DK171369B1 - Biologisk ren kultur af en stamme af Lactobacillus acidophilus, fremgangsmåde til isolering af en sådan kultur og terapeutisk præparat indeholdende denne - Google Patents

Description

DK 171369 B1

Opfindelsen angår en terapeutisk virksom bakteriestamme, nemlig en stamme af Lactobacillus acidophilus, en fremgangsmåde til isolering af en sådan stamme samt farmaceutisk præparat indeholdende denne.

5 L. acidophilus er en bestanddel af den normale tarmflora hos de fleste raske mennesker. Slægten Lactobacillus er vidt udbredt i naturen. Mange arter som f.eks. L. bulgari-cus og L. casei findes i mejeriprodukter såvel som i frugter og grøntsager. Andre Lactobacillus arter findes i pat-10 tedyrs og insekters tarm. Igennem mange århundreder er Lactobaciller blevet anvendt i mælke- og mejeriprodukter som forgæringsorganismer til fremstilling af yoghurt og forskellige typer fermenterede og syrnede mælkeprodukter, surmælksprodukter og flødetyper. Den art Lactobacillus, 15 der anvendes inden for mejeriindustrien, er sædvanligvis L. bulgaricus, skønt L. acidophilus stammer ret ofte også er blevet anvendt.

I de senere år er en række undersøgelser blevet udført under anvendelse af L. acidophilus stammer isoleret på North 20 Carolina State University ("NCSU"). Disse undersøgelser har vist, at NCSU stammerne, når de indtages af mennesker eller dyr, har gavnlig virkning på forskellige funktioner i mave-tarmkanalen, herunder undertrykkelse af aktivering af kemiske carcinogener i tyktarmen, en reduktion af fækal 25 udskillelse af cholesterol (der står i forbindelse med en reduceret risiko for tyktarmscancer) og en reduktion af gastrointestinale bivirkninger ved antibiotisk terapi.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt L. acidophilus stamme, der udviser en række egen-30 skaber, der gør den nyttig for mennesker og specielt gør den værdifulde ved behandlingen af bivirkninger ved antibiotisk terapi, ulcerativ colitis og forstoppelse; som bi- DK 171369 B1 2 bringer resistens mod kolonisering af patogene mikroorganismer og gær i mavetarmkanalen; som reducerer choleste-roludskillelsen med fæces, og som reducerer østrogenudskillelse med fæces.

5 L. acidophilus stammen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne. Lactobacil-lusstammen ifølge opfindelsen er i overensstemmelse med Budapesttraktatens bestemmelser deponeret i American Type Culture Collection under nummeret 53103.

10 Den omhandlede stamme adskiller sig overraskende væsentligt fra andre hidtil kendte Lactobacillus arter. Undersøgelser af forgæringen af forskellige sukkerarter med mikroorganismen ifølge opfindelsen (tabel 1 nedenfor) indicerer, at denne Lactobacillus stamme er en atypisk stamme 15 af Lactobacillus casei subspecies rhamnosus. Den er atypisk, fordi den ikke forgærer lactose, og fordi den kun langsomt (efter 5 dages inkubation) forgærer rhamnose, maltose, saccharose og inositol. Typiske L. casei subspecies rhamnosus forgærer disse sukkerarter (Collins. M.D.

20 Phillips B.A og Zanomi P (1989) Int. J. Syst. Bact. 39(2) 105-108).

DK 171369 B1 3

Tabel 1. Forgæring af kulhydrater af Lactobacillus GG [ATCC

53103] (APT 50 CHI, Bio Mérieux, France)_

Kulhydrat_Forgæring_Kulhydrat_Forgæring_ D-Arabinose +++ Glycerol

Ribose + Erythritol

Galactose +++ L-Arabinose D-Glucose +++ D-Xylose D-Fructose +++ L-Xylose D-Mannose +++ Adonitrol

