ES2645026T3 - Anticuerpos de NKG2D para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide o enfermedad de Crohn - Google Patents

Anticuerpos de NKG2D para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide o enfermedad de Crohn Download PDF

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ES2645026T3 ES10183329.1T ES10183329T ES2645026T3 ES 2645026 T3 ES2645026 T3 ES 2645026T3 ES 10183329 T ES10183329 T ES 10183329T ES 2645026 T3 ES2645026 T3 ES 2645026T3
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Abstract

Un agente que es específico para NKG2D y es capaz de alterar la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin empobrecer dichas células, para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide o enfermedad de Crohn, en donde el agente es un anticuerpo o un fragmente de anticuerpo.

Description

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Anticuerpos de NKG2D para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide o enfermedad de Crohn Descripcion
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a composiciones para uso en el tratamiento y / o prevencion de smdromes inflamatorios, en particular mediante alteracion de la expansion y funcion de las celulas T autorreactivas, y cualesquiera caractensticas de la invencion adicionales relacionadas con la misma. Ademas, la presente invencion proporciona composiciones para uso en el rechazo de injertos mediada por las celulas NK.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
NKG2D es un receptor de activacion que se expresa en seres humanos y ratones en celulas NK y ciertos tipos de celulas T. NKG2D reconoce la protema de union a UL16 (ULBP1), ULBp2, ULBP3, ULBP4, y moleculas relacionadas con la cadena de MHC clase I (M ICA y MICB) en seres humanos, y antigeno 60 de histocompatibilidad secundaria (H60), transcripcion inducible temprana de acido retinoico (RAE1), y transcripcion de tipo ULBP de tipo murino 1 (MULT-1) en ratones. Homodfmeros NKG2D asociados a la molecula adaptadora DAP10, que contiene el motivo de union a p85 fosfatidil inositol-3-quinasa de consenso (PI3-K) Tyr-lIe-Asn-Met (YINM, establecido como la SEC ID N°: 9). NKG2D y DAP 10 interaction de manera temprana en su ruta biosintetica y esta interaccion se requiere para el transporte de NKG2D a la superficie de las celulas.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona una gente que es espedfico para NKG2D y es capaz de debilitar la expansion de celulas NKG2D+T o celulas NK sin empobrecer dichas celulas, para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide o enfermedad de Crohn, en el que el agente es un anticuerpo o un fragmente de anticuerpo. Se divulgan metodos y composiciones para uso en el tratamiento o prevencion de un srndrome asociado a activacion mediada por NKG2D.
En un aspecto, los metodos se llevan a cabo poniendo en contacto los leucocitos que expresan NKG2D con un agente que reduce la activacion de NKG2D inducida por ligando de las celulas en condiciones adecuadas para tratar o prevenir el srndrome. En algunas realizaciones, el contacto da como resultado una reduccion de al menos aproximadamente el 30% en una activacion de NKG2D inducida por ligando; en otras realizaciones, la reduccion es al menos aproximadamente el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% con relacion a un control.
El agente puede, sin limitacion, reducir la interaccion de NKG2D con DAP10; reducir la cantidad de NKG2D sobre la superficie de las celulas; incrementar la velocidad a la que NKG2D de superficie se internaliza; reducir la senalizacion a traves del complejo de NKG2D-ligando de NKG2D; y / o reducir la transcripcion o traduccion de los acidos nucleicos que codifican NKG2D. En algunas realizaciones, el agente potencia la internalizacion de los polipeptidos de NKG2D de superficie en condiciones (tales como, por ejemplo, los presentes en los smdromes inflamatorios cronicos) en los que uno o mas de MICA, MICB, UlBp1, ULBP2, ULBP3, o ULBP4 no pueden disminuir la cantidad de NKG2D de superficie celular hasta el grado que sena necesario (en el caso de un agente terapeutico) proporcionar un beneficio terapeutico.
El agente usado en las composicion para su uso de acuerdo con la invencion, comprende un anticuerpo que se une a NKG2D, y el fragmento de union a NKG2D del mismos o un ARNi codificado por una secuencia de AdN que comprende la SEC ID N°:10, SEC ID N°: 11 o SEC ID N°: 12. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimerico.
En la puesta en practica de la invencion, los leucocitos diana pueden ser uno o mas de un NKG2D+ CD8 + celula T, un NKG2D+ cD4 + Celula T, un NKG2D + y§ Celula T; y un NKG2D + Celula NK; o las celulas T diana pueden comprender celulas de macrofagos.
En un aspecto, la invencion puede usarse en un mairnfero como un paciente humano. Al paciente humano se le puede haber diagnosticado que tiene o esta en un riesgo sustancial de desarrollar un srndrome inflamatorio. En un aspecto particular, se trata una afeccion diagnosticada en un paciente humano. La invencion proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide o enfermedad de Crohn.
En otro aspecto particular, la invencion se refiere al uso de un agente seleccionado de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que es espedfico para NKG2D y es capaz de alterar la expansion de NKG2D+ celulas T o celulas NK sin empobrecimiento de tales celulas para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de artritis reumatoide.
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En todavfa otro aspecto ejemplar, la invencion se refiere al uso de un agente seleccionado de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es espedfico para NKG2D y es capaz de alterar la expansion de NKG2D + celulas T o celulas NK sin empobrecimiento de tales celulas para su uso en el tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino seleccionada de enfermedad de Crohn.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es una ilustracion grafica de la expresion de RAE-1 sobre celulas pancreaticas en ratones NOD pre-diabeticos. La Figura 1 (a) muestra ARNm de RAE-1 medido mediante la RT-PCR cuantitativa en tejido pancreatico de ratones NOD y BALB/c de 12 -16 semanas de edad. La Figura 1(b) muestra ARNm de RAE- 1 medido mediante la RT-PCr cuantitativa en tejido pancreatico de ratones NOD y NOD.scid de 4 - 6 semanas y 12 -16 semanas de edad. La Figura 1(c) muestra ARNm de RAE-1 medido mediante la RT-PCR cuantitativa en diferentes tejidos de ratones NOD pre-diabeticos. Los datos representativos se muestran y se expresan como veces de induccion de la transcripcion de RAE-1. Las veces de induccion se calcularon de acuerdo con la formula: Veces de induccion = cantidad de la transcripcion de RAE-1 en el organo de NOD pre-diabetico normalizado hasta HPRT dividido por la cantidad de transcripcion de RAE-1 en el organo de NOD joven normalizado para HPRT. La Figura 1(d) muestra la expresion de RAE-1 sobre celulas pancreaticas CD45-NOD analizada sobre citometna de flujo usando anti-CD45 y anti-RAE-1 mAb. La Figura 1(e) muestra la expresion de RAE-1 sobre celulas de islotes de CD45 aisladas de pancreas (panel superior) y ganglios linfaticos pancreaticos de drenaje (PLN) (panel inferior) en ratones NOD tenidos con anti- CD45 y anti-RAE-1 mAb.
La Figura 2 (a) es una ilustracion grafica de la expresion de NKG2D sobre celulas T CD8 + T. Se aislaron leucocitos de bazo, Idgado, ganglios linfaticos pancreaticos (PLN) y pancreas de ratones NOD de 10 y 25 semanas de edad y se tineron mediante procedimientos convencionales usando anticuerpos monoclonales contra CD8 y NKG2D. Se muestran los porcentajes indicados de celulas T NKG2D + CD8+ (expresados como el porcentaje total de celulas CD8 +). La Figura 2 (b) es una ilustracion grafica de la expresion de CD44 y Ly-6C sobre celulas pancreaticas y T PLN NKG2D + CD8 +. Se tineron las celulas con anticuerpos monoclonales contra CD8, NKG2D, y CD44 o Ly6C y se muestran los resultados para las celulas T CD8 + activadas. La Figura 2 (c es una ilustracion grafica de la expresion de NKG2D y CD44 sobre celulas pancreaticas T CD8 + PLN NRP-V7/H-2Kd tetramero-positivo. Se tineron las celulas con NRP-V7/H-2Kd tetramero y con anticuerpos monoclonales contra cD8 y CD44 o NKG2D. Se muestran los porcentajes indicados de celulas T CD8+ NRP-V7/H-2Kd tetramero-positivo (activadas sobre T CD8+).
La Figura 2(d) muestra micrograffas de celulas T CD8+ + NKG2D+ acumuladas cerca de los islotes. Se tineron secciones congeladas secuenciales de pancreas aisladas de ratones NOD pre-diabeticos de 16 semanas de edad con anti-CD8, anti-C068 (marcador de macrofagos), anti-NKG2D y anticuerpos anti-insulina. Izquierda: imagen diferencial de contraste de fase, Centro: CD8 (rojo), NKG2D (verde), e insulina (azul); Derecha: C068 (rojo), NKG2D (verde), e insulina (azul). Celulas T CD8+ NKG2D+ doble-positivas y macrofagos C068+NKG2D+ son amarillos.
La Figura 3(a) es una ilustracion grafica del efecto de tratamiento con anti- NKG2D mAb de sobre la proporcion de ratones NOD de 7 - 25 semanas de edad que desarrollaron diabetes. Cfrculos oscuros: ratones NOD tratados con anti-NKG2D mAb (n = 7) (dos veces a la semana a 200 pg/raton IP); drculos claros, ratones NOD tratados con PBS no pirogenico esteril (n = 7). Diabetes se diagnostico cuando el nivel de glucosa en sangre era mayor que 300 mg/dl en dos mediciones consecutivas. La Figura 3 45 (b) es una ilustracion grafica de los niveles de glucosa en sangre medidos semanalmente a partir de 6 semanas a 40 semanas de edad en los animales representados en la Figura 3a. La Figura 3(c) es una ilustracion grafica de la proporcion de ratones NOD que desarrollaron diabetes despues del tratamiento con anti-NKG2D mAb en una fase pre-diabetica tardfa. Se trataron ratones NOD con anti-NKG2D mAb (dos veces a la semana a 200 pg/raton IP, drculos oscuros; n = 14) o control lg (drculos claros; n = 14) de 13 semanas a 25 semanas de edad. A las 25 semanas de edad, siete ratones tratados con anti-NKG2D mAb continuaron recibiendo tratamiento hasta las 30 semanas de edad (triangulos oscuros). La Figura 3 (d) es una ilustracion grafica de los niveles de glucosa en sangre medidos semanalmente de 12 semanas a 36 semanas de edad en los animales representados en La Figura 3c.
La Figura 4(a) es una ilustracion grafica del analisis de leucocitos que infiltran el pancreas y ganglios linfaticos pancreaticos de ratones NOD de 11 semanas de edad tratados con control lg (clg) o anti-NKG2D mAb (200 pg/raton IP dos veces a la semana comenzando a las 7 semanas de edad) que se habfan tenido con anti- CD8, anti-NKG2D, y anti-CD44 y se sometieron a citometna de flujo. Los resultados mostrados estan activados sobre celulas T CD8+. La Figura 4(b) representa fotomicrograffas de islotes pancreaticos de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con Ig control de 7 semanas de edad. Se prepararon secciones congeladas de pancreas y se tineron de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con Ig control. Izquierda: tincion DAPI (nucleos); Derecha: CD8 (rojo), NKG2D (verde) e insulina (azul). La Figura 4(c) representa fotomicrograffas de islotes pancreaticos de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con tratamiento anti-NKG2D mAb (200 pg/raton IP dos veces a la semana) de 7 semanas de edad que se prepararon y se tineron como en el panel (b). La Figura 4 (d) es una ilustracion grafica del efecto del tratamiento con anticuerpo anti-NKG2D sobre la acumulacion de celulas T CD8+ autorreactivas NRP-V7/H- 2Kd tetramero positivo en el pancreas. Se aislaron los leucocitos de los pancreas y PLN de ratones NOD de
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18 semanas de edad tratados con anti-NKG2D mAb (200 pg/raton IP dos veces a la semana) o control 5 Ig de 13 semanas de edad. Se muestran los porcentajes indicados de celulas T CD8+ NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo (activadas sobre celulas T CD8+). La Figura 4(e) es una ilustracion grafica de Linfocitos de bazo y sangre periferica en ratones tratados con control lg o con anti-NKG2D (200 pg/raton IP dos veces a la semana tenidos con NRP-V7/H-2Kd tetramero y anti- CD8 mAb. Los porcentajes indicados eran celulas NRP- V7/H-2Kd tetramero positivo (activadas sobre la poblacion de celulas T CD8+). La Figura 4(f) es una ilustracion grafica de celulas de ganglios linfaticos de pancreas aisladas de ratones NOD de 25 semanas de edad tratados con Ig control (clg) o anti- NKG2D (200 pg/raton IP dos veces a la semana) comenzando a las 13 semanas de edad, como se indica, y cultivadas con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (500 ng/ml) y brefeldina A (5 pg/ml) durante 6 hr. Se detecto la IFN- y intracellular en celulas T CD8+ mediante tincion inmunofluorescente y citometna de flujo.
La Figura 5 es una ilustracion grafica de mediciones de citometna de flujo de un experimento de transferencia adoptiva de celulas NOD T en receptores NOD.scid. La Figura 5(a) muestra celulas T CD8+ NKG2D+ en el pancreas, PLN y bazo de ratones NOD.scid transplantados con celulas NOD T. Antes de la transferencia adoptiva, celulas T purificadas de un donante NOD diabetico se tineron con anti-CD8 y anti- NKG2D (a, panel izquierdo inferior). Cinco semanas despues de la transferencia, se recogieron las celulas del pancreas, PLN y bazo se tineron con anti-CD8 y anti-NKG2D (a, paneles superiores) o anti- NKG2D y anti- CD44 (a, paneles inferiores). Se muestran los porcentajes de celulas NKG2D+ T CD8+ (activadas sobre celulas T CD8+). La Figura 5 (b) muestra la acumulacion de celulas autorreactivas NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo T CD8+ en ratones NOD.scid que reciben de manera adoptiva celulas T transferidas de ratones NOD tratados con anti-NKG2D mAb (200 pg/raton IP dos veces a la semana) o Ig control, que comienza en el momento de la transferencia y se analizaron 10 semanas despues de la transferencia. Se detectaron los porcentajes indicados de celulas T CD8+ autorreactivas de NRP- V7/H-2Kd tetramero positivo activadas sobre celulas vivas. La Figura 5(c) muestra la deteccion de NKG2D sobre celulas T de NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo de estos mismos ratones tratados, activadas sobre celulas T CD8+. La Figura 5 (d) es una ilustracion grafica de la proporcion de ratones NOD.scid trasplantados con celulas T de ratones NOD diabeticos que desarrollaron diabetes. Los ratones NOD.scid de cinco semanas de edad que recibieron celulas T transferidas de manera adoptiva de ratones NOD diabeticos se trataron con anti-NKG2D mAb (drculos oscuros; n = 6) Ig control (drculos claros; n = 7) de 5 semanas a 14 semanas de edad. Se inyectaron los ratones por via intraperitoneal con 200 pg de anti- NKG2D mAb CX5, dos veces a la semana. Se diagnostico diabetes cuando el nivel de glucosa en sangre era mayor que 300 mg/dl en dos mediciones consecutivas. La Figura 5 (e) es una ilustracion grafica de la expansion de celulas autorreactivas NRP-V7/H- 2Kd tetramero positivo T CD8+ despues de tratamiento de parada con anti-NKG2D mAb. Cuatro semanas despues se ceso el tratamiento de anti-NKG2D mAb en ratones NOD.scid trasplantados con celulas T de ratones NOD diabeticos, se sacrificaron los animales y se analizaron los pancreas para evaluar la infiltracion de celulas NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo, NKG2D+ T CD8+. Para comparacion, tambien se analizaron los ratones tratados con Ig control que desarrollaron diabetes.
La Figura 6 (a) es una ilustracion grafica de la perdida de expresion de NKG2D sobre celulas T de 8.3 TcR- transgenicos NOD antes de la transferencia adoptiva. Se aislaron de los ganglios linfaticos y bazo de ratones 8.3 TcR- transgenicos NOD. Se purificaron despues las celulas T de 8.3 TcR- transgenicos NOD, mediante aislamiento magnetico de celulas. Antes de la transferencia de celulas T, celulas T de 8.3 TcR-transgenicos NOD se tineron con anti-CD8 y NRP-V7/H-2Kd tetrameros o anti-NKG2D y se analizaron mediante citometna de flujo, como se muestra. La Figura 6 (b) es una ilustracion grafica de la expresion de NKG2D sobre celulas T de 8.3 TcR- transgenicos NOD en el pancreas dos dfas despues de la transferencia adoptiva de celulas T de 8.3 TcR-transgenicos NOD. Dos dfas despues de la transferencia adoptiva de celulas T de 8.3 TcR- transgenicos NOD, se aislaron los leucocitos del pancreas de ratones que se trataron con Ig control o anti- NKG2D mAb CX5 en el momento de la transferencia de celulas. Se tineron las celulas con NRP-V7/H-2Kd tetrameros y anti-NKG2D y se analizaron mediante citometna de flujo. Se muestra la expresion de NKG2D sobre las celulas T transferidas de manera adoptiva (identificada mediante la activacion sobre celulas NRP- V7/H- 2Kd tetramero positivo).
La Figura 6(c) es una ilustracion grafica del efecto de anti-NKG2D mAb CX5 sobre la proliferacion de celulas T CD8+ de 8.3 TcR-transgenicos NOD en el pancreas. Celulas T marcadas con CFSE-45 de 8.3 TcR- transgenicos NOD (1 x107) se transfirieron en ratones NOD de tipo salvaje de 10 semanas de edad (dfa 0). Los ratones NOD receptores se trataron con clg o anti-NKG2D mAb CX5 (200 pg) el dfa -1, dfa 1, y dfa 5. Despues de la transferencia, los ratones NOD receptores se sacrificaron y los leucocitos se aislaron y se analizaron del pancreas, ganglio linfatico pancreatico (PLN), ganglio linfatico mesenterico (MLN). Las celulas mostradas en (c) se activaron sobre Linfocitos viables CD8-positivos. La Figura 6 (d) es una ilustracion grafica de los porcentajes de celulas marcadas con CSFS en los ratones tratados con Ig control (barras abiertas) y anti-NKG2D mAb (barras cerradas) que habfan experimentado una o dos divisiones (es decir, proliferacion de celulas) los dfas 2, 3 y 4 despues de la transferencia, calculado por la siguiente formula: % de celulas de proliferacion = (Total de celulas CFSE+ NRP-V7/H-2Kd tetramero+ CD8+ menos celulas CFSE+ NRP-V7/H-2Kd tetrameroo+ CD8+ que no se dividen) x 100/ Total de celulas CFSE+ NRP-V7/H-2Kd tetramero+ CD8+.
La Figura 7 representa microfotograffas de linfocitos de 8.3 TcR-transgenicos NOD cultivados con 100 nM IGRP (protema relacionada con la subunidad catalttica de glucosa-6-fosfatasa) de peptido durante 3 dfas y despues se desarrollaron en la presencia de 200 U/ml de IL-2 de recombinante humano y 4 ng/mI de IL-7
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durante 5 dfas adicionales celulas T CD8+ activadas de 8.3 TcR- transgenicos se tineron sobre hielo con anti- NKG2D mAb CX5 y se tineron por contraste de fase con toxina b de colera para marcar la membrana de superficie celular. Se incubo una almuota de estas celulas tenidas durante 30 minutos a 37°C y se mantuvo otra almuota sobre hielo. Se analizaron las celulas mediante el uso de un microscopio de fluorescencia. En la microfotograffa, se muestra la expresion de NKG2D como fluorescencia verde y la tincion con fluorescencia roja indica toxina B de colera (membrana). Hay que hacer notar que NKG2d estaba presente sobre la superficie celular de las celulas incubadas sobre hielo pero se modulaba y se internalizaba en las celulas cultivadas a 37°C.
La Figura 8 es una ilustracion grafica del efecto de anti-NKG2D mAb sobre celulas T CD8+ que llevan NKG2D in vivo. Se activaron celulas T CD8+ de TcR transgenicos espedficas de ovoalbumina oT-1 (OVA) con 100 nM de peptido de OVA durante 3 dfas y despues se cultivaron con 200 U/ml de IL-2 humana recombinante y 4 ng/ml de lL-7 durante 5 dfas adicionales. Se expreso NKG2D sobre las celulas T activadas de OT-1 (> 95%), que se marcaron con CFSE y se transfirieron de manera adoptiva (2 x 107 celulas) en ratones C57B/6. Los ratones que recibieron celulas T de CD8+ NKG2D+ OT-1 TcR-transgenicos se trataron con anti-NKG2D mAb o Ig de rata de control a -2, 0, y +2 dfas (200 |jg por inyeccion intraperitoneal). La Figura 8 (a): Cuatro dfas despues de la transferencia, se recogieron muestras de sangre, se tineron con mAbs contra CD8 y NKG2D de raton y se analizaron mediante citometna de flujo.
Se indican los porcentajes de celulas CD8+ marcadas con CSFE. La Figura 8(b): El dfa 21 despues de la transferencia adoptiva de celulas T de OT-1 TcR- transgenicos marcadas con CFSE y tratamiento con lg control o anti-NKG2D mAb CX5 como se ha indicado en (a), se sacrificaron los ratones y se aislaron y se analizaron los esplenocitos mediante citometna de flujo. La Figura 8 (c): El dfa 7 despues de la transferencia adoptiva de las celulas T CD8+NKG2D+ OT-1 marcadas con CFSE, los ratones se inyectaron con un anti- raton CD8 mAb de rata de empobrecimiento (2.43 hibridoma, isotipo IgG2b de rata). Tres dfas despues se tineron celulas de sangre periferica con Ig control, anti-CD8 o anti- NKG2D mAb y se analizaron mediante citometna de flujo. El proposito de este experimento era demostrar que el anticuerpo monoclonal CX5 anti- NKG2D no empobrece las celulas T CD8+ NKG2D+ cuando se administra el anticuerpo in vivo.
