JP2012510468A - 安定な抗体組成物およびこれを安定させるための方法 - Google Patents

安定な抗体組成物およびこれを安定させるための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、鉄が、ヒスチジンの存在下で、ヒンジ領域における切断のためラムダ軽鎖を含有する組換え完全ヒトＩｇＧ分子の断片化の増大をもたらすという観察に基づいて、ラムダ軽鎖を含む免疫グロブリンの分画を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明は、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに結合している抗体またはこの抗原結合部分を含みおよびヒスチジンを含む緩衝液系を含む水性医薬製剤を更に提供し、この製剤は、断片化に対する増強した耐性等の増強した安定性を有する。

Description

（関連出願への参照）
本出願は、２００８年１１月２８日に出願した米国仮出願第６１／１１８，５２８号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれている。
（発明の背景）
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）および関連するサイトカインＩＬ−２３は、共通のｐ４０サブユニットを共有するサイトカインのＩＬ−１２スーパーファミリーのメンバーである（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００６）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２７：４２５−４２）。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞の分化および後続のインターフェロンガンマの分泌を主に刺激するのに対して、ＩＬ−２３は、ナイーブＴ細胞からＩＬ−１７（炎症誘発性媒介物質）を分泌するエフェクターヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７）への分化を優先的に刺激する（ＲｏｓｍａｒｉｎおよびＳｔｒｏｂｅｒ（２００５）Ｊ．Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４：３１８−２５、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１１２３−３２、Ｐａｒｋら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１１３２−４１）。
ヒトインターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、固有の構造および多面的効果を有するサイトカインである（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：８２７−８４５、Ｓｅｄｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０１８８−９２、Ｌｉｎｇら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：１１６−１２７、Ｐｏｄｌａｓｋｉら（１９９２）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９４：２３０−２３７）。ＩＬ−１２は、３５ｋＤａサブユニット（ｐ３５）および４０ｋＤａサブユニット（ｐ４０）の両方がジスルフィド架橋によって連結された（「ｐ７０サブユニット」と称される）ヘテロダイマータンパク質である。ヘテロダイマータンパク質は、単球、マクロファージおよび樹状細胞等の抗原提示細胞によって主に産生される。これらの細胞型は、ｐ７０サブユニットに比べて過剰のｐ４０サブユニットをも分泌する。ｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニットは、遺伝子的に無関係であり、いずれも生物学的活性を持たないことが報告されているが、ｐ４０ホモダイマーはＩＬ−１２アンタゴニストとして機能することができる。ＩＬ−１２は、免疫応答および炎症反応が関与する幾つかの疾患に伴う病状において重要な役割を果たす。ＩＬ−１２、その生物学的活性および疾患におけるその役割の総説は、Ｇａｔｅｌｙら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：４９５−５２１において見出され得る。
機能的に、ＩＬ−１２は、自己免疫障害の開始および進行を司る抗原特異的ヘルパーＴ型（Ｔｈ１）および２型（Ｔｈ２）リンパ球のバランスを調節する上で中心的な役割を果たしており、Ｔｈ１リンパ球の分化および成熟の調節において重要である。Ｔｈ１細胞によって放出されたサイトカインは炎症性であり、インターフェロンγ（ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびリンホトキシン（ＬＴ）が含まれる。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を分泌し、液性免疫、アレルギー性反応および免疫抑制を助長する。
ヒトインターロイキン２３（ＩＬ−２３）は、１９ｋＤａサブユニット（ｐ１９）および共通の４０ｋＤａサブユニット（ｐ４０）がジスルフィド架橋によって連結されたヘテロダイマータンパク質である。ＩＬ−１２と同様に、ＩＬ−２３は、単球、マクロファージおよび樹状細胞等の抗原提示細胞によって主に産生される。ＩＬ−２３の主な役割は、サイトカインＩＬ−１７を産生するための（ＩＬ−１７Ｔ細胞またはＴｈ１７とも称される）ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットの刺激を含む。ＩＬ−１７もまた、内皮細胞およびマクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生を誘発する自己免疫性炎症の確立および永続化における重要な成分である（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎら（２００７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２２１−４２）。
自己免疫疾患においてＴｈ１応答が優勢であることならびにＩＦＮγおよびＩＬ−１７の炎症誘発性活性に合致して、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、インスリン依存型糖尿病およびクローン病（ＣＤ）等の多くの自己免疫疾患および炎症性疾患に伴う病状において主要な役割を果たす。
健康な対照と比較して、ＩＬ−１２ｐ７０の上昇したレベルが、ＲＡ患者の滑液において検出されている（Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４１：３０６−３１４）。ＲＡ滑液におけるサイトカインメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現のプロファイルにより、主にＴｈ１サイトカインが同定された。（Ｂｕｃｈｔら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：３４７−３６７）。ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットまたはＩＬ−１２／２３のｐ４０サブユニットを欠失している遺伝子標的化マウスを用いて、ＩＬ−２３がコラーゲン誘導関節炎の発生にとって重要であることが示された（Ｍｕｒｐｈｙら、（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８（１２）：１９５１−１９５７）。
ヒトＭＳ患者は、急性ＭＳプラークにおけるｐ４０ｍＲＮＡレベルによって報告されているように、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３発現の増加を示した。（例えば、Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９８５−９６参照）。更に、ＭＳ患者に由来するＣＤ４０Ｌ発現Ｔ細胞による抗原提示細胞のエクスビボ刺激は、対照Ｔ細胞と比較して増加したＩＬ−１２産生をもたらし、このことはＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用がＩＬ−１２の強力な誘発物質であるという観察と一致した。ＩＬ−２３を欠失している遺伝子標的化マウスを用いて、ＩＬ−２３は、脳の自己免疫性炎症にとって重要であることが示された（Ｃｕａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ４２１：７４４０７４８）。
ＩＦＮγおよびＩＬ−１２の増加した発現は、ＣＤ患者の腸粘膜において観察されている（Ｆａｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．１４：２３５−２３８、Ｐａｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：８２３−８３２、Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１２：１１６９−１１７８およびＢｅｒｒｅｂｉら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５２：６６７−６７２）。ＣＤ患者の基底膜由来のＴ細胞のサイトカイン分泌プロファイルは、大きく上昇したＩＦＮγレベル等の主にＴｈ１応答の特性である（Ｆｕｓｓら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１２６１−１２７０）。更に、ＣＤ患者に由来する大腸組織切片は、大量のＩＬ−１２発現マクロファージおよびＩＦＮγ発現Ｔ細胞を示す（Ｐａｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：８２３−８３２）。ＩＬ−２３の増加した発現もまた、クローン病患者において観察され、および炎症性腸疾患のマウスモデルにおいて観察されている。ＩＬ−２３は、Ｔ細胞媒介性大腸炎にとって不可欠であり、大腸炎のマウスモデルにおけるＩＬ−１７依存性機構およびＩＬ−６依存性機構を通じて炎症を促進するために不可欠である（例えば、Ｚｈａｎｇらによる総説、（２００７）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７：４０９−４１６参照）。
乾癬皮膚病変におけるＩＬ−１２／ＩＬ−２３ ｐ４０およびＩＬ−２３ ｐ１９メッセンジャーＲＮＡの過剰発現は、ＩＬ−１２／２３ ｐ４０サブユニットタンパク質に対する中和抗体によるＩＬ−１２およびＩＬ−２３の阻害が乾癬の処置のための有効な治療アプローチを提供する可能性があることを示唆する（Ｙａｗａｌｋａｒら（１９９８）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：１０５３−５７、Ｌｅｅら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：１２５−３０、Ｓｈａｋｅｒら（２００６）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１９−２５、Ｐｉｓｋｉｎら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６、１９０８−１５、また、Ｔｏｒｔｉらによる最近の総説（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５７（６）：１０５９−１０６８も参照、Ｆｉｔｃｈら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４６１−４６７）。）。両方のサイトカインは、乾癬における１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）免疫応答の発生に寄与するが、各々は固有の役割を有する（ＲｏｓｍａｒｉｎおよびＳｔｒｏｂｅｒ（２００５）Ｊ．Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４：３１８−２５、Ｈｏｎｇら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：７４８０−９１、Ｙａｗａｌｋａｒら（１９９８）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：１０５３−５７）。乾癬の処置のかかる治療アプローチが、当技術分野において明らかに必要である。
様々なヒトの障害におけるヒトＩＬ−１２およびＩＬ−２３の役割のため、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３活性を阻害し、またはそれに拮抗するように治療戦略が設計されてきた。特に、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに結合しそれを中和する抗体が、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３活性を阻害するための手段として求められてきた。最も初期の抗体の内の幾つかは、ＩＬ−１２によって免疫化されたマウスのリンパ球から調製されたハイブリドーマによって分泌されたマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であった（例えば、ＳｔｒｏｂｅｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９７／１５３２７号、Ｎｅｕｒａｔｈら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１２８１−１２９０、Ｄｕｃｈｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９３４−９３８参照）。短い血清半減期、ある種のヒトエフェクター機能を誘発することの不能性およびヒトにおけるマウス抗体に対する望ましくない免疫応答の惹起（「ヒト抗マウス抗体」（ＨＡＭＡ）反応）等、ヒトへのマウス抗体の投与に伴う問題があるため、これらのマウスＩＬ−１２抗体は、インビボでのそれらのマウスＩＬ−１２抗体の使用について限定される。
一般に、ヒトにおける完全マウス抗体の使用に伴う問題を克服するための試みは、抗体をより「ヒト様」に遺伝子操作することを含む。例えば、抗体鎖の可変領域がマウス由来であり、抗体鎖の定常領域がヒト由来であるキメラ抗体が調製されてきた（Ｊｕｎｇｈａｎｓら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５−１５０２、Ｂｒｏｗｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２６６３−２６６７、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３−７８３）。しかし、これらのキメラ抗体およびヒト化抗体は、幾つかのマウス配列をなお保持しているので、とりわけ、長期間にわたって投与された場合、望ましくない免疫反応（ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応）をなお惹起し得る。
マウス抗体またはこれらの派生体（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体）に比べて好ましいＩＬ−１２／ＩＬ−２３阻害剤は、長期間にわたって使用される場合であってもかかる剤がＨＡＭＡ反応を惹起するはずはないので、完全なヒト抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３抗体である。高親和性および低解離速度を有するヒトＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに結合し、ならびにｈＩＬ−１２誘発フィトヘマグルチニン芽球増殖およびｈＩＬ−１２誘発ヒトＩＦＮγ産生が含まれるヒトＩＬ−１２を中和する能力を有する組換えヒト抗体が記載されている（米国特許第６，９１４，１２８号参照）。
特異性抗原に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の選択性によって、それらのモノクローナル抗体は優れた治療用候補物質になる。しかし、抗体分子の構造のため、それらのモノクローナル抗体は、酵素的および非酵素的分解に弱い。例えば、長期間にわたる上昇した温度における抗体の保存は、抗体の非酵素的分解をもたらす（Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｇ．Ｅ．およびＲ．Ｈ．Ｐａｉｎｔｅｒ（１９６６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４（３）：３７１−９、Ｃｏｒｄｏｂａ，Ａ．Ｊ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８１８（２）：１１５−２１、Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｌ．ら（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（２２）：６９７６−７）。
一般に、ヒト免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）抗体は、２つの同一の軽鎖および重鎖から構成される。重鎖はガンマ型であるが、軽鎖はカッパ型またはラムダ型のいずれかであり得、それらのカルボキシ末端の定常領域が異なる。鎖間ジスルフィド架橋は、重鎖同士を結合させる。ジスルフィド架橋の数は、ＩｇＧサブクラスによって変わる。ＩｇＧ１について、例えば、２つの重鎖間ジスルフィド架橋およびそれぞれの軽鎖と重鎖を結合させる１つのジスルフィド架橋がある。
ＩｇＧ分子は、ヒンジ領域によって連結されたＦｃ領域および２つのＦａｂ領域から構成される。ヒンジ領域は、上部領域、コア領域および下部領域の３つの部分に分割される（図１）。上部領域はＦａｂアームをコアに連結し、下部領域はＦｃ部分をコアに連結する。コア領域は、鎖間ジスルフィド結合を含有し、高プロリン含有量を有する。ヒンジ領域の長さは、ＩｇＧサブクラスによって変わり、Ｆａｂアームに柔軟性をもたらし、それによって、アーム間の角度の変化ならびにそれらの軸を中心とした回転の自由の両方が可能になる。その柔軟性の結果として、ヒンジ領域は露出され、従って、温度および長期間の保存によって容易に撹乱される。例えば、ヒンジ領域は、抗体のＦｃ断片およびＦａｂ断片を生成するために通常用いられるパパインおよびｌｙｓ−Ｃ等のプロテアーゼに接近可能である。この領域におけるＩｇＧ分子を切断する他の酵素としては、カテプシンＬ、プラスミンおよびメタロプロテアーゼが挙げられる。
液状製剤中のモノクローナル抗体は、長期間にわたって５℃で保存された場合に非酵素的加水分解を受け、Ｆａｂ＋ＦｃおよびＦａｂ断片を生じる（Ｊｉｓｋｏｏｔ，Ｗ．ら（１９９０）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７（１２）：１２３４−４１、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ａ．Ｊ．およびＤ．Ｅ．Ｈｕｇｈｅｓ（１９９５）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７（２０）：３６２６−３２、Ｃｏｒｄｏｂａ，Ａ．Ｊ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８１８（２）：１１５−２１、Ｌｉｕ，Ｈ．ら（２００６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８３７：３５−４３、ならびにＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｌ．ら（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（２２）：６９７６−７）。典型的にはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってモニターされる断片化は、極度のｐＨ条件および高温において増大する（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｌ．ら（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（２２）：６９７６−７）。切断は、重鎖領域配列Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓにわたる多数のペプチド結合において起きる。重鎖配列Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓにわたる切断はＦａｂ断片（４８ｋＤａ）の対応するラダーをもたらしたが、一方で、Ｓｅｒ−Ｃｙｓ残基間の切断はベータ脱離機構を介して起き、重鎖断片および軽鎖断片（２３ｋＤａ）をもたらした。
カッパ軽鎖を含有するＩｇＧ分子のヒンジ領域における金属誘発断片化は、組換えモノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ）において実証された（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．ら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４８（１）：４８−５５）。Ｓｍｉｔｈらは、わずかにアルカリ性のｐＨにおける銅媒介断片化を報告し、切断は、重鎖配列Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓのヒンジ領域におけるリシン残基とスレオニン残基の間で特異的に局在した。切断の機構は前記著者によって明らかにされなかったが、ｐＨ５−６の酸性条件において切断は減少した。
国際公開第９７／１５３２７号 米国特許第６，９１４，１２８号明細書
Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００６）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２７：４２５−４２ ＲｏｓｍａｒｉｎおよびＳｔｒｏｂｅｒ（２００５）Ｊ．Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４：３１８−２５ Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１１２３−３２ Ｐａｒｋら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１１３２−４１） Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：８２７−８４５ Ｓｅｄｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０１８８−９２ Ｌｉｎｇら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：１１６−１２７ Ｐｏｄｌａｓｋｉら（１９９２）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９４：２３０−２３７） Ｇａｔｅｌｙら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：４９５−５２１ Ｋａｓｔｅｌｅｉｎら（２００７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２２１−４２ Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４１：３０６−３１４ Ｂｕｃｈｔら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：３４７−３６７ Ｍｕｒｐｈｙら、（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８（１２）：１９５１−１９５７ Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９８５−９６ Ｃｕａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ４２１：７４４０７４８ Ｆａｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．１４：２３５−２３８ Ｐａｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：８２３−８３２ Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１２：１１６９−１１７８ Ｂｅｒｒｅｂｉら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５２：６６７−６７２ Ｆｕｓｓら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１２６１−１２７０ Ｚｈａｎｇら、（２００７）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７：４０９−４１６ Ｙａｗａｌｋａｒら（１９９８）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：１０５３−５７ Ｌｅｅら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：１２５−３０ Ｓｈａｋｅｒら（２００６）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１９−２５ Ｐｉｓｋｉｎら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６、１９０８−１５ Ｔｏｒｔｉら（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５７（６）：１０５９−１０６８ Ｆｉｔｃｈら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４６１−４６７ Ｈｏｎｇら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：７４８０−９１ Ｎｅｕｒａｔｈら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１２８１−１２９０ Ｄｕｃｈｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９３４−９３８ Ｊｕｎｇｈａｎｓら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５−１５０２ Ｂｒｏｗｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２６６３−２６６７ Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３−７８３ Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｇ．Ｅ．およびＲ．Ｈ．Ｐａｉｎｔｅｒ（１９６６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４（３）：３７１−９ Ｃｏｒｄｏｂａ，Ａ．Ｊ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８１８（２）：１１５−２１ Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｌ．ら（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（２２）：６９７６−７ Ｊｉｓｋｏｏｔ，Ｗ．ら（１９９０）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７（１２）：１２３４−４１ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ａ．Ｊ．およびＤ．Ｅ．Ｈｕｇｈｅｓ（１９９５）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７（２０）：３６２６−３２ Ｌｉｕ，Ｈ．ら（２００６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８３７：３５−４３ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．ら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４８（１）：４８−５５
安定な組成物（例えば、製剤）ならびに処理および保存の間におけるそれらの製剤中の抗体の切断を防止するための方法を提供するために、抗体分子の断片化を取り巻くパラメータを決定する必要性が残っている。
例えば、有害なＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性を阻害し、またはそれに拮抗するための治療的使用に適切で、処理および長期保存の間で増強された安定性を有し、ラムダ軽鎖の断片化に対する増強された耐性を有する抗体またはこの断片を含む水性医薬製剤の必要性が残っている。
（発明の要旨）
第１の態様において、本発明は、ラムダ鎖を含む抗体、例えば有害なＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性を阻害し、またはそれに拮抗するための治療的使用に適切な抗体またはこの抗原結合部分を含み、当技術分野において認識されている製剤と比較して改善した性質を有する水性製剤を提供する。例えば、本発明の製剤は、例えば液体状態または固体状態において、少なくとも２４ヵ月間の貯蔵寿命を有する。別の一実施形態において、本発明の製剤は、少なくとも５回の製剤の凍結融解サイクルの後で安定性を維持する。
第２の態様において、本発明は、ヒンジ領域における特異的切断により、ラムダ軽鎖を含有する抗体の増大した断片化をヒスチジンの存在下で鉄がもたらすという観察に基づいて、ラムダ軽鎖を含む免疫グロブリンの断片化を阻害するための組成物および方法を提供する。製剤中にヒスチジンだけが存在することは、断片化に影響を及ぼさなかった。断片化のレベルは、鉄レベルおよびヒスチジンレベルの両方に関して用量依存的であった。鉄およびヒスチジンによって引き起こされた断片化の上昇したレベルは、カッパ軽鎖を含有する抗体において観察されなかった。ラムダ鎖含有抗体は、軽鎖および重鎖を接合するジスルフィド結合の近くでヒンジ領域に存在する残基において切断される。
第１の態様において、本発明は、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子と、ヒスチジンを含む緩衝液系とを含み、実質的に金属を含まない安定な製剤を提供する。
一実施形態において、金属はＦｅ２＋またはＦｅ３＋である。別の一実施形態において、金属はＣｕ２＋またはＣｕ１＋である。
別の一実施形態において、本発明は、金属がヒスチジンの存在下でラムダ軽鎖の切断をもたらさない濃度で存在する、約５から約７のｐＨを有するヒスチジンを含む緩衝溶液中にラムダ軽鎖を含む治療上有効量の分子を含む安定な製剤を更に提供する。
別の一実施形態において、本発明は、金属の存在下でヒンジ領域内において切断されない、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子と、イミダゾールを含む緩衝液系と、金属とを含む安定な製剤を更に提供する。
一実施形態において、製剤は、濾過、緩衝液交換、クロマトグラフィーおよび樹脂交換から成る群から選択される少なくとも１つの手法に供した後で金属を実質的に含まない。一実施形態において、緩衝液交換は、ヒスチジンを含む緩衝液、クエン酸塩およびリン酸塩を含む緩衝液ならびにイミダゾールを含む緩衝液から成る群から選択される緩衝液による透析を含む。
一実施形態において、金属は、例えば、約５，０６０ｐａｒｔ ｐｅｒ ｂｉｌｌｉｏｎ（ｐｐｂ）未満、約１，０６０ｐｐｂ未満、約５６０ｐｐｂ未満、約３１０ｐｐｂ未満、約１６０ｐｐｂ未満、約１１０ｐｐｂ未満および約７０ｐｐｂ未満の濃度で存在する。特定の一実施形態において、金属は、約１６０ｐｐｂ未満の濃度、より好ましくは約７０ｐｐｂ未満の濃度で存在する。
一実施形態において、製剤は、ラムダ軽鎖を含む分子ならびにポリオールおよび界面活性剤から成る群から選択される少なくとも１種の更なる賦形剤を含む。一実施形態において、製剤は安定剤を更に含む。一実施形態において、製剤は、マンニトール、ポリソルベート８０およびメチオニンを更に含む。一実施形態において、製剤は、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液を更に含む。一実施形態において、ｐＨは約５以下である。別の一実施形態において、製剤は、（ａ）１−１０％のマンニトール、（ｂ）０．００１％−０．１％のポリソルベート８０、ならびに（ｃ）５から７のｐＨを有する１−１００ｍＭのヒスチジンおよび１−５０ｍＭのメチオニンを含む緩衝液系を含む。更に別の実施形態において、製剤は、（ａ）２−６％のマンニトール、（ｂ）０．００５−０．０５％のポリソルベート８０、ならびに（ｃ）５から７のｐＨを有する５−５０ｍＭのヒスチジンおよび５−２０ｍＭのメチオニンを含む緩衝液系を含む。特定の一実施形態において、製剤は、（ａ）約４％のマンニトール、（ｂ）約０．０１％のポリソルベート８０、ならびに（ｃ）約６のｐＨを有する約１０ｍＭのヒスチジンおよび約１０ｍＭのメチオニンを含む緩衝液系を含む。
一実施形態において、本発明は、（ａ）ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合する１−２５０ｍｇ／ｍｌのヒト抗体、（ｂ）１−１０％のマンニトール、（ｃ）０．００１％−０．１％のポリソルベート８０、（ｄ）１−５０ｍＭのメチオニンおよび（ｅ）５から７のｐＨを有する１−１００ｍＭのヒスチジンを含み、金属を実質的に含まない水性医薬製剤を提供する。
一実施形態において、医薬製剤は、約２．５ｍＳ／ｃｏｍ未満の伝導率を有さない。別の一実施形態において、医薬製剤は、米国特許第６，９１４，１２８号の実施例９において用いられた製剤ではない。
一実施形態において、分子は、モノクローナル抗体またはこの抗原結合部分である。様々な実施形態において、抗体またはこの抗原結合部分の濃度は、例えば、約１から約２５０ｍｇ／ｍｌの間、約４０から約２００ｍｇ／ｍｌの間または約１００ｍｇ／ｍｌである。
一実施形態において、抗体は、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合し得るヒト抗体またはこの抗原結合部分である。一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、ｐ４０サブユニットがＩＬ−１２のｐ３５サブユニットに結合する場合、ｐ４０サブユニットのエピトープに結合し得る。別の一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、ｐ４０サブユニットがＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する場合、ｐ４０サブユニットのエピトープに結合し得る。更に別の一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、ｐ４０サブユニットがＩＬ−１２のｐ３５サブユニットに結合する場合、そしてまた、ｐ４０サブユニットがＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する場合、ｐ４０サブユニットのエピトープに結合し得る。特定の一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、Ｙ６１およびＪ６９５から成る群から選択される抗体が結合するＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合する。
特定の一実施形態において、本発明は、また更に、（ａ）ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合する約１００ｍｇ／ｍｌのヒト抗体、（ｂ）約４％のマンニトール、（ｂ）約０．０１％のポリソルベート８０、（ｃ）約１０ｍＭのメチオニンおよび（ｄ）約６のｐＨを有する１０ｍＭのヒスチジンを含む水性医薬製剤を提供する。
一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴によって決定される通りの１×１０−１０Ｍ以下のＫｄまたは１×１０−３ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数によってＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットから解離する。