Rhamnose + p-Methyl-xylosid

Dulcitol +++ L-Sorbose

Inositol + ot-Methyl-D-

Mannitol +++ mannosid

Sorbitol +++ a-Methyl-D- N-Acetyl glycosid

Glucosamin +++ Lactose

Amygdalin ++ Melibiose

Arbutin ++ Inulin

Esculine +++ D-Raffinose

Salicine +++ Amidon

Cellobiose +++ Glycogen

Maltose + Xylitol

Saccharose + D-Turanose

Trehalose +++ D-Lyxose

Melezitose ++ D-Fucose β-Gentiobiose ++ D-Arabitol

Tagatose +++ L-Arabitol L-Fucose +++ 2-Ceto-gluconat

Gluconat_+++_5-Ceto-gluconat_- _ +++ Forgæring i løbet af 1 dag ++ Forgæring i løbet af 2 dage + Forgæring i løbet af 5 dage DK 171369 B1 4

Yderligere undersøgelser af mikroorganismestammen ifølge opfindelsen under anvendelse af direkte sekvensering af et enzymatisk forstærket 1,5 kb segment af 16S rRNA genet har bekræftet, at stammen er forskellig fra hidtil kendte 5 stammer (i trykken: Chassy B. Clinical Infektions Diseases (ca. marts 1996).

Opfindelsen tilvejebringer også en fremgangsmåde til isolering af den omhandlede stamme fra en prøve indeholdende en hel række forskellige bakteriestammer, hvilken frem-10 gangsmåde er ejendommelig ved det i krav 3's kendetegnende del angivne.

Derudover angår opfindelsen terapeutiske præparater til behandling af gastrointestinale bivirkninger ved antibiotikaterapi, ulcerativ collitis og forstoppelse, hvilke 15 præparater er ejendommelige ved det i henholdsvis krav 4, 5 og 6 angivne.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende.

Raske mennesker bærer bakterier af arten L. acidophilus som en del af deres normale flora, sædvanligvis i koncen-20 trationer på ca. 109 lactobaciller pr. gram tarmindhold; således har et rask menneske over 1011 lactobaciller i sin tarmkanal. Det første trin ved fremgangsmåden er at undersøge prøver af fæces fra mennesker og udvælge de, hvori der er høje koncentrationer af lactobaciller. 1

Herefter undersøges disse prøver under anvendelse af en metode, der er udformet til at isolere stammer, der udviser de egenskaber, der er omtalt tidligere, og som kort kan opsummeres således: DK 171369 B1 5 (1) Stabilitet over for syre (2) Stabilitet over for galde (en egenskab der forud er identificeret som ønskelig af Department of Food Science, North Carolina State University) 5 (3) Evnen til at klæbe kraftigt til slimhindeceller fra menneskets tarmkanal (4) Mælkesyreproduktion (5) Kraftig in vitro vækst

Undersøgelse af stabiliteten over for galde og af stabili-10 tet over for et forholdsvist surt miljø udføres på følgende måde. LBS agar (beskrevet i J. Bacteriol. (1951) 62.

132) fremstilles, idet agaren har følgende sammensætning pr. liter:

Tripticase og pepton 10,0 g Gærekstrakt 5,0 g

Ammoniumcitrat 2,0 g

Monokaliumphosphat 6,0 g

Dextrose 20,0 g

Polysorbat PO4 1,0 g

Natriumacetathydrat 25,0 g

Magnesiumsulfat 0,575 g

Mangansulfat 0,12 g

Ferrosulfat 0,034 g

Agar 15,0 g 15 Til 84 g pulver af ovennævnte sammensætning, dehydratise-ret, sættes 300 ml tomatsaft og 800 ml destilleret vand og, efter blanding, 1,32 ml eddikesyre. 1,5 g oksegalde tilsættes herefter, og pH indstilles til 5,5 under anvendelse af IN HC1. Plader lagres i et anaerobt rum 1-3 dage inden DK 171369 B1 6 anvendelsen og anvendes herefter uden autoklavering. Prøver af fæces fra raske individer homogeniseres i vand under anaerobe betingelser og inkuberes som rækkefortyndinger på plader i 48 timer i et anaerobt kammer. De bakteri-5 er, der formerer sig på pladerne, udvælges og undersøges yderligere. Dette trin eliminerer mange af mikroorganismerne i prøven.