La Figura 9 es una ilustracion grafica del efecto de anti-NKG2D mAb sobre la proliferacion de celulas T CD8+ autorreactivas. Celulas T de 8.3 TcR-20 transgenicos NOD se marcaron con CSFE y se transfirieron en ratones NOD de tipo salvaje, que se trataron con Ig control o anti-NKG2D mAb CX5 como se ha descrito en la Fig. 6. Las celulas recogidas del pancreas, ganglios linfaticos pancreaticos, ganglios linfaticos mesentericos y bazo se tineron con NRP-V7/H-2Kd tetramero y anti-CD8 mAb y se analizaron mediante citometna de flujo. Se muestran los histogramas de Linfocitos activados sobre celulas CD8-positivo NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo. Los porcentajes de celulas de proliferacion (mas de una division) y no proliferacion (activadas sobre celulas T CFSE+ CD8+ NRP-V7/H-2Kd tetramero+) se indican en cada histograma. Las celulas tenidas con Ig control emparejada a isotipo o controles para tincion de tetramero demostro la especificidad de union de los reactivos.
La Figura 10 ilustra la especificidad de la tincion para los ligandos de NKG2D sobre las celulas de pancreas de NOD. Figura 10 (a): se aislaron y se tineron celulas de pancreas de NOD con anti-CD45 mAb y con Ig control, un anti-pan RAe-1 mAb (clon 186107), anti-RAE-1 ymAb (clon CX1) o protema de fusion NKG2D-lg de raton (dominio extracelular de NKG2D de raton condensado a IgG1 Fc de tipo humano), seguido de los reactivos de la segunda etapa apropiados para visualizacion. Se analizaron las celulas mediante citometna de flujo y CD45-negativo y yoduro de propidio negativo, se evaluaron las celulas viables. Se tineron las celulas con lg control emparejada a isotipo (clg) demostro la especificidad de union a mAb (lmea delgada). Figura 10 (b): Anti- RAE1 mAbs bloquearon la tincion de anti-RAE-1 mAbs marcados con biotina, que demuestra la especificidad de union. Se incubaron previamente celulas de pancreas con 0,25 jg de clg, anti-pan RAE-1 mAb purificado 186107 o clon CX1 anti- RAE-1 y mAb ( que tambien reacciona de manera cruzada con RAE-1 a y RAE-1 p). Despues de 20 min de incubacion sobre hielo, estas celulas se tineron despues durante 20 min adicionales con 0,25 jg de Ig control biotinilada, clon 186107 anti-RAE-1 mAb biotinilado, clon CX1 anti-RAE-1Y mAb biotinilado y anti-CD45 mAb conjugado a FITC. Para detectar las celulas mAbs biotiniladas, se lavaron las celulas y se incubaron con estreptavidina conjugada a PE. Se analizaron las celulas mediante citometna de flujo y los datos mostrados se activan sobre celulas CD45- negativo, yoduro de propidio -negativo, viables. De este modo, se detectan los ligandos de NKG2D sobre las celulas de pancreas de NOD usando tres reactivos independientes: clon 186107 anti-RAE-1 mAb, clon CX1 anti-RAE-1 mAb , y una protema de fusion NKG2D-lg. La tincion Anti-RAE-1 mAb es espedfica porque la tincion de anti- RAE1 biotinilado se bloquea completamente mediante anti-RAE-1 mAbs purificados, pero no una IgG de control de rata.
La Figura 11 (a) muestra la secuencia de ADNc (SEC ID N°: 1) de NKG2D murino. La Figura 11 (b) muestra la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°: 2) de NKG2D murino. La Figura 11 (c) muestra la secuencia de ADNc (SEC ID N°: 3) de NKg2d humano. La Figura 11 (d) muestra la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:4) de NKG2D humano.
La Figura 12 es una representacion grafica de de un analisis de citometna de flujo de celulas de NKL (una lmea celular de leucemia NK numana) que se ha incubado con un anticuerpo anti-humano NKG2D de raton (clon 149810) durante 16 h para estimular la internalizacion de NKG2D (panel derecho). El panel izquierdo muestra las celulas que se han incubado con un anticuerpo control durante 16 h. en cada caso, lasd celulas se lavaron brevemente en un tampon acido (pH 3,5) para eliminar cualquier anticuerpo residual unido y
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despues se tino con Ig control o anti-NKG2D mAb, seguido de anticuerpo IgG anti-raton de cabra conjugado a ficoeritrina. El experimento muestra que el anticuerpo monoclonal anti-humano NKG2D monoclonal indujo la internalizacion (modulacion) de NKG2D, mientras que la incubacion con la Ig control no provoco la internalizacion ded NKG2D.
La Figura 13 muestra que la RAE-1 se expresa sobre celulas B/c BM pero no sobre celulas B6 BM. Figura 13(a): Se tineron celulas recientemente aisladas de BM con una protema de fusion NKG2D-humana Ig Fc humana (NKG2D Ig) o Ig control humana Ig (clg). Para detector la union de NKG2D-lg, se uso un anticuerpo de IgG anti-humano conjugado a PE (anti-humano Ig PE) como un segundo anticuerpo de etapa. La lmea de puntos representa una tincion de clg sobre celulas BM. La lmea gruesa muestra la expresion del ligando NKG2D sobre celulas BM. Figura 13(b):se tineron las celulas BM con anti-pan RAE-1 mAb biotinilado, anti- H60 mAb biotinilado, anti-MULT1 mAb biotinilado o un clg emparejado a isotipo biotinilado, y despues se tineron con estreptavidina conjugada a PE. La lmea de puntos muestra la tincion de clg ya la lmea gruesa muestra la expresion de RAE-1, H60 y MULT1 sobre las celulas BM. Figura 13 (c y d): los receptores de CB6F1 se trataron con anti-NK1.1 mAb el dfa -2. El dfa 0, se irradiaron los receptores (11 Gy) y despues se reconstituyeron con celulas B/c o CB6F1 BM (4 x 10 6). El dfa 7, celulas del bazo del receptor se aislaron y se analizaron como se ha descrito para los paneles a y b. La lmea de puntos representa la tincion de clg sobre celulas BM. La lmea gruesa muestra la expresion de ligandos de NKG2D, RAE-1, H60 y MULT1 sobre celulas BM. Los numeros representan la fluorescencia media (unidades lineales arbitrarias) de las celulas tenidas. Figura 13 (e y f): ilustra de manera grafica ese fenotipo de las celulas que expresan RAE-1. Se transfirieron las celulas BM en receptores irradiados tratados previamente con anti-NK1.1 mAb. Se aislaron las celulas y se tineron como se ha descrito para el panel c. La Figura 13(g): ilustra que la proliferacion de celulas expresa RAE- 1. Se transfirieron celulas B/c Bm en ratones irradiados CB6F1 que se habfan tratado previamente con anti-NK1.1 mAb. Seis dfas despues de la transferencia, BrdU (0,8 mg/ raton) se inyecto en ratones. Dos o 12 horas despues, se recogieron celulas de bazo de receptores y se tineron con anti- pan- RAE-1 mAb y anti-BrdU. La Figura 13(h y 1): 1lustra que RAE-1 se expresa sobre la progenie de BM tratados con 5-FU. Celulas BM de ratones B/c tratados con 5-fluorouracilo se transfirieron en ratones CB6F1 irradiados que se trataron previamente con anti-NK1.1 mAb. Ocho dfas despues de la transferencia, se aislaron las celulas y se analizaron como se ha descrito para los paneles c y e. La Figura 13 (i): muestra la tincion de c-kit y Sca-1 de celulas activadas positivas de RAE-1. En los paneles e - i, > 98% de las celulas tenidas con clg estaban en el cuadrante inferior izquierdo (no mostrado). Se muestra el porcentaje de celulas en cada uno de los dos cuadrantes superiores. Estos resultados eran reproducibles en al menos dos experimentos independientes (datos representativos no mostrados).
La Figura 14 (a): ilustra que Anti-NKG2D mAb bloquea el rechazo de B/c BM en ratones Imbridos CB6F1. Aproximadamente 4x106 de celulas BM se transfirieron en receptores CB6F1 irradiados. Los ratones receptores se inyectaron con 125IUdR el dfa 5, y se recogieron los bazos y se contaron el dfa 6. Las barras negras muestran la captacion de 125IUdR de los bazos en ratones B/c Bm -> CB6F1 y las barras blancas muestran la captacion de radiomarca en receptores CB6F1 BM -> CB6F1. Se trataron los receptores con anti- NKG2D mAb neutralizante no empobrecido o el anti-NK1.1 mAb no empobrecido de las las celulas NK (200 pg/raton el dfa -2), como se ha indicado. Los resultados se muestran como la media ± D. E cpm (5 ratones por grupo). Se realizo el experimento dos veces con resultados comparables. La Figura 14 (b): ilustra de manera grafica el fenotipo de celulas donantes de B/c que repoblaron receptores irradiados de CB6F1 tratados con anti-NKG2D mAb o Ig control. Se trataron los ratones como se ha descrito en el panel a, con los esplenocitos recogidos el dfa 8 despues del transplante, se tineron globulos blancos y se presentaron los datos como se ha descrito en la Figura 13.
La Figura 15 ilustra el rechazo de celulas BM singenicas que expresan RAE-1. La Figura 15(a) muestra la expresion de RAE-1 £ sobre celulas de medula osea en ratones transgenicos B6 RAE-1 E. Medula osea recientemente aislada de ratones B6 y B6 RAE-1 £ transgenicos se tineron con clg o anti-pan-RAE-1 mAb. La Figura 15(b) ilustra que las celulas NK B6matan celulas de BM transgenicos RAE-1 £ singenicas in vitro. Las celulas de BM recientemente aisladas de ratones B6 de tipo salvaje B6 y RAE-1 £ transgenicos se usaron como dianas en un ensayo de citotoxicidad in vitro usando celulas NK de tipo salvaje activadas por IL-2 (Celulas NK B6 cultivadas durante 7 dfas en 2000 U/ml de IL-2 recombinante humana del Almacen Pre- Clmico de de la Rama de Fuentes Biologicas del Instituto de Cancer Institute Nacional) como efectores, en la presencia de clg o anti-NKG2D mAb (clon 191004) usados a 10 pg/ml. La Figura 15(c) ilustra que los ratones B6 rechazan la medula osea singenica que expresa RAE-1- £. Aproximadamente 4x106 de celulas RAE-1 £ de B6 BM transgenicos se transfirieron en receptores B6 irradiados. Los ratones receptores se inyectaron con 125IUdR el dfa 5, y se recogieron los bazos y se contaron el dfa 6Las barras negras muestran la captacion de 125IUdR de bazos en ratones RAE-1 £ transgenicos BM -> B6 y las barras blancas muestran la captacion de radiomarca en receptores de tipo salvaje B6 BM -> B6. Se trataron los ratones con el anti-NKG2D mAb neutralizante no empobrecido o el anti- NK1.1 mAb empobrecido de las celulas (200 pg/raton el dfa -2), como se ha indicado. Los resultados se muestran como la media ± D. E cpm (5 ratones por grupo). El experimento se realizo dos veces con resultados comparables. La Figura 15(d) ilustra que los ratones CB6F1 rechazan la medula osea singenica que expresa RAE-1 £. Aproximadamente 4 x106 celulas de RAE-1 £ transgenicos CB6F1 BM se transfirieron en receptores CB6F1 irradiados. Se inyectaron los ratones con 125IUdR el dfa 5, y se recogieron los bazos y se contaron el dfa 6. Las barras negras muestran la captacion de 125IUdR de bazos en ratones RAE-1 £ transgenicos CB6F1 BM -> CB6F1 y las barras blancas muestran la captacion de la
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radiomarca en los receptores CB6F1 BM -> CB6F1 de tipo salvaje. Se trataron los ratones y los datos se muestran en como se ha descrito en el panel c.
La Figura 16(a) ilustra que los ratones DAP 10-1 rechazan de manera ineficaz la medula osea singenica que expresa RAE-1£. Aproximadamente 4 x 106 de celulas de B6 BM RAE-1 £ transgenicos se transfirieron en receptores irradiados. Los ratones se inyectaron con 125IUdR el dfa 5 y se recogieron y se contaron los bazos el dfa 6. Las barras negras muestran la captacion de 125IUdR de bazos en ratones B6 BM -> RAE-1£ transgenicos B6 de tipo salvaje y las barras blancas muestran la captacion de radiomarca en receptores RAE- 1 £ transgenicos B6 BM -> DAP10-/- B6. Se trataron los ratones con el anti- NKG2D mAb neutralizante no o el anti-NK1.1 mAb empobrecido de celulas NK (200 pg/raton el dfa -2), como se ha indicado. Los resultados son la media ± D. E cpm (5 ratones por grupo). La Figura 16(b) ilustra que los ratones DAP12-/- (Bakker et al., Immunity, 13: 345-353, 2000) rechazan la medula osea singenica que expresa RAE-1 £. Aproximadamente 4x106 'de celulas de RAE-1 £ transgenicos B6 BM se transfirieron en receptores irradiados. Los ratones se inyectaron con 1251DdR el dfa 5 y se recogieron y se contaron los bazos el dfa 6. Las barras negras muestran que la captacion de 1251DdR de bazos en ratones RAE-1 £ transgenicos B6 BM - > B6 de tipo salvaje y las barras blancas muestran la captacion de radiomarca en receptores RAE-1 £ transgenicos B6 BM -> DAP12-1- B6. Se trataron los ratones y los resultados se muestran como se describe en el panel a.
La Figura 17 (a) ilustra la modulacion de NKG2D sobre celulas NK en ratones B6 RAE-1 £ transgenicos. Se tineron esplenocitos de ratones de tipo salvaje y B6 RAE-1 £ transgenicos con anti-pan-RAE-1 mAb (paneles de la izquierda) o anti-NKG2D y anti-NK1.1 mAb (paneles de la derecha). Se analizo la expresion de RAE-1 sobre celulas de bazo, y se analizo la expersion de NKG2D mediante la activacion sobre celulas NK1.1 +. Las lmeas delgadas muestran las celulas tenidas con clg, mientras las lmeas gruesas muestran la tincion espedfica de RAE-1 o NKG2D. Los numeros representan la fluorescencia media (unidades lineales arbitrarias) de las celulas tenidas. La Figura 17(b) muestra de manera grafica que la citotoxicidad dependiente de NKG2D esta alterada en celulas de RAE-1 £ transgenicos (Tg) nK. Se prepararon celulas NK enriquecidas de los bazos de ratones de tipo salvaje o RAE-1E Tg B6 a los que se les inyecto por via IP polil:C (100 pg/ raton) un dfa antes de la recogida. Se realizaron ensayos de destruccion redirigida dependiente de anticuerpo monoclonal contra celulas diana 721.221 transfectadas en C032 como se ha descrito (Lanier et al., J Immunol, 141 : 3478 - 3485, 1998) mediante el uso de Ig control (clg), anti-NKG2D, o anti-NK1.1 mAbs. La Figura 17(c): ilustra la modulacion de NKG2D sobre celulas NK de tipo salvaje que se desarrollan en huespedes RAE-1 £ transgenicos. Celulas Ly 5.2 B6 BM (1 x107/raton) se transfirieron en ratones (WT) o RAE-1 £ Tg B6. Tres meses despues del transplante, se analizo el nivel de expresion de NKG2D (paneles de la izquierda) y NK1.1 (paneles de la derecha) sobre celulas NK esplenicas (activadas sobre C03-, linfocitos NK1.1 +). Las lmeas delgadas muestran las celulas tenidas con clg, mientras que las lmeas gruesas muestran la tincion espedfica de RAE-1 o NKG2D. Los numeros representan la fluorescencia media (unidades lineales arbitrarias) de las celulas tenidas. La Figura 17 (d) muestra de manera grafica la citotoxicidad dependiente de NKG2D de celulas NK en ratones Ly5.2 B6 BM -> RAE-1 Tg quimericos. Se prepararon celulas NK enriquecidas de los bazos de Ly5.2 B6 BM -> RAE-1 Tg y ratones Ly5.2 B6 BM -> B6 inyectados por via IP -con polyl:C (100 pg7raton) un dfa antes de la recogida. Se realizaron ensayos de citotoxicidad redirigida dependiente de mAb como se ha descrito en el panel b. La Figura 17(e) ilustra que las celulas NK de tipo salvaje que se desarrollan en ratones RAE-1 Tg demuestran el rechazo de medula osea dependiente de NKG2D. Las barras de color negro muestran la captacion de 125IUdR en bazos de celulas RAE-1 + Tg BM -> ratones quimericos (Ly5.2 B6 BM-> B6 de tipo salvaje), y las barras blancas muestran la captacion de la radiomarca en bazos de celulas RAE-1 +Tg bM -> ratones quimericos (ratones quimericos Ly5.2 B6 BM-> RAE-1 Tg). La Figura 17 (f) ilustra que la resistencia dbrida en ratones RAE-1 £ transgenicos CB6F1 esta alterada. Se transfirieron aproximadamente 4x106 de celulas B/c BM en receptores irradiados. Los ratones receptores se inyectaron con 125IUdR el dfa 5 y se recogieron y se contaron los bazos el dfa 6. Las barras de color negro muestran la captacion de 125IUdR de bazos en ratones B/c BM -> tipo salvaje CB6F1, las barras de color blanco muestran la captacion de radiomarca en receptores B/c BM -> RAE-1 £ transgenicos CB6F1, y las barras de color gris muestran los ratones CB6F1 BM ->CB6F1. Se trataron los ratones con el anti-NKG2D mAb no empobrecido, neutralizante o el anti-NK1.1 mAb que empobrece las celulas NK (200 pg/raton el dfa -2), como se ha indicado. Los resultados se muestran como la media ± D. E cpm (5 ratones por grupo). El experimento se realizo dos veces con resultados comparables.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invencion se basa, en parte, en el sorprendente hallazgo de la modulacion de NKG2D, un receptor de activacion sobre celulas T CD8+, celulas NK, y ciertas celulas T CD4+ activadas, es un medio eficaz para la prevencion y / o tratamiento de smdromes autoinmunes e inflamatorios. En un aspecto, los presentes inventores han descubierto agentes y procedimientos para estimular la internalizacion de NKG2D y han identificados tales agentes como modalidades terapeuticas utiles para tratar los smdromes asociados a la activacion de NKG2D. Los agentes son particularmente utiles en afecciones (tales como las que se cree que estan presentes, por ejemplo, en smdromes inflamatorios cronicos) en las que los ligandos naturales solubles NKG2D no son capaces de estimular la internalizacion. Se divulga cualquier medio para reducir la expresion funcional de NKG2D con el fin de tratar tales smdromes inflamatorios. En algunas realizaciones, las composiciones de la invencion afectan solamente al
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subconjunto de leucocitos que dependen de su activacion principalmente sobre NKG2D. Se divulgan
procedimientos y composiciones eficaces para uso en el tratamiento o prevencion de un smdrome asociado a la activacion mediada por NKG2D de leucocitos. Los usos se llevan a cabo poniendo en contacto los leucocitos que expresan NKG2D con un agente que reduce la activacion mediada por NKG2D de las celulas en condiciones adecuadas para la prevencion o tratamiento del smdrome. El contacto se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado, que incluye la administracion del agente o una composicion que comprende el agente a un paciente, o huesped que comprende las celulas activadas por la ruta (s) de NKG2D en condiciones que permiten la administracion del agente a las celulas en el paciente o huesped. La activacion de NKG2D se puede reducir de acuerdo con la invencion mediante uno o mas de: (i) empobrecer la superficie celular de las moleculas de NKG2D que existen previamente sobre la superficie; (ii) interferir con la interaccion funcional entre NKG2D y DAP10 o de otra manera bloquear la funcion de senalizacion de NKG2D; y (iii) evitar que las moleculas NKG2D alcancen la superficie, incluyendo la interferencia con la produccion de NKG2D a un nivel de transcripcion, de traduccion, o despues de la traduccion. En algunas realizaciones, la invencion abarca la reduccion de las moleculas de NKG2D de la superficie celular preexistentes mediante la estimulacion de su internalizacion sin que provoque de manera simultanea la activacion de que activana las funciones efectoras de leucocitos que llevan NKG2D.
Los terminos "NKG2D," "NKG2-D," "D12S2489E," "KLRK1 ," y "subfamilia K del receptor de tipo pectina de celulas destructoras, miembro 1," como se usa en el presente documento se refiere a un gen receptor que activa las celulas destructoras, ADNc (por ejemplo, Homo sapiens - N° de acceso del GENBANK NM_007360), y su producto genico, asf como sus homologos de mairnferos, que incluye productos de tipo salvaje y mutantes. Un NKG2D humano que codifica la region se establece como SEC ID N°:3, y una secuencia de protema NKG2D humana se establece como la SEC ID N°:4. Los homologos de mai^eras de NKG2D incluyen but pero no se limitan a NKG2D de raton (por ejemplo, Mus musculus - N° de acceso del GENBANK NM_033078), NKG2D de rata (por ejemplo, Rattus norvegicus - N° de acceso del GENBANK NM_133512), NKG2D de cerdo (por ejemplo, Sus scrofa - N° de acceso del GENBANK AF285448), monkey NKG2D de mono (por ejemplo, Macaca mulatta - N° de acceso del GENBANK AJ554302), y NKG2D de orangutan (por ejemplo, Pongo pygmaeus - N° de acceso del GENBANK AF470403). Los agentes que modulan NKG2D de la presente invencion comprenden un anticuerpo que se une a NKG2D, un fragmento de union de NKG2D -del mismo, o un ARNi codificado por una secuencia de ADn que comprende la SEC ID N°: 10, SEC ID N°: 11 o SEC ID N°: 12.
Salvo que se establezca de otra manera, los usos de acuerdo con la invencion se pueden poner en practica en el contexto de tratamiento (por ejemplo, reducir los smtomas asociados a y / o afecciones subyacentes que se consideran causantes de una afeccion o bien en terminos de tiempo para que tales afecciones / smtomas existan, la extension de tales afecciones / smtomas, gravedad de tales afecciones / smtomas etc.) o prevencion (por ejemplo, reduccion de la probabilidad ded desarrollo de la aparicion subyacente, retraso de la gravedad de la aparicion posterior, reduccion de la gravedad despues de la aparicion, etc.) cualquier tipo de afeccion inflamatoria asociada a la actividad de NKG2D, tal como enfermedad autoinmune inflamatoria asociada a la actividad de NKG2D. Sin embargo, se reconocera que tales afecciones pueden variar de manera significativa de manera que los procedimientos para tratar diversas condiciones tambien se pueden considerar como aspectos unicos de la invencion.
