n=14）从13周到25周处理NOD小鼠。在25周大时，七只抗-NKG2D mAb-处理的小鼠继续接受治疗，直到30周大（黑色三角形）。图3（d）是显示用图3c所示动物从12周-36周开始每周测定的血糖含量的图。

图4（a）是用对照Ig（cIg）或抗-NKG2D mAb（200μg/小鼠IP，每两周一次，从第7周开始）处理的11周大的NOD小鼠的白细胞浸润胰腺和胰***的分析的图，所述切片业已用抗-CD8、抗-NKG2D和抗-CD44进行过染色，并且进行流式细胞测量术。所示出的结果是对CD8⁺T细胞的分选。图4（b）是用对照Ig从7周大开始处理的16周大的NOD小鼠的胰岛的显微照片。冷冻的胰腺切片是从用对照I g处理的16周大的NOD小鼠制备的，并且染色。左侧：DAPI（核）染色；右侧：CD8（红色），NKG2D（绿色）和胰岛素（蓝色）。图4（c）是用抗-NKG2D mAb从7周大开始进行处理的16周大的NOD小鼠的胰岛按照图片（b）所示制备并染色的显微照片（200μg/小鼠IP，每两周一次）。图4（d）是抗-NKG2D抗体治疗对自身反应性NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8⁺T细胞在胰腺中蓄积的效果的图。从18周大的NOD小鼠的胰腺和PLN中分离白细胞，所述小鼠是用抗-NKG2D mAb（200μg/小鼠IP，每两周一次）或对照Ig从13周大开始处理的。示出了NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8⁺T细胞（对CD8+T细胞的分选）的标明的百分比。图4（e）是来自用对照Ig或用抗-NKG2D（200μg/小鼠IP，每两周一次）处理的小鼠脾脏和外周血中分离，并用NRP-V7/H-2K^d四聚体和抗-CD8 mAb染色的淋巴细胞的图。所标明的百分比是NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性细胞（对CD8⁺T细胞群体的分选）。图4（f）是从用对照Ig（cIg）或抗-NKG2D处理的（200μg/小鼠IP，每两周一次）25周大的NOD小鼠体内分离的胰***的图，正如所标明的，处理是从13周大开始的，并且用PMA（20ng/ml）和伊屋诺霉素（500ng/ml）和布雷菲德菌素A（5μg/ml）培养6小时。通过免疫荧光染色和流式细胞测量术在CD8+T细胞中检测细胞内IFN-γ。

图5是显示来自NOD T细胞转移入NOD重度联合免疫缺陷受体的继承转移实验的流式细胞测定的图。图5（a）表示移植了NOD T细胞的NOD重度联合免疫缺陷小鼠的胰腺、PLN和脾脏中的NKG2D⁺CD8⁺T细胞。在继承转移之前，用抗-CD8和抗-NKG2D对来自糖尿病NOD供体的纯化的T细胞进行染色（a，上部左侧图片）。在转移五周之后，用抗-CD8和抗-NKG2D对从胰腺、PLN和脾脏中收获的细胞进行染色（a，上部图片）或用抗-NKG2D和抗-CD44染色（a，下部图片）。示出了NKG2D⁺CD8⁺T细胞的百分比（对CD8⁺T细胞的分选）。图5（b）表示自身反应性NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8+T细胞在接收了糖尿病NOD小鼠的继承转移的T细胞的NOD重度联合免疫缺陷小鼠中的蓄积，所述糖尿病NOD小鼠用抗-NKG2D mAb（200μg/小鼠IP，每两周一次）或对照Ig处理，在转移时开始，并且在转移10周之后分析。所标明的自身反应性NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8+T细胞的百分比是对分选的活细胞的检测。图5（c）表示对来自相同处理的小鼠的NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性T细胞、分选的CD8+T细胞上NKG2D的检测。图5（d）是显示移植了发生为糖尿病的NOD小鼠的T细胞的NOD重度联合免疫缺陷小鼠的比例的图。接受了来自糖尿病NOD小鼠的继承转移的T细胞的五周大的NOD重度联合免疫缺陷小鼠从5周开始到14周用抗-NKG2D mAb（黑色圆圈；n=6）或对照Ig（浅色圆圈；n=7）处理。用200μg抗-NKG2D mAb CX5对小鼠进行腹膜内注射，每周两次。当血糖含量在两次连续测定时都超过300mg/dL时就诊断为糖尿病。图5（e）是显示在停止用抗-NKG2DmAb处理之后自身反应性NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8+T细胞增殖的图。在停止用抗-NKG2D mAb处理移植有糖尿病NOD小鼠的T细胞的NOD重度联合免疫缺陷小鼠四周之后处死小鼠，并且分析胰腺的NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性，NKG2D+CD8+T细胞的浸润。为了进行比较，还分析了用出现糖尿病的对照Ig处理过的小鼠。

图6（a）是在继承转移之前在8.3TcR-转基因NOD T细胞上缺少NKG2D表达的图。淋巴细胞是从幼小的8.3TcR-转基因NOD小鼠的***和脾脏中分离的。然后通过磁力细胞分选来纯化8.3TcR-转基因NODT细胞。在T细胞转移之前，用抗-CD8和NRP-V7/H-2K^d四聚体或抗-NKG2D对8.3TcR-转基因NOD T细胞进行染色，并且通过流式细胞测量术分析，正如图中所示出的。图6（b）是在8.3TcR-转基因NOD T细胞继承转移两天之后NKG2D在胰腺中8.3TCR转基因NOD T细胞上表达的图。在8.3TcR-转基因NOD T细胞继承转移两天之后，从在细胞转移的同时用对照Ig或抗-NKG2D mAb CX5处理过的小鼠胰腺中分离白细胞。用NRP-V7/H-2K^d四聚体和抗-NKG2D对细胞进行染色，并且通过流式细胞测量术分析。示出了NKG2D在继承转移的T细胞（通过分选NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性细胞鉴定）上的表达。图6（c）是抗-NKG2DmAb CX5在胰腺中8.3TcR-转基因CD8+NOD T细胞增殖的影响的图。将CFSE-标记的8.3TcR-转基因NOD T细胞（1x10⁷）转入10周大的野生型NOD小鼠体内（第0天）。在第－1，第1和第5天用cIg或抗-NKG2DmAb CX5（200μg）处理受体NOD小鼠。在转移之后，处死受体NOD小鼠，并且从胰腺、胰***（PLN）和肠系膜***（MLN）中分离和分析白细胞。在（c）中所示出的细胞是分选的活的CD8-阳性淋巴细胞。图6（d）是在对照Ig（空心条柱）和抗-NKG2D mAb（实心条柱）-处理的小鼠中CSFS-标记的细胞百分比的图，所述细胞在转移之后在第2、3和4天已发生了一次或多次***（即，增殖细胞），通过以下公式计算：%增殖细胞=（总的CFSE＋NRP-V7/H-2K^d四聚体＋CD8+细胞－非***的CFSE＋NRP-V7/H-2K^d四聚体＋CD8+细胞）×100/总的CFSE＋NRP-V7/H-2K^d四聚体＋CD8+细胞。

图7表示用100nM IGRP（葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白）肽培养3天，然后在有200U/ml人重组IL-2和4ng/ml IL-7的条件下再生长5天之后的8.3TcR-转基因NOD淋巴细胞的显微照片。激活的8.3TcR-转基因CD8+T细胞在冰上用抗-NKG2D mAb CX5染色，并且用霍乱毒素B进行复染色，以便对细胞表面膜进行标记。在37℃下将一等份这种染色细胞培养30分钟，并且将另一等份保持在冰上。用荧光显微镜分析细胞。在显微照片中，NKG2D表达表现为绿色荧光，而红色荧光表示霍乱毒素B（膜）染色。注意，NKG2D出现于在冰上培养的细胞的细胞表面上，不过在37℃下培养的细胞中得到了调控并且内在化。

图8是抗-NKG2D mAb对携带NKG2D的CD8+T细胞的体内作用的图。用100nM OVA肽激活OT-1卵白蛋白（OVA）-特异性TcR-转基因CD8+T细胞3天时间，然后用200U/ml人重组IL-2和4ng/ml IL-7再培养5天时间。NKG2D是在激活的OT-1T细胞上表达的（>95%），所述细胞是用CFSE标记并且继承转移（2x10⁷细胞）到C57BL/6小鼠体内。在第－2、0和+2天用抗-NKG2D mAb或对照大鼠Ig（每次腹膜内注射200μg）处理接受转移的CD8+NKG2D+OT-1 TcR-转基因T细胞的小鼠。图8（a）：转移4日之后，采集血液样品，用抗小鼠CD8和NKG2D的mAbs染色，并且通过流式细胞测量术进行分析。标明了用CSFE标记的CD8+T细胞的百分比。图8（b）：在CFSE-标记的OT-1 TcR-转基因T细胞继承转移并且按（a）中所示用对照Ig或抗-NKG2D mAb CX5进行处理之后第21天，处死小鼠，分离脾细胞，并且通过流式细胞测量术进行分析。图8（c）：在CFSE-标记的CD8+NKG2D+OT-1T细胞继承转移之后第7天，用耗尽大鼠抗-小鼠CD8mAb（2.43杂交瘤，大鼠IgG2b同种型）注射小鼠。三天之后，用对照Ig、抗-CD8或抗-NKG2D mAb对外周血进行染色，并且通过流式细胞测量术进行分析。本实验的目的是证实在体内施用CX5抗-NKG2D单克隆抗体时，这种抗体不会耗尽NKG2D+CD8+T细胞。

图9是抗-NKG2D mAb对自身反应性CD8+T细胞增殖的影响的图。用CSFE标记8.3TcR-转基因NOD T细胞，并且转入野生型NOD小鼠，所述小鼠是用对照Ig或抗-NKG2D mAb CX5处理过的，参见图6。用NRP-V7/H-2K^d四聚体和抗-CD8mAb对从胰腺、胰***、肠系膜***和脾脏中收集的细胞进行染色，并且通过流式细胞测量术进行分析。示出了对CD8-阳性NRP-V7/H-2K^d四聚体阳性细胞分选的淋巴细胞的柱状图。在每一个柱状图中示出了增殖（***一次以上）和非-增殖细胞（对CFSE+CD8+NRP-V7/H-2K^d四聚体+T细胞分选）的百分比。用同种型-匹配的对照I g或用于证实了所述制剂结合特异性的四聚体染色的对照进行的细胞染色。

图10表示对NOD胰腺细胞上NKG2D配体染色的特异性。图10（a）：分离NOD胰腺细胞，并且用抗-CD45mAb和用对照Ig、抗-泛RAE-1mAb（克隆186107）、抗-RAE-lγmAb（克隆CX1）或小鼠NKG2D-Ig融合蛋白（与人IgGl Fc融合的小鼠NKG2D的细胞外结构域）进行染色，随后通过合适的第二个步骤的制剂显像。通过流式细胞测量术分析细胞，并且评估CD45-阴性和碘化丙锭-阴性，活细胞。用同种型-匹配的对照Ig（cIg）染色的细胞表现出mAb结合的特异性（细线条）。图10（b）：纯的抗-RAE-1 mAbs阻断了生物素-标记的抗-RAE-1 mAbs的染色，证实了结合的特异性。胰腺细胞用0.25μg纯化的cIg、抗-泛RAE-1mAb克隆186107或抗-RAE-1γmAb克隆CXI（它还能与RAE-1α和RAE-1β交叉反应）预培养。在冰上培养20分钟之后，再用0.25μg生物素化的对照Ig、生物素化的抗-RAE-1 mAb克隆186107、生物素化的抗-RAE-1γmAb克隆CX1和FITC-缀合的抗-CD45mAb对所述细胞进行染色20分钟。为了检测生物素化的mAbs，洗涤细胞，并且用PE-缀合的抗生物素蛋白链菌素培养。通过流式细胞测量术分析细胞，并且所显示的数据是对CD45-阴性，碘化丙锭-阴性，活细胞分选的。因此，使用下列三种独立的制剂在NOD胰腺细胞上检测NKG2D配体：抗-RAE-1 mAb克隆186107、抗-RAE-1 mAb克隆CX1和小鼠NKG2D-Ig融合蛋白。抗-RAE-1 mAb染色是特异性的，就是说，生物素化的抗-RAE-1 mAb染色能够被纯化的抗-RAE-1 mAbs完全阻断，而不能被对照大鼠IgG阻断。

图11（a）显示鼠NKG2D的cDNA序列（SEQ ID NO：1）。图11（b）显示鼠NKG2D的氨基酸序列（SEQ ID NO：2）。图11（c）显示人NKG2D的cDNA序列（SEQ ID NO：3）。图11（d）显示人NKG2D的氨基酸序列（SEQ ID NO：4）。

图12是NKL细胞（人NK白血病细胞系）的流式细胞分析的图，所述细胞已用小鼠抗-人NKG2D抗体（克隆149810）培养了16小时，以便刺激NKG2D内在化（右侧图片）。左侧图片表示业已用对照抗体培养了16小时的细胞。在每一种场合下，用酸性缓冲液（pH3.5）简单地洗涤细胞，以便除掉任何残余的结合抗体，然后用对照Ig或抗-NKG2DmAb染色，然后用藻红蛋白-缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体染色。该实验表明，抗-人NKG2D单克隆抗体诱导了NKG2D的内在化（调节），而用对照Ig培养不能导致NKG2D内在化。

图13表示RAE-1是在B/c BM细胞上表达的，而不是在B6 BM细胞上表达。图13（a）：用小鼠NKG2D-人Ig Fc融合蛋白（NKG2D Ig）或对照人Ig（cIg）对最新分离的BM细胞进行染色。为了检测NKG2D-Ig的结合，将PE-缀合的抗-人IgG抗体（抗-人Ig PE）用作二级抗体。虚线表示BM细胞上的cIg染色。粗线条表示NKG2D配体在BM细胞上的表达。图13（b）：用生物素化的抗-泛RAE-1mAb、生物素化的抗-H60mAb、生物素化的抗-MULTI mAb或生物素化的同种型-匹配的cIg对BM细胞进行染色，然后用PE-缀合的抗生物素蛋白链菌素染色。虚线表示cIg染色，而粗线条表示RAE-1、H60和MULTI在BM细胞上的表达。图13（c和d）：在－2天用抗-NK1.1mAb处理CB6F1受体。在第0天，对受体进行辐射（11Gy），然后用B/c或CB6F1BM细胞（4x10⁶）重建。在第7天，从受体脾脏中分离细胞，并且按照图片a和b所示进行分析。虚线表示cIg对BM细胞的染色。粗线条表示NKG2D配体、RAE-1、H60和MULTI在BM细胞上的表达。数字表示染色细胞的平均荧光（任意线性单位）。图13（e和f）：用图表表示RAE-1-表达细胞的表型。将BM细胞转入用抗-NK1.1mAb预处理过的辐射过的受体。按图片c所示方法分离细胞并且染色。图13（g）：显示增殖细胞能表达RAE-1。将B/c BM细胞转入用抗-NK1.1mAb预处理过的辐射过的CB6F1小鼠体内。转移六天之后，将BrdU（0.8mg/小鼠）注射到小鼠体内。2或12小时之后，收集来自受体脾脏的细胞，并且用抗-泛-RAE-1mAb和抗-BrdU进行染色。图13（h和I）：表示RAE-1在5-FU-处理的BM的后代上表达。将来自5-氟尿嘧啶-处理的B/c小鼠的BM细胞转入用抗-NK1.1mAb预处理过的辐射过的CB6F1小鼠体内。转移八天之后，按图片c和e所示分离细胞并且进行分析。图13（i）：表示c-试剂盒和RAE-1-阳性分选细胞的Sca-1染色。在图片e-I中，>98%的用cIg染色的细胞在左下方的象限（未示出）。示出了上面两个象限中的细胞百分比。以上结果至少在两次独立的实验中是可再现的（示出了代表性数据）。

图14（a）：表示了抗-NKG2D mAb能阻断B/c BM在CB6F1杂交小鼠体内的排斥。将大约4x10⁶BM细胞转入辐射过的CB6Fl受体。在第5天用¹²⁵IUdR注射受体小鼠，并且在第六天收集脾脏和计数。黑色条柱显示在B/c BM->CB6F1小鼠脾脏中¹²⁵IUdR的吸收，而白色线条表示放射线标记在CB6F1 BM->CB6F1受体中的吸收。按图中所示用非耗尽的，中和抗-NKG2D mAb或NK细胞-耗尽的抗-NK1.1mAb（200μg/小鼠，第－2天）处理小鼠。结果表示为平均值±S.D.cpm（5只小鼠/组）。重复进行该实验两次，获得了相当的结果。图14（b）：表示B/c供体细胞的表型，它能对用抗-NKG2D mAb或对照I g处理过的辐射过的CB6F1受体进行种群恢复。按图片a所示处理小鼠，在移植8天之后收获脾细胞，同时对细胞进行染色，并且数据如图13所示。

