CN118256375A - 一株用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌及其应用 - Google Patents
一株用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一株用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌及其应用，其用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21(Limosilactobacillus reuteri GF21)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231528。本发明还公开了用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21及其发酵组合物在制备防治高血压和/或糖脂代谢病的药物中的应用。该用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21，可产生血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽、γ‑氨基丁酸、短链脂肪酸等活性成分，能高效抑制α‑葡萄糖苷酶、α‑淀粉酶的活性，改善血糖稳态，降低胆固醇浓度，抑制脂肪积累，改善肠道屏障，对高血压及糖脂代谢病有良好的防治效果；此外，罗伊氏粘液乳杆菌GF21还可以产生有机酸，用于发酵食品的制备。
Description
技术领域
本发明属于益生菌技术领域及医药技术领域，尤其是涉及一株用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌及其应用。
背景技术
高血压是心血管疾病最重要的危险因素之一，也是全球范围内重大公共卫生问题。随着年龄的增长，高血压的患病率和病死率均显著增加。根据国家心血管病中心发布的《2022年中国心血管病健康和疾病报告》，我国高血压患病人数2.45亿。目前，仅管理高血压患者已经很难有效降低人群心脑血管事件发生率和死亡率。高血压前期概念是由美国高血压预防、检测、评价和治疗全国联合会在2013年提出，是指收缩压120～139mmHg和/或舒张压80～90mmHg，高血压前期防治对降低高血患病率具有十分重要的意义。代谢紊乱如肥胖、糖尿病及代谢综合征等是我国高血压发病的主要驱动因素，并通过引起代谢性炎症损害肾脏及血管导致血压升高。有关研究发现，超重或肥胖者高血压发病风险高于体重指数正常者；糖尿病或糖耐量异常者高血压发病风险是正常人的2倍；无论是否合并糖尿病或肥胖，高血压均可导致胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇等升高及高密度脂蛋白胆固醇下降，是中老年人易患脂代谢异常的危险因素之一。
目前，用于高血压的药物类型有血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、β受体阻滞剂(BBs)和钙通道阻滞剂(CCBs)等药物，其中ACEI药物具有预防糖尿病的作用，而BBs药物与糖尿病发病风险增加显著相关，而CCBs类的药物会使部分患者低密度脂蛋白胆固醇水平升高。
CN112126604B公开了一株可降低高血压发生风险因子的植物乳杆菌及其应用，该植物乳杆菌通过降低细胞内过氧化氢、提高，细胞内SOD酶、CAT活力来制备预防和/或治疗高血压的产品(如食品或药品等)。CN110384719A公开一种乳杆菌组合物，包含一罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263，其中该罗伊氏乳杆菌GMNL-263为热灭杀死菌，透过抑制促发炎细胞激素IL-1β与提升双歧杆菌属的生长，而具有降血压的功效。
近年来，发现人体肠道菌群与高血压和糖脂代谢相关疾病的发生与发展息息相关，提出肠道菌群是高血压与糖脂代谢干预的新靶点。因此，筛选出能够产生食源性抑制血管紧张素转化酶抑制物质及特定的益生菌及代谢产物对血压和糖脂代谢进行靶向调控的菌株，对预防或治疗高血压及糖脂代谢病具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一株可高效抑制血管紧张素转化酶活性、改善人体肠道屏障的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21，以及罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物的新应用，具体为在用于制备预防或治疗高血压、糖脂代谢病药物中的应用，尤其是利用罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株及其代谢产物，包括但不限于血管紧张素转化酶抑制肽、γ-氨基丁酸及色氨酸代谢产物，进而实现调节血压及糖脂代谢。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一株用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌，所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21(Limosilactobacillus reuteri GF21)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231528。