一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの生物学的活性を中和する。一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、ＩＬ−１２の生物学的活性を中和する。特定の一実施形態において、ＩＬ−１２機能の中和は、ヒト抗体またはこの断片とＩＬ−１２のｐ４０サブユニットとの相互作用によって達成される。特定の一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、インビトロＰＨＡアッセイにおいて、１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０においてフィトヘマグルチニン芽球増殖を阻害し、またはそれは、１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０においてヒトＩＦＮγ産生を阻害する。別の一実施形態において、ヒト抗体またはこの結合部分は、ＩＬ−２３の生物学的活性を中和する。特定の一実施形態において、ＩＬ−２３機能の中和は、ヒト抗体またはこの断片とＩＬ−２３のｐ４０サブユニットとの相互作用によって達成される。
一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。別の一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を有する。別の一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を有する。更に別の一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。特定の一実施形態において、ヒト抗体は、抗体Ｊ６９５またはこの抗原結合部分である。
一実施形態において、製剤は、少なくとも２４ヵ月間の貯蔵寿命を有する。別の一実施形態において、製剤は、少なくとも５回の製剤の凍結融解サイクルの後で安定性を維持する。
一実施形態において、製剤は、更なる薬剤（例えば更なる治療剤）を更に含む。
一実施形態において、更なる治療剤は、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、サイクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチレート、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、抗ＩＬ−１受容体抗体、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦの抗体またはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０またはこれらのリガンドに対する抗体、メトトレキサート、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、Ｓ１Ｐ１アゴニスト、ｂｃｌ−２阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動剤、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５ ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５ ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβから成る群から選択される。
別の一実施形態において、更なる治療剤は、抗ＴＮＦ抗体およびこの抗体断片、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物、ＴＡＣＥ阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、コルチコステロイド、ブデノシド、デキサメタゾン、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸、オルサラジン、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＩＬ−１ｒａ、チロシンキナーゼ阻害剤、６‐メルカプトプリンおよびＩＬ−１１から成る群から選択される。
更に別の一実施形態において、更なる治療剤は、メチルプレドニゾロン、シクロホスファミド、４−アミノピリジン、チザニジン、インターフェロン−β１ａ、インターフェロン−β１ｂ、コポリマー１、高圧酸素、静脈内免疫グロブリン、クラブリビン、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ｓＩＬ−１３Ｒ、抗Ｐ７およびｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）から成る群から選択される。
別の一実施形態において、本発明は、ヒンジ領域の中で切断されない、または金属キレーターの非存在下で観察された切断のレベル未満のレベルでヒンジ領域の中で切断される、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子と、ヒスチジンを含む緩衝液系と、金属キレーターとを含む安定な製剤を更に提供する。
一実施形態において、金属はＦｅ２＋またはＦｅ３＋である。別の一実施形態において、金属はＣｕ２＋またはＣｕ１＋である。
一実施形態において、金属キレーターは、クエン酸塩、シデロホア、カリクセレン（ｃａｌｉｘｅｒｅｎｅ）、アミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、二座、三座または六座鉄キレーター、銅キレーターならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択される。好ましい一実施形態において、金属キレーターはデスフェリオキサミンである。
第２の態様において、本発明は、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子を切断する金属の能力を阻害または防止する段階を含む、ヒスチジン含有製剤における前記分子の切断を阻害または防止するための方法を提供する。一実施形態において、阻害または防止は、製剤中に少なくとも１種の金属キレーターを含めることを含む。別の一実施形態において、阻害または防止は、濾過（例えば、限外濾過および透析濾過）、緩衝液交換、クロマトグラフィーおよび樹脂交換から成る群から選択される少なくとも１つの手法に分子を供することを含む。一実施形態において、緩衝液交換は、ヒスチジンを含む緩衝液、クエン酸塩およびリン酸塩を含む緩衝液ならびにイミダゾールを含む緩衝液から成る群から選択される緩衝液による透析を含む。
なお別の一実施形態において、阻害または防止は、ラムダ軽鎖または重鎖における少なくとも１つのアミノ酸を改変することによって切断を阻害または防止することを含む。更に別の一実施形態において、阻害または防止は、アミノ酸配列グルタミン酸−システイン−セリンが変化するようにラムダ鎖においてアミノ酸配列を改変することによって切断を阻害または防止することを含む。更に別の一実施形態において、阻害または防止は、より酸性レベルの方に（例えば５以下のｐＨに）製剤のｐＨを低下させることを含む。別の一実施形態において、阻害または防止は、製剤中にクエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液等の更なる緩衝液を含めることを含む。一実施形態において、製剤は、約１−１００ｍＭのヒスチジン（例えば、約１０ｍＭのヒスチジン）を含む。
一実施形態において、製剤は、２５℃または４０℃で６ヵ月後にラムダ鎖含有抗体の切断をもたらさないレベルの鉄を含み、例えば、鉄は約１６０ｐｐｂ未満で存在する。
一実施形態において、分子は、約１ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、例えば約２ｍｇ／ｍｌ、例えば約７ｍｇ／ｍｌ、例えば約１００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲内で存在する。
一実施形態において、分子は、免疫グロブリン（例えば、モノクローナル抗体）である。特定の一実施形態において、分子は、抗ＩＬ−１２／２３抗体（例えば、Ｊ６９５）である。別の一実施形態において、抗体は、抗ＣＤ−８０または／および抗ＩＧＦ１、２抗体である。
別の一実施形態において、分子は、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ、単一ドメイン抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体および双特異性抗体から成る群から選択されるヒンジ領域を含有する。一実施形態において、分子は、重鎖の少なくとも部分を含む。別の一実施形態において、重鎖の部分は、アミノ酸配列セリン−システイン−アスパラギン酸−リシン（ＳＣＤＫ）または抗体結合を阻害しない少なくとも１つの修飾を含む。別の一実施形態において、切断は、セリンとシステイン残基の間のヒンジ領域において起きる。更に別の一実施形態において、切断は、システインとアスパラギン酸残基の間で起きる。
一実施形態において、金属はＦｅ２＋またはＦｅ３＋である。別の一実施形態において、金属はＣｕ２＋またはＣｕ１＋である。
一実施形態において、ラムダ軽鎖は、グルタミン酸−システイン−セリン（ＥＣＳ）のアミノ酸配列または抗体結合を阻害しない少なくとも１つの修飾を含む。別の一実施形態において、切断は、ラムダ鎖のヒンジ領域において起きる。別の一実施形態において、切断は、グルタミン酸とシステイン残基の間で起きる。更に別の一実施形態において、切断は、セリンとシステイン残基の間で起きる。
一実施形態において、切断は、約２℃から約２５℃の温度、例えば約２℃から約８℃の温度で起きる。一実施形態において、切断は、約４から約８のｐＨ、例えば約５から約６のｐＨで起きる。
一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、アエロバクチン、アグロバクチン、アゾトバクチン、バシリバクチン、Ｎ−（５−Ｃ３−Ｌ（５アミノペンチル）ヒドロキシカルバモイル）−プロピオンアミド）ペンチル）−３（５−（Ｎ−ヒドロキシアセトアミド）−ペンチル）カルバモイル）−プロプリオンヒドロキサム酸（デフェロキサミン、デスフェリオキサミンまたはＤＦＯもしくはＤＥＦ）、デスフェリチオシン、エンテロバクチン、エリスロバクチン、フェリクローム、フェリオキサミンＢ、フェリオキサミンＥ、フルビアバクチン、フサリニンＣ、ミコバクチン、パラバクチン、シュードバクチン、ビブリオバクチン、ブルニバクチン、イェルシニアバクチン、オルニバクチンならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択されるシデロホアである（Ｒｏｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．ら（２０００）Ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｒｏｎ Ｃｈｅｌａｔｏｒｓ，ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．７：１５９−１９７）。好ましい一実施形態において、金属キレーターはデスフェリオキサミンである。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、クエン酸塩またはリン酸塩である。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トランス−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、アスパラギン酸、ビス（アミノエチル）グリコールエーテルＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、グルタミン酸およびＮ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択されるアミノポリカルボン酸である。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビスヒドロキシエチルグリシン（ビシン）およびＮ−（トリスヒドロキシメチルメチル）グリシン（トリシン）ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択されるヒドロキシアミノカルボン酸である。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、Ｎ−置換グリシンまたはこの誘導体、類似体もしくは組み合わせである。例えば、Ｎ−置換グリシンは、グリシルグリシンならびにこの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択される。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、２−（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）またはこの誘導体、類似体および組み合わせである。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、カリックスアレーン、例えば、フェノールおよびアルデヒドのヒドロキシアルキル化生成物に基づく大環状もしくは環状オリゴマー、またはこの誘導体、類似体もしくは組み合わせである（Ｇｕｔｓｃｈｅ，Ｃ．Ｄ．（１９８９）Ｃａｌｉｘａｒｅｎｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｄｈａｒａｍ，ＰおよびＨａｒｊｉｔ，Ｓ．（２００６）Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｉｘａｒｅｎｅｓ、Ａｒｃｉｖｏｃ）。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、ＤＴＰＡおよびＤＥＦの組み合わせを含む。別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＥＦの組み合わせを含む。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、ヒドロキシピリジン誘導体、ヒドラゾン誘導体およびヒドロキシフェニル誘導体またはニコチニル誘導体、例えば、１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリジン−４−オン（Ｄｅｆｅｒｉｐｒｏｎｅ、ＤＦＰまたはＦｅｒｒｉｐｒｏｘ）、２−デオキシ−２−（Ｎ−カルバモイルメチル−［Ｎ’−２’−メチル−３’−ヒドロキシピリジン−４’−オン］）−Ｄ−グルコピラノース（Ｆｅｒａｌｅｘ−Ｇ）、ピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン（ＰＩＨ）、４，５−ジヒドロ−２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−メチルチアゾール−４−カルボン酸（ＧＴ５６−２５２）、４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］安息香酸（ＩＣＬ−６７０）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｏ−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、５−クロロ−７−ヨード−キノリン−８−オール（クリオキノール）またはこれらの誘導体、類似体もしくは組み合わせである。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、トリエチレンテトラミン（トリエンチン）、テトラエチレンペンタミン、Ｄ−ペニシラミン、エチレンジアミン、ビスピリジン、フェナントロリン（ｐｈｅｎａｎｔｒｏｌｉｎｅ）、バソフェナントロリン、ネオクプロイン、バトクプロインスルフォネート、クプリゾン、シス，シス−１，３，５，−トリアミノシクロヘキサン（ＴＡＣＨ）、Ｔａｃｈｐｙｒならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択される銅キレーターである。
別の一実施形態において、少なくとも１種の金属キレーターは、当技術分野において記載されている、例えば、Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、第６版、３巻：Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｓ、Ａｂｒａｈａｍ編、Ｄ．Ｊ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００３におけるＢｅｒｇｅｒｏｎ，Ｒ．らによる「Ｉｒｏｎ Ｃｈｅｌａｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅｓ」において記載されているキレート剤、薬剤の類似体および誘導体から選択され得る。更に、キレーターは、米国特許第６，０８３，９６６号、米国特許第６，５２１，６５２号、米国特許第６，５２５，０８０号、米国特許第６，５５９，３１５号、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９３１８、ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２２０１２、ＷＯ／２００２／０４３７２２およびＷＯ２００４／００７５２０において記載されているキレート剤、薬剤の類似体および誘導体から選択され得る。
別の一実施形態において、製剤は、アミノ酸、糖、糖アルコール、緩衝液、塩および界面活性剤から成る群から選択される少なくとも１種の更なる賦形剤を含む。
別の一実施形態において、製剤は、約１から約６０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、約１から約５０ｍＭのメチオニン、約０．００１％から約０．５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、約０．００１％から約１％（ｗ／ｖ）のポリオキサマー１８８、約１から約１５０ｍＭの塩化ナトリウム、約１から約３０ｍＭの酢酸塩、約１から約３０ｍＭのクエン酸塩、約１から約３０ｍＭのリン酸塩および約１から約３０ｍＭのアルギニンから成る群から選択される少なくとも１種の更なる賦形剤を含む。
別の一実施形態において、断片化の阻害または防止は、酸の添加、滴定またはｐＨを低下させるための当技術分野で知られている透析もしくは様々な濾過プロセス、例えば、限定されないが、透析またはタンジェント流濾過によってより酸性レベルの方に製剤のｐＨを変更することを含む。
別の一実施形態において、断片化の阻害または防止は、リン酸塩またはクエン酸塩等の特定の緩衝液の使用を含む。
第２の態様の別の一実施形態において、本発明は、製剤中に少なくとも１種の金属キレーターを含める段階および切断についてラムダ軽鎖の少なくとも部分を分析する段階を含む、ヒスチジン含有製剤においてラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子の切断を検出するための方法を提供する。
本発明の前述のおよび他の目的、特性および利点、ならびに本発明自体は、添付の図面と一緒に読まれる場合、以下の好ましい実施形態の記載からより完全に理解される。
抗体分子のヒンジ領域を示す図である。 サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後のＪ６９５の異なる種の分画（画分１−４）を示すグラフである。 非還元性（ＮＲ）種、重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）、ならびに画分３におけるＨＣ（ＨＣ−Ｆｃ）ならびに画分４におけるＬＣおよびＨＣ−Ｆａｂの断片を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された図２のＳＥＣからの異なる画分の評価を示す図である。 ヒンジ領域におけるＨＣ上における多数の切断部位を示す、脱グリコシル化後における図２からの画分３のＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳによる分析を示すグラフである。ピークは（ａ）から（ｅ）として示され、ピークおよび切断部位の同一性は表１において提供される。 この画分中における対応するＦａｂ断片を示す図２からの画分４のＭＳによる分析を示すグラフである。ピークは（ｆ）から（ｊ）として示され、ピークおよび切断部位の同一性は表１において提供される。 アミノ酸残基１−２１５由来の遊離ＬＣおよびアミノ酸残基１−２１７由来の遊離ＨＣを示す、図２からの画分４のＭＳによる分析を示すグラフである。 画分４がＦａｂならびにＬＣおよびＨＣ断片を含有したのに対して断片２（Ｆａｂ＋Ｆｃ）を示す、図２からの画分３のＣＥ−ＳＤＳによる分析を示すグラフである。完全抗体中における断片２は、他のピークから十分に解像される。 １０，０００のＭＷＣＯ膜を用いたクエン酸緩衝液に対する５００ｐｐｂ鉄を含有するＪ６９５（Ｍａｂ−ロット１）の透析を示すグラフである。 ４０℃で１ヵ月間恒温放置され、ＣＥ−ＳＤＳによって分析されたＪ６９５の正常対照ロット中にスパイクされた金属塩の異なるレベル（２．５、１０および５０ｐｐｍ）を示すグラフである。 １ｍＭのデスフェリオキサミンを用いた、５００ｐｐｂの鉄を含有するＪ６９５の４０℃で１ヵ月間の恒温放置の後のＣＥ−ＳＤＳによる分析を示すグラフである。 水に対する透析ならびにヒスチジン、鉄または鉄およびヒスチジンの両方のいずれかによる恒温放置の後の鉄を有さないＪ６９５の正常ロットを示すグラフである。 ストレスをかけた正常ロットに対する５００ｐｐｂの鉄を含有するストレスをかけたＪ６９５のＥＳＩ／ＬＣ−ＭＳによる図２からの断片２の比較を示すグラフである。 鉄を含有するストレスをかけたＪ６９５を、ストレスをかけた正常ロットと比較した場合に切断部位が同等だったことを明らかにする対応するＦａｂ種の分析を示すグラフである。 重鎖（１−２１７）および軽鎖（１−２１５）のより高いレベルの断片を明らかにするＬＣ断片およびＨＣ断片の分析を示すグラフである。 ラムダ軽鎖またはカッパ軽鎖のいずれかを含有するＩｇＧ分子の鉄誘発断片化の検討を示すグラフである。 ラムダ軽鎖またはカッパ軽鎖および切断された結合上の残基の配列を示す図である。
（発明の詳細な記述）
Ｉ．定義
「抗体」という用語は、広く、４本のポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖）から構成されるあらゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子または（Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合特性を保持する）そのあらゆる機能的断片、突然変異体、変異体もしくは派生体を指す。かかる突然変異体、変異体または派生体の抗体フォーマットは当技術分野において公知であり、その非限定的な実施形態は本明細書において考察される。
完全長抗体において、各重鎖は、（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）重鎖可変領域および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）軽鎖可変領域および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に小区分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４において配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
「Ｆｃ領域」という用語は、完全抗体のパパイン消化によって生成され得る、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であってよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含み、場合によってＣＨ４ドメインを含む。抗体エフェクター機能を改変するためのＦｃ部分におけるアミノ酸残基の置き換えは、当技術分野において公知である（米国特許第５，６４８，２６０号および米国特許第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、幾つかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）ならびに抗体および抗原抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。ある種のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれＦｃγＲおよび補体Ｃ１ｑへの結合を介してＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。免疫グロブリンの２つの同一の重鎖の二量体化は、ＣＨ３ドメインの二量体化によって媒介され、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合によって安定化される（Ｈｕｂｅｒら（１９７６）Ｎａｔｕｒｅ ２６４：４１５−２０、Ｔｈｉｅｓら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：６７−７９）。重鎖間ジスルフィド結合を防止するためのヒンジ領域の中のシステイン残基の突然変異は、ＣＨ３ドメインの二量体化を不安定化させる。ＣＨ３二量体化を担う残基が同定されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：９２６６−７３）。ゆえに、一価の半Ｉｇを生成することが可能である。一価の半Ｉｇ分子は、ＩｇＧおよびＩｇＡ両サブクラスについて天然に見出されている（Ｓｅｌｉｇｍａｎ（１９７８）Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：８５５−７０、Ｂｉｅｗｅｎｇａら（１９８３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：３９５−４００）。半Ｉｇ分子は、通常の抗体よりそのサイズが小さいので、組織透過においてある種の利点を有し得る。一実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基は、重鎖の二量体化が破壊されて半Ｉｇ分子をもたらすように、本発明の結合タンパク質の定常領域、例えばＦｃ領域において置き換えられる。軽鎖は、カッパ型またはラムダ型であってよい。
抗体の「抗原結合部分」または「抗体部分」という用語は、抗原（例えば、ｈＩＬ−１２および／またはｈＩＬ−２３）に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片を包含する。かかる抗体の実施形態は、双特異性、二重特異性または多重特異性であってもよく、例えば２つ以上の異なる抗原に特異的に結合する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）が別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成している単一タンパク質鎖としてこれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて接合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３参照）。かかる一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含されることが意図される。ダイアボディ等の一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが一本鎖ポリペプチド鎖上に発現されているが、同一鎖上における２つのドメイン間における対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合するように強制し、２つの抗原結合部位を作製する二価の双特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３参照）。かかる抗体結合部分は、当技術分野において公知である（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．７９０頁。更に、一本鎖抗体はまた、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｖセグメントの対を含む「直鎖抗体」（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）も挙げられる（Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２、米国特許第５，６４１，８７０号）。
なお更に、抗体またはこの抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１種以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合性または非共有結合性会合によって形成されるより大きな免疫接着分子の一部であってよい。かかる免疫接着分子の例としては、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３−１０１）ならびに二価およびビオチン化されたｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片等の抗体部分は、それぞれ完全抗体のパパインまたはペプシン消化等の慣用技術を用いて完全抗体から調製され得る。更に、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書において記載されるように標準組換えＤＮＡ技術を用いて得られ得る。好ましい抗原結合部分は、完全なドメインまたは完全なドメインの対である。
「多価結合タンパク質」という用語は、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を指す。一実施形態において、多価結合タンパク質は、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般に、天然に存在する抗体ではない。「多重特異性結合タンパク質」という用語はまた、２つ以上の関連する標的または無関係な標的に結合することが可能なタンパク質をも指す。二重可変ドメイン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合部位を含み、四価または多価結合タンパク質である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、単一特異性であり得（すなわち、１つの抗原に結合することができる。）または多重特異性であり得る（すなわち、２つ以上の抗原に結合することができる。）。２つの重鎖ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）ポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）ポリペプチドを含むＤＶＤ−Ｉｇ（商標）結合タンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）と称される。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の各半分は、重鎖ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）ポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）ポリペプチドおよび２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、合計６つのＣＤＲが抗原結合部位当たりの抗原結合に関与する。
「双特異性抗体」という用語は、クアドローマ技術によって（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＡ．Ｃ．Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５（５９３４）：５３７−４０）、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーションによって（Ｓｔａｅｒｚ，Ｕ．Ｄ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４（６０１２）：６２８−３１）、またはノブイントゥホールもしくはＦｃ領域中に突然変異を導入する類似のアプローチによって（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８．１８）生成され、その内の１つのみが機能的双特異性抗体である多数の異なる免疫グロブリン種をもたらす完全長抗体を指す。分子機能によって、双特異性抗体は、その２つの結合アーム（ＨＣ／ＬＣの１つの対）の１つの上の１つの抗原（またはエピトープ）に結合し、その第２のアーム（ＨＣ／ＬＣの異なる対）の上の異なる抗原（またはエピトープ）に結合する。この定義によって、双特異性抗体は、（特異性およびＣＤＲ配列の両方において）２つの異なる抗原結合アームを有し、それが結合する各抗原に対して一価である。
「二重特異性抗体」という用語は、その２つの結合アーム（ＨＣ／ＬＣの対）の各々の中における２つの異なる抗原（またはエピトープ）に結合することが可能な完全長抗体を指す（ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０２７７３号）。従って、二重特異性結合タンパク質は、同一の特異性および同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有し、それが結合する各抗原に対して二価である。
免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖または軽鎖定常ドメインを指す。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、当技術分野において公知である。
「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、前記集団を含む個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原に対して特異的である。更に、異なる決定因子（エピトープ）に対して特異的な異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と異なり、各ｍＡｂは、抗原上の単一の決定因子に対して特異的である。「モノクローナル」という修飾語句は、いずれかの特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈すべきではない。一実施形態において、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって産生される。
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体等、ある種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列ならびに別の種に由来する定常領域配列を含む抗体を指す。
「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、マウスＣＤＲの内の１つ以上（例えば、ＣＤＲ３）をヒトＣＤＲ配列によって置き換えたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体等、ある種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の内の１つ以上の配列を別の種のＣＤＲ配列によって置き換えた抗体を指す。
