KR100808416B1 - 노화 지연 및 과일 성숙을 향상시키는라이소포스파티딜에탄올아민(18:1)과라이소포스파티딜이노시톨의 용도 - Google Patents

노화 지연 및 과일 성숙을 향상시키는라이소포스파티딜에탄올아민(18:1)과라이소포스파티딜이노시톨의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과일 또는 식물 조직에 노화를 지연시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 수확 전·후에 라이소포스포리피드 및 활성화제를 포함한 조성물을 과일 및 다른 식물 조직에 사용하는 것을 포함한다. 그 조성물은 과일 및 다른 식물 조직에 노화를 지연시키는데 효과적인 라이소포스포리피드의 양을 포함한다. 그 조성물에 포함된 바람직한 라이소포스포리피드는 라이소포스파티딜이노시톨 및/또는 라이소포스패티딜에탄올아민(18:1)이다. 라이소포스포리피드를 포함한 것 이외에, 조성물은 또한 에탄올, 터지톨 또는 sylgard 309와 같은 활성화제도 포함한다.
더우기, 본 발명은 또한 과일의 성숙 및 안정성을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 수확전에 라이소포스포리피드 및 활성화제를 포함하는 조성물을 전체 식물에 사용하는 것을 포함한다. 그 조성물은 과일 성숙 및 안정성을 향상시키는데 효과적인 라이소포스리피드의 양을 포함한다. 그 조성물에 포함된 바람직한 라이소포스포리피드는 라이소포스파티딜이노시톨 및/또는 라이소포스파티딜에탄올아민(18:1)이다. 그 라이소포스포리피드를 포함한 것 이외에, 그 조성물은 또한, 에탄올, 터지톨 또는 sylgard 309 와 같은 활성화제를 포함할 수도 있다.

Description

노화 지연 및 과일 성숙을 향상시키는 라이소포스파티딜에탄올아민(18:1)과 라이소포스파티딜이노시톨의 용도{USE OF LYSOPHOSPHATIDYLETHANOLAMINE (18:1) AND LYSOPHOSPHATIDYLINOSITOL TO RETARD SENESCENE AND TO ENHANCE FRUIT RIPENING}
도1은 여러 아실쇄를 갖는 다양한 농도의 LPE에 의한 부분적으로 정제된 양배추 PLD 활성도의 억제를 나타낸 그래프이다.
도2는 부분적으로 정제된 양배추 PLD 활성도의 억제를 위한 LPE(18:1)의 구조 특이성을 나타낸 그래프이다.
도3은 부분적으로 정제된 양배추 PLD 활성도의 억제를 LPE농도의 함수로 나타낸 그래프이다.
도4는 LPE(18:1)에 의해 부분적으로 정제된 양배추 PLD의 PLD에 대한 기질 농도의 효과를 나타낸 좌표이다.
도5는 부분적으로 정제된 양배추 PLD 활성도에 대한 여러 라이소포스포리피드의 효과를 나타낸 그래프이다.
도6은 LPA, LPC, LPEegg, 또는 LPI로 처리한 잎의 상대적 엽록소 함량을 나타낸 그래프이다.
현재 과일 성숙 시기를 조절하기 위해 다양한 화학적 및 생물적 제제(agent)를 통상적으로 성숙한 과일에 사용하고 있다. 그러한 제제들은 다양한 목적으로 사용할 수 있다. 한 가지 목적은 경작지에서 과일의 효과적인 수확을 돕기 위해 과일의 성숙 시기를 일치시키는 것이다. 다른 목적은 낙과를 방지하여 적합한 성숙시기까지 과일이 식물에 남아있게 하는 것이다. 과일 성숙제의 또 다른 목적은 과일에 색상 전개를 향상시켜 과일 소매 소비자가 기대하는 것처럼 과일이 더 균일한 색상을 갖게 하는 것이다. 미국에서, 많은 형태의 과일들을 재배하는 동안 1개 이상의 그런 성숙제를 처리하는 것이 현재 실행되고 있다.
과일 성숙을 조절하기 위해 이전에 사용한 몇 개의 성숙제는 해당 과일에 원하는 효과를 주는 순수한 합성 성숙제이다. 불행하게도, 잠재적 독성과 발암성의 문제로 인해, 몇 몇 그러한 합성 화학 과일 성숙제는 사용이 금지되거나 제품에 대한 상업적 또는 소비자 저항으로 인해 그 사용이 급격히 감소하였다. 과일 성숙을 향상시키기 위해 현재 사용하는 가장 인기있는 성숙제는 Rhone-Poulenc Ag. Co.(노오쓰 캐롤라이나주의 리서치 트라이앵글 파크 소재)의 에트렐(Ethrel)이란 상표명으로 시판되고 있는 합성 화합물, 에테폰(ethephon)이다. 비록 이 성숙제가 성숙을 촉진하지만, 그것은 과일을 무르게 하기도 한다. 그리하여, 에테폰을 처리한 과일은 저장 수명이 길지 않다. 환경적으로 안정하고 과일을 무르게 하지 않는 성숙제에 대한 요구가 증폭되고 있다. 게다가, 소비자들은 잘 성숙한 덩쿨 과일을 사기 위해 기꺼이 최고의 값을 지불하려 한다. 그러나 잘 익은 덩쿨 과일은 쉽게 무르고 저장 수명이 길지 않기 때문에 장거리를 운반할 수 없다. 그러므로 잘 익은 덩쿨 과일의 저장 수명을 향상시키는 것은 유익하다.
노화를 지연시키고 저장 수명을 증진시키는 환경적으로 안전한 제품을 발견하는 것이 식물 사업분야(특히, 신선한 야채와 절단 꽃 사업분야)에 엄청난 이득을 가져다 줄 것이다. 현재, 실버 티오설페이트와 같은 환경적으로 유해한 화합물을 절단 꽃의 저장 수명을 증가시키는데 사용하고 있다. 그러나, 환경적 관심사 때문에 실버 티오설페이트의 사용을 감소시키고 있다. 그러므로, 실버 티오설페이트의 대체물을 개발하는 것이 바람직하며, 이것은 상업적 이익과 소비자에 의해 훨씬 더 쉽게 받아들여질 가능성이 있다.