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21分离自云南大理白族自治州乳扇，将分离纯化的菌株进行16S rRNA鉴定，该菌株的16S rRNA鉴定序列如SEQ ID NO:1所示；将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对，与Genebank中的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)相似度大于99％，可鉴定该菌株为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，基于16S rRNA基因序列比对结果以Pediococcusdamnosus DSMZ20331(AJ318414)为外枝构建的Neighbor-Joining***发育树，命名为用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21(Limosilactobacillus reuteri GF21)。
本发明用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基上培养形成的菌落呈近圆形，菌落大小中等，乳白色，向上凸起，较湿润。革兰氏染色后呈阳性，杆状，其适宜的生长温度为25～38℃，生长pH为3.0-7.0。
优选，所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21通过发酵产生血管紧张素转化酶抑制肽、γ-氨基丁酸、短链脂肪酸及色氨酸代谢产物，进而调节血压及糖脂代谢。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种发酵组合物，通过使用上述的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵生产制得。
所述发酵组合物包括用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌、用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21灭活菌体、代谢产物和用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元中的一种或多种；所述发酵组合物为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基、或添加10～20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的MRS培养基、或添加10～20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳中发酵生产制得。
优选，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF21的代谢产物为用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基中37℃发酵培养24h后，以1％的接种量转接入新鲜MRS培养基中，同条件下培养12h，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬，再以1％的接种量接入MRS培养基、或添加10～20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的MRS培养基、或优选添加10～20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳中，37℃培养24h，低温离心(10000r/min，10min,4℃)收集发酵乳上清液，上清液经高温灭活(121℃、15min)、浓缩、喷雾干燥制备而成，该代谢产物含有血管紧张素转化酶抑制肽、γ-氨基丁酸以及色氨酸代谢产物等活性成分。添加谷氨酸或谷氨酸钠能促进罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵过程中γ-氨基丁酸合成，而灭菌新鲜牛乳在罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵过程产生的活性酶作用下能产生大量抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性的多肽，进而进一步提高发酵组合物调节血压、糖脂代谢的功效。
优选，所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元为用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基、或添加10～20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的MRS培养基、或优选添加10～20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳中发酵培养结束后，通过细胞裂解、灭活、浓缩、喷雾干燥含有用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21灭活菌体及其代谢产物的固体粉末，包括死细胞、菌体裂解物和/或发酵液。
本发明进一步解决其技术问题所采用的另一技术方案是：
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在制备血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在生产γ-氨基丁酸和/或色氨酸代谢产物中的应用。在某一示范实施例中，色氨酸代谢产物为吲哚-3-丙酸。
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21和/或上述发酵组合物在制备用于预防和/或治疗高血压、糖脂代谢病的药物中的应用。
在此应用中，所述组合物中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌的用量为1×109～5×1010CFU/day，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21灭活菌体的用量为1～5×1010个/day，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21代谢产物为100～1000mg/day，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元为5.0×109～1×1011个/day。