图15表示表达RAE-1的同源的BM细胞的排斥。图15（a）表示RAE-1ε在RAE-1ε转基因B6小鼠的骨髓细胞上的表达。从野生型B6和RAE-1ε转基因B6小鼠中新分离的骨髓用cIg或抗-泛-RAE-1 mAb进行染色。图15（b）表示B6NK细胞在体外杀伤同源的RAE-1ε转基因BM细胞。将从野生型B6和RAE-1ε转基因B6小鼠中新分离的BM用作体外细胞毒性测定的标准的目标，用IL-2-激活的野生型NK细胞（B6NK细胞，在2000U/ml重组人IL-2中培养七天时间，由National Cancer InstituteBiological Resources Branch Pre-clinical Repository提供）用作效应物，在浓度为10μg/ml的cIg或抗-NKG2D mAb（克隆191004）存在的条件下进行。图15（c）表示B6小鼠排斥表达RAE-1ε的同源的骨髓。将大约4x10⁶RAE-1ε转基因B6BM细胞转入辐射过的B6受体。在第5天用¹²⁵IUdR注射受体小鼠，并且在第六天收获脾脏和计数。黑色条柱表示在RAE-Iε的转基因BM->B6小鼠的脾脏中的¹²⁵IUdR的吸收，而白色条柱表示放射线标记在野生型B6BM->B6受体中的吸收。按图中所示用非耗尽的，中和抗-NKG2D mAb或NK细胞-耗尽的抗-NKl.l mAb处理小鼠（200μg/小鼠，第-2天），结果表示为平均值±S.D.cpm（5只小鼠/组）。该实验重复进行两次，获得了相似结果。图15（d）表示CB6F1小鼠排斥表达CB6F1ε的同源骨髓。将大约4x10⁶RAE-1ε转基因CB6F1BM细胞转入辐射过的CB6F1受体。在第5天用¹²⁵IUdR注射受体小鼠，并且在第六天收获脾脏和计数。黑色条柱表示RAE-Iε转基因BM->CB6F1小鼠脾脏中的¹²⁵IUdR吸收，而白色条柱表示放射线标记在野生型CB6F1BM->CB6F1受体中的吸收。按图片c所示处理小鼠并且示出了数据。

图16（a）表示DAP10-/-小鼠不能有效地排斥表达RAE-1ε的同源的骨髓。将大约4x10⁶RAE-1ε转基因B6BM细胞转入辐射过的受体。在第5天用¹²⁵IUdR注射小鼠，并且在第六天收获脾脏和计数。黑色条柱表示在RAE-1ε转基因B6BM->野生型B6小鼠脾脏中的¹²⁵IUdR的吸收，白色条柱表示在RAE-1ε转基因B6BM->DAP10-/-B6受体中放射线标记的吸收。按图中所示用非耗尽的，中和抗-NKG2D mAb或NK细胞-耗尽的抗-NK1.1mAb（200μg/小鼠，第-2天）处理小鼠。结果表示为平均值±S.D.cpm（5只小鼠/组）。图16（b）表示DAP12-/-小鼠（Bakkeret al.，Immunity，13：345-353，2000）排斥表达RAE-1ε的同源的骨髓。将大约4x10⁶RAE-1ε转基因B6BM细胞转入辐射过的受体。在第5天用¹²⁵IUdR注射小鼠，并且在第六天收获脾脏和计数。黑色条柱显示在RAE-1ε转基因B6BM->野生型B6小鼠的脾脏中¹²⁵IUdR的吸收，而白色条柱表示在RAE-lε转基因B6BM->DAP 12-/-B6受体中放射线标记的吸收。处理小鼠，结果如图片a所示。

图17（a）示出了在RAE-1ε转基因B6小鼠中的NK细胞上NKG2D的调节。用抗-泛-RAE-1 mAb（左侧图片）或抗-NKG2D和抗-NK1.1 mAb（右侧图片）对来自野生型和RAE-1ε转基因B6小鼠的脾细胞进行染色。分析在脾细胞上的RAE-1表达，并且通过对NK1.1⁺细胞分选来分析NKG2D表达。细线条表示用cIg染色的细胞，而粗线条表示RAE-1或NKG2D特异性染色。数字表示染色细胞的平均荧光（任意线性单位）。图17（b）表示在RAE-1ε转基因（Tg）NK细胞中NKG2D-依赖型细胞毒性减弱。用来自野生型或RAE-1εTgB6小鼠的脾脏制备富集的NK细胞，所述小鼠在收获前一天IP-注射polyI：C（100μg/小鼠）。按文献披露的方法对CD32-转染的721.221靶细胞进行单克隆抗体-依赖型改向杀伤测定（Lanier et al.，Jlmmunol，141：3478-3485，1998），使用对照Ig（cIg），抗-NKG2D，或抗-NK1.1 mAbs进行。图17（c）：示出了NKG2D对在RAE-1ε转基因宿主中发育的野生型NK细胞的调节作用。将Ly 5.2B6BM细胞（1x10⁷/小鼠）转入辐射过的野生型（WT）或RAE-1εTg B6小鼠。在移植三个月之后，在脾NK细胞（对CD3-，NK1.1+淋巴细胞的分选）上分析NKG2D（左侧图片）和NK1.1（右侧图片）的表达水平。细线条表示用cIg染色的细胞，而粗线条表示RAE-1或NKG2D特异性染色。数字表示染色细胞的平均荧光（任意线性单位）。图17（d）表示在Ly5.2 B6 BM->RAE-1 Tg嵌合小鼠中NK细胞的NKG2D-依赖型细胞毒性。用Ly5.2 B6 BM->RAE-1 Tg和Ly5.2 B6 BM->B6小鼠的脾脏制备富集的NK细胞，所述小鼠在收获脾脏之前一天IP-注射polyI：C（100μg/小鼠）。按图片b所示进行mAb-依赖型改向细胞毒性测定。图17（e）表示在RAE-1 Tg小鼠中发育的野生型NK细胞，证实减弱了的NKG2D-依赖型骨髓排斥。黑色条柱表示在RAE-1+Tg BM细胞->嵌合小鼠（Ly5.2 B6 BM->野生型B6）的脾脏中¹²⁵IUdR的吸收，而白色条柱表示RAE-1+Tg BM细胞->嵌合小鼠（Ly5.2 B6 BM->RAE-1 Tg嵌合小鼠）的脾脏中放射线标记的吸收。图17（f）表示在RAE-1ε转基因CB6F1小鼠中的杂合阻抗受到减弱。将4x10⁶B/c BM细胞转入辐射过的受体。在第5天用¹²⁵IUdR注射受体小鼠，并且在第六天收获脾脏和计数。黑色条柱表示B/c BM->野生型CB6F1小鼠脾脏中的¹²⁵IUdR的吸收，白色条柱表示在B/c BM->RAE-1ε转基因CB6F1受体中放射线标记的吸收，而灰色条柱表示CB6F1 BM->CB6F1小鼠。按图中所示用非耗尽的，中和抗-NKG2D mAb或NK细胞-耗尽的抗-NK1.1mAb（200μg/小鼠，第-2天）处理小鼠。结果表示为平均值±S.D.cpm（5只小鼠/组）。重复进行该实验两次，获得了相当的结果。

发明的详细说明

本发明在某种程度上基于以下出人意料的发现，NKG2D，一种CD8+T细胞、NK细胞和某些激活的CD4+T细胞上的激活受体，它的调节是预防和/或治疗自身免疫和炎性综合征的有效方法。一方面，本发明人业已发现了刺激NKG2D内在化的制剂和方法，并且业已确定所述制剂是治疗与NKG2D激活相关的综合征的有效的治疗方法。所述制剂和方法特别适用于这样的症状（如被认为出现在，例如，慢性炎性综合征中的症状）：其中天然可溶性NKG2D配体不能够刺激内在化。本发明还涉及用于减弱NKG2D的功能性表达以便治疗所述炎性综合征的任何方法。在某些实施方案中，本发明的方法和组合物只能影响白细胞的亚类，这取决于它们主要在NKG2D上的激活。

本发明涉及能有效治疗或预防白细胞的与NKG2D-介导的激活相关的综合征的方法和组合物。该方法是通过在适合预防和治疗所述综合征的条件下使表达NKG2D的白细胞与能减弱所述细胞的NKG2D-介导的激活的制剂接触。所述接触可以通过任何适合的方法进行，包括给患者或包括通过NKG2D途径激活的细胞的宿主，在能将所述制剂输送给所述患者或宿主体内的细胞的条件下施用所述制剂或包含所述制剂的组合物。根据本发明，NKG2D激活可以通过下面一种或多种方式减弱：（i）耗尽预先存在于细胞表面上的细胞表面NKG2D分子；（ii）干扰NKG2D和DAP 10之间的功能性相互作用，或阻断NKG2D的信号传导功能；和（iii）防止NKG2D分子到达细胞表面，包括在转录、翻译或翻译后水平上干扰NKG2D的产生。在某些实施方案中，本发明涉及通过促进它们的内在化来减少预先存在的细胞表面NKG2D分子，而又不会同时导致有可能引发携带NKG2D的白细胞的效应子功能的显著的激活。

在本文中，术语"NKG2D"，"NKG2-D"，"D12S2489E"，"KLRK1"，和"杀伤细胞外源凝集素-样受体亚科K，成员1"，表示人类杀伤细胞激活受体基因，cDNA（例如，人类-基因库保藏号NM-007360），及其基因产物，以及它的哺乳动物对应物，包括野生型和突变型产物。人NKG2D编码区参见SEQ ID NO：3所示，而人NKG2D蛋白序列参见SEQ ID NO：4所示。NKG2D的哺乳动物对应物包括，但不局限于小鼠NKG2D（例如，Mus musculus-GENBANK保藏号NM-033078）、大鼠NKG2D（例如，褐家鼠-GENBANK保藏号NM-133512）、猪NKG2D（例如，小型猪-GENBANK保藏号AF285448）、猴子NKG2D（例如，恒河猴-GENBANK保藏号AJ554302）和猩猩NKG2D（例如，猕猴-GENBANK保藏号AF470403）。本发明的优选实施方案包括NKG2D调节剂，如NKG2D拮抗剂和部分拮抗剂。

除非另有说明，本发明的方法可用于实施治疗（例如，减轻与以下状态相关和/或造成以下状态的症状，所述状态被认为导致了一种症状，依据这种症状/状态存在的时间，所述状态/症状的发展，所述状态/症状的严重性等），或预防（例如，降低出现的可能性，延缓发作，延缓发作后严重性，减轻发作时的严重程度等）与NKG2D活性相关的任何类型的炎性症状，如与NKG2D相关的任何炎性自身免疫疾病。不过，可以理解的是，所述症状可能有很大不同，因此，用于治疗各种症状的方法同样被认为是本发明的独特方面。

I.NKG2D-调节剂

除非另有说明或者在本文中明确指明，在实施本发明时，能够减弱NKG2D-介导的细胞激活的任何制剂都可以使用。所述制剂的非限定性例子包括：NKG2D配体，或NKG2D-结合片段，其变体，或衍生物；抗体，或其片段，变体，或衍生物（例如，NKG2D-结合抗体）；核酸（或其变体或衍生物），或小分子，它能抑制细胞中NKG2D或DAP 10产生；能干扰NKG2D-DAP10复合物的形成或功能的肽或小分子；能改变NKG2D信号传导的小分子，和上述任何物质的组合。例如，典型的NKG2D配体可以参见美国专利6,653,447；Carayannopoulos et al.，J lmmunol，169（8）：4079-83，2002；Carayannopoulos et al.，Eur J Immunol，32（3）：597-605，2002；Sutherland et al.，J Immunol，168（2）：671-9，2002；Sutherland et al.，Immunol Rev，181：185-92，2001；和Cosman et al.，Immunity，14（2）：123-33，2001）。

本发明涉及能从外部接触NKG2D-表达细胞并且在它们随后接触携带NKG2D-配体的细胞或重组NKG2D配体时能减弱携带NKG2D的细胞的激活。可以监测这种激活的任何指示剂，包括，但不局限于DAP 10磷酸化的刺激，p85 PI3激酶的刺激，Akt的激活，干扰素-γ（IFN-γ）或其他细胞因子或趋化因子的NKG2D-依赖型产生，携带NKG2D-配体的靶细胞的NKG2D-依赖型杀伤等。评估NKG2D激活的水平一种方法是测定人NK细胞杀伤携带NKG2D配体的靶细胞的能力（例如，参见下面的例1）。在本发明的某些实施方案中，有用的NKG2D-调节剂是这样的，它能在诸如例1披露的模型***中导致NKG2D配体诱导的NKG2D激活减弱至少大约20%；在其他实施方案中，所述制剂导致配体诱导的NKG2D激活减弱至少大约30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或以上。例如，与对照相比，在存在所述制剂的条件下，NKG2D配体诱导的激活可以减弱至少大约30%。例如，所述对照可以是在没有所述制剂但是在基本上相同的条件下NKG2D的激活，所述条件是在（a）个体，（b）一群大体上相似的有机体，将平均值用作对照，或（c）这两者。评估NKG2D激活水平的另一种方法是在存在或缺少NKG2D配体，如MICA或ULBP的条件下测定IFN-γ产量。用于测定IFN-γ产量的任何方法都可以使用，包括，但不局限于能测定IFN-γ蛋白的免疫测定方法或其他测定方法，能测定IFN-γ活性的生物测定方法等。在本发明的某些实施方案中，有用的NKG2D-调节剂是能导致NKG2D-介导的IFN-γ产量降低至少大约20%的制剂；在其他实施方案中，所述制剂导致NKG2D-介导的IFN-γ产量降低至少大约30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或以上。

在一个系列的实施方案中，本发明的NKG2D-调节剂刺激NKG2D的细胞内在化。可以通过任何合适的方法，例如，通过流式细胞测量术（例如，参见下面的例2）；免疫荧光显微术（包括，通过共焦显微术监测抗体的内在化）；能检测细胞表面NKG2D的结合测定等评估内在化。在本发明的某些实施方案中，有用的NKG2D-调节剂是这样的一些制剂，它能导致NKG2D的细胞表面含量降低至少大约10%，或者导致NKG2D从细胞表面消失的比率提高10%，所述变化是相对对照而言的，测定是在例2所披露的模型***中进行的；在其他实施方案中，所述制剂导致NKG2D的细胞表面含量降低至少大约20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，或>99%或导致NKG2D的消失比率增加至少大约20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%。

优选的是，本发明的NKG2D-调节剂不会导致NKG2D-表达细胞的细胞溶解或耗尽，所述细胞包括，例如CD8+T细胞，CD4+T细胞，γδTcR+T细胞，和CD56/16+NK细胞中的一种或多种。可以采用任何合适的方法评估一种制剂杀伤NKG2D-表达细胞的能力，例如，使用膜联蛋白V或碘化丙锭染色，整合了台盼蓝，通过流式细胞测量术或显微术，铕分析或铬释放测定来检测死亡细胞。在本发明的某些实施方案中，有用的NKG2D-调节剂是在能保持至少大约90%的NKG2D-表达细胞生活力的条件下具有可检测的治疗效果的制剂。在其他实施方案中，所述制剂导致NKG2D-表达细胞的数量减少至少大约5%，10%，20%30%，40%，50%，60%，70%，或80%。

以下表格包含本发明的NKG2D调节剂的特征的非限定性例子。

表1.NKG2D-调节剂的特征

本发明涉及NKG2D的天然可溶性配体（例如，MICA或ULBP）不能在患有慢性炎症的患者体内以类似于在没有患有慢性炎症的个体体内有可能发生的内在化的方式刺激NKG2D的内在化；不希望受任何理论的约束，据信，这种现象至少在某种程度上是由于高水平的细胞因子所导致的，这种现象伴随着慢性炎性状态（通过比较患有慢性炎症的患者和健康患者体内T细胞或NK细胞上的NKG2D含量可以证实这种现象；尽管事实上慢性炎症伴随着NKG2D配体的高循环水平，在以上两组中具有类似的NKG2D含量，反应了NKG2D内在化的缺陷）。本发明涉及能在天然可溶性NKG2D配体可能是无效的或者是效果较差的条件下刺激NKG2D内在化的制剂，以及所述制剂在本文所提供的各种发明方法中的应用。用于检验这种效果的任何合适的模型***都可用于验证特定的制剂具有或展现出所述特征，例如，通过比较天然可溶性配体和本发明的调节剂对NKG2D内在化的影响，比较是在以下条件下进行的，其中，NKG2D-表达细胞在已知能抵消天然可溶性配体对内在化的作用的条件下接触细胞因子（包括，但不局限于，白介素-2，白介素-15，肿瘤坏死因子，或以上物质的组合）。在某些实施方案中，本发明的NKG2D-调节剂导致的表面NKG2D含量的降低比由天然可溶性NKG2D配体导致的表面NKG2D含量的降低至少高出10%，内在化是在能干扰天然可溶性配体介导内在化的条件下（例如，在存在一种或多种细胞因子的条件下）测定的。在其他实施方案中，所述NKG2D-调节剂在介导NKG2D内在化方面的效果比天然可溶性NKG2D配体高出至少大约20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，或>99%。