I. Agentes de modulacion de NKG2D
A menos que se indique lo contrario o este implfcito claramente en el contexto, puede usarse cualquier agente que reduzca la activacion celular mediada por NKG2D. Ejemplos no limitativos de tales agentes incluyen ligando de NKG2D, o un fragmento de union a NKG2D, variante, o derivado del mismo; un anticuerpo, o un fragmento, variante o derivado del mismo (como, por ejemplo un anticuerpo de union a NKG2D); un acido nucleico (o variante o derivado del mismo), o una molecula pequena, que inhibe la produccion de NKG2D o DAP 10 en una celula; peptidos o moleculas pequenas que interfieren con la formacion o funcion del complejo NKG2D-DAP10; moleculas pequenas que alteran la transduccion de la senal de NKG2D, y combinaciones de cualquiera de los anteriores. Ligandos de NKG2D ejemplares pueden encontrarse, por ejemplo, en la Patente U.S. N° 6.653.447; Carayannopoulos et al., J Immunol, 169(8):4079-83, 2002; Carayannopoulos et al., Eur J Immunol, 32(3):597-605, 2002; Sutherland et al., J Immunol, 168(2):671-9, 2002; Sutherland et al., Immunol Rev, 181:185-92, 2001; y Cosman et al., Immunity, 14(2):123-33, 2001). Se divulgan agentes que ponen en contacto las celulas que expresan NKG2D desde el exterior y reducen la activacion de celulas que llevan NKG2D -cuando se exponen de manera posterior a celulas que llevan ligando NKG2D o ligandos NKG2D recombinantes. Cualquier indicador de esta activacion se puede controlar, que incluyen, sin limitacion, estimulacion de la fosforilacion de DAP10, estimulacion de la p85 PI3 quinasa, activacion de Akt, produccion dependiente de NKG2D -de interferon gamma (1 FN-y) u otras citoquinas o quimioquinas, destruccion dependiente de NKG2D -de las celulas T diana que llevan ligando de NKG2D, y similares. Un medio de determinar el nivel de activacion de NKG2D es mediante la medicion de la destruccion de celulas NK humanas de celulas diana que llevan ligando de NKG2D (vease, por ejemplo, Ejemplo 1 mas adelante). En algunas realizaciones, los agentes de modulacion de NKG2D utiles son los que provocan al menos aproximadamente el 20% de reduccion de activacion de NKG2D inducida por el ligando de NKG2D en un sistema modelo tal como se describe en el Ejemplo 1; en otras realizaciones, el agente da como resultado al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o mas reduccion en la activacion de NKG2D inducida por ligando. Por
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ejemplo, la activacion inducida por el ligando de NKG2D se puede reducir en al menos aproximadamente el 30% en presencia del agente cuando se compara con un control. El control puede ser, por ejemplo, la activacion de NKG2D en la ausencia del agente pero en condiciones sustancialmente identicas en bien (a) un individuo, (b) una poblacion de organismos sustancialmente similares, usando un valor medio como control, o (c) ambos. Otro medio de determinar el nivel de la activacion de NKG2D es mediante la produccion de IFN-y en la presencia o ausencia de un ligando de NKG2D tal como MICA o ULBP. Se puede usar cualquier procedimiento para la medicion de la produccion de IFN-y, incluyendo, sin limitacion, inmunoensayos u otros ensayos que miden la protema IFN-y; bioensayos que miden la actividad de IFN-y, y similares. En algunas realizaciones de la invencion, los agentes de modulacion de NKG2D utiles son los que provocan al menos aproximadamente el 20% de reduccion de la produccion de IFN-y mediada por NKG2D; en otras realizaciones, el agente da como resultado al menos aproximadamente el 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o mas reduccion en la produccion de IFN-y mediada por NKG2D.
En una serie de realizaciones, los agentes de modulacion de NKG2D de acuerdo con la invencion estimulan la internalizacion celular de NKG2D. La internalizacion se puede determinar mediante cualquier medio adecuado, tal comos, por ejemplo, mediante citometna de flujo (vease, por ejemplo, el Ejemplo 2 mas adelante); microscopfa de inmunofluorescencia (incluyendo, el control de la internalizacion de un anticuerpo mediante microscopfa confocal); ensayos de union que detectan NKG2D de superficie celular, y similares. En algunas realizaciones de la invencion, los agentes de modulacion de NKG2D utiles son los que provocan al menos aproximadamente el 10% de reduccion en el nivel de la superficie celular de NKG2D o un 10% de incremento en na velocidad de desaparicion de NKG2D de la superficie celular, cuando se compara con el control cuando se ensaya en un sistema modelo tal como se describe en el Ejemplo 2; en otras realizaciones, el agente da como resultado al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o >99% reduccion en el nivel de superficie celular o al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de incremento en la velocidad de desaparicion de NKG2D.
Preferiblemente, los agentes que modulan NKG2D de acuerdo con la invencion no dan como resultado una histolisis significativa o empobrecimiento de las celulas que expresan NKG2D, incluyendo, por ejemplo, una o mas de celulas T CD8+, celulas T CD4+, y celulas T Yp-TcR+, y celulas NK CD56/16+. La capacidad de un agente para destruir las celulas que expresan NKG2D se puede determinar usando cualquier medio apropiado, tal como, por ejemplo, mediante deteccion de celulas muertas por citometna de flujo o microscopfa usando tincion por annexina V o yoduro de propidio, incorporacion de azul Trypan, ensayo de europio o ensayo de liberacion de cromo. En algunas realizaciones de la invencion, los agentes de modulacion de NKG2D utiles son los que muestran un beneficio terapeutico detectable en condiciones que conservan la viabilidad al menos aproximadamente el 90% de las celulas que expresan NKG2D. En otras realizaciones, el agente provoca menos de aproximadamente el 5%, 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, u 80% de reduccion en el numero de celulas que expresan NKG2D.
La siguiente tabla contiene los ejemplos no limitantes de las caractensticas de los agentes de modulacion de NKG2D de acuerdo con la invencion.
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Tabla 1. Caracteristicas de los Agentes de modulacion de NKG2D
Estimulacion de la
Activacion de NKG2D Empobrecimiento de celulas
internalizacion de NKG2D
que expresan NKG2D
(% de reduccion en los niveles de superficie de NKG2D o incremento en la velocidad de desaparicion con relacion al control)
(% de reduccion la activacion de celulas que llevan NKG2D despues de la exposicion a celulas que llevan el ligando NKG2D) (% de reduccion en celulas que expresan NKG2D con relacion al control)
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Se divulga la incapacidad de de los ligandos solubles naturales de NKG2D (tal como, por ejemplo, MICA o ULBP) para estimular la internalizacion de NKG2D en pacientes que padecen de inflamacion cronica de una manera similar a la internalizacion que se pudiera producir en individuos que no padecen inflamacion cronica; sin tener en cuenta estrictamente la teona, se cree que este fenomeno se produce en parte a partir como consecuencias de altos niveles de citoquinas que acompanan estados inflamatorios cronicos. (Este fenomeno se puede documentar mediante la comparacion de los niveles de NKG2D en celulas T o celulas NK en pacientes que padecen de inflamacion cronica y en pacientes sanos; niveles similares de NKG2D en los dos grupos, no obstante el hecho que la inflamacion cronica este acompanada de altos niveles circulantes de ligandos de NKG2D, reflejan un defecto en NKG2D internalizacion). Se divulgan ademas agentes que estimulan la internalizacion de NKG2D en condiciones en las que los ligandos de NKG2D naturales solubles no senan eficaces o senan menos eficaces de esta manera, asf como el uso de tales agentes en los diversos procedimientos de la invencion proporcionados en el presente
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documento. Cualquier sistema de modelo adecuado para examinar este efecto se puede usar para demostrar que los agentes particulares comprenden o muestran tales caractensticas, por ejemplo comparando el efecto sobre la internalizacion de NKG2D de un ligando natural soluble y un agente de modulacion de acuerdo con la invencion, en condiciones en las que las celulas que expresan NKG2D se exponen a citoquinas (incluyendo, sin limitacion, interleuquina-2, interleuquina-15, factor de necrosis tumoral, o las combinaciones de los anteriores) en condiciones adecuadas para contrarrestar el efecto de los ligandos naturales solubles sobre la internalizacion. En algunas realizaciones, los agentes de modulacion de NKG2D de la invencion pueden provocar una reduccion en los niveles de NKG2D de superficie que es al menos el 10% mayor que la reduccion de los niveles de NKG2D de superficie provocados por un ligando natural soluble de NKG2D, cuando se mide la internalizacion en condiciones (tal como, por ejemplo, en la presencia de uno o mas citoquinas) que interfieren con la capacidad del ligando natural soluble para que medie la internalizacion. En otras realizaciones, los agentes de modulacion de NKG2D son al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o >99% mas eficaz que un ligando natural soluble de NKG2D en la mediacion de la internalizacion de NKG2D.
A. Anticuerpos
La presente invencion abarca el uso de cualesquiera anticuerpos que se pueden usar para disminuir la activacion mediada por NKG2D, tal como, por ejemplo, los que estimulan la internalizacion de NKG2D sin activacion significativa mediante las rutas de senalizacion mediadas por NKG2D. Los ejemplos no limitantes de tales anticuerpos incluyen anticuerpos dirigidos contra cualquier epftopo extracelular o intramembrana de NKG2D; anticuerpos dirigidos contra cualquier epftopo extracelular o intramembrana de DAP 10; y anticuerpos dirigidos contra un ligandp soluble de NKG2D o un complejo de ligando NKG2D-NKG2D. Tambien se abarcan anticuerpos biespedficos, es decir anticuerpos en los que cada uno de los dos dominios reconoce un epftopo de union diferente. La secuencia de aminoacidos de NKG2D se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 6.262.244, se describen la secuencia de aminoacidos de DAP10 en Wu et al., Science 285: 730, 1999, y la secuencia de aminoacidos de polipeptidos MICA y MICB, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 2003/0165835.
En general, la unidad de anticuerpo basico estructural se sabe que comprende un tetramero. Cada tetramero incluye dos pares identicos de cadenas de polipeptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50 - 70 kDa). La parte amino terminal de cada cadena puede incluir una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos principalmente responsable del reconocimiento de antfgeno. La parte carboxi-terminal de cada cadena puede definir una region constante principalmente responsable de la funcion efectora.
De manera tfpica, las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Ademas, las cadenas pesadas humanas se clasifican de manera tfpica como mu, delta, gamma, alfa, o epsilon, y definen el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante se unen con una region "J" de aproximadamente 12 o mas aminoacidos, incluyendo tambien la cadena pesada una region "D" de aproximadamente mas de 10 aminoacidos. Vease en general, Fundamental lmmunology, Ch. 7 (Paul, ed., 2a ed. Raven Press, NY, 1989).
Las regiones variables de cada par de par de cadena ligera / pesada de manera tfpica forman el sitio de union de anticuerpo. De este modo, en general, un anticuerpo IgG intacto tiene dos sitios de union. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o bispecincos, los dos sitios de union, en general, los mismos. Normalmente, todas las cadenas muestran la misma estructura general de las regiones de marco conservadas relativamente (FR) unidos mediante tres regiones hipervariables, que tambien se llaman regiones determinantes complementarias o CDRs Las CDRs de las cadenas pesada y ligera de cada par estan usualmente en alineacion con las regiones de marco conservadas, permitiendo la union a un epftopo espedfico. En general, del N-terminal a C- terminal, tanto las cadenas ligera como pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La determinacion de aminoacidos para cada dominio esta, en general, de acuerdo con las definiciones de las Secuencias de Protemas de Interes inmunologico, Kabat et al., National Institutes of Health, Bethesda, MO, 5a ed., NIH Publ. No. 91 - 3242, 1991; Kabat, Adv Prot Chem, 32:1 - 75, 1978; Kabat et al., J Biol Chem, 252: 6609 - 6616, 1977; Chothia et al., J Mol Biol, 196:901 - 917, 1987; y Chothia et al., Nature, 342: 878 - 883, 1989.
Los anticuerpos para su uso de acuerdo con la presente invencion pueden abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos biespedficos, fragmentos de anticuerpos Fab, fragmentos de anticuerpos F(ab)2, fragmentos de anticuerpos Fv (por ejemplo, Vh o Vl), fragmento de anticuerpos de la cadena sencilla Fv y fragmentos de anticuerpos dsFv. Ademas, las moleculas de anticuerpo para su uso de acuerdo con la invencion pueden ser anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos quimericos. En algunas realizaciones, las moleculas de anticuerpo son anticuerpos monoclonales, completamente humanos. Los anticuerpos monoclonales abarcan anticuerpos obtenidos a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto para las mutaciones posibles de origen natural que pueden estar presentes en cantidades pequenas. Los anticuerpos monoclonales altamente espedficos, que estan dirigidos contra un unico sitio antigenico. Los anticuerpos
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monoclonales son ventajosos porque se pueden sintetizar mediante un cultivo de hibridoma, esencialmente sin contaminacion por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo por estar entre una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no se debe considerar como la produccion que requiere el anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular.
Los anticuerpos para su uso de acuerdo con la presente invencion incluyen cualquier region de anticuerpo variable, maduro o no procesado unido a cualquier region de inmunoglobulina constante. Si una region variable de cadena ligera esta unida a una region constante, preferiblemente es una cadena kappa. Si una region variable de cadena pesada esta unida a una region constante, preferiblemente es una region constante gamma 1, gamma 2, gamma 3 o gamma 4 humana, mas preferiblemente, gamma 1, gamma 2 or gamma 4 y even more preferiblemente gamma 1 o gamma 4.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales totalmednte humanos dirigidos contra, por ejemplo, NKG2D o DAP10 se generan usando ratones transgenicos que llevan partes de sistema inmune humano en lugar del sistema de raton. Estos ratones transgenicos, que se pueden mencionar en el presente documento, como ratones "HuMAb", contienen el gen de la inmunoglobulina humana miniloci que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada humana sin disposicion (mu y gamma) y la cadena ligera kappa, conjuntamente con las mutaciones dirigidas que inactivan los loci de la cadena murina mu y kappa endogena. De acuerdo con lo anterior, los ratones muestran una expresion reducida de IgM o kappa de raton, y en respuesta a la inmunization, los transgenes introducidos de cadena pesada y ligera humanos sometidos a cambio de clase y mutacion somatica para generar anticuerpos de alta afinidad IgG/kappa monoclonales. La generacion de los anticuerpos completamente humanos en ratones HuMAb se conoce comunmente en la tecnica
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el procedimiento de hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975, o mediante otros procedimientos bien conocidos, desarrollados posteriormente. En el procedimiento de hibridoma, un raton u otro animal huesped apropiado se inmuniza para inducir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran de manera espedfica a la protema usada para la inmunizacion. De manera alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos se fusionan despues con celulas de mieloma usando un agente de fusion adecuado, tal como polietien glicol, para formar una celula de hibridoma. Las celulas de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o mas sustancias que inhiben el desarrollo o supervivencia de las celulas no fusionadas, parentales de mieloma. Por ejemplo, si las celulas de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas de manera tfpica incluiran hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), dichas sustancias evitan el crecimiento de de celulas deficientes en HGPRT.
El medio de cultivo en el que las celulas de hibridoma se desarrollan se ensayan para la produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antfgeno. La especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos mediante celulas de hibridoma se pueden determinar mediante inmunoprecipitaonn o mediante un ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELlSA) o mediante inmunofluorescencia y citometna de flujo o mediante transferencia de Western. Despues se identifican las celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y / o actividad deseada, los clones se peden suclonar mediante procedimientos de dilucion limitantes y se desarrollan mediante procedimientos convencionales. Los medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen por ejemplo, medio RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores de ascites en un animal: Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, el fluido de ascites, o suero mediante procedimientos de purificacion de inmunoglobulina convencionales tal como, por ejemplo, protema A-Sefarosa, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis, o cromatograffa de afinidad.
El ADN que codifica anticuerpos monoclonales o fragmento de anticuerpos se afsla facilmente y se secuencia usando y procedimientos convencionales. Las celulas de hibridoma sirven como una fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADn se puede colocar en vectores de expresion, que despues se transfectan en celulas huesped tales como celulas E. coli, celulas COS de simio, celulas T 293 humanas, celulas de ovario de hamster chino (CHO), o celulas de mieloma que no producen de otra manera protema inmunoglobulina, para obtener la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes.
Anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tambien se pueden aislar a partir de genotecas de fago de anticuerpos generada usando tecnicas bien conocidas, con o sin el uso de recomposicion de cadena asf como infeccion de combinacion y recombinacion in vivo como una estrategia para construir genotecas de fago muy grandes. De este modo, estas tecnicas son alternativas viables para las tecnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
Las variaciones menores en las secuencias de aminoacidos de anticuerpos o moleculas de inmunoglobulina estan abarcadas por la presente invencion, siempre que las variaciones en la secuencia de
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aminoacidos mantengan al menos el 75%, mas preferiblemente al menos el 80%,90%,95%, y lo mas preferiblemente el 99% de la secuencia. En particular, se contemplan reemplazos de aminoacidos conservadores. Los reemplazos conservadores son los que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Si un cambio de aminoacidos da como resultado un peptido funcional se puede determinar facilmente ensayando la actividad espedfica del derivado de polipeptido. Los fragmentos (o analogos) de anticuerpos o moleculas de inmunoglobulina, se pueden preparar facilmente por los expertos en la tecnica. Los extremos amino- y carboxi- de los fragmentos o analogos se producen cerca de los lfmites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante comparicion de los datos de la secuencia de nucleotidos y / o de aminoacidos con las bases de datos de secuencias publicas o registradas. Preferiblemente, se usan procedimientos de comparacion por ordenador para identificar los motivos de secuencia o predecir los dominios de conformacion de protema que se producen en otras protemas de estructura conocida y / o funcion. Se conocen los procedimientos para identificar las secuencias de protemas que se pliegan en una estructura tridimensional. Los motives de secuencia y conformaciones estructurales se pueden usar para definer los dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invencion.