本发明提供了一种用于防治(即预防和/或治疗)高血压和/或糖脂代谢病的药物，所述药物包含上述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21和/或上述发酵组合物。
所述药物通过如下至少一种功能实现对高血压、糖脂代谢病的防治作用：
a)高效抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和血管紧张素转化酶的活性；
b)显著抑制高脂饮食小鼠的体重增加；
c)显著改善高脂饮食小鼠的血糖稳态；
d)显著抑制高脂饮食小鼠的肝脏脂肪堆积，减小肝细胞出现坏死和脂质空泡化；
e)显著降低皮下脂肪、附睾脂肪、白色脂肪、棕色脂肪的积累；
f)降低血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇浓度，提高血清中吲哚-3-丙酸浓度；
g)可以显著降低高血压前期患者的收缩压和舒张压。
所述药物包括上述组合物和药学上可接受的载体和/或药用辅料。
在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或润滑剂中的一种或多种。
优选，所述药物为口服药物。
在一种实施方式中，所述填充剂为海藻糖、壳聚糖、淀粉或糊精中的一种或多种；所述粘合剂为液状葡萄糖、淀粉糊或糖浆的一种或多种；所述润湿剂为甘油或乙醇中的一种或多种；所述崩解剂为交联聚维酮、羧甲基淀粉钠或交联羧甲基淀粉钠的一种或多种；所述润滑剂为二氧化硅硬脂酸镁或硬脂酸富马酸钠的一种或多种。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21和/或上述发酵组合物在制备用于改善肥胖与糖脂代谢的生物制剂或功能性食品或药物中的应用。
其中，所述功能性食品为酵素、固体饮料、丸剂、片剂或微胶囊晶球中的任意一种。
所述改善肥胖与糖脂代谢通过至少以下一种途径实现：
a)抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，显著改善高脂饮食小鼠的血糖稳态
b)降低血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇浓度；
c)显著抑制高脂饮食小鼠的体重增加；
d)显著抑制高脂饮食小鼠的肝脏脂肪堆积，减小肝细胞出现坏死和脂质空泡化；
e)显著降低皮下脂肪、附睾脂肪、白色脂肪、棕色脂肪的积累；
f)提高血清中的吲哚-3-丙酸(IPA)的浓度。
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21作为发酵剂在泡菜、酸菜等发酵食品中的应用。
本发明用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌的有益效果：
本发明用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21，一方面通过可产生血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽、短链脂肪酸和γ-氨基丁酸，高效抑制体内血管紧张素转化酶的活性，可显著降低高血压前期患者的收缩压和舒张压；另一方面，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21可高效抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性，改善血糖稳态，减少肝细胞出现坏死和脂质空泡化，抑制高脂饮食小鼠的体重增加及体内脂肪积累，降低血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇浓度；此外，罗伊氏粘液乳杆菌GF21通过提高血清中吲哚-3-丙酸浓度进而改善肠道屏障(包括但不限于降低肠道通透性、结肠组织病变和体重)、调节血压。基于罗伊氏粘液乳杆菌GF21的上述优点，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在制备预防和/或治疗高血压、糖脂代谢病的药物中，具有巨大的应用前景。
GF21发酵24h后产酸含量高达1.74g/100ml，具备产酸快，产酸持久的优势，是很好的发酵剂。
动物试验表明，本发明的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21及其后生元具有良好的安全性，且具有良好的胃肠液耐受性和胆盐耐受性，可口服并在体内使用。
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21可抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，干预后小鼠体重增加量，皮下脂肪重量、附睾脂肪重量较HFD组显著降低，同时白色脂肪、棕色脂肪脂肪细胞面积均有显著性的降低，同时显著降低了小鼠血清中总胆固醇，减少低密度脂蛋白胆固醇的积累，显著提升了血清中IPA浓度，因此，罗伊氏粘液乳杆菌GF21可显著改善肥胖与糖脂代谢，为改善肥胖和糖脂代谢的管理提供了新的生物制剂。
生物材料保藏
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21(Limosilactobacillusreuteri GF21)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20231528，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号。
附图说明