「ヒト抗体」という用語は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２参照）によって記載されているように、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変および定常領域を有する抗体を包含する。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおける無作為の突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボにおける体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含むことができる。突然変異は、好ましくは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，９１４，１２８号に記載されている「選択的突然変異誘発アプローチ」を用いて導入される。ヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていない活性増強アミノ酸残基によって置き換えられた少なくとも１つの位置を有することができる。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の一部でないアミノ酸残基によって置き換えられた最高２０個の位置を有することができる。他の実施形態において、最高１０個、最高５個、最高３個または最高２個の位置が置き換えられる。好ましい一実施形態において、これらの置き換えは、以下において詳細に記載されているようにＣＤＲ領域の中にある。しかし、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を含むことが意図されるものではない。ヒト抗体または完全ヒト抗体を生成するための方法は、当技術分野において公知であり、ヒトＢ細胞のＥＢＶ形質転換、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイまたは他のディスプレイ技術によって調製された抗体ライブラリーに由来するヒト抗体または完全ヒト抗体の選択、更に上で定義された重鎖および軽鎖ゲノム領域の全部または一部を含むヒトＩｇ遺伝子座の全部または一部に対してトランスジェニックであるマウスまたは他の種にも由来するヒト抗体または完全ヒト抗体の選択を包含する。選択されたヒト抗体は、意図された標的に対する親和性を増強するために、好ましくはＣＤＲ領域または隣接する残基のインビトロ突然変異誘発を含む、当技術分野において認識されている方法によって親和性成熟させることができる。
「組換えヒト抗体」という句は、組換え手段によって調製、発現、作製もしくは単離されたヒト抗体を包含し、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体（以下のセクションＩＩにおいて更に記載されている）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（以下のセクションＩＩＩにおいて更に記載されている）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照）または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む他のいずれかの手段によって調製、発現、作製もしくは単離された抗体を包含する。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２参照）。しかし、ある種の実施形態において、かかる組換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）に供され、従って、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、近縁であるが、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリの中で天然に存在しなくてもよい配列である。しかし、ある種の実施形態において、かかる組換え抗体は、選択的突然変異誘発アプローチもしくは復帰突然変異または両方の結果である。
本明細書において使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３に特異的に結合する、例えばヒトＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに特異的に結合する単離抗体は、ヒトＩＬ−１２およびＩＬ−２３以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。しかし、ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３に特異的に結合する単離抗体は、他の種に由来するヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３分子等の他の抗原との交差反応性を有し得る。更に、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてよい。
本明細書において使用される「中和抗体」（または「ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性を中和する抗体」もしくは「ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性を中和する抗体」）は、ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３に結合することによって（例えば、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに結合することによって）、ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３の生物学的活性（例えば、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの生物学的活性）を阻害する抗体を指すことが意図される。ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３の生物学的活性のこの阻害は、フィトヘマグルチニン芽球増殖アッセイ（ＰＨＡ）におけるヒトフィトヘマグルチニン芽球増殖の阻害、またはヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３受容体結合アッセイ（例えば、インターフェロンガンマ誘導アッセイ）における受容体結合の阻害等、ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３生物学的活性の１つ以上の指標を測定することによって評価され得る。ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３生物学的活性のこれらの指標は、当技術分野において公知の、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，９１４，１２８号（例えば、実施例３、第９欄第３１行から第１１３欄第５５行）に記載されている幾つかの標準インビトロまたはインビボアッセイの内の１つ以上によって評価され得る。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス）に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも部分がより「ヒト様」になるように、すなわちヒト生殖系列可変配列により類似するように改変させた抗体を指す。ヒト化抗体の１つの型は、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨおよびＶＬ配列中に導入されて対応する非ヒトＣＤＲ配列を置き換えたＣＤＲグラフト抗体である。また、「ヒト化抗体」は、対象となる抗原に特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域および非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体またはこの変異体、派生体、類似体もしくは断片である。
「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接合する重鎖分子の部分を意味する。ヒンジ領域は、約２５の残基を含み、柔軟であるため、２つのＮ末端抗原結合領域を独立して移動させることができる。ヒンジ領域は、上部、中央および下部のヒンジドメインという、３つの異なるドメインに小区分され得る（Ｒｏｕｘら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３）。単一ジスルフィド結合を形成することが必要であるだけであるので、抗体分子の組み立てを容易にするためにヒンジ領域におけるシステイン残基の数が１つに減らされた幾つかの改変された抗体分子が作製されている。これはまた、別のヒンジ領域またはエフェクターもしくはレポーター分子にヒンジ領域を付着させるための特異的な標的をも提供する（米国特許第５，６７７，４２５号）。抗体ヒンジ中におけるシステイン残基の数も増加している（米国特許第５，６７７，４２５号）。ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインがヒトＩｇＧ３ヒンジ領域によって置き換えられた他の突然変異抗体が構築されている。（ＷＯ９７／１１３７０）。これらの分子は、チオール基を介した多数のハプテンの置換のための１１個のスルフヒドリル基を含有する。
Ｉｇタンパク質の軽鎖成分は、２つの別々の遺伝子座（Ｉｇκ（カッパ）およびＩｇλ（ラムダ））によってコードされる。κまたはλ軽鎖を含有する抗体の割合は、異なる種の間で著しく変わり、例えば、κ：λ比は、ヒトにおける６０：４０と比較してマウスにおいては９５：５である。ヒトにおいて、ほとんど全てのλ産生細胞が、再編成された両κ対立遺伝子を有するが、κおよびλ産生細胞の割合は同様である（Ｈｉｅｔｅｒら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３６８−７２、ＵＳ２００４０２３１０１２）。Ｂ細胞は、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれか（アイソタイプ排除と称される選択）によって表面免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現する。軽鎖Ｖ−Ｊ再編成は、プレＢＩＩから未成熟Ｂ細胞までの遷移において出現し、ここで膜Ｉｇμ（ミュー）に関連付けられた代理軽鎖がκまたはλ軽鎖によって置き換えられる（Ｏｓｍｏｎｄら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １９、６５−６８）。軽鎖再編成のタイミングが本質的に定義されるにもかかわらず、軽鎖遺伝子座再編成を活性化するプロセスは完全には理解されていない。カッパおよびλ再編成は独立した事象であり（Ａｒａｋａｗａら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：９１−９９）、その活性化は、それらのそれぞれのエンハンサーの強度の差に影響を受け得る。ヒトλ遺伝子座の接近性の調節において重要であると考えられる領域は、Ｃλ７の約１０Ｋｂ下流において同定されている（ＧｌｏｚａｋおよびＢｌｏｍｂｅｒｇ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：４２７−３８、ＡｓｅｎｂａｕｅｒおよびＫｌｏｂｅｃｋ（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１４２−５０）。レポーター遺伝子アッセイにおける機能比較は、プレＢ細胞中におけるエンハンサー活性を大幅に減少させ得る元素によってフランクされたコアエンハンサー領域を同定した（ＧｌｏｚａｋおよびＢｌｏｍｂｅｒｇ（１９９６））。トランスフェクション研究は、κおよびλ３’エンハンサー領域が機能的に同等であると思われることを示したにもかかわらず、コアエンハンサーモチーフをフランクする他の（機能的）配列は著しく異なる。トランスジェニックマウス中におけるκ３’エンハンサーの標的欠失は、この領域がκ遺伝子座再編成および発現に必須ではないが、κ：λ比を確立するために必要であることを示した（Ｇｏｒｍａｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：２４１−５２）。
染色体２２ｑｌ１．２上におけるヒトＩｇλ遺伝子座は、大きさが１．１Ｍｂであり、典型的に７０Ｖλ遺伝子および７Ｊλ−Ｃλ遺伝子セグメントを含有する（Ｆｒｉｐｐｉａｔら（１９９５）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：９８３−９１、Ｋａｗａｓａｋｉら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：２６０−６１）。Ｖλ遺伝子の約半分は機能的であると考えられ、Ｊλ−Ｃλ１、２、３および７は活性である。Ｖλ遺伝子は、異なるＶ遺伝子ファミリー群を含む３つのクラスターにおいて構成される。１０のＶλ遺伝子ファミリーがあり、最も大きなＶλＩＩＩは２３のメンバーによって表される。ヒト末梢血リンパ球において、ファミリーＩ、ＩＩおよびＩＩＩに由来するクラスターＡ中におけるほとんどのＪ−Ｃ近位Ｖ遺伝子セグメントは優先的に再編成され、２ａ２Ｖλセグメントの寄与（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２０６−１１．）は、異例に高い（Ｉｇｎａｔｏｖｉｃｈら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８：６９−７７）。全てのλ遺伝子セグメントは、欠失の再編成を可能にする同じ極性を有する（ＣｏｍｂｒｉａｔｏおよびＫｌｏｂｅｃｋ（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１５１３−２２）。Ｉｇλレパートリの配列多様性は、主にＶλ−Ｊλの組み合わせによって提供される。ＶからＪの接合部におけるＮ（非コード）−またはＰ（パリンドローム）−ヌクレオチド付加による更なるＣＤＲ３多様性は、ＩｇＨ再編成において見られるものほど広範囲にはわたらないが、マウスにおける場合よりもヒトにおいて更により頻繁に用いられると思われ（Ｆｏｓｔｅｒら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９、１６１４−２７、Ｉｇｎａｔｏｖｉｃｈ、博士論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９９８、Ｂｒｉｄｇｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：８３１−４１、Ｖｉｃｔｏｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３４６７−７５）、ここでＴｄＴ（末端デオキシリボヌクレオチドトランスフェラーゼ）活性は軽鎖再編成時に下方制御される。幾つかのλ軽鎖配列のアラインメントは、以下で提供され、
Figure 2012510468
 のコンセンサス配列があることを示す。
ヒト抗体カッパ鎖は、非変異体アミノ酸配列に基づいて４つのサブ群に分類されている（例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第４版）、Ｔｈｅ Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ出版参照）。約８０のヒトＶＫ遺伝子があると思われるが、１つのサブ群ＩＶ ＶＫ遺伝子だけがヒトゲノムにおいて同定されている（Ｋｌｏｂｅｃｋら（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３：６５１６−６５２８参照）。Ｈｕｍ４ＶＬのヌクレオチド配列は、Ｋａｂａｔら（１９９１）（前掲）において説明されている。「Ｋａｂａｔ番号付与」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。当技術分野において認められているこれらの用語は、抗体またはこの抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基よりも可変的な（すなわち、超可変的な）アミノ酸残基に番号付与する系を指す（Ｋａｂａｔら（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から６５およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置９５から１０２の範囲にわたる。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から５６およびＣＤＲ３に対するアミノ酸位置８９から９７の範囲にわたる。
本明細書において使用される「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列の中における相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の各可変領域において３つのＣＤＲがあり、これらは、各可変領域に対してＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と表される。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って、異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔ（同上）によって記載されている系は、抗体のいずれの可変領域に対しても適用可能な明確な残基番号付与系を提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する厳密な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａらは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの中におけるある種のサブ部分が、アミノ酸配列のレベルにおいて大きな多様性を有するにもかかわらず、ほとんど同一のペプチド骨格立体構造をとることを見出した（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３）。これらのサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と表されたが、ここで「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ軽鎖領域および重鎖領域を表す。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと称されてよく、そのＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−１３９およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５によって記載されている。更に他のＣＤＲ境界定義が、本明細書において記載されている系の内の１つに厳密に従わない可能性があるが、それでもなお、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するが、これらは、残基または更にＣＤＲ全体の特定の残基または基が抗原結合に著しい影響を及ぼさないという予測または実験結果に鑑みて短縮または延長され得る。本明細書において使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用することができるが、ある種の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用する。
本明細書において使用される「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、ＣＤＲを差し引いた可変領域の残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は異なる系によって決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、対応して異なる解釈に従う。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２および−Ｌ３ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３）は、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域をも、各鎖上の４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。他者によって表されるように、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定のサブ領域を特定することなく、フレームワーク領域は、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域の中における組み合わされたＦＲを表す。本明細書において使用される場合、１つのＦＲは、４つのサブ領域の内の１つを表し、複数のＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つのサブ領域の内の２つ以上を表す。
「キレーター」という用語は、広く、金属イオンに結合する薬剤、または金属イオンと錯体を形成する薬剤を指す。一実施形態において、かかる結合または錯体形成は、金属キレーターの１個以上の原子を含む。結合および錯体形成は、結合（例えば、共有、供与またはイオン）のいずれかの形および組み合わせであってよい。一実施形態において、キレーターは、金属イオンに結合することによって、または金属イオンと錯体を形成することによって、金属イオンを隔離する。金属キレーターの誘導体、類似体および組み合わせのフォーマットは、当技術分野において公知であり、それらの非限定的な実施形態は、以下において考察される。
「ストレスをかけた正常ロット」という用語は、金属の非存在下で上昇した温度（典型的には２５℃または４０℃）において恒温放置されたロットを意味する。例えば、ストレスをかけた正常ロットにおいて、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子（例えば、抗体）の切断は、ヒンジ領域において、例えば、重鎖領域配列Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓにわたる多数のペプチド結合において起きる可能性がある。
「金属を実質的に含まない」または「ラムダ軽鎖の切断をもたらさない製剤中の金属の濃度」という句は、製剤中に存在するラムダ軽鎖含有抗体の正常または許容し得るレベルの断片化または切断、例えば、対応するストレスをかけた正常ロットにおいて観察された切断レベル、例えば、約０．５％の断片化が観察されるように十分に低い製剤中の金属の濃度（例えば２５℃または４０℃の温度で、例えば約１６０ｐｐｂ未満、好ましくは約１１０未満、より好ましくは約７０ｐｐｂ未満）を指す。例えば、製剤中の金属の濃度は、ラムダ軽鎖における約０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満または０．５％未満だけの断片化または切断（例えば、ラムダ鎖のヒンジ領域）が観察されるような濃度である。製剤中のラムダ軽鎖含有抗体の断片化または切断のレベルは、例えば、ＳＥＣ、キャピラリー電気泳動および／または質量分析によって決定され得る。
「対象」という用語は、生物、例えば、原核生物および真核生物を包含することが意図される。対象の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。本発明の特定の実施形態において、対象はヒトである。
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性を明らかに有効にし得るような形態における、および製剤が投与される対象に対して著しく有毒な更なる成分を含有しない調製物を指す。「医薬的に許容し得る」賦形剤（例えば、ビヒクル、添加剤）は、用いられる活性成分の有効量を提供するように、対象哺乳動物に適度に投与され得るものである。
「安定な」製剤は、この製剤中の抗体が保存の際にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を本質的に保持するものである。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技術は、当技術分野において利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７−３０１、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）において概説されている。安定性は、選択された温度で、選択された時間、測定され得る。好ましくは、製剤は、２から８℃の間で２４ヵ月間安定である。更に、製剤は、好ましくは、−２０から−８０℃の間で、少なくとも１８ヵ月間、好ましくは２４ヵ月間安定である。更に、製剤は、好ましくは、以下において「凍結融解サイクル」と称される製剤の凍結（例えば、−８０℃に）および融解（例えば、２５から３７℃において）の後で安定である。好ましくは、製剤は、少なくとも５回の凍結融解サイクルの後で安定である。
抗体は、色および／または清澄度の目視検査の際、または紫外線散乱もしくはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定して、凝集、沈殿および／または変性の兆候を実質的に示さない場合、医薬製剤において「その物理的安定性を保持する」。
抗体は、所定の時間における化学的安定性が以下において定義されるように抗体がその生物学的活性をなお保持すると考えられるようなものである場合、医薬製剤において「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、化学的に改変した形の抗体を検出および定量することによって評価され得る。化学的改変は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）を使用して評価され得るサイズ修飾（例えば、クリッピング）を含む。化学的改変の他の型としては、例えばイオン交換クロマトグラフィーによって評価され得る（例えばアミド分解の結果として起きる）荷電の改変が挙げられる。
抗体は、医薬製剤において抗体がその意図された目的に対して生物学的に活性である場合、医薬製剤において「その生物学的活性を保持する」。例えば、医薬製剤における抗体の生物学的活性が、（例えば抗原結合アッセイにおいて決定される通りの）医薬製剤が調製された時に示された生物学的活性の約３０％、約２０％または約１０％の範囲内（アッセイの誤差の範囲内）にある場合、生物学的活性は保持される。
「等張」は、例えば、対象となる製剤がヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有することを意味し得る。等張製剤は、一般に、約２５０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等浸透圧は、例えば蒸気圧または氷凍結型浸透圧計を使用して測定され得る。「等張化剤」は、製剤を等張にする化合物である。
「ポリオール」は、多数のヒドロキシル基を有する物質であり、糖（還元糖および非還元糖）、糖アルコールおよび糖酸を包含する。本明細書において好ましいポリオールは、約６００ｋＤ未満の（例えば、約１２０から約４００ｋＤの範囲内における）分子量を有する。「還元糖」は、金属イオンを還元し得るまたはタンパク質におけるリシンおよび他のアミノ基と共有結合的に反応し得るヘミアセタール基を含有するものであり、「非還元糖」は、還元糖のこれらの性質を有さないものである。還元糖の例は、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトースおよびグルコースである。非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレチトースおよびラフィノースが挙げられる。マンニトール、キシリトール、エリトリトール、トレイトール、ソルビトールおよびグリセロールは、糖アルコールの例である。糖酸に関して、これらは、Ｌ−グルコネートおよびこの金属塩を包含する。ポリオールは、等張化剤としての役割を果たすこともできる。本発明の一実施形態において、製剤の１種の成分は、約１０から約１００ｍｇ／ｍｌ（例えば１−１０％）の濃度におけるマンニトールである。本発明の特定の一実施形態において、マンニトールの濃度は、３０から５０ｍｇ／ｍｌ（例えば３−５％）である。本発明の好ましい一実施形態において、マンニトールの濃度は、約４０ｍｇ／ｍｌ（例えば４％）である。
本明細書において使用される「緩衝液」は、その酸塩基コンジュゲート成分の作用によるｐＨの変化に耐える緩衝溶液である。本発明において使用される緩衝液は、約４．０から約４．５、約４．５から約５．０、約５．０から約５．５、約５．５から約６、約６．０から約６．５、約５．７から約６．３、約６．５から約７．０、約７．５から約８．０の範囲内におけるｐＨを有する。一実施形態において、本発明の緩衝液は、約５以下のｐＨを有する。一実施形態において、本発明の緩衝液は、約６のｐＨを有する。この範囲内にｐＨを制御する緩衝液の例としては、酢酸（例えば、酢酸ナトリウム）緩衝液、コハク酸（例えば、コハク酸ナトリウム）緩衝液、グルコン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、メチオニン緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液および他の有機酸緩衝液が挙げられる。本発明の一実施形態において、緩衝液系は、ヒスチジンを含む。本発明の特定の一実施形態において、緩衝液系は、ヒスチジンおよびメチオニンを含む。一実施形態において、緩衝液系は、５−７（例えば、約５または約６）のｐＨを有して、１−５０ｍＭのヒスチジン（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）を含む。好ましい一実施形態において、本発明の緩衝液系は、５−７（例えば、約５または約６）のｐＨを有して、１−５０ｍＭのヒスチジン（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）および１−５０ｍＭのメチオニン（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）を含む。一実施形態において、緩衝液系は、約６のｐＨを有して、約１０ｍＭのヒスチジンを含む。一実施形態において、緩衝液系は、約５以下のｐＨを有して、約１０ｍＭのヒスチジンを含む。本発明の特に好ましい一実施形態において、緩衝液は、約６のｐＨを有して、約１０ｍＭのヒスチジンおよび約１０ｍＭのメチオニンを含む。本発明の別の好ましい一実施形態において、緩衝液は、約５以下のｐＨを有して、約１０ｍＭのヒスチジンおよび約１０ｍＭのメチオニンを含む。
本発明の別の一実施形態において、緩衝液系は、ヒスチジンおよびリン酸塩を含む。特定の一実施形態において、緩衝液系は、１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）、好ましくは約１０ｍＭの濃度におけるヒスチジン、および１−６０ｍＭの間（例えば、１０−５０ｍＭの間、２０−４０ｍＭの間）、好ましくは３０ｍＭの濃度におけるリン酸塩（例えば、リン酸水素ナトリウム）を含む。好ましい一実施形態において、緩衝液系は、ヒスチジン、メチオニンおよびリン酸塩を含み、例えば、緩衝液系は、１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）、好ましくは約１０ｍＭの濃度におけるヒスチジン、１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）、好ましくは約１０ｍＭの濃度におけるメチオニン、および１−６０ｍＭの間（例えば、１０−５０ｍＭの間、２０−４０ｍＭの間または２０−３０ｍＭの間）、好ましくは約３０ｍＭの濃度におけるリン酸塩を含む。
別の一実施形態において、緩衝液系は、ヒスチジンおよびクエン酸塩を含む。特定の一実施形態において、緩衝液系は、１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）、好ましくは約１０ｍＭの濃度におけるヒスチジン、および１−６０ｍＭの間（例えば、１０−５０ｍＭの間または２０−４０ｍＭの間）、好ましくは約３０ｍＭの濃度におけるクエン酸塩を含む。好ましい一実施形態において、緩衝液系は、ヒスチジン、メチオニンおよびクエン酸塩を含み、例えば、緩衝液系は、１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）、好ましくは約１０ｍＭの濃度におけるヒスチジン、１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）、好ましくは約１０ｍＭの濃度におけるメチオニン、および１−６０ｍＭの間（例えば、１０−５０ｍＭの間または２０−４０ｍＭの間）、好ましくは約３０ｍＭの濃度におけるクエン酸塩を含む。
更に別の一実施形態において、緩衝液系は、イミダゾールを含む。一実施形態において、緩衝液系は、１−５０ｍＭの間、５−４０ｍＭの間、５−３０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間、１０−２０ｍＭの間、好ましくは例えば１０ｍＭの濃度におけるイミダゾールを含む。好ましい一実施形態において、緩衝液系は、イミダゾールおよびメチオニンを含み、例えば、１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、５−３０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）、好ましくは１０ｍＭの濃度におけるイミダゾール、および１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、１０−３０ｍＭの間または１０−２０ｍＭの間）、好ましくは約１０ｍＭの濃度におけるメチオニンを含む。
なお別の一実施形態において、緩衝液系は、リン酸塩およびクエン酸塩を含み、例えば、１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、５−３０ｍＭの間、１０−２０ｍＭの間）、好ましくは１０ｍＭの濃度におけるリン酸塩（例えばリン酸水素ナトリウム）、および１−５０ｍＭの間（例えば、５−４０ｍＭの間、５−３０ｍＭの間、１０−２０ｍＭの間）、好ましくは１０ｍＭの濃度におけるクエン酸塩（クエン酸）を含む。
前述の緩衝液系のいずれかにおいて、ｐＨは、好ましくは、約２から７の間、約３から７の間、約４から７の間、例えば、約５以下（例えば、約２から５の間、約２．５から５の間、約３から５の間、約３．５から５の間、約４．０から５の間または約４．５から５の間）または約６である。
本発明の文脈における薬理学的意味において、抗体の「治療上有効量」または「有効量」は、障害の処置のために抗体が有効である障害の予防または処置において有効な量を指す。「障害」は、抗体による処置から利益を受けるあらゆる状態である。これは、対象を当該の障害にかかりやすくする素因になるそれらの病的状態が含まれる慢性および急性の障害または疾患を含む。
「保存剤」は、製剤中の細菌作用を本質的に減少させるように製剤中に含まれ得る化合物であり、従って、例えば多回使用製剤の製造を容易にする。可能な保存剤の例としては、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物）および塩化ベンゼトニウムが挙げられる。保存剤の他の型としては、芳香族アルコール、例えば、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールおよびｍ−クレゾールが挙げられる。
「処置」は、治療上の処置および予防的または防止的対策の両方を指す。処置を必要とするそれらとしては、すでに障害を有するそれらならびに障害が予防されるべきそれらが挙げられる。
本明細書において使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」の句は、通常は注射による腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経皮気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内および胸骨内注射または注入を包含する。
本明細書において使用される「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」および「末梢的に投与される」という句は、患者の系に入り、従って代謝および他の同様のプロセスを受けるような、中枢神経系中への直接の投与以外の化合物、薬物または他の材料の投与、例えば皮下投与を意味する。
「医薬的に許容し得る担体」という句は、認識されている技術であり、哺乳動物への投与に適切な医薬的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルを包含する。担体としては、ある器官または身体の部分から別の器官または身体の部分への対象となる薬剤の運搬または輸送に関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料が挙げられる。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者に対して有害でないという意味において「許容し得る」必要がある。