A.NKG2D配体

本发明的一种类型的NKG2D调节剂涉及NKG2D配体。一般，所述配体相对天然可溶性NKG2D配体（例如，可溶形式的MICA，MICB，和ULBP）来说具有以下改进，这使得它们能在天然可溶性配体无效的条件下有效刺激NKG2D内在化。例如，可溶形式的MICA和MICB蛋白（即，缺少跨膜和细胞质结构域，例如，参见，美国专利申请US2003/0165835，被收作本文参考），或来自它们的保留了NKG2D-结合活性的片段，可以通过常规方法化学交联，以便形成多聚体NKG2D配体，它们能结合一个以上NKG2D分子并因此刺激内在化。NKG2D-结合活性能通过任何方法测定，例如，包括竞争结合，流式细胞测量术等。在另一个系列的实施方案中，多聚体NKG2D配体可以通过表达编码具有来自MICA，MICB，或ULBP的NKG2D-结合结构域的串联重复（通过合适的分隔基团）的多肽的核酸产生。在另一个系列的实施方案中，所述配体可以结合其他化学基团，例如，聚乙二醇（PEG）。

B.抗体

本发明涉及可用于减弱NKG2D-介导的激活的任何抗体。例如，能够促进NKG2D内在化而又不会通过NKG2D-介导的信号传导途径显著激活的抗体。这种抗体的非限定性例子包括针对NKG2D的任何合适的细胞外或膜内表位抗体；针对DAP 10的任何合适的细胞外或膜内表位的抗体；以及针对可溶性NKG2D配体或NKG2D-NKG2D配体复合体的抗体。还包括双特异性抗体，即，这样的抗体，其中两个结合结构域中的每一个能识别不同的结合表位。披露了NKG2D的氨基酸序列，例如，美国专利6,262,244，DAP 10的氨基酸序列披露于Wu等，Science 285：730，1999，而MICA和MICB多肽的氨基酸序列披露于，例如，美国专利申请US 2003/0165835，所有文献都以全文形式被收作本文参考。

一般，已知基础抗体结构单位包括四聚体。每一个四聚体包括两对相同的多肽链，每一对具有一个"轻"（大约25kDa）和一个"重"链（大约50-70kDa）。每一条链的氨基末端部分可以包括大约100-110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每一条链的羧基末端可以形成恒定区，主要负责效应子功能。

一般，人类轻链被划分为κ和λ轻链。另外，人类重链通常被划分为μ，δ，γ，α，或ε，并且分别确定抗体的同种型为IgM，IgD，IgG，IgA，和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区是通过大约12或更多个氨基酸的"J″区连接的，重链还包括大约10个或更多个氨基酸的"D"区。一般参见Fundamental Immunology，Ch.7（Paul，ed.，2^nded.Raven Press，NY，1989）。

每一对轻链/重链可变区通常形成抗体-结合位点。因此，一般，完整的IgG抗体具有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体之外，一般，所述两个结合位点是相同的。通常，所有的链都展出具有相对保守的构架区（FR）的相同的整体结构。所述构架区是通过三个高变区结合的，又被称作互补性决定区或CDRs。每一对的重链和轻链的CDRs通常通过所述构架区对齐在一起，以便结合特定的表位。一般，从N-末端到C-末端，轻链和重链都包括以下结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。将氨基酸安排到每一个结构域上，一般是按照Sequences of Proteins of Immunological Interest的定义，Kabat等，National Institutes of Health，Bethesda，MD，5^thed.，NIHPubl.No.91-3242，1991；Kabat，Adv Prot Chem，32：1-75，1978；Kabat et al.，J.Biol Chem，252：6609-6616，1977；Chothia et al.，J Mol Biol，196：901-917，1987；和Chothia et al.，Nature，342：878-883，1989。

本发明的抗体包括单克隆抗体，多克隆抗体，双特异性抗体，Fab抗体片段，F（ab）2抗体片段，Fv抗体片段（例如，VH或VL），单链Fv抗体片段和dsFv抗体片段。另外，本发明的抗体分子可以是全人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体。在某些实施方案中，所述抗体分子是单克隆全人抗体。单克隆抗体包括获自大体上为同质性抗体的群体中的抗体，即，构成所述群体的单个抗体是相同的，除了存在很少数量的可能天然发生的变异。单克隆抗体是高度特异的，针对单抗原位点。单克隆抗体的优势在于可以通过基本上没有受到其他免疫球蛋白污染的杂交瘤培养合成。修饰语"单克隆"表示所述抗体的特征是属于大体上一致的抗体群体，并且并不意味着通过任何特殊方法生产所述抗体。

本发明的抗体包括任何成熟的或未加工过的连接任何免疫球蛋白恒定区的抗体可变区。如果轻链可变区与恒定区连接，它优选是κ链。如果重链可变区与恒定区连接，它优选是人γ1，γ2，γ3或γ4恒定区，更优选，γ1，γ2或γ4，甚至更优选γ1或γ4。

在某些实施方案中，例如，针对NKG2D或DAP 10的全人单克隆抗体是使用携带部分人类免疫***而不是小鼠***的转基因小鼠制备的。这些转基因小鼠在本文中可以被称为"HuMAb"小鼠，它包括人类免疫球蛋白基因小型基因座，它编码未重新排列的人类重链（μ和γ）和κ轻链免疫球蛋白序列，同时具有能够使内源鼠μ和κ链基因座失活的定向突变。因此，所述小鼠表现出减弱了的小鼠IgM或κ表达，并且对免疫有反应，所导入的人类重链和轻链转基因发生了类型转变和体细胞突变，以便产生高亲和力人类IgG/κ单克隆抗体。全人抗体在HuMAb小鼠体内的产生为本领域所公知。

可以采用最早由Kohler等在Nature，256：495，1975中披露的杂交瘤方法，或者通过其他已知的随后开发的方法生产单克隆抗体。在杂交瘤方法中，对小鼠或其他合适的宿主进行免疫，以便诱导淋巴细胞，它产生或者能够产生能特异性地结合用于免疫的蛋白的抗体。或者，淋巴细胞可以在体外进行免疫，然后使用合适的融合制剂，如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以便形成杂交瘤细胞。由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并且生长，所述培养基优选包含一种或多种能够抑制未融合的亲体骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲体骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT或HPRT），杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤，氨基蝶呤，和胸苷（HAT培养基），所述物质能抑制HGPRT-缺陷型细胞生长。

分析用于生长杂交瘤细胞的培养基以观察抗所述抗原的单克隆抗体的产生。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀方法或通过体外结合测定，如放射性免疫测定（RIA）或酶联免疫吸附测定（ELISA）或通过免疫荧光和流式细胞测量术或通过western印迹方法测定。在鉴定能产生具有需要的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过限制稀释方法对所述克隆进行亚克隆和用标准方法使其生长。用于这一目的的合适的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，所述杂交瘤细胞能够以腹水肿瘤的形式在动物体内生长：通过常规免疫球蛋白纯化方法，适当地从培养基，腹水，或血清中分离由所述亚克隆分泌的单克隆抗体，例如，所述方法为蛋白A-Sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析。

编码单克隆抗体或抗体片段的DNA可以使用常规方法方便地则可将分离和测序。所述杂交瘤细胞可用作所述DNA的来源。一旦分离，则可将DNA***表达载体，然后可以将该载体转染到宿主细胞中，如大肠杆菌细胞，猴COS细胞，人293T细胞，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，或骨髓瘤细胞这些否则不能产生免疫球蛋白的细胞，以便实现单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。

抗体或抗体片段还可以从利用众所周知的技术制备的抗体噬菌体文库中分离，可使用或不使用链式穿梭以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的方法。因此，上述技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的有效的替代方案。

本发明包括抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小的变化，只要氨基酸序列中的该变化能保持该序列的至少75%，更优选至少80%，90%，95%，最优选99%就行。具体地讲，涉及保守性氨基酸取代。保守性取代是发生在氨基酸家族内的取代，与它们的侧链相关。可以通过分析多肽衍生物的比活性容易地确定氨基酸改变是否产生了功能性肽。本领域普通技术人员可以方便地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段（或类似物）。优选的片段或类似物的氨基和羧基末端发生在靠近功能性结构域的边界附近。结构和功能性结构域可以通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专利序列数据库确定。优选的是，利用计算机比较方法确定出现在具有已知结构和/或功能的其他蛋白上的序列基序或推测的蛋白构像结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。序列基序和结构构像可用于确定本发明的结构和功能结构域。

在某些实施方案中，产生氨基酸取代，这些取代：（1）降低了对蛋白水解的敏感性，（2）降低了对氧化的敏感性，（3）改变了形成蛋白复合物的结合亲和力，（4）改变了结合亲和力，和/或（4）产生或改变了所述类似物的其他物理化学或功能特性。

一般，本发明的有用的抗-NKG2D抗体表现出的对人NKG2D的亲和力（Kd）至少等于可溶性NKG2D配体所表现的亲和力。在某些实施方案中，所述抗体以纳摩尔的亲和力，更优选皮摩尔的亲和力结合人NKG2D。在某些实施方案中，所述抗体以小于大约100nM，50nM，20nM，20nM，或1nM的Kd结合人NKG2D。

在某些实施方案中，有用的抗体包括能减弱人NKG2D与下列一种或多种：MICA，MICB，ULBP1，ULBP2，ULBP3和ULBP4的相互作用的抗体。所述封闭抗体可以采用常规竞争分析方法鉴定。

C.核酸调节剂

本发明涉及在转录，翻译或翻译后水平上调节NKG2D细胞表面表达。在某些实施方案中，所述调节剂是核酸类型的，包括，但不局限于，DNA，RNA，嵌合RNA/DNA，蛋白核酸，和其他核酸衍生物。

在某些实施方案中，所述NKG2D调节剂包括在导入表达NKG2D的细胞时能够抑制NKG2D产生的RNA分子（被称为RNAi），包括短发卡双链RNA（shRNA）。用于调节NKG2D表达的有用的RNAi序列的非-限定性例子包括由以下序列编码的序列：5'-GGATGGGACT AGTACACATT CC-3'（SEQ ID NO：10）；5'-TGGCAGTGGG AAGATGGCTC C-3'（SEQ ID NO：11）；和5'-CAGAAGGGAG ACTGTGCACT CTATGCCTC-3'（SEQ ID NO：12）。可以理解的是，能够减弱NKG2D的细胞表面表达的任何序列都可用于实施本发明。

RNA i构建体的产生可以通过化学合成方法或通过重组核酸技术完成。处理过的细胞的内源RNA聚合酶能够在体内介导转录，或者将克隆的RNA聚合物用于体外转录。所述RNAi构建体可以包括对磷酸-糖主链或核苷的修饰，例如，用于降低对细胞核酸酶的敏感性，提高生物可利用率，改善配方特征，和/或改变其他药物动力学特性。例如，可以对天然RNA的磷酸二酯键进行修饰，以便包括至少一个氮杂原子或硫杂原子。RNA结构的修饰可以定制以能够进行特异性遗传学抑制，同时又避免了对dsRNA的一般性反应。类似地，可以修饰碱基，以便阻断腺苷脱氨酶的活性。所述RNAi构建体可以通过酶促方法生产或者通过部分/总的有机合成方法生产，可以通过体外酶促或有机合成导入任何修饰的核糖核苷酸。

化学修饰RNA分子的方法可用于修饰RNA i构建体（例如，参见，Heidenreich等，Nucleic Acids Res，25：776-780，1977；Wilson etal.，J Mol Recog，7：89-98，1994；Chen et al.，Nucleic AcidsRes，23：2661-2668，1995；和Hirschbein et al.，Antisense NucleicAcid Drug Dev，7：55-61，1997）。例如，RNAi构建体的主链可以用硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，二硫代硫酸酯，嵌合膦酸甲酯-磷酸二酯，肽核酸，含有寡聚体或糖修饰（例如，2'-取代的核糖核苷，a-构型）的5-丙炔基-嘧啶修饰。

所述双链结构可以由一条自我互补的RNA链或由两条互补的RNA链形成。RNA双链体形成可以在细胞内或细胞外开始。可以以以下用量导入RNA，使得每一个细胞输送至少一个拷贝。较大剂量（例如，每个细胞至少5，10，100，500或1000个拷贝）的双链材料可以产生更有效的抑制作用，而较低的剂量还可用于特殊用途。抑制作用是序列-特异性的，因为相应于RNA的双链区的核苷酸序列被靶定用于遗传学抑制。

在某些实施方案中，主题RNAi构建体是"小型干扰RNAs"或"siRNAs"。这些核酸的长度为大约19-30个核苷酸，例如，大约为21-23个核苷酸，相当于通过核酸酶"切割"较长的双链RNAs产生的片段的长度。所述siRNAs被理解为恢复核酸酶复合体，并且将所述复合物通过与特定序列配对而导向靶mRNA。其结果是，靶mRNA被蛋白复合物中的核酸酶降解。在具体实施方案中，21-23个核苷酸的siRNA分子包括3'羟基。

用于本发明的siRNA可以使用本领域技术人员所公知的多种技术获得。例如，所述siRNA可以使用本领域公知的方法化学合成或重组生产。例如，合成短的正义或反义RNA寡聚体并且退火，以便形成双链RNA结构，在其每一个末端具有2-核苷酸突出部分（Caplen等，Proc NatlAcad Sci USA，98：9742-9747，2001；和Elbashir et al.，EMBO J，20：6877-88，2001）。然后可以通过被动吸收或通过选择的输送***将所述双链s iRNA结构直接导入细胞。

在某些实施方案中，所述siRNA构建体可以通过加工较长的双链RNAs制备，例如，在存在酶剪切物的条件下加工。在一种实施方案中，使用果蝇体外***。在该实施方案中，dsRNA与来自果蝇胚胎的可溶性提取物混合，以便产生组合。将所述组合维持在以下条件下：其中，将ds RNA加工成具有大约21-大约23个核苷酸的RNA分子。

siRNA分子可以使用常规技术纯化。例如，可以用凝胶电泳纯化siRNAs。或者，可以将非-变性方法，如非-变性柱层析用于纯化siRNA。另外，可以利用层析（例如，分子排阻层析），甘油梯度离心，使用抗体的亲和纯化可用于纯化siRNAs。

在某些实施方案中，将质粒用于输送双链RNA，例如，作为转录产物输送。在这些实施方案中，将质粒设计成包含RNAi构建体的每一个正义和反义链的"编码序列"。所述编码序列可以是相同的序列，例如，旁侧为颠倒的启动子，或者可以是两个独立的序列，各自受不同启动子的转录控制。在编码序列转录之后，互补的RNA转录物碱基配对，以形成双链RNA。PCT申请WO 01/77350披露了用于转基因双向转录，以便在真核细胞中产生相同转基因的正义和反义RNA转录物的典型载体。

I I.治疗方法

本发明提供了预防和/或治疗炎性疾病，包括各种炎性自身免疫疾病和与NKG2D激活相关的综合征的方法。所述综合征包括，但不局限于以下临床症状，其中，导入应激相关的NKG2D配体（例如，MI CA，MI CB，和ULBPs）导致了自身反应性T细胞和/或NK细胞的过度激活和/或扩增，这可能表现为较高含量的细胞因子，如IL-2，TNF-α，和IL-15。

因此，在特定方面，本发明提供了用于治疗和/或预防类风湿性关节炎（RA）的方法。该方法包括将有效量的能减弱配体诱导的NKG2D激活的制剂输送给患有RA或被确定/诊断为很有可能出现RA的较大风险的患者体内，以便治疗或预防RA。在特定方面，本发明的RA治疗/或预防方法是通过使用"抗"（即，"具有特异性"或"特异性结合"或"优先结合"）NKG2D的单克隆抗体或单克隆抗体片段实现的。