En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoacidos se realizan de manera que: (1) reduzcan la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reduzcan la susceptibilidad a oxidacion, (3) alteren la afinidad de union para formar complejos de protemas, (4) alteren las afinidades de union, y / o (4) confieran o modifiquen otras propiedades fisicoqmmicas o funcionales de tales analogos.
En general, los anticuerpos anti-NKG2D para su uso de acuerdo con la presente invencion muestran una afinidad (Kd) para NKG2D humano que es al menos igual al de los ligandos de NKG2D solubles. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a NKG2D humano con afinidad nanomolar o, incluso mas preferiblemente, afinidad picomolar. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a NKG2D humano con un Kd de menos de aproximadamente 100 nM, 50 nM, 20 nM, 20 nM, o 1 nM.
En algunas realizaciones, los anticuerpos utiles incluyen los que reducen la interaccion entre NKG2D humano y uno o mas de MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, y ULBP4. Tales anticuerpos de bloqueo se pueden identificar usando ensayos de competicion convencionales.
II. Procedimientos de tratamiento
En un aspecto, el agente (por ejemplo, un anti-NKG2D mAb o fragmento de mAb) es un agente que se demuestra que es eficaz en la mejora de RA en un modelo aceptable de RA, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.414.218 y la publicacion de Patente de Estados Unidos N° 20030005469 (los principios y modelos relacionados de describen en, por ejemplo, Wooley, P. H., Animal Models of Artritis, eds. J. H. Klippel y P. A. Oieppe, Mosby Publishers (Londres), 1998; Erning et al., Artritis Res, 4 SuppI 3:S133-40, 2002; Holmdahl et al., Ageing Res Rev,1 (1):135-47, 2002; Anthony et al., Clin Exp Rheumatol, 17(2): 240 - 4,1999; Ourie et al., Clin Inmunollmmunopathol, 73 (1 ): 11 - 8,1994; y Muller-Ladner et al., Orugs Today (Barc), 35(4-5):379-88, 1999). En un aspecto adicional, el agente es un anticuerpo que es capaz de reducir de manera detectable la activacion de NKG2D inducida por ligando de los leucocitos de expresion de NKG2D y / o alteracion de la expansion de celulas NKG2D+ T o celulas NK (por ejemplo, alteracion de la expansion y / o funcion de las celulas T CD8+) (por el contrario, por ejemplo, al menos algunos de los anticuerpos descritos en la publicacion de Patente de Estados Unidos N° 20040115198), sin empobrecimiento de manera significativa tales celulas (por ejemplo, provocando una reduccion de aproximadamente el 10% o menos de tales celulas cuando se compara con un control adecuado). En un aspecto, el procedimiento da como resultado una modulacion de uno o mas biomarcadores de una manera consistente con el tratamiento o prevencion (segun sea aplicable) de RA (por ejemplo, IL-6 de suero, TNF R, IL-2R, CD4 suprimido, CD8 suprimido, y / o protema C reactiva). En otro aspecto, la practica del procedimiento da como resultado una reduccion detectable de inflamacion sinovial en las articulaciones perifericas del paciente / huesped. En un aspecto, el procedimiento da como resultado la prevencion del deterioro radiografico y mejora de la funcion ffsica en el paciente o huesped como se muestra mediante, por ejemplo, una reduccion en la progresion radiografico en el paciente o huesped, reduccion de la inflamacion y articulaciones sensibles (como se determina mediante criterio analttico aceptable), y / o mejora de la calidad de vida de manera significativa (por ejemplo, como se determina mediante una reduccion en las puntuaciones de incapacidad en el Cuestionario De Evaluacion de salud de RA). Un modulador de NKG2D se puede administrar a un paciente como una sola dosis que comprende una cantidad eficaz de dosis unica para prevenir o tratar un smdrome inflamatorio o autoinmune, o en una serie de dosis por fases, que conjuntamente comprenden una cantidad eficaz de para prevenir o tratar el smdrome. Una cantidad eficaz de un modulador de NKG2D se refiere a la cantidad de modulador que , cuando se administra en una unica dosis o el agregado de dosis multiples, o como parte de cualquier otro tipo de regimen de tratamiento definido, produce a una mejora estadfstica cuantificable en resultado, como se evidencia mediante al menos un parametro clmico asociado al smdrome. Una cantidad eficaz de un modulador de NKG2D puede ralentizar la progresion de una enfermedad cuando se compara con los pacientes que no reciben el modulador de NKG2D.
Se entendera que la cantidad eficaz del modulador de NKG2D, asf como el regimen de dosificacion global, puede variar de acuerdo con la enfermedad y el estado clmico del paciente, que, a su vez se puede reflejar en uno o
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mas parametros clmicos tales como las puntuaciones de enfermedad clmicamente aceptadas. Por ejemplo, para artritis reumatoide, la gravedad de la enfermedad y / o resultado de tratamiento, se puede evaluar controlando el numero de articulaciones inflamadas; dolor; mobilidad; y / o la puntuacion de enfermedad oficial ACR 20/50 o 70. Para la diabetes Tipo 1, gravedad de enfermedad y / o resultado de tratamiento se puede evaluar mediante la medicion de los niveles de glucosa en sangre o sus variaciones, niveles de Hb1 C, y similares. Para la esclerosis multiple, se puede determinar la inflamacion de cerebro mediante el escaneo del cerebro. Para el rechazo de transplante hematopoyetico, se puede evaluar la gravedad de la enfermedad (fallo de trasplante) y / o resultado de tratamiernto mediante la evidencia de neutropenia prolongada, trombocitopenia, y dependencia de la transfusion de globulos rojos en pacientes que se han sometido a acondicionamiento mieloablativo, y mediante incapacidad para observar el quimerismo en pacientes que se han sometido a acondicionamiento no mieloablativo. En general, los efectos detectables en el resultado del tratamiento que usan los procedimientos y composiciones de la presente invencion incluyen una disminucion en la necesidad de otros tratamientos (incluyendo, por ejemplo, una disminucion en la cantidad de y / o duracion de otros farmacos o tratamientos), una disminucion en el numero y / o duracion de estancias en hospital, una disminucion de la perdida de dfas de trabajo debido a enfermedad, y similares. Se entendera ademas que la cantidad eficaz se puede determinar por los expertos en la tecnica mediante experimentacion de rutina, mediante la construccion de una matriz de valores y ensayando los puntos diferentes en la matriz. Se divulga la administracion combinada de uno o mas agentes adicionales en conexion con un modulador de NKG2D. Se entendera que, en las realizaciones que comprenden la administracion de combinaciones de un modulador de NKG2D con otros agentes, la dosificacion del modulador de NKG2D puede por sf mismo comprender una cantidad eficaz y el (los) aumentar agente (s) adicional (es) pueden ademas aumentar el beneficio terapeutico al paciente. De manera alternativa, la combinacion del modulador de NKG2D y el segundo agente puede comprender conjuntamente una cantidad eficaz para prevenir o tratar el smdrome. Tambien se entendera que se pueden definir cantidades eficaces en el contexto de regfmenes de tratamiento particular, incluyendo, por ejemplo, programacion y numero de administraciones, modos de administraciones, formulaciones, etc.
En algunas realizaciones en las que el smdrome asociado a NKG2D es diabetes Tipo 1, el agente adicional abarca uno o mas de un agente que promueve el crecimiento de celulas beta pancreaticas o potencia el trasplante de celulas beta, tal como, por ejemplo factores de crecimiento de celulas beta o de supervivencia o anticuerpos inmunomoduladores. En algunas realizaciones en las que el smdrome asociado a NKG2D es artritis reumatoide, el agente adicional es uno o mas de metotrexato; un anticuerpo anti-TNF- a; una protema de fusion TNF-a receptor-Ig un anticuerpo anti-IL-15, un farmaco antiinflamatorio no esteroide (NSAIO), y un farmaco antirreumatico que modifica la enfermedad (OMARO). Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente biologico tal como un agente anti-TNF (por ejemplo, ENBREL®), infliximab (REMICAOE®) y adalimumab (HUMIRA®) o rituximab (RITUXAN®). En algunas realizaciones en las que el smdrome asociado a NKG2D es rechazo de transplante hematopoyetico, el (los) factor (es) de crecimiento hematopoyetico (s) (por ejemplo,
eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF, lL-3, EL- 11, trombopoyetina, etc.) o antimicrobiano (s) (por ejemplo, antibiotico, antiviral, antifungico) se puede administrar como una terapia adjunta. En algunas realizaciones en las que el smdome asociado a NKG2D es psoriasis, el agente adicional es uno o mas de de tar y sus derivados, fototerapia, corticoesteroides, Ciclosporina A, analogos de la vitamina D, metotrexato, inhibidores de la protema quinasa activada por mitogeno p38 (MAPK) asf como agentes biologicos tales como agentes anti-TNF-alfa y RITUXAN®. En algunas realizaciones en las que el smdrome asociado a NKG2D -es una enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) tal como, por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, el agente adicional es uno o mas de aminosalicilatos, corticosteroides, inmunomoduladores, antibioticos, o agentes biologicos tales como REMICADE® y HUMIRA®.
III Formulaciones farmaceuticas y Modos de Administracion
Las formulaciones farmaceuticas que comprenden los moduladores de NKG2D tambien pueden comprender uno o mas vehmulos farmaceuticamente aceptables para uso en el tratamiento o prevencion de un smdrome como en la reivindicacion 1. Los vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen cualesquiera y todos los disolventes y, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes que retrasan la absorcion e isotonicos , y similares que son fisiologicamente compatibles con un modulador de NKG2D o composicion o combinacion relacionada usada de acuerdo con la invencion. Los ejemplos de vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen uno o mas de agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asf como una combinacion de los mismos. En muchos casos, puede ser deseable incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, o cloruro de sodio en tal composicion. Las sustancias farmaceuticamente aceptables tambien cantidades menores de substancias auxiliares tal como agentes humectantes o agentes emulsionantes, conservantes o tampones, que de manera deseable potencian la vida util o eficacia del modulador del modulador de NKG2D, composicion, o combinacion relacionada. De manera adecuada para los vehmulos y otros componentes de composiciones farmaceuticas se determina basandose en la falta de un impacto negativo significativo en las propiedades biologicas deseadas del modulador de NKG2D, composicion, o combinacion relacionada. Las composiciones de modulador de NKG2D, composiciones, o combinaciones relacionadas usadas de acuerdo con la invencion pueden estar en una diversidad de formas adecuadas. Tales formas incluyen, por ejemplo, formas de dosificacion lfquidas, semi-solidas y
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solidas, tales como soluciones Kquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, emulsiones, microemulsiones, comprimidos, pastillas, polvos, liposomas, dendnmeros y otras nanopartfculas (vease, por ejemplo, Baek et al., Methods Enzymol, 362: 240 - 9, 2003; y Nigavekar et al., Pharm Res, 21: 476 - 83,2004), micropartfculas, y supositorios. La forma optima depende del modo propuesto de administracion, la naturaleza de la composicion o combinacion, y y la aplicacion terapeutica. Las formulaciones tambien pueden incluir , por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lfpidos, vesfculas que contienen lfpidos (cationicos o anionicos), conjugados de ADN, pastas de absorcion anhidra, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbocera (polietiilen glicoles de diversos pesos moleculares), geles semi- solidos, y mezclas semi-solidas que contienen carbocera . Puede ser apropiada cualquiera de las mezclas anteriores en los tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invencion, siempre que el ingrediente activo en la formulacion no este inactivado por la formulacion y la formulacion sea fisiologicamente compatible y tolerable con la via de administracion. Vease tambien, por ejemplo, Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol, 52: 238 - 311, 1998, y las citas en el documento para informacion adicional relacionada con los excipientes y vetnculos bien conocidos por los qmmicos farmaceuticos.
Las composiciones de moduladores de NKG2D tambien incluyen composiciones que comprenden cualquier combinacion adecuada de un peptido modulador de NKG2D y una sal adecuada del mismo. Cualquier sal adecuada, como una sal de metal terreo alcalino en cualquier forma adecuada (por ejemplo, una sal tampon), puede usarse en la estabilizacion de los moduladores de NKG2D (preferiblemente la cantidad de sal es tal que se evita la oxidacion y/o precipitacion del modulador de NKG2D). Las sales adecuadas incluyen tfpicamente cloruro sodico, succinato sodico, sulfato sodico, cloruro potasico, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, y cloruro calcico. Tambien se proporcionan composiciones que comprenden una base y moduladores de NKG2S. En otros aspectos, la invencion proporciona una composicion de modulador de KKG2D que carece de una cantidad tonificante de cualquier sal.
Una composicion para uso farmaceutico tambien puede incluir diluyentes, cargas, sales, tampones, detergentes (por ejemplo, un detergente no ionico, tal como Tween-80), estabilizantes (por ejemplo, azucares o aminoacidos sin protemas), conservantes, fijadores de tejido, solubilizantes, y / u otros materiales adecuados para la inclusion en una composicion farmaceutica. Los ejemplos de componentes adecuados tambien se describen en, por ejemplo, Berge et al., J Pharm Sci, 6661 :1 - 19,1977; Wang y Hanson, J Parenteral Sci Tech, 42:S4-S6, 1988, Patente de Estados Unidos numeros. 6.165.779 y 6.225. 289; y otros documentos citados en los documentos. Tal composicion farmaceutica tambien puede incluir conservantes, antioxidantes, u otros aditivos conocidos por los expertos en la tecnica. Los vetnculos farmaceuticamente aceptables adicionales se conocen en la tecnica y se describen en, por ejemplo, Urquhart et al., Lancet, 16: 40 367, 1980; Lieberman et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS, 2a ed., vol. 3, 1998; Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELlVERY SYSTEMS, 7a ed., 2000; Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA, 31 st ed.; Remington's PHARMACEUTICAL SCI ENCES, 16th-20th editions; THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Goodman y Gilman, eds., 9th ed., 1996; Wilson y Gisvolds' TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL y PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado y Remers, eds., 10a ed., 1998; y las Patentes de Estados Unidos Numeros. 5.708.025 y 5.994.106. Los principios de formulacion de composiciones farmaceuticamente aceptables tambien se describen en, por ejemplo, Platt, Clin Lab Med, 7: 289 - 99, 1987; Aulton, PHARMACEUTICS: THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone, NY, 1988; EXTEMPORANEOUS ORAL L1QUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP, 1998, y "Drug Dosage," J Kans Med Soc, 70(1): 30 - 32, 1969. Los vehfculos farmaceuticamente aceptables particularmente adecuados para la administracion de vectores se describen en, por ejemplo, Solicitud de Patente Internacional WO 50 98/32859. En un aspecto ejemplar, el compuesto activo o combinacion se prepara con un vehuculo que protegera el compuesto contra la liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos, y sistemas de administracion microencapsulados. Se pueden usar polfmeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilen vinil acetato, polianhudridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Estan patentados muchos procedimientos para la preparacion de tales formulaciones o se conocen de manera general por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, SUSTAINED AND CONTROL-LED RELEASE DRUG DELlVERY SYSTEMS, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, 1978.
En otro aspecto, las composiciones propuestas para la administracion oral, por ejemplo, se pueden formular con un diluyente inerte o un vehuculo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) tambien pueden estar contenidas en capsulas de gelatina duras o blandas, comprimirse en comprimidos, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administracion terapeutica oral, los compuestos se pueden incorporar con excipientes y usarse en la forma de comprimidos que se pueden ingerir, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto usado en la invencion mediante la administracion distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o administrar de manera conjunta el compuesto con, un material para evitar su inactivacion.
Las composiciones de modulador de NKG2D, composiciones relacionadas, y composiciones de combinacion se pueden administrar mediante cualquier via adecuada, tal como una via oral, mucosal, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutaneoa, intramuscular, parenteral, intertumoral, intratumoral, o topica. Tambien se puede administrar de manera continua mediante una minibomba u otro dispositivo adecuado. El
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anticuerpo u otro modulador de NKG2D en general se administrara mientras la afeccion patologica este presente, siempre que el anticuerpo provoque que el empeoramiento de la afeccion se detenga o se mejore. El anticuerpo u otro modulador de NKG2Dwill en general se administrara como parte de una composicion farmaceuticamente aceptable como se describe en otra parte en el presente documento. El anticuerpo se puede administrar mediante cualquier via adecuada, pero de manera tfpica se administra por via parenteral en formulaciones de dosificacion unitaria que contienen vetuculos farmaceuticamente aceptables, adjuvantes, y similares (estabilizantes, agentes disgregantes, anti-oxidantes, etc.). El termino "parenteral" como se usa en el presente documento incluye, tecnicas subcutaneas, intravenosas, intraarteriales, intramusculares, intrasternales, intratendinosas, intraspinales, intracraneales, intratoracicas, de infusion y administracion intraperitoneal. Lo mas comunmente, un anticuerpo se administro por via intravenosa o subcutanea. Las vfas de inyeccion tambien incluyen inyeccion en el musculo (intramuscular, IM); inyeccion bajo la piel (subcutanea, SC); inyeccion en una vena (intravenosa, IV); inyeccion en la cavidad abdominal (intraperitoneal, IP); y otra administracion en / a traves de la piel (intradermica, ID, usualmente mediante inyecciones multiples). Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar de manera adicional ciertas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invencion y no se consideran limitantes del su alcance.
Ejemplo 1
Ensayo para la activacion de NKG2D
Celulas NK humanas activadas con IL-2 se cultivaron conjuntamente con un cultivo de celulas diana apropiado marcado con 51Cr, tal como celulas Ba/F3 de raton que se habfan transfectado con ADNc que codifica MICA humano en condiciones in en las que el polipeptido de MICA se expresa; y; como celulas control, las mismas celulas diana que no se han transfectado. La liberacion de 51 Cr se controla para indicar la lisis de celulas. La lisis de celulas que expresan MICA mediante las celulas NK activadas a niveles por encima de controles indica la activacion espedfica de NKG2D.
Para seleccionar los moduladores de NKG2Ds, las celulas NK activadas se incuban con agentes candidatos antes de la exposicion a las celulas diana marcadas con 51Cr. Los compuestos que disminuyen de manera significativa la destruccion de las celulas diana que llevan el ligando de NKG2D se identifican y se evaluan posteriormente.
Ejemplo 2
Ensayo para la intemaNzacion de NKG2D