本明細書において使用される（本明細書においてｈＩＬ−１２またはＩＬ−１２と略記される）「ヒトインターロイキン１２」または「ヒトＩＬ−１２」という句は、主にマクロファージおよび樹状細胞によって分泌されたヒトサイトカインを包含する。この用語は、両方がジスルフィド架橋によって一緒に連結された３５ｋＤサブユニット（ｐ３５）および４０ｋＤサブユニット（ｐ４０）を含むヘテロダイマータンパク質を含む。ヘテロダイマータンパク質は、「ｐ７０サブユニット」と称される。ヒトＩＬ−１２の構造は、更に、例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７０：８２７−８４５、Ｓｅｄｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０１８８−１０１９２、Ｌｉｎｇら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１５４：１１６−１２７、Ｐｏｄｌａｓｋｉら（１９９２）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９４：２３０−２３７およびＹｏｏｎら（２０００）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９（１４）：３５３０−３５４１において記載されている。ヒトＩＬ−１２という用語は、標準組換え発現方法によって調製され得る組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈ ＩＬ−１２）を包含することが意図される。
本明細書において使用される（本明細書においてｈＩＬ−２３またはＩＬ−２３と略記される）「ヒトインターロイキン２３」または「ヒトＩＬ−２３」という句は、主にマクロファージおよび樹状細胞によって分泌されたヒトサイトカインを包含する。この用語は、両方がジスルフィド架橋によって一緒に連結された１９ｋＤサブユニット（ｐ１９）および４０ｋＤサブユニット（ｐ４０）を含むヘテロダイマータンパク質を含む。ヘテロダイマータンパク質は、「ｐ４０／ｐ１９」ヘテロダイマーと称される。ヒトＩＬ−２３の構造は、更に、例えば、Ｂｅｙｅｒら（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８２：９４２−９５５、Ｌｕｐａｒｄｕｓら（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８２：９３１−９４１において記載されている。ヒトＩＬ−２３という用語は、標準組換え発現方法によって調製され得る組換えヒトＩＬ−２３（ｒｈＩＬ−２３）を包含することが意図される。
本明細書において使用される「ヒトＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニット」または「ヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニット」または「ｐ４０サブユニット」は、ヒトＩＬ−１２およびヒトＩＬ−２３によって共有されたｐ４０サブユニットを指すことが意図される。ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの構造は、例えば、Ｙｏｏｎら（２０００）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９（１４）：３５３０−３５４１において記載されている。
「活性」という用語は、例えば、抗原に対する抗体（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３抗原に結合する抗ｐ４０抗体）の結合特異性／親和性、および／または、抗体（例えば、ヒトＩＬ−１２および／またはヒトＩＬ−２３への結合がヒトＩＬ−１２および／またはヒトＩＬ−２３の生物学的活性を阻害する抗ｐ４０抗体）の中和力価、例えば、ＰＨＡ芽球増殖の阻害またはヒトＩＬ−１２受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害（例えば、米国特許第６，９１４，１２８号の実施例３参照）等の活性を包含する。
「表面プラズモン共鳴」という句は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、バイオセンサマトリックスにおけるタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムな生物特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を包含する。更なる記載について、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０−６２７、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１、およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照されたい。
本明細書において使用される「Ｋｏｆｆ」という用語は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対する解離速度定数を指すことが意図される。
本明細書において使用される「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。
ＩＩ．本発明の組成物および方法
断片化をモニターするためにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、質量分析（ＭＳ）およびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して、ヒスチジンおよび金属（鉄または銅のいずれか）の両方が一緒に作用してラムダ軽鎖含有分子を断片化する分解経路を見出した。鉄およびヒスチジンの両方は、４０℃において抗体分子のヒンジ領域における断片化の動態を増進するために必要である。鉄またはヒスチジンは、単独で、ＩｇＧ分子の断片化の動態の増進に対してほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった。多くの異なる金属によって行われた金属スパイク研究は、抗体製剤中の鉄または銅の存在が用量依存的な様式における抗体の切断をもたらすことを示した。デスフェリオキサミン（鉄特異的キレーター）による鉄のキレート化は、この断片化を抑止した。ラムダ鎖またはカッパ鎖のいずれかを有するＩｇＧ分子の検討は、この断片化機構がラムダ鎖を含有する分子に対して特異的であることを示す。カッパおよびラムダ軽鎖は、これらのＣ末端領域が異なり、ラムダ軽鎖は、システイン残基の後に余分のセリン残基を有する。
凝集物および断片をモニターするため、および上昇した温度における長期間の恒温放置の後で抗体の断片を分画するために、ＳＥＣを用いた。正確に断片を定量するためだけでなく、他の分解種をも定量するために、ＣＥ−ＳＤＳを用いた。ストレスをかけた正常ロットのＭＳスペクトルは、断片２（Ｆａｂ＋Ｆｃ）上における主要な切断部位が重鎖の残基Ｃ／Ｄ、Ｄ／Ｋ、Ｋ／Ｔ、Ｔ／ＨおよびＨ／Ｔの間にあることを示した（図４）。重鎖のセリン−２１７とシステイン−２１８残基（Ｓ／Ｃ）の間における切断は、鉄およびヒスチジンを含有する製剤中で増大し、結果的にＨＣ断片１−２１７の上昇したレベルがＭＳスペクトルにおいて認められた（図６）。ストレスをかけた正常ロットと同様に、システイン−２１８から開始する対応するＦａｂ＋Ｆｃ断片は見出されなかった。代わりに、アスパラギン酸から開始するＦａｂ＋Ｆｃ断片（Ｃ／Ｄ間の切断）およびアスパラギン酸断片への２７Ｄａの付加を示した種の上昇が観察された。遊離ＬＣ（残基１−２１７）はＭＳスペクトルにおいて観察されなかったが、グルタミン酸によって終止した断片１−２１５を与える残基Ｅ／Ｃの間で切断されたＬＣの上昇したレベルが検出された。これらの結果は、鉄誘発切断が、ＨＣおよびＬＣを一緒に保持するジスルフィド結合の周囲における残基に局在化したことを示す。
金属イオンは、異なる方法においてタンパク質の酸化および分解を触媒することが公知である。これらの金属イオンは、（部位特異的な）システイン残基のチオール基と直接反応してラジカルを生成し、または酸素と反応して、スーパーオキシドラジカルアニオン、ヒドロキシルラジカルおよび過酸化水素等の多くの反応性酸素種を生成することができる（Ｌｉ，Ｓ．ら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．およびＢｉｏｅｎｇ．４８：４９０−５００、Ｌｉ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０（１１）：１５７２−１５７９、Ｋｏｃｈａ，Ｔ．ら（１９９７）ＢＢＡ １３３７：３１９−３２６）。金属イオンおよび還元環境（ＤＴＴ、アスコルビン酸）の存在下で生成された反応性酸素種（ＲＯＳ）は、タンパク質骨格を切断する（Ｋｉｍ，Ｒ．ら（１９８５）。いかなる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、銅およびヒスチジンのキレートが様々な酸化を触媒する可能性がある。鉄およびヒスチジンのキレートが報告されている（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．（１９６８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３（２２）：６０６４−６０６７、Ｌａｖａｎａｎｔ，Ｈ．ら（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１８５／１８６／１８７：１１−２３）。ラムダ軽鎖は、カッパ鎖上において存在しない遊離セリン残基を有する。最近の報告は、Ｃ末端セリン残基によって終止するペプチドが、金属の存在下で効率的に加水分解されることを示している（Ｙａｓｈｉｒｏ，Ｍ．ら（２００３）Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１：６２９−６３２）。
一実施形態において、濾過方法としては、透析濾過、限外濾過またはそれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態において、緩衝液交換方法としては、透析が挙げられる。別の一実施形態において、緩衝液交換は、脱塩カラムの使用を含む。一実施形態において、クロマトグラフィー方法は、抗体を捕獲するためのプロテインＡまたは弱カチオン交換クロマトグラフィー等のアフィニティークロマトグラフィーの使用を含む。
一実施形態において、樹脂交換方法は、金属に結合して剥離させるためのＣｈｅｌｅｘ−１００の使用を含む。
一実施形態において、ＬＣ、ＨＣ中のアミノ酸は、置換される、または金属およびヒスチジン関連切断を阻害するために欠失される。置換または欠失され得るアミノ酸は、ラムダ軽鎖上において存在するＣ末端セリン残基を含む。他の残基は、重鎖上におけるシステイン残基に隣接したセリン残基を含む。
ＩＩＩ．本発明の製剤における使用に適した抗体
本発明は、約５から約７の間にｐＨを有し、例えば２−８℃の温度で、または−２０から−１８０℃の間の温度で好ましくは少なくとも約２４ヵ月の増強した安定性を有するヒスチジン緩衝溶液中に抗体を含む製剤を提供する。本発明の別の一実施形態において、主張された製剤は、少なくとも５回の凍結融解サイクルの後で安定なままである。好ましい一実施形態において、製剤中の金属の量は、抗体の切断、例えば抗体のラムダ軽鎖の切断を防止するように十分に低い。好ましくは、主張された製剤は、金属を含まない。別の好ましい一実施形態において、製剤は、金属の存在下で、例えばラムダ軽鎖のヒンジ領域内において、抗体が切断されないまたはより低い程度で切断される金属キレーターを含む。なお別の一実施形態において、本発明の医薬製剤は、単回ｓｃ注射に適切である。
製剤において使用され得る抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、組換え抗体、一本鎖抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはこれらの断片が挙げられる。抗原に対する１または２つの結合部位および免疫グロブリンのＦｃ部分を含有する抗体様分子も使用され得る。本発明の好ましい一実施形態において、製剤において使用された抗体は、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む。本発明の製剤において使用される好ましい抗体は、ヒト抗体である。好ましい一実施形態において、製剤は、単離されたヒト組換え抗体である抗体またはこの抗原結合部分を含有する。別の特定の一実施形態において、抗体は、ラムダ鎖含有抗体またはこの抗原結合部分である。
本発明の一態様において、製剤は、ヒト抗体、例えば、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合するラムダ鎖を含むヒト抗体を含有する。一実施形態において、抗体は、ｐ４０サブユニットがＩＬ−１２のｐ３５サブユニットに結合する場合、ｐ４０サブユニットに結合する。一実施形態において、抗体は、ｐ４０サブユニットがＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する場合、ｐ４０サブユニットに結合する。一実施形態において、抗体はｐ４０サブユニットに結合するが、それは、そのサブユニットがＩＬ−１２のｐ３５サブユニットに結合する場合であり、更に、ｐ４０サブユニットがＩｌ−２３のｐ１９サブユニットに結合する場合である。好ましい一実施形態において、抗体またはこの抗原結合部分は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，９１４，１２８号において記載されているもの等の抗体である。例えば、好ましい一実施形態において、抗体は、米国特許第６，９１４，１２８号において記載されているようにＹ６１およびＪ６９５から成る群から選択される抗体が結合するＩＬ−１２のｐ４０サブユニットのエピトープに結合する。米国特許第６，９１４，１２８号において記載されているように、Ｊ６９５は、ヒト抗体の中でとりわけ好ましい。ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３に結合し、本発明の製剤において使用され得る他の抗体としては、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，９０２，７３４号において記載されているように、ヒト抗ＩＬ−１２抗体Ｃ３４０が挙げられる。
一実施形態において、本発明の製剤は、抗体の組み合わせ（２種以上）または抗体の「カクテル」を含む。例えば、製剤は、抗体Ｊ６９５および１種以上の更なる抗体を含むことができる。
一態様において、本発明の製剤は、Ｊ６９５抗体および抗体部分、Ｊ６９５関連抗体および抗体部分、ならびに低解離速度および高中和能力を有するｈＩＬ−１２／ＩＬ−２３への高親和性結合等、Ｊ６９５と同等な性質を有する他のヒト抗体および抗体部分を含有する。例えば、本発明の一実施形態において、製剤は、表面プラズモン共鳴によって決定される通りの１．３４×１０−１０Ｍ以下のＫｄまたは１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数によってヒトＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットから解離するヒト抗体またはこの抗原結合部分を含有する。好ましくは、抗体またはこの抗原結合部分は、１×１０−４ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数によって、より好ましくは１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数によって、または１×１０−１０Ｍ以下のＫｄによって、より好ましくは９．７４×１０−１１Ｍ以下のＫｄによって、ヒトＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットから解離する。
ＩＬ−１２／ＩＬ−２３抗体の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）は、表面プラズモン共鳴によって決定され得る。一般に、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってリガンド（バイオセンサマトリックス上に固定された組換えヒトＩＬ−１２）と分析物（溶液中の抗体）の間のリアルタイムな結合相互作用を測定する。表面プラズモン分析は、分析物（バイオセンサマトリックス上の抗体）を固定し、リガンド（溶液中の組換えＩＬ−１２／ＩＬ−２３）を提示することによっても実施され得る（例えば、その内容が参照により本明細書において組み込まれているＵＳ６，９１４，１２８の実施例５において記載されているアッセイを参照されたい。）。ＩＬ−１２／ＩＬ−２３抗体またはこの抗原結合部分の中和活性は、幾つかの適切なインビトロアッセイの内の１つ以上を用いて評価され得る（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれているＵＳ６，９１４，１２８の実施例３において記載されているアッセイを参照されたい。）。
本発明の別の一実施形態において、製剤は、ヒトＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの生物学的活性を中和するヒト抗体またはこの抗原結合部分を含有する。一実施形態において、抗体またはこの抗原結合部分は、遊離ｐ４０、例えば、モノマーｐ４０またはｐ４０ホモダイマー、例えば、２つの同一のｐ４０サブユニットを含有するダイマーの生物学的活性を中和する。好ましい実施形態において、抗体またはこの抗原結合部分は、ｐ４０サブユニットがＩｌ−１２のｐ３５サブユニットに結合する場合および／またはｐ４０サブユニットがＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する場合、ｐ４０サブユニットの生物学的活性を中和する。様々な実施形態において、抗体またはこの抗原結合部分は、１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０によって、好ましくは１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０によって、より好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０によって、いっそうより好ましくは１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０によって、最も好ましくは１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０によって、インビトロＰＨＡアッセイにおいて、ヒトＩＬ−１２誘発フィトヘマグルチニン芽球増殖を阻害する。他の実施形態において、抗体またはこの抗原結合部分は、１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０によって、好ましくは１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０によって、より好ましくは５×１０−１２Ｍ以下のＩＣ５０によって、ヒトＩＬ−１２誘発ヒトＩＦＮγ産生を阻害する。
本発明の更に別の一実施形態において、製剤は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有するヒト抗体またはこの抗原結合部分を含有する。一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を更に有する。一実施形態において、ヒト抗体またはこの抗原結合部分は、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を更に有する。特に好ましい一実施形態において、抗体またはこの抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。本発明の製剤の抗体またはこの抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥ定常領域から成る群から選択される重鎖定常領域を含むことができる。好ましくは、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ１である。様々な実施形態において、抗体またはこの抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片または一本鎖Ｆｖ断片である。
ラムダ鎖含有抗体、例えば、本発明の製剤中に含まれ得るラムダ鎖含有抗体の例は、当技術分野において周知であり、本発明によって包含されると考えられる。ラムダ鎖含有抗体の例としては、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている国際出願第ＷＯ２００７／１４９０３２号において記載されている通りの抗ＩＬ−１７抗体Ａｎｔｉｂｏｄｙ７（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３抗体Ｊ６９５（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ＩＬ−１３抗体ＣＡＴ−３５４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ヒトＣＤ４抗体ＣＥ９ｙ４ＰＥ（ＩＤＥＣ−１５１、クレノリキシマブ）（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ／Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、抗ヒトＣＤ４抗体ＩＤＥＣ ＣＥ９．１／ＳＢ−２１０３９６（ケリキシマブ）（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ）、抗ヒトＣＤ８０抗体ＩＤＥＣ−１１４（ガリキシマブ）（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ）、抗狂犬病ウイルスタンパク質抗体ＣＲ４０９８（フォラヴィルマブ（ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ））および抗ヒトＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド受容体２（ＴＲＡＩＬ−２）抗体ＨＧＳ−ＥＴＲ２（レクサツムマブ）（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ＩＶ．製剤の調製
本発明は、当技術分野において認識されている製剤と比較して改善された性質を有する製剤（例えば、タンパク質製剤および／または抗体製剤）を特徴とする。例えば、本発明の製剤は、当技術分野において認識されている製剤と比較して改善された貯蔵寿命および／または安定性を有する。一実施形態において、本発明の製剤は、例えば液体状態または固体状態において、少なくとも１８ヵ月の貯蔵寿命を有する。別の一実施形態において、本発明の製剤は、例えば液体状態または固体状態において少なくとも２４ヵ月の貯蔵寿命を有する。好ましい一実施形態において、本発明の製剤は、２−８℃の温度で少なくとも２４ヵ月の貯蔵寿命を有する。好ましい一実施形態において、本発明の製剤は、約−２０から−８０℃の間の温度で少なくとも１８ヵ月または少なくとも２４ヵ月の貯蔵寿命を有する。別の一実施形態において、本発明の製剤は、製剤の少なくとも５回の凍結融解サイクルの後で安定性を維持する。好ましい一態様において、本発明の製剤は、（製剤が、当技術分野において認識されている製剤と比較して、ラムダ軽鎖の断片化に対する増強された耐性、例えばラムダ軽鎖の減少した切断を提供する）分子、例えば、ラムダ軽鎖の少なくとも一部を含む抗体を含む。
好ましい一態様において、本発明の製剤は、金属を実質的に含まない。好ましい一実施形態において、本発明の製剤は、Ｆｅ２＋およびＦｅ３＋から成る群から選択される金属を実質的に含まない。別の好ましい一実施形態において、本発明の製剤は、Ｃｕ２＋およびＣｕ１＋から成る群から選択される金属を実質的に含まない。好ましい一実施形態において、本発明の製剤は、ヒスチジンの存在下でラムダ鎖の切断を減少または防止するために十分に低い量の金属を含み、例えば、金属は、約５，０６０ｐｐｂ未満、約１，０６０ｐｐｂ未満、約５６０ｐｐｂ未満、約５００ｐｐｂ未満、約４５０ｐｐｂ未満、約４００ｐｐｂ未満、約３５０ｐｐｂ未満、約３１０ｐｐｂ未満、約３００ｐｐｂ未満、約２５０ｐｐｂ未満、約２００ｐｐｂ未満、約１６０ｐｐｂ未満、約１５０ｐｐｂ未満、約１４０ｐｐｂ未満、約１３０ｐｐｂ未満、約１２０ｐｐｂ未満、約１１０ｐｐｂ未満、約１００ｐｐｂ未満、約９０ｐｐｂ未満、約８０ｐｐｂ未満、約７０ｐｐｂ未満、約６０ｐｐｂ未満、約５０ｐｐｂ未満、約４０ｐｐｂ未満、約３０ｐｐｂ未満、約２０ｐｐｂ未満、約１０ｐｐｂ未満または約１ｐｐｂ未満の濃度で存在する。好ましい一実施形態において、金属は、約１６０ｐｐｂ未満の濃度で存在する。好ましい一実施形態において、金属は、約１１０ｐｐｂ未満の濃度で存在する。特に好ましい一実施形態では、金属は、約７０ｐｐｂ未満の濃度、例えば約６０ｐｐｂの濃度で存在する。最大濃度は、上記の列挙された濃度（例えば、約６５ｐｐｂ未満）の間にあり、本発明の一部であることが意図されもする。更に、上限および／または下限としての上記の列挙された値のいずれかの組み合わせを用いた値の範囲（例えば、約５０ｐｐｂから約７０ｐｐｂの間の濃度）も含まれることが意図される。
好ましい一実施形態において、本発明の製剤は、濾過、緩衝液交換、クロマトグラフィーまたは樹脂交換等、金属を除去する少なくとも１つの手法に供した後で金属を実質的に含まない。本発明の製剤から金属を除去するために有用な手法は、当業者に公知であり、本明細書において、例えば以下の実施例において更に記載される。別の好ましい一実施形態において、本発明の製剤は、例えば、分子がヒンジ領域の中で切断されないように、または金属キレーターの非存在下で観察される切断のレベル未満のレベルにおいてヒンジ領域の中で切断されるように、金属キレーターを含む。本発明の製剤において、金属キレーターは、例えば、シデロホア、カリクセレン、アミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、二座、三座または六座鉄キレーター、銅キレーターならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせであってよい。一実施形態において、金属キレーターは、デスフェリオキサミンである。本発明の製剤において有用な金属キレーターは当業者に公知であり、非排他的な実施例が以下に記載される。
本発明の製剤において有用な特定のシデロホアとしては、アエロバクチン、アグロバクチン、アゾトバクチン、バシリバクチン、Ｎ−（５−Ｃ３−Ｌ（５アミノペンチル）ヒドロキシカルバモイル）−プロピオンアミド）ペンチル）−３（５−（Ｎ−ヒドロキシアセトアミド）−ペンチル）カルバモイル）−プロプリオンヒドロキサム酸（デフェロキサミン、デスフェリオキサミンまたはＤＦＯもしくはＤＥＦ）、デスフェリチオシン、エンテロバクチン、エリスロバクチン、フェリクローム、フェリオキサミンＢ、フェリオキサミンＥ、フルビアバクチン、フサリニンＣ、ミコバクチン、パラバクチン、シュードバクチン、ビブリオバクチン、ブルニバクチン、イェルシニアバクチン、オルニバクチンならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の製剤において有用なアミノポリカルボン酸としては、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トランス−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、アスパラギン酸、ビス（アミノエチル）グリコールエーテルＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、グルタミン酸およびＮ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の製剤において有用なヒドロキシアミノカルボン酸としては、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビスヒドロキシエチルグリシン（ビシン）およびＮ−（トリスヒドロキシメチルメチル）グリシン（トリシン）ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｎ−置換グリシン、例えば、グリシルグリシン、ならびにこれらの誘導体、類似体または組み合わせも本発明の製剤中の金属キレーターとして有用である。金属キレーター２−（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）ならびにこの誘導体、類似体および組み合わせも使用され得る。
本発明の製剤において有用な特定のカリックスアレーンとしては、フェノールおよびアルデヒドのヒドロキシアルキル化生成物に基づく大環状もしくは環状オリゴマー、またはこの誘導体、類似体および組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明において有用な特定の銅のキレーターとしては、トリエチレンテトラミン（トリエンチン）、テトラエチレンペンタミン（ｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｐｅｎｔａｍｉｎｅ）、Ｄ−ペニシラミン、エチレンジアミン、ビスピリジン、フェナントロリン、バソフェナントロリン、ネオクプロイン、バトクプロインスルフォネート、クプリゾン、シス，シス−１，３，５−トリアミノシクロヘキサン（ＴＡＣＨ）、Ｔａｃｈｐｙｒならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせが挙げられる。
本発明の製剤において用いられ得る更なる金属キレーターとしては、クエン酸塩、ヒドロキシピリジン誘導体、ヒドラゾン誘導体およびヒドロキシフェニル誘導体またはニコチニル誘導体、例えば、１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリジン−４−オン（Ｄｅｆｅｒｉｐｒｏｎｅ、ＤＦＰまたはＦｅｒｒｉｐｒｏｘ）、２−デオキシ−２−（Ｎ−カルバモイルメチル−［Ｎ’−２’−メチル−３’−ヒドロキシピリジン−４’−オン］）−Ｄ−グルコピラノース（Ｆｅｒａｌｅｘ−Ｇ）、ピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン（ＰＩＨ）、４，５−ジヒドロ−２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−メチルチアゾール−４−カルボン酸（ＧＴ５６−２５２）、４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］安息香酸（ＩＣＬ−６７０）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｏ−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、５−クロロ−７−ヨード−キノリン−８−オール（クリオキノール）ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせが挙げられる。
前述の金属キレーターのいずれかの内の２つ以上の組み合わせが、本発明の製剤において組み合わせて使用され得ることが認識される。例えば、本発明の特定の一実施形態において、製剤は、ＤＴＰＡおよびＤＥＦの組み合わせを含む。別の一実施形態において、製剤は、ＥＧＴＡおよびＤＥＦの組み合わせを含む。
好ましい一態様において、本発明の製剤は、例えば、約４５ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約５０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１００ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１１０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１２０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１３０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１４０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１５０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１６０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１７０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１８０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約１９０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約２００ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約２１０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約２２０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約２３０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約２４０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度、約２５０ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度または約３００ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度が含まれる高タンパク濃度を含む。本発明の好ましい一実施形態において、タンパク質は、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む。本発明の好ましい一実施形態において、タンパク質は、抗体、例えば、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む抗体である。本発明の好ましい一実施形態において、抗体は、Ｉｌ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに結合する。別の好ましい一実施形態において、抗体は、例えばその全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，９１４，１２８号において記載されているように、Ｊ６９５である。
対象となる抗体の調製は、当技術分野において公知の標準法に従って実施される。本発明の好ましい一実施形態において、製剤において使用された抗体は、例えばＣＨＯ細胞等の細胞において発現させられ、クロマトグラフィー段階の標準系列によって精製される。更に好ましい一実施形態において、抗体は、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに特異的であり、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，９１４，１２８号において記載されている方法に従って調製される。
対象となる抗体の調製後、抗体を含む医薬製剤が調製される。製剤中に存在する抗体の治療上有効量は、例えば、所望の用量体積および（１つ以上の）投与様式を考慮に入れることによって決定される。本発明の一実施形態において、製剤中の抗体の濃度は、液体製剤１ｍｌにつき約０．１から約２５０ｍｇの間の抗体である。本発明の一実施形態において、製剤中の抗体の濃度は、液体製剤１ｍｌにつき約１から約２００ｍｇの間の抗体である。様々な実施形態において、製剤中の抗体の濃度は、１ｍｌにつき約３０から約１４０ｍｇの間、約４０から約１２０ｍｇ／ｍｌの間、約５０から約１１０ｍｇ／ｍｌの間または約６０から約１００ｍｇ／ｍｌの間である。製剤は、１５ｍｇ／ｍｌ超の大きな抗体用量にとりわけ適切である。様々な実施形態において、製剤中の抗体の濃度は、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０ｍｇ／ｍｌである。好ましい一実施形態において、抗体の濃度は５０ｍｇ／ｍｌである。別の好ましい一実施形態において、抗体の濃度は１００ｍｇ／ｍｌである。好ましい一実施形態において、抗体の濃度は、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１１０ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも約１２０ｍｇ／ｍｌである。