一方面，所述制剂（例如，抗-NKG2D mAb或mAb片段）是被证实在可接受的RA模型中能有效缓解RA的制剂，例如，参见美国专利6，414，218和美国专利公开号20030005469（相关的原理和模型参见，例如，Wooley，P.H.，Animal Models of Ar thritis，eds.J.H.K lippeland P.A.Dieppe，Mosby Publishers（London），1998；Eming etal.，Arthritis Res，4Suppl 3：S133-40，2002；Holmdahl et al.，Ageing Res Rev，1（1）：135-47，2002；Anthony et al.，Clin ExpRheumatol，17（2）：240-4，1999；Durie et al.，Clin ImmunolImmunopathol，73（1）：11-8，1994；和Muller-Ladner et al.，Drugs Today（Ba rc），35（4-5）：379-88，1999）。另一方面，所述制剂是能够可检测地减弱NKG2D-表达白细胞的配体诱导的NKG2D激活和/或减弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增（例如，减弱自身反应性CD8+T细胞的扩增和/或功能)(例如，与在美国专利公开号20040115198中披露的至少某些抗体不同），而又不会明显耗尽这些细胞（例如，导致与合适的对照相比所述细胞减少大约10%或更少）。一方面，所述方法导致了一种或多种生物标记的调节，以与RA的治疗或预防（根据应用情况）一致的方式（例如，血清IL-6，TNF R，IL-2R，脱落CD4，脱落CD8，和/或C反应蛋白）进行。另一方面，所述方法的实施导致了在患者/宿主外周关节中滑液炎症的可检测的减弱。一方面，所述方法导致了预防X光照相中所示的损伤，并且改善了患者或宿主的机体功能，例如，表现为患者或宿主X光照相所示进展的减慢，关节肿胀和触痛的减轻（通过可接受的分析标准确定），和/或显著改善了生命的质量（例如，通过根据RA Health Assessment Questionnaire评估的残基评分的降低确定）。

在另一个特定的典型方面，本发明提供了用于治疗和/或预防多发性硬化（MS）的方法。该方法包括将能减弱配体诱导的NKG2D激活的有效量的制剂输送给患有MS或被确定/诊断为很有可能出现MS的人类患者或哺乳动物宿主，以便治疗或预防所述患者或宿主的MS。在特定方面，本发明的MS治疗/或预防方法是通过使用抗NKG2D的（"抗-NKG2D抗体"）的单克隆抗体或单克隆抗体片段实现的。在更具体的方面，所述制剂是能够可检测地减弱NKG2D-表达白细胞配体诱导的NKG2D激活和/或减弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增，而又不会明显耗尽这些细胞的抗-NKG2D单克隆抗体。

在另一个典型方面，本发明提供了用于治疗和/或预防炎性肠病（IBD），例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的方法。该方法包括将能减弱配体诱导的NKG2D激活的有效量的制剂输送到患有I BD或被确定/诊断为很有可能出现IBD的人类患者或哺乳动物宿主，以便治疗或预防所述患者或宿主的IBD。在特定方面，本发明的IBD治疗/或预防方法是通过施用抗NKG2D的单克隆抗体或单克隆抗体片段实现的。在更具体的方面，所述制剂是能够可检测地减弱表达NKG2D的白细胞的配体诱导的NKG2D激活和/或减弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增，而又不会明显耗尽这些细胞的抗-NKG2D单克隆抗体。

另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防牛皮癣的方法。该方法包括将能够减弱配体诱导的NKG2D激活的有效量的制剂输送给患有牛皮癣或被确定/诊断为很有可能出现牛皮癣的人类患者或哺乳动物宿主，以便治疗或预防所述患者或宿主的牛皮癣。一般，该方法是通过施用有效量的抗NKG2D的单克隆抗体或单克隆抗体片段实现的。在更具体的方面，所述制剂是能够可检测地减弱表达NKG2D的白细胞配体诱导的NKG2D激活和/或减弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增，而又不会明显耗尽这些细胞的抗-NKG2D单克隆抗体。

另一方面，本发明提供了减弱移植排斥的可能性（或减弱移植排斥-相关症状的严重性或发作时间）的方法。该方法包括给人类患者或哺乳动物宿主输送（例如，直接施用或通过包含编码核酸的组合物等的方式施用）有效量的能减弱配体诱导的NKG2D激活的制剂，所述宿主大概或者最近是组织/器官移植的受体，以便可检测地减弱排斥的可能性（例如，与对照相比）。在特定方面，所述方法是通过输送抗-NKG2DmAb或抗-NKG2D mAb片段实现的。在更具体的方面，所述制剂是能够可检测地减弱NKG2D-表达白细胞配体诱导的NKG2D激活和/或减弱NKG2D+T细胞或NK细胞的增殖，而又不会明显耗尽这些细胞的抗-NKG2DmAb或片段。

另一方面，本发明的制剂，如抗-NKG2D mAb或抗-NKG2D mAb片段是以一定用量并且在足以治疗或预防所述患者或宿主的症状的条件下给患有或很有可能出现I型糖尿病的患者输送的。

本发明的方法同样可应用于与NKG2D相关的其他自身免疫疾病和炎性症状，包括***性红斑狼疮，桥本甲状腺炎，重症肌无力，传染性神经元炎，自身免疫性眼色素层炎，夏科氏肝硬变，自身免疫性肝炎，自身免疫性溶血性贫血，恶性贫血，自身免疫性血小板减少症，Grave's病，自身免疫性***，自身免疫性***，颞动脉炎，抗-磷脂综合征，韦格内氏肉芽肿症，贝切特氏综合征，硬皮病，多肌炎，皮肤肌炎，关节强硬性脊椎柱炎，Sjogren's综合征，疱疹样皮炎，慢性天疱疮，白癫风，牛皮癣关节炎，骨关节炎，类固醇抗性哮喘，慢性阻塞性肺病，和动脉粥样硬化。在某些优选实施方案中，所述移植是骨髓（BM）或外周血干细胞（PBSM）移植物。在某些实施方案中，所述BMT或PBSCT移植物是作为白血病或淋巴瘤的治疗剂使用的，而在其他实施方案中，所述移植物是作为其他类型的癌症，如成神经细胞瘤或多发性骨髓瘤的治疗剂使用的。

在实施本发明时，能够以单一剂量形式给患者施用NKG2D调节剂，该剂量包括用于预防或治疗炎性或自身免疫性综合征的单一有效的剂量，或通过分阶段的系列剂量施用，这些剂量合在一起包括用于预防或治疗所述综合征的有效量。有效量的NKG2D调节剂表示所述调节剂的用量在以单一剂量或以组合的多个剂量施用，或者作为任何其他类型的特定治疗方案的一部分进行时，产生了后果的可检测的统计学改进，正如通过与所述综合征相关的至少一项临床参数证实的。与不接受NKG2D调节剂的患者相比，有效量的NKG2D调节剂可以延缓疾病的进展。

可以理解的是，所述有效量的NKG2D调节剂，以及总的剂量方案，可以根据疾病和患者的临床状态而改变，反过来，又可以反映一种或多种临床参数，如临床上接受的疾病评分。例如，对于类风湿性关节炎来说，疾病严重性和/或治疗效果可以通过监测肿胀关节的数量；疼痛；运动能力；和/或官方的疾病评分ACR 20/50或70来评估。对于1型糖尿病来说，疾病严重性和/或治疗效果可以通过检测血糖含量或血糖含量的波动，Hb1C含量等来评估。对于多发性硬化、大脑发炎来说，可以通过扫描大脑评估。对于造血性移植排斥来说，疾病严重性（移植失败）和/或治疗效果可以通过长期中性白细胞减少，血小板减少症，和患者的红细胞输血依赖型的证据评估，所述患者业已进行了成髓细胞调节，并且根据业已进行了非-成髓细胞调节的患者未能出现嵌合现象评估。一般，使用本发明的方法和组合物的治疗结果的可检测效果包括对其他治疗的必要性的降低（例如，包括其他药物或治疗数量和/或持续时间的减少），住院次数和/或时间的减少，因生病而不能工作天数的减少等。还可以理解的是，所述有效用量可以由本领域普通技术人员通过常规实验确定，通过制作值的矩阵并且实验该矩阵中的不同的点来确定。

本发明包括与NKG2D调节剂组合施用一种或多种其他制剂。可以理解的是，在包括施用NKG2D调节剂与其他制剂的组合的实施方案中，NKG2D调节剂的剂量可以本身包括有效量，并且其他制剂能够进一步加强对患者的治疗效果。另外，NKG2D调节剂和其他制剂的组合可共同包括用于预防或治疗所述综合征的有效量。还可以理解的是，有效量可以在具体治疗方案中确定，例如，包括施用时间和次数，施用模式，配方等。

在某些实施方案中，其中的NKG2D-相关的综合征是1型糖尿病，所述其他制剂包括能够促进胰腺β-细胞或改善β-细胞移植的下列一种或多种制剂：例如，β细胞生长或存活因子或免疫调节抗体。在某些实施方案中，其中，NKG2D-相关的综合征是类风湿性关节炎，所述其他制剂是下列成分中的一种或多种：甲氨蝶呤；抗-TNF-α抗体；TNF-α受体-I g融合蛋白，抗-IL-15抗体，非-类固醇抗-炎药物（NSAI D），和疾病修饰抗-风湿药物（DMARD）。例如，所述其他制剂可以是生物学制剂，如抗-TNF制剂（例如，），英夫利昔单克隆抗体（）和阿达木单抗（）或美罗华（）。在某些实施方案中，其中，NKG2D-相关的综合征是造血移植排斥，造血生长因子（例如，***，G-CSF，GM-CSF，IL-3，IL-11，血小板生成素等）或抗微生物剂（例如，抗生素，抗病毒剂，抗真菌剂）可以作为辅助治疗剂使用。在某些实施方案中，其中，所述NKG2D-相关的综合征是牛皮癣，所述其他制剂是下列成分中的一种或多种：焦油及其衍生物，光线治疗，皮质激素类，环孢霉素A，维生素D类似物，甲氨蝶呤，p38促细胞***剂-激活的蛋白激酶（MAPK）抑制剂，以及生物学制剂，如抗-TNF-α制剂和在某些实施方案中，其中，NKG2D-相关的综合征是炎性肠病（IBD），例如，克罗恩氏病或溃疡性结肠炎，所述其他制剂是下列成分中的一种或多种：氨基水杨酸，皮质激素类，免疫调节剂，抗生素，或生物学制剂，如和

III.药用制剂和施用模式

本发明涉及包括NKG2D调节剂的药用制剂，它还包括一种或多种可药用的载体。可药用的载体包括任何和所有合适的溶剂，分散媒介，包衣剂，抗细菌和抗真菌制剂，等渗和吸收延缓制剂等，它们在生理学上与本发明所提供的NKG2D调节剂或相关的组合物或组合相容。可药用的载体的例子包括下列一种或多种：水，盐水，磷酸缓冲的盐溶液，葡萄糖，甘油，和乙醇等，以及它们的组合。在很多场合下，可能需要在所述组合物中包含等渗制剂，例如，糖，多元醇，如甘露糖醇或山梨糖醇，或氯化钠。可药用的物质还可以是微量辅助物质，如湿润剂或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，它们优选能够改善所述NKG2D调节剂，相关的组合物，或组合的货架寿命或效果。药用组合物的合适的载体和其他成分是根据对NKG2D调节剂，相关的组合物，或组合的理想的生物学特性缺少显著的负面影响确定的。

本发明的NKG2D调节剂组合物，相关的组合物，和组合可以是多种合适的形式。所述形式包括，例如液体，半固体和固体剂型，如液体溶液（例如，可注射的和可输注的溶液），分散液或悬浮液，乳液，微滴乳液，片剂，药丸，粉剂，脂质体，树形分子和其他纳米颗粒（例如，参见，Baek等，Methods Enzymol，362：240-9，2003；和Nigavekaret al.，Pharm Res，21：476-83，2004），微粒和栓剂。最佳形式取决于预期的施用模式，组合物或组合的性质，以及治疗用途。制剂还包括，例如，粉末，糊剂，软膏，凝胶剂，蜡状物，油剂，类脂，含有脂类（阳离子或阴离子型）的小囊，DNA缀合物，无水吸收糊剂，水包油和油包水乳液，乳液碳蜡（各种分子量的聚乙二醇），半固体凝胶，和含有碳蜡的半固体混合物。上述任何混合物都适用于本发明的治疗和治疗方法，只要所述制剂中的活性成分不会被所述制剂失活，并且所述制剂与施用途径在生理学上相容并且可以耐受就行。还可参见，例如Powell等"Compendium of excipients for parenteralformulations"PDA J Pharm Sci Technol，52：238-311，1998，本文所引用的其他信息涉及药物化学家所熟知的赋形剂和载体。

NKG2D调节剂组合物还包括含有NKG2D调节剂肽和它的合适的盐的任何合适组合的组合物。任何合适的盐，如任何合适形式的碱土金属盐（例如，缓冲剂盐）都可用于稳定NKG2D调节剂（优选所述盐的用量使得可以避免NKG2D调节剂的氧化和/或沉淀）。合适的盐通常包括氯化钠，琥珀酸钠，硫酸钠，氯化钾，氯化镁，硫酸镁，和氯化钙。还提供包括碱和NKG2D调节剂的组合物。在其他方面，本发明提供了缺少等渗用量的任何盐的NKG2D调节剂组合物。

用于药物用途的组合物还可以包括稀释剂，填料，盐，缓冲剂，洗涤剂（例如，非离子洗涤剂，例如Tween-80），稳定剂（例如，无糖或蛋白氨基酸），防腐剂，组织固定剂，助溶剂，和/或其他适合用在药用组合物中的材料。合适成分的例子还可以参见，例如，Berge等，J Pharm Sci，6661：1-19，1977；Wang and Hanson，J ParenteralSci Tech，42：S4-S6，1988，美国专利号6,165,779和6,225,289；以及其中所引用的其他文献。所述药用组合物还可以包括防腐剂，抗氧化剂，或本领域技术人员所公知的其他添加剂。本领域所公知的其他可药用的载体可以参见，例如，Urquhart等，Lancet，16：367，1980；Lieberman et al.，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS，2nd ed.，vo l.3，1998；Ansel et al.，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS&DRUG DELIVERY SYSTEMS，7th ed.，2000；Martindale，THE EXTRAPHARMACOPEIA，31st ed.；Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES，16th-20th editions；THE PHARMACOLOGI CAL BASIS OF THERAPEUTICS，Goodman and Gilman，eds.，9th ed.，1996；Wilson and Gisvolds'TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY，Delgado and Remers，eds.，10th ed.，1998；和美国专利号5,708,025和5,994,106。制备可药用的组合物的原理还可以参见，例如，Platt，Clin Lab Med，7：289-99，1987；Aulton，PHARMACEUTICS：THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN，Churchill Livingstone，NY，1988；EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS，CSHP，1998，和"Drug Dosage，"J Kans Med Soc，70（1）：30-32，1969。特别适合施用媒介物的其他可药用的载体可以参见，例如，国际专利申请号WO 98/32859。

在一个典型方面，所述活性化合物或组合是与载体一起制备的，所述载体能阻止所述化合物迅速释放，如控制释放的制剂，包括植入物，经皮贴剂，和微型胶囊化输送***。可以使用生物可降解的，生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯共聚物，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯，和聚乳酸。制备所述制剂的很多方法被授予了专利权或者为本领域技术人员所公知。例如，参见，SUSTAINED AND CONTROLLEDRELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS，J.R.Robinson，ed.，MarcelDekker，Inc.，NY，1978。

另一方面，本发明的组合物可用于口服，例如，可以与惰性稀释剂或可同化的食用载体配制。所述化合物（和其他成分，如果需要的话）还可以封闭在硬的或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入对象饮食中。对于口服治疗施用来说，所述化合物可以与赋形剂掺合，并且以可摄取的片剂，***片剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆，和晶片等的形式使用。为了通过肠胃外施用以外的方式施用本发明的化合物，可能需要用能防止它失活的材料对所述化合物进行包衣或者与这样的材料一起施用所述化合物。

本发明的另一方面提供了包括NKG2D调节剂，相关的组合物，或组合，可药用的载体，以及任选地含有其他药用组合物成分的试剂盒。除了NKG2D调节剂之外，试剂盒可以包括诊断或治疗剂。试剂盒还可以包括用于诊断或治疗方法的说明。在一个系列的实施方案中，所述试剂盒包括NKG2D调节剂，相关的化合物，或高度稳定形式的组合组合物（如冷冻干燥形式），与可药用的载体组合，该载体可以与高度稳定的组合物混合以便形成可注射的组合物。