라이소포스파티딜에탄올아민(이하 "LPE"라 함)는 과일 성숙을 조절하고, 저장하는 동안 과일의 안정성을 향상시키고, 저장 과일의 저장 수명을 증가시키는데 가능성을 보여준 화합물 그룹을 포함한다. 과일 성숙과 안정성을 향상시키기 위해 달걀에서 정제한 LPE(이하 "LPEegg"라 함)를 사용하는 방법들이, 여기 참고문헌에 의해 통합된, 미국 특허 제 5,126,155호와 제 5,100,341호에 기술되어 있다. LPE는 세포막에서 보통 발견되는 지질인 포스파티딜에탄올아민에서 유도된다. 포스파티딜에탄올아민은 달걀 노른자에 풍부하며 2개의 지방산 부분을 갖는 인지질이다. 포스포리파제 A2 에 의해 포스파티딜에탄올아민에서 하나의 지방산을 제거하여 LPE를 얻는다.
LPE는 식물 및 동물 조직에 천연적으로 존재하며, 특히 달걀 노른자와 뇌 조직에 풍부하다. Avanti Polar Lipids, Inc.(알라바마주의 알라바스터 소재)에서 상 업적으로 시판하는 것을 이용할 수 있다. 자연원에서 정제된 LPE에서 발견할 수 있는 다른 지방산들이 많이 있다. 지방산은 불포화도 뿐만 아니라 쇄길이가 변할 수 있다. 그러나, 과일 성숙을 조절 및 과일의 안정성을 향상시키는데 LPE의 여러 종류와 LPE 이외의 다른 종류의 라이소포스포리피드의 상대적 효능을 실험하지 않았다.
본 발명은 LPE(18:1) 및/또는 라이소포스파티딜이노시톨(이하 "LPI"라 함)을 포함하지만 여기에만 한정되지 않는 라이소포스포리피드을 사용하여, 과일의 성숙 및 안정성을 향상시키고 과일 및 다른 식물 조직에 노화를 지연시키는 방법에 관한 것이다. 여기에서 사용된 용어 "라이소포스포리피드"는 포스포리파제 A2 에 의해 하나의 지방산이 제거된 포스포리피드의 유도체를 말한다. 여기에서 사용된 용어 "식물 조직"은 살아있는 식물의 어떤 부분 또는 기관을 말한다. 일례는 과일, 꽃, 뿌리, 줄기, 배축, 잎, 잎꼭지, 꽃잎 등을 포함한다.
본 발명의 방법은 하기 식을 갖는 라이소포스포리피드를 포함하는 조성물로 수확 전·후에 과일 및 다른 식물 조직에 처리하는 것을 포함한다.
Figure 112000009356669-pct00001
여기에서, R1 은 C5-C22 아실옥시 및 C5-C22 알콕시 기로 구성된 기에서 선택되며 ; R2 는 수소, 하이드록실, C1-C5 아실옥시 및 C1-C5 알콕시 기로 구성된 기에 서 선택되며 ; 그리고, R3 는 수소, 콜린, 에탄올아민, 글리세롤, 이노시톨 및 세린으로 구성된 기에서 선택되며, 여기에서 R1과 R2는 상호교환 가능하다. 상기 확인된 식(Ⅰ)을 갖는 바람직한 화합물은 LPE(18:1) 및 LPI이다.
바람직하게도, 그 조성물은 라이소포스포리피드를 위한 물과 같은 허용된 담체를 포함한다. 그러나, 유기 용매와 같은 다른 담체들도 또한 사용 가능하다. 그 조성물은 과일 성숙과 안정성을 향상시키고 과일 및 다른 식물조직에 노화를 지연시키는데 효과적인 라이소포스포리피드의 양을 포함한다. 특히, 조성물내에 라이소포스포리피드의 양은 조성물 1ℓ당 약 0.5-1000mg이며, 바람직하게는 조성물 1ℓ당 약 1-500mg이며, 보다 바람직하게는 조성물 1ℓ당 약 5-250이며, 보다 더 바람직하게는 조성물 1ℓ당 약 5-250이다. 조성물은 스프레이 또는 단순히 액체 형태로 과일 또는 식물 조직에 사용할 수 있다.
라이소포스포리피드를 포함하는 것 이외에, 그 조성물은 1개 이상의 활성화 화합물을 포함할 수도 있다. 여기에 사용된 용어 "활성화 화합물"은 라이소포스포리피도인 활성 성분의 가용성력 및 효과를 향상시키는 물질을 말한다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 활성화 화합물의 일례는 에탄올, 터지톨 및 sylgard 309(마이애미주의 미드랜드에 소재한 Dow Corning사에서 구입)를 포함한다. 활성화 화합물은 그 조성물의 약 0.05-2.0 부피% 양으로 존재한다.
바람직한 라이소포스포리피드, LPE(18:1)는 하나의 이중결합을 포함하는 18 탄소 지방산을 갖는 일종의 LPE이다. 과일 성숙을 촉진시키고 과일 및 식물 조직의 노화를 지연시키는데, LPE(18:1)은 다른 LPE 종 보다 특히 우수하다는 것이 밝혀졌다.
미국 특허 제 5,126,155호 및 제 5,110,341호에 기술된 바와같이, LPE는 과일 성숙 및 안정성을 향상시키는데 효과적이다. 이런 효과를 나타내는 정확한 메카니즘은 단지 부분적으로만 이해되고 있다. 미국 특허 제 5,126,155호 및 제 5,110,341호에서는, LPE가 에틸렌 생성을 촉진시키고 과일에 호흡작용을 억제시키는 것에 관한 관찰에 대해 기술하고 있다. 이런 효과는 LPE-처리 과일의 성숙 및 안정성의 향상을 설명할 수 있다고 생각한다. LPE-처리 과일 및 식물 조직의 노화 지연이 멤브레인을 통한 전해질의 누수의 감소와 상관관계를 가진다는 것(5)이 발견되었다. 그리하여, 본 발명자들은 LPE가 식물 노화에서 멤브레인 퇴화의 핵심 과정을 조절할 수 있다고 추측한다.