本発明の様々な実施形態において、製剤中の抗体の濃度は、約０．１−２５０ｍｇ／ｍｌ、０．５−２２０ｍｇ／ｍｌ、１−２１０ｍｇ／ｍｌ、約５−２００ｍｇ／ｍｌ、約１０−１９５ｍｇ／ｍｌ、約１５−１９０ｍｇ／ｍｌ、約２０−１８５ｍｇ／ｍｌ、約２５−１８０ｍｇ／ｍｌ、約３０−１７５ｍｇ／ｍｌ、約３５−１７０ｍｇ／ｍｌ、約４０−１６５ｍｇ／ｍｌ、約４５−１６０ｍｇ／ｍｌ、約５０−１５５ｍｇ／ｍｌ、約５５−１５０ｍｇ／ｍｌ、約６０−１４５ｍｇ／ｍｌ、約６５−１４０ｍｇ／ｍｌ、約７０−１３５ｍｇ／ｍｌ、約７５−１３０ｍｇ／ｍｌ、約８０−１２５ｍｇ／ｍｌ、約８５−１２０ｍｇ／ｍｌ、約９０−１１５ｍｇ／ｍｌ、約９５−１１０ｍｇ／ｍｌ、約９５−１０５ｍｇ／ｍｌまたは約１００ｍｇ／ｍｌである。範囲は、上記の列挙された濃度（例えば、約３１−１７４ｍｇ／ｍｌ）の間にあり、本発明の一部であることが意図されもする。例えば、上限および／または下限としての上記の列挙された値のいずれかの組み合わせを用いた値の範囲が含まれることが意図される。
一実施形態において、本発明は、ポリオール、界面活性剤および約５から７のｐＨを有する緩衝液系と組み合わせて活性成分、好ましくは抗体から構成される改善された安定性または延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。一実施形態において、製剤は、安定剤を更に含む。一実施形態において、前記製剤は、金属を含まない。好ましい一実施形態において、延長された貯蔵寿命の改善された安定性を有する製剤は、活性成分、好ましくは抗体、ならびにマンニトール、ヒスチジン、メチオニン、ポリソルベート８０、塩化水素酸および水を含む。更なる一実施形態において、本発明の製剤は、液体状態において約２から８℃の間で少なくとも約２４ヵ月の延長された貯蔵寿命を有する。本発明の製剤の凍結を、その貯蔵寿命を更に延長するために用いることもできる。更なる一実施形態において、本発明の製剤は、製剤の少なくとも５回の凍結融解サイクルの後で安定性を維持する。
水性の製剤は、ｐＨ緩衝溶液中で抗体を含んで調製される。本発明の緩衝液は、約４から約８、好ましくは約４．５から約７．５、より好ましくは約５から約７、より好ましくは約５．５から約６．５、の範囲にわたるｐＨを有し、最も好ましくは約６．０から約６．２のｐＨを有する。特に好ましい一実施形態において、緩衝液は、約６のｐＨを有する。別の好ましい一実施形態において、緩衝液は、例えば２．５から５．０、３．０から５．０、３．５から５．０、４．０から５．０および４．５から５．０等の約５以下のｐＨを有する。上記の列挙されたｐＨのものの間にある範囲も本発明の一部であることが意図される。例えば、上限および／または下限としての上記の列挙された値のいずれかの組み合わせを用いた値の範囲が含まれることが意図される。この範囲内にｐＨを制御する緩衝液の例としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩、イミダゾールおよび他の有機酸緩衝液が挙げられる。本発明の好ましい一実施形態において、製剤は、ヒスチジンを含む緩衝液系を含有する。本発明の好ましい一実施形態において、緩衝液は、ヒスチジン、例えば、Ｌ−ヒスチジンである。好ましい実施形態において、本発明の製剤は、約１−１００ｍＭのヒスチジン、好ましくは約５−５０ｍＭのヒスチジン、最も好ましくは１０ｍＭのヒスチジンを含む緩衝液系を含む。別の一実施形態において、製剤は、ヒスチジンおよびクエン酸塩を含む緩衝液系、またはヒスチジンおよびリン酸塩を含む緩衝液系を含む。更に別の一実施形態において、製剤は、イミダゾールを含む緩衝液系を含む。更に別の一実施形態において、製剤は、クエン酸塩およびホスホン酸塩（ｐｈｏｓｐｈｏａｔｅ）を含む緩衝液系を含む。当業者は、例えば、１−３００ｍＭ、最適には液体剤形に対して１５０ｍＭの濃度で溶液の毒性を修飾するために塩化ナトリウムを使用することができることを認識する。
等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）としての役割を果たし、抗体を安定させ得るポリオールも製剤中に含まれる。ポリオールは、製剤の所望の等浸透圧によって変わり得る量において製剤に加えられる。好ましくは、水性製剤は等張性である。加えられるポリオールの量は、ポリオールの分子量によって変わり得る。例えば、二糖（例えば、トレハロース）と比較して、より少ない量の単糖（例えば、マンニトール）を加えることができる。本発明の好ましい一実施形態において、等張化剤としての製剤においてすなわち使用されるポリオールは、マンニトールである。好ましい一実施形態において、組成物は、約１０から約１００ｍｇ／ｍｌ、または約２０から約８０、約２０から約７０、約３０から約６０、約３０から約５０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０および約１００ｍｇ／ｍｌのマンニトールを含む。好ましい一実施形態において、製剤は、（約４％のマンニトールに対応する）約４０ｍｇ／ｍｌのマンニトールを含む。好ましい一実施形態において、組成物は、約１％から約１０％の間のマンニトール、より好ましくは約２％から約６％の間のマンニトール、最も好ましくは約４％のマンニトールを含む。本発明の別の一実施形態において、ポリオールソルビトールは、製剤中に含まれる。
また、本明細書において記載されている抗体製剤に安定剤または抗酸化剤を加えることもできる。安定剤は、液体剤形および凍結乾燥剤形の両方において使用され得る。本発明の製剤は、安定剤としてメチオニン（例えば、Ｌ−メチオニン）を含むことができる。例えば、酸化することによって、メチオニンは、製剤中に存在する他の緩衝液の安定効果を強化するように作用することができる。しかし、本発明のある種の実施形態において、ある種の状況下において、メチオニンは、安定剤としてではなく、緩衝液系の一部として製剤中に存在し、例えば、メチオニンは、安定剤としての役割を果たすことに不十分な量において製剤中に存在することができる。本発明の製剤において有用な他の安定剤は当業者に公知であり、グリシンおよびアルギニンを包含するが、これらに限定されるものではない。凍結乾燥剤形に対して、凍結保護剤、主にスクロース（例えば、１−１０％のスクロース、最適には０．５−１．０％のスクロース）が含まれ得る。他の適切な凍結保護剤（ｃｙｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）としては、トレハロースおよびラクトースが挙げられる。
洗浄剤または界面活性剤も抗体製剤に加えられる。例示的な洗浄剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０等）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。加えられる洗浄剤の量は、製剤化された抗体の凝集を減少させ、および／または製剤中の微粒子の形成を最小限にし、および／または吸着を減少させるようなものである。本発明の好ましい一実施形態において、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含む。本発明の別の好ましい一実施形態において、製剤は、洗浄剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０を含有する。Ｔｗｅｅｎ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを記載するために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ、Ｅｄｉｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ Ｖｅｒｌａｇ Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ、第４版、１９９６参照）。好ましい一実施形態において、製剤は、０．００１から約０．１％の間のポリソルベート８０、または約０．００５から０．０５％の間のポリソルベート８０、例えば、約０．００１、約０．００５、約０．０１、約０．０５または約０．１％のポリソルベート８０を含有する。好ましい一実施形態において、約０．０１％のポリソルベート８０が、本発明の製剤中に見出される。
本明細書における実施例において記載されるように、製剤成分の幾つかは、抗体分子の安定性に負の影響を及ぼすことなく、例えば、抗体分子の断片化を促進または増加させることなく、製剤中に含まれ得、または存在し得る。例えば、界面活性剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）は、抗体の断片化を促進または増加させることなく製剤に加えられ得る。ポリオール、例えば、マンニトールは、抗体の断片化を促進または増加させることなく製剤に加えられ得る。アミノ酸、例えば、アルギニンも、抗体の断片化を促進または増加させることなく製剤に加えられ得る。有機系緩衝液、例えば、酢酸塩は、抗体の断片化を促進または増加させることなく製剤に加えられ得る。従って、酢酸塩（酢酸）を使用して、例えば、抗体分子の安定性に負の影響を及ぼすことなく製剤のｐＨを低下させることができる。更に、製剤のイオン強度は、抗体分子の安定性（例えば、断片化）に影響を及ぼさないので、例えばＮａＣｌ等の塩を製剤に加えることができる。
本発明の好ましい一実施形態において、製剤は、以下で表１において示される成分を含有する容器中の１．０ｍＬの溶液である。別の一実施形態において、製剤は、容器中の０．８ｍＬの溶液である。
Figure 2012510468
一実施形態において、製剤は、上で確認した薬剤（すなわち、抗体、ポリオール／等張化剤、界面活性剤および緩衝液）を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノールおよびベンゼトニウムＣｌ等の１種以上の保存剤を本質的に含まない。別の一実施形態において、保存剤は、特に製剤が多回用量製剤である場合、製剤中に含まれ得る。１種以上の他の医薬的に許容し得る担体、賦形剤または安定剤、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）において記載されているものは、製剤の所望の特徴に著しい悪影響を与えないならば、製剤中に含まれ得る。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、更なる緩衝剤、共溶媒、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、生分解性ポリマー（例えば、ポリエステル）および／または塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）を包含する。
本発明の組成物は、様々な形態においてあってよい。これらとしては、例えば、液体、半固体および固体剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射用および注入用溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉剤、リポソームおよび坐剤が挙げられる。好ましい形態は、意図された投与様式および医療適用に依存する。典型的な好ましい組成物は、他の抗体によるヒトの受動免疫化のために使用されるものと類似の組成物等、注射用または注入用溶液の形態においてある。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい一実施形態において、抗体は、静脈内注入または注射によって投与される。別の好ましい一実施形態において、抗体は、筋肉内または皮下注射によって投与される。従って、好ましくは、抗体は、注射用溶液として調製される。注射用溶液は、フリントもしくはアンバーバイアル、アンプルまたはプレフィルドシリンジ中の液体または凍結乾燥剤形から構成され得る。本発明の好ましい一実施形態において、抗体を含む安定な製剤が、プレフィルドシリンジ中で調製される。
本明細書における製剤は、処置される特定の適応症の必要に応じて１種以上の他の治療剤と併用してもよく、製剤の抗体に悪影響を与えない相補的活性を有するものが好ましい。かかる治療剤は、意図された目的に有効な量における併用において適切に存在する。かかる併用治療は、有利には、投与された治療剤のより低い用量を利用することができ（例えば、相乗的治療効果は、併用治療を用いることを通じて達成され得、次に、より低い用量の抗体の使用によって所望の治療効果を達成することができる。）、従って、様々な単剤治療に伴って生じ得る毒性または合併症が回避される。本発明の好ましい一実施形態において、Ｉｌ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに結合する抗体は、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性が有害である障害を処置するのに有用な１種以上の更なる治療剤と共製剤化および／または同時投与される。例えば、本発明の製剤の抗体または抗体部分は、他の標的に結合する１種以上の更なる抗体（例えば、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１７）に結合する抗体または細胞表面分子に結合する抗体）と共製剤化および／または同時投与され得る。更に、本発明の製剤の抗体は、前述の治療剤の内の２種以上と併用され得る。本発明の製剤と併用され得る更なる治療剤は、米国特許第６，９１４，１２８号（例えば、第７６欄第１０行から第７８欄第５３行）において更に記載されている。米国特許第６，９１４，１２８号の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
インビボにおける投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、製剤の調製の前または後における無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
Ｖ．製剤の投与
本発明の製剤は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，９１４，１２８号に記載されているものと類似の適応症において使用され得、それらの適応症は、以下において更に詳述される。
本発明の一態様において、本発明の安定な製剤は、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３に結合する（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに結合する）ならびにＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３の活性を阻害する（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性を阻害する）抗体を含む。本明細書において使用される「ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性阻害製剤」という用語は、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３に結合する（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに結合する）ならびにＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３の活性を阻害する（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性を阻害する）抗体を含む製剤を包含することが意図される。
製剤の「有効量」という用語は、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性を阻害するために（例えば、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性を阻害するために）、例えば、有害なＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性関連状態の様々な形態的および身体的症状を予防するために必要なまたは十分な量である。別の一実施形態において、製剤の有効量は、所望の結果を達成するために必要な量である。一例において、製剤の有効量は、有害なＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性（例えば、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの有害な活性）を阻害するために十分な量である。別の一例において、製剤の有効量は、表１において記載されるように、５０ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌの抗体（例えば、４０ｍｇまたは８０ｍｇの抗体）を含有する製剤０．８ｍＬである。別の一例において、製剤の有効量は、表１において記載されるように、５０ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌの抗体（例えば、５０ｍｇまたは１００ｍｇの抗体）を含有する製剤１．０ｍＬである。有効量は、対象のサイズおよび体重、または疾患の型等の因子に応じて変わり得る。例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性阻害製剤の選択は、「有効量」を構成するものに影響を及ぼす可能性がある。当業者であれば、上述の因子を検討し、過度の実験を行うことなくＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性阻害製剤の有効量に関する決定を為すことができる。
投与レジメンは、有効量を構成するものに影響を及ぼす可能性がある。ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性阻害製剤は、有害なＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性の発現の前または後に対象に投与され得る。更に、幾つかの分割された用量ならびに時間をずらせた用量を毎日もしくは逐次的に投与することができ、または用量を、連続的に注入することができ、もしくはボーラス注射することができる。更に、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性阻害製剤の用量は、治療状況または予防状況の緊急性によって示されるように比例的に増加または減少させることができる。
「処置される」、「処置する」または「処置」という用語は、処置される状態、障害または疾患に伴うまたは起因する少なくとも１つの症状の軽減または緩和を包含する。例えば、処置は、障害の１つもしくは複数の症状の軽減または障害の完全な根絶であり得る。
本発明の医薬製剤中の活性成分（抗体）の実際の用量レベルは、患者に対して毒性となることなく特定の患者、組成物および投与様式に対する所望の治療応答を達成するために有効な活性成分の量を得るように変わり得る。
選択された用量レベルは、製剤中に見出された抗体の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の***率、処置期間、用いられる特定の化合物と併用する他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康状態および以前の病歴ならびに医療分野において周知の因子等の様々な因子に依存する。
当技術分野における通常の知識を有する医師または獣医師は、本発明の医薬組成物の必要な有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、医薬製剤において用いられる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで用量を漸増させることができる。
一般に、本発明の製剤の適切な１日用量は、治療効果を生じるために有効な最低用量である製剤のその量である。かかる有効量は、一般に上記の因子に依存する。本発明の製剤の有効量は、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性が有害である障害に罹患している対象におけるＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性（例えば、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性）を阻害する量である。好ましい一実施形態において、製剤は、１回の注射につき活性成分（抗体）の４０ｍｇ、５０ｍｇ、８０または１００ｍｇの有効用量を提供する。別の一実施形態において、製剤は、抗体の約０．１から２５０ｍｇの範囲にわたる有効用量を提供する。所望により、医薬製剤の有効１日用量は、１日を通して適切な間隔において、場合によって単位用量形態において別々に投与される２、３、４、５、６回以上に分けた用量として投与され得る。
本発明の一実施形態において、製剤中の抗体の用量は、約１から約２００ｍｇの間である。一実施形態において、製剤中の抗体の用量は、約３０から約１４０ｍｇの間、約４０から約１２０ｍｇの間、約５０から約１１０ｍｇの間、約６０から約１００ｍｇの間または約７０から約９０ｍｇの間である。更なる一実施形態において、組成物は、例えば、約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０ｍｇにおいてＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３に結合する（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３（例えば、Ｊ６９５）のｐ４０サブユニットに結合する）抗体用量またはこの抗原結合断片を含む。
上記の列挙された用量の間にある範囲（例えば、約２−１３９ｍｇ）も本発明の部分であることが意図される。例えば、上限および／または下限としての上記の列挙された値のいずれかの組み合わせを用いた値の範囲が含まれることが意図される。
用量の値が緩和すべき状態の重症度と共に変わり得るという点に留意する必要がある。任意の特定の対象のための特定の用量レジメンは、個体の必要性および組成物の投与者または投与監理者の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書において記載されるその用量範囲は例示に過ぎず、主張された組成物の範囲または実施を限定することが意図されないことを更に理解するべきである。
本発明は、一実施形態において、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性が有害である障害に罹患している対象においてＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性）を阻害するために使用される延長された貯蔵寿命を有する医薬製剤を提供し、対象におけるＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性が阻害されるように本発明の抗体または抗体部分を対象に投与することを含む。好ましくは、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３はヒトＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３であり、対象はヒト対象である。別の場合、対象は、本発明の抗体が交差反応するＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３を発現する哺乳動物であり得る。また更に、対象は、（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３の投与によって、またはＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３導入遺伝子の発現によって）ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３が導入された哺乳動物であり得る。本発明の製剤は、（以下で更に考察される）治療目的のためにヒト対象に投与され得る。本発明の一実施形態において、液体医薬製剤は、容易に投与可能（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔａｂｌｅ）であり、例えば患者によって自己投与される製剤を包含する。好ましい一実施形態において、本発明の製剤は、ｓｃ注射を通じて投与され、単回使用が好ましい。更に、本発明の製剤は、獣医学的目的のためにまたはヒト疾患の動物モデルとして抗体が交差反応するＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３を発現する非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類、ブタまたはマウス）に投与され得る。後者に関して、かかる動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するため（例えば、用量および投与時間経過の試験）に有用であり得る。
本明細書において使用される「ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性が有害である障害」または「ＩＬ／１２および／またはＩＬ−２３活性が有害である障害」という用語は、障害に罹患している対象におけるＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３（例えば、このｐ４０サブユニット）の存在が、障害の病態生理の原因であるもしくは障害の増悪に寄与する因子であることが示されたまたは推測される疾患および他の障害を包含することが意図される。従って、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性が有害である障害は、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性の阻害（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性の阻害）が障害の症状および／または進行を緩和させると予想される障害である。かかる障害は、例えば、（例えば上記の通りの抗ｐ４０ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３抗体を使用して検出され得る）障害に罹患している対象の生物学的液中のＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３の濃度の増加、例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液等におけるＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３の濃度、例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの濃度の増加）によって証明され得る。
ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性）が有害である障害の多くの例がある。かかる障害の例は、参照により本明細書に組み込まれている米国出願第６０／１２６，６０３号において記載されている。ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３活性（例えば、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの活性）が有害である障害の例は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，９１４，１２８号（例えば、第８１欄第９行目から第８２欄第５９行目）においても記載されている。
特定の障害の処置におけるＩＬ−１２および／またはＩＬ−２３（例えば、Ｉｌ−１２および／またはＩＬ−２３のｐ４０サブユニット）に結合する抗体を含む本発明の製剤の使用は、以下で更に考察される。
Ａ．関節リウマチ
インターロイキン−１２およびインターロイキン−２３は、関節リウマチ等の炎症性疾患の役割を果たすことに関連づけられている。関節リウマチ患者に由来する滑液中で誘導性ＩＬ−１２ｐ４０メッセージが検出されており、関節リウマチを有する患者に由来する滑液中にＩＬ−１２が存在することが示されている（例えば、Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４１：３０６−３１４参照）。関節リウマチ滑膜の下内層中にＩＬ−１２陽性細胞が存在することが見出されている。関節リウマチに対するコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルにおいて、関節炎の前における抗ＩＬ−１２ｍＡｂ（ラット抗マウスＩＬ−１２モノクローナル抗体、Ｃ１７．１５）によるマウスの処置は、発症を非常に抑制し、疾患の発現率および重症度を低下させた。関節炎の発症後における早期の抗ＩＬ−１２ｍＡｂによる処置は重症度を低下させたが、疾患の発症後における抗ＩＬ−１２ｍＡｂによるマウスの遅い処置は、疾患重症度に対して最小限の影響を及ぼした。ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットまたはＩＬ−１２／２３のｐ４０サブユニットを欠失している遺伝子標的マウスを使用して、コラーゲン誘導関節炎の発生にＩＬ−２３が重要であることが示された（Ｍｕｒｐｈｙら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８（１２）：１９５１−１９５７）。
従って、本発明のヒト抗体および抗体部分は、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ライム関節炎、リウマチ性脊椎炎、骨関節炎および痛風性関節炎を処置するために使用され得る。典型的には、抗体または抗体部分は、全身的に投与されるが、ある種の障害については、抗体または抗体部分の局所投与が有益であり得る。本発明の抗体または抗体部分はまた、自己免疫疾患の処置において有用な１種以上の更なる治療剤と共に投与することもできる。
Ｂ．クローン病
インターロイキン−１２およびインターロイキン−２３は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）においても役割を果たす。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の増加した発現が、クローン病を有する患者の腸粘膜中で起こる（例えば、Ｆａｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．１４：２３５−２３８、Ｐａｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：８２３−８３２、Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１２：１１６９−１１７８、Ｂｅｒｒｅｂｉら（１９９８）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２：６６７−６７２参照）。抗ＩＬ−１２抗体は、大腸炎のマウスモデル（例えば、ＴＮＢＳ誘導性大腸炎ＩＬ−２ノックアウトマウスおよび最近ではＩＬ−１０ノックアウトマウス）において、疾患を抑制することが示されている。ＩＬ−２３の増加した発現もまた、クローン病を有する患者において観察されており、炎症性腸疾患（例えば、ＴＮＢＳ誘導性大腸炎）のマウスモデルおよびＲＡＧ１ノックアウトマウスにおいて観察されている。Ｉｌ−２３は、Ｔ細胞媒介性大腸炎に対して本質的であることが示され、大腸炎のマウスモデルにおいて、例えば、ＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいて、ＩＬ−１７およびＩＬ−６依存性機構を通じて炎症を促進することが示されている（例えば、Ｚｈａｎｇらによる総説（２００７）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７：４０９−４１６参照）。従って、本発明の抗体および抗体部分は、炎症性腸疾患の処置において使用され得る。
Ｃ．多発性硬化症
インターロイキン−１２およびインターロイキン−２３は、多発性硬化症の主要な媒介物質として関連づけられている。誘導性ＩＬ−１２ｐ４０メッセージまたはＩＬ−１２自体の発現は、多発性硬化症を有する患者の病変において実証され得る（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９８５−１９９６、Ｄｒｕｌｏｖｉｃら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１４７：１４５−１５０）。多発性硬化症を有する慢性の進行性患者は、ＩＬ−１２の上昇した循環レベルを有する。多発性硬化症を有する患者に由来するＴ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）による検討は、Ｔｈ１型免疫応答につながる進行性多発性硬化症の基礎として自己永続的な一連の免疫相互作用を明らかにした。Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの増加した分泌は、ＡＰＣによる増加したＩＬ−１２産生につながり、増加したＩＬ−１２産生は、Ｔｈ１型免疫活性化および疾患の慢性状態につながるサイクルを永続させた（Ｂａｌａｓｈｏｖら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５９９−６０３）。多発性硬化症におけるＩＬ−１２およびＩＬ−２３の役割は、多発性硬化症のマウスおよびラット実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを使用して検討されてきた。マウスにおける多発性硬化症の再発寛解型ＥＡＥモデルにおいて、抗ＩＬ−１２ｍＡｂによる前処置は、麻痺を遅延させ、臨床スコアを低下させ、麻痺のピーク時または後続の寛解期の間における抗ＩＬ−１２ｍＡｂによる処置は、臨床スコアを低下させた。また、ＥＡＥマウスモデルにおいて、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに対する抗体による処置は、ＥＡＥの誘導を予防し、確立された疾患を逆転させた（Ｃｈｅｎら ２００６ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１６（５）：１３１７−１３２６）。ＩＬ−２３を欠失している遺伝子標的マウスを使用して、脳の自己免疫性炎症に対してＩＬ−２３が重要であることが示された（Ｃｕａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２１：７４４０７４８）。ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに対する抗体は、多発性硬化症の非ヒト霊長類モデル（例えば、コモンマーモセットにおけるＥＡＥ）において有益な活性を有することが示された（Ｈａｒｔら ２００８ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓ．５：３８−５２）。（また、Ｇｒａｎらによる総説、２００４ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：１１１−１２８、ＭｃＫｅｎｚｉｅら ２００６ Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：１７−２３も参照されたい。）。従って、本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ヒトにおける多発性硬化症に伴う症状を緩和させる役目をすることができる。
Ｄ．インスリン依存性糖尿病
インターロイキン−１２は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の重要な媒介物質として関連づけられた。ＩＬ−１２の投与によって、ＮＯＤマウスにおいてＩＤＤＭが誘導され、抗ＩＬ−１２抗体は、ＩＤＤＭの養子移入モデルにおいて保護的であった。早期発症型ＩＤＤＭ患者は、多少の残存する膵島細胞機能が維持されているいわゆる「ハネムーン期間」を経験する場合が多い。これらの残存する膵島細胞は、インスリンを産生し、投与されたインスリンよりも良好に血中グルコースレベルを調節する。これらの早期発症型患者の抗ＩＬ−１２抗体による処置は、膵島細胞の更なる破壊を予防することができ、これによってインスリンの内生源を維持することができる。ストレプトゾトシンの分割した糖尿病誘発性の多回低用量と共に同時投与した場合にＩＬ−２３がマウスにおける糖尿病を誘導したという観察に基づいて、ＩＬ−２３は、糖尿病を悪化させることに関連づけられてきた（例えば、Ｃｏｏｋｅによる総説 ２００６ Ｒｅｖ．Ｄｉａｂｅｔ．Ｓｔｕｄ．３（２）：７２−７５参照）。従って、本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、糖尿病に伴う症状を緩和させる役目をすることができる。