Undersøgelse af stabilitet over for mere sure betingelser udføres under anvendelse af MRS bouillon (Difco; beskrevet 10 i J. Applied Bacteriol. (1960) 22, 130) med følgende sammensætning:

Bacto-Protease Pepton nr. 3 10,0 g

Bacto-Kødekstrakt 10,0 g

Bacto-Gærekstrakt 5,0 g

Dextrose 20,0 g

Tween® 80 1,0 g

Ammoniumcitrat 2,0 g

Natriumacetat 5,0 g

Magnesiumsulfat 0,1 g

Mangansulfat 0,05 g

Dinatriumphosphat 2,0 g 55 g pulver af ovenstående sammensætning, dehydratiseret, blandes med 1000 ml destilleret vand og steriliseres ved 15 autoklavering i 15 minutter ved 15 lb. Bouillonen har en slut pH-værdi på 6,5 ved 25 °C. Derefter justeres pH under anvendelse af 1,0 N HC1 og eventuelt 1,0 N NaOH, og bouillonen sterilfiltreres. Bakterierne inkuberes i bouillonen i 48 timer i et anaerobt kammer. Udvalgte bakterier kan 20 formere sig fortrinsvis ved pH under 3,5, foretrukkent ved pH 3,0.

DK 171369 B1 7

Det næste trin er isoleringen, fra de bakterier der er i stand til at formere sig i syre og galde, af arten L. a-cidophilus. Denne behandling udføres under anvendelse af standard mikrobiologiske metoder.

5 Det næste trin er at afprøve syre- og galdestabile L. a-cidophilus bakterier for deres evne til at adhærere til gastrointestinale celler. Humane gastrointestinale celler isoleres først på almindelig måde. En metode indebærer opsamling af affaldsstoffer fra en patient med en godt fun-10 gerende ileostomi ved saltvandsudskylning.

Saltvandsskylningen opsamles i kold 1/10 rumfangspuffer I (0,1% gelatine, 1% glucose, 500 mM natriumphosphat, pH 7,4). Denne opløsning filtreres gennem nr. 25 silkedug for at fjerne klumper og småstykker og tyndtarms (ileal)slim-15 hindeceller opsamles ved centrifugering ved 100 x g i 10 minutter. Herefter vaskes cellerne i puffer II (0,45% NaCl, 0,1% glucose, 0,01% gelatine, 50 mM natriumphosphat, pH 7,4), idet der centrifugeres under samme betingelser som ovenfor. Til slut genopslæmmes cellerne i puffer II, 20 1/3 rumfang vævsdyrkningssubstrat NCTC 135 tilsættes, og cellerne lagres ved 4 °C, indtil de skal bruges. Antallet af tarmceller og levedygtigheden bestemmes ved hjælp af trypanblå farvning. De humane tyndtarmceller kan fryses i flydende nitrogen efter tilsætning af 10 rumfang/rumfang-% 25 glycerol.

Bakterierne dyrkes i 18 timer ved 37 °C i MRS bouillon til-sat 6 pCi H-alanin og H-leucin. Herefter vaskes bakterierne i 5 rumfang phosphatpufret saltopløsning, genopslæmmes i puffer II og filtreres gennem 2,0 μ polycarbonatfil-30 tre for at fjerne klumper. Herefter blandes bakterierne med de humane tyndtarmsceller, inkuberes ved 37 °C, og prøver udtages 5 minutter senere. Prøverne anbringes på 2,0 μ DK 171369 B1 8 polycarbonatfiltre, og overskud af væske fjernes ved forsigtig afsugning. Herefter renses filtrene, først med 2 ml og derefter med 5 ml phosphatpufret saltvand (pH 7,4). Ved at anvende disse filtre tilbageholdes tyndtarmscellerne og 5 de vedhæftede bakterier, men de frie bakterier går igennem filtret. Kontroller omfatter reaktionsblandingen uden de humane tyndtarmsceller. Den tilbageholdte radioaktivitet bestemmes ved væskescintillation. Den bakterielle specifikke aktivitet bestemmes ud fra de kolonidannende enheder 10 beregnet ud fra den optiske densitet ved 550 nm og den tilbageholdte radioaktivitet på 0,2 μ filtre. Den bakterielle specifikke aktivitet anvendes til beregning af antal bundne bakterier.

