KR100805660B1

KR100805660B1 - 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100805660B1
Application number: KR1020060118161A
Authority: KR
Inventors: 함기백; 김동규; 곽미선; 주상언; 문병석; 송근석
Original assignee: 주식회사유한양행
Priority date: 2005-12-01
Filing date: 2006-11-28
Publication date: 2008-02-21
Also published as: AU2006321471A1; CR10018A; CN101316594B; JP2009517462A; JP5207974B2; BRPI0619081A2; US7776873B2; HK1123507A1; AU2006321471B2; EP1954279A4; ECSP088545A; KR20070057663A; CA2631068C; CN102309490A; CN101316594A; WO2007064128A1; MY145406A; EP1954279A1; CA2631068A1; US20070129391A1

Abstract

본 발명은 레바프라잔(revaprazan) 또는 그의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 레바프라잔 또는 그의 염은 산 펌프 길항제로서 작용함과 동시에, 위장관 점막의 방어인자를 증강시킴으로써 우수한 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료효과를 가진다.

레바프라잔

Description

위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물{A composition for preventing or treating damages of the mucousa in the gastrointestinal tracts}

도 1은 헬리코박터 파이로리(H. pylori)-유도 위장관 점막 손상에 의한 세포 사멸에 미치는 레바프라잔의 억제효과에 대한 MTT 분석 결과를 나타낸다.

도 2는 에탄올-유도 위장관 점막 손상에 의한 세포 사멸에 미치는 레바프라잔의 억제효과에 대한 MTT 분석 결과를 나타낸다.

도 3a 및 도 3b는 생체 내(in vivo) 위장관 손상에 미치는 레바프라잔의 세포 보호 효과(cytoprotective effect)를 나타내는 이미지(image)이다.

도 4는 헬리코박터 파이로리(H. pylori)-유도 ERK (extracellular signal-regulated kinase) 활성화에 미치는 레바프라잔의 저해 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 이미지이다.

도 5는 헬리코박터 파이로리(H. pylori)-유도 NF-kB 활성화에 미치는 레바프라잔의 저해 효과를 나타내는 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) 결과이다.

도 6은 프로-안지오제닉 성장 인자들의 활성에 미치는 레바프라잔의 효과를 나타내는 RT-PCR 결과이다.

도 7은 열 충격 단백질들(heat shock proteins)의 활성에 미치는 레바프라잔 의 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 이미지이다.

도 8은 인도메타신 투여 전에 레바미피드, 오메프라졸, 및 레바프라잔을 처리하여, 위점막 병변에 대한 예방 효과를 나타내는 비교 이미지이다.

도 9는 인도메타신을 투여한 후의 위점막 병변에 대한 레바프라잔의 치료 효과를 나타내는 비교 이미지이다.

본 발명은 레바프라잔(revaprazan) 또는 그의 염을 포함하는 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

레바프라잔(revaprazan)은 화학명이 5,6-디메틸-2-(4-플루오로페닐아미노)-4-(1-메틸-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-2-일)피리미딘[5,6-dimethyl-2-(4-fluorophenylamino)-4-(1-methyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-2-yl)pyrimidine]으로서 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이며, 레바프라잔 염산 등을 포함한 산 부가염 형태로 사용될 수 있다 (국제특허공개 제WO96/05177호).

레바프라잔 또는 그의 염은 위벽 세포에 존재하는 프로톤 펌프(H⁺/K⁺ ATPase)의 H⁺/K⁺ 교환부위에 가역적으로 결합하여 위관강 내로의 H⁺의 분비를 경쟁적으로 억제한다. 레바프라잔 또는 그의 염은 H⁺/K⁺ ATPase의 특정 부위에 결합하여, H⁺의 수송 및 위관강으로의 산 분비를 차단함으로써, 위내 pH(intragastric pH)를 상승시킨다. 오메프라졸 등의 비가역적 프로톤 펌프 저해제와 달리, 레바프라잔 또는 그의 염은 약물의 위산 활성화(gastric acid activation) 또는 프로톤 펌프의 위산 분비에 영향을 받지 않는다. 오메프라졸 등의 비가역적 프로톤 펌프 저해제와의 상이한 기전에 근거하여, 레바프라잔 또는 그의 염은 위산 펌프 길항제(Acid Pump Antagonist, APA)로 분류된다.