Ｅ．乾癬
インターロイキン−１２およびインターロイキン−２３は、乾癬の主要な媒介物質として関連づけられている。乾癬は、ＴＨ１型サイトカイン発現プロファイルを伴う急性および慢性の皮膚病変を伴う（Ｈａｍｉｄら（１９９６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２２５−２３１、Ｔｕｒｋａら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：６９０−６９９）。マウスにおいて、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットの過剰発現および組換えＩＬ−２３の注射の両方は、炎症性皮膚疾患をもたらし、マウス乾癬モデルへの抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体の投与は、乾癬病変を消失させた。罹病したヒト皮膚試料中で、ＩＬ−１２ｐ３５およびｐ４０ｍＲＮＡが検出された。他の研究において、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットおよびＩＬ−２３のｐ１９サブユニットの両方の増加した発現がヒト乾癬病変において観察され、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３の減少した発現が乾癬治療後に観察された。ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットにおける遺伝子多型は、乾癬に対する増加した感受性に結びつけられている（例えば、Ｔｏｒｔｉらによる総説（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５７（６）：１０５９−１０６８、Ｆｉｔｃｈら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４６１−４６７参照）。ＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、乾癬性関節炎における重要な因子としても同定されている（例えば、Ｈｕｅｂｅｒらによる総説 ２００７ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １１４：５９−６５参照）。従って、本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、乾癬等の慢性的皮膚障害ならびに乾癬性関節炎を緩和させる役目をすることができる。
Ｆ．他の障害
インターロイキン１２および／またはインターロイキン２３は、免疫および炎症性の要素を含む様々な疾患に伴う病状において重要な役割を果たす。これらの疾患としては、関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、皮膚炎強皮症、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム硬化症、播種性血管内凝固、川崎病、グレーヴス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ−シェーンライン紫斑（Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病（散発性）、多内分泌腺機能低下症候群Ｉ型および多内分泌腺機能低下症候群ＩＩ型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸促迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ ａｒｔｈｏｐａｔｈｙ）、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸疾患性滑膜炎、クラミジア、エルシニアおよびサルモネラ関連関節症、脊椎関節症（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｏｐａｔｈｙ）、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、リニアＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス試験陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／ローヤルフリー病、慢性皮膚粘膜カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、原因不明の自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全（分類不能型低γグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、線維性肺疾患、原因不明の線維性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織病関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬剤誘発性間質性肺疾患、放射線性線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球性浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性またはルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫性媒介低血糖、黒色表皮腫を伴うＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、骨関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体疾患、腎臓の顕微鏡的血管炎（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、ライム病、円板状エリテマトーデス、男性不妊症（特発性またはＮＯＳ）、***自己免疫、多発性硬化症（全亜型）、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、結合組織病に続発する肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺病変、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スチル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎および尋常性白斑が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のヒト抗体および抗体部分は、自己免疫疾患、特に、リウマチ性脊椎炎、アレルギー、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎等の炎症を伴う自己免疫疾患を処置するために使用され得る。
本発明の実施は、以下の実施例からなおより完全に理解されるが、それらの実施例は、例示目的だけのために本明細書において示され、いかなる形であれ本発明を限定すると解釈されるべきではない。
本出願にわたって引用され得る全ての引用文献（参考文献、特許、特許出願およびウェブサイト等）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の実施は、特に明記しない限り、当技術分野において周知のタンパク質分析の慣用の技術を用いる。
例示
実施例１は、例えば実施例２−６において使用されるように、本発明の実施において使用される方法および材料を提供する。実施例２は、例示的な液体Ｊ６９５抗体製剤の調製を記載する。実施例３は、−８０℃から２５℃の間で繰り返された凍結融解サイクルの間における液体Ｊ６９５製剤の安定性を実証する実験を提供する。実施例４は、凍結状態における様々な温度における長期保存の間における液体Ｊ６９５製剤の安定性を実証する実験を提供する。実施例５は、−８０℃から３７℃の間で繰り返された凍結融解サイクルの間における液体Ｊ６９５製剤の安定性を実証する実験を提供する。実施例６は、様々な温度における加速および長期保存の間における液体Ｊ６９５製剤の安定性を実証する実験を提供する。実施例７は、例えば実施例８−９において使用されるように、本発明の実施において使用される方法および材料を提供する。実施例８は、ヒスチジンおよび金属（例えば、銅または鉄）の存在下におけるラムダ軽鎖を含有する抗体の切断の実証を提供する。実施例９は、抗体製剤および溶液成分の様々なパラメータに関する抗体の断片化およびその防止を実証する。これらのパラメータとしては、溶液ｐＨ、抗体濃度、製剤のイオン強度、製剤緩衝液の型および濃度、界面活性剤ならびに安定化賦形剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。実施例１０は、鉄の様々なレベルおよび異なる温度におけるＪ６９５（１００および２ｍｇ／ｍＬ）の断片化を示す。
実施例１：Ｊ６９５の安定性をモニターするために使用された分析方法
実施例１．１：カチオン交換ＨＰＬＣ
弱カチオン交換高速液体クロマトグラフィーを使用してＪ６９５薬物物質の同一性および純度を決定するためにカチオン交換ＨＰＬＣを使用した（ＳＰＤ ＵＶ／ＶＩＳ Ｄｅｔｅｃｔｏｒまたは同等物を有するＳｈｉｍａｄｚｕ １０ＡＤ ＨＰＬＣ）。電荷に基づいて弱カチオン交換静止相（Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０、４ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上において種を解像した。１ｍｇ／ｍＬの濃度で１００マイクロリットルを注入し、１．０ｍＬ／分の流速において、リン酸緩衝液系中で増加する塩（塩化ナトリウム）および減少するｐＨの勾配を利用して試料成分を解像した（移動相Ａ：１０ｍＭリン酸二ナトリウム、ｐＨ７．５、移動相Ｂ：２０ｍＭリン酸二ナトリウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、４００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）。カラム温度を分析にわたって２５℃において維持し、注入前に試料を２−８℃において維持した。参照標準材料に対して試料についての（２８０ナノメートルにおける吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｓｅ）を介して検出した）対象となるメインピークの相対保持時間を比較することによってピークの同一性を決定した。試験試料クロマトグラムについての異質性プロファイルを参照標準クロマトグラフィープロファイルと比較した。試料の主要なアイソフォーム領域、酸性領域および塩基性領域におけるピーク面積の合計を各々報告した。特に異なって述べない限り、全ての試薬は、ＪＴ Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ ＮＪ）から購入した。
実施例１．２：Ｊ６９５結合ＥＬＩＳＡ
結合ＥＬＩＳＡを用いて、ＩＬ−１２に対する抗ＩＬ−１２抗体Ｊ６９５試料の相対結合能力を参照標準の相対結合能力と比較して測定した。このアッセイにおいて、２−８℃における終夜の恒温放置を通じてｒｈＩＬ−１２タンパク質（ＡＢＣ）を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）に結合させた。標準物質および試料をＰＢＳ中の５０％のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）および０．０５％のＳｕｒｆａｃｔａｍｐ−２０（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により５０％の１×ＰＢＳ中で１６０ｎｇ／ｍＬから０．６２５ｎｇ／ｍＬに連続的に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートのｒｈＩＬ−１２被覆ウェル中にロードした。次いで、捕獲したＪ６９５を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって認識した。比色読み出しのための基質としてＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用した。相対結合能力のパーセントを、標準物質および試料に対する４パラメータ曲線適合からの「Ｃ」値の比として計算した。
実施例１．３：サイズ排除ＨＰＬＣ
サイズ排除ＨＰＬＣを用いてＪ６９５の純度を決定した（ＳＰＤ ＵＶ／ＶＩＳ Ｄｅｔｅｃｔｏｒまたは同等物を有するＳｈｉｍａｄｚｕ １０ＡＤ ＨＰＬＣ）。１０マイクロリットルの（２−８℃において維持した）２．０ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液をカラム上に注入し、分析のための十分なシグナルを得た。Ｓｕｐｅｒｄｅｘゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）または同等の静止相および移動相に対する２１１ｍＭＮａ２ＳＯ４／９２ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０を使用して、種を毎分０．７５ｍＬの流速において無勾配に分離した。分析の間、カラム温度を周囲温度で維持した。試験試料を繰り返して注入し、モノマーＪ６９５および他の種を２１４ｎｍにおける吸光度によって検出した。Ｊ６９５抗体の面積を、緩衝液関連ピークを除外した２１４ｎｍの吸光度の試料中の成分の全面積と比較することによって純度を決定した。その方法は、高分子量凝集物および完全Ｊ６９５由来の抗体断片を解像することができた。
実施例１．４：コロイド青色染色還元および非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル
コロイド青色染色還元および非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを用いてＪ６９５の純度を決定した。還元および非還元条件下で、それぞれ、加えたメルカプトエタノールを有するまたは有さない試料緩衝液（２×トリス−グリシンＳＤＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用することによって試料を調製した。最初に、試料および標準物質を、それぞれ還元または非還元ゲルに対して０．４ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬに、ＭｉｌｌｉＱ水中で希釈した。試料を試料緩衝液によって１：１に希釈し、タンパク質に結合し、変性させるＳＤＳと共に約６０℃において約３０分間加熱した。タンパク質に結合するＳＤＳの量は、その分子サイズに正比例した。分子量マーカ（Ｍａｒｋ１２、非染色ＭＷ Ｍａｒｋｅｒｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、試験試料および標準物質（還元および非還元）を１２％（還元）および８−１６％（非還元）のトリス−グリシン商業的ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の別々のレーン上にロードした。タンパク質種の分離を、１×トリス−グリシンランニング緩衝液中で、最初の３０分間は６０Ｖの定常電圧を用いて完了し、次いで染料前部がゲルの底部に達するまで１２５Ｖとした。タンパク質をコロイド青色染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって検出した。非還元ゲル中の純度プロファイルをＪ６９５参照標準に対する試験試料の純度プロファイルと比較することによって純度の質的評価を達成した。走査デンシトメトリー（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ １Ｄデンシトメトリーソフトウェアまたは同等物を有するＵＭＡＸスキャナ）を使用して、還元条件下におけるゲル走行上において検出した重鎖および軽鎖の合計から試料の純度パーセントを決定した。
実施例１．５：タンパク質濃度（Ａ２８０）
分光光度測定によりＪ６９５薬物物質のタンパク質濃度を測定した。試料を３通りにおいて希釈して、０．３から１．５ＡＵの間のＡ２８０におけるＯＤ値を得た。水中の希釈物を、重量測定的に（重量によって）Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ天秤を使用して調製した。分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ８００または同等物）は、２８０ｎｍにおいて無効になった。各試料および対照の吸光度を２８０ｎｍにおいて読み取り、得られた値を希釈について補正し、タンパク質濃度に達する吸光係数によって分割した。Ｊ６９５について、ＡＵ／ｍｇ／ｍＬにおける吸光係数の値は、１．４２であった。
実施例１．６：Ｊ６９５バイオアッセイ
Ｊ６９５細胞に基づくバイオアッセイによって、参照標準と比較したＪ６９５試料の相対活性を測定した。ＮＫ−９２細胞を定義濃度のＩＬ−１２によって刺激し、可変濃度の抗ＩＬ−１２抗体Ｊ６９５と混合した。恒温放置期間の間、ＮＫ−９２細胞は、溶液中のＩＬ−１２の量に比例してインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を分泌した。商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットを使用してＩＦＮ−γの量を定量した。非線形回帰を用いて、試料および参照標準のＩＣ５０値を計算した。個々の試料の活性を参照標準の活性（平均ＩＣ５０値）の割合として表した。
実施例２：Ｊ６９５製剤の調製
以下のプロトコールに従って医薬製剤を製造した。
製剤において使用した材料は、マンニトール、ヒスチジン、メチオニン、ポリソルベート８０、注射用水および（ｐＨを調整するための１０％溶液として使用した）塩化水素酸、ならびにタンパク質濃縮物（すなわち、抗体濃縮物）を含んだ。
実施例２．１：１０Ｌの緩衝液の調製（１０．１３３ｋｇと同等−溶液の密度：１．０１３３ｇ／ｍＬ）
成分を以下のように秤量した（４００．００ｇのマンニトール、１５．５０ｇのヒスチジン、１４．９０ｇのメチオニン、１．００ｇのポリソルベート８０および９．７０１ｇの注射用水）。
５４．８０ｇの塩化水素酸（３７％）と１４５．２０ｇの注射用水とを組み合わせることによって１０％の塩酸溶液を調製した。
以下の予め秤量した（上記の）成分（マンニトール、ヒスチジン、メチオニンおよびポリソルベート８０）を約９０％の注射用水中に溶解することによって緩衝液を調製した。緩衝液成分の添加の順序は、緩衝液の質に影響を及ぼさなかった。
緩衝液成分の全てを加えた後、溶液のｐＨを１０％の塩化水素酸によって約ｐＨ６に調整し、最終重量の水を加えた。
実施例２．２：１０Ｌの製剤の調製（１０．３９８ｋｇと同等）
融解し、場合によってプールした抗体濃縮物に、実施例２．１において調製した緩衝溶液を以下の方法において加えた。Ｊ６９５抗体濃縮物を、医薬製剤の調製前に水浴中で融解した。約１２５ｍｇタンパク質／ｍＬタンパク質濃縮物を有する約１．０ｋｇのタンパク質と同等である約８．３７ｋｇの抗体濃縮物を使用した。濃縮物の密度は、約１．０４６７ｇ／ｍＬであった。バルク溶液の最終重量に達するまで撹拌しながら緩衝液を加えた。
その成分の全てを含有する最終製剤を、滅菌レセプタクル中に２つの０．２２μｍ滅菌膜フィルター（親水性ポリフッ化ビニリデン、０．２２μｍ孔径）を通して濾過した。使用した濾過培地を、窒素を使用して濾過滅菌した。滅菌後、バイアルまたはプレフィルドシリンジのいずれかにおける使用のために製剤を包装した。
当業者は、列挙された成分の当技術分野において認識された分子量を用いて、本明細書において列挙される重量量および／または重量体積比をモルおよび／またはモル濃度に転化させることができることを理解する。本明細書において例示される重量量（例えば、ｇまたはｋｇ）は、列挙される体積（例えば、緩衝液または医薬製剤）に対するものである。当業者は、異なる製剤体積が望まれる場合に重量量を比例して調整することができることを理解する。例えば、３２Ｌ、２０Ｌ、５Ｌまたは１Ｌの製剤は、それぞれ例示された重量量の３２０％、２００％、５０％または１０％を含む。
実施例３：繰り返された凍結融解研究（−８０℃／２５℃）の間の安定化された液体Ｊ６９５製剤の物理化学的分析
Ｊ６９５抗体に対する製剤緩衝液を選択した後、薬物物質を最終製品と同じマトリックスにおいて製剤化した。タンパク質製剤の第１の目標は、医薬的タンパク質薬物の許容し得る貯蔵寿命を保証するように長期間にわたってそのネイティブで医薬的に活性な形態における所定のタンパク質の安定性を維持することである。典型的には、長い貯蔵寿命は、凍結形態（例えば、−８０℃）におけるタンパク質を保存することによって、またはタンパク質を凍結乾燥プロセスに供することによって、すなわち、凍結乾燥形態におけるタンパク質を保存し、使用の直前にそれを再構成することによって達成される。しかし、凍結融解プロセスがタンパク質の安定性に影響を及ぼす場合が多く、このことは、凍結形態における医薬的タンパク質の保存でさえ、凍結融解段階による安定性の喪失を伴う可能性があることを意味することは、当業者に周知である。また、凍結乾燥の第１のプロセス段階は、タンパク質の安定性に負に影響を及ぼし得る凍結をも含む。タンパク質の不安定性の現象に直面するリスクがタンパク質濃度の増加と共に増加することは周知であるので、高タンパク質濃度におけるタンパク質の安定性を維持する製剤化条件を達成することは、困難な課題である。
薬物物質を凍結状態と液体状態との間で最高５回繰り返すことによって、１３８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度におけるＪ６９５抗体の凍結融解挙動を評価した。温度が制御された−８０℃の冷凍庫によって凍結を実施し、２５℃の温度に制御された水浴によって融解を実施した。約３０ｍＬのＪ６９５溶液を、この実験のための３０ｍＬのＰＥＴＧ容器中に充填した。表２は、試験間隔および実施した凍結融解サイクルの回数についての概要を提供する。この研究に対するＪ６９５抗体の所望の質および安定性を定義する基準を表３に列挙する。
Figure 2012510468
この研究に対するＪ６９５抗体の所望の質および安定性を定義する基準は、表３において列挙したものと同じである。
Figure 2012510468
Ｊ６９５を約６（６．２）のｐＨで少なくとも１１０ｍｇ／ｍＬにおいて製剤化する５回の凍結融解サイクルの効果を評価する実験の結果を表４において報告する。表４は、Ｊ６９５抗体が、実施例２において記載したように本発明の医薬組成物において製剤化される場合、化学的性質（カチオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、色、ｐＨ）、生理化学的性質（清澄度、還元および非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ）または生物学的活性（活性ＥＬＩＳＡアッセイ）に対していかなる有害な影響も及ぼすことなく、少なくとも５回繰り返した凍結融解サイクルに供され得ることを示す。
Figure 2012510468
Figure 2012510468
実施例４：凍結状態における様々な温度における長期保存の間における安定化された液体Ｊ６９５製剤の物理化学的分析
最終医療品の貯蔵寿命ならびに医療品製造戦略、ロジスティックスおよび最終医療品の出荷を満たすために、バルクタンパク質（すなわち、薬物物質、活性医薬成分、ＡＰＩ）を、より長い期間、凍結状態において医薬タンパク質の安定性を維持する製剤において製剤化する。理想的には、タンパク質製剤は、バルクタンパク質製造および医療品充填／仕上げの間におけるバルクタンパク質の保存場所の柔軟性を満たすために、凍結状態において様々な温度で、例えば−８０℃、−４０℃および−２０℃で安定性を維持する。当業者は、これが非常に困難な課題であることを認める。
１２１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度におけるＪ６９５抗体の保存安定性を、制御温度条件において長期間の間、−２０℃および−８０℃の範囲内の様々な温度で評価した。定義された保存期間の後、バルクタンパク質を解凍し、Ｊ６９５の安定性に対する保存時間および保存温度の影響を評価した。約１６００ｍＬのＪ６９５溶液を、この実験のための２Ｌのポリエチレンテレフタレートコポリエステル（ＰＥＴＧ）容器中で各々充填した。表４は、試験間隔およびこの実験において適用したＪ６９５抗体のそれぞれの保存温度についての概要を提供する。Ｊ６９５を約６（６．２）のｐＨで少なくとも１１０ｍｇ／ｍＬにおいて製剤化する保存時間および保存温度の効果を評価する実験の結果を表５において報告する。
Figure 2012510468
表６は、Ｊ６９５抗体が、物理的および化学的安定性に対する有害な影響を及ぼすことなく−２０℃から−８０℃の間の様々な温度で少なくとも１８ヵ月間保存に供することができることを実証する。例えば、１８ヵ月の保存時間にわたって、Ｊ６９５抗体試料は、凍結抗体溶液を保存した全ての温度に対して少なくとも９８％のモノマーレベルを示した。同様に、活性ＥＬＩＳＡのデータは、凍結Ｊ６９５抗体溶液を保存した温度とは関係なく、試験したＪ６９５抗体試料が高活性を示すことを実証した。カチオン交換ＨＰＬＣによってモニターしたＪ６９５の化学的安定性に関して、データは、Ｊ６９５抗体の化学的安定性が、−２０℃から−８０℃の間の温度で凍結形態において保存した場合に少なくとも１８ヵ月にわたって影響を受けないことを実証した。要約すると、データは、実施例２において記載されるように医薬組成物において製剤化する場合、化学的性質（カチオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、色、ｐＨ）、生理化学的性質（清澄度、還元および非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ）または生物学的性質（活性ＥＬＩＳＡアッセイ、生物汚染度、エンドトキシンレベル）に対する負の影響を及ぼすことなく、−２０℃から−８０℃の範囲の中の様々な温度で少なくとも１８ヵ月間、Ｊ６９５抗体を保存に供することができることを実証する。
Figure 2012510468
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Figure 2012510468
Figure 2012510468
実施例５：繰り返した凍結融解研究（−８０℃／３７℃）の間の安定化された液体Ｊ６９５製剤の物理化学的分析
Ｊ６９５抗体に対する製剤緩衝液を選択した後、薬物物質を最終製品と同じマトリックスにおいて製剤化した。
（実施例２において記載されるように製剤化した）２つの異なる薬物物質バッチを凍結状態から液体状態に５回繰り返すことによって少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度におけるＪ６９５抗体薬物物質の凍結融解挙動を評価した。この目的のために、実施例２において記載される通りの製剤中の約１．６ＬのＪ６９５を含有する２ＬのＰＥＴＧボトルを使用した。
表７は、−８０℃から開始する製剤緩衝液中の５回の凍結融解サイクルの効果を評価する実験の結果を示す。溶液を、３７℃に調整した水浴中で解凍し、試料試験のために完全な融解を行った直後に除去した。
Figure 2012510468
表７は、清澄度測定、ＰＣＳ、肉眼不可視粒子測定およびサイズ排除ＨＰＬＣによってモニターされる通りの物理化学的性質に対するいかなる有害な影響も及ぼすことなく、製剤緩衝液中のＪ６９５抗体薬物物質を少なくとも５回凍結融解することができることを示す。
例えば、一連の５回の凍結融解サイクルにわたって、試験した全てのＪ６９５抗体試料は、少なくとも９８％のモノマーレベルを示した。一般に、抗体溶液の凍結融解処理は、凝集物の増加および肉眼不可視粒子の数の上昇に反映されるタンパク質の不安定性を誘導するその高リスクが知られている。実施例２において記載されるように医薬組成物において製剤化した場合、一連の５回の凍結融解処理サイクルにわたって、事実上、凝集物レベルの変化はモニターされず（１％を下回る試験した全ての試料に対するレベル）、断片レベルの変化はモニターされず（０．５％をはるかに下回る全ての試料に対するレベル）、および肉眼不可視粒子の数の変化はモニターされなかった（凍結融解研究の全体にわたって事実上変化しないデータ）。
実施例６：加速および長期保存の間における安定化された液体Ｊ６９５製剤の物理化学的分析
１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度におけるＪ６９５抗体の保存安定性を、Ｊ６９５医療品を制御温度条件において保存した場合に様々な温度で長期間評価した。定義された保存期間の後、試料を取り出し、Ｊ６９５の安定性に対する保存時間および保存温度の影響を評価した。
約１ｍＬのＪ６９５溶液を、この実験のための１ｍＬガラスシリンジ中に各々充填した（第１のパッキング：ＳＦ１Ｆ００７Ａ：Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃピストンストッパ４０２３／５０と組み合わせたＳＣＦシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））。表８は、試験間隔およびＪ６９５抗体のそれぞれの保存温度についての概要を提供する。
Figure 2012510468
液体医療品の安定性を評価するために使用した分析試験は、開発された方法または薬局方の方法のいずれかであった。それらの方法を、Ｊ６９５液体医療品の試験のために上記のように適用し、引用した薬局方において記載されているように実施した。
Ｊ６９５を約６のｐＨで１００ｍｇ／ｍＬにおいて製剤化した保存時間および保存温度の効果を評価する実験の結果を表９において報告する。表９は、Ｊ６９５抗体が、物理的および化学的安定性に対する有害な影響を及ぼすことなく２℃から８℃の間の温度範囲において少なくとも２４ヵ月間保存に供することができることを実証する。例えば、２４ヵ月の保存時間にわたって、試験した全てのＪ６９５抗体試料は、清澄度、色、外観、肉眼不可視粒子レベルおよびｐＨに関して事実上不変のままだった。更に、少なくとも２４ヵ月の期間にわたって、１００ｍｇ／ｍＬにおいて実施例２において記載されるように製剤化したＪ６９５は、少なくとも９８％のモノマーレベルを示し、断片レベルは０．５％を十分に下回った。加速保存条件においてさえ、Ｊ６９５は高度に安定であり、モノマーレベルは、６ヵ月間の４０℃における保存の後でさえ９０％を超えた。
化学的安定性に関して、１００ｍｇ／ｍＬにおける実施例２において記載されるように組成物において製剤化したＪ６９５抗体は、２−８℃において少なくとも２４ヵ月間、少なくとも８０％の主要アイソフォームレベルを示し、塩基性検体レベルは１０％を十分に下回り、酸性検体レベルは２０％を十分に下回った。加速保存条件においてさえ、Ｊ６９５は高度に安定であり、２５℃における６ヵ月間の保存の後でさえ、凍結抗体溶液を保存した全ての温度に対して、主要アイソフォームレベルは８０％を超え、塩基性検体レベルは１０％を十分に下回り、酸性検体レベルは２０％を十分に下回った。
要約すると、データは、実施例２において記載されるように医薬組成物において製剤化する場合、化学的性質（カチオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、色、ｐＨ）、生理化学的性質（清澄度、肉眼不可視粒子レベル、サイズ排除ＨＰＬＣ）または他の性質（活性ＥＬＩＳＡアッセイ、タンパク質濃度）に対する負の影響を及ぼすことなく、２℃から８℃において少なくとも２４ヵ月間、Ｊ６９５抗体を保存に供することができることを実証する。
Figure 2012510468
Figure 2012510468
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実施例７：切断研究のための方法および材料
実施例７．１：材料
メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、マンニトール、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、塩化ナトリウム、リン酸塩、酢酸塩、デスフェリオキサミン、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、トリス−塩酸塩、デスフェリチオシン、スーパーオキシドジスムターゼおよび最高グレードのブチルヒドロキシトルエンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。Ｎ−グリカナーゼをＰｒｏｚｙｍｅ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）から購入した。硫酸鉄（ＩＩ）−７Ｈ２Ｏ、硫酸マグネシウム、硫酸ニッケル（ＩＩ）、硫酸コバルト（ＩＩ）および硫酸マンガン（ＩＩ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。塩化第二鉄−６Ｈ２ＯをＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。硫酸第二銅−５Ｈ２ＯをＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。硫酸亜鉛−７Ｈ２ＯをＪＴ Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。Ｃ１８トラップをＭｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入し、キャピラリー（裸の非被覆キャピラリー（５０μｍ ｉｄ、全長３０ｃｍ））およびＳＤＳ ＭＷ試料緩衝液をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。
実施例７．２：方法
実施例７．２．１：抗体の脱グリコシル化
質量スペクトルを単純化するためにＮ−グリカナーゼを使用して酵素的に試料を脱グリコシル化した。約３０μｌの各試料（濃度約１ｍｇ／ｍＬ）を２μｌの１０％ｗ／ｗ ｎ−オクチルグルコシドに加え、２μｌのＮ−グリカナーゼおよび試料を３７℃において１９時間恒温放置した。
実施例７．２．２：サイズ排除クロマトグラフィー
以下に記載する２つの方法のいずれかを用いてＳＥＣを実施した。（ａ）抗体断片および凝集物をモノマーから分離するためにＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（１０／３００ＧＬ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した。２１１ｍＭのＮａ２ＳＯ４を９２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）と共に使用してアイソクラチック条件下において分離を行った。２１４ｎｍおよび０．５ｍＬ／分において維持した流速において検出を実施した。典型的には、約１００μｌの１ｍｇ／ｍｌ溶液（１００μｇロード）をカラム上に注入した。１０ｋＤ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して、カラムから分画した材料を５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中に濃縮および交換した。典型的には、より小さい注入体積（２０μｌの１ｍｇ／ｍｌ、２０μｇロード）を用いること以外は同じ方法を用いて、分画した材料をＳＥＣカラム上に再注入した。（ｂ）抗体の凝集物および断片をモニターするために、代わりにＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。２１１ｍＭのＮａ２ＳＯ４を９２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）と共に使用してアイソクラチック条件下において分離を行った。２１４ｎｍおよび０．２５ｍＬ／分において維持した流速において検出を実施した。典型的には、約１０μｌの２ｍｇ／ｍｌ溶液（２０μｇロード）をカラム上に注入した。
実施例７．２．３：質量分析