식물 노화 과정 동안 전해질 누수의 증가는 멤브레인 포스포리피드의 파괴에 기인한다(1, 2). LPE-처리 잎, 꽃 및 수확 후 과일에 전해질 누수의 감소는 LPE가 멤브레인 지질 분해를 억제함으로써 멤브레인을 완전히 보호할 수 있다(3)는 것을 제시하고 있다. 시험관 조건 및 생체 조건에서 여러 지방 생성물(lipolytic products)의 방출 반응속도를 근거로 할 때, 포스포리파제 D (이하 "PLD"라 함)가 노화 조직에서 초기에 신속하게 발생하는 멤브레인 포스포리피드의 선택적 분해를 조절하는 것(4-9)으로 제안되었다. 노화 잎 조직에서 PLD 발현의 증가가 관찰되었으며 PLD의 발현을 멤브레인-조합 PLD에 증가, PLD 변형의 특이한 발현 및 PLD 단백질 및 mRNA의 양에서 변화를 포함하는 복잡한 방식으로 특징지을 수 있다(10).
여기에 기술된 바와같이, 본 발명자들은 라이소포스포리피드 LPE가 부분적으로 정제된 PLD의 활성도를 식물에서 매우 특이한 방식으로 억제할 수 있다는 것을 입증하였다. 하기 실시예가 설명하는 바와같이, 라이소포스포리피드 LPE(18:1) 및 LPI가 특히 PLD의 강한 억제제이다. 게다가, LPE(18:1) 또는 LPI로 식물을 처리하는 것은 에틸렌 생성을 감소시키는 것과 관련이 있다. LPI-처리한 노화 잎의 높은 엽록소 함량으로 입증된 바와같이, LPI는 LPE 또는 LPC-처리 잎과 비교될 만큼이나 대조군에 대하여 잎의 노화를 지연시키는데 특히 효과적인 것으로 나타났다. 결과적으로, LPE(18:1) 및 LPI에 국한되지는 않지만 이와같은 라이소포스포리피드는 과일 및 식물 조직의 노화를 지연시키는데 특히 현저한 물질이다. 본 발명자들은 또한 LPE(18:1) 및 LPI가 과일 성숙 및 안정성을 향상시키는데 특히 효과적임을 입증한다.
실시예 방법 및 여기에만 한정되지 않는 본 발명의 실시예를 하기에 제공한다.
실시예 1 : LPE(18:1) 및 LPI에 의한 PLD의 특이적인 억제
실시예 1a : 화학 약품 및 식물 물질
달걀 노른자, 소간, 및 대두에서 정제한 천연 라이소포스포리피드와 여러 아실쇄를 갖는 합성 LPE(14:0, 16:0, 18:0, 18:1)을 Avanti Polar Lipids사(알라바마주의 알라바스터 소재)에서 구입하였다. 사용한 다른 모든 포스포리피드 화학약품및 물질들을 시그마사(미주리주의 세인트 루이스 소재)에서 구입하였다. 포스포리 피드와 지방산을 클로로포름:메탄올:KOH(1N)(부피비 95:5:1)인 용액에 녹였다. 물을 첨가한 후, 질소를 흘려주어 유기용매를 제거하였다. 물로 저장용액 농도를 1mM로 맞춘 후에 PLD 반응 혼합물에 첨가하였다. 유기 용매를 사용하지 않고 물에서 LPE 분말을 초음파 분쇄하여 현탁화함으로써 과일 및 식물 조직에 처리할 LPE 용액을 대용량으로 제조하였다.
PLD의 생화학 및 생리학적 양상을 조사하기 위해 통상적으로 사용한 부분적으로 정제된 양배추 PLD(11, 12)를 50mM Tris(pH8.0)에 녹인 후, PLD에 대한 LPE의 효과를 조사하기 위하여 최종 농도가 0.6㎍/㎖으로 반응 혼합물에 첨가하였다.
부분적으로 정제된 양배추 PLD이외에, 본 발명자들은 또한 2가지 식물, 즉, 양배추(Brassica oleracea L. Blue Vintage) 및 아주까리 씨(Ricinus communis L. cv. Hale), 에서 얻은 멤브레인-조합 PLD 및 가용성 PLD의 활성도에 대한 LPE의 효과를 조사하였다. 질석 및 파르레이드의 혼합물(1:1, v/v)을 포함하는 플라스틱 화분에서 아주까리 식물을 재배하면서 14시간의 광주기로 차가운 백생광(150μmol min-1, m-2)하에서 Hloagland 영양액으로 22℃에서 지하관개하였다(10). 양배추는 시장에서 구입하였다.
실시예 1b : 조직 분류법
2개월 된 아주까리 식물과 양배추의 완전히 펴진 잎을 따서 재빨리 액체 질소로 얼린 다음, 얼음으로 냉각한 막자 사발로 균일하게 찧었다. 50mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM KCl, 1mM EDTA, 0.5mM PMSF, 및 2mM DTT를 포함하는 추출 완충액 을 분말 시료에 첨가하였다. 추가적으로 5분동안을 더 분쇄한 후에, 파쇄액을 10분동안 6,000g으로 원심분리하여 그 찌꺼기를 제거하였다. 그 상청액을 30분간 100,000g으로 원심분리하여 그 추출물을 가용성 및 멤브레인 조합 PLD 로 분류하였다. 그 결과로서 생성된 상층액을 가용성 분류물 및 펠렛을 멤브레인 분류물로 수집하였다. 멤브레인 분류물을 추출 완충액으로 한번 씻어서 가용성 오염물을 제거하였다. 가용성 PLD 및 멤브레인-조합 PLD 시료를 각각 100㎍/㎖ 및 10㎍/㎖의 최종 농도로 반응 혼합물에 첨가하였다.