한편, 위장관 질환은 공격인자(예를 들어, 위산)가 강하거나, 방어인자가 약해질 경우에 발생하게 된다. 오메프라졸 등의 프로톤 펌프 저해제 및 레바프라잔 등의 위산 펌프 길항제는 모두 공격인자 즉, 위산 분비를 억제하는 화합물이며, 수크랄페이트(sucralfate), 레바미피드(rebamipide) 등의 점막 보호제(cytoprotective agent)는 방어인자를 증강시키는 화합물이다.

본 발명자들은 위산 펌프 길항제인 레바프라잔 또는 그의 염을 사용하여 다양한 임상시험을 수행하였으며, 레바프라잔 또는 그의 염이 프로톤 펌프 억제 활성뿐만 아니라, 위장관에서 점막 보호 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 레바프라잔 또는 그의 염이 공격인자인 위산 분비를 억제하는 효과뿐 아니라, 방어인자를 증강시키는 위장관 점막 보호 효과를 동시에 가짐을 시사하는 것으로, 매우 놀라운 것이다.

따라서, 본 발명은 레바프라잔 또는 그의 염을 포함하는 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 레바프라잔(revaprazan) 또는 그의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 치료학적으로 유효한 양의 레바프라잔(revaprazan) 또는 그의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약물-유도성(drug-induced) 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 치료학적으로 유효한 양의 레바프라 잔(revaprazan) 또는 그의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 알콜-유도성(alcohol-induced) 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 치료학적으로 유효한 양의 레바프라잔(revaprazan) 또는 그의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 비-스테로이드성 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)에 의한 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다. 본 발명에서 사용되는 NSAIDs는 특별히 제한된 것이 아니며, 널리 사용되는 모든 NSAIDs, 예를 들어, 아스피린(Aspirin), 인도메타신(Indomethacin), 디클로페낙(Diclofenac), 이부프로펜(Ibuprofen), 나프록센(Naproxen), 피록시캄(Piroxicam), 메페남산(Mefenamic Acid), 플루페남산(Flufenamic Acid), 플록타페닌(Floctafenine), 에텐자마이드(Ethenzamide), 소듐 살리실레이트(Sodium salicylate), 디플루니살(Diflunisal), 클로페존(Clofezone), 케토페닐부타존(Ketophenylbutazone), 페닐부타존(Phenylbutazone), 아세틀로페낙(Alclofenac), 알미노프로펜(Alminoprofen), 케토프로펜(Ketoprofen), 플루비프로펜(Flurbiprofen), 프라노프로펜(Pranoprofen), 록소프로펜 소듐(Loxoprofen-Na), 티아라마이드 염산염(Tiaramide hydrochloride), 페리속살 시트레이트(Perisoxal citrate), 에모르파존(Emorfazone), 아세페타신(Acemetacin), 프로글루메타신 말리에이트(Proglumetacin maleate), 부콜롬(Bucolome) 등을 포함한다.

레바프라잔은 국제특허공개 제WO96/05177호, 제WO97/42186호, 및/또는 제 WO98/18784호에서 개시한 제조방법으로 제조할 수 있다. 또한, 레바프라잔의 염은 염산, 황산, 인산, 및 질산 등의 무기산 염 및 타르타르산, 푸마르산, 시트르산, 메실산, 및 아세트산 등의 유기산 염일 수 있으며, 바람직하게는 레바프라잔 염산염일 수 있다.

본 발명의 조성물은 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 활택제, 유화제, 현탁화제, 안정화제, 및 등장화제 등을 포함할 수 있다. 필요할 경우, 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 투여하거나, 정맥내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여를 포함한 비경구로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 정제, 캡슐제, 수성액제 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 통상 락토즈, 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 가해질 수 있다. 경구투여용 캡슐제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여의 경우, 활성성분의 멸균 용액이 통상 제조되며, 용액의 pH를 적합하게 조절하고 완충시켜야 한다. 정맥내 투여의 경우, 용질의 총 농도는 제제에 등장성이 부여되도록 조절되어야 한다. 본 발명에 따른 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태일 수 있다. 상기 용액은 국소 주사(local bolus injection)로 환자의 근육내 혈류에 투여될 수 있다.