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００キャピラリーＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に連結したＡＰＩ ＱＳＴＡＲパルサーＱＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）上において試料を分析した。試料を質量分析計内に導入し、Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）からのＣ１８マイクロトラップを使用して脱塩した。試料を最初の５分間は水性条件（０．０２％ＴＦＡ、水中の０．０８％ギ酸）下でロードして塩を除去し、次いで有機条件（０．０２％ＴＦＡ、アセトニトリル中の０．０８％ギ酸）下で溶出させた。１ｍｇ／ｍＬ（１０μｇのロードに対して１０μｌの注入）のおよその濃度で試料を走行させた。質量スペクトルを単純化するのを助けるために、試料を室温において５０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）によって３０分間処置し、ジスルフィド結合を減少させ、軽鎖および重鎖成分を放出させた。別の場合、試料を非還元において走行させ、脱グリコシル化して質量スペクトルを単純化した。３０μｌ（およその濃度＝１ｍｇ／ｍＬ）の各試料に２μｌの１０％ｗ／ｗ ｎ−オクチルグルコシドおよび２μｌのＮ−グリカナーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を加え、３７℃において１９時間恒温放置した。４５００のキャピラリー電圧、非還元試料に対して１５００−３５００、還元試料に対して５００から２５００のｍ／ｚ走査範囲によって正イオンモードにおいて走行するように質量分析計を設定した。レニン基質ペプチド（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｒ−８１２９）を用いて計器をチューンし、キャリブレートした。ＢｉｏＡｎａｌｙｓｔソフトウェアバージョン１．１を使用してＥＳＩ質量スペクトルのデコンボリューションを実施した。
実施例７．２．４：キャピラリー電気泳動
全ての研究をＰｒｏｔｅｏｍｅｌａｂ ＰＡ８００ ＣＥシステムまたはＰ／ＡＣＥ ＭＤＱシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）上において実施し、検出を２１４ｎｍにおいて実施した。０．２ミクロンの検出器窓を有する５０μｍ ｉｄ×全長３０ｃｍの寸法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ部品番号３３８４５１）による分離のために裸の非被覆キャピラリーを使用した。非還元条件下で試料調製を実施した。約１００μｇの試料を０．５ｍＬバイアルに加え、適切な体積のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて１００μｌの最終体積を得た。次いで５μｌの５００ｍＭヨードアセトアミドを加え、その後５０μｌの５０ｍＭ酢酸（ｐＨ４）１％ＳＤＳ緩衝液を加えて１ｍｇ／ｍＬの終濃度とした。試料を十分に混合し、６０℃において１０分間恒温放置した。最後に試料をオートサンプラバイアルに移し、分析を待つ１０℃のオートサンプラ内に置いた。キャピラリーの走行前調整のための方法パラメータは、７０ｐｓｉにおいて３分間の（逆流を使用する）塩基性洗浄処理（０．１Ｎ水酸化ナトリウム）、その後の７０ｐｓｉにおいて３分間の酸性洗浄処理（０．１Ｎ塩化水素酸）、その後の７０ｐｓｉにおいて１分間の水洗浄処理（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）、その後の７０ｐｓｉにおいて１０分間のＳＤＳ−Ｇｅｌ充填（ＳＤＳ ＭＷ Ｇｅｌ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．３９１１６３）、その後のＭｉｌｌｉ−Ｑ水浸漬を行ってキャピラリーを洗浄することであった。試料を１５ｋＶにおいて１０秒間動電学的に注入し、その後Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水浸漬を行ってキャピラリーを洗浄した。電圧分離は、１５ｋＶにおいて３５分間だった。キャピラリー温度は２０−２５℃であり、試料保存温度は１０℃であった。
実施例７．２．５：ＩＣＰ−ＭＳ
試料を、低解像度ＩＣＰ−ＭＳのためにＱＴＩ−Ｉｎｔｅｒｔｅｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ、ＮＪ、ＵＳＡ）に、高解像度ＩＣＰ−ＭＳのためにＡＱｕｒａ ＧｍｂＨ（Ｒｏｄｅｎｂａｃｈｅｒ Ｃｈａｕｓｓｅｅ４、Ｄ−６３４５７ Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に提出した。低解像度ＩＣＰ−ＭＳのために、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｌａｎ ＩＣＰ−ＭＳ分光計を使用したが、一方で高解像度のために、ＨＲ−ＩＣＰ−ＭＳ Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｍｅｎｔ ＸＲを使用した。
実施例７．２．６：濾過
実施例７．２．６．１：限外濾過（ＵＦ）は、静水圧によって半透膜に対して液体を押しやる一種の膜濾過である。抗体が保持されるが、一方で水および鉄塩等の低分子量の溶質が膜を通過する。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの指示書に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ３０Ｋ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２再生セルロース膜を設置した。製造業者のトルク仕様を維持し、適切な圧力計、管およびポンプと共にＵＦシステムをセットアップした。次いで、適切にバルブを開いて限外濾過を開始した。入口（フィード）圧および出口圧を規定の範囲内に維持し、透過流量および圧力を厳密にモニターした。１５−３０分間毎にデータを記録した。限外濾過が完了した後、最終重量を記録し、濃度をＡ２８０によって決定した。
実施例７．２．６．２：透析濾過（ＤＦ）は、一定体積を維持するためにフィルターを通して失われた溶液の量を置き換えるために緩衝液を加える濾過操作（通常はＵＦ）と共に実施されるタンジェント流濾過プロセスである。ＤＦは、金属を除去して、元の溶液を新しい緩衝液と置き換えるために使用される。膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ指示書につきＭｉｌｌｉｐｏｒｅ３０Ｋ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）の表面に沿って接線方向に液をポンピングする。定常圧力を印加して、一部の液を、膜を通して濾液側面に押しやる。ＵＦにおけるように、ＩｇＧ分子は、あまりに大きいので膜細孔を通過することができず、上流側の側面上に保持される。保持された成分は、膜の表面において集積しない。代わりに、それらの成分は、タンジェント流によって押し流される。少なくとも８の透析濾過容量を用いて鉄を除去する。
実施例８：断片化分析
実施例８．１：ヒンジ領域におけるＩｇＧ分子（Ｊ６９５）の断片化
ＳＥＣは、クロマトグラムにおけるモノマーのピークの低下および更なるピークの出現をモニターするために一般的に用いられる。図２は、４０℃における約６ヵ月間の保存後のモノクローナル抗体の典型的なＳＥＣプロファイルを示す。４つの画分（画分１−４）を回収し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＳおよびＣＥ−ＳＤＳによって分析した。画分１および２は、それぞれ凝集物およびモノマー抗体を表す。画分３は、Ｆａｂアーム（Ｆａｂ＋Ｆｃまたは断片２）の喪失によって形成された１００ｋＤａの種ならびに重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）の間のチオエーテル結合から構成された低い割合の非還元性（ＮＲ）種を含有する（Ｔｏｕｓ，Ｇ．Ｉ．ら（２００５）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７７（９）：２６７５−８２）。画分４は、Ｆａｂアームを含有する（Ｃｏｒｄｏｂａ，Ａ．Ｊ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８１８（２）：１１５−２１）。
還元条件下（図３、レーン１および２）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる凝集物およびモノマーの分析は、１００ｋＤａの見掛けの質量を有するＨＣ、ＬＣおよびＮＲ種を示した。非還元性である高次凝集物は、画分１において見出され、画分２において小さい程度に見出される。還元条件（レーン３）下における画分３の分析は、ＨＣ、ＬＣ、ＮＲ種および重鎖（ＨＣ−Ｆｃ）のＦｃ断片を示した。画分４（レーン４）の分析は、ＬＣおよびＨＣ（ＨＣ−Ｆａｂ）のＦａｂ断片を示した。
画分３および４をＥＳＩ／ＬＣ−ＭＳによっても分析した。図４は、画分３の脱グリコシル化の後で得られたスペクトルを示す。Ｆａｂアームの喪失をもたらしたＩｇＧ分子の重鎖のヒンジ領域において多数の切断部位を観察した（表９にまとめたピークａ−ｅ）。切断の主要な部位は、残基Ｈｉｓ−２２２とＴｈｒ−２２３（Ｈ／Ｔ）の間のピーク−ａならびに残基Ｃｙｓ−２１８とＡｓｐ−２１９（Ｃ／Ｄ）の間のピーク−ｅにおいて観察される。軽微な切断部位は、Ｔ／Ｈ、Ｋ／ＴおよびＤ／Ｋの間で見出される。Ｓｅｒ−２１７とＣｙｓ−２１８（Ｓ／Ｃ）の間の切断部位は見出されず、Ｃｏｈｅｎら（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（２２）：６９７６−７によって以前により高いｐＨ８において報告されたＨＣ上におけるアスパラギン酸残基への７０Ｄａの付加も見出されなかった。
図５は、対応するＦａｂ種を含有した画分４から得られたＭＳスペクトルを示す（表１０にまとめたピークｆ−ｊ）。
Figure 2012510468
切断の主要な部位は、Ｃ／Ｄ残基間のピーク（ｆ）およびＨ／Ｔ残基間のピーク（ｊ）においても見られる。Ｄ／ＫおよびＴ／Ｈの間の軽微な切断部位は、断片２のスペクトルと比較した場合におけるＫ／Ｔ間の高次の切断と共に見出される。また、画分４における遊離軽鎖断片（ピーク（ｋ）−残基１−２１５）および重鎖断片（ピーク（ｌ）−残基１−２１７）の存在も図６（表１０にまとめられたピークｋおよびｌ）において示される。上記したように、断片２１８−４４４を含有する対応する断片２種も、Ｃｏｈｅｎら（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（２２）６９７６−７によって報告される通りのＡｓｐ−２１９残基への７０Ｄａの付加も見られなかった。
画分３および４をＣＥ−ＳＤＳによっても分析した。図７は、画分３および断片２種の移動位置の電気泳動図を示す（Ｆａｂアームの喪失）。完全抗体の電気泳動図において観察されるように、断片２は、主要なモノマーピークならびに他のピークから十分に解像され、このことによって、従って、後続の分析のためのこの断片のレベルの正確な評価が提供された。画分４は、完全ＦａｂならびにＬＣおよびＨＣ断片を示した。
実施例８．２−鉄または銅の存在は、ヒスチジンの存在下で用量依存的方法においてＩｇＧ分子の切断を引き起こした
一実施形態において、鉄およびヒスチジンが製剤中に存在する場合、４０℃におけるラムダ軽鎖含有抗ＩＬ−１２抗体Ｊ６９５ロット１の恒温放置は、ヒンジ領域における抗体の断片化を増進する（表１１）。
Figure 2012510468
４０℃において、Ｊ６９５（ロット１）中における断片化のレベルは、５つの正常ロットから得られた平均０．５％と比較した場合、４．７３％と高かった。ＣＥ−ＳＤＳを用いて、断片２（Ｆａｂ＋Ｆｃ）のレベルが正確に推定され、Ｊ６９５ロット１において３倍高いことが示された（表１２）。
Figure 2012510468
他の分解種をＣＥ−ＳＤＳによって定量し、Ｆａｂ断片のレベルは上昇した。断片（ＬＣ／ＨＣ断片）のレベルは、同様に有意に上昇した。
行われた多くの研究は、Ｊ６９５ロット１における増加した断片化の理由としてプロテアーゼ活性を支持しなかった。例えばプロテアーゼ阻害剤のカクテルによる恒温放置は断片化のレベルを低下させず、モノクローナル抗体を除去した後の二次元ゲル電気泳動および宿主細胞タンパク質の同定も、プロテアーゼの汚染の証拠を示さなかった（結果は示さない。）。
断片化の正常レベルは、４０℃における１０，０００のＭＷＣＯ膜を使用してクエン酸に対する透析後に回復したが（図８）、このことは、金属がＪ６９５ロット１の増強された断片化に関与することを示唆する。続いて多くの実験を実施して、断片化における金属の役割を評価した。Ｊ６９５ロット１ならびに他のロットを、ＩＣＰ−ＭＳによって６４の異なる元素の存在について分析した。これらの研究は、高解像度ＩＣＰ−ＭＳを用いて５つの正常ロットと比較した場合にＪ６９５ロット１が１０倍の鉄のレベル（５００ｐｐｂ）を有したことを実証した（表１３）。
Figure 2012510468
抗体試料を異なるレベルの金属塩（２．５、１０および５０ｐｐｍ）によって正常ロット中にスパイクし、４０℃において恒温放置した。図９に示すように、鉄または銅のいずれかの酸化状態を有する製剤は、断片化（断片２）の用量依存的増加を示した。試験した他の金属は、断片化に対して影響を及ぼさなかった。５００ｐｐｂのスパイクされた鉄（２．５ｐｐｍの鉄塩）によって観察された断片化のレベルは、Ｊ６９５ロット１に対して観察されたレベルと同様であった。表１４は、ＣＥ−ＳＤＳによって分析した通りの異なる金属によって誘導された抗体の分解プロファイルをまとめたものである。抗体試料を、分析前の１ヵ月間、４０℃において保存した。Ｆａｂ、遊離ＬＣ／ＨＣ断片および断片２（Ｆａｂ＋Ｆｃ）のレベルは、鉄または銅の存在下で全て上昇し、他の金属の存在下で変化しなかった。
Figure 2012510468
実施例８．３：デスフェリオキサミン（鉄特異的キレーター）による鉄のキレート化、抑止された断片化
Ｊ６９５ロット１を１ｍＭのデスフェリオキサミン（鉄特異的キレーター）を用いて恒温放置した。４０℃において１ヵ月の恒温放置後、正常レベルの断片化を観察した（図１０）。鉄（５００ｐｐｂ）によって正常抗体ロットをスパイクすることによって断片レベルの上昇が示され、これはデスフェリオキサミンによる前保温によって正常レベルに回復した（図１０）。
実施例８．４：ヒスチジンおよび鉄の両方によって触媒された断片化の増強
ヒスチジンからの金属誘導断片化に対する寄与を検討した（図１１）。モノクローナル抗体の正常ロットを水に対して透析した。鉄単独（５０ｐｐｍ）またはヒスチジン単独（１０ｍＭ）を加え、または６．０の一定のｐＨにおける異なる濃度のヒスチジン（２、５および１０ｍＭ）と共に鉄（５０ｐｐｍ）をモノクローナル抗体に加え、４０℃において１週間恒温放置した。図１１に示すように、ヒスチジンの存在も鉄単独も、対照レベルを超えた抗体断片化の有意な増加をもたらさなかった。しかし、鉄およびヒスチジンによって一緒に抗体を恒温放置した場合、断片化の用量依存的増加が観察され、このことは、製剤に加えたヒスチジンのレベルが鉄誘導断片化において有意な役割を果たす可能性があることを示した。
実施例８．５：ストレスをかけた正常ロットおよびＪ６９５ロット１中における金属触媒断片化の間のＭＳスペクトルの比較は異なる切断プロファイルを示す
図１２は、断片２（Ｆａｂ＋Ｆｃ）の脱グリコシル化の後のＭＳスペクトルの比較を示す。ヒンジ領域配列ＳＣＤＫＴＨＴＣ中におけるＣｙｓ−２１８とＡｓｐ−２１９（Ｃ／Ｄ）の間の切断はＪ６９５ロット１において有意に上昇したが、一方で分子上の他の切断部位における切断は増加しなかった。しかし、Ｆａｂ種の分析（図１３）は、Ｊ６９５ロット１中におけるこの切断部位（残基１−２１８）における対応するＦａｂ断片のレベルがストレスをかけた正常ロットと同等であるが、一方でＳｅｒ−２１７とＣｙｓ−２１８（Ｓ／Ｃ）の間で切断された遊離ＨＣ断片が有意に上昇して残基１−２１７からＨＣ断片が得られた（図１４）ことを示した。Ｃｏｈｅｎら（（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（２２）６９７６−７）は、Ｓ／Ｃ結合間の切断がβ−除去機構を介して起きることを最近実証した。この機構はより高いｐＨ（ｐＨ８）において優勢であり、この機構の前にＬＣ−ＨＣジスルフィド結合の破壊およびデヒドロアラニン残基の後続の加水分解が起こり、これらは、セリンアミドによって終止するＦａｂ断片（１Ｄａ質量の付加）およびピルボイル基を有するＣ末端Ｆｃ断片（アスパラギン酸残基への７０Ｄａ質量の付加）をもたらす。結果は、残基Ｃ／Ｄ間の切断部位の増加およびアスパラギン酸残基への２７Ｄａの付加（表１４におけるピークＣ）を示し、加水分解の異なる機構を示唆した。Ｊ６９５ロット１中におけるＥ／Ｃ（残基１−２１５）間で切断された遊離軽鎖の上昇したレベル（図１４）が観察された。表１５は、異なるＭＳスペクトルの比較のために得たデータをまとめたものである。
Figure 2012510468
実施例８．６：切断機構は、ラムダ鎖を含有する分子に特異的である
カッパまたはラムダ軽鎖を有する抗体分子の加水分解を触媒する鉄およびヒスチジンの能力を検討した。ラムダＬＣを有する２個のＩｇＧ分子は鉄およびヒスチジンによって切断されたが、カッパＬＣを有するＩｇＧ分子は切断されなかった（図１５）。図１６は、その周りにおいてＩｇＧ分子の加水分解が観察される残基の配列を示す。
実施例９：加速安定性研究
一実施形態において、鉄およびヒスチジンが製剤中に存在する場合、４０℃におけるラムダ軽鎖含有抗ＩＬ−１２抗体Ｊ６９５の恒温放置は、ヒンジ領域における抗体の断片化を増進する。従って、これらの研究のための４０℃の恒温放置温度を選択した。温度それ自体によって誘導された抗体の断片化と鉄およびヒスチジンの存在によって誘導された断片化との間を明らかに区別するために、陽性対照（すなわち、鉄およびヒスチジンを含有する抗体製剤）が参照製剤（すなわち、ヒスチジンを含有するが鉄を欠いたそれぞれの製剤）によって消去されるように全ての加速安定性研究を設計し、実施した。
実施例９．１から９．１５において列挙した実験において試験した全ての様々なＪ６９５製剤を滅菌非発熱性ポリプロピレン低温貯蔵バイアル中に充填し、４０℃において最高３ヵ月間恒温放置した。所定の時点において（すなわち、４０Ｃ／７５％ＲＨにおける保存のＴ１月の後およびＴ３月の後のＴ０において）、全ての製剤の試料を取り出し、様々な製剤中における抗体断片化の程度を７．２．２において記載されるようにＳＥＣによって決定した。
実施例９．１：溶液ｐＨ５における鉄の存在下におけるＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄。
更に、以下の組成において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５ｐｐｍの鉄。
これらの研究の結果を表１５ １において列挙する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中における鉄およびヒスチジンの存在が、２ｍｇ／ｍＬにおける対照（すなわち、製剤を欠いた鉄）と比較してＪ６９５断片化を促進することが実証される。しかし、それらの結果によって、ｐＨ５への低下がＪ６９５を鉄−ヒスチジン媒介断片化から保護したことも実証される。断片化のこの低下は、ｐＨ６．０またはｐＨ７．０において観察されなかった（例えば、以下の表１５．２および表１５．３参照）。
Figure 2012510468
実施例９．２：溶液ｐＨ６における鉄の存在下におけるＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄、ならびに
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および２．５ｐｐｍの鉄。
更に、以下の組成において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、
ｅ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５ｐｐｍの鉄、ならびに
ｆ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、２．５ｐｐｍの鉄。
これらの研究の結果を表１５．２において列挙する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中における鉄およびヒスチジンの存在が、２ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬの両方のＪ６９５における対照（すなわち、鉄を欠いた製剤）と比較して実質的なＪ６９５断片化につながることが実証される。それらの結果によって、鉄レベルの増加がＪ６９５断片レベルの増加をもたらすことが更に実証される。
Figure 2012510468
実施例９．３：溶液ｐＨ７における鉄の存在下におけるＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄。
更に、以下の組成において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、および
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５ｐｐｍの鉄。
これらの研究の結果を表１５．３において列挙する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中における鉄およびヒスチジンの存在が、幅広いタンパク質濃度範囲（すなわち、２ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬまで）にわたって対照（すなわち、鉄を欠いた製剤）と比較してＪ６９５断片化を助長することが実証される。それらの結果によって、鉄−ヒスチジン媒介断片化の帰結としてのＪ６９５の断片化が製剤のｐＨに依存することが更に実証される。表１５．３において示されるように、６．０を上回るｐＨを有する製剤（表１５．３）は、より断片化の傾向がある。１００ｍｇ／ｍＬおよびｐＨ７．０において断片化は横ばいになるが、一方で２ｍｇ／ｍＬにおいて、断片化はｐＨ７．０において増加し続ける。
Figure 2012510468
実施例９．４：様々なイオン強度の条件におけるＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄、
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および１５０ｍＭのＮａＣｌ、ならびに
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５ｐｐｍの鉄および１５０ｍＭのＮａＣｌ。
更に、上記で列挙した組成（ａ）から（ｄ）において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。
これらの研究の結果を表１５．４において列挙する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中における鉄およびヒスチジンの存在が、２ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬの両方のＪ６９５における対照（すなわち、鉄を欠いた製剤）と比較して実質的なＪ６９５断片化につながることが実証される。それらの結果によって、イオン強度がＪ６９５の鉄−ヒスチジン媒介断片化に影響を及ぼさないことが更に実証される。
Figure 2012510468
実施例９．５：溶液ｐＨ６において鉄およびヒスチジンの存在下でアルギニン緩衝液において製剤化したＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ａ）３０ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに
ｂ）３０ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄。
更に、以下の組成において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。
ｃ）３０ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、および
ｄ）３０ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５ｐｐｍの鉄。
これらの研究の結果を表１５．５において列挙する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中における鉄およびヒスチジンの存在が、対照（すなわち、鉄を欠いた製剤）と比較してＪ６９５の断片化をもたらし、アルギニン等の他の有機およびアミノ酸系緩衝液の存在が、タンパク質濃度（例えば、２ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬ）に関係なくＪ６９５の鉄−ヒスチジン媒介断片化に対して影響を及ぼさないことが実証される。
Figure 2012510468
実施例９．６：溶液ｐＨ６において鉄およびヒスチジンの存在下でリン酸緩衝液において製剤化したＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０濃度で抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ａ）３０ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに
ｂ）３０ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄。
更に、以下の組成において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ｃ）３０ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、および
ｄ）３０ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５ｐｐｍの鉄。
これらの研究の結果を表１５．６において列挙する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中における鉄およびヒスチジンの存在が２ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬの両方においてＪ６９５断片化をもたらさないことが実証される。それらの結果によって、抗体製剤中におけるリン酸塩の使用が、タンパク質濃度（例えば、２ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬ）に関係なく抗体の鉄−ヒスチジン媒介断片化を減少させることが更に実証される。
Figure 2012510468
実施例９．７：溶液ｐＨ６における鉄およびヒスチジンの存在下における酢酸緩衝液において製剤化したＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０において抗体Ｊ６９５を製剤化した。
ａ）３０ｍＭの酢酸塩、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに
ｂ）３０ｍＭの酢酸塩、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄。
更に、以下の組成において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。
ｃ）３０ｍＭの酢酸塩、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、および
ｄ）３０ｍＭの酢酸塩、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５ｐｐｍの鉄。
実施例９．１において概説されるように、様々な温度における恒温放置、試料の取り出しおよび得られた４個の製剤中における断片化の分析を実施した。
これらの研究の結果を表１５．７において提供する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中における鉄およびヒスチジンの存在が、対照（すなわち、鉄を欠いた製剤）と比較してＪ６９５の断片化をもたらし、酢酸等の他の有機系緩衝液の存在が、タンパク質濃度（例えば、２ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬ）に関係なくＪ６９５の鉄−ヒスチジン媒介断片化に対して影響を及ぼさないことが実証される。
Figure 2012510468
実施例９．８：ポリソルベート８０の存在下におけるＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６においてＪ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトールおよび０．５ｐｐｍの鉄
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄
更に、上記で列挙した組成（ａ）から（ｄ）において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。この実験の結果を表１５．９において提供し、以下において実施例９．９において考察する。
実施例９．９：ポロキサマー１８８の存在下におけるＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトールおよび０．５ｐｐｍの鉄、
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．１％（ｍ／ｖ）のポロキサマー１８８、ならびに
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．１％（ｍ／ｖ）のポロキサマー１８８および０．５ｐｐｍの鉄。
更に、上記で列挙した組成（ａ）から（ｄ）において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。
実施例９．８および９．９において記載される実験の結果を表１５．９において提供する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中における鉄およびヒスチジンの存在が、対照（すなわち、鉄を欠いた製剤）と比較してＪ６９５の断片化をもたらし、ポリソルベート８０またはポロキサマー１８８等の界面活性剤の有無が、タンパク質濃度（例えば、２ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬ）ならびに界面活性剤の型および濃度に関係なくＪ６９５の鉄−ヒスチジン媒介断片化に対して影響を及ぼさないことが実証される。
Figure 2012510468
実施例９．１０：マンニトールの存在下におけるＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄、
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄。
更に、上記で列挙した組成（ａ）から（ｄ）において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。実施例９．１において概説されるように、様々な温度における恒温放置、試料の取り出しおよび得られた８個の製剤中におけるＪ６９５の断片化の分析を実施した。
これらの研究の結果を表１５．１０において列挙する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中における鉄およびヒスチジンの存在が、対照（すなわち、鉄を欠いた製剤）と比較してＪ６９５の断片化をもたらし、この断片化プロセスが、糖および糖アルコール、例えばマンニトールの様々な濃度（例えば、０および１５０ｍｇ／ｍＬ）ならびにタンパク質濃度（例えば、２ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬのＪ６９５）によって影響を受けないことが実証される。
Figure 2012510468
実施例９．１１：デスフェリオキサミンの存在下におけるＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０ならびに０．５および２．５ｐｐｍの鉄、
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および１ｍＭのデスフェリオキサミン、ならびに
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５および２．５ｐｐｍの鉄ならびに１ｍＭのデスフェリオキサミン。
更に、上記で列挙した組成（ａ）から（ｄ）において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。実施例９．１において概説されるように、様々な温度における恒温放置、試料の取り出しおよび得られた１２個の製剤中におけるＪ６９５の断片化の分析を実施した。
これらの研究の主要な結果を表１５．１１において列挙する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中におけるデスフェリオキサミンの存在が、対照（すなわち、デスフェリオキサミンを欠いた製剤）と比較してＪ６９５の安定性に対して負の影響を及ぼさないことが実証される。それらの結果によって、デスフェリオキサミンが、幅広い鉄濃度にわたって、および幅広いタンパク質濃度にわたって（例えば、２ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬのＪ６９５において）Ｊ６９５製剤中におけるヒスチジン−鉄媒介断片化を減少させることが更に実証される。
Figure 2012510468
実施例９．１２：クエン酸塩の存在下におけるＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄、
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および３０ｍＭのクエン酸塩、ならびに
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５ｐｐｍの鉄および３０ｍＭのクエン酸塩。
更に、上記で列挙した組成（ａ）から（ｄ）において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。実施例９．１において概説されるように、様々な温度における恒温放置、試料の取り出しおよび得られた８個の製剤中におけるＪ６９５の断片化の分析を実施した。
これらの研究の主要な結果を表１５．１２において列挙する。それらの結果によって、Ｊ６９５製剤中におけるクエン酸塩の存在が、対照（すなわち、クエン酸塩を欠いた製剤）と比較してＪ６９５の安定性に対して負の影響を及ぼさないことが実証される。それらの結果によって、クエン酸塩が、幅広いタンパク質濃度（例えば、２ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬのＪ６９５）にわたってＪ６９５製剤中におけるヒスチジン−鉄媒介断片化を減少させることが更に実証される。
Figure 2012510468
実施例９．１３：デスフェリチオシンの存在下でＪ６９５の断片化
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化する。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄、
ｃ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．１ｍＭのデスフェリチオシン、ならびに
ｄ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、０．５ｐｐｍの鉄および０．１ｍＭのデスフェリチオシン。
更に、上記で列挙した組成（ａ）から（ｄ）において１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化する。実施例９．１において概説されるように、様々な温度における恒温放置、試料の取り出しおよび得られた８個の製剤中におけるＪ６９５の断片化の分析を実施する。
実施例９．１４：ヒンジ領域における残基の突然変異
以下の組成において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６においてヒンジ領域において突然変異した特異的残基を有するＪ６９５を製剤化する。
ａ）１０Ｍｍのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および０．５ｐｐｍの鉄。
更に、上記で列挙した組成（ａ）から（ｂ）において１００ｍｇ／ｍＬにおいてＪ６９５を製剤化する。実施例９．１において概説されるように、様々な温度における恒温放置、試料の取り出しおよび得られた４個の製剤中におけるＪ６９５の断片化の分析を実施する。
実施例９．１５：製剤からのヒスチジンの除去
以下の組成において１７ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化した。
ａ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのイミダゾール、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、ならびに
ｂ）１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのイミダゾール、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトールおよび１００ｐｐｍの硫酸鉄（ＩＩ）。