NKG2D调节剂组合物，相关的组合物，和组合组合物可以通过任何合适的途径，如口腔，黏膜，面颊，鼻内，可吸入，静脉内，皮下，肌内，肠胃外，肿瘤间，肿瘤内，或局部途径施用。它们还可以通过微型泵或其他合适的装置连续施用。所述抗体或其他NKG2D调节剂通常可以根据疾病状态的存在时间施用，只要所述抗体能阻止症状恶化或能够改善就行。所述抗体或其他NKG2D调节剂通常是作为可药用的组合物的一部分施用的，正如在本文的其他地方所披露的。所述抗体可以通过任何合适的途径施用，不过，通常是以剂量单位制剂的形式肠胃外施用的，该剂型含有常规可药用的载体和佐剂（稳定剂，分解剂，抗氧化剂）等。本文所使用的术语"肠胃外"包括皮下，静脉内，动脉内，肌内，胸骨内，腱内，脊柱内，颅内，胸内，输液技术和腹膜内输送。最常见的是，通过静脉内或皮下途径施用抗体。注射途径还包括注射到肌内（肌内，IM）；在皮肤下注射（皮下，SC）；注射到静脉内（静脉内，IV）；注射到腹腔（腹膜内，IP）；和其他输送进入/通过皮肤（真皮内，ID，通常通过多次注射）。

本发明还提供了促进根据上文所述的或在本文的其他地方所披露的上述任何方面的化合物的销售和/或使用的方法，包括散布信息（例如，通过分发，邮寄等散发的印刷材料等；通过广告信息；通过电视节目和广告；通过广播节目和广告；通过互联网网址登记；通过电子邮件；通过电话销售；通过上门销售或通过传销；通过资助和/或主办会议，图片，专题等，通过雇佣和/或订立销售人员的服务合同和/或医学/科学协作，通过资助和/或主办科学研究和与所述用途相关的出版物等），涉及将所述化合物用于预防或治疗在本文的前面或任何其他地方披露的任何症状或组合的症状，涉及任何潜在感兴趣的个人或团体（例如，药物产销量，配方主管，保险公司，HMOs，医院和医院连锁店，其他卫生保健公司，药物受益经营者，潜在的患者，症状缓解的患者，主治医生，护士，药方医生，和/或关键意见引导者。）。

提供以下实施例是为了证实和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面，而不被理解成限定本发明的范围。

例1

NKG2D激活的分析

I L-2激活的人类NK细胞与合适的⁵¹Cr-标记的靶细胞培养物共同培养，如业已用编码人MICA的cDNA转染过的小鼠Ba/F3细胞，培养条件为能表达MICA多肽；并且将使用没有经过转染的相同的靶细胞作为对照细胞。监测⁵¹Cr的释放，以便指示细胞裂解。激活的NK细胞对MICA-表达细胞的裂解高于对照的裂解表明了NKG2D-特异性激活。

为了筛选NKG2D调节剂，将激活的NK细胞与候选制剂一起培养，然后接触⁵¹Cr-标记的靶细胞。鉴别能显著减少携带NKG2D配体的靶细胞的杀伤的化合物并且进一步评估。

例2

NKG2D内在化的分析

于37℃，在存在生物素-标记的抗-NKG2D抗体的条件下培养表达人NKG2D的细胞一小时或更长时间。作为对照，将NKG2D+细胞与生物素-标记的抗-NKG2D一起在4℃下，在存在0.05%叠氮化钠的条件下培养，以便抑制内在化。洗涤所述细胞，以便除掉多余的抗体，然后用荧光染料-标记的抗生物素蛋白链菌素染色，以便检测生物素-缀合的NKG2D抗体。然后通过荧光显微术或流式细胞测量术评估内在化。与在4℃下用生物素-标记的抗-NKG2D抗体培养的细胞相比，在37℃下用生物素-标记的抗-NKG2D抗体培养之后在细胞表面上的NKG2D的数量减少是内在化的一个指标。这一结果可以通过细胞的固定和透化，并用荧光染料标记的二级抗体（它能够检测一级抗-NKG2D抗体）染色以进一步验证。如果内在化，所述二级抗体能够检测在37℃下培养的细胞内部的一级抗-NKG2D抗体，可以通过荧光显微术观察。

例3

NKG2D封闭来预防小鼠的自身免疫性糖尿病

进行以下实验，以便检验NKG2D封闭对动物模型***的I型糖尿病发展的影响，所述模型***为NOD小鼠（Ogasawara et al.，Immunity，20：757-767，2004）。

小鼠，制剂，细胞因子和抗体

NOD小鼠是从Taconic（Germantown，NY）购买的。NOD重度联合免疫缺陷小鼠是从Jackson实验室（Bar Harbor，ME）购买的。业已公开了8.3TcR-转基因NOD小鼠（Verdaguer et al.，J Exp Med，186：1663-1676，1997）。所有小鼠都保持在UCSF动物饲养设备中在特殊无病原体条件下喂养，并且按照UCSF Committee on Animal Research的指南进行实验。当连续两次测定的血糖含量都超过300mg/dL时，就诊断为糖尿病。血糖含量是通过使用血糖监测仪（Walgreen's，Deerfield，IL）测定的。

抗-小鼠NKG2D mAb，克隆CX5和CX6（大鼠IgG1同种型）是按照公开方法（Oga sawara et al.，Immunity，18：41-51，2003）制备的，而抗-小鼠NKG2D mAb克隆191004（大鼠IgG2a同种型）是从R&DSystems（Minneapolis，MN）获得的。所有抗-NKG2D mAbs能识别NKG2D细胞外结构域，并且有效阻断NKG2D与它的配体结合。为了进行体内注射，使用纯化的CX5抗体，它不包含可检测的内毒素（<0.3μg/注射）。对照大鼠IgG是从Sigma（St.Louis，MO）购买的。抗-小鼠泛RAE-1mAb（克隆186107，大鼠I gG2b同种型）能结合RAE-1α，β，γ，δ，和ε。NRP-V7/H-2K^d和TUMM-2K^d（对照）四聚体是按公开方法（Amraniet al.，Nature，406：739-742，2000）生产的或从NIH TetramerFacility（Atlanta，GA）购买。TUM/H-2K^d四聚体不能结合NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性细胞。其他抗体是从BD PharMingen或eBioscience（San Diego，CA）购买的。

用胰腺制备胰岛细胞

按以下方法分离小鼠胰岛。简单地讲，将0.3mg/ml胶原酶P（Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN）注入胰管。取出膨胀的胰腺，并且在37℃下培养13-17分钟。通过在Eurocollin-Ficoll梯度上离心纯化所述胰岛，所述梯度包括四种不同的密度（1.108，1.096，1.069，和1.037）。在离心之后，收集1.069/1.096处的组织片段，并且洗涤。然后，为了获得单细胞，通过非-酶促细胞裂解溶液（Sigma，St.Louis，MO）裂解胰岛细胞。

免疫荧光，流式细胞测量术和显微术

为了检测NKG2D，用0.25g生物素化的或PE-标记的抗-NKG2D mAb（克隆191004）对细胞（大约1x10⁶）进行染色。同时用FITC-缀合的抗-CD8，APC-缀合的抗-CD8，FITC-缀合的抗-CD44，或FITC-缀合的抗-Ly-6C对细胞进行共染色。为了检测RAE-1，用能识别所有五种已知RAE-1蛋白的生物素化的抗-泛RAE-1mAb对细胞进行染色（Lodoen etal.，J Exp Med，197：1245-1253，2003）或用抗-RAE-l mAb（克隆CX1）（Ogasawara et al.，同上，2003）进行染色。将PE-缀合的抗生物素蛋白链菌素或APC-缀合的抗生物素蛋白链菌素用于检测生物素化的mAbs。用mAbs培养所述细胞20分钟，并且用含有0.01%NaN₃的PBS洗涤。通过使用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）或使用具有Guava ViaCount^TM和Guava Express^TM软件（Hayward，CA）的小型台式Personal Cytometer分析细胞。根据正向和侧向散射特征以及通过缺乏碘化丙锭染色对活的淋巴细胞群体进行分选。为了免疫组织化学分析，在OCT介质中快速冷冻器官，并且制备切片，通过常规技术染色。使用Deltavision显微镜（Applied Precision，Issaquah，WH）获取图像，并且使用softWoRx软件（Applied Precision）进行计算解卷积。

定量RT-PCR

使用ABI 7700（Applied Biosystems）仪器，按照生产商的说明进行定量（实时）PCR。探针是从Applied Biosystems购买的。RAE-1特异性探针和引物如以前所公开的（Ogasawara et al.，同上，2003）。用于检测所有已知RAE-1转录物的通用引物是：正义，5'-ctagtgccacctgggaattc a-3'（SEQ ID NO：6）；反义5'-catcattagct gatctccagctca-3'（SEQ ID NO：7），并且探针为5'-6-FAM-catcagtgac agttacttcttcaccttcta cacagaga-Tamra-3'（SEQ ID NO：8）。用DNase I处理总RNA，然后使用随机六聚体引物合成第一股cDNA链。实时PCR的循环条件如下：50℃10分钟，然后95℃30秒，共进行50轮，以及60℃2分钟。通过使用Sequence Detector v1.7分析软件（Applied Biosystems）分析数据。使用双样本t-测验进行统计学分析。

继承转移研究-转移到NOD重度联合免疫缺陷小鼠体内的NOD T细胞

使用MACS（Miltenyi Biotec Inc.，Germany）通过磁力细胞分选从16周大的NOD小鼠的脾脏和***中分离T细胞。通过负筛选富集T细胞（纯度>98%），耗尽CD19⁺，CD24⁺，和MHC型II+细胞。通过向尾静脉注射将大约7.5x10⁶T细胞转入4-5周大的NOD重度联合免疫缺陷小鼠体内。每周检查继承转移的小鼠的血糖含量。

继承转移研究-进入NOD小鼠体内的8.3TcR-转基因T细胞

继承T细胞转移是按照以前披露的方法进行的（Serra et al.，Proc Natl Acad Sci USA，99：15566-15571，2002）。简单地讲，从***和脾脏中分离8.3TcR-转基因淋巴细胞。使用MACS通过磁力分选负筛选来富集T细胞（纯度>95%）。在第0天通过尾静脉注射将用CFSE（5μM）标记的大约1x10⁷T细胞转入10周大的NOD小鼠体内。在第－1，＋1和＋5天，将抗-NKG2D mAb（CX5）或cIg（200μg/注射）注入受体NOD小鼠。

RAE-1在前驱糖尿病的NOD小鼠的胰腺中的表达

为了研究NKG2D和RAE-1之间的相互作用是否与自身免疫性糖尿病的发展有关，开发了定量RT-PCR分析方法，以便检测所有已知RAE-1基因的转录物。在晚期前驱糖尿病的NOD小鼠（12-16周大）的胰腺中检测到大量RAE-1转录物，而在年龄-匹配的BALB/c小鼠的胰腺检测不到（图la）。尽管显著性较低，但RAE-1转录物也能够在4-6周大的NOD小鼠的胰腺中检测到。还能够在成年NOD重度联合免疫缺陷小鼠（它缺少B和T细胞）的胰腺中检测到RAE-1（图1b）。总之，以上结果表明，RAE表达不取决于正在进行的自身免疫反应。为了检查RAE-1是否随着衰老在胰腺中被选择性地上调，将来自幼小NOD小鼠特定器官中的RAE-1转录物的含量与晚期前驱糖尿病的NOD小鼠体内的相同器官中的转录物含量进行比较。根据这一标准，与肝脏，脾脏，肾脏和胸腺相比，随着衰老，前驱糖尿病小鼠的胰腺中的RAE-1增加的更多（图1c）。

为了确定RAE-1蛋白是否在细胞表面表达，从前驱糖尿病的NOD和非-糖尿病BALB/c小鼠体内分离胰腺细胞。通过对胰腺进行酶促消化分离的细胞用抗-RAE-1和抗-CD45mAb（它能区分浸润性CD45+造血细胞和CD45-非-造血胰岛细胞）进行染色。在浸润性前驱糖尿病的NOD胰腺中检测到CD45-阳性造血谱系细胞，而在非-糖尿病BALB/c胰腺中检测不到（图1d）。RAE-1蛋白主要是在NOD小鼠的CD45-阴性非-造血性胰腺细胞上检测到的，而在BALB/c小鼠的胰腺细胞上检测不到。通过密度梯度分离技术，从NOD胰腺中分离胰岛，并且还可以从所述小鼠的胰***（PLN）中收集。来自分离的胰岛和PLN的单细胞悬浮液用抗-RAE-1和抗-CD45mAb进行染色，并且通过流式细胞测量术进行分析。RAE-1以低含量存在于大部分CD45-胰岛细胞上，而不存在于胰腺或PLN的CD45+造血细胞上（图1d，e）。以上结果表明，RAE-1转录物和蛋白存在于前驱糖尿病的NOD小鼠的胰腺中，而不存在于非-糖尿病BALB/c小鼠体内，并且表明，RAE-1的表达可能是在疾病发作之前，并且在NOD小鼠中导致了疾病的发展。

D8+T细胞浸润表达NKG2D的NOD胰腺

由于糖尿病在NOD小鼠中的发展需要CD4+和CD8+T细胞，分析了NKG2D在从外周免疫组织中分离的T细胞上的表达，以及在NOD小鼠的胰腺中的浸润白细胞上的表达。参见图2a，在10和15周大的NOD小鼠的浸润胰腺的CD8+T细胞的亚型上检测NKG2D。浸润胰腺的NKG2D+CD8+T细胞的百分比随着疾病的发展而提高（图2a）。在PLN和脾脏中检测到较小比例的NKG2D+CD8+T细胞（图2a，b）。另外，发现胰腺和PLN中的NKG2D^＋CD8⁺T细胞能表达高含量的CD44，但是不能表达Ly-6C（图2b）。还在浸润NOD胰腺的白细胞中观察到了CD8^-NKG2D⁺白细胞群体（它不能表达CD3）（图2a），并且这些细胞中的很多能共同表达NK细胞和髓样细胞抗原。正如在正常非糖尿病小鼠品系中报导的，famieson等，Immunity，17：19-29，2002），在10周或25周大的NOD小鼠的胰腺外周淋巴组织中的CD4+T细胞或220+B细胞上检测不到NKG2D。

最新的研究发现，NOD小鼠中的较大比例的自身反应性CD8+T细胞能识别来自葡萄糖六磷酸酶催化的亚基相关蛋白（IGRP）的肽，这种肽是由H-2K^d呈递的。模拟型肽，NRP-V7（KYNKANVFL，参见SEQ ID NO：5），在表达8.3TcR的NOD小鼠体内起着超级拮抗剂的作用。NRP-V7-反应性CD8+T细胞在NOD小鼠的胰腺中蓄积，并且在糖尿病形成中发挥关键作用。用NRP-V7/H-2K^d四聚体和抗-NKG2D对胰腺和PLN中的CD8+T细胞同时进行染色。在浸润胰腺的所有NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8+T细胞中都能高水平表达NKG2D和CD44（图2c）。类似地，胰腺中的NKG2D+CD8+T细胞是CD44高含量，而Ly-6C^－（图2b），Ly-6C是一种与效应子CD8+T细胞一致的表型（Cerwenka et al.，J lmmunol，161：97-105，1998）。特别是，在PLN中检测很少的NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8+T细胞（图2c）。免疫组织化学分析发现，NKG2D+CD8+T细胞在前驱糖尿病NOD小鼠的胰岛中蓄积，所述细胞靠近产生胰岛素的β细胞（图2d）。除了CD8+T细胞之外，胰腺中CD68-阳性细胞（巨噬细胞）也能表达NKG2D（图d）。

用中和抗-NKG2D mAb进行体内治疗能预防自身免疫糖尿病

NKG2D在浸润性CD8+T细胞上的表达以及NKG2D配体在前驱糖尿病的胰岛上的表达表明了这些分子在糖尿病发生中的作用。通过用中和抗-NKG2D mAb处理前驱糖尿病的NOD小鼠检验了这种假说。CX5抗-小鼠NKG2D mAb阻断NKG2D与它的配体结合，并且培养携带NKG2D的细胞和CX5导致了所述受体的调节和内在化。重要的是，用CX5对小鼠进行体内处理不会消耗NKG2D+NK细胞或CD8+T细胞。用抗-NKG2D mAb从7开始直至25周处理NOD小鼠。用稀释剂处理的小鼠只能在15周大开始出现糖尿病，而所有（n=7）小鼠在28周时患病（图3a，b）。相反，用抗-NKG2D处理的NOD小鼠（n=7）没有一个在30周大时出现糖尿病，尽管抗体治疗提前5周停止（图3a，b）。

作为更严格的分析，检验了抗-NKG2D mAb治疗在具有确定的胰岛炎的13周大的前驱糖尿病的小鼠中对糖尿病发作的预防。使用对照IgG的小鼠从15周大开始出现糖尿病。相反，在抗-NKG2D治疗的12周时间内在NOD小鼠中没有一只出现糖尿病（图3c，d）。显然，大多数抗-NKG2D处理的小鼠在终止治疗之后有7周时间保持不发病（图3c，d）。因此，NKG2D的封闭，不仅在患有胰岛炎的幼小小鼠中，而且还在具有晚期前驱糖尿病阶段胰岛破坏即将发作的小鼠中能预防糖尿病的发展。通过肉眼检查或组织学分析都没有观察到抗-NKG2D mAb治疗的副作用。因此，抗-NKG2D mAb治疗是预防糖尿病的有效治疗方法，至少只要连续施用抗体就行。