图1—为本发明用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的菌落图；
图2—为本发明用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21显微镜下形态图；
图3—为本发明用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21***发育树；
图4—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的体重及采食量变化图；
其中：A-体重增加量对比分析图；B-采食量对比分析图；C-体重变化曲线图；
图5—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的葡萄糖耐量测试分析图；
其中：A-葡萄糖含量变化曲线图；B-葡萄糖糖耐量对比分析图；
图6—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的肾脏和肝脏重量；
其中：A-肾脏重量对比分析图；B-肝脏重量对比分析图；
图7—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的肝脏染色组织切片及切片面积对比分析图；
图8—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的皮下脂肪重量分析图；
图9—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的附睾脂肪重量分析图；
图10—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的白色脂肪切片及切片面积对比分析图；
图11—为本发明不同高脂饮食小鼠组别的棕色脂肪切片及切片面积对比分析图；
图12—为本发明不同高脂饮食小鼠组别血清中脂质分析；
其中：A-血清中LDL-C含量对比分析图；B-血清中TC含量对比分析图；
图13—为本发明GF21对血清中色氨酸代谢物浓度分析图；
其中：图4～13中ns代表无统计学意义；*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001；****代表P<0.0001。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
以下为本发明实施例中所涉及的培养基：
MRS培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐温80 1.5，K2HPO4·7H2O 2.0，无水乙酸钠5，柠檬酸二氨2.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O0.038，(加琼脂粉15g/L为固体培养基)。
实施例1
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的筛选及鉴定
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21(Limosilactobacillusreuteri GF21)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20231528。
1)用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株的筛选
样品采集于云南大理白族自治州乳扇，将采集的样品称取1g，放入9mL无菌生理盐水中。充分震荡混匀后，10倍梯度稀释涂布于MRS固体培养基中，37℃培养48h。肉眼观察，挑取培养基中不同形态大小的单菌落，划线纯化4次以上。通过显微镜观察和溶钙法初步确定为乳酸菌，并将纯化的菌株45％甘油保存于-80℃冰箱备用。
2)菌株形态及显微镜观察
罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株菌落形态参见图1，菌落呈近圆形，菌落大小中等，乳白色，向上凸起，较湿润。显微镜形态参见图2，罗伊氏粘液乳杆菌GF21呈杆状，革兰氏染色后呈阳性。
3)菌株分子生物学鉴定
将纯化的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株进行16S rRNA鉴定，该菌株的16S rRNA鉴定序列如SEQ ID NO:1所示。将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对，与Genebank中的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)相似度大于99％，可鉴定该菌株为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，基于16S rRNA基因序列比对结果以Pediococcus damnosus DSMZ20331(AJ318414)为外枝构建的Neighbor-Joining***发育树，其***发育树如图3所示，命名为罗伊氏粘液乳杆菌GF21(Limosilactobacillusreuteri GF21)。
4)菌株产酸性能测定
将罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株菌种按5％的接种量分别接种到MRS培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次。将活化好的GF21菌液按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，混合均匀后按8ml/支分装到无菌试管中(18mm×180)。将分装好的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌液放置在37℃恒温培养箱中静置培养，并取3支试管，每隔8小时，测定菌液总酸，并用HPLC测定24小时短链脂肪酸含量。