레바프라잔 또는 그의 염은 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 약 50 mg 내지 약 400 mg per day, 바람직하게는 약 100 mg 내지 300 mg per day, 더욱 바람직하게는 약 150 mg 내지 250 mg per day, 특히 바람직하게는 약 200 mg per day의 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 물론, 상기 용량은 환자의 나이, 체중, 감수성, 또는 증상에 따라 변경될 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1. 헬리코박터 파이로리( H. pylori )-유도 세포 사멸율 측정 (MTT 분석-1)

헬리코박터 파이로리(H. pylori) 감염에 대한 레바프라잔의 세포 보호능 (cytoprotective properties)을 측정하기 위하여, 헬리코박터 파이로리(H. pylori) 감염 전에 위점막 세포를 레바프라잔 및 레바미피드로 전처리하고, 세포 사멸율을 측정하였다. 대조약물로서, 점막 보호능을 갖는 것으로 알려진 레바미피드를 사용하였다.

사람의 위상피세포 (AGS 세포, KCLB 21739)를 96-웰 플레이트(96-well plate)에 5 X 10⁴cells/ml로 시딩(seeding)한 후, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 10 % 소태아혈청(FBS)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, New York, USA)에 배양하였다. 멸균수에 용해시킨 레바프라잔 및 레 바미피드를 최종농도가 50 μM이 되도록 AGS 세포에 첨가하고, 상기 세포를 37 ℃에서 16시간 배양하였다. RPMI 1640 배지를 제거하기 위하여, 상기 플레이트를 24 ℃에서 3000 rpm으로 5분간 원심분리한 후 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 및 2 mM KH₂PO₄)로 3회 세척하였다. 헬리코박터 파이로리(H. pylori, ATCC 43504) 균액을 PBS 에 재현탁시켜, 최종농도가 5 × 10⁸ CFU/ml가 되도록 AGS 세포에 접종하여 공배양(coculture)하였다. 37 ℃에서 48시간 배양한 후, 배양물을 24 ℃에서 3000 rpm으로 5분간 원심분리하여 배지(즉, RPMI 1640)를 제거하고, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolim bromide) 분석 방법으로 살아있는 총 세포수를 분석하였다. PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 및 2 mM KH₂PO₄)에 MTT (Amresco, Ohio, U.S.A.)를 용해시켜 제조한 1 mg/ml MTT 용액을 50 ul/웰이 되도록 각 웰에 첨가한 다음, 37 ℃에서 4시간 배양하였다. 24 ℃에서 3000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 살아 있는 세포에 의해 형성되는 포르마잔 결정(formazan grains)을 99.5 % 디메틸 술폭사이드(DMSO)(Kanto, Tokyo, Japan)(50 ul/웰)에 녹인 후, ELISA reader (TECAN, Maennedorf, Switzerland)를 사용하여 540 nm에서 흡광도(optical intensity)를 측정하였다.

상기 MTT 분석 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 확이할 수 있는 바와 같이, 48시간 헬리코박터 파이로리 (H.pylori) 감염에 의해 유의성 있는 위점막 세포손상(cytotoxicity)이 유도되었다. 그러나 레바미피드와 레바프라잔을 전처리하였을 때, 헬리코박터 파이로리(H.pylori)에 의한 위점막 세포손상이 유의성 있게 감소하였다. 이러한 결과는 헬리코박터 파이로리(H. pylori)-유도 세포손상에 대하여 레바프라잔이 레바미피드와 동등 이상의 세포 보호 효과(cytoprotective effect)를 가짐을 나타낸다.

실시예 2. 에탄올에 의한 세포 사멸율 측정 ( MTT 분석-2)