为了检验抗-NKG2D mAb-介导的治疗的机制，分析了从对照I g和抗-NKG2D mAb-处理的NOD小鼠的胰腺和PLN中分离的白细胞。共同表达NKG2D和高水平的CD44的CD8+T细胞出现在对照Ig-处理的小鼠的胰腺中。正如所预料的，NKG2D表达在CD8+T细胞上显著减弱，但是CD44表达与用抗-NKG2D mAb处理的小鼠的胰腺中的表达相同，以上结果是相对用对照I g处理的小鼠而言的（图4a）。相反，表达NKG2D的CD8+T细胞在对照和抗-NKG2D mAb处理的小鼠的PLN中都比较少见，表明了NKG2D+CD8+T细胞在胰腺中的优势定位（与图2中所示的未处理过的NOD小鼠的结果一致）。对来自对照Ig处理的小鼠的胰腺冰冻切片的组织化学分析表明在用对照Ig处理的16周大的NOD小鼠的胰腺中具有大量表达NKG2D的CD8+T细胞（图4b）。相反，很少的CD8+T细胞出现在16周大的用抗-NKG2D处理了九周时间的健康小鼠的胰腺中（图4c）。

还分析了从用对照Ig或抗-NKG2D mAb处理的NOD小鼠的胰腺和PLN中分离的白细胞中抗原-特异性自身反应性CD8+T细胞的存在。很显然，在用抗-NKG2D mAb处理的小鼠体内，自身反应性NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8+T细胞向胰腺中的浸润显著降低（～75%）（图4d）。与对照Ig-处理的小鼠相比，用抗-NKG2D mAb-处理的小鼠的PLN，脾脏和外周血NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8+T细胞的频率同样降低（图4d，e）。在用抗-NKG2D mAb处理的小鼠的CD8+T细胞上检测不到NKG2D。由于CX5是非耗尽的抗-NKG2D mAb（参见，图8），所述治疗方法是通过调节受体（参见，图7）和/或抑制配体结合起作用。还检查了在体内用对照Ig或抗-NKG2D mAb处理的小鼠的PLN中分离的CD8+T细胞的IFN-γ产量。在体外用PMA和伊屋诺霉素刺激时，在cIg-处理的NOD小鼠中检测到IFN-γ^＋CD8⁺T细胞，而在进行抗-NKG2D mAb治疗的小鼠体内观察到较少的IFN-γ^＋CD8⁺T细胞（图.4f）。尽管如此，为了实施和利用本发明，对所述机制的了解不是必要的。

NKG2D的封闭在接受了来自糖尿病NOD小鼠的继承转移的T细胞的NOD重度联合免疫缺陷小鼠体内能预防糖尿病

为了确定NKG2D的封闭是否能影响效应子CD8+T细胞，将从16周大的糖尿病NOD小鼠体内分离的T细胞继承转移到NOD重度联合免疫缺陷受体内（它缺少T细胞，并且不能发生糖尿病）。在转移时，只有很小百分比的CD8+T细胞能表达NKG2D（图5a）。不过，在转移5周之后，在受体小鼠的胰腺，PLN，和脾脏中检测到大量NKG2D+CD8+T细胞（图5a），表明了预先存在的NKG2D+T细胞的扩增或在转移的CD8+T细胞上获得了NKG2D。在cIg-处理的受体小鼠上，浸润胰腺的大约15%的CD8+T细胞是NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性，而在抗-NKG2D mAb-处理的小鼠中出现的量明显更少（图5b，c）。NKG2D出现在对照Ig-处理的NOD小鼠的大部分NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性自身反应性CD8+T细胞上，但是在接受抗-NKG2D mAb治疗的小鼠上检测不到（图5c）。尽管在接受了来自糖尿病NOD小鼠的T细胞的所有对照Ig-处理的NOD重度联合免疫缺陷小鼠上都出现了糖尿病，但在接受治疗时，抗-NKG2D mAb-处理的小鼠无一出现糖尿病（图5d）。

为了确定抗-NKG2D治疗是否能在NOD重度联合免疫缺陷受体小鼠中阻断病原性CD8+T细胞的扩增，在8周之后终止抗-NKG2D mAb治疗，此时所有对照Ig-处理的小鼠都发病。在终止抗-NKG2D治疗4周之后，在大部分业已接受了来自糖尿病NOD供体的T细胞的NOD重度联合免疫缺陷小鼠中出现了糖尿病（图5d）。另外，此时，存在NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性NKG2D+CD8+T细胞在NOD重度联合免疫缺陷小鼠体内扩增的证据（图5e）。以上结果表明，抗-NKG2D mAb治疗抑制了NKG2D+CD8+T细胞在胰腺中的扩增和/或蓄积。在终止治疗之后不久糖尿病的迅速发展，表明在抗体治疗期间效应子T细胞受到了控制，而不是被耗尽。

抗-NKG2D mAb治疗能预防自身反应性CD8+T细胞在胰腺中扩增

在抗-NKG2D处理小鼠的胰腺中出现较少的NRP-V7/H-2K^d四聚体-阳性CD8+T细胞的这一结果与mAb治疗阻断了自身反应性T细胞扩增的可能性吻合。为了直接检验这一假说，用CSFE标记8.3TcR-转基因T细胞，继承转移到10周大的NOD受体内，并且用对照Ig或抗-NKG2DmAb处理（图6）。在转移之前，来自8.3TcR-转基因NOD小鼠的***和脾脏的供体CD8+T细胞是>90%NRP-V7/H2K^d四聚体阳性的，但是不能表达NKG2D（图6a）。两天之后，浸润用对照Ig处理的小鼠胰腺的转移了CSFE-标记的8.3 TcR-转基因NOD CD8+T细胞表达NKG2D（图6b），并且已经增殖；不过，在出现在胰腺或肠系膜***上转移的T细胞中没有观察到CSFE的稀释（图6c）。在转移之后4天和8天，在用对照Ig处理的小鼠的胰腺和胰***，而不是在肠系膜***中的CFSE-标记的8.3 TcR-转基因T细胞，表现出充分的增殖（图6c）。形成显明对照的是，在用抗-NKG2D mAb处理的NOD小鼠的胰腺中转移的CSFE-标记的8.3TcR-转基因CD8+T细胞的细胞表面上检测不到NKG2D（图6b）。另外，与用对照Ig处理的小鼠相比，所述细胞在胰腺中的扩增受到显著抑制（图6c）。有趣的是，与***中的细胞相比，用抗-NKG2D mAb治疗对浸润胰腺的CSFE-标记的8.3 TcR-转基因T细胞的增殖具有更显著的影响。与对照Ig处理的小鼠相比，通过用抗-NKG2D mAb处理同样能减弱在用NRP-V7/H2K^d四聚体检测的内源CSFE-未标记的T细胞在胰腺中的扩增。在对照Ig和抗-NKG2D mAb处理的NOD小鼠中浸润胰腺的继承转移的8.3TcR-转基因T细胞的增殖定量，表明了抗-NKG2D治疗对自身反应性抗原-特异性CD8+T细胞扩增的显著影响（图6d）。

以上数据表明，RAE-1出现在前驱糖尿病的NOD小鼠的胰腺胰岛中，并且，浸润胰腺的自身反应性CD8+T细胞表达NKG2D。在前驱糖尿病阶段，用非耗尽的抗-NKG2D单克隆抗体（mAb）治疗，通过减弱自身反应性CD8+T细胞的扩增和功能完全预防了发病。以上发现证实，NKG2D是疾病发展所必需的，并且提供了自身免疫I型糖尿病的新的治疗目标。这些数据直接暗示了NKG2D受体在病原性CD8+T细胞的效应子功能方面的功能性发展，并且表明，抗-NKG2D mAb起着治疗性作用，能够在细胞没有耗尽时阻断受体介导的信号。

例4

通过shRNA调节细胞表面NKG2D的表达

为了检验抑制RNA对NKG2D表达的作用，进行了以下实验。将包含IRES-eGFP因子的载体中的编码人NKG2D的DNA稳定地转染到CHO细胞中。然后用编码小鼠CD8的cDNA（mCD8）和用含有22个碱基对（bp）的cDNA（5'-ggatgggact agtacacatt cc-3'，参见SEQ ID NO：10）的质粒（购自InVitroGen的pCR2.1-TOPO载体），与一段人NKG2D片段同源，（被命名为shDNA03）转染（采用Lipofectamine和标准方法）所述稳定转染的NKG2D-表达细胞。作为验证特异性的对照，还用mCD8和22bp cDNA对表达NKG2D的CHO细胞进行双重转染，所述22bp cDNA类似于人NKG2D，但是具有3个突变的核苷酸（5'-ggatgggattagtatagatt cc-3'，参见SEQ ID NO：13）。左侧图片中的细胞只用包含小鼠CD8cDNA（mCD8）的质粒转染。转染的细胞用抗小鼠CD8和抗人NKG2D的单克隆抗体进行染色，并且通过流式细胞测量术分析。获得了双变量点图，显示的荧光代表（i）小鼠CD8与人NKG2D和（ii）eGFP（通过人NKG2D-IRES-eGFP载体表达产生的内在绿色荧光）与人NKG2D。

以上结果表明，首先在细胞表面上表达小鼠CD8的细胞可以方便地被检测，表明它们是由导入CHO细胞中的质粒转染的。另外，人NKG2D在小鼠CD8-表达细胞上的表达不受用小鼠CD8质粒单独转染或者与包含突变型NKG2D构建体的质粒共同转染的影响。相反，用同源NKG2D序列共同转染显著抑制了NKG2D的表达。

例5

通过使用抗-NKG2D单克隆抗体调节细胞表面NKG2D

进行以下实验，以便评估针对抗NKG2D的单克隆抗体调节NKG2D细胞表面表达的能力。

在冰上用生物素-缀合的对照IgG（cIg bio）或用生物素缀合的小鼠抗-人NKG2D mAb（R&D Systems clone 149810）对人NK细胞系（NKL）进行染色30分钟，洗涤，并且在37℃下培养一等份样品过夜。在培养之前（0h）或之后（16h），用别藻蓝蛋白-缀合的抗生物素蛋白链菌素对细胞进行染色，随后通过流式细胞测量术进行分析。在培养之前抗-NKG2D染色的细胞的平均荧光强度（任意单位）为186，而培养之后的强度为61，表明在用抗-NKG2D mAb处理16小时的NK细胞的细胞表面上NKG2D的表达减弱了67%。

在37℃下用对照IgG或用小鼠抗-人NKG2D IgG（R&D Systems clone149810）培养NKL细胞16小时。在培养结束时，洗涤所述细胞，并且用pH 3.5的酸性介质处理15分钟，以便除去表面抗体。然后用抗-NKG2D抗体对所述细胞进行染色，接着用PE-标记的山羊抗-小鼠IgG二级抗体进行染色，以便检测表面NKG2D。图12表示这种抗-NKG2D抗体能有效刺激人细胞上的表面NKG2D的内在化。

例6

NKG2D封闭能在F l小鼠中预防亲本骨髓移植排斥

进行以下实验，以便检验NKG2D封闭对动物模型***（C57BL/6xBALB/c）Fl（CB6F1）小鼠中杂合阻抗（F1受体对亲本骨髓移植的排斥）的发展的影响。

小鼠

大约6-8周大的C57BL/6，BALB/c，和CB6F1小鼠是从NationalCancer Institute Animal Program（Frederick，MD）购买的。制备RAE-1ε转基因小鼠，并且回交到C57BL/6背景中（Ehrlich等，未发表的发现）。以前业已披露了（Bakker等，Immunity，13：345-353，2000）C57BL/6背景上的DAP12-/-小鼠（回交9代），用C57BL/6胚胎干细胞制备的DAP10-/-（Phillips et al.，未发表的发现）。所有实验是按照UCSF Committee on Animal Research的指南进行的。

制剂、细胞因子和抗体

抗-小鼠NKG2D mAb、克隆CX5（大鼠IgG1同种型）是按照以前披露的方法（Ogasawara et al.，Immunity，18：41-51，2003）通过用纯化的小鼠NKG2D蛋白进行免疫大鼠制备的。抗-小鼠NKG2D，克隆191004（大鼠IgG2a同种型）是用杂交瘤生产的，杂交瘤是通过小鼠骨髓瘤与来自用重组小鼠NKG2D细胞外结构域免疫过的大鼠（R&DSystems，Minneapolis，MN）的B细胞融合得到的。所有抗-NKG2D mAbs都能识别NKG2D细胞外结构域，并且能有效阻断NKG2D结合它的配体。为了进行体内注射，使用了纯化的抗-NKG2D mAb CX5和抗-NK1.1 mAbPK136，它们不包含可检测的内毒素（<0.3μg/注射）。抗-NKG2D mAbCX5是封闭抗体，在体内注射时，它不会耗尽携带NKG2D的NK细胞或T细胞（Ogasawara et al.，Immunity，20，757-7567，2004；Lodoenet al.，JExp Med，197：1245-1253，2003）；和Lodoen et al.，JExp Med，200：1075-108，2004）。对照大鼠IgG是从Sigma公司（St.Louis，MO）购买的。抗-小鼠泛-RAE-1mAb（克隆186107，大鼠IgG2b同种型），抗-小鼠H60mAb（克隆205310）和抗-小鼠MULTI mAb（克隆237104）是按公开方法制备的（Lodoen et al.，同上，2003；和Lodoen et al.，同上，2004）。其他抗体是从BD PharMingen或eBiosocience（San Diego，CA）购买的。

骨髓移植

按以前公开的方法（George et al.，J Immunol，163：1859-1867，1999）移植鼠骨髓。简单地讲，在骨髓移植2天之前进行mAb处理（200μg/小鼠），并且在注射骨髓细胞之前1天用poly I：C（Sigma，200μg/小鼠）处理受体，以便加强NK细胞-介导的移植排斥（Murphy etal.，J Exp Med，166：1499-1509，1987）。在第0天，通过接触致死剂量（11Gy）的¹³⁷Cs γ射线对小鼠进行辐射，然后静脉内注射4x10⁶BM细胞。转移5天之后，通过静脉途径给小鼠使用26μg的5-氟-2'-脱氧尿苷（Sigma，St.Louis，MO），以便抑制内源胸苷合成（Georgeet al.，同上，1999）。三十分钟之后，通过静脉内途径给小鼠使用3μCi的5-[¹²⁵I]碘-2'-脱氧尿苷（Amersham Life Science，ArlingtonHeights IL）。在第6天，将脾脏从受体小鼠体内取出，并且用γ计数器计数。

BM嵌合小鼠的制备

简单地讲，通过静脉内途径将1x10⁷ Ly5.2B6BM细胞转移到NK细胞耗尽的和辐射过的受体小鼠体内（辐射吸收剂量=11Gy），按以前披露的方法进行（Ogasawara et al.，Nature，391：701-703，1998）。在再生期间，将小鼠用抗生素维持。

NK细胞的制备

按以前公开的方法富集NK细胞（Ogasawara et al.，J Immunol，169：3676-3685，2002）。简单地讲，脾细胞与抗-小鼠CD4mAb（克隆GK1.5）和抗-小鼠CD8mAb（克隆53-6.7）培养，然后将这些细胞与用山羊抗-小鼠Ig和山羊抗-大鼠Ig包衣的磁珠（AdvancedMagnetic，Inc，Cambridge，MA）混合。通过磁力细胞分选除去CD4，CD8，和表面Ig（sIg）-阳性细胞。

流式细胞分析

利用包含与人IgG1 Fc融合的小鼠NKG2D的细胞外结构域的融合蛋白（mNKG2D-Ig）检测NKG2D配体（Cerwenka et al.，Immunity，12：721-727，2000）。将PE-缀合的山羊抗-人IgG Fcy片段（JacksonImmunoResearch，West Grove，PA）用作二级制剂。用0.5μg的mNKG2D-Ig和用0.25μg的其他mAbs对细胞（1x10⁶）进行染色。为了确定哪一种NKG2D配体得到表达，细胞用能识别所有五种已知的RAE-1蛋白（即RAE-1α，β，γ，δ和ε）的生物素化的抗-泛RAE-1 mAb、生物素化的抗-H60 mAb或抗-MULTI mAb进行染色。将PE-缀合的抗生物素蛋白链菌素或APC-缀合的抗生物素蛋白链菌素用于检测生物素化的mAbs。为了检测NKG2D，用0.25μg生物素化的或PE-标记的抗-NKG2D mAb（克隆191004）对细胞（^-1x10⁶）进行染色。细胞用抗-CD43，抗-Ly6C/G，抗-CD 11c，抗-B220，抗-CD3，抗-TER119，抗-NK1.1和抗-CD49d（DX5）mAbs进行共染色。所述细胞用mAbs培养20分钟，并且用含有0.01%NaN₃的PBS洗涤。通过使用FACS Calibur（BectonDickinson，San Jose，CA）流式细胞器对细胞进行分析。根据正面和侧面反射特征并且根据碘化丙锭染色的缺乏对活的淋巴细胞群体进行分选。