罗伊氏粘液乳杆菌GF21产酸结果见表1，培养时间8、16，24和32小时，产酸分别为0.75g/100ml，1.16g/100ml，1.74g/100ml，1.71g/100ml，因此，本发明的罗伊氏粘液乳杆菌GF21具备产酸快、产酸持久的特点，可作为发酵剂用于发酵食品的制作。
表1用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的产酸分析
短链脂肪酸(Short-chain fatty acid，SCFAs)，也称挥发性脂肪酸(Volatilefatty acids，VFA)，一般是指碳链中碳原子数小于6的有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸等，其分子量均小于200Da，具有改善高血压的作用。罗伊氏粘液乳杆菌GF21产短链脂肪酸的测定结果见表2，结果表明，罗伊氏粘液乳杆菌GF21能够产生4.74μg/ml丙酸和1.44μg/ml丁酸。
表2罗伊氏粘液乳杆菌GF21产短链脂肪酸的检测分析
注释：短链脂肪酸定量单位为μg/ml。
γ-氨基丁酸是一种非蛋白质氨基酸，具有抗糖尿病、抗高血压、促进睡眠等活性。本申请的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS发酵培养基中发酵能产2.17g/L的γ-氨基丁酸，说明罗伊氏粘液乳杆菌GF21具备产γ-氨基丁酸的应用前景，进而用于改善机体睡眠质量、抗抑郁、抗焦虑、降血压、改善糖脂代谢等领域。
实施例2
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21对人体胃肠耐受性、胆盐耐受性试验
1)菌株的活化及培养
在无菌的超净工作台里，将保存好的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21接种到装有10mL MRS液体培养基的离心管中，置于37℃的恒温生化培养箱里培养24h。培养好的菌液浑浊，有白色沉淀。
2)用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21对胃液和肠液的耐受性
配制模拟胃液：NaCl 2.0g/L，用HCl将pH值分别调至2.0、2.5、3.0和4.0，进行高压灭菌，胃蛋白酶3.2g/L，胃蛋白酶在实验时现加现用；
配制模拟肠液：磷酸二氢钾6.8g/L，用NaOH将pH值调至7.5，进行高压灭菌，胰蛋白酶10.0g/L，胰蛋白酶在实验时现加现用；
取甘油管保存的实施例1的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌种以10％的接种量接种至MRS培养基中37℃活化24h；将等量的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌液加入到体系50mL模拟胃液中，记录初始活菌，37℃恒温培养3h后测定活菌数。对检测的GF21进行统计，并计算存活率，菌株存活率＝试验组/对照组×100％。
当食物进入胃中时，胃酸即开始分泌。人体正常的胃分泌的胃酸浓度pH值约为2左右。胃在排空时pH值约在7.0-7.2间，当食物进入胃中时，pH值迅速下降到2-3。饭后胃液稀释，pH上升至3.5左右。GF21胃酸耐受性数据如表3所示，pH2.0时，GF21存活率为38.41％；pH2.50时，GF21存活率为68.19％；在pH3.0时，GF21存活率为82.17％；在pH4.0时，GF21存活率为97.55％，在进食以后服用的GF21菌株能够耐受胃液，且在肠道中，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株能够耐受肠液。
表3用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21胃酸耐受性
3)用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21对胆盐的耐受性
将用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次。将活化好的GF21菌液按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，于恒温培养箱中37℃静置培养15h。将培养好的菌液采用5000rpm离心10min收集菌体，并用无菌生理盐水将菌体震荡均匀。
按10％的添加量将震荡均匀的菌液加入到胆盐浓度分别为1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L和0.0g/L(初始菌液)的MRS培养基中，以胆盐浓度为0.0g/L为对照组。然后于37℃恒温培养箱中孵育3h。将孵育后的菌液取出，立即按照10倍稀释加入无菌生理盐水，拍打混匀后检测GF21；对检测的活菌进行统计，并计算存活率，计算公式如下：
菌株存活率(％)＝试验组/对照组×100％。
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21胆盐耐受性数据如表4所示：当胆盐浓度为1.0g/L和2.0g/L时，GF21菌株的存活率分别为99.13％和94.52％，但当胆盐浓度达到3.0g/L时，GF21菌株存活率仍达到92.17％。肠道内的胆盐浓度不超过3.0g/L，说明用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株能够耐受肠道内的胆盐。
表4用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21胆盐耐受性
综上所述，本发明筛选的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21具有良好的胃酸和胆盐耐受性，可以通过胃肠道途径发挥其调节人体微生物肠道菌群以及调节血压及糖脂代谢的作用。