실시예 1c : PLD 활성도 평가 분석
포스파티딜에탄올(이하 "PEOH"라 함) 및 기질 포스파티딜콜린(이하 "PC" 라 함)에서 방출된 포스파틱딘산(이하 "PA"라 함)에 포함된 인 함량을 측정함으로써 부분적으로 정제된 양배추 PLD의 활성도를 평가 분석하였다(13). 이 평가 분석에서, 20μmol의 클로로포름에 용해된 달걀의 PC를 질소로 건조하였다. 그 지질을 실온에서 초음파로 1㎖ hH2O에 에멀션화하였다. 표준 효소 평가 분석 혼합물은 100mM Mes/NaOH(pH6.5) 50mM CaCl2, 0.5mM SDS, 20㎕ 기질(0.4μmol PC), 1%에탄올 및 20㎕ PLD를 포함하여 전체 부피가 200㎕(14)였다. 그 다음 평가분석 혼합물을 30℃의 물 항온조에서 30분간 항온처리하였다. 750㎕ 클로로포름:메탄올(1:2)의 혼합용매를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 클로로포름(200㎕)을 혼합물에 떨어뜨린 후 200㎕의 KCl(2M)을 첨가하였다. 와동시킨 후, 클로로포름 및 수용액층을 5분동안 12,000g으로 원심분리하였다. 클로로프름 층을 수집하여 건조시켰다. 건조된 시료 를 50㎕의 클롤로포름에 녹인 후, TLC 판(실리카겔 G)에 점적하였다. 클로로포름:메탄올:NH4OH(65:35:5)의 혼합용매로 판을 전개하였다. 요오드 기체에 노출시킴으로써 판에 지질을 눈에 보이게 하였다. 지질 표준 물질인 PEOH, PA 및 PC에 해당하는 점적을 긁어내어 바이알에 넣고 로우저(Rouser)등이 기술된 인 함량 측정법(15)으로 그 양을 정량화하였다. 트랜드포스파티딜레이션 반응의 생성물인 PEOH는 가수분해 반응의 생성물인 PA보다 오히려 더 많이 PLD 활성도의 지시약으로 사용되는데 전자가 쉽게 물질대사화하지 않기 때문이다.
동위원소 식별 PEOH 및 기질PC의 PC의 방출을 정량화함으로써 멤브레인과 관련되 PLD활성도 및 양배추 및 아주까리 조직에서 얻은 가용성 분류물을 측정하였다(10). 이런 목적으로, 0.4μCi의 L-3-포스파티딜콜린, 1,2-디[1-C14] 팔미토일(아메르샴, 일리노이주의 알링톤 하이츠 소재)를 20μmol의 클로로포름에 용해된 달걀의 PC와 혼합하였다. 평가 분석 조건과 반응 생성물 분리는 상기와 동일하다. TLC에서 긁은 PEOH, PA 및 PC에 방사능을 신틸레이션 분광 분석기로 정량화하였다.
실시예 1d. LPE 처리 및 과일 에틸렌 생성.
LPEegg(달걀에서 정제하며 주로 LPE 16:0 및 18:0으로 구성됨)로 수확 후의 과일 조직에 처리하면 노화를 지연시키고 과일의 조정 수명을 향상시키는 결과를 보였다(3,16). 그러나, 과일 노화에 대한 LPE의 여러 아실쇄의 효과를 조사하지 않았다. 본 연구에서, 본 발명자들은 PLD활성도에 대한 LPE의 다른 아실 쇄의 효과를 보완하며, 크랜베리 과일의 에틸렌 생성에 대한 LPE의 여러 아실 쇄의 효과를 조사하였다. 완전히 성숙한 크랜베리 과일(Vaccinium macrocarpon Ait. "Stevens")을 가을에 수확하여 서늘한 곳에 저장하였다. 임의로 선택한 수확 후의 크랜베리 과일(시료당 15개)을 여러 아실쇄를 갖는 LPE 용액(100μM)에 30분간 담군 후, 공기중에서 건조하고 실온(26±2℃)에 두었다. 이틀 후, 에틸렌 생성을 측정하기 위해 크랜베리를 봉인된 유리병에 넣어 24시간 동안 항온처리 하였다. 불꽃 이온화 검출기(시나쯔 9AM, 일본 쿄토에 소재한 시마쯔사)가 부착된 개스 크로미토그래프로 에틸렌을 정량화하였다(3).
실시예 le : 잎 엽록소 함량에 대한 라이소포스포리피드의 효과
잎에 노화를 지연시키는데 여러 라이소포스포리피드 종의 상대적인 효과를 평가하기 위해, 라이소포스파티딘산(LPA), 라이소포스파티딜콜린(LPC), LPE, LPI, 또는 물을 포함하는 처리 용액을 잎에 사용하였다. 각 시료의 엽록소 함량을 8일간의 노화기간 후에 표준 방법으로 측정하였다(10). 상대적인 엽록소 함량을 대조군에 대해 %로 나타냈다.
실시예 1f : 결과 및 토론.
여러 아실 쇄를 갖는 LPE에 의한 PLD 활성도의 억제.
본 발명자들은, 천역적으로 생성된 포스포리피드, LPE가 시험관 조건에서 특이한 방식으로 PLD 활성도를 억제함으로써 생물학적으로 활성 지질 조절자로 작용하는가를 연구하였다. PC를 기질로 사용하여, 부분적으로 정제된 양배추 PLD에 대한 LPE의 억제 효과를 평가 분석하였다. 40 및 200μM의 농도에서 여러 아실 쇄를 갖는 LPE에 의해 PLD 활성도를 억제하였다(도1). 억제도는 아실쇄의 길이 및 불포화에 따라 증가하였다. 18:1의 아실쇄를 갖는 LPE가 시험한 종 중에서 가장 효과적인 억제제였으며, 그 결과로 생성된 PLD 활성도는 40 및 200μM의 LPE 농도에서 각각 대조군에 대해 16% 및 11%였다. 한편, 식물 조직에 드물게 존재하는 LPE 14:0는 거의 효과가 없었다. 18:2 및 18:3을 포함하는 다른 아실 쇄를 갖는 LPE의 효과는 시험하기에는 흥미로왔지만, 이런 형태의 LPE는 현재 상업적으로 이용 할 수 없다. 시험한 다른 LPE 분자들과 비교하여, LPE(18:1)에 의한 PLD의 현저한 억제는 LPE의 현저한 억제는 LPE의 특이적인 배열이 이런 억제 효과를 위해 필요하다는 것을 제시하고 있다.