Se cultivan celulas que expresan NKG2D humano a 37°C durante una o mas horas en la presencia de un anticuerpo anti-NKG2D marcado con biotina. Como control, las celulas NKG2D+ celulas se cultivan con el anti- NKG2D marcado con biotina a 4°C ien la presencia del 0,05% de azida de sodio para evitar la internalizacion. Se lavan las celulas para retirar el exceso de anticuerpo, y despues se tinen con estreptavidina marcada con tinte fluorescente para detectar el anticuerpo NKG2D conjugado con biotina, despues se evalua la internalizacion mediante microscopfa fluorescente o citometna de flujo. Una disminucion en la cantidad de NKG2D en la superficie celular con el anticuerpo anti-NKG2D marcado con biotina a 37°C comparado con las celulas incubadas con el anticuerpo anti-NKG2D marcado con biotina a 4°C es un indicador de la internalizacion. Esto ademas se puede verificar mediante la fijacion y permeabilizacion de las celulas y tincion con un anticuerpo de segunda etapa marcado con tinte fluorescente y permeabilizacion de las celulas y tincion con un anticuerpo de segunda etapa marcado con tiente fluorescente que detectara el anticuerpo primario anti- NKG2D. Si se internaliza, el anticuerpo de segunda etapa detectara el anticuerpo anti-NKG2D primario en el interior de las celulas cultivadas a 37°C, como se visualiza mediante microscopfa fluorescente.
Ejemplo 3
El bloqueo de NKG2D evita la Diabetes Autoinmune en ratones
Se realizaron los siguientes experimentos para ensayar el efecto de bloqueo de NKG2D en el desarrollo de la diabetes de Tipo I en un sistema de modelo animal, el raton NOD (Ogasawara et al., Immunity, 20: 757 - 767, 2004).
Ratones, Reactivos, Citoquinas y Anticuerpos
Se compraron ratones NOD de Taconic (Germantown, NY). Se compraron ratones NOD.scid de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME). Se han descritoos ratones 8.3 TcR-transgenicos NOD (Verdaguer et aL, J Exp Med, 186: 5 1663 - 1676, 1997). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones sin patogenos en la instalacion de animales UCSF y se realizaron los experimentos de acuerdo con las grnas del Comite UCSF de Investigacion animal. Se diagnostico diabetes cuando el nivel de glucosa en sangre era mayor que 300 mg/dl en
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dos mediciones consecutivas. Se midieron los niveles de glucosa en sangre usando un control de glucosa en sangre (Walgreen's, Oeerfield, IL).
Se generaron clones Anti-raton NKG2D mAb, CX5 y CX6 (isotipo IgG1 de rata), como se describe en (Ogasawara 10 et aL, Immunity, 18: 41 - 51, 2003) y se obtuvo el clon anti-raton NKg2d mAb 191004 (isotipo IgG2a de rata) de R&D Systems (Minneapolis, MN). Todos los anti-NKG2D mAbs reconocen el dominio extracelular de NKG2D y bloquean de manera eficaz la union de NKG2D a sus ligandos. Para la inyeccion in vivo, se utilizo un anticuerpo CX5 purificado que no contema endotoxina detectable (0,3 pg/inyeccion). Se compraron ratas control IgG de Sigma (St. Louis, MO). Anti-raton pan RAE-1 mAb (clon 186107, isotipo de rata IgG2b) se une a RAE-1 a, p, 8 y, y £. Se produjeron tetrameros NRP-V7/H-2Kd y TUM/H-2Kd (control) como se describe en (Amrani et aL, Nature, 406: 739 - 742, 2000) o a partir de la instalacion de del tetramero NIH (Atlanta, GA). El tetramero TUMI H-2Kd no se unio a las celulas NRP-V71 H-2Kd tetramero positivas. Se compraron otros anticuerpos de BD PharMingen o eBioscience (San Diego, CA).
Preparacion de celulas de islotes de Pancreas
Se aislaron islotes de raton como sigue. En resumen, se inyectaron 0,3 mg/ml de colagenasa P (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) en el conducto pancreatico. Se retiraron los pancreas distendidos y se incubaron a 37°C durante 13 -17 min Se purificaron los islotes mediante centrifugacion en gradientes de Eurocollin- Ficoll que comprendfa cuatro densidades diferentes (1,108, 1,096, 1,069, y 1,037). Despues de la centrifugacion, se recogieron y se lavaron los fragmentos de tejido a 1,.069/1,096 Despues de esto, para obtener las celulas individuales, se disociaron las celulas de islotes mediante solucion de disociacion de celulas no enzimatica (Sigma, St. Louis, MO).
Inmunofluorescencia, Citometna de flujo y Microscop^a
Para la deteccion de NKG2D, se tineron las celulas (-1 x106) con 0,25 |jg de anti-NKG2D mAb biotinilado o marcado con PE (clon 191004). Se tineron conjuntamente las celulas con anti-CD8 conjugado a FITC, anti-CD8 conjugado a APC, antiCD44 conjugado a FITC, o anti-Ly-6C conjugado a FITC. Para detectar RAE-1, se tineron las celulas con un anti-pan RAE-1 mAb biotinilado que reconoce las cinco protemas RAE-1 conocidas (Lodoen et aL, JExp Med, 197: 1245 - 1253, 2003) o anti-RAE-1 mAb (clon CX1) (Ogasawara et al., supra, 2003). Se uso estreptavidina conjugada a PE o estreptavidina conjugada a APC para detectar mAbs biotinilados. Se incubaron las celulas con mAbs durante 20 min y se lavaron con PBS que contema NaN3 al 0,01%. Se analizaron las celulas usando un FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) o un citometro Personal Guava® con software Guava ViaCount™ y Guava Express™ (Hayward, CA). Se activaron las poblaciones de linfocitos viables basandose en los perfiles de dispersion anteriores y laterales y mediante la perdida de tincion de yoduro de propidio. Para la inmunohistoqmmica, se congelaron de manera rapida los organos en medio, OCT y se prepararon las secciones y se tineron y mediante tecnicas convencionales. Se adquirieron las imagenes usando un microscopio Deltavision (Applied Precision, Issaquah, WH) y se llevo a cabo la desconvolucion por ordenador usando el software softWoRx (Applied Precision).
RT-PCR Cuantitativa
Se llevo a a cabo (tiempo real) PCR usando un instrumento ABI 7700 (Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se compraron sondas en Applied Biosystems. Se describieron anteriormente sondas y cebadores espedficos de RAE-1 (Ogasawara et al., supra, 2003). Los cebadores universales usados para detectar todas las trascripciones de RAE- 1 conocidas eran: 5'-ctagtgccac ctgggaattc a-3' no codificante (SEC ID N°:6); 5'-catcattagc tgatctccag ctca-3' no codificante (SEO ID NO:7), y la sonda era 5'-6-FAM-catcagtgac agttacttct tcaccttcta cacagaga-Tamra-3' (SEC ID N°:8). Se tarto el ARN total con ADNasa I, y despues se sintetizo ADNc de primera cadena usando cebadores de hexameros al azar. Las condiciones de ciclacion para PCR de tiempo real fueron: 50°C durante 10 min, seguido de 50 ciclos a 95°C durante 30 segundos, y 60°C durante 2 mino Se analizaron los datos mediante el uso del Software de Analisis de Detector de Secuencias v1.7 (Applied Biosystems). Se realizo el analisis estadfstico usando un ensato t de dos muestras.
Estudios de Transferencia adoptiva - Celulas T NOD transferidas en ratones NOO.scid
Se aislaron celulas T de bazos y ganglios linfaticos de ratones NOD diabeticos de 16 semanas de edad mediante aislamiento magnetico de celulas usando MACS (Miltenyi Biotec Inc., alemania). Se enriquecieron celulas T (pureza > 98%) mediante seleccion negativa con empobrecimiento de celulas C019+, C024+, y MHC clase II+. Aproximadamente 7,5 x106 de celulas T se transfirieron en ratones NOD.scid de 4 - 5 semanas de edad mediante la inyeccion en la vena de la cola. Se examinaron semanalmente los niveles de glucosa en sangre en los ratones transferidos de manera adoptiva.
Estudios de Transferencia adoptiva de celulas T de 8.3 TcR-transgenicos en ratones NOD
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Se realizo la transferencia de celulas T como se ha descrito previamente (Serra et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99: 15566 - 15571, 2002). En resumen, se aislaron Linfocitos de 8.3 TcR-transgenicos a partir de ganglios linfaticos y bazos. Se enriquecieron las celulas T (pureza > 95 %) mediante la seleccion negativa mediante aislamiento magnetico usando un MACS. Aproximadamente 1 x 107 de celulas T marcadas con CFSE (5 jM) se transfirieron en ratones NOD de 10 semanas de edad mediante inyeccion en la vena de la cola el dfa 0. Se inyecto Anti-NKG2D 10 mAb (CX5) o clg (200 jg/inyeccion) en los ratones Nod receptores los d^as -1, +1 y +5.
Expresion de RAE-1 en el pancreas de ratones NOD pre-diabeticos
Para investigar si las interacciones entre NKG2D y RAE-1 estan implicados en el desarrollo de diabetes autoinmune, se desarrollo en un ensayo de RT-PCR cuantitativo para detectar las transcripciones de genes RAE-1 conocidos. Se detectaron las transcripciones de RAE1 en los pancreas de ratones NOD pre-diabeticos de fase tardfa (12 -16 semanas de edad), pero no en los pancreas de ratones BALB/c de edad coincidente (Fig. 1a). Aunque las transcripciones de RAE-1 comparativamente menos pronunciadas tambien se detectaron en los pancreas de ratones NOD de 4 - 6 semanas de edad. RAE-1 tambien se detecto en los pancreas de ratones adultos NOD.scid (que caredan de celulas B y T) (Fig. 1b). Conjuntamente, estos resultados indicaron que la expresion de RAE es independiente de una respuesta autoinmune en curso. Para examinar si RAE-1 se regula hacia arriba de manera selectiva en el pancreas con la edad, se compararon los niveles de transcripciones de RAE-1 en un organo particular de ratones NOD jovenes con aquellos en el mismo organo en ratones NOD prediabeticos de fase tardfa. Mediante este criterio, se incremento RAE-1 relativamente mas en el pancreas de los ratones prediabeticos con la edad, comparados con el Idgado, bazo, rinon y timo (Fig. 1c).
Para determinar si las protemas de RAE-1 se expresan en la superficie celular, se aislaron celulas pancreaticas a partir de ratones NOD prediabeticos y no diabeticos BALB/c. Las celulas aisladas mediante digestion enzimatica del pancreas se tineron con anti-RAE-1 y anti-CD45 mAb (que distingue la infiltracion de celulas CD45+ hematopoyeticas de las celulas de los islotes pancreaticos CD45 no hematopoyeticas). Las celulas de linaje CD45 hematopoyeticas positivo se detectaron infiltrando el pancreas de NOD prediabeticos, pero no el pancreas de BALB/c no diabeticos (Fig. 1d). Se detectaron las protemas de RAE-1 predominantemente cobre las celulas pancreaticas no hematopoyeticas CD45 negativo en ratones NOD, pero no se encontro en las celulas pancreaticas en ratones BALB/c. Usando tecnicas de separacion de gradiente de densidad, se aislaron los islotes a partir de pancreas de NOD y tambien se recogieron de ganglios linfaticos (PLN) de estos ratones. Se tineron suspensiones de celulas individuales de los islotes aislados y se tineron las PLN con anti-RAE-1 y anti-CD45 mAb y se analizaron mediante citometna de flujo. RAE-1 estaba presente a niveles inferiores en la mayona de las celulas de los islotes de CD45-, pero no en las celulas CD45+ hematopoyeticas en el pancreas o PLN (Fig. 1d, e). Estos resultados indicaban que las transcripciones y protemas de RAE-1 estaban presentes en el pancreas de ratones NOD pre-diabeticos, pero no enratones BALB/c 35 no diabeticos, e indicaban que la expresion de RAE-1 puede preceder a la aparicion de la enfermedad y contribuir a la progresion de la enfermedad en ratones NOD.
Celulas T CD8+ que infiltran el pancreas de NOD expresan NKG2D
Ya que el desarrollo de diabetes en ratones NOD requiere tanto ceulas CD4+ como T CD8+, se analizo la expresion de NKG2D sobre las celulas T aisladas de los tejidos inmunes perifericos y sobre los leucocitos de infiltracion en los pancreas de ratones NOD. Como se muestra en la in Fig. 2a, se detecto NKG2D en un subconjunto de celulas T CD8+ que infiltran el pancreas in ratones NOD de 10 y 25 semanas de edad. Los porcentajes de celulas T CD8+ NKG2D+ que infiltran el pancreas con progresion de la enfermedad (Fig. 2a). Se detecto una fraccion mas pequena de celulas T CD8+ NKG2D+ en las PLN y bazo (Fig. 2a, b). Ademas, celulas T CD8+ NKG2D+ en el pancreas y PLN se encontro que expresan altos niveles de CD44, pero no de Ly6C (Fig. 2b). Tambien se observo una poblacion de leucocitos CD8 NKG2D+ leucocitos (que no expresaban CD3) en los leucocitos que infiltran el pancreas de NOD (Fig. 2a) y muchas de estas celulas expresaban de manera conjunta anffgenos de celulas NK cell y mieloides. Como se ha indicado para las razas de ratones no diabeticos normales (Jamieson et al., Immunity, 17: 19 - 29,2002), no se detecto NKG2D en celulas T CD4+ o en celulas B220+ B celulas en el pancreas o en los tejidos linfoides perifericos de o bien ratones NOD de 10 semanas o 25 semanas de edad.
Los estudios recientes revelaron que una proporcion sustancial de celulas T autorreactivas CD8+ en ratones NOD reconocen un peptido de la protema relacionada con la subunidad catalftica de la glucosa-6-fosfatasa (IGRP) que se presenta por H-2Kd. Un peptido de mimotopo, NRP-V7 (KYNKANVFL, establecido como la SEQ ID N°:5), funciona como un super-agonista en los ratones nOd que expresan 8.3 TcR. Celulas T NRP-V7-reactivas CD8+ se acumulan en el pancreas de ratones NOD y juegan un papel cntico en la diabetogenesis. Se tineron de manera conjunta celulas T CD8+ y PLN en el pancreas con NRP-V7/H-2Kd tetrameros y anti-NKG2D. Casi todas las celulas T NRPV7/H-2Kd tetramero positivo CD8+ que infiltran el pancreas expresaron NKG2D y CD44anto (Fig. 2c). De manera similar, las celulas T NKG2D+ CD8+ en el pancreas eran CD44alto, pero Ly-6C' (Fig. 2b), un fenotipo consistente con las celulas T CD8+ efectoras (Cerwenka et al., J Inmunol, 161: 97 - 105, 1998). De manera notable, pocas celulas T CD8+ NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo se detectaron en las PLN (Fig. 2c). La inmunohistoqmmica demostro que las celulas T CD8+ NKG2D+ se acumulan en los islotes de ratones pre- diabeticos NOD, cerca de las celulas beta que producen insulina (Fig. 2d). Ademas de las celulas T CD8+, un
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subconjunto de las celulas C068 positivo (macrofagos) en el pancreas tambien expreso NKG2D (Fig. 2d). Tratamiento con anti-NKG2D mAb neutralizante in vivo evita la diabetes autoinmune
La expresion de NKG2D sobre las celulas T CD8+ y ligandos de NKG2D sobre los islotes prediabeticos indicaron un papel para estas moleculas en la diabetogenesis. Se ensayo esta hipotesis, mediante tratamiento de ratones NOD prediabeticos con un anti-NKG2D mAb neutralizante. El CX5 anti-raton NKG2D mAb bloquea la union de NKG2D a sus ligandos, e incubacion de celulas que llevan NKG2D con CX5 da como resultado la modulacion e internalizacion del receptor. De manera importante, el tratamiento de ratones in vivo con CX5 no empobrecieron las celulas NKG2D+ NK o celulas T CD8+. Se trataron ratones NOD con anti-NKG2D mAb de 7 - 25 semanas de edad. Los ratones tratados con diluyente solamente desarrollaron diabetes comenzando a las 15 semanas de edad y todos (n = 7) teman enfermedad a las 28 semanas (Fig. 3a, b). Por el contrario, ninguno de los ratones NOD tratados con anti-NKG2D (n = 7) desarrollo diabetes a las 30 semanas de edad, aunque el tratamiento con anticuerpo se detuvo 5 semanas antes (Fig. 3a, b).
Como un analisis mas riguroso, se ensayo el tratamiento de anti- NKG2D mAb para la prevencion de la aparicion de la enfermedad en ratones pre-diabeticos de 13 semanas de edad con insulitas establecida. Los ratones de control proporcionados con lgG desarrollaron diabetes comenzando a las 15 semanas de edad. Por el contrario, no se produjo diabetes en cualquiera de los ratones NOD durante las 12 semanas de tratamiento de anti- NKG2D (Fig. 3c, d). De manera notable, la mayona de los ratones tratados con anti- NKG2D estaban sin enfermedad durante 7 semanas despues de la detencion de la terapia (Fig. 3c, d). De este modo, el bloqueo de NKG2D evito la progresion de diabetes no solamente en los ratones jovenes con insulitis, pero tambien en ratones en una prediabes tardfa con la aparicion inminente de la destruccion de islotes. Los efectos secundarios de del tratamiento de anti- NKG2D mAb no se observaron o bien mediante un examen bruto o analisis histologico. De este modo, el tratamiento de anti-NKG2D mAb es una terapia eficaz para prevenir la diabetes, al menos mientras se administre un anticuerpo de manera continua.
Para examinar el mecanismo de la terapia mediada por anti-NKG2D mAb, se analizaron los leucocitos aislados del pancreas y PLN de Ig de control y ratones NOD tratados con anti-NKG2D mAb. Celulas T CD8+ que expresan conjuntamente NKG2D y los niveles altos de CD44 estaban presentes en el pancreas de ratones tratados con Ig de control. Como se esperaba, la expresion de NKG2D se redujo de manera significativa en las celulas T CD8+, pero la expresion de CD44 era identica en el pancreas de ratones tratados con anti-NKG2D mAb comparado con la de los ratones tratados con Ig control (Fig. 4a). Por el contrario, Celulas T CD8+ que expresan NKG2D eran relativamente infrecuentes en las PLN de ratones tratados tanto como control como anti-NKG2D mAb, indicativo de la localizacion preferencial de las celulas T CD8+ NKG2D+ en el pancreas (consistente con los resultados presentados en la in Fig 2 para los ratones no tratados). El analisis inmunohistoqmmico de las secciones congeladas de pancreas de ratones tratados con Ig control indico celulas T CD8+ que expresan NKG2D en el pancreas de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con Ig control (Fig. 4b). Por el contrario, estaban presentes muchas menos celulas T CD8+ en el pancreas sano de los ratones de 16 semanas de edad que se habfan tratado durante nueve semanas con antiNKG2D (Fig. 4c).
Los leucocitos aislados del pancreas y PLN de ratones NOD tratados con Ig control o anti-NKG2D mAb tambien se analizaron para determinar la presencia de celulas T CD8+ autorreactivas espedficas de antfgeno. De manera notable, la infiltracion de celulas T CD8+ autorreactivas NRPV7/H-2Kd tetramero positivo en el pancreas se disminuyo de manera notable (-75%) en los ratones tratados con antiNKG2D mAb (Fig. 4d). La frecuencia de celulas T CD8+ NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo tambien disminuyo en PLN, bazo y sangre periferica de ratones tratados con anti-NKG2D mAb, comparado con los ratones tratados con Ig control (Fig 4d, e). No se detecto NKG2D sobre las celulas T CD8+ en ratones tratados con anti-NKG2D mAb. Debido a que CX5 es un anti-NKG2D mAb no empobrecedor (Vease, La Figura 8), la terapia se contempla para que trabaje mediante modulacion del receptor (Vease, La Figura 7) y / o inhibicion de union de ligando. Tambien se examino la produccion de IFN-y por las celulas T CD8+ aisladas a partir de PLN de ratones tratados in vivo con Ig control o antiNKG2D mAb. Tras la estimulacion con PMA y yonomicina in vitro, las celulas T CD8+ IFN-y se detectaron en ratones NOD tratados con clg, mientras que se observaron menos celulas T IFN+ y CD8+ en ratones sometidos a terapia de anti-NKG2D mAb (Fig. 4f). No obstante, un entendimiento del (de los) mecanismo (s) no es necesario con el fin de realizar y usar la presente invencion.
El bloqueo de NKG2D evita la diabetes en ratones NOD.scid que reciben celulas Transferidas de manera adoptiva de ratones NOD diabeticos
Para dirigir si el bloqueo de NKG2D afecta a las celulas T CD8+ efectoras , las celulas T aisladas de ratones de 16 semanas de edad se transfirieron de manera adoptiva en receptores NOD.scid (que caredan de celulas T y y no desarrollaban diabetes). En el momento de la transferencia , solamente un pequeno porcentaje de las celulas T CD8+ expresaban NKG2D (Fig. 5a). Sin embargo, 5 semanas despues de la transferencia se detectaron un numero sustancial de celulas T CD8+ NKG2D+ en el pancreas, PLN, y bazo en los ratones receptores (Fig. 5a), que sugiere la expansion de celulas T NKG2D+ preexistentes o adquisicion de NKG2D sobre las celulas T
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CD8+ transferidas. Aproximadamente el 15% de las celulas T CD8+ ique infiltran el pancreas en ratones receptores tratados con clg eran NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo, mientras que se encontro de manera significativa que eran menos en los ratones tratados con anti-NKG2D mAb (Fig. 5b, c). NKG2D estaba presente en la mayona de las celulas T CD8+ NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo autorreactivas en los ratones NOD tratados con Ig control, pero no se detecto en los ratones que recibieron terapia anti-NKG2D (Fig 5c). Aunque la diabetes desarrollada en todos los ratones NOD. scid control que recibfan celulas T de ratones NOD diabeticos, ninguno de los ratones tratados con anti-NKG2D desarrollo diabetes mientras que se sometfa a terapia (Fig 5d).
Para determinar si el tratamiento de anti-NKG2D bloqueaba la expansion de celulas T CD8+ patogenas en los ratones receptores NOD.scid, se detuvo el tratamiento de anti-NKG2D mAb despues de 8 semanas, cuando habfan sucumbido a la enfermedad todos los ratones tratados con Ig control. Cuatro semanas despues de la detencion de la terapia de anti-NKG2D, la diabetes desarrollada en la mayona de los ratones NOD.scid que habfan recibido celulas T de donantes NOD diabeticos (Fig. 5d). Ademas, en ese momento existia evidencia de expansion de celulas T CD8+ NRPV7/H-2Kd tetramero positivo NKG2D+ en los ratones NOD.scid (Fig. 5e). Estos resultados indicaron que el tratamiento de antiNKG2D mAb inhibfa la expansion y / o acumulacion de celulas T CD8+ NKG2D+ en el pancreas. La rapida progresion a diabetes en poco tiempo despues de la detencion de la terapia indico que las celulas T efectoras estaban controladas, en lugar de empobrecidas, durante el penodo de tratamiento de anticuerpo.