实施例3
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21产γ-氨基丁酸及其对血管紧张素转化酶抑制活性的测定
1)罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵乳制备血管紧张素转化酶抑制肽(ACE抑制肽)及γ-氨基丁酸
将罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株于37℃，MRS液体培养基中培养24h后，以1％的接种量转接入新鲜MRS培养基中，同条件下培养12h，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬，再以1％的接种量分别接入灭菌新鲜牛乳、含有10g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳中，37℃培养24h，低温离心(10000r/min，10min,4℃)收集2种发酵乳上清液，并将所得上清液用0.10mol/LNaOH调pH至8.3，即得到罗伊氏粘液乳杆菌GF21在灭菌新鲜牛乳、含有10g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳发酵中的ACE抑制肽与γ-氨基丁酸样品，于-70℃条件下保存待用。
经检测，本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在含有10g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳中发酵得到发酵液其γ-氨基丁酸含量为8.17g/L(上清液中谷氨酸的残留量为0.49g/L)，而在灭菌新鲜牛乳中发酵得到的发酵液其γ-氨基丁酸含量仅为1.83g/L；与实施例1中罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基上发酵的γ-氨基丁酸含量相比，添加谷氨酸或者谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳对γ-氨基丁酸的产生有显著的促进作用，而单独的灭菌新鲜牛乳相对MRS培养基其碳源含量较低，不利于γ-氨基丁酸的产生，但有利于ACE抑制肽的合成(参见表6)，本实施例为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在产γ-氨基丁酸的应用，提供了新的技术方案。
2)ACE抑制肽与γ-氨基丁酸组分分离纯化
将本实施例中的两种发酵乳上清液(F0)，利用10kDa、3kDa的超滤膜和200Da的纳滤膜，通过连续流动分析***，分别收集四种组分：F1：分子量<200Da，含有γ-氨基丁酸、短链脂肪酸等；F2分子量200Da～3kDa，含有ACE抑制活性肽；F3：分子量3～10kDa；F4：分子量>10kDa，并对ACE抑制活性进行分析。
3)ACE抑制活性测定
根据表5，按照先后顺序将各试剂加入试管中，在(37±0.5)℃水浴中反应1h,反应结束后马上加入1mol/L的HCL以终止反应；然后于各试管中加入乙酸乙酯1.0mL，漩涡混合后进行离心(4000r/min,10min)；吸取750uL乙酸乙酯层移于另一试管中，放入120℃的烘箱中挥发溶剂30min，拿出冷却后加入去离子水3mL，涡旋混合0.5min后用紫外分光光度计在228nm下测定吸光值，ACE抑制活性的计算公式如下：
式中，Ab为样b的光密度值，样b在反应中不加ACE抑制肽，反应结束后添加ACE抑制肽以维持整个反应体系平衡，是ACE与HHL完全反应；Aa为样a的光密度值，样a在反应中加ACE抑制肽，是ACE在存在抑制剂的情况下与HHL的反应；Ac为样c的光密度值，样c在反应前先失去ACE抑制活性，再加ACE抑制肽，是ACE与HHL反应的空白。
表5ACE抑制活性(体外)检测方法(单位：uL)
备注：ACE购自美国Sigma公司，将0.25U的ACE用2.5mL的去离子水溶解，配成0.1U/mL，分装后-20℃保藏备用；
血管紧张素转化酶作为肾素-血管紧张素-醛固酮***中的关键酶，在调节血压方面起到了重要作用，抑制ACE的活性对降血压有积极影响，罗伊氏粘液乳杆菌上清液不同分子量肽的ACE抑制活性测定结果如表6所示。
表6不同分子量超滤和纳滤组分的ACE抑制率
实验结果表明：添加10g/L谷氨酸分离后的各组分中F1(<200Da)和F2(200Da-3kDa)表现出最强的抑制活性，ACE抑制活性分别为90.17％和92.18％，F1组方含有γ-氨基丁酸、短链脂肪酸等，而F2组方含有ACE抑制活性肽，因此，罗伊氏粘液乳杆菌GF21对ACE抑制起主要作用的物质分子量小于3kDa，主要为短肽、γ-氨基酸丁酸、短链脂肪酸等；罗伊氏粘液乳杆菌GF21在添加10g/L谷氨酸的灭菌新鲜牛乳中发酵得到发酵乳上清液中，F0、F1，F2组分对ACE的抑制率都显著高于灭菌新鲜牛乳作为培养基的相应组分，而F3，F4组未见显著性差异，说明添加谷氨酸有利于γ-氨基酸丁酸、及ACE抑制肽的生成，提高对ACE的抑制率。罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵产生并分泌的血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽、γ-氨基酸丁酸、短链脂肪酸，具有显著的降血压功效，为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在制备预防/治疗高血压的药物中的应用奠定了基础。
基于上述实验结果，申请人提出了本发明的罗伊氏粘液乳杆菌GF21及其发酵组合物在产γ-氨基酸丁酸中的应用，以及罗伊氏粘液乳杆菌GF21及其发酵组合物在产血管紧张素转化酶抑制剂中的应用，尤其是，罗伊氏粘液乳杆菌GF21及其发酵组合物在制备预防/治疗高血压的药物中的应用。
实施例4