PLD 억제를 위한 LPE의 구조 특이성
어떤 구조 특이성이 LPE 억제를 위해 필요한지를 확인해 보고자 PLD활성도에 대한 LPE 분자의 여러 성분의 효과를 시험하였다. 헤드 기(에탄올아민) 및 아실 쇄(18:1지방산) 자체로는 PLD 활성도에 대한 억제 효과가 전혀 나타나지 않았다(도2). 이 결과는 단지 완전한 LPE분자만이 PLD를 억제할 수 있으며, 어떤 구조 성분의 손상은 완전히 효과가 없음을 나타내므로, 이것이 구조 특이성을 나타내는 것이다. 사실상, 포스파티딜에탄올아민(PE)은 PLD 활성도에 대해 약간의 자극적인 효과를 나타냈다. 200μM PE 존재하에서, PLD 활성도는 대조군의 126%였다(도2). PE 자체는 PLD의 우선적 기질이기 때문에, PLD 활성도에 증가는 PLD에 대한 직접적인 자극 효과 및/또는 PLD에 의한 PE의 우선적 가수분해로 설명할 수 있다.
LPE(18:1)에 의한 PLD 억제의 용량-의존성 및 반응속도.
LPE에 의한 PLD의 억제는 용량 의존적이다(도.3). LPE(18:1)는 10μM 농도에서 현저한 억제 효과를 나타내어 대조군의 50% 활성도를 보이며, 200μM까지 농도 증가시킴에 따라 억제도 점차적으로 증가하였다. 10 및 200μM의 LPE 농도는 반응 혼합물에서 전체 포스포리피드의 0.5 및 10 몰%를 각각 나타낸다. PLD 억제를 특성화하기 위해, LPE의 존재 또는 비존재하에서 PLD 억제에 대한 기질 농도의 영향을 분석하였다(도4). 정상적인 평가 분석 조건에는 기질의 포화 농도(2mMPC)를 사용한다. 4mM 기질 농도에서조차도 LPE(18:1)의 억제 효과를 유지하였다. PLD에 대한 분명한 Km은 1.7mM이었고, LPE 존재하에서도 변화가 없었다. 그러나. 대조군(Vmax: 20.0 μmol min-1 mg-1 단백질)과 비교할 때, LPE(18:1)의 존재는 Vmax(2.9μmol min -1 mg-1 단백질)에서 현저한 감소를 나타냇다. 이 결과는 LPE에 의한 PLD의 비경쟁적 억제를 제시한다.
LPE(18:1)에 의한 PLD의 원상 억제(in situ inhibition)
PLD는 시토졸에서 가용성 형태 뿐만아니라 멤브레인-조합 형태로 존재하기 때문에, 본 발명자들은 양배추 및 아주까리 잎에서 추출한 멤브레인-조합 PLD에 대한 LPE의 원상 억제를 측정하였다. 멤브레인-조합 및 가용성 양배추 PLD의 특이적인 활성도를 LPE(18:1)의 존재하에서 대조군의 59% 및 51%까지 각각 감소시켰다(표1). 멤브레인-조합 및 가용성 아주까리 PLD활성도를 대조군의 31% 및 30%까지 각각 감소시켰다. 이 결과는 멤브레이드-조합 및 가용성 PLD활성도 둘 다 LPE에 의해 억제됨을 나타낸다. 그러나, 멤브레인과 관련된 PLD 및 가용성 분류물의 억제는 LPE에 의해 부분적으로 정제된 양배추 PLD의 억제보다 덜 두드려졌다(도1 및 표1). 이것은 아마 약간의 방해 인자의 존재 또는 LPE에 덜 민감한 PLD의 다른 형태의 존재에 기인한다. 그러므로, PLD의 부분 정제는 PLD의 조절 메카니즘을 특징짓는데 중요하다는 것을 나타낸다(18). 이런 이유로, 본 연구에서 발명자들은 상업적으로 구입 가능한, 부분적으로 정제된 양배추 PLD를 사용하였다. 그러나, 잎 조직에서 추출한 멤브레인-조합 및 가용성 PLD에 대한 LPE의 관찰된 억제 효과는 부분적으로 정제된 PLD에서 얻은 결과를 뒷받침해 주고 있다.
LPE(18:1)에 의한 가용성 및 멤브레인-조합 PLD 활성도의 억제. 데이타는 양배추 및 아주까리에서 제조한 2개의 개별적인 추출(각 추출에서 2회 실험)의 평균 ±SE이다
가용성 PLD 멤브레인-조합 PLD
양배추 아주까리 양배추 아주까리
대조군 45.2±3.5 10.2±0.1 368.8±6.5 153.8±8.5
LPE 18:1(200μM) 23.1±1.6 3.1±0.1 217.0±13.0 47.0±3.6
비율(LPE/대조군) 0.51 0.30 0.59 0.31
여러 아실 쇄를 갖는 LPE에 의한 과일 에틸렌 생성의 억제
대조군과 비교했을때 낮은 비율의 에틸렌 생성으로 나타난 바와같이 LPEegg(달걀 노른자에서 추출)는 과일 노화를 지연시키는 것으로 발견되었다(3). PLD에 대한 LPE의 억제 효능이 LPE 아실 쇄의 길이 및 불포화에 좌우되는 것으로(도 1) 본 발명자들이 발견(3)한 이후에 과일 노화에 대한 여러 아실쇄를 갖는 LPE의 효과를 시험했다. 크린베리 과일을 14:0, 16:0, 18:0 및 18:1 쇄길이를 갖는 LPE로 처리하고 이 과일들에 의한 에틸렌 생성을 모니터하였다. 에틸렌 생성의 억제가 LPE 의 아실쇄 길이 및 불포화에 따라 증가했다(표 2). LPE(18:1)는 처리 2일 후 에틸렌 생성에 있어서 가장 급격한 감소(40%)를 나타냈다. 놀랍게도, 다양한 형태의 LPE에 의한 에틸렌 생성의 억제 패턴은 다양한 형태의 LPE에 의한 PLD의 억제 패턴과 유사했다(도 1). 이 결과는 PLD 활성도 및 에틸렌 생성의 억제가 마찬가지로 LPE의 쇄 길이 및 불포화에 좌우된다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 LPE(18:1)가 PLD를 억제하여 과일 노화를 지연시키는데 있어서 시험된 다른 LPE 종보다 우수하다는 것을 나타낸다.
여러 아실쇄를 갖는 LPE(100μM)에 의한 크랜베리 과일에 있어서 에틸렌 생성의 억제. 값은 세번 반복의 평균 ±SE 이다.