De bakterier, der binder ved ovennævnte metode, i en stør-15 relse på mindst 50, og fortrinsvis 100 bakterier pr. gastrointestinal celle (repræsenterende omtrent 10% af de bakterier, der er bragt i kontakt med cellerne) er de ønskede bakterier.

Mælkesyreproduktion måles ved at inkubere bakterierne i 20 MRS bouillon eller Scott Pepton-Gærbouillon under anaerobe betingelser og måle mælkesyre 8 eller 24 timer senere under anvendelse af gas-væskekromatografi. Udvalgte bakterier frembringer mindst 3,5 meq og fortrinsvis over 4 meq mælkesyre pr. 1010 CFU ved 37 °C over en 24 timers periode. 1 2 3 4 5 6

Det sidste undersøgelsestrin er selektionen af bakterier, 2 der udviser kraftig vækst in vitro udtrykt ved generati 3 onstiden. 5 x 10^ CFU af bakterier anvendes til at inoku- 4 lere næringssubstratet, f.eks. MRS bouillon, og CFU måles 5 efter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 timer ved at udstryge 0,1 6 ml fortyndede prøver på LBS agar og inkubere pladerne 48 timer ved 37 °C under anaerobe betingelser. Bakterier ud- DK 171369 B1 9 vælges, der har en generationstid ved 37 °C på mindre end 1 time, fortrinsvis på ca. 45 minutter.

Hver af de ovennævnte undersøgelsesmetoder er udformet til at isolere L. acidophilus stammer, der er i besiddelse af 5 de egenskaber, der gør dem i stand til at udøve helbredende virkning på mennesker.

Syre- og galdestabilitet er vigtig, fordi bakterierne spises og skal gå gennem surt miljø i maven såvel som den galdeholdige tyndtarm, og de må være i stand til at over-10 leve og formere sig under disse betingelser, dersom bakterierne skal udøve helbredende virkning på den person, der indtager dem.

Adhærering er af vigtighed, fordi denne egenskab muliggør, at L. acidophilus bakterier kan kolonisere og blive etab-15 leret i mavetarmkanalen.

Mælkesyreproduktion er vigtig, fordi det antages, at mælkesyre produceret af bakterierne delvist er ansvarlig for de fordelagtige virkninger ved koloniseringen i tarmkanalen med de omhandlede stammer. Mælkesyre er en antimikro-20 biel forbindelse, og frembringelsen heraf af den omhandlede stamme kan hjælpe dem til at danne en beskyttende barriere mod patogener i tarmkanalen. Mælkesyre hjælper måske også til at inaktivere carcinogener i tarmkanalen.

Kraftig in vitro vækst er en vigtig egenskab, fordi den 25 omhandlede stammer skal være i stand til at reproduceres i stor målestok; kraftig vækst er også en indikator for, at bakterierne sandsynligvis vil gro ligeså godt in vivo.

Den omhandlede stamme (betegnet GG) havde følgende egenskaber: DK 171369 B1 10

Syrestabilitet

Stammen kan vokse ved pH 3,0 indtil en koncentration på 1 x 107 CFU. Ved højere pH-værdier er væksten endog kraftigere, idet der opnås 109 CFU ved pH 5,0.

5 I normal human mavesaft kan GG stammen, idet der startes

Q

med et inokulum på 10 CFU, overleve med mindre end 2 log nedgang af inokulummængden i mindst 30 minutter ved pH

2,5.

Q

Bakterier af GG stammen (10 CFU) inokuleredes ved hjælp 10 af en Levin slange direkte i maven på raske frivillige.

Med maveindhold på pH 1,0-2,0 overlevede mindst 1000 organismer af GG stammen mindst 2 timer.

Galdestabilitet GG stammen kunne vokse i oksegalde i en koncentration på 15 0,15% i LBS agar.

Adhærerina til tarmslimhindeceller

Tabellen nedenfor viser graden af vedhæftning af bakterierne af GG stammen til tyndtarmslimhindeceller.