랫드의 위점막 세포 (RGM-1, RIKEN cell bank, Japan)를 96-웰 플레이트(96-well plate)에 5 X 10⁴cells/ml로 시딩(seeding)한 후, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 10 % 소태아혈청(FBS)이 첨가된 DMEM-F12 (Gibco BRL, Grand Island, New York, USA)에 배양하였다. 멸균수에 용해시킨 레바프라잔 및 레바미피드를 최종농도가 50 μM이 되도록 RGM-1 세포에 첨가하고, 상기 세포를 37 ℃에서 16시간 배양하였다. DMEM-F12 배지를 제거하기 위하여, 상기 플레이트를 24 ℃에서 3000 rpm으로 5분간 원심분리한 후 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 및 2 mM KH₂PO₄)로 3회 세척하였다. 에탄올-함유 배지(100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 10% 소태아혈청(FBS)이 첨가된 200 mM 에탄올-함유 DMEM-F12)를 상기 세포에 가하고, 세포를 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 배양 후, 배양물을 24 ℃에서 3000 rpm으로 5분간 원심분리하여 배지를 제거하고, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolim bromide) 분석 방법으로 살아있는 총 세포수를 분석하였다. PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 및 2 mM KH₂PO₄)에 MTT (Amresco, Ohio, U.S.A.)를 용해시켜 제조한 1 mg/ml MTT 용액을 50 ul/웰이 되도록 각 웰에 첨가한 다음, 37 ℃에서 4시간 배양하였다. 24 ℃에서 3000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 살아 있는 세포에 의해 형성되는 포르마잔 결정(formazan grains)을 99.5 % 디메틸 술폭사이드(DMSO)(Kanto, Tokyo, Japan)(50 ul/웰)에 녹인 후, ELISA reader (TECAN, Maennedorf, Switzerland)를 사용하여 540 nm에서 흡광도(optical intensity)를 측정하였다.

상기 MTT 분석 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 에탄올 단독 처리군에서는 유의성 있는 위점막 세포손상(cytotoxicity)이 유도되었다. 한편, 레바미피드/레바프라잔-에탄올 처리 군에서는 위점막 세포손상이 유의성 있게 감소되었다. 이러한 결과는 레바프라잔이 레바미피드에 비하여 동등 이상의 세포 보호 효과(cytoprotective effect)를 가짐을 나타낸다.

실시예 3. 생체 내( in vivo ) 위장관 손상 억제시험

6 주령의 SPF(specific-pathogen-free) 스프라그-도울리 계 웅성 랫드(Charles River, Tokyo, Japan)를 시험에 사용하였다. 상업적으로 시판되는 멸균된 펠렛 사료(Biogenomics Co., Seoul, Korea)와 멸균된 물을 자유롭게 먹이고, 12시간씩 낮과 밤을 조절하며 청정실(air-conditioned biohazard room)에서 사육하였다. 랫드를 인도메타신 단독 처리군, 레바프라잔-인도메타신 처리군, 에탄올 단독 처리군, 레바프라잔-에탄올 처리군의 4군으로 나누었다. 랫드를 24 시간 절식시키고, 인도메타신(40mg/kg, 12 시간) 또는 순수한 에탄올(6ml/kg, 1 시간)에 노출시키기 전에, 오로-가스트릭 튜브(oro-gastric tube)를 통하여 0.5% CMC (카르복시메틸셀룰로오스)에 현탁시킨 10mg/kg의 레바프라잔을 투여하였다.

인도메타신을 투여한 군에 속하는 랫드의 위를 적출하여 위점막의 병변 정도를 관찰하였다(도 3a). 도 3a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인도메타신 단독 처리군에서는 위점막에 출혈성 병변의 증가가 육안으로 관찰되었다. 그러나, 레바프라잔 투여 후 인도메타신으로 처리한 레바프라잔-인도메타신 처리군에서는 인도메타신-유도 위점막 손상(gastric injury)이 완전히 억제되었다. 또한, 에탄올 처리군에 속하는 랫드의 위를 적출하여 위점막의 병변 정도를 관찰하였다(도 3b). 도 3b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 에탄올 단독 처리군에서도 위점막에 출혈성 병변의 확연한 증가가 육안으로 관찰되었다. 그러나, 레바프라잔 투여 후 에탄올을 투여한 레바프라잔-에탄올 처리군에서는 에탄올-유도 위점막 손상(gastric injury)이 완전히 억제되었다. 이러한 결과는 레바프라잔 전처리가 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)(예를 들어, 인도메타신)이나 에탄올-유도성 위점막 손상을 유의성 있게 감소시킴으로써, 우수한 위장관 세포 보호 효과가 있음을 나타낸다.