대조군 LPE 14:0 LPE 16:0 LPE 18:0 LPE 18:1
에틸렌 (nℓhr-1g-1) 1.78±0.38 1.78±0.11 1.65±0.05 1.27±0.05 1.06±0.13
상대 % 100 100.0 92.7 71.3 59.6
라이소포스포리피드에 의한 PLD의 구조적으로 선택적인 조절
PLD의 억제가 넓은 범위의 라이소포스포리피드에 의해서 발생 했는지를 알기 위하여 PLD에 대한 LPE의 억제효과를 식물세포에 존재하는 관련 라이소포스포리피드에 의한 억제와 비교했다 (도 5). 라이소포스파티딜콜린 (이하 "LPC"라 함), 라이소포스파티딜글리세롤 (이하 "LPG"라 함) 및 라이소포스파티딜세린 (이하 "LPS"라 함)은 PLD 활성도에 많은 영향을 미치지 않았다. 그러나, LPI는 LPE와 약간 유사한 억제효과를 나타냈다. 반면, 라이소포스파티딘산 (이하 " LPA"라 함)은 PLD 활성도를 상당히 증가시켰다(도 5). 예를들면, 200μM의 LPI 및 LPA농도에서 PLD 활성도는 각각 대조군의 31% 및 169%였다. 도 5에서 시험된 합성 라이소포스포리 피드는 LPA뿐이었다. 다른 모든 라이소포스포리피드는 기본적으로 16:0 또는 18:0 지방산을 함유하는 천연원으로부터 얻은 것이다. LPA(16:0) (도 5) 이외에 본 발명자들은 LPA(18:1) 시험하여 두 형태의 LPA에서 유사한 결과를 발견했다. 본 연구에서는 LPC가 아닌 LPE가 PLD에 대하여 강한 억제효과를 가졌다(도 5). 이 결과는 PLD 효소에 대한 개별적인 라이소포스포리피드의 조절 효과가 매우 특이하며 구조적으로 선택적이라는 것을 나타낸다.
LPE 이외에 LPI도 식물에서 노화를 지연시키기 위한 지질 매개체가 될 수 있다는 것을 나타낸다.
LPI에 의한 잎 노화의 지연
LPI로 처리된 노화 잎의 엽록소 함량은 LPA, LPC 또는 LPEegg로 처리된 잎보다 훨씬 더 높은 것으로 나타났다(도 6). 이 결과는 LPI가 잎 노화를 지연시키는데 특히 효과적이라는 것을 나타낸다.
실시예 1을 요약하면 본 발명자들의 지식으로는, 이것이 PLD 효소의 활성도를 직접 표적으로 하는, LPE(18:1) 및 LPI에 의한 PLD의 특이적인 억제 조절을 나타내는 첫번째 연구이다. 이것은 식물 및 동물에 있는 PLD의 알려진 특이적 억제인자가 없기 때문에 중요한 발견이다(19). LPE(18:1)로 과일 식물을 처리하는 것은 보다 짧은 아실쇄 길이와 보다 높은 정도의 포화를 갖는 LPE종 보다 더 많이 에틸렌 생성을 감소시키는 것으로 나타났다. 에틸렌과 PLD 모두 식물의 노화와 관련있기 때문에 LPE(18:1)와 LPI가 LPE의 다른 종보다 과일 및 식물조직에 있어서 노화를 지연시키는데 특히 효과적인 것으로 예상된다.
실시예 2. 꽃의 노화지연 및 저장 수명 강화
금어초(Antirrhinm majus L. cv. Potomac White)의 개화 이삭을 수집하여 상업적인 재배자로부터 밤새 배달받았다(20). 접수시에 이삭의 줄기단부를 증류수하에서 재절단하고 2시간동안 다시 수분 공급했다. 수분공급 후 이삭을 40cm 길이로 절단하고 이삭의 18cm이하에 있는 잎들을 제거했다. 이것은 잎이 꽃병에서 박테리아 및 진균류 오염원이 되는 것을 방지하기 위함이다. 모든 이삭들을 저장하고 처리를 위해 임의적으로 선택했다. LPE(18:1), LPI 및 LPEegg를 증류수에서 제조하였다. 물에서 LPE 및 다른 라이소포스포리피드의 용해를 용이하게 하기 위해 초음파 처리를 사용했다.
LPE 처리의 경우에는 이삭의 절단단부를 여러 농도의 LPE용액에 24시간동안 유지시켰다. 그후, 이들을 증류수로 옮기고 3주동안 그 물에 유지시켰다. 이삭에 대하여 꽃봉오리의 개화 및 노화현상(시듬 및 변색)을 관찰했다. 꽃의 목부분이 시들면 상품화가 불가능한 것으로 간주했다. 이삭이 팽창된 상태(시들지 않은)를 유지하는 한 그리고 50%이상의 꽃이 싱싱함을 유지할때를 상품성 있는 것으로 간주했다. 연구의 종료시점에서 싱싱한 것 대 건조한 것의 중량비를 측정하여 팽창도 및 잎의 건강의 지수로서 이삭 잎의 수분함량을 측정했다.
표 3에 도시된 바와같이, LPEegg(달걀에서 정제된 LPE) 처리는 대조군과 비교했을때 노화를 지연시켰으며 ; 37-52%의 가시들은 반면에 대조군에서는 76%가 처리 7일 후에 시들었다. LPE(18:1)와 LPI처리는 금어초의 꽃병 수명을 증가시키는데 특히 효과적이었는데 ; 이들 두 처리에서 각각 30-39% 및 15-22%의 이삭이 시들 었다. LPE(18:1)와 LPI는 꽃의 꽃병수명을 증가시킬뿐만 아니라 이들 지질에 대한 꽃의 민감도도 개선시켰다. 예를들면, 5mg/L의 LPI 및 LPE(18:1)은 25mg의 LPEegg로 처리한 것 보다 보다 긴 꽃의 꽃병 수명을 나타냈는데, 이것은 LPI와 LPE(18:1)이 노화지연을 위해서는 라이소포스포리피드들 중에서 보다 활성적인 형태라는 것을 나타낸다. LPI와 LPE(18:1)로 처리된 꽃들은 13일까지 상품성을 유지했지만 물로 처리한 꽃과 LPEegg 처리된 꽃들은 각각 4일 및 7일 동안 상품성을 유지했다. LPE(18:1) 및 LPI 처리된 이삭의 잎 수분 함량은 처리 18일 후에 LPEegg 및 물로 처리된 이삭보다 더 높았다. 이 데이타는 LPE(18:1)와 LPI로 처리된 꽃의 저장 수명이 개선된 것과 일치했다. 이 데이타는 LPE(18:1)과 LPI가 LPEegg 보다 우수하다는 것을 지지한다.