La terapia de Anti-NKG2D mAb evita la expansion de celulas T CD8+ autorreactivas en el pancreas
El hallazgo de pocas celulas T CD8+ NRP-V7/H-2Kd tetramero positivo en el pancreas de ratones tratados con anti-NKG2D era consistente con la posibilidad de que la terapia de mAb bloqueaba la expansion de las celulas T autorreactivas. Para probar directamente esta hipotesis, celulas T de 8.3 TcR-transgenicos se marcaron con CSFE, transferidas de manera adoptiva a receptores NOD de 10 semanas de edad y se trataron o bien con Ig control o anti-NKG2D mAb (Fig. 6). Antes de la transferencia, celulas T CD8+ donantes de ganglios linfaticos y bazos de ratones NOD 8.3 TcR-transgenicos eran mas de > 90 % NRP-V7/H2Kd tetramero positivo pero no expresaban NKG2D (Fig. 6a). Dos dfas mas tarde, las celulas celulas T CD8+ marcadas con CSFE de 8.3 TcR-transgenicos NOD que infiltran el pancreas de ratones tratados con Ig control expresaron NKG2D (Fig. 6b) y sin embargo ya estaban proliferando, sin dilucion de CSFE se observo en las celulas celulas T transferidas presentes en los ganglios linfaticos pancreaticos o mesentericos (Fig. 6c). Los dfas 4 y 8 despues de la transferencia, las celulas T marcadas con CFSe de 8.3 TcR-transgenicos en el pancreas y ganglios linfaticos pancreaticos, pero no en los ganglios linfaticos mesentericos, de ratones tratados con Ig control mostraron la proliferacion extensiva (Fig. 6c). En un contraste sorprendente, no se detecto NKG2D sobre la superficie celular de las celulas T CD8+ transferidas marcadas con CSFE de 8.3 TcR-transgenicos en el pancreas de ratones NOD tratados con anti-NKG2D mAb (Fig. 6b). Ademas, la expansion de estas celulas en el pancreas se inhibio sustancialmente comparado con los ratones tratados con Ig control (Fig. 6c). De manera interesante, el tratamiento con antiNKG2D mAb tema un efecto mucho mas profundo en la proliferacion de celulas T marcadas con CSFE de 8.3 TcR-transgenicos que infiltran el pancreas comparado con las celulas en los ganglios linfaticos. La expansion de las celulas T endogenas no marcadas con CSFE en el pancreas detectada con NRP-V7/H2Kd tetramero tambien se administro mediante tratamiento con anti- NKG2D mAb, comparado con los ratones tratados con Ig control. La cuantificacion de la proliferacion de las celulas T transferidas de manera adoptiva de 8.3 TcR-transgenicos que infiltran el pancreas en ratones NOD tratados con Ig control y anti-NKG2D mAb indicaron un efecto profundo de la terapia de anti-NKG2D sobre la expansion de las celulas T CD8+ autorreactivas espedficas de antfgeno (Fig. 6d).
Los datos indican que RAE-1 esta presente en los islotes de pancreas prediabeticos de los ratones NOD y que las celulas T CD8+ autorreactivas que infiltran el pancreas expresan NKG2D. El tratamiento con un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-NKG2D no empobrecedor durante la fase prediabetica evitaba completamente la enfermedad mediante la alteracion de la expansion y funcion de las 35 celulas T CD8+ autorreactivas. Estos hallazgos demuestran que NKG2D es esencial para la progresion de la enfermedad y y proporciona una nueva diana terapeutica para la diabetes de tipo I autoinmune. Estos datos directamente implican al receptor de NKG2D en el desarrollo funcional de las funciones efectoras de las celulas T CD8+ patogenas e indican que el anti-NKG2D mAb funciona de manera terapeutica para bloquear las senales mediadas por receptor en la ausencia de l empobrecimiento de las celulas flanqueantes.
Ejemplo 4
Modulacion de la Expresion de la superficie celular de NKG2D mediante ARNsh
Se realizo el siguiente experimento para examinar el efecto del ARN inhibidor en la expresion de NKG2D. El ADN que codifica NKG2D en un vector que contiene un elemento IRES-eGFP se transfecto de manera estable en celulas CHO. Se transfectaron despues las celulas que expresan NKG2D transferidas de manera estable (usando Lipofectamina y procedimientos convencionales) con un ADNc que codifica CD8 de raton (mCD8) y con un plasmido (el vector pCR2.1TOPO de InVitroGen) que contema un ADNc de 22 pares de bases (bp) (5'-ggatgggact agtacacatt cc-3' como se establece en la SEC ID N°:10) homologo a un segmento de NKG2D humano (denominado
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shDNA03). Como un control espedfico para demostrar la especificidad, celulas CHO que expresan NKG2D tambien se transfirieron de manera doble con mCD8 y con un ADNc de 22 pares de bases similar a NKG2D humano pero con 3 nucleotidos mutados (5'-ggatgggatt agtatagatt cc-3' como se establece en la SEC ID N°: 13). Las celulas en los paneles de la izquierda se transfectaron solamente con el plasmido que contiene el ADNc de CD8 de raton (mCD8). Las celulas transfectadas se tineron con anticuerpos monoclonales contra CD8 de raton y contra NKG2D humano y se analizaron mediante citometna de flujo. Se obtuvieron transferencias de puntos bivariadas mostrando la fluorescencia que representa (i) CD8 de raton contra NKG2D humano y (ii) eGFP (fluorescencia verde intnnseca que se produce a partir de la expresion del vector NKG2D-IRES-eGFPhumano) contra NKG2D humano.
Los resultados indicaron, primero, que las celulas T que expresaban CD8 de raton sobre la superficie celular se puede detectar facilmente revelando que se transfirieron con los plasmidos introducidos en las celulas CHO. Ademas, la expresion de NKG2D humano sobre las celulas que expresan el CD8 de raton no estaba afectada por la co-transfeccion con el plasmido CD8 de raton solo o con el plasmido contienen la construccion de NKG2D. Por el contrario, la co- transfeccion con la secuencia de NKG2D homologa sustancialmente evito la expresion de NKG2D.
Ejemplo 5
Modulacion de NKG2D de superficie celular mediante el uso de un anticuerpo Monoclonal Anti-NKG2D
Se realizaron los siguientes experimentos para la evaluacion de la capacidad de un anticuerpo monoclonal dirigido contra NKG2D para modular la expresion en la superficie celular de NKG2D.
Se tino una lmea celular de NK humana (NKL) durante 30 min sobre hielo con una lgG control conjugada a biotina (clg bio) o con NKG2D mAb anti- humano de raton conjugado a biotina (clon 149810 de R&D Systems), se lavo y se incubo una alfcuota, y se incubo una alfcuota durante toda una noche a 37°C. Las celulas se tineron con estreptavidina conjugada a aloficocianina -o bien antes del cultivo (0 h) o despues de cultivo (16 h), y y se analizaron posteriormente mediante citometna de flujo. La intensidad de fluorescencia media (unidades arbitrarias) de celulas tenidas con anti-NKG2D antes del cultivo era 186 comparado con 61 despues del cultivo, lo que indica una disminucion del 67% en la expresion de NKG2D sobre la superficie celular de las celulas NK tratadas con anti- NKG2D mAb durante 16 horas.
Se cultivaron celulas NKL durante 16 h a 37°C con o bien IgG o con IgG anti-humano NKG2D de raton (clon 149810 de R y D Systems). Al final de la incubacion, se lavaron las celulas y se trataron con medio acido a pH 3,5 durante 15 min para retirar el anticuerpo de superficie. Las celulas se tineron despues con anticuerpo anti- NKG2D seguido de anticuerpo secundario de IgG anti-raton de cabra marcado con PE para detectar NKG2D. La Figura 12 muestra que este anticuerpo anti-NKG2D es eficaz en la estimulacion de la internalizacion de NKG2D de superficie sobre estas celulas humanas.
Ejemplo 6
El bloqueo de NKG2D evita el rechazo de Injerto de Medula Osea Parental en ratones F1
Se realizaron los siguientes experimentos para ensayar el efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de resistencia (rechazo de injertos de medula osea parental por los receptores F1) en un sistema de modelo animal, ratones (C57BU6 x BALB/c) F1 (CB6F1).
Ratones
Se compraron ratones C57BU6, BALB/c, y CB6F1 de aproximadamente 6 semanas de edad en el National Cancer Institute Animal Program (Frederick, MD). Se generaron ratones RAE-1 £ transgenicos y se retrocruzaron en el antecedente C57BU 6 (Ehrlich et al., observaciones no publicadas). Ratones DAP12-/- en el antecedente
C57BU6 (retrocruzados 9 generaciones) se dewscribieron anteriormente (Bakker et al., Immunity, 13: 345 - 353,2000), y se generaron DAP1 0-/- a partir de celulas del tronco embrionario C57BU6 (Phillips et al., observaciones no publicadas). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las grnas del Comite UCSF sobre la Investigacion de Animales.
Reactivos, Citoquinas y Anticuerpos
Se genero Anti-raton NKG2D mAb, clon CX5 (isotipo IgG1 de rata mediante la inmunizacion de ratas con protema NKG2D de raton purificada, como se ha descrito previamente (Ogasawara et al., Immunity, 18: 41 - 51, 2003). Se produjo Anti-raton NKG2D, clon 191004 (isotipo IgG2a de rata), a partir de un hibridoma que se produce de la fusion de un mieloma de raton con celulas B a partir de una rata inmunizada con el dominio de raton NKG2D extracelular (R y D Systems, Minneapolis, MN). Todos los anti-NKG2D mAbs reconocen el dominio extracelular NKG2D bloquean de manera eficaz y la union de NKG2D a sus ligandos. Para la inyeccion in vivo, se usaron anti-
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NKG2D mAb CX5 y anti-NK1.1 mAb PK136 purificados que no conteman endotoxina detectable (< 0,3 pg/inyeccion). El anti-NKG2D mAb CX5 es un anticuerpo bloqueante que no empobrece las celulas NK o celulas T que llevan NKG2D -cuando se inyectan in vivo (Ogasawara et al., Immunity, 20, 757 - 7567, 2004; Lodoen et al., J Exp Med, 197: 1245 - 1253, 2003); y Lodoen et al., J Exp Med, 200: 1075 - 108, 2004). Se compro IgG control de rata en Sigma (S1. Louis, MO). Se generaron Anti-raton pan-RAE-1 mAb (clon 186107, isotipo IgG2b de rata), anti- raton H60 mAb (clon 205310) y anti-raton MULT1 mAb (clon 237104) como se ha descrito (Lodoen et al., supra, 2003; y Lodoen et al., supra, 2004). Se compraron otros anticuerpos en BD PharMingen o eBiosocience (San Diego, CA).
Trasplante de medula osea
Se trasplanto medula osea murina como se ha descrito anteriormente (George et al., J Inmunol, 163: 1859 - 1867, 1999). En resumen, se realizaron tratamientos de mAb (200 pg/raton) 2 dfas antes de la transferencia de la medula osea, y se trataron los receptores con poli I:C (Sigma, 200 pg/raton) para activar el rechazo de injerto mediado por celulas NK un dfa antes de la inyeccion de celulas de medula osea (Murphy et al., J Exp Med, 166: 1499 - 1509, 1987). El dfa 0 se irradiaron los ratones mediante exposicion a dosis letales (11 Gy) de irradiacion 137CS gamma, y despues 4 x 106 de celulas BM se inyectaron por via intravenosa. Cinco dfas despues de la transferencia a los ratones se les proporciono 26 pg de 5-fluoro-2'-deoxyuridina (Sigma, St. Louis, MO) por via intravenosa para suprimir la smtesis de timidina endogena (George et al., supra, 1999). Treinta minutos mas tarde, a los ratones se les proporciono 3 p Ci de 5-[1251]yodo-5 2'-deoxiuridina (Amersham Life Science, Arlington Heights IL) por via intravenosa. El dfa 6, se retiraron los bazos de los ratones receptores y se contaron con un contador gamma.
Generacion de ratones BM quimericos
En resumen, 1x107 de celulas Ly5.2 B6 BM se transfirieron por via intravenosa en celulas NK empobrecidas y ratones receptores irradiados (dosis absorbida de radiacion = 11 Gy), como se ha descrito previamente (Ogasawara et al., Nature, 391 :701-703, 1998). Durante la reconstitucion, se mantuvieron los ratones en antibioticos.
Preparacion de celulas NK
Las celulas NK se enriquecieron como se ha descrito previamente (Ogasawara et al., J Inmunol, 169: 3676 - 3685, 2002). En resumen, se incubaron celulas de bazo con anti-raton CD4 mAb (clon GK1.5) y anti-raton CD8 mAb (clon 53-6.7), y despues se mezclaron estas celulas con perlas magneticas recubiertas con anti-raton Ig y anti-rata Ig de cabra (Advanced Magnetic, Inc, Cambridge, MA). CD4, CD8, y se retiraron las celulas Ig (slg)- positivo de superficie mediante aislamiento de celulas magnetico.
Analisis de citometria de flujo
Se uso una protema de fusion que contiene el dominio extracelular de raton NKG2D condensado a IgG1 Fc humano (mNKG2D-lg) para detectar ligandos de NKG2D (Cerwenka et al., Immunity, 12:721 - 727,2000). Se uso un fragmento de IgG Fcy anti-humana de cabra (Jackson InmunoResearch, West Grove, PA) como un reactivo de segunda etapa. Las celulas (1 x 106) se tineron con 0,5 pg de mNKG2D-lg y con 0,25 pg de otros mAbs. Para determinar que ligandos de NKG2D se expresaban, se tineron celulas con un anti-pan RAE-1 mAb biotinilado, que reconoce las cinco protemas RAE-1 conocidas (es decir, RAE-1 a, p, y, 5 y £,) anti-H60 mAb biotinilado o anti- MULT1 mAb, estreptavidina conjugada a PE o estreptavidina conjugada a APC se uso para detectar mAbs biotinilados. Para la deteccion de NKG2D, celulas (-1x106) se tineron con 0,25 pg de anti-NKG2D mAb biotinilado o marcado con PE (clon 191004). Se tineron conjuntamente las celulas con anti- CD43, anti- Ly6C/G, antiC011 c, anti- B220, anti-C03, anti-TER119, anti-NK1.1 y anti- CD49d (OX5) mAbs. Se incubaron las celulas con mAbs durante 20 min y se lavaron con PBS que contiene NaN3 al 0,01 %. Se analizaron las celulas mediante el uso de un citometro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Se activaron poblaciones de linfocitos viables basandose en los perfiles de dispersion directos y laterales y mediante la falta de yoduro de propidio.
Ensayo Citotoxico
Se realizaron ensayos de citotoxicidad redirigidos mediados por anticuerpo monoclonal como se ha descrito previamente (Lanier et al., J Inmunol, 141 :3478 - 3485, 1988). Se marcaron las celulas T diana con 50 pCi de Na2 (51 Cr) O4 durante 2 h a 37°C en medio RPMI - 1640 que contiene un 10% de FCS, se lavo tres veces con medio, y se uso en ensayos de citotoxicidad. Se mezclaron celulas diana marcadas con 51 Cr (5 x 103) y celulas efectoras en pocillos con fondo en forma de U de una placa de microtitulacion de 96 pocillos en las relaciones efector/diana (EIT) indicadas, por triplicado. Despues de un penodo de incubacion de 4 h, se recogieron los sobrenadantes sin celulas y se midio la radiactividad en un contador Micro-beta (Wallac, Turku, Finlandia). La liberacion espontanea era menor que el 15% de la liberacion maxima. Se calculo el porcentaje de liberacion de 51 Cr espedfica de acuerdo con la siguiente formula: % de lisis espedfica = liberacion (experimental - espontanea) x
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Expresion de ligandos NKG2D en celulas de raton BM
Los genes que codifican ligandos de NKG2D son polimorficos; ratones BALB/c (B/c) tienen genes RAE-1a, p y y, mientras que los ratones C57BU6 (B6) poseen los genes RAE-1u y £ (Cerwenka y Lanier, Tissue Antigens, 61 :335 - 343,2003). De manera similar, ratones B/c pero no B6 expresan H60 (Malarkannan et al., J Inmunol, 161: 3501 - 3509, 1998). Se analizaron las celulas BM aislados de ratones B/c, B6 y (BALB/c x C57BU6) F1 (CB6F1) para determinar si los ligandos de NKG2D se expresan en celulas BM. Se tineron las celulas con una protema de fusion de raton NKG2D-lgG Fc y se analizo mediante citometna de flujo. Se detectaron bajos niveles de ligandos de NKG2D sobre la superficie de celulas recientemente aisladas B/c BM, pero no de celulas B6 BM (Fig. 13a). Con el fin de determinar que ligandos de NKG2D se expresaban, se tineron las celulas BM con anticuerpos monoclonales anti- pan RAE-1, anti-H60 y antiMULT1 (mAbs). Se expresaron RAE-1 y H60 a bajos niveles en celulas B/c BM recientemente aisladas, mientras que no se detecto MULT1 (Fig 13b). Por el contrario, RAE-1 no se detecto en esplenocitos recientemente aislados de ratones B/c, B6 o CB6F1 ratones.
Estudios anteriores han probado que las celulas NK en receptoers F1 son capaces de rechazar injertos de medula osea parental (Kiessling et al., Eur J Inmunol, 7: 655 - 663, 1977; Lotzova et al., Transplantation, 35: 490 - 494, 1983; Murphy et al., J Exp Med, 165, 1212-1217, 1987; y Murphy et al., Eur J Inmunol, 20: 1729-1734, 1990). Los inventores contemplaban que las celulas B/c BM que repueblan el bazo en un receptor CB6F1 irradiado expresa los ligandos NKG2D. De este modo durante el desarrollo de la presente invencion, los ratones receptores CB6F1 se trataron previamente con anti- NK1.1 mAb para empobrecer las celulas NK residentes y por lo tanto evitan el rechazo de las celulas B/c BM trasplantadas. Como un control, un grupo de ratones CB6F1 irradiados se reconstituyeron con celulas CB6F1 BM singenicas. Siete dfas despues del injerto, las celulas hematopoyeticas que repueblan los bazos de los ratones CB6F1 se aislaron y se analizaron para evaluar la expresion de ligandos de NKG2D. Como se muestra en la Fig. 13c, se detectaron los ligandos de NKG2D sobre las celulas hematopoyeticas aisladas de los bazos de ratones B/c BM -> CB6F1, pero no sobre las celulas aisladas de los bazos de ratones CB6F1 BM -> CB6F1. Las celulas B/c hematopoyeticas que reconstituyen los bazos de los receptores CB6F1 irradiados predominantemente expresaban RAE-1, y no H60 o MULT1 (Fig. 13d).
Con el fin de identificar la poblacion de celulas hematopoyeticas que expresan RAE-1, las celulas aisladas de los bazos de receptores CB6F1 BM -> CB6F1 y B/c BM -> CB6F1 se tineron con mAbs con marcadores de linaje hematopyeticos. El dfa 7 despues del trasplante, se detecto RAE-1 sobre la mayona de las celulas aisladas de los bazos de receptores CB6F1 BM -> CB6F1. Por el contrario, no se detecto RAE-1 sobre una proporcion sustancial de celulas de los bazos de receptores CB6F1 BM -> CB6F1. Esencialmente todas las celulas RAE-1- positivas aisladas de los receptores B/c BM -> CB6F1 expresaban CD43 (Fig. 13e). RAE-1 tambien estaban presentes sobre la mayona de las celulas que expresan Gr-1 asociado a protema de granulocitos (Ly-6C/G) y el marcador CD11 b asociado a celulas mieloides (Mac-1). Solamente una fraccion menor de celulas positivas B220 (marcador asociado a celulas B) y celulas positivas Ter119 (un marcador asociado a eritrocitos) expresaban RAE-1, y no se detecto RAE-1 en las celulas T CD3+ (Fig. 13e). Se contemplo que las celulas B y celulas T detectadas en los bazos eran celulas residuales resistentes a radiacion de origen de huesped, debido a que es diferente de las celulas T o celulas B se habnan desarrollado a partir de las celulas de medula osea del donante es menor que una semana despues del trasplante. Se detecto RAE-1 sobre un pequeno subconjunto de celulas que expresan c-kit y Sca-1, aunque la mayona de las celulas RAE-1 -positivas no teman estos marcadores (Fig. 13f). El estado de proliferacion de las celulas que expresan RAE-1 en los receptores B/c BM -> CB6F1 se evaluo mediante la inyeccion de BrdU en estos ratones a las 2 hr y 12 hr antes de la recogida de las celulas de bazo el dfa 7 despues de trasplante. Como se muestra en la Fig. 13g, se detecto facilmente RAE-1 en una fraccion grande (pero no toda) de las celulas progenitoras proliferantes en los bazos de los receptores de trasplante.
En los experimentos iniciales, ratones CB6F1 se trasplantaron con medula osea aislada de donantes B/c. Con el fin de dirigir si RAE-1 se expresa en la progenie de celulas de tronco hematopoyeticas (HSC), se trataron ratones B/c donantes con 5-fluorouracilo (5-FU) antes de la recogida de la medula osea para enriquecer para HSC, y despues se trasplanto medula osea de donantes tratados con 5-FU en receptores CB6F1 que se habfan tratado previamente con anti-NK1.1 mAb para empobrecer las celulas NK de huesped. Las celulas de medula osea recogidas de los donantes tratados con 5-FU no expresaron RAE-1. Cuando las celulas en los bazos de receptores B/c 5-FU BM -> CB6F1 se analizaron el dfa 8 despues de trasplante, esencialmente todas las celulas RAE-1-positivo expresaban bajos niveles de Ly-6C/G, CD11 b y CD43, pero no CD3, Ter119, o B220. Una pequena poblacion de celulas RAE-1 positivo expresaban bajos niveles de c-kit y Sca-1, aunque una mayona de las celulas rAE-1 positivo que carecen de estos marcadores (Fig. 13i). Estos resultados indicaron que la mayona de las celulas B/c progenitoras proliferantes en los receptores CB6F1 empobrecidos con celulas Nk expresan RAE-1.
Despues del desarrollo de la presente invencion, se ha resenado la expresion de los ligandos de NKG2D sobre las celulas de medula osea humanas proliferantes (Nowbakht et al., Blood, publicado de manera electronica el 18 de enero de 2005). De este modo, los inventores contemplan que los experimentos descritos en el presente documento en ratones, son tambien relevantes para los humanos (y otros mairnferos).