细胞毒性分析

按照以前披露的方法进行单克隆抗体-介导的改向的细胞毒性分析（Lanier et al.，J Immunol，141：3478-3485，1988）。在37℃下，在含有10%FCS的RPMI-1640介质中用50μCi的Na₂（⁵¹Cr）O₄对靶细胞进行标记2小时，用介质洗涤3次，并且用于细胞毒性分析。⁵¹Cr-标记的靶细胞（5x10³）和效应子细胞在96孔微量滴定板的U-形底的孔中，以标明的效应子/靶细胞（E/T）比例混合，重复三次。在培养4小时之后，收集无细胞的上清液，并且用微型-β计数器（Wallac，Turku，Finland）测定放射性。自发性释放低于最大释放的15%。特异性⁵¹Cr释放的百分比是按照以下公式计算的：%特异性裂解=（实验-自发）释放x100/（最大-自发）释放。

NKG2D配体在小鼠BM细胞上的表达

编码NKG2D配体的基因是多形性的；BALB/c（B/c）小鼠具有RAE-1α，β，和γ基因，而C57BL/6（B6）小鼠具有RAE-1δ和ε基因（Cerwenka and Lanier，Tissue Antigens，61：335-343，2003）。类似地，B/c而不是B6小鼠能表达H60（Malarkannan et al.，J Immunol，161：3501-3509，1998）。分析从B/c，B6和（BALB/cxC57BL/6）Fl（CB6F1）小鼠体内分离的BM细胞以便确定NKG2D配体是否能在BM细胞上表达。用小鼠NKG2D-IgG Fc融合蛋白对细胞进行染色，并且通过流式细胞测量术进行分析。在新分离的B/c BM细胞上，而不是在B6BM细胞上检测到低含量的NKG2D配体（图13a）。为了确定表达了哪一种NKG2D配体，用抗-泛RAE-1，抗-H60和抗-MULTI单克隆抗体（mAbs）对BM细胞进行染色。RAE-1和H60以低含量在新分离的B/c BM细胞上表达，而检测不到MULTI（图13b）。相反，在从B/c，B6或CB6F1小鼠中新分离的脾细胞上检测不到RAE-1。

以前的研究业已证实，F1受体中的NK细胞能够排斥亲本骨髓移植（Kiessling et al.，Eur J Immunol，7：655-663，1977；Lotzovaet al.，Transplantation，35：490-494，1983；Murphy et al.，JExp Med，165，1212-1217，1987；和Murphy et al.，Eur J Immunol，20：1729-1734，1990）。本发明人认为，在辐射过的CB6F1受体内恢复脾脏的B/c BM细胞表达NKG2D配体。因此，在本发明开发过程中，用抗-NK1.1mAb对受体CB6F1小鼠进行预处理，以便耗尽原有的NK细胞，并因此防止移植的B/c BM细胞的排斥。作为对照，用同源CB6F1BM细胞复原了一组辐射过的CB6F1小鼠。移植七天之后，分离恢复CB6F1小鼠脾脏的造血细胞群，并且分析NKG2D配体的表达。参见图13c，在从B/c BM->CB6F1小鼠的脾脏中分离的造血细胞上检测到NKG2D配体，而在从CB6F1 BM->CB6F1小鼠的脾脏中分离的细胞上检测不到。恢复辐射过的CB6F1受体脾脏的B/c造血细胞主要表达RAE-1，而不能表达H60或MULTI（图13d）。

为了鉴定能表达RAE-1的造血细胞群体，从CB6F1 BM->CB6F1和B/c BM->CB6F1受体的脾脏中分离的细胞用抗造血谱系标记的mAbs进行染色。在移植之后第7天，在从CB6F1 BM->CB6F1受体的脾脏中分离的大部分细胞上检测到RAE-1。相反，在来自CB6F1 BM->CB6F1受体的脾脏中的大部分细胞上检测不到RAE-1。从B/c BM->CB6F1受体中分离的几乎所有RAE-1-阳性细胞都能表达CD43（图13e）。RAE-1还出现在能表达粒细胞-相关的Gr-1（Ly-6C/G）蛋白和骨髓细胞相关的标记CD11b（Mac-1）的大部分细胞上。只有一小部分B220（B细胞相关的标记）-阳性细胞和Ter 119（红血球相关的标记）-阳性细胞表达RAE-1，而在CD3+T细胞上检测不到RAE-1（图13e）。认为在脾脏中检测到的B细胞和T细胞是宿主原有的残留的耐辐射T细胞，因为不可能是由供体骨髓细胞在移植后不到一周时间形成的T细胞或B细胞。在表达c-kit和Sca-1的小部分（subset）细胞上检测到RAE-1，尽管大部分RAE-1-阳性细胞没有这样的标记（图13f）。通过将BrdU注射到所述小鼠体内，评估B/c BM->CB6F1受体中表达RAE-1的细胞的增殖状态，所述注射是在移植之后第7天收获脾细胞之前2小时和12小时进行的。参见图13g，RAE-1能方便地在大部分（而不是全部）移植受体的脾脏中的增殖祖细胞上检测到。

在初步实验中，用从B/c供体中分离的完整的骨髓移植到CB6F1小鼠体内。为了确定RAE-1是否在造血干细胞的后代（HSC）上表达，在收集骨髓以便富集HSC之前用5-氟尿嘧啶（5-FU）处理供体B/c小鼠，然后将来自5-FU-处理的供体的骨髓移植到CB6F1受体内，所述受体用抗-NK1.1mAb预处理过，以便耗尽原有的宿主NK细胞。从5-FU-处理的供体中收获的骨髓细胞不能表达RAE-1。当在移植之后第8天分析B/c5-FU BM->CB6F1受体脾脏中的细胞时，基本上所有RAE-1-阳性细胞都能表达Ly-6C/G，CD11b和CD43，但不能表达CD3，Ter119，或B220。小部分的RAE-1-阳性细胞表达低水平的c-kit和Sca-1，不过大部分RAE-1-阳性细胞都缺少这两种标记（图13i）。以上结果表明，NK细胞-耗尽的CB6F1受体中的大部分增殖的B/c祖细胞能表达RAE-1。

由于本发明的发展，业已报导了NKG2D配体在增殖的人类骨髓细胞上的表达（Nowbakht et al.，Blood，于2005年1月18日通过电子版发表）。因此，本发明人认为，本发明人认为，本文所披露的用小鼠进行的实验，还涉及到人类（和其他哺乳动物）。

NKG2D与杂合阻抗有关

在开发本发明的过程中，RAE-1在用B/c骨髓重建的CB6F1小鼠脾脏中的增殖祖细胞上表达这一发现，给本发明人提示了NKG2D与杂合阻抗相关。这一假设通过将B/c BM细胞转入辐射过的CB6F1小鼠体内得到了验证，所述小鼠用对照抗体（cIg），中和的，非耗尽的抗-NKG2D mAb（CX5）（Ogasawara et al.，Immunity，20：757-767，2004），或NK细胞-耗尽的抗-NK1.1mAb（PK136）进行过预处理。在第7天收获脾脏12小时之前通过注射¹²⁵IUdR来评估受体小鼠的造血细胞恢复情况。cIg-处理的小鼠排斥B/c BM细胞，并且与以前的报导一致（Lotzova etal.，Transplantation，35：490-494，1983），NK细胞在CB6F1小鼠体内的耗尽，有效预防了B/c骨髓细胞的排斥，由此导致了放射性标记在所述脾脏中整合的显著增加（图14a）。与耗尽的NK细胞的作用相比，非耗尽的，中和抗-NKG2D mAb也显著增加¹²⁵IUdR的整合。

通过在移植之后第8天检查脾脏的细胞恢复，验证了抗-NKG2D mAb治疗防止B/c骨髓细胞排斥的能力。参见图14b，在用抗-NKG2D mAb处理的CB6F1小鼠的脾脏的RAE-1-阳性细胞上检测到占优势的共同表达的CD43，Ly-6C/G，和CD11b。相反，从cIg-处理的小鼠中回收的细胞少得多，并且这些细胞中很少表达RAE-1。这些数据表明，在CB6F1小鼠中RAE-1-阳性B/c BM细胞的排斥可以通过耗尽NK细胞或通过阻断NKG2D受体有效地预防。

NK细胞消除高水平表达RAE-1的同源的BM细胞

抗-NKG2D mAb治疗以在F受体中阻断亲本骨髓移植排斥的能力产生了这样的问题：Fl NK细胞对亲本H-2的识别是否是NKG2D-依赖型排斥所必需的，或者，假若RAE-1以足够高的水平表达则NK细胞是否也能排斥同源的骨髓细胞。恢复同源的辐射过的CB6F1受体的CB6F1骨髓细胞（图13c，e）和恢复同源的辐射过的B6受体的B6骨髓细胞与B/c恢复骨髓细胞相比只能表达非常低水平的RAE-1（图13d，e）。因此，为了评估RAE-1是否能在B6上表达或者CB6F1骨髓细胞是否会导致同源的骨髓的排斥，制备了能表达RAE-1ε的转基因小鼠，该RAE-1ε是由人β-肌动蛋白启动子驱动的，导致RAE-1ε能在所有组织中表达。参见图15a，RAE-1ε在从B6RAE-1ε转基因小鼠体内新分离的骨髓细胞上的表达水平与出现在恢复B/c骨髓细胞上的RAE-1的水平相似（图13d，e）。

在标准体外细胞毒性分析中，将从RAE-1ε转基因B6小鼠内新分离的骨髓细胞作为IL-2-激活的同源非-转基因NK细胞的目标进行实验。参见图15b，激活的NK细胞杀伤了新分离的RAE-1ε转基因B6骨髓细胞，但不能杀伤RAE-1-阴性非-转基因B6骨髓细胞。通过抗-NKG2DmAb阻断了细胞毒性，表明所述杀伤是NKG2D-依赖型的。按照这一体内实验结果，辐射过的非-转基因B6小鼠能排斥来自RAE-1ε转基因B6供体的骨髓细胞。重要的是，在用中和抗-NKG2D mAb处理的小鼠体内防止了排斥作用，而在用对照I g处理的小鼠体内不能防止（图15c）。在RAE-1ε转基因B6与B/c小鼠杂交并且将RAE-1ε转基因CB6F1骨髓移植到非-转基因CB6F1受体时获得了类似结果。与非-转基因CB6F1骨髓细胞（图13c，e）不同，RAE-1ε转基因CB6F1骨髓细胞能表达高水平的RAE-1ε，并且受到同源的非-转基因CB6F1受体的排斥（图15d）。通过施用中和的，非耗尽的抗-NKG2D mAb处理或通过用抗-NK1.1mAb耗尽NK细胞能防止排斥作用。综上所述，以上发现表明，B6和CB6F1NK细胞能排斥H-2相同的骨髓细胞，只要所述骨髓细胞能表达RAE-1。

NKG2D-介导的BM排斥中的DAP10和DAP12

在小鼠体内，NKG2D转录物的不同的RNA剪接产生了两种蛋白异构型，被称为NKG2D-S和NKG2D-L。NKG2D-L主要是在静息NK细胞上表达，并且与DAP 10接头蛋白结合，而NKG2D-S是通过激活NK细胞诱导的，并且与DAP10或DAP12结合（Diefenbach et al.，Nat Immunol，3：1142-1149，2002）。将来自RAE-1ε转基因B6小鼠的骨髓细胞移植到辐射过的野生型，DAP10-/-，和DAP12-/-C57BL/6受体内，以便确定DAP 10或DAP 12或这两种接头是否参与了NKG2D-介导的排斥。在第5天用¹²⁵IUdR注射小鼠并且在第六天收获脾脏和计数。与野生型B6小鼠相比，DAP10-/-B6小鼠表现出在排斥RAE-1ε转基因B6骨髓移植方面的显著的缺陷（图16a）。相反，DAP12-/-B6受体比DAP 10-/-B6小鼠更有效地排斥RAE-1转基因B6骨髓，不过比野生型B6小鼠稍差一些（图16b）。野生型，DAP10-/-和DAP12-/-B6小鼠在用耗尽的抗-NK1.1mAb或用非耗尽的，中和抗-NKG2D mAb处理过后都不会排斥RAE-1ε转基因B6骨髓移植物。这些结果表明，DAP10在NKG2D-依赖型骨髓排斥中起主要作用而DAP12起次要作用。尽管如此，对于实施和利用本发明来说，对所述机制的理解并非是必要的。

RAE-1ε转基因小鼠中的缺陷型杂合阻抗

来自NOD小鼠的NK细胞的激活诱导了RAE-1的表达，它导致了NK细胞上NKG2D的配体-依赖型调节（Ogasawara et al.，Immunity，18，41-51，2003）。分析NKG2D在来自RAE-1ε转基因B6小鼠的NK细胞表面上的表达，发现了与来自野生型小鼠的NK细胞相比NKG2D的表达减弱（图17a）。尽管RAE-1转基因B6上的NKG2D的数量显著减少了，但脾脏中NK细胞的数量和NK1.1，Ly-49D，Ly-49A，Ly-49C/I，Ly-49F/I/C/H，和Ly-49G2在NK细胞上的表达与野生型NK细胞相似。为了检查NKG2D的功能在RAE-1ε转基因NK细胞中是否被削弱，用cIg，抗-NKG2D mAb和抗-NK1.1mAbs进行了抗体改向的细胞毒性分析。尽管RAE-1转基因NK细胞的NK1.1-依赖型细胞毒性与野生型B6NK细胞的相同，但NKG2D-依赖型细胞毒性在RAE-1ε转基因NK细胞中削弱（图17b）。

在所述转基因小鼠中，RAE-1ε转基因是由β-肌动蛋白启动子驱动的，因此这些动物的NK细胞能同时表达配体和受体。为了确定野生型（非-转基因）NK细胞在体内是否能通过恒定接触NKG2D配体而失活，通过将野生型Ly5.2同类希B6骨髓移植到致死性-辐射过的RAE-1εB6（Ly5.1）转基因受体内制备骨髓嵌合体。在移植三个月之后，脾脏中NK细胞的数量和NK1.1（图17c），Ly-49D，Ly-49A，Ly-49C/I，Ly-49F/I/C/H和Ly-49G2在Ly5.2BM->RAE-1ε转基因小鼠体内的表达与在Ly5.2BM->野生型B6小鼠体内的表达相似。相反，NKG2D在NK细胞上的表达在Ly-5.2BM->RAE-1ε转基因小鼠体内显著减弱（图17c）。与NK细胞上NKG2D的降低的水平一致，NKG2D-依赖型细胞毒性在Ly-5.2BM->RAE-1ε转基因小鼠体内减弱，这一结果是通过体外抗体改向细胞毒性分析测定的（图17d）。本发明人还研究了RAE-1转基因B6BM细胞在Ly-5.2B6BM->RAE-1εB6转基因受体中是否会被排斥。正如所预料的，野生型Ly5.2B6->野生型B6小鼠体内的NK细胞能有效排斥RAE-1ε转基因BM细胞（图17e）。相反，在Ly-5.2B6BM->RAE-1转基因小鼠体内产生的NK细胞不能排斥RAE-1ε转基因BM细胞（图17）。这些发现表明，NK细胞的NKG2D调节是通过与耐辐射的受体RAE-1表达细胞在体内相互作用引起的，并且由此导致了体内NKG2D功能的减弱。尽管如此，对于实施和使用本发明来说，对所述机制的理解并非是必要的。

为了研究F1杂合阻抗是否受RAE-1ε转基因B6小鼠中NK细胞上的NKG2D含量降低的影响，将转基因小鼠与B/c小鼠杂交，并且检验RAE-1转基因CBF1小鼠排斥亲本B/c BM细胞的能力。与野生型CB6F1小鼠不同，RAE-1ε转基因CB6F1小鼠不会排斥B/c BM细胞（图17f）。另外，用抗-NK1.1mAb或抗-NKG2D mAb处理不会影响RAE-1ε转基因CB6F1受体中B/c BM细胞中的¹²⁵IUdR的掺入。不过，耗尽NK细胞或阻断NKG2D使得可以将B/c骨髓细胞移植到野生型CB6F1受体中。因此，正如本文所证实的，NKG2D作为重要成分参与了F1杂合阻抗。