실시예 4. 헬리코박터 파이로리 ( H. pylori )-매개 세포독성을 유도하는 ERK( extracellular signal -regulated kinase )의 활성 측정

헬리코박터 파이로리(H. pylori)-유도 세포독성(cytotoxicity)은 MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)를 활성화시킴으로써, 세포사멸(apoptosis)를 유도한다. 그러므로, 헬리코박터 파이로리(H. pylori) 감염은 MAPK의 세 개의 주요 subfamily 중의 하나인 ERK의 인산화를 증가시키게 된다.

사람의 위상피세포 (AGS 세포, KCLB 21739)를 배양 접시(culture dish)에 2 X 10⁶ cells/100 mm²로 시딩(seeding)한 후, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 10 % 소태아혈청(FBS)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, New York, USA)에 배양하였다. 멸균수에 용해시킨 레바프라잔을 최종농도가 5 및 25 μM이 되도록 AGS 세포에 첨가하고, 상기 세포를 37 ℃에서 16시간 배양하였다. RPMI 1640 배지를 제거하고, 상기 세포를 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 및 2 mM KH₂PO₄)로 3회 세척하였다. 헬리코박터 파이로리(H. pylori, ATCC 43504) 균액을 PBS 에 재현탁시켜, 최종농도가 5 × 10⁸ CFU/ml가 되도록 AGS 세포에 접종하여 공배양(coculture)하였다. 37 ℃에서 30 분간 배양한 후, 세포를 용해 완충액(Lysis buffer)(20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA, 및 protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Germany)에 재현탁시켰다. 현탁액을 BIORUPTOR (Cosmo Bio, Koto-ku, Tokyo)를 사용하여 초음파 파쇄 (약 10초, 4회)하고, 4 ℃에서 12000rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상등액을 단백질 추출물로 사용하였으며, 10% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동 한 후, semidry transfer system (Hoeffer Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, USA)을 사용하여 PVDF막 (Millipore, Massachusetts, USA)으로 전이(transfer) 시켰다. 일차 항체와 단백질 사이의 비특이적인 결합을 차단하기 위하여, PVDF막을 5% skim milk (Difco, Livonia MI, USA)를 함유하는 블록킹 완충액(blocking buffer) (TBST: 10　mM Tris-Cl, pH 8.0, 150　mM NaCl, 및 0.1% Tween 20 (v/v))으로 23 ℃에서 1시간 블록킹하였다. PVDF막을 p-ERK 또는 ERK에 대한 일차 항체의 1:1000 희석액(200 ng/ml)과 함께 4 ℃에서 15시간 배양하였다. PVDF막을 HRP (horseradish peroxidase)-포합된(conjugated) 이차 항체 (Santa Cruz Biotech, California, U.S.A.)의 1:2000 희석액(100 ng/ml)과 함께 23 ℃에서 1시간 배양하였다. 면역복합체(immunocomplex)를 ECL (enhanced chemiluminescence) detection kit (Amersham-Pharmacia Biotec)를 사용하여 확인하였다.

헬리코박터 파이로리(H. pylori)-감염 세포의 비처리군 및 레바프라잔 처리군의 p-ERK에 대한 웨스턴 블롯 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 레바프라잔은 ERK의 활성화에 대하여 유의성 있는, 농도-의존적인 저해효과를 나타낸다.

실시예 5. 헬리코박터 파이로리 ( H. pylori ) 감염과 연관된 NF - kB 전사인자의 활성 측정( Electrophoretic mobility shift assay , EMSA )

헬리코박터 파이로리(H. pylori) 감염과 연관된 것으로 알려져 있는 레독스-감수성(Redox-sensitive) 전사인자인 NF-kB (nuclear factor - kappa B)의 DNA 결합 활성을 EMSA로 측정하였다. 대조약물로서 점막 보호능을 갖는 것으로 알려진 레바미피드 (50 μM)를 사용하였으며, 시험약물로서 레바프라잔(25 μM)을 사용하였 다.