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NKG2D esta implicado en la resistencia h^brida
Durante el desarrollo de la presente invencion, el hallazgo que RAE-1 se expreso en las celulas progenitoras proliferantes en los bazos de ratones CB6F1 reconstituidos con medula osea de B/c sugirio a los inventores que NKG2D esta implicado en la resistencia tnbrida. Esto se confirmo mediante la transferencia de celulas B/c BM en ratones CB6F1 irradiado tratados previamente con un anticuerpo control (clg), un anti-NKG2D mAb (CX5) neutralizante, no empobrecedor (Ogasawara et al., Immunity, 20: 757 - 767, 2004), o el anti-NK1.1 mAb (PK136) empobrecedor de las celulas NK. Hematopoyeticas. La reconstitucion de las celulas hematopoyeticas de ratones receptores se evaluo mediante inyeccion de 125IUdR doce horas antes de la recogida de bazos el dfa 7. Los ratones tratados con clg rechazaron las celulas de B/c BM celulas, y consistente con las resenas anteriores (Lotzova et al., Transplantation, 35: 490 - 494, 1983), el empobrecimiento de las celulas NK en ratones CB6F1 evitaban de manera eficaz el rechazo de las celulas de medula osea de B/c, que daban como resultado un incremento sustancial en la incorporacion de la radiomarca en los bazos (Fig. 14a). El anti-NKG2D mAb no empobrecedor, neutralizante tambien incrementaba de manera notable la incorporacion de 125IUdR, comparable con los efectos de celulas NK empobrecedoras.
La capacidad de tratamiento de anti-NKG2D mAb para evitar el rechazo de de las celulas de medula osea de B/c se confirmo mediante el examen de las celulas que repoblan los bazos el dfa 8 despues de transplante. Como se muestra en la Fig. 14b, se detectaron las celulas RAE-1 positivas predominantemente expresaban de manera conjunta CD43, Ly-6C/G, y CD11 b en los bazos de ratones CB6F1 tratados con antiNKG2D mAb. Por el contrario, se recuperaron muchas menos celulas de los ratones tratados con clg y muy pocas de estas celulas expresaron RAE-1. Estos datos indicaron que el rechazo de las celulas RAE-1-positivo de B/c BM en ratones CB6F1 se evita de manera eficaz mediante o bien el empobrecimiento de las celulas Nk o mediante el bloqueo del receptor de NKG2D.
Las celulas NK eliminan las celulas de BM singenicas que expresan altos niveles de RAE-1
La capacidad de tratamiento de anti-NKG2D mAb para bloquear el rechazo de injerto de medula osea parental en receptores F1 provocaban la pregunta de si el reconocimiento de H-2 parental por las celulas NK de F1 se requiere para el rechazo de dependiente de NKG2D o si las celulas NK tambien pueden rechazar las celulas de medula osea singenicas siempre que RAE-1 se exprese a niveles suficientemente altos. De celulas de medula osea CB6F1 que repueblan los receptores CB6F1 singenicos irradiados (Fig. 13c, e) y celulas B6 de medula osea que repueblan los receptores B6 irradiados singenicos expresaban solamente niveles muy bajos de RAE-1 comparado con las celulas de medula osea de B/c de repoblacion (Fig. 13d, e). Por lo tanto, con el fin de evaluar si existe o no la expresion de RAE-1 sobre celulas de medula osea de B6 o CB6F1 provocanan el rechazo de injertos de medula osea singenicos, se generaron ratones transgenicos que expresan RAE-1 £ dirigidos mediante un promotor de p-actin humano, que da como resultado la expresion de RAE-1 £ en todos los tejidos. Como se muestra en la Fig. 15a el nivel de expresion de RAE-1 £ en las celulas de medula osea aisladas recientemente de ratones transgenicos B6 RAE-1 £, es similar a los niveles de RAE-1 presentes en las celulas de medula osea de B/c (Fig. 13d,e).
Se ensayaron celulas de medula osea aisladas recientemente de ratones B6 RAE-1 £ transgenicos como dianas para las celulas NK no transgenicas singenicas activadas por IL-2 NK en un ensayo de citotoxicidad in vitro convencional. Como se muestra en la Fig. 15b, las celulas NK activadas destrrnan las celulas medula osea recientemente aisladas RAE-1 £ transgenicas B6, pero no las celulas de medula osea RAE-1 negativo no transgenicas B6. Se bloqueo la citotoxicidad mediante un anti-NKG2D mAb, demostrando que la destruccion es dependiente de NKG2D. De acuerdo con los resultados in vitro, los ratones B6 no transgenicos irradiados rechazaron las celulas de medula osea de donantes B6 transgenicos de RAE-1 £ transgenicos.
De manera importante, se evito el rechazo en ratones tratados con el anti-NKG2D mAb neutralizante, pero no en los ratones tratados con una Ig control (Fig. 15c). Se obtuvieron resultados similares cuando se cruzaron ratones RAE-1 £ transgenicos B6 con ratones B/c y la medula osea de RAE-1 £ transgenicos CB6F1 se injerto en receptores no transgenicos CB6F1. Las celulas de medula osea de RAE-1 £ transgenicos CB6F1, se diferenciaban de las celulas de medula osea de CB6F1 no transgenicos (Fig. 13c,e), expresaron altos niveles de of RAE1 £ y se rechazaron por los receptores singenicos no transgenicos CB6F1 (Fig. 15d). Se evito el rechazo mediante la administracion de anti- NKG2D mAb neutralizante no emprobrecedor o mediante el empobrecimiento de las celulas NK con anti-N K1.1 mAb. De manera colectiva, estos hallazgos demuestran que las celulas NK de B6 y CB6F1 pueden rechazar las celulas de medula osea H-2 identicas, siempre que las celulas de medula osea expresen RAE-1.
DAP10 y DAP12 en rechazo de BM mediada por NKG2D
En ratones, el ayuste de ARN alternativo de transcripciones de NKG2D genera dos isoformas de protemas llamadas NKG2D-S y NKG2D-L. NKG2D-L se expresa predominantemente en las celulas NK de reposo y se asocia con la protema adaptadora DAP 10 mientras que NKG2D-S se induce mediante la activacion de las celulas NK y se asocia o bien con Dap 10 o DAP12 (Diefenbach et al., Nat Inmunol, 3: 1142 - 1149,2002). celulas de medula osea
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de ratones RAE-1 £ transgenicos B6 se transplantaron en receptores irradiados de tipo salvaje, DAP1 0-1-, y DAP12- 1- C57BU6, con el fin de determinar si DAP10 o DAP 12 o ambos adaptadores estaban implicados en el rechazo mediado por NKG2D. Los ratones se inyectaron con 125IUdR el dfa 5 y se recogieron los bazos y se contaron el dfa 6. Comparado con los ratones B6 de tipo salvaje, los ratones DAP10- / B6 demostraron una deficiencia significativa en el rechazo de injerto de medula osea de RAE-1 £ transgenicos B6 (Fig. 16a). Por el contrario, los receptores DAP12-1- B6 rechazaron la medula osea de RAE-1 £ transgenicos B6 de manera mas eficaz que los ratones DAP10-I- B6, aunque ligeramente menos que los ratones B6 de tipo salvaje (Fig. 16b). Los ratones de tipo salvaje, DAP10 -/- y DAP12-/- B6 todos confeccionados para rechazar el inyerto de medula osea de RAE-1 £ transgenicos B6 cuando se trata con anti-NK1.1 mAb de empobrecimiento con el anti-NKG2D mAb neutralizante no empobrecedor. Estos resultados indican un papel predominante de DAP1 O, y un papel menor de DAP12, en el rechazo de medula osea dependiente de NKG2D. No obstante, no es necesaria una comprension del mecanismo con el fin de realizar y usar la invencion.
Resistencia h^brida detective en ratones transgenicos in RAE-1 £
La activacion de las celulas NK de ratones NOD induce la expresion de RAE-1, que da como resultado la modulacion dependiente de ligando de NKG2D en las celulas NK (Ogasawara et al., Immunity, 18, 41 - 51,2003). El analisis de la expresion de NKG2D sobre la superficie de las celulas NK de los ratones RAE-1 £ transgenicos B6 revelo una expresion reducida de NKG2D cuando se compara con las celulas NK de ratones de tipo salvaje (Fig. 17a). Aunque la cantidad de NKG2D en los RAE-1 £ transgenicos B6 se disminuyeron de manera sustancial, el numero de celulas NK en los bazos y la expresion de NK1.1, Ly-49D, Ly-49A, Ly-49C/I, Ly-49F/I/C/H, 50 y Ly-49G2 en las celulas NK eran similares a las nK celulas de tipo salvaje. Para examinar si la funcion de NKG2D esta alterada en las celulas NK de RAE-1 £ transgenicos, se realizo un ensayo de citotoxicidad redirigida de anticuerpos usando clg, anti-NKG2D mAb y anti-NK1.1 mAbs. Aunque la actividad dependiente de NK1.1 de celulas Nk de RAE-1 £ transgenicos era identica a las celulas NK de B6 de tipo salvaje, se altero la citotoxicidad dependiente de NKG2D en celulas NK de RAE-1 £ transgenicos (Fig. 17b).
El transgen RAE-1 £ se dirige mediante un promotor de accion p es estos ratones transgenicos, y por lo tanto, las celulas NK de estos animales expresan de manera conjunta tanto el ligando como el receptor. Con el fin de determinar si las celulas NK de tipo salvaje (non-transgenicas) estan inactivadas in vivo mediante la exposicion constante a ligandos NKG2D, se generaron quimeras de medula osea mediante trasplante de medula osea de B6 congenicos Ly5.2 de tipo salvaje en receptores RAE-1 £ B6 (Ly5.1) irradiados de manera letal. Tres meses despues del trasplante el numero de celulas ,NK en los bazos y la expresion de NK1.1 (Fig. 17c), Ly-49D, Ly-49A, Ly- 49 C/I, Ly-49F/I/C/H y Ly-49G2 en ratones transgenicos Ly5.2 BM ->RAE-1 £ eran similares a a los que habfa en ratones B6 Ly5.2 BM -> de tipo salvaje. Por el contrario, la expresion de NKG2D en las celulas NK disminuyo drasticamente en ratones Ly-5.2 bM -> RAE-1E transgenicos (Fig. 17c). Consistente con los niveles disminuidos de NKG2D sobre las celulas Nk, Se altero la actividad citotoxica dependiente de NKG2D -en ratones Ly-5.2 BM - > RAE-1 £ transgenicos, como se determina mediante un ensayo de citotoxicidad in vitro redirigido de anticuerpos (Fig. 17d). Los inventores tambien investigaron si celulas de rAE-1 £ transgenicos B6 BM se rechazaban en receptores Ly-5.2 B6 BM -> RAE-1 EB6 transgenicos. Como se esperaba, celulas NK en los ratones Ly5.2 B6 de tipo salvaje -> B6 de tipo salvaje rechazaron las celulas de RAE-1 £ transgenicos BM de manera eficaz (Fig. 17e). Por el contrario, las celulas NK que se desarrollaban en ratones Ly-5.2 B6 BM -> RAE-1 E transgenicos no rechazaban las celulas de RAE-1 £ transgenicos BM (Fig. 17). Estos hallazgos indicaban que la modulacion de NKG2D de celulas NK esta provocada por la interaccion con el receptor RAE-1 resistente a la radiacion que expresa las celulas in vivo, y que esto da como resultado la alteracion de la funcion de NKG2D in vivo. Sin embargo, un entendimiento del mecanismo no es necesario con el fin de hacer uso la invencion.
Para investigar si la resistencia de hubridos F1 esta afectada por los niveles disminuidos de NKG2D en celulas NK en los ratones RAE-1 £ transgenicos B6, los ratones transgenicos se cruzaron con ratones B/c, y los ratones RAE-1 £ transgenicos CBF1 se ensayaron para evaluar su capacidad de rechazar las celulas B/c BM parentales. A diferencia de los ratones CB6F1 de tipo salvaje, los ratones RAE-1 £ transgenicos CB6F1 no rechazaban las celulas B/c BM (Fig. 17f). ademas, el tratamiento con anti-NK1.1 mAb o anti- NKG2D mAb no afectaron la incorporacion de 125IUdR de celulas B/c BM en los receptores RAE-1E transgenicos CB6F1. Sin embargo, las celulas NK empobrecedoras o que bloquean NKG2D permitieron el injerto de las celulas de medula osea de B/c en receptores CB6F1 de tipo salvaje. De este modo como se demuestra en el presente documento, NKG2D esta implicado como un componente importante en la resistencia de hfbridos F1.
Ejemplo 7
Bloqueo de NKG2D para la Prevencion y Tratamiento de Artritis reumatoide
Esto se puede ensayar en un modelo animal cronico de artritis donde NKG2D se puede demostrar que esta presente en el sitio de la inflamacion. Un ejemplo de tal modelo es la artritis inducida por colageno cronica (Malfait et al., Artritis y Rheumatism 44: 1215 - 1224, 2001).
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Recientemente, celulas T CD4+ CD28- en la sangre periferica y tejidos sinoviales de pacientes de artritis reumatoide humanos se encontro que expresan NKG2D, mientras que los sinoviocitos inflamados se encontro que expresan de manera aberrante los ligandos MIC de NKG2D (Groh et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100: 9452 - 9457,2003). De este modo, los inventores contemplan que las composiciones y procedimientos para bloquear NKG2D descritos en el presente documento son tambien adecuados para la prevencion y tratamiento de artritis reumatoide. Se realizaron los siguientes experimentos para ensayar el efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de artritis reumatoide (RA) en un sistema de modelo animal, el raton DBA/1.
En resumen, la artritis inducida por el colageno de tipo II (CII) (CIA) se induce en ratones DBA/1 de 6 - 7 semanas de edad mediante inyeccion intradermica en la base de la cola 100 |jg de colageno II bovino suplementado con 2,0 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis H37RA emulsionado en adyuvante de Freund completo, como se ha descrito (Seo et al., Nat Med, 10: 1088 - 1094,2004). La inflamacion de las articulaciones se puntuo de 1 a 4,con una puntuacion maxima de 16 por raton. la gravedad clmica de artritis se clasifica como sigue: 0, normal; 1, inflamacion ligera y / o eritema; 2, inflamacion eritematosa sustancial; 3, inflamacion eritematosa sustancial mas ligera rigidez de las articulaciones; o 4, laxitud (Vease, por ejemplo, Williams et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89: 9784 - 9788, 1992). Cada miembro se clasifica, permitiendo una puntuacion clmica maxima de 16 para cada animal. La inflamacion de las patas traseras se mide con un par de calibres.
Se inyectan ratones con 200 jg de un anti-NKG2D mAb o un mAb IP emparejado a isotipo control , los dfas 0, 2, 4, 6 y 8 o los dfas 0, 3, 7 y 10 despues de la inmunizacion. Los inventores contemplan que el tratamiento con IgG control da como resultado el desarrollo de artritis grave que comienza aproximadamente 28 d despues de la inmunizacion (por ejemplo, gravedad mayor que10; la incidencia mayor que el 80%, y el grosor de la pata mayor que 3,5 mm). Por el contrario, el tratamiento con anti-NKG2D mAb se espera que de como resultado la supresion de la enfermedad, que se manifiesta como una disminucion de la gravedad e incidencia de artritis, asf como una reduccion del grosor de la pata e histopatologfa de la articulacion reducida con relacion a los animales tratados con mAb control (por ejemplo, la gravedad menor que 10, preferiblemente menor que 5 y lo mas preferiblemente menor que 2; la incidencia menor que el 80%, preferiblemente menor que el 50%, y lo mas preferiblemente menor que el 20%; y grosor de la pata menor que 3,5 mm, preferiblemente menor que 3.0 mm, y lo mas preferiblemente menor que 2,5 mm).
Para tratar CIA establecida, se inyectan ratones los dfas 28, 30, 32, 34 y 36 o los dfas 28, 31, 35 y 38 despues de la inmunizacion. Los ratones se dividen despues en dos grupos con puntuaciones medias de artritis iguales el dfa 28 despues de la inmunizacion, y se trataron con mAb control, o anti- NKG2D mAb los dfas 28, 30, 32, 34 y 36 despues de la inmunizacion. Se contempla que la artritis se invierte solamente en el grupo tratado con anti-NKG2D mAb (por ejemplo, de reduccion en la gravedad de la enfermedad, incidencia, grosor de la para e histopatologfa de la articulacion). Ademas, los inventores contemplan que el tratamiento con anti-NKG2D mAb dara como resultado una reduccion de los numeros de celulas que expresan NKG2D presentes en las articulaciones de sujetos artnticos, asf como una reduccion INEN los niveles de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, TNF-a, IL-15, etc.) en el fluido sinovial.
Ejemplo 8
Bloqueo de NKG2D para la Prevencion y Tratamiento de Enfermedad celiaca
MIC se expresa de manera intense en la superficie del epitelio del intestino en los pacientes de Enfermedad celfaca (CD), que a su vez activan de manera conjunta los linfocitos T intraepiteliales (IEL) mediante NKG2D, que conduce a la citolisis de dianas de celulas epiteliales (Meresse et aL, Immunity, 21 :357 - 366,2004; y Hue et aL, Immunity, 21 :367 - 377, 2004). Los inventores contemplan que las composiciones y procedimientos para bloquear NKG2D descritos en el presente documento son tambien adecuados para la prevencion y tratamiento de enfermedad celfaca. El efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) se ensayara en un modelo de animal pequeno adecuado, tal como, por ejemplo, cualquiera de los dos siguientes modelos de raton de colitis: TNB inducido (Chin et aL, Digestive Diseases and Sciences 39: 513 - 525,1994) o modelo de celulas T transferidas (Powrie etal., Int Inmuno15:1461 etseq., 1993) en ratones SCID.
Todos los encabezados y sub-encabezados se usan en la presente por conveniencia solamente y no deben considerarse limitativos de la invencion de ninguna manera. Cualquier combinacion de los elementos anteriormente descritos en todas sus posibles variaciones esta abarcado por la invencion a menos que se indique lo contrario en la presente o se contradiga claramente de otra manera por el contexto.
El uso de los terminos "un" y "el" y referentes similares en el contexto de la descripcion de la invencion (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) debe entenderse que cubre tanto el singular como el plural a menos que se indique lo contrario en la presente o se contradiga claramente por el contexto. La enumeracion de intervalos de valores en la presente se pretende meramente que sirva como un metodo abreviado de referirse individualmente a cada valor separado dentro del intervalo, a menos de que se indique los contrario en la presente, y cada valor separado se incorpora en la descripcion como si se citase individualmente en la presente. A
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
menos que se indique lo contrario, todos los valores exactos proporcionados en la presente son representativos de los valores aproximados correspondientes (por ejemplo todos los valores ejemplares exactos proporcionados con respecto a un factor o medicion particulares puede considerarse que tambien proporcionan una medicion aproximada correspondiente, modificada por "aproximadamente", donde sea apropiado). Todos los metodos descritos en la presente pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario o se contradiga de otra manera claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "como") proporcionados en la presente, se pretende que meramente aclaren mejor la invencion y no suponen una limitacion al alcance de la invencion a menos que se reivindique lo contrario. Ningun lenguaje en la descripcion debe entenderse que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial para la puesta en practica de la invencion. La cita de documentos de patente en la presente se hace por conveniencia solamente y no refleja ningun punto de vista de la validez, patentabilidad, y/o ejecutabilidad de dicho documetno de patente. Una descripcion en la presente de un aspecto o realizacion de la invencion usando terminos como "comprende", "tiene", "incluye", o "contiene" un elemento particular se pretende que proporcione apoyo para un aspecto o realizacion de la invencion que "consiste de", "consiste esencialmente de", o "comprende sustancialmente" ese elemento particular, a menos que se indique lo contrario o se contradiga claramente por el contexto. Esta invencion incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia recitada en las reivindicaciones adjuntas a la presente segun lo permitido por la ley aplicable.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA
<120> MODULACION DE NKG2D
<130> P055654EP
<140> EP-10__________._
<141> 2005-04-05
<150> US-60/559,919 <151> 2004-04-05
<150> US-60/576,242 <151> 2004-06-01
<150> US-60/659,678 <151> 2005-03-07
<150> EP-09008665.3 <151> 2005-04-05
<150> EP-05761976.9 <151> 2005-04-05
<160> 13
<170> SeqWin2010, version 1.0
<210> 1 <211> 699 <212> ADN <213> Mus musculus
<400> 1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
atggcattga ttcgtgatcg aaagtctcat cactcagaga tgagcaaatg gacctcaagc cagcaaagtg ggatacttct caagaacaac agaaacaaag actaccagtc aacctggaga aaatggtatc ataagaggaa gataccctat aaaatatctc caatgttcgt tgttcgagtc cttgctatag ccttggcaat cttaacacat tgatgtggct tgccattttc aaagagacgt ttcagccagt aaggaagtcc cagtttcctc aagagagggc tactgtggcc catgccctaa tgtcacagaa acaactgtta ccaatttttt aatgaagaga aaacctggaa gcttcctgtt tgtctcaaaa ttccagcctt ctgaagatat acagtaaaga ttcttaaagc tggttaagtc ctatcactgg atgggactgg tccagatccc tcctggcagt gggaagatgg ctcctctctc tcatacaatc agttaactct ccaaaaggat cctgtgctgt ctatggctca agctttaagg cttacacaga aatctaaaca cgtacatctg catgaaaagg gcggtgtaa
<210>2 <211> 232 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>2
ccataattac
60
attagcacta
120
agaaaaactc
180
tcgattcacc
240
attgtgcaac
300
caactggata
360
ccagagccaa
420
agaacaggat
480
agcaaatggc
540
ggtggaaata
600
agactgtgca
660
699