例7

NKG2D封闭用于预防和治疗类风湿性关节炎

这一结论可以在关节炎的慢性动物模型上验证，其中，可以证实NKG2D存在于发炎部位。这种模型的一个例子是慢性胶原诱导的关节炎（Malfait et al.，Arthritis and Rheumatism 44：1215-1224，2001）。

最近，发现人类类风湿性关节炎患者的外周血和滑液组织中的CD4+CD28-T细胞能表达NKG2D，而发现发炎的滑膜细胞能异常地表达NKG2D的MIC配体（Groh et al.，Proc Natl Acad Sci USA，100：9452-9457，2003）。因此，本发明人认为，本文所披露的用于封闭NKG2D的方法和组合物同样适合预防和治疗类风湿性关节炎。进行了以下实验，以便检验NKG2D封闭对动物模型***，DBA/I小鼠的类风湿性关节炎（RA）发生的影响。

简单地讲，II型胶原（CII）-诱导的关节炎（CIA）是在6-7-周大的雄性DBA/1小鼠体内通过以下方法诱导的，包括在尾巴根部真皮内注射100μg牛II型胶原，其中补充了2.0mg/ml结核杆菌H37RA，正如所公开的，所述杆菌乳化在完全弗氏佐剂中（Seo et al.，Nat Med，10：1088-1094，2004）。用1-4的等级为关节炎评分，每只小鼠的最高得分为16。关节炎临床严重性的分级如下：0，正常；1，轻微肿胀和/或红斑；2，明显的水肿性肿涨；3，明显的水肿性肿涨加上轻微的关节僵硬；或4，无张力（例如，参见，Williams et al.，Proc NatlAcad Sci USA，89：9784-9788，1992）。对每一个肢体进行分级，使得每一只动物的最高临床得分为16。后爪的肿胀是用一对卡钳测量的。

在免疫之后第0，2，4，6和8或第0，3，7和10天用200μg的抗-NKG2D mAb或对照同种型-匹配的mAb IP注射小鼠。本发明人认为，对照IgG处理导致了严重关节炎的出现，关节炎的出现始于免疫之后大约28天（例如，严重性超过10；发病率超过80%，并且爪子厚度超过3.5mm）。相反，预计抗-NKG2D mAb治疗导致了疾病的抑制，这种抑制表现为相对对照mAb-处理的动物而言关节炎严重性的减轻，以及发病率的降低，以及爪子厚度的降低，并且减弱了关节组织病理学程度（例如，严重性小于10，优选小于5，最优选小于2；发病率小于80%，优选小于50%，最优选小于20%；并且，爪子厚度小于3.5mm，优选小于3.0mm，最优选小于2.5mm）。

为了治疗业已确定的CIA，在免疫之后第28，30，32，34和36或第28，31，35和38天对小鼠进行注射。然后在免疫之后第28天将小鼠分成两组，具有相等的平均关节炎得分，并且在免疫之后第28，30，32，34和36天用对照mAb，或抗-NKG2D mAb进行处理。预计只有在抗-NKG2D mAb-处理的组中能够逆转关节炎（例如，降低疾病严重性，发病率，爪子厚度和关节组织病理学程度）。另外，本发明人认为，抗-NKG2D mAb治疗会导致出现在关节炎患者关节中的NKG2D-表达细胞数量的减少，以及滑液中炎性细胞因子（例如，TNF-α，IL-15等）含量的降低。

例8

NKG2D封闭用于预防和治疗乳糜泻

MIC在乳糜泻（CD）患者的肠道上皮细胞表面上能强烈表达，它反过来又通过NKG2D共同激活了上皮内T淋巴细胞（IEL），导致上皮细胞目标的细胞溶解（Meresse et al.，Immunity，21：357-366，2004；和Hue et al.，Immunity，21：367-377，2004）。本发明人认为，本文所披露的用于封闭NKG2D的方法和组合物同样适用于预防和治疗乳糜泻。将在合适的小型动物模型，例如，下列两种结肠炎小鼠模型之一：重度联合免疫缺陷小鼠中的TNB诱导的（Chin等，DigestiveDiseases and Sciences 39：513-525，1994）或T-细胞转移的模型（Powrie et al.，Int Immunol 5：1461 et seq.，1993）中检验NKG2D封闭对炎性肠病（IBD）发生的影响。

本发明涉及以下实施方式：

实施方式1.用于治疗或预防与NKG2D-介导的激活相关的综合征的方法，该方法包括在适合治疗或预防所述综合征的条件下，使表达NKG2D的白细胞与能减弱所述细胞的配体诱导的NKG2D激活的制剂接触。

实施方式2.如实施方式1的方法，其中，所述接触导致了配体诱导的NKG2D激活减弱至少30%。

实施方式3.如实施方式1和2中任意一项的方法，其中，所述制剂减弱了NKG2D与DAP 10的相互作用。

实施方式4.如实施方式1-3中任意一项的方法，其中，所述制剂减少了细胞表面上NKG2D的数量。

实施方式5.如实施方式4的方法，其中，细胞表面NKG2D数量的减少是在以下条件下发生的，其中MICA，MICB，ULBP1，ULBP2，ULBP3，或ULBP4中的一种或多种不能减少细胞表面NKG2D的数量。

实施方式6.如实施方式1-5中任意一项的方法，其中，所述制剂增加了细胞表面NKG2D内在化的比率。

实施方式7.如实施方式6的方法，其中，所述NKG2D内在化比率的增加出现在以下条件下：其中MICA，MICB，ULBP1，ULBP2，ULBP3，或ULBP4中的一种或多种不能增加NKG2D内在化的比率。

实施方式8.如实施方式1-7中任意一项的方法，其中，所述接触通过NKG2D-NKG2D配体复合体减弱了信号传导。

实施方式9.如实施方式1-8中任意一项的方法，其中，所述白细胞选自下列一组：NKG2D+CD8+T细胞，NKG2D+CD4+T细胞，NKG2D+γδT细胞，NKG2D+NK细胞和巨噬细胞。

实施方式10.如实施方式1-9中任意一项的方法，其中，所述接触导致与对照相比表达NKG2D的白细胞的数量减少不到大约10%。

实施方式11.如实施方式1-10中任意一项的方法，其中，所述制剂包括能结合NKG2D或它的NKG2D-结合片段的抗体。

实施方式12.如实施方式11的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。

实施方式13.如实施方式12的方法，其中，所述单克隆抗体是人类抗体，人源化抗体，或嵌合抗体。

实施方式14.如实施方式1-10中任意一项的方法，其中，所述制剂包括能减弱NKG2D-编码核酸的转录或翻译的核酸。

实施方式15.如实施方式1-14中任意一项的方法，其中，所述综合征是I型糖尿病。

实施方式16.如实施方式1-14中任意一项的方法，其中，所述综合征是移植排斥。

实施方式17.如实施方式1-14中任意一项的方法，其中，所述综合征不是I型糖尿病。

实施方式18.如实施方式1-14中任意一项的方法，其中，所述综合征是类风湿性关节炎。

实施方式19.如实施方式1-14中任意一项的方法，其中，所述综合征是乳糜泻。

实施方式20.如实施方式1-14中任意一项的方法，其中，所述综合征是多发性硬化。

实施方式21.如实施方式1-20中任意一项的方法，其中，在受所述综合征影响的器官或组织的细胞中NKG2D配体的表达被提高。

实施方式22.如实施方式1-21中任意一项的方法，其中，所述条件导致浸润受所述综合征影响的器官或组织的淋巴细胞减少。

实施方式23.如实施方式1-22中任意一项的方法，其中，所述条件导致受所述综合征影响的器官或组织中γ干扰素含量的降低。

实施方式24.如实施方式1-23中任意一项的方法，其中，所述制剂减弱了所述白细胞的增殖。

实施方式25.如实施方式1-24中任意一项的方法，其中，所述方法包括治疗被诊断患有所述综合征的人类患者。

实施方式26.一种治疗或预防人类患者中与NKG2D-介导的激活相关的综合征的方法，包括在适合治疗或预防所述综合征的条件下，给人类患者施用有效量的能减弱表达NKG2D的白细胞的配体诱导的NKG2D激活的制剂。

实施方式27.一种试剂盒，包括NKG2D调节剂和有关使白细胞与NKG2D调节剂在适合治疗或预防与白细胞的NKG2D-介导的激活相关的综合征的条件下接触的说明。

实施方式28.一种鉴定NKG2D调节剂的方法，包括：

i）使NKG2D+白细胞与检验试剂接触；和

ii）测定所述白细胞的NKG2D表达。

实施方式29.如实施方式28的方法，其中，测定NKG2D表达包括测定NKG2D、转录、翻译和内在化中的一种或多种。

实施方式30.一种鉴定NKG2D调节剂的方法，包括：

i）使NKG2D+白细胞与检验试剂接触；和

ii）测定所述白细胞的配体诱导的NKG2D激活。

实施方式31.如实施方式30的方法，其中，测定配体诱导的NKG2D激活包括测定DAP 10磷酸化，p85 PI3激酶活性，Akt激酶活性，IFN-γ产量，和NKG2D+靶细胞细胞溶解中的一种或多种。

实施方式32.将能够结合NKG2D并且能够削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增而又不会耗尽所述细胞的抗体或抗体片段制备用来治疗与NKG2D-介导的激活相关的自身免疫疾病的药品的用途。

实施方式33.如实施方式32的用途，其中，所述抗体或抗体片段能增加细胞表面NKG2D内在化的比率。

实施方式34.如实施方式32-33中任意一项的用途，其中，所述抗体是人类抗体或人源化抗体。

实施方式35.如实施方式32-34中任意一项的用途，其中，所述自身免疫疾病是类风湿性关节炎。

实施方式36.如实施方式32-34中任意一项的用途，其中，所述自身免疫疾病是多发性硬化。

实施方式37.如实施方式32-34中任意一项的用途，其中，所述自身免疫疾病不是I型糖尿病。

实施方式38.将能结合NKG2D并且能够削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增而又不会耗尽所述细胞的抗体或抗体片段制备用来治疗移植排斥的药品的用途。

实施方式39.一种鉴定与NKG2D-介导的激活相关的炎性症状的治疗或预防制剂的方法，包括筛选抗体或抗体片段特异性结合NKG2D并且减弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增，而又不会明显耗尽这些细胞的能力。

实施方式40.如实施方式39的方法，其中，进一步筛选所述抗体或抗体片段诱导NKG2D+T细胞或NK细胞表面上的NKG2D内在化的能力。

实施方式41.如实施方式39或40的方法，其中，所述抗体是人类抗体或人源化抗体。

实施方式42.一种鉴定与NKG2D-介导的激活相关的炎性症状的治疗或预防制剂的方法，包括筛选抗体或抗体片段结合NKG2D和诱导细胞表面NKG2D内在化，而又不会明显耗尽这些细胞的能力。

实施方式43.一种减弱患有或者具有出现与NKG2D活性相关的炎性症状的较大风险的哺乳动物宿主中NKG2D+细胞的扩增的方法，包括将对NKG2D特异并且能够削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的扩增，而又不会明显耗尽这些细胞的抗体输送到哺乳动物宿主体内，其条件和用量能有效削弱所述哺乳动物宿主中NKG2D+细胞的增殖。

实施方式44.一种在患有或具有出现与NKG2D活性相关的炎性症状和/或自身免疫疾病的较大风险的宿主的NKG2D-表达细胞中促进NKG2D的细胞内在化的方法，包括给所述宿主输送能特异性结合NKG2D并且能够刺激NKG2D的细胞内在化而又不会通过NKG2D-介导的信号传导途径明显激活的抗体或抗体片段，其条件和用量能促进NKG2D在NKG2D-表达细胞中的细胞内在化。

本文所引用的所有参考文献，包括出版物，专利申请和专利都以相同的程度被收作本文参考。就如同每一份参考文献被分别和专门指明被收作参考一样，并且是以全文形式收作参考的（以法律允许的最大程度）。本文所使用的所有标题和副标题都仅仅是为了方便起见，而不应当被理解成以任何方式限定本发明。本发明包括上述要素以它们的所有可能形式的组合，除非本文中另有说明或者另外通过文本明确限定。

术语"a"和"an"和"the"以及类似的指示代词在本发明说明书中的使用（特别是在以下的权利要求书中的使用）被理解成包括单数和复数，除非本文中另有说明或者通过文本形式明确限定。本文对数值范围的引用仅仅被用作落入该范围内的每一个独立值的简写方式，除非在本文中另有说明，并且每一个独立的值都被收入本说明书中，就如同它们被本文单独地引用。除非另有说明，本文所提供的所有确切的数值是相应的近似值的代表（例如，相对特定因素或测量提供的确切的典型值，同样可以被认为提供了相应的近似测量值，可以用"大约"修饰，如果合适的话）。本文所披露的所有方法都能够以任何合适的顺序实施，除非在本文中另有说明或以其他方式通过文本明确限定。本文所提供的任何和所有例子，或典型语言（例如，"例如"）的使用，仅仅是为了更好地说明本发明，而不构成对本发明范围的限定，除非另有要求，说明书中的语言都不被理解成表明任何非-要求保护的要素是实施本发明所必需的。将专利文献引用并且整合在本文中，仅仅是为了方便，而不体现所述专利文献的任何有效性，可专利性和/或强制性的观点。

在本发明的一个方面或实施方案的说明中，用术语，如"包含"，"具有"，"包括"，或"含有"限定一个具体要素，是为了提供对本发明的一个方面或实施方案的支持，如"由…组成"，"主要由…组成′″，或"实质上包含"这些特定要素，除非另有说明或通过文本明确限定。本发明包括适用法律允许在所附权利要求书中的引用的主题的所有变化形式和等同方案。

Claims (21)

1.选自结合NKG2D的细胞外结构域的抗体和结合NKG2D的细胞外结构域的抗体片段之中的制剂制备用于治疗或预防选自以下的综合征的药物中的用途，所述综合征选自类风湿性关节炎、乳糜泻和炎性肠病，其中所述制剂表现出对人NKG2D的亲和力Kd至少与可溶性NKG2D配体相等，并且其中所述制剂降低NKG2D在白细胞表面上的量，其中所述抗体片段选自Fab抗体片段、F(ab)₂抗体片段、Fv抗体片段、单链Fv抗体片段和dsFv抗体片段。

2.如权利要求1的用途，其中所述制剂导致了配体诱导的NKG2D激活减弱。

3.如权利要求1的用途，其中所述制剂减弱了NKG2D与DAP10的相互作用。

4.如权利要求1的用途，其中，所述制剂增加了细胞表面NKG2D内在化的比率。

5.如权利要求1的用途，其中，细胞表面NKG2D的数量的减少是在以下条件下发生的，其中MICA，MICB，ULBP1，ULBP2，ULBP3，或ULBP4中的一种或多种不能减少细胞表面NKG2D的数量。

6.如权利要求4的用途，其中，所述NKG2D内在化比率的增加出现在以下条件下：其中MICA，MICB，ULBP1，ULBP2，ULBP3，或ULBP4中的一种或多种不能增加NKG2D内在化的比率。

7.如权利要求1的用途，其中，所述制剂降低通过NKG2D-NKG2D配体复合体的信号传导。

8.如权利要求1的用途，其中，所述白细胞选自下列一组：NKG2D+CD8+T细胞、NKG2D+CD4+T细胞、NKG2D+γδT细胞、NKG2D+NK细胞和巨噬细胞。

9.如权利要求1的用途，其中，所述白细胞包含NKG2D+CD8+T细胞。

10.如权利要求1的用途，其中，所述抗体是单克隆抗体。

11.如权利要求10的用途，其中，所述单克隆抗体是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

12.如权利要求1的用途，其中，在受所述综合征影响的器官或组织的细胞中NKG2D配体的表达被提高。

13.如权利要求1的用途，其中，所述制剂导致浸润受所述综合征影响的器官或组织的淋巴细胞减少。

14.如权利要求1的用途，其中，所述制剂导致由CD8+T细胞产生的γ干扰素含量的降低。

15.如权利要求1的用途，其中，所述制剂减弱了所述白细胞的增殖。

16.如权利要求1的用途，其中，所述药物用以治疗被诊断患有所述综合征的人类患者。

17.如权利要求1或16的用途，其中，所述综合征是类风湿性关节炎。

18.如权利要求1或16的用途，其中，所述综合征是乳糜泻。

19.如权利要求1或16的用途，其中，所述综合征是炎性肠病。

20.如权利要求19的用途，其中，所述炎性肠病是克罗恩氏病。

21.如权利要求19的用途，其中，所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。