사람의 위상피세포 (AGS 세포, KCLB 21739)를 배양 접시(culture dish)에 2 X 10⁶ cells/100 mm²로 시딩(seeding)한 후, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 10 % 소태아혈청(FBS)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, New York, USA)에 배양하였다. 멸균수에 용해시킨 레바프라잔 및 레바미피드를 최종농도가 각각 25 μM 및 50 μM이 되도록 AGS 세포에 첨가하고, 상기 세포를 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 배지를 제거하고, 상기 세포를 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 및 2 mM KH₂PO₄)로 2회 세척하였다. 헬리코박터 파이로리(H. pylori, ATCC 43504) 균액을 PBS 에 재현탁시켜, 최종농도가 5 × 10⁸ CFU/ml가 되도록 AGS 세포에 접종하여 37 ℃에서 1 시간 공배양(coculture)하였다. EMSA를 위한 핵 분획(nuclear fraction)을 NE-PER Nuclear와 Cytoplasmic Extraction Kit (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 준비하였다. EMSA를 위해 사용된 NF-kB의 2중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'이고, 상기 올리고뉴클레오티드는 Biotin 3' End DNA Labeling Kit (Pierce, Rockford, IL, U.S.A.)로 표지하였다. EMSA는 Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce, Rockford, IL, U.S.A.)를 사용하여 수행하였다.

EMSA를 이용하여 NF-kB의 DNA 결합 활성을 측정한 결과는 도 5와 같다. 이러한 결과는 레바프라잔 전처리에 의해 NF-kB의 활성이 유의성 있게 억제됨으로써, 레바미피드에 비하여 동등 이상의 점막 보호 효과를 달성하는 것을 나타낸다.

실시예 6. 세포 보호 작용( cytoprotection )에 관여하는 단백질의 발현량 측정 ( RT - PCR )

레바프라잔의 점막 보호 효과를 측정하기 위하여, NSAIDs에 속하는 설린닥(sulindac) 100 μM을 랫드 세포에 처리한 후, 프로-안지오제닉 성장 인자(pro-angiogenic growth factors)인 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), 인터루킨-8(interleukin-8), 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현량을 측정하였다. 대조약물로서 점막 보호능을 갖는 것으로 알려진 레바미피드 (50 μM)를 사용하였으며, 시험약물로서 레바프라잔(25 μM)을 사용하였다.

랫드의 위점막 세포 (RGM-1, RIKEN cell bank, Japan)를 배양접시(culture dish)에 2 X 10⁶ cells/100 mm²로 시딩(seeding)한 후, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 10 % 소태아혈청(FBS)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, New York, U.S.A.)에 배양하였다. 멸균수에 용해시킨 레바프라잔 및 레바미피드를 최종농도가 각각 25 μM 및 50 μM이 되도록 RGM-1 세포에 첨가하고, 상기 세포를 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 배지를 제거하고, 상기 세포를 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 및 2 mM KH₂PO₄)로 3회 세척하였다. 설린닥을 DMSO에 용해시켜 최종농도가 100 uM이 되도록 상기 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 8시간 배양하였다. 배양된 세포를 23 ℃에서 3000rpm으로 3분간 원심분리하여 회수한 다음, TRIzol(Life technologies, Milan, Italy)을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA 2ug과 10 pmol/λ oligo dT 1 ul에 멸균한 RNase-free water를 넣어 총 34 ul 반응 용액을 얻었다. 반응 용액을 65 ℃에서 5분간 배양한 후, 5 X 역전사 완충액 10 ul, 10 mM dNTPs 5 ul, 및 M-MLV 역전사효소(reverse transcriptase) 1 ul를 첨가하였다. 반응 용액을 37 ℃에서 1시간 배양하여 cDNA를 합성하였고 (Promega, Madison, WI), 상기 cDNA를 PCR로 증폭하였다. PCR은 Premix Ex Taq kit (Takara, Chiba, Japan)을 사용하여 수행하였고, 사용한 특정 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다. VEGF, 5'-TGCACCCACGACAGAAGGGGA-3'과 5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3'; IL-8, 5'-GAAGATAGATTGCCCGA-3'과 5'-CATAGCCTCTCACACATTTC-3'; COX-2, 5'-ATCTGTGTGGGTACAAATTTG-3'과 5'-GTCTCTCATCTGCAATAATGTG-3'; GAPDH, 5'-TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGTC-3'과 5'-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3'. 상기한 바와 같이, GAPDH는 양성 대조군으로서 사용하였다. PCR 반응은 94 ℃에서 1분간, 60℃ (VEGF), 45℃ (IL-8), 48 ℃ (COX-2), 55℃ (GAPDH)에서 각각 1분간, 그리고 72℃에서 1분간 총 35 사이클 (VEGF, IL-8, 및 COX-2) 또는 28 사이클(GAPDE)을 수행하였다. PCR 산물은 1% 아가로즈 겔 상에서 분리(resolve)한 후, 10 mg/ml의 에티디움 브로마이드로 염색하였다.