Met Ala Leu lie Arg Asp Arg Lys 1 5
Cys His Asn Tyr Asp Leu Lys Pro 20

Gin Gin Lys Gin Arg Leu Ala Leu 35 40

Gly lie lie Arg Gly Arg Tyr Pro 50 55

Met Phe Val Val Arg Val Leu Ala 65 70

Ser His His Ser Glu Met Ser Lys 10 15

Ala Lys Trp Asp Thr Ser Gin Glu 25 30
Thr Thr Ser Gin Pro Gly Glu Asn 45
lie Glu Lys Leu Lys lie Ser Pro 60
lie Ala Leu Ala lie Arg Phe Thr 75 80
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Leu
Asn Thr Leu Met Trp Leu Ala lie Phe Lys Glu Thr Phe Gin Pro
85 90 95
Val
Leu Cys Asn Lys Glu Val Pro Val Ser Ser Arg Glu Gly Tyr Cys
100 105 110
Gly
Pro Cys Pro Asn Asn Trp lie Cys His Arg Asn Asn Cys Tyr Gin
115 120 125
Phe
Phe
Asn Glu Glu Lys Thr Trp Asn Gin Ser Gin Ala Ser Cys Leu
130 135 140
Ser
Gin Asn Ser Ser Leu Leu Lys lie Tyr Ser Lys Glu Glu Gin Asp
145
150 155 160
Phe
Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val Gin lie
165 170 175
Pro
Ala Asn Gly Ser Trp Gin Trp Glu Asp Gly Ser Ser Leu Ser Tyr
180 185 190
Asn
Gin Leu Thr Leu Val Glu lie Pro Lys Gly Ser Cys Ala Val Tyr
195 200 205
Gly
Ser Ser Phe Lys Ala Tyr Thr Glu Asp Cys Ala Asn Leu Asn Thr
210 215 220
Tyr
lie Cys Met Lys Arg Ala Val
225
230
<210>3 <211> 651 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400>3

atggggtgga ttcgtggtcg gaggtctcga cacagctggg agatgagtga atttcataat 60

tataacttgg atctgaagaa gagtgatttt tcaacacgat ggcaaaagca aagatgtcca 120

gtagtcaaaa gcaaatgtag agaaaatgca tctccatttt ttttctgctg cttcatcgct 180

gtagccatgg gaatccgttt cattattatg gtagcaatat ggagtgctgt attcctaaac 240

tcattattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 300

aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 360

tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 420

gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 480

ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 540

ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 600

gaaaactgtt caactccaaa tacatacatc tgcatgcaaa ggactgtgta a 651
<210>4 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Met Gly Trp lie Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser 15 10 15

Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr 20 25 30

Arg Trp Gin Lys Gin Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu 35 40 45
Asn
Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe lie Ala Val Ala Met Gly
50 55 60
lie
Arg Phe lie lie Met Val Ala lie Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn
65
70 75 80
Ser
Leu Phe Asn Gin Glu Val Gin lie Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
85 90 95
Gly
Pro Cys Pro Lys Asn Trp lie Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gin
100 105 110
Phe
Phe
Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gin Ala Ser Cys Met
115 120 125
Ser
Gin Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gin Asp
130 135 140
Leu
Leu
Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His lie
145
150 155 160
Pro
Thr Asn Gly Ser Trp Gin Trp Glu Asp Gly Ser lie Leu Ser
Pro
165 170 175
Asn
Leu Leu Thr lie lie Glu Met Gin Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr
180
185
190

Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr lie Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr 195 200 205

Tyr He Cys Met Gin Arg Thr Val 210 215
<210>5 <211>9 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido mimotopo NRP-V7 <400>5
Lys Tyr Asn Lys Ala Asn Val Phe Leu 1 5
<210>6 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Cebador <400>6
ctagtgccac ctgggaattc a 21
<210>7 <211> 24 <212>ADN <213> Cebador
<400> 7
catcattagc tgatctccag ctca 24
<210>8 <211> 38 <212> ADN <213> Cebador
<400> 8
catcagtgac agttacttct tcaccttcta cacagaga 38
<210>9 <211>4 <212> PRT
<213> motivo de union p85 fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) de consenso <400> 9
Tyr lie Asn Met 1
<210> 10 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> shADN03 <400> 10
ggatgggact agtacacatt cc 22
<210> 11 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Secuencia codificante de ARNi <400> 11
tggcagtggg aagatggctc c 21
<210> 12 <211> 29 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Secuencia codificante de ARNi <400> 12
cagaagggag actgtgcact ctatgcctc 29
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 13 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> 22 bp ADNc similar a NKG2D humano <400> 13
ggatgggatt agtatagatt cc 22

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un agente que es espedfico para NKG2D y es capaz de alterar la expansion de celulas T NKG2D+ o celulas NK sin empobrecer dichas celulas, para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide o enfermedad de Crohn, en donde el agente es un anticuerpo o un fragmente de anticuerpo.
  2. 2. El agente para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el agente aumenta la tasa a la que se internaliza la superficie celular de NKG2D.
  3. 3. El agente para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el agente reduce la activacion de NKG2D inducida por ligando de leucocitos que expresan NKG2D.
  4. 4. El agente para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente reduce la senalizacion a traves del complejo KG2D-ligando de NKG2D.
  5. 5. El agente para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el agente es un humano o anticuerpo humanizado.
  6. 6. El agente para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide.
  7. 7. El agente para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento de enfermedad de Crohn.
  8. 8. El agente para el uso en el tratamiento de artritis reumatoide de acuerdo con la reivindicacion 6, en combinacion con un agente adicional seleccionado del grupo que consiste de uno o mas de: metotrexato; un anticuerpo anti-TNF- a; una protema de fusion TNF-a receptor-Ig; un anticuerpo anti-IL-15, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAIO); y un farmaco antirreumatico que modifica la enfermedad (OMARO).
  9. 9. El agente para el uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde el agente adicional se selecciona del grupo que consiste de infliximab, adalimumab, y rituximab.
  10. 10. El agente para el uso en el tratamiento de la enfermedad de Crohn de acuerdo con la reivindicacion 7, en combinacion con un agente adicional seleccionado del grupo que consiste de uno o mas de: aminosalicilatos; corticosteroides; inmunomoduladores; antibioticos; infliximab; y adalimumab.
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