組成物の恒温放置を４０℃において２週間実施し、実施例７．２．４において記載されるように非還元ＣＥ−ＳＤＳによって分析を行った。これらの研究の主要な結果を以下の表１５．１３において列挙する。それらの結果によって、ヒスチジンの除去およびイミダゾールによる置き換えが、鉄の存在下でＪ６９５の断片化をもたらさないことが実証される。これらの結果によって、ヒスチジンの除去が、鉄の存在下でＪ６９５の断片化を阻害または防止することが実証される。
Figure 2012510468
実施例９．１６：限外濾過／透析濾過を介したまたは透析による鉄分の除去
鉄を含有するＪ６９５（５００ｐｐｍ）および対照としての鉄を有さないＪ６９５（６０ｐｐｍ）を、製剤緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのメチオニン、４％のマンニトール、ｐＨ６．０）またはクエン酸／リン酸緩衝液（１０ｍＭのリン酸水素ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ＝６．０）のいずれかの中に透析した。次いで、試料を４０℃において１ヵ月間恒温放置した。存在する断片の量を決定するために恒温放置の後の非還元ＣＥ−ＳＤＳによって試料を分析した。
結果を以下の表１５．１４において提供する。それらの結果によって、製剤緩衝液またはクエン酸／リン酸緩衝液に対する透析が断片化の減少をもたらすことが実証される。クエン酸／リン酸緩衝液中への透析は、製剤緩衝液に対する透析と比較して断片化のより大きな低下をもたらしたが、このことは、鉄の結合およびタンパク質からの鉄の剥離におけるクエン酸塩／リン酸塩の可能な役割を示した。
Figure 2012510468
実施例１０：鉄の様々なレベルおよび異なる温度におけるＪ６９５の断片化
ＳＥＣによる分析によって、鉄レベルの増加と共に２５℃および４０℃におけるＪ６９５における増強された断片化が示された。最高１０，０００ｐｐｂまでスパイクされた鉄の影響が、５℃における６ヵ月の保存後に観察されなかった。
実施例１０．１：鉄の様々なレベルおよび異なる温度におけるＪ６９５（１００ｍｇ／ｍＬ）の断片化
Ｊ６９５抗体に対する製剤緩衝液を選択した後、最終製品と同じマトリックスにおいて薬物物質を製剤化した。タンパク質製剤の主要な目標は、医薬的タンパク質薬物の許容し得る貯蔵寿命を保証するように長期間にわたってそのネイティブで医薬的に活性な形態における所定のタンパク質の安定性を維持することである。Ｊ６９５プレフィルドシリンジ（ＰＦＳ）のための推奨された保存温度は２−８℃であり、Ｊ６９５の様々なロットにおいて測定した正常鉄レベルは約６０ｐｐｂであった（表１６）。最高６ヵ月間５℃の推奨保存温度ならびに２５℃および４０℃の上昇した温度でＰＦＳを保存した後における断片化に対する異なるレベルの鉄をスパイクする影響を評価した。
抗体（Ｊ６９５）を、以下の公称組成においてｐＨ６．０において維持して、プレフィルドシリンジ（ＰＦＳ）中における１００ｍｇ／ｍＬにおいて製剤化した。
１．１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０
２．１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および硫酸鉄（ＩＩ）としての１０ｐｐｂの鉄
３．１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および硫酸鉄（ＩＩ）としての５０ｐｐｂの鉄
４．１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および硫酸鉄（ＩＩ）としての１００ｐｐｂの鉄
５．１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および硫酸鉄（ＩＩ）としての２５０ｐｐｂの鉄
６．１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および硫酸鉄（ＩＩ）としての５００ｐｐｂの鉄
７．１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および硫酸鉄（ＩＩ）としての１ｐｐｍの鉄
８．１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および硫酸鉄（ＩＩ）としての５ｐｐｍの鉄
９．１０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭのヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０１％（ｍ／ｖ）のポリソルベート８０および硫酸鉄（ＩＩ）としての１０ｐｐｍの鉄
得られた製剤をプレフィルドシリンジ（ＰＦＳ）中に充填し、５、２５および４０℃において最高６ヵ月間恒温放置した。所定の時点において、全ての製剤の試料を取り出し、様々な製剤中における抗体の断片化の程度をＳＥＣによって決定した。表１６に示すように、推奨保存条件において６ヵ月後に観察した断片化に対する（最高１０，０００ｐｐｂまでスパイクした）鉄の影響はなかった。これらの研究は、推奨保存条件において、Ｊ６９５製剤が、医薬的タンパク質薬物の許容し得る貯蔵寿命を提供するように長期間にわたってそのネイティブで医薬的に活性な形態における所定のタンパク質の安定性を維持したことを示す。
Ｊ６９５プレフィルドシリンジ中に異なるレベルの鉄をスパイクし、２５℃および４０℃において保存することによる上昇した温度における断片化に対する影響も評価した。表１６に示すように、（６０ｐｐｂの正常Ｆｅレベル＋スパイキング実験のために加えた１００ｐｐｂに相当する）約１６０ｐｐｂを上回って鉄をスパイクすることは、ＳＥＣによって評価されるように２５℃および４０℃における増加した断片化につながる。
Figure 2012510468
実施例１０．２：鉄の様々なレベルおよび異なる温度におけるＪ６９５（２ｍｇ／ｍＬ）の断片化
更に、上記で列挙した通りの公称組成（１）から（９）において２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０においてＪ６９５を製剤化する。得られた９個の製剤を滅菌非発熱性ポリプロピレン低温貯蔵バイアル中に充填し、５℃、２５℃および４０℃において最高６ヵ月間恒温放置する。更に、９個の全ての製剤を２−８℃の推奨保存温度で最高１２ヵ月間保存する。所定の時点において、全ての製剤の試料を取り出し、様々な製剤中における抗体の断片化の程度をＳＥＣによって決定する。
参照による組込み
本出願にわたって引用され得る全ての引用文献（参考文献、特許、特許出願およびウェブサイト等）の内容は、そこで引用された参考文献であるように、それらの全体において参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の実施は、特に明記しない限り、当技術分野において周知のタンパク質製剤の慣用の技術を用いる。
均等物
本発明は、この精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において実施され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書において記載される本発明を限定するものではなく、全ての点において例示的であると考えられるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、従って、請求項の均等物の意味および範囲の中にある全ての変化は、本明細書において包含されることが意図される。

Claims (144)

  1. ヒスチジン含有製剤におけるラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子の切断を阻害または防止するための方法であって、前記分子を切断する金属の能力を阻害または防止する段階を含む、方法。
  2. 阻害または防止が、製剤中に少なくとも１種の金属キレーターを含めることを含む、請求項１の方法。
  3. 阻害または防止が、濾過、緩衝液交換、クロマトグラフィーおよび樹脂交換から成る群から選択される少なくとも１つの手法に製剤を供することを含む、請求項１の方法。
  4. 濾過が、限外濾過および透析濾過から成る群から選択される、請求項３の方法。
  5. 緩衝液交換が、ヒスチジンを含む緩衝液、クエン酸塩およびリン酸塩を含む緩衝液ならびにイミダゾールを含む緩衝液から成る群から選択される緩衝液による透析を含む、請求項３の方法。
  6. 阻害または防止が、製剤中にクエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液を含めることを含む、請求項１の方法。
  7. 阻害または防止が、ラムダ軽鎖における少なくとも１つのアミノ酸を改変することによって切断を阻害または防止することを含む、請求項１の方法。
  8. 阻害または防止が、アミノ酸配列グルタミン酸−システイン−セリンが変化するようにラムダ鎖においてアミノ酸配列を改変することによって切断を阻害または防止することを含む、請求項１の方法。
  9. 製剤が、約１０ｍＭのヒスチジンを含む、請求項１の方法。
  10. 製剤が、約１−１００ｍＭのヒスチジンを含む、請求項１の方法。
  11. 切断が、ラムダ鎖のヒンジ領域において起きる、請求項１の方法。
  12. ラムダ軽鎖の少なくとも部分が、グルタミン酸−システイン−セリンのアミノ酸配列または抗体結合を阻害しない少なくとも１つの修飾を含む、請求項１の方法。
  13. 切断が、グルタミン酸とシステインの間で起きる、請求項１２の方法。
  14. 分子が、重鎖の少なくとも部分を含む、請求項１の方法。
  15. 重鎖の部分が、アミノ酸配列ＳＣＤＫまたは抗体結合を阻害しない少なくとも１つの修飾を含む、請求項１の方法。
  16. 切断が、セリンとシステインの間で起きる、請求項１０の方法。
  17. 切断が、システインとアスパラギン酸の間で起きる、請求項１０の方法。
  18. 金属がＦｅ２＋である、請求項１の方法。
  19. 金属がＦｅ３＋である、請求項１の方法。
  20. 金属がＣｕ２＋である、請求項１の方法。
  21. 金属がＣｕ１＋である、請求項１の方法。
  22. 分子が、約１ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲内で存在する、請求項１の方法。
  23. 分子が、約２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１の方法。
  24. 分子が、約７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１の方法。
  25. 分子が、約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１の方法。
  26. 分子が免疫グロブリンである、請求項１の方法。
  27. 分子がモノクローナル抗体である、請求項１の方法。
  28. 分子が、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ、単一ドメイン抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体および双特異性抗体から成る群から選択される、請求項１の方法。
  29. 分子が抗ＩＬ−１２／２３抗体である、請求項１の方法。
  30. 分子がＪ６９５である、請求項１の方法。
  31. 分子が、抗ＣＤ８０または抗ＩＧＦ１、２抗体である、請求項１の方法。
  32. 切断が、約２℃から約２５℃の温度で起きる、請求項１の方法。
  33. 切断が、約２℃から約８℃の温度で起きる、請求項１の方法。
  34. 切断が、約４から約８のｐＨで起きる、請求項１の方法。
  35. 切断が、約５から約６のｐＨで起きる、請求項１の方法。
  36. 阻害または防止が、ｐＨを約５以下に低下させることを含む、請求項１の方法。
  37. 少なくとも１種の金属キレーターが、クエン酸塩、シデロホア、カリクセレン、アミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、二座、三座または六座鉄キレーター、ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択される、請求項２の方法。
  38. 少なくとも１種の金属キレーターが、アエロバクチン、アグロバクチン、アゾトバクチン、バシリバクチン、Ｎ−（５−Ｃ３−Ｌ（５アミノペンチル）ヒドロキシカルバモイル）−プロピオンアミド）ペンチル）−３（５−（Ｎ−ヒドロキシアセトアミド）−ペンチル）カルバモイル）−プロプリオンヒドロキサム酸（デフェロキサミン、デスフェリオキサミンまたはＤＦＯもしくはＤＥＦ）、デスフェリチオシン、エンテロバクチン、エリスロバクチン、フェリクローム、フェリオキサミンＢ、フェリオキサミンＥ、フルビアバクチン、フサリニンＣ、ミコバクチン、パラバクチン、シュードバクチン、ビブリオバクチン、ブルニバクチン、イェルシニアバクチン、オルニバクチンならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択されるシデロホアである、請求項２の方法。
  39. 金属キレーターがデスフェリオキサミンである、請求項３８の方法。
  40. 少なくとも１種の金属キレーターが、クエン酸塩である、請求項２の方法。
  41. 少なくとも１種の金属キレーターが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トランス−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、アスパラギン酸、ビス（アミノエチル）グリコールエーテルＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、グルタミン酸およびＮ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択されるアミノポリカルボン酸である、請求項２の方法。
  42. 少なくとも１種の金属キレーターが、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビスヒドロキシエチルグリシン（ビシン）およびＮ−（トリスヒドロキシメチルメチル）グリシン（トリシン）ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択されるヒドロキシアミノカルボン酸である、請求項２の方法。
  43. 少なくとも１種の金属キレーターが、Ｎ−置換グリシンまたはこの誘導体、類似体もしくは組み合わせである、請求項２の方法。
  44. Ｎ−置換グリシンが、グリシルグリシンならびにこの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択される、請求項４３の方法。
  45. 少なくとも１種の金属キレーターが、２−（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）ならびにこの誘導体、類似体および組み合わせである、請求項２の方法。
  46. 少なくとも１種の金属キレーターが、ＤＴＰＡおよびＤＥＦの組み合わせを含む、請求項２の方法。
  47. 少なくとも１種の金属キレーターが、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＥＦの組み合わせを含む、請求項２の方法。
  48. 少なくとも１種の金属キレーターが、フェノールおよびアルデヒドのヒドロキシアルキル化生成物に基づく大環状または環状オリゴマー、ならびにこの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択されるカリックスアレーンである、請求項２の方法。
  49. 少なくとも１種の金属キレーターが、ヒドロキシピリジン誘導体、ヒドラゾン誘導体およびヒドロキシフェニル誘導体またはニコチニル誘導体、例えば、１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリジン−４−オン（Ｄｅｆｅｒｉｐｒｏｎｅ、ＤＦＰまたはＦｅｒｒｉｐｒｏｘ）、２−デオキシ−２−（Ｎ−カルバモイルメチル−［Ｎ’−２’−メチル−３’−ヒドロキシピリジン−４’−オン］）−Ｄ−グルコピラノース（Ｆｅｒａｌｅｘ−Ｇ）、ピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン（ＰＩＨ）、４，５−ジヒドロ−２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−メチルチアゾール−４−カルボン酸（ＧＴ５６−２５２）、４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］安息香酸（ＩＣＬ−６７０）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｏ−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、５−クロロ−７−ヨード−キノリン−８−オール（クリオキノール）ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせである、請求項２の方法。
  50. 少なくとも１種の金属キレーターが、トリエチレンテトラミン（トリエンチン）、テトラエチレンペンタミン、Ｄ−ペニシラミン、エチレンジアミン、ビスピリジン、フェナントロリン、バソフェナントロリン、ネオクプロイン、バトクプロインスルフォネート、クプリゾン、シス，シス−１，３，５，−トリアミノシクロヘキサン（ＴＡＣＨ）、Ｔａｃｈｐｙｒならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択される銅キレーターである、請求項２の方法。
  51. 製剤が、アミノ酸、糖、糖アルコール、緩衝液、塩および界面活性剤から成る群から選択される少なくとも１種の更なる賦形剤を含む、請求項１の方法。
  52. 製剤が、約１から約６０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、約１から約５０ｍＭのメチオニン、約０．００１％から約０．５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、約０．００１％から約１％（ｗ／ｖ）のポリオキサマー１８８、約１から約１５０ｍＭの塩化ナトリウム、約１から約３０ｍＭの酢酸塩、約１から約３０ｍＭのクエン酸塩、約１から約３０ｍＭのリン酸塩および約１から約３０ｍＭのアルギニンから成る群から選択される少なくとも１種の更なる賦形剤を含む、請求項１の方法。
  53. 製剤中に少なくとも１種の金属キレーターを含める段階および切断について分子の少なくとも部分を分析する段階を含む、ヒスチジン含有製剤においてラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子の切断を検出するための方法。
  54. ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子と、ヒスチジンを含む緩衝液系とを含み、実質的に金属を含まない安定な製剤。
  55. 金属がＦｅ２＋またはＦｅ３＋である、請求項５４の製剤。
  56. 金属がＣｕ２＋またはＣｕ１＋である、請求項５４の製剤。
  57. 製剤が、濾過、緩衝液交換、クロマトグラフィーおよび樹脂交換から成る群から選択される少なくとも１つの手法に供した後で金属を実質的に含まない、請求項５４の製剤。
  58. 緩衝液交換が、ヒスチジンを含む緩衝液、クエン酸塩およびリン酸塩を含む緩衝液ならびにイミダゾールを含む緩衝液から成る群から選択される緩衝液による透析を含む、請求項５７の製剤。
  59. 金属が、約５，０６０ｐｐｂ未満、約１，０６０ｐｐｂ未満、約５６０ｐｐｂ未満、約３１０ｐｐｂ未満、約１６０ｐｐｂ未満、約１１０ｐｐｂ未満および約７０ｐｐｂ未満から成る群から選択される濃度で存在する、請求項５４の製剤。
  60. 金属が、約１６０ｐｐｂ未満の濃度で存在する、請求項５９の製剤。
  61. 金属が、約７０ｐｐｂ未満の濃度で存在する、請求項５９の製剤。
  62. ポリオールおよび界面活性剤から成る群から選択される少なくとも１種の更なる賦形剤を更に含む、請求項５４の製剤。
  63. 安定剤を更に含む、請求項６２の製剤。
  64. マンニトール、ポリソルベート８０およびメチオニンを更に含む、請求項５４の製剤。
  65. 緩衝液系が、クエン酸塩またはリン酸塩を更に含む、請求項５４の製剤。
  66. ｐＨが約５以下である、請求項５４の製剤。
  67. （ａ）１−１０％のマンニトール、
    （ｂ）０．００１％−０．１％のポリソルベート８０、
    （ｃ）５から７のｐＨを有する１−１００ｍＭのヒスチジンおよび１−５０ｍＭのメチオニンを含む緩衝液系
    を含む、請求項６４の製剤。
  68. （ａ）２−６％のマンニトール、
    （ｂ）０．００５−０．０５％のポリソルベート８０、
    （ｃ）５から７のｐＨを有する５−５０ｍＭのヒスチジンおよび５−２０ｍＭのメチオニンを含む緩衝液系
    を含む、請求項６４の製剤。
  69. （ａ）約４％のマンニトール、
    （ｂ）約０．０１％のポリソルベート８０、
    （ｃ）約６のｐＨを有する約１０ｍＭのヒスチジンおよび約１０ｍＭのメチオニンを含む緩衝液系
    を含む、請求項６４の製剤。
  70. 分子が、モノクローナル抗体またはこの抗原結合部分である、請求項５４から６９のいずれか一項の製剤。
  71. 抗体またはこの抗原結合部分の濃度が、約１から約２５０ｍｇ／ｍｌの間である、請求項７０の製剤。
  72. 抗体またはこの抗原結合部分の濃度が、約４０から約２００ｍｇ／ｍｌの間である、請求項７０の製剤。
  73. 抗体またはこの抗原結合部分の濃度が、約１００ｍｇ／ｍｌである、請求項７０の製剤。
  74. 抗体が、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合し得るヒト抗体またはこの抗原結合部分である、請求項７０の製剤。
  75. ヒト抗体が、抗体Ｊ６９５またはこの抗原結合部分である、請求項７４の製剤。
  76. 少なくとも２４ヵ月間の貯蔵寿命を有する、請求項７４または７５の製剤。
  77. 少なくとも５回の製剤の凍結融解サイクルの後で安定性を維持する、請求項７４または７５の製剤。
  78. 更なる薬剤を更に含む、請求項７４または７５の製剤。
  79. 更なる薬剤が治療剤である、請求項７８の製剤。
  80. 治療剤が、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、サイクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチレート、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦの抗体またはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０またはこれらのリガンドに対する抗体、メトトレキサート、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動剤、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５ ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５ ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβから成る群から選択される、請求項７９の製剤。
  81. 治療剤が、抗ＴＮＦ抗体およびこの抗体断片、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物、ＴＡＣＥ阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、コルチコステロイド、ブデノシド、デキサメタゾン、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸、オルサラジン、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＩＬ−１ｒａ、チロシンキナーゼ阻害剤、６‐メルカプトプリンおよびＩＬ−１１から成る群から選択される、請求項７９の製剤。
  82. 治療剤が、メチルプレドニゾロン、シクロホスファミド、４−アミノピリジン、チザニジン、インターフェロン−β１ａ、インターフェロン−β１ｂ、コポリマー１、高圧酸素、静脈内免疫グロブリン、クラブリビン、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ｓＩＬ−１３Ｒ、抗Ｐ７およびｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）から成る群から選択される、請求項７９の製剤。
  83. 金属の存在下でヒンジ領域内において切断されない、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子と、イミダゾールを含む緩衝液系と、金属とを含む安定な製剤。
  84. ヒンジ領域内において切断されない、または金属キレーターの非存在下で観察された切断のレベル未満のレベルでヒンジ領域内において切断される、ラムダ軽鎖の少なくとも部分を含む分子と、ヒスチジンを含む緩衝液系と、金属キレーターとを含む安定な製剤。
  85. 金属が、Ｆｅ２＋またはＦｅ３＋である、請求項８３または８４の製剤。
  86. 金属が、Ｃｕ２＋またはＣｕ１＋である、請求項８３または８４の製剤。
  87. 金属キレーターが、シデロホア、カリクセレン、アミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、二座、三座または六座鉄キレーター、銅キレーター、クエン酸塩、ならびにこれらの誘導体、類似体および組み合わせから成る群から選択される、請求項８４の製剤。
  88. 金属キレーターがデスフェリオキサミンである、請求項８７の製剤。
  89. ポリオールおよび界面活性剤から成る群から選択される少なくとも１種の更なる賦形剤を更に含む、請求項８３または８４の製剤。
  90. 安定剤を更に含む、請求項８９の製剤。
  91. マンニトール、ポリソルベート８０およびメチオニンを更に含む、請求項８４の製剤。
  92. 緩衝液系が、クエン酸塩またはリン酸塩を更に含む、請求項８４の製剤。
  93. 製剤のｐＨが約５以下である、請求項８３または８４の製剤。
  94. （ａ）１−１０％のマンニトール、
    （ｂ）０．００１％−０．１％のポリソルベート８０、
    （ｃ）５から７のｐＨを有する１−１００ｍＭのヒスチジンおよび１−５０ｍＭのメチオニンを含む緩衝液系
    を含む、請求項９１の製剤。
  95. （ａ）２−６％のマンニトール、
    （ｂ）０．００５−０．０５％のポリソルベート８０、
    （ｃ）５から７のｐＨを有する５−５０ｍＭのヒスチジンおよび５−２０ｍＭのメチオニンを含む緩衝液系
    を含む、請求項９１の製剤。
  96. （ａ）約４％のマンニトール、
    （ｂ）約０．０１％のポリソルベート８０、
    （ｃ）約６のｐＨを有する約１０ｍＭのヒスチジンおよび約１０ｍＭのメチオニンを含む緩衝液系
    を含む、請求項９１の製剤。
  97. 分子が、モノクローナル抗体またはこの抗原結合部分である、請求項８４から９６のいずれか一項の製剤。
  98. 抗体またはこの抗原結合部分の濃度が、約１から約２５０ｍｇ／ｍｌの間である、請求項９７の製剤。
  99. 抗体またはこの抗原結合部分の濃度が、約４０から約２００ｍｇ／ｍｌの間である、請求項９７の製剤。
  100. 抗体またはこの抗原結合部分の濃度が、約１００ｍｇ／ｍｌである、請求項９７の製剤。
  101. 抗体が、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合し得るヒト抗体またはこの抗原結合部分である、請求項９７の製剤。
  102. ヒト抗体が、抗体Ｊ６９５またはこの抗原結合部分である、請求項１０１の製剤。
  103. 少なくとも２４ヵ月間の貯蔵寿命を有する、請求項１０１または１０２の製剤。
  104. 少なくとも５回の製剤の凍結融解サイクルの後で安定性を維持する、請求項１０１または１０２の製剤。
  105. 更なる薬剤を更に含む、請求項１０１または１０２の製剤。
  106. 更なる薬剤が治療剤である、請求項１０５の製剤。
  107. 治療剤が、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、サイクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチレート、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、ＩＬ−１受容体抗体、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、ＩＬ−６受容体抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル−イミダゾール化合物、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦの抗体またはアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０またはこれらのリガンドに対する抗体、メトトレキサート、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、Ｓ１Ｐ１アゴニスト、ｂｃｌ−２阻害剤、補体阻害剤、アドレナリン作動剤、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５ ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５ ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβから成る群から選択される、請求項１０６の製剤。
  108. 治療剤が、抗ＴＮＦ抗体およびこの抗体断片、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物、ＴＡＣＥ阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、コルチコステロイド、ブデノシド、デキサメタゾン、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸、オルサラジン、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＩＬ−１ｒａ、チロシンキナーゼ阻害剤、６‐メルカプトプリンおよびＩＬ−１１から成る群から選択される、請求項１０６の製剤。
  109. 治療剤が、メチルプレドニゾロン、シクロホスファミド、４−アミノピリジン、チザニジン、インターフェロン−β１ａ、インターフェロン−β１ｂ、コポリマー１、高圧酸素、静脈内免疫グロブリン、クラブリビン、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ｓＩＬ−１３Ｒ、抗Ｐ７およびｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）から成る群から選択される、請求項１０６の製剤。
  110. 金属がヒスチジンの存在下でラムダ軽鎖の切断をもたらさない濃度で存在する、約５から約７のｐＨを有するヒスチジンを含む緩衝溶液中にラムダ軽鎖を含む治療上有効量の抗体を含む、安定な製剤。
  111. 切断が、ラムダ鎖のヒンジ領域において起こる、請求項１１０の製剤。
  112. 金属が、Ｆｅ２＋またはＦｅ３＋である、請求項１１０の製剤。
  113. 金属が、Ｃｕ２＋またはＣｕ１＋である、請求項１１０の製剤。
  114. 金属が、約５，０６０ｐｐｂ未満、約１，０６０ｐｐｂ未満、約５６０ｐｐｂ未満、約３１０ｐｐｂ未満、約１６０ｐｐｂ未満、約１１０ｐｐｂ未満および約７０ｐｐｂ未満から成る群から選択される濃度で存在する、請求項１１０の製剤。
  115. 金属が、約１６０ｐｐｂ未満の濃度で存在する、請求項１１０の製剤。
  116. 金属が、約７０ｐｐｂ未満の濃度で存在する、請求項１１０の製剤。
  117. ポリオールおよび界面活性剤から成る群から選択される少なくとも１種の更なる賦形剤を含む、請求項１１０の製剤。
  118. 安定剤を更に含む、請求項１１７の製剤。
  119. マンニトール、ポリソルベート８０およびメチオニンを更に含む、請求項１１０の製剤。
  120. 緩衝溶液が、リン酸塩またはクエン酸塩を更に含む、請求項１１０の製剤。
  121. ｐＨが約５以下である、請求項１１０の製剤。
  122. 抗体が、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合し得るヒト抗体またはこの抗原結合部分である、請求項１１０の製剤。
  123. ヒト抗体またはこの抗原結合部分が、Ｙ６１およびＪ６９５から成る群から選択される抗体が結合するＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合する、請求項１２２の製剤。
  124. ヒト抗体が、抗体Ｊ６９５またはこの抗原結合部分である、請求項１２３の製剤。
  125. 少なくとも２４ヵ月間の貯蔵寿命を有する、請求項１１０から１２４のいずれか一項の製剤。
  126. 少なくとも５回の製剤の凍結融解サイクルの後で安定性を維持する、請求項１１０から１２４のいずれか一項の製剤。
  127. （ａ）ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合する１−２５０ｍｇ／ｍｌのヒト抗体、
    （ｂ）１−１０％のマンニトール、
    （ｃ）０．００１％−０．１％のポリソルベート８０、
    （ｄ）１−５０ｍＭのメチオニン、および
    （ｅ）５から７のｐＨを有する１−１００ｍＭのヒスチジン
    を含み、金属を実質的に含まない水性医薬製剤。
  128. 金属が、約５，０６０ｐｐｂ未満、約１，０６０ｐｐｂ未満、約５６０ｐｐｂ未満、約３１０ｐｐｂ未満、約１６０ｐｐｂ未満、約１１０ｐｐｂ未満および約７０ｐｐｂ未満から成る群から選択される濃度で存在する、請求項１２７の製剤。
  129. 金属が、約１６０ｐｐｂ未満の濃度で存在する、請求項１２８の製剤。
  130. 金属が、約７０ｐｐｂ未満の濃度で存在する、請求項１２８の製剤。
  131. ヒト抗体またはこの抗原結合部分が、Ｙ６１およびＪ６９５から成る群から選択される抗体が結合するＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合する、請求項１２７の製剤。
  132. ヒト抗体が、抗体Ｊ６９５またはこの抗原結合部分である、請求項１３１の製剤。
  133. 少なくとも２４ヵ月間の貯蔵寿命を有する、請求項１２７から１３２のいずれか一項の製剤。
  134. 少なくとも５回の製剤の凍結融解サイクルの後で安定性を維持する、請求項１２７から１３２のいずれか一項の製剤。
  135. （ａ）ＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合する約１００ｍｇ／ｍｌのヒト抗体、
    （ｂ）約４％のマンニトール、
    （ｂ）約０．０１％のポリソルベート８０、
    （ｃ）約１０ｍＭのメチオニン、および
    （ｄ）約６のｐＨを有する１０ｍＭのヒスチジン
    を含む、水性医薬製剤。
  136. ヒト抗体またはこの抗原結合部分が、Ｙ６１およびＪ６９５から成る群から選択される抗体が結合するＩＬ−１２／ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのエピトープに結合する、請求項１３５の製剤。
  137. ヒト抗体が、抗体Ｊ６９５またはこの抗原結合部分である、請求項１３６の製剤。
  138. 金属を実質的に含まない、請求項１３５から１３７のいずれか一項の製剤。
  139. 金属キレーターを更に含む、請求項１３５から１３７のいずれか一項の製剤。
  140. 金属が、約５，０６０ｐｐｂ未満、約１，０６０ｐｐｂ未満、約５６０ｐｐｂ未満、約３１０ｐｐｂ未満、約１６０ｐｐｂ未満、約１１０ｐｐｂ未満および約７０ｐｐｂ未満から成る群から選択される濃度で存在する、請求項１３５の製剤。
  141. 金属が、約１６０ｐｐｂ未満の濃度で存在する、請求項１４０の製剤。
  142. 金属が、約７０ｐｐｂ未満の濃度で存在する、請求項１４０の製剤。
  143. 少なくとも２４ヵ月間の貯蔵寿命を有する、請求項１３５から１３７のいずれか一項の製剤。
  144. 少なくとも５回の製剤の凍結融解サイクルの後で安定性を維持する、請求項１３５から１３７のいずれか一項の製剤。
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