Behandlingstid Antal bundne bakterier pr. tarmcelle_ 5 minutter 119 10 minutter 235 15 minutter 333 20 Mælkesyreproduktion

Produktionen af mælkesyre blev målt ved hjælp af gas-væskekromatografi efter inkubation af GG stammen i flydende næringsbouillon. Følgende mælkesyrekoncentrationer måltes på de pågældende tider for inkubation.

DK 171369 B1 11

Inkuberingstid Mælkesyreproduktion 8 timer 1,53 meq/108 CFU

24 timer 4,44 meq/1010 CFU

Generationstid GG stammen viste kraftig vækst in vitro. Under anvendelse af et begyndelsesinokulum på 5 x 10^ CFU i MRS bouillon 5 viste stammen en 40-fold stigning i væksten i løbet af 4 timer, idet der nåedes en densitet på 2 x 106 CFU. Under denne 4 timers periode var der 5,2 generationer, hvilket giver en enkelt generationstid på 45 minutter.

Den omhandlede L. acidophilus stamme kan dyrkes i stor må-10 lestok og anvendes terapeutisk i lyofiliseret form eller sammen med farmaceutisk acceptable bærestoffer og kan sættes til fødevarer, specielt mejeriprodukter som mælk og yoghurt, således som man har gjort med andre L. acidophilus stammer i mange år. Bakterier af stammen alene, i fø-15 devarer eller i andre bærevehikler, kan indtages peroralt af mennesker i en effektiv mængde (f.eks. 106-1010 bakterier pr. person pr. dag) for at behandle eller forhindre en hel række sygdomme nævnte ovenfor og nærmere specificeret nedenfor.

20 Dyrkningsbetingelserne er følgende:

En stamopløsning består af steril skummetmælk indeholdende 1010 CFU levende organismer. 1 ml af denne stamopløsning sættes til 2 liter MRS bouillon. Beholderen anbringes i et anaerobt inkubationskammer og dyrkes natten over i 14 ti-25 mer under omrøring ved 37 °C. Bouillonen centrifugeres ved 10.000 x g i 20 minutter, og centrifugebundfaldet genop-slæmmes i 50-100 ml steril skummetmælk og lagres ved -80 °C.

DK 171369 B1 12 9 · 10

Ved én særlig måde for administrering sættes 10 til 10 organismer til mælk, enten i rumfang på 10 til 20 ml eller i store rumfang, f.eks. 250 til 500 ml. Mælken indtages én gang dagligt, således at 109 til 1010 CFU indgives pr. en-5 kelt administrering. Til dyr blandes 0,2 til 1,0 ml af stammælkeopløsningen i deres foder, således at de får 109 til 1010 CFU bakterier dagligt.

Diarré er hovedkomplikationen ved antibiotikabehandling, idet det forekommer hos omtrent 10% af patienterne, der 10 får antibiotika, specielt med ampicillin, amoxacillin, cephalosporiner, clindamycin, erythromycin og tetracycli-ner. Den omhandlede stamme kan anvendes til at behandle antibiotika-induceret diarré på samme måde som andre L. a-cidophilus præparater er blevet anvendt tidligere. Herud-15 over kan stammen anvendes inden eller sammen med antibiotikaterapien som profylaktisk behandling. Sådan profylaktisk administrering bør foregå inden for 24 timer af antibiotikabehandlingen.

Idiopatisk ulcerativ colitis, også betegnet inflammatorisk 20 tyktarmsyge, er et vanskeligt terapeutisk problem. Sygdommen er ret almindelig, og patienterne lider af gentagne anfald af diarré, der kan forekomme ved forskellige lejligheder gennem flere år, hvor sygdommen er aktiv. For øjeblikket er den eneste terapi, der har vist sig at være 25 anvendelig, salicylazosulfapyridin (SAS) og corticosteroi-der. Mange patienter får imidlertid atter anfald på trods af disse behandlinger. Herudover er behandlingerne i sig selv ofte forbundne med tilfælde af bivirkninger.

Adskillige kendsgerninger har antydet, at tarmmikrofloraen 30 spiller en rolle ved denne sygdom, enten som en initiator eller som en determinant for symptomerne.

DK 171369 B1 13

Bakterier af den omhandlede L. acidophilus stamme kan administreres som beskrevet ovenfor til behandling af antibiotikabivirkninger for at behandle eller forhindre ulce-rativ colitis.