레바미피드-설린닥 처리군 및 레바프라잔-설린닥 처리군에 있어서, IL-8, VEGF, 및 COX-2의 발현량은 도 6과 같다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 레바프라잔-설린닥 처리군에서 IL-8, VEGF, 및 COX-2의 발현량이 레바미피드-설린닥 처리군에 비하여 두드러지게 더 높았다. NSAID-유도 위점막 손상의 기전 중의 하나가 위점막 재생 및 허혈의 원인이 되는 VEGF, IL-8, 및 COX-2의 감소와 연관되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 레바프라잔-설린닥 처리군에서의 IL-8, VEGF, 및 COX-2의 발현량 증가를 나타내는 도 6의 결과는 레바프라잔이 우수한 위장관 점막의 세포 보호 효과(cytoprotective effect)를 갖는 것을 나타낸다.

실시예 7. 열충격단백질의 활성 측정 ( 웨스턴 블롯 )

열충격단백질(heat shock protein)인 HO-1, HSP27, 및 HSP70의 발현을 측정하기 위하여, 레바프라잔을 5, 10, 및 25 μM의 농도로 세포에 전처리하고, NSAID중의 하나인 인도메타신(0.5 μM)을 처리였다.

랫드의 위점막 세포 (RGM-1, RIKEN cell bank, Japan)를 배양접시(culture dish)에 2 X 10⁶ cells/100 mm²로 시딩(seeding)한 후, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 10 % 소태아혈청(FBS)이 첨가된 DMEM-F12 (Gibco BRL, Grand Island, New York, U.S.A.)에 배양하였다. RGM-1 세포를 레바프라잔( 5, 10, 및 25 uM)으로 전처리하고 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 배지를 제거하고, PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 및 2 mM KH₂PO₄)로 3회 세척하였다. 멸균수에 용해시킨 인도메타신을 최종농도가 0.5 uM이 되도록 상기 세포에 첨가하고, 세포를 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 배양 후, 세포를 용해 완충액(Lysis buffer) (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA, 및 protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Germany))에 재현탁시켰다. 상기 현탁액을 BIORUPTOR (Cosmo Bio, Koto-ku, Tokyo)를 사용하여 초음파 파쇄(약 10 초, 4회)하고, 4 ℃에서 12000rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상등액을 단백질 추출물로 사용하였으며, 10% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동 한 후, semidry transfer system (Hoeffer Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, USA)을 사용하여 PVDF막 (Millipore, Massachusetts, USA)으로 전이(transfer) 시켰다. 일차 항체와 단백질 사이의 비특이적 결합을 차단하기 위하여, PVDF막을 5% skim milk (Difco, Livonia MI, USA)를 함유하는 블록킹 완충액(blocking buffer) (TBST: 10　mM Tris-Cl, pH 8.0, 150　mM NaCl, 및 0.1% Tween 20 (v/v))으로 23 ℃에서 1시간 블록킹(blocking)하였다. 상기 PVDF막을 HO-1, HSP27, HSP70, 또는 a-튜블린 (TU-02)에 대한 일차 항체의 1:1000 희석액(200 ng/ml)과 함께 4 ℃에서 15시간 배양하였다. 상기 PVDF막은 HRP (horseradish peroxidase)-포합된(conjugated) 이차 항체 (Santa Cruz Biotech, California, U.S.A.)의 1:2000 희석액(100 ng/ml)과 함께 23 ℃에서 1시간 배양하였다. 면역복합체(immunocomplex)를 ECL (enhanced chemiluminescence) detection kit (Amersham-Pharmacia Biotec)를 사용하여 확인하였다 (도 7 참조).

도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 레바프라잔은 열충격단백질의 발현을 자극함으로써 세포 보호 효과를 나타낸다.