처리 7일 후 꽃이 시든 이삭 (총 %) 18일 후 잎의 수분 함량 (싱싱한 것의 중량/건조한 것의 중량) 이삭의 꽃병 수명** (일)
대조물(물) 평균±SE* 75.5±10.3 평균±SE* 5.79±0.18 4
LPEegg 5mg/L 10 25 52.3±9.5 50.0±15.5 36.7±5.55 6.77±0.44 --- --- --- --- 7
LPE18:1 5mg/L 10 25 34.5±5.5 30.0±5.5 38.7±8.5 7.81±0.22 --- --- --- 12 ---
LPI 5mg/L 10 25 21.6±7.0 15.0±11.5 17.8±7.5 7.57±0.52 --- --- --- 13 ---
* 데이타는 두번의 개별적인 실험의 평균 ±SE이다. 각 실험은 처리당 12개의 이삭으로 수행되었다.
** 꽃병수명 : >50%의 이삭이 상품성을 유지한 일수
카네이션(Dianthus caryophyllus L. cv. White Sim)의 개화이삭을 상업적인 재배자로 부터 얻어서 상기 금어초에 대해 기술한 바와같은 다양한 지질로 처리했다. 금어초에서와 같이 LPI와 LPE(18:1)이 25m/L에서 카네이션의 꽃병수명을 연장시키는데 있어서 LPEegg 및 대조군 보다 우수했다(표 4). LPEsoy(콩에서 정제된 LPE)도 LPEegg(달걀에서 정제된 LPE)보다 우수한 저장수명을 제공했다. LPEsoy는 LPE(18:1), LPE(18:2) 및 LPE(18:3)과 같은 64% 불포화 LPE, 및 LPE(16:0) 및 LPE(18:0)과 같은 30% 포화 LPE, 및 2% LPI(앨러바마, 알라바스터에 소재하는 Avanti Polar Lipids, Inc.로 부터 입수가능함)로 이루어져 있는 반면에 LPEegg는 LPE(16:0) 및 LPE(18:0)와 같은 대부분(>94%) 포화 LPE를 함유한다. 이러한 결과는 LPE(18:1) 와 LPI가 꽃의 꽃병수명을 연장시키는데 있어서, 다른 LPE 종보다 우수하다라는 본 발명자들의 결론을 지지한다.
처리 처리 6일 후 상품성 있는 꽃 (총 %)
*평균 ±SE
대조군(물) 27.5±3.3
LPEegg 30.8±3.3
LPE 18:1 41.7±8.3
LPI 44.2±8.3
LPEsoy 41.7±8.3
* 데이타는 처리당 36개 꽃의 평균±SE이다 (9꽃/반복).
실시예 3. 과일 노화의 지연
성숙된 녹색의 토마토(Lycopersicon esculentum cv. H9144)를 3개월된 토마토 식물로부터 수확했다. 수확한 과일을 1% 에탄올에서 100mg/L 농도로, 하기 표 5에 기재된 바와같은 라이소포스포리피드 용액에 20분동안 침지시켰다. 대조토마토들을 1% 에탄올 함유 증류수에 침지시켰다. 침지 후 과일들은 3주동안 실온에서 저장했다. 처리 7일 후 에틸렌 개스의 생성을 측정했다. 과일에서 에틸렌 생성비율은 과일이 성숙하기 시작함에 따라 점차적으로 증가했다. 0일에 성숙된 녹색 토마토에서 에틸렌의 생성이 없었지만 비처리 대조군 과일은 처리 7일 후에 1.26nℓ/g.hr-1의 비율로 에틸렌을 생성했다 (하기 표5 참조). LPEegg 처리 과일은 대조군과 유사한 에틸렌 생성을 나타냈다. LPE(18:1)과 LPI로 처리된 과일은 모두 에틸렌 생성의 억제를 나타냈고 비율은 대조군의 약 절반정도 뿐인 반면에 LPEegg로 처리된 과일에서는 에틸렌 생성의 억제가 과일의 저장수명을 연장시키는 것과 관련되었다. 이러한 예상과 일치하여, 배양 3주 후 부패한 과일의 비율은 LPE(18:1) 와 LPI가 토마토의 저장수명을 연장시키는데 있어서 LPEegg와 대조군보다 특히 더 효과적이라는 것을 나타냈다. LPEsoy는 과일의 저장 수명을 연장시킨다는 면에서 LPEegg보다 우수한 것으로 발견되었다(LPEegg에서는 부패한 과일이 24%이고 LPEsoy에서는 15%였다).
처리* 7일 후 에틸렌 생성 (nℓ/g.hr-1)_ 3주 후 부패한 과일 (총 %)
대조군 평균±SE** 1.26±0.21 37.2
LPEegg 1.22±0.22 24.4
LPE 18:1 0.70±0.20 7.7
LPI 0.71±0.40 17.5
LPEsoy 0.74±0.10 15.0
* 모든 용액은 1%(v/v) 에탄올에서 제조되었음.