5 Langsom tarmfunktion og kronisk forstoppelse er et af hovedproblemerne hos ældre mennesker. Forstoppelse fører til ubehag i maven, kramper og almindeligt dårligt velbefindende. Interessen hos det brede publikum for at fremme god tarmfunktion afspejles i den mængde produkter, der findes 10 tilgængelig til at behandle disse tilstande. Disse produkter varierer fra kraftige laxativer til kortkædede fedtsyrer, forskellige naturlige fiberprodukter som f.eks. pektiner, ligniner, gummier og slimstoffer.

Podede mejeriprodukter, yoghurt og syrnede mælkeprodukter 15 har været anvendt gennem historien til at afhjælpe kronisk forstoppelse.

De omhandlede bakterier af L. acidophilus stammen kan anvendes alene som beskrevet ovenfor eller kan blandes med en sub-terapeutisk dosis af lactulose, et syntetisk disac-20 charid, der har været anvendt til behandling af forstoppelse. Lactulosen vil blive nedbrudt af bakterierne, hvilket forøger deres helbredende virkning uden at frembringe de bivirkninger, der somme tider ses ved terapeutiske doser af lactulose. 1 2 3 4 5 6

Det er i de senere år blevet klart, at kolonisering af 2 tarmkanalen hos mennesker udgør et reservoir for spredning 3 af patogene mikroorganismer, specielt hos værter med im 4 munsygdomme. Tarmmikrofloraen hos raske individer kan mod 5 stå podning med uønskede mikroorganismer ved hjælp af en 6 hel række indre kontrolmekanismer. Selv om disse kontrolmekanismer ikke forstås fuldt ud, er nettoresultatet for- DK 171369 B1 14 holdsvis stabilitet i den humane tarmflora med opretholdelse af samme type og samme koncentration af bakterier gennem lange tidsrum.

Ved antibiotikabehandling kan uønskede mikroorganismer væ-5 re i stand til at kolonisere tarmkanalen. Blandt disse uønskede organismer er Pseudomonas, Enterobacter, Serra-tia, Klebsiella, Citrobacter og Proteus-Providencia. Svampe kan også kolonisere tarmen, specielt gær som f.eks. Candida.

10 Medens raske individer kan modstå tarmkolonisering selv under antibiotikabehandling, er der en alvorlig fare under disse forhold for værter med immunsygdomme. De uønskede mikroorganismer kan invadere slimhinden, hvorved der forekommer septicemia og livstruende sygdom.

15 De kliniske tilfælde, hvor tarmkolonisering med uønskede mikroorganismer spiller en afgørende rolle, omfatter cancer, specielt hos patienter der behandles med kraftig kemoterapi; arvelig eller erhvervet immundefekt syndrom; patienter, der behandles med corticosteroider for en hel 20 række tilstande, og patienter, der har modtaget organ transplantater som nyre, knoglemarv og lever. Der er også ældre, svagelige patienter, der koloniseres og til slut inficeres med disse uønskede mikroorganismer. Blandt spædbørn sker anbringelse på en intensiv afdeling ofte i for-25 bindelse med antibiotikabehandling, dårlig ernæringstil stand og immuntruende tilstande. Denne høje risikogruppe af børn udsættes også for problemerne med kolonisering med potentielt patogene bakterier og gærarter.

Opretholdelse af naturlig resistens mod overgroning af 30 uønskede mikroorganismer er beskrevet i den nyere videnskabelige litteratur med udtrykket "koloniseringsresis- DK 171369 B1 15 tens" (CR). Forskellige tiltag er blevet foretaget for enten at forøge koloniseringsresistensen eller, alternativt, forhindre overgroning med tarmmikroorganismer. Forøgelse af CR opnås ved at anvende antibiotika, der kun frembrin-5 ger minimale virkninger på sammensætningen af den normale tarmflora, specielt ved at opretholde de normale anaerobe komponenter, der synes at være ansvarlige for at være i stand til at modstå overgroning af uønskede mikroorganismer. Den alternative metode er at forhindre kolonisering 10 ved administrering af perorale antibiotika, der i det væsentlige dræber en hvilken som helst ny tilkomst til mikrofloraen. Denne metode frembringer en "steril" mikroflora, idet mindste i korte tidsrum.