실시예 8. NSAID -유도성 위병변(NSAID-induced gastropathy)에 대한 레바프라잔의 예방 효과의 평가

6 주령의 SPF(specific-pathogen-free) 스프라그-도울리 계 웅성 랫 드(Charles River, Tokyo, Japan)를 시험에 사용하였다. 상업적으로 시판되는 멸균된 펠렛 사료(Biogenomics Co., Seoul, Korea)와 멸균된 물을 자유롭게 먹이고, 12시간씩 낮과 밤을 조절하며 청정실(air-conditioned biohazard room)에서 사육하였다. 랫드를 24시간 절식시키고, 인도메타신(40mg/kg, 12 시간)에 노출시키기 전에, 오로-가스트릭 튜브(oro-gastric tube)를 통하여 0.5% CMC (카르복시메틸셀룰로오스)에 현탁시킨 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 레바프라잔, 30 mg/kg의 레바미피드, 및 5 mg/kg의 오메프라졸을 투여하였다. 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline)를 랫드의 위강내에 주입하여 위를 팽창시켰다. 큰 굽이(greater curvature)를 따라 절개하여, 위(stomachs)를 열고, 위병변의 총 면적을 계산하여 병변의 평균 크기를 얻었다.

대조군 및 시험군의 위점막 병변에 대한 예방 효과를 비교한 결과는 도 8과 같다. 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군, 오메프라졸 전처리군, 및 레바미피드 전처리군에서는 출혈성 병변이 관찰되는 반면, 레바프라잔 전처리군에서는 출혈성 병변이 거의 관찰 되지 않았다. 이러한 결과는 레바프라잔이 위점막 병변에 대하여 우수한 예방효과를 가지는 것을 나타낸다.

실시예 9. NSAID -유도성 위병변(NSAID-induced gastropathy)에 대한 레바프라잔의 치료 효과의 평가

6 주령의 SPF(specific-pathogen-free) 스프라그-도울리 계 웅성 랫드(Charles River, Tokyo, Japan)를 시험에 사용하였다. 상업적으로 시판되는 멸균 된 펠렛 사료(Biogenomics Co., Seoul, Korea)와 멸균된 물을 자유롭게 먹이고, 12시간씩 낮과 밤을 조절하며 청정실(air-conditioned biohazard room)에서 사육하였다. 랫드를 24시간 절식시키고, 인도메타신(40mg/kg, 12 시간)에 노출시키기 전에, 오로-가스트릭 튜브(oro-gastric tube)를 통하여 0.5% CMC (카르복시메틸셀룰로오스)에 용해시킨 인도메타신 1 ml(40 mg/kg)을 랫드에 처리하였다. 인도메타신 처리 8시간 후, 0.5 % CMC에 용해시킨 레바프라잔 1 ml(5mg/kg 및 10 mg/kg)로 각각 1시간 동안 랫드를 처리하고, 실시예 8과 동일한 방법으로 위병변 정도를 측정하였다.

인도메타신 단독 처리군과 인도메타신-레바프라잔 처리군에서의 위점막 병변에 대한 치료효과를 비교한 결과는 도 9와 같다. 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인도메타신-레바프라잔 투여군에서는 위점막 출혈성 병변이 현저히 개선되었으며, 미란 및 궤양의 수도 감소하였다. 이러한 결과는 레바프라잔이 위점막 병변에 대하여 우수한 치료효과를 가지는 것을 나타낸다.

레바프라잔 또는 그의 염은 산 펌프 길항제로서 작용함과 동시에, 위장관 점막의 방어인자를 증강시킴으로써 우수한 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료효과를 가진다.

Claims

치료학적으로 유효한 양의 레바프라잔(revaprazan) 또는 그의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물.
치료학적으로 유효한 양의 레바프라잔(revaprazan) 또는 그의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약물-유도성(drug-induced) 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물.
치료학적으로 유효한 양의 레바프라잔(revaprazan) 또는 그의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 알콜-유도성(alcohol-induced) 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물.
치료학적으로 유효한 양의 레바프라잔(revaprazan) 또는 그의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 비-스테로이드성 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)에 의한 위장관 점막 손상의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레바프라잔의 염이 레바프 라잔 염산염인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레바프라잔 또는 그의 염의 치료학적으로 유효한 양이 100 mg 내지 300 mg per day인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레바프라잔 또는 그의 염의 치료학적으로 유효한 양이 150 mg 내지 250 mg per day인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레바프라잔 또는 그의 염의 치료학적으로 유효한 양이 200 mg per day인 것을 특징으로 하는 조성물.