** 데이타는 두개의 독립적 실험의 평균 ±SE이다. 각 실험은 처리당 9개의 과일로 이루어졌다.
실시예 4. 에테폰 유도 잎 노화의 지연
Ethrel(Ethrel은 Rhone-Poulence Ag. Co.(노오쓰 캐롤라이나, 리서치 트라이앵글 파크)의 상표임)로 알려진 에테폰은 에틸렌으로 분해되어 수확작업시 익숙한 토마토 과일의 수확량을 최대화시키는데 널리 사용되는 수성 제제이다. 본 발명은 에테폰 유도 잎의 노화로부터 잎을 보호하는데 있어서 LPE(18:1)가 LPEegg 및 다른 라이소포스포리피드가 더 우수하다는 것을 입증한다. 토마토 식물 cv. H9144를 비닐하우스에서 두달 반 동안 재배하여 잎 샘플원으로 제공했다. 하기 표 6에 도시된 바와같이 1000mg/L의 에테폰 또는 에테폰과 라이소포스포리피드 혼합물로 식물에 흘러내릴때까지 스프레이 했다. 50mg/L의 라이소포스포리피드 용액을 1%(v/v) 에탄올에서 제조하고 에테폰(1000mg/L)과 혼합했다. 대조식물에는 1%(v/v) 에탄올에 있는 에티폰만으로 스프레이했다. 처리된 잎의 노화를 처리 10-14일 후에 엽록소 및 단백질 함량을 측정하여 정량화했다. 에테폰 스프레이 잎 조직은 하기 표 6에 도시된 바와같이 엽록소 및 단백질 함량에 있어서 많은 손실을 나타냈다. LPEegg는 에테폰 유도 노화를 현저히 지연시켰다. LPE(18:1)은 에테폰에 의해 야기된 잎 노화를 훨씬 더 우수하게 지연시키는 것으로 나타났다. LPI는 에테폰 유도 잎 노화에 대한 약간의 지연효과를 가졌다. 이 결과는 LPE(18:1)이 이러한 목적에 있어서도 다른 형태의 LPE보다 우수한 작용을 한다는 것을 입증한다.
처리* 엽록소 함량 (mg/g 건조 중량) 단백질 함량 (mg/g 건조 중량)
에테폰(E) 평균±SE** 3.65±0.25 평균±SE** 58.8±14.7
E+LPEegg 5.88±2.04 81.9±17.6
E+LPE 18:1 8.40±2.70 100.0±20.0
E+LPI 4.12±0.55 60.0±14.7
* 모든 용액은 1%(v/v) 에탄올에서 제조되었다.
** 데이타는 세번의 독립적 실험의 평균±SE이다. 데이타는 처리 10-14일 후에 수집되었다.
실시예 5. 과일 성숙의 강화
과일을 성숙시키는 것에 대한 LPEegg, LPE(18:1) 및 LPI의 효과를 비교하기 위해 이 실험을 수행하였다. 토마토 식물 cv. H9478을 형광등 아래에서 두달 반 동안 화분에서 재배했다. 약 10%의 과일이 성숙 단계에 있는 전체식물에 LPEegg, LPE(18:1) 또는 LPI와 같은 여러 라이소포스포리피드 100mg/L를 함유하는 용액으로 스프레이 했다. 모든 용액은 1%에탄올과 활성화제로서 0.05% sylgard 309(미시간, 미들랜드에 소재하는 Dow Corning Co.)를 함유했다. 대조식물에는 1%에탄올과 0.05% sylgard 309를 함유하는 증류수를 스프레이했다. 처리 10일 후 과일을 수확하여 녹색, 부분적 적색 및 적색(완전 성숙을 나타냄)으로 등급화했다. LPEegg는 미국 특허 제 5,126,155호 및 제 5,110,341호에 이미 기술된 바와같이, 대조군과 비교할때 과일 성숙은 매우 강화시켰다(표 7참조). 그러나, LPI와 LPE(18:1)는 LPEegg 보다 효과적인 것으로 발견되었다. LPI와 LPE(18:1)는 또한 대조군과 LPEegg와 비교했을 때 수확 후 과일의 저장 수명을 연장시키므로서 과일 안정성도 강화시켰다.
수확시 수확 3주 후
처리* 녹색 부분적색 적색 연질 과일 (상품성 없음)
(총 %) (총 %)
대조군 33.2 13.2 53.6 47.8
LPEegg 22.8 15.9 61.3 36.6
LPE 18:1 22.9 11.7 65.4 33.0
LPI 18.3 11.7 70.1 25.6
* 모든 용액은 1%(v/v) 에탄올과 0.05% sylgard 309에서 제조되었다. 스프레이 살포는 수확 10일 전에 이루어졌다.
** 데이타는 세번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
Figure 112000009356669-pct00002
Figure 112000009356669-pct00003

Claims (13)

  1. 과일 및 다른 식물조직의 노화를 지연시키는 방법에 있어서,
    과일 및 다른 식물조직에 라이소포스파티딜이노시톨, 라이소포스파티딜에탄올아민 (18:1) 또는 그것들의 조합을 포함하는 조성물을 살포하는 단계를 포함하는, 과일 및 다른 식물조직에서 노화 지연 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조성물이 활성화제를 더 포함하는, 과일 및 다른 식물조직의 노화 지연 방법.
  3. 제1항에 있어서, 조성물이 수용액인, 과일 및 다른 식물조직의 노화 지연 방법.
  4. 제1항에 있어서, 조성물이 수확 전 또는 수확 후에 살포되는, 과일 및 다른 식물조직의 노화 지연 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 조성물이 ℓ당 0.5∼1000㎎의 라이소포스파티딜이노시톨, 라이소포스파티딜에탄올아민 (18:1) 또는 그것들의 조합을 함유하는, 과일 및 다른 식물조직의 노화 지연 방법.
  7. 제2항에 있어서, 활성화제가 에탄올, 노닐페놀, 폴리옥시에틸렌 또는 실옥실레이티드 폴리에테르인, 과일 및 다른 식물조직의 노화 지연 방법.
  8. 과일의 성숙 및 안정성을 향상시키는 방법에 있어서,
    수확 전 전체 식물조직에 라이소포스파티딜이노시톨, 라이소포스파티딜에탄올아민 (18:1) 또는 그것들의 조합을 포함하는 조성물을 살포하는 단계를 포함하는, 과일의 성숙 및 안정성 향상 방법.
  9. 제8항에 있어서, 조성물이 활성화제를 더 포함하는, 과일의 성숙 및 안정성 향상 방법.
  10. 제8항에 있어서, 조성물이 수용액인, 과일의 성숙 및 안정성 향상 방법.
  11. 제8항에 있어서, 조성물이 수확 전 또는 수확 후에 살포되는, 과일의 성숙 및 안정성 향상 방법.
  12. 삭제
  13. 제 9항에 있어서, 활성화제가 에탄올, 노닐페놀, 폴리옥시에틸렌 또는 실옥실레이티드 폴리에테르인, 과일의 성숙 및 안정성 향상 방법.
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