Medens hver af disse metoder til at forhindre kolonisering 15 har visse tiltrækkende træk, er de ikke nødvendigvis effektive. Relativt få terapeutiske antibiotika er i stand til at opretholde CR således, at denne metode ofte er uden virkning. Den anden metode, der indebærer administrering af perorale antibiotika, frembringer selv mange bivirknin-20 ger, og er ofte virkningsløs, da højt resistente mikroorganismer kan kolonisere selv i tilstedeværelse af antimi-krobielle lægemidler. Således forbliver problemerne med kolonisering af uønskede mikroorganismer hos patienter med dårligt immunsystem, hvad enten de er voksne eller børn, 25 et hovedproblem inden for den moderne medicin.

Bakterier af den omhandlede L. acidophilus stamme kan administreres til patienter som beskrevet ovenfor til opnåelse af CR på en heldig måde, da bakterierne ikke har nogen i sig selv iboende patogenicitet. Kolonisering af tar-30 men med denne naturlige mikroorganisme vil forhindre andre patogene former i at komme ind i floraen, medens der på samme tid opretholdes et forholdsvis sundt tarmmiljø.

DK 171369 Bl 16

Udskillelse af cholesterol

Betydelig interesse har i de senere år været om den fækale ekskretion af steroler, specielt cholesterol, da der kan være en sammenhæng med coloncancer. Undersøgelser hos for-5 søgsdyr udført for over 10 år siden viste, at kemisk induceret coloncancer kunne øges ved forøget ekskretion af cholesterol i fæces.

Det har været kendt gennem et stykke tid, at cholesterol gennemgår en enterohepatisk cirkulation, hvilket bevirker 10 tarmreabsorption af noget af cholesterolen og fækal ekskretion af resten. I tyktarmen underkastes cholesterol mikrobiel reduktion til coprostanol og coprostanon. De fleste mennesker udskiller hoveddelen af cholesterol som disse reducerede slutprodukter, men omtrent 20% mennesker ud-15 skiller mest ren cholesterol med kun en ringe mængde af reduktionsprodukterne.

Selv om disse dyreundersøgelser var interessante, var deres relevans ikke af særlig betydning, indtil kliniske forsøg med cholesterolsænkende lægemidler blev offentlig-20 gjort. Disse undersøgelser viste, at cholesterolsænkende lægemidler som at romid var i stand til at reducere serum cholesterolniveauerne og til at reducere hjerteanfald. Samtidig sås imidlertid en forøgelse i tyktarmscancer, fordi sænkningen af serum cholesterol skete på bekostning 25 af en forøgelse i fækal cholesterol. Disse kliniske undersøgelser verificerede de resultater, der sås hos dyr, hvor højere niveauer af fækal cholesterol stod i forbindelse med en forøget risiko for coloncancer.

Bakterier af den omhandlede L. acidophilus stamme kan ad-30 ministreres til patienter som beskrevet ovenfor for at re- DK 171369 B1 17 ducere mængden af udskilt cholesterol i patienternes fæces .

Udskillelse af østrogen

Forbedringer inden for laboratorieundersøgelser til måling 5 af østrogener har udvidet vor forståelse for disse vigtige kønshormoner. Østrogener produceres især i ovarierne og i mindre udstrækning i fedt- og andre væv. Hovedudskillelsen af østrogener er via urinen.

Et vigtigt fremskridt inden for de senere år er forståel-10 sen af den enterohepatiske cirkulation af østrogener. Det har vist sig, at så meget som halvdelen af de cirkulerende østrogener recirkuleres gennem galden ind i tarmkanalen, hvor de atter absorberes af kroppen. Kun 5% af østrogenerne udskilles i fæces.

15 For at blive udskilt i galden bindes østrogenerne sædvanligvis som et glucoronid eller sulfonat. Disse konjugerede østrogener går gennem galden ind i tarmen, hvor de atter adskilles ved hjælp af tarmbakterierne og herefter atter absorberes. 1 2 3 4 5 6

Betydningen af den enterohepatiske cirkulation blev vist i 2 undersøgelser af Adlercreutz et al., hvor fækale og urinæ 3 re østrogener blev undersøgt hos kvinder, der blev behand 4 let med ampicillin for mindre infektioner. Dette orale 5 antibiotikum forårsagede en 30% reduktion i udskillelsen 6 af urinære østrogener med en samtidig stigning i fækal østrogenudskillelse. Forklaringen er, at antibiotikumet undertrykker bakterierne i tarmen, der er ansvarlige for at frigøre østrogenerne. Dette fører til nedsat tarmreab-sorption og forøget fækal udskillelse af østrogener.

DK 171369 B1 18

Mange undersøgelser har vist, at højere østrogenniveauer i urin og plasma er korreleret med forøget risiko for brystcancer. Dette synes at passe med observationen, at kvinder, der lever vegetarisk, der har lave niveauer af urin-5 og plasmaøstrogener, mindre hyppigt har brystcancer.

Bakterier af den omhandlede L. acidophilus stamme kan administreres som beskrevet ovenfor til menstruerende kvinder for at sænke mængden af udskilt østrogen; de samme spaltende enzymer, der er involveret i østrogenreabsorpti-10 onen, påvirkes af indtagelsen af L. acidophilus.

Claims (6)

1. Biologisk ren kultur af en bakteriestamme af arten Lac-5 tobacillus acidophilus, kendetegnet ved, at stammen har deponeringsnummeret ATCC 53103, og at et gennemsnit på mindst 50 af bakterierne kan adhærere til en human tyndtarmsmucosacelle efter 5 minutters inkubation af bakterierne med cellen, 10 at bakterierne frembringer mindst 3,5 meq mælkesyre pr. 1010 kolonidannende enheder (CFU) i næringssubstrat ved 37 °C i løbet af 24 timer, og at bakterierne er i stand til at formere sig i næringssubstrat ved en pH-værdi på 3,0, at bakterierne udviser en 15 generationstid på mindre end en time i næringssubstrat ved 37 °C, og at bakterierne formerer sig i et substrat indeholdende mindst 0,1% galde.

2. Kultur ifølge krav 1, kendetegnet ved, at et gennemsnit på mindst 100 af bakterierne kan adhærere til 20 en human tyndtarmscelle efter 5 minutters inkubation af bakterierne med cellerne.

3. Fremgangsmåde til isolering af en terapeutisk værdifuld stamme af Lactobacillus acidophilus med deponeringsnummeret ATCC 53103 fra en prøve indeholdende en hel række for- 25 skellige bakteriestammer, kendetegnet ved, at man i vilkårlig rækkefølge udfører følgende undersøgelsestrin på prøven a) fra bakterieprøven isolerer arten Lactobacillus a-cidophilus og DK 171369 B1 20 b) inkuberer bakterier fra prøven roed gastrointestinale celler og selekterer bakterier, der (1) er i stand til at hæfte på cellerne i en gennemsnitsmængde på mindst 50 bakterieceller pr. gastrointestinalcelle i løbet af 5 5 minutters inkubering sammen, (2) formerer sig i næ ringssubstrat ved en pH-værdi på 3,0, (3) formerer sig i næringssubstrat indeholdende mindst 0,1% galde, (4) er i stand til at frembringe mindst 3,5 meq mælkesyre pr. 1010 kolonidannende enheder (CFU) i næringssubstrat 10 ved 37 °C i løbet af 24 timer og (5) udviser en genera tionstid på mindre end 1 time ved 37 °C.

4. Præparat til behandling af gastrointestinale bivirkninger ved antibiotikaterapi hos en human patient, kendetegnet ved, at det indeholder en bivirkningsredu- 15 cerende mængde af bakterier af L. acidophilus-stammen ifølge krav 1.

5. Præparat til behandling af ulcerativ colitis hos et menneske, kendetegnet ved, at det indeholder en terapeutisk effektiv mængde bakterier af L. acidophilus- 20 stammen ifølge krav 1.

6. Præparat til behandling af forstoppelse hos en patient, kendetegnet ved, at det indeholder en terapeutisk effektiv mængde af bakterier af L. acidophilus-stammen ifølge krav 1. 1