含有20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的MRS培养基对罗伊氏粘液乳杆菌GF21产γ-氨基丁酸的促进作用
1)样品制备
将罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌株菌种按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次；将活化好的菌液按5％的接种量接种到含有20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的MRS液体培养基中，恒温培养箱中37℃静置培养24h得到罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵液。
称取1g GF21发酵液加入10ml提取液(无水乙醇：水＝4:1；V/V)，超声30min后静置5min，将上清液转移至25ml容量瓶中，重复提取一次，合并上清液至25ml容量瓶中，用提取液定容至25ml。待衍生，取1ml试样于试管中，加入0.2ml碳酸氢钠溶液和0.4ml丹磺酰氯衍生试剂，混匀在70℃水浴中衍生反应20min，用0.45μm水相滤膜过滤，待测。
2)色谱条件
色谱柱：C18 250mm×4.6mm；粒径5μm；柱温：30℃；进样量：50μL；流速：1ml/min；检测波长：436nm；流动相为乙腈：乙酸钠(35：65)；洗脱方式等度洗脱。
3)标准曲线及试样测定计算
分别配置2ppm、5ppm，10ppm，20ppm，50ppm的γ-氨基丁酸浓度标准液，按上述方法进行色谱分析，以峰面积—标准液浓度作图，绘制标准曲线和回归方程，回归方程为：
f(x)＝402.178*X-414.556
通过回归方程计算，罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵液γ-氨基丁酸含量为8.23g/L(上清液中谷氨酸的残留量为0.99g/L)，产量较高。与实施例1中罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基上发酵的γ-氨基丁酸含量相比具有显著优势，本实施例为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在产γ-氨基丁酸的应用提供了新的方法。
实施例5
罗伊氏粘液乳杆菌GF21对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制性的测定
1)样品制备
取甘油管保存的罗伊氏粘液乳杆菌GF21以10％的接种量接种至MRS培养基中活化，37℃，培养16h，再以2％的接种量接种至MRS培养基中进行发酵，37℃，培养24h，于7000r/min离心10min，取上清液作为待测样品。
2)α-葡萄糖苷酶抑制性
在试管中的4mL反应体系添加顺序如表7所示，以商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG的α-葡萄糖苷酶抑制率为对照，最后加入2mL 0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应，于紫外分光光度计405nm处测定吸光值。
α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100
式中：A为样品组，含样品和α-葡萄糖苷酶；B为样品空白组，含样品不含α-葡萄糖苷酶；C为对照组，不含样品含α-葡萄糖苷酶；D为空白组，不含样品不含α-葡萄糖苷酶。
表7α-葡萄糖苷酶抑制性测定方法
实验结果如表8所示，商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG对α-葡萄糖苷酶抑制率为(60.62±2.7)％，罗伊氏粘液乳杆菌GF21对α-葡萄糖苷酶的抑制率为(80.01±2.28)％，罗伊氏粘液乳杆菌GF21明显优于鼠李糖乳杆菌LGG，可以作为α-葡萄糖苷酶抑制剂，延缓碳水化合物的吸收，降低餐后高血糖。
表8α-葡萄糖苷酶抑制性测定结果
3)α-淀粉酶抑制性
在试管中的7mL反应体系添加顺序如表9所示，加碘液显色后在660nm测OD值。α-淀粉酶抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100
式中：A为样品空白组，含样品不含α-淀粉酶；B为样品组，含样品以及α-淀粉酶；C为空白组，不含样品以及α-淀粉酶；D为对照组，不含样品含α-淀粉酶。
表9α-淀粉酶抑制性测定方法
α-淀粉酶是一种重要的淀粉水解酶，它能够切断淀粉内部的糖苷键，产生糊精、低聚糖和葡萄糖等，能够促进食物中碳水化合物的水解和消化，促进糖分的摄入，从而提高了血糖和血脂含量水平。参见表10，实验结果表明，商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG对α-淀粉酶抑制率为(44.22±3.52)％，罗伊氏粘液乳杆菌GF21对α-淀粉酶的抑制率为(53.63±3.06)％，罗伊氏粘液乳杆菌GF21明显优于鼠李糖乳杆菌LGG，人体进食罗伊氏粘液乳杆菌GF21后对α-淀粉酶的抑制，可以延缓血糖的升高。
表10α-淀粉酶抑制性测定结果
综上所述，罗伊氏粘液乳杆菌GF21进入人体后通过抑制体内的α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性，进而维持血糖稳态，调节并改善糖脂代谢。
实施例6
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌粉，为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基上，37℃恒温培养箱中静置培养24h，发酵液离心分离得到的菌体沉淀，再冷冻干燥或喷雾干燥制成罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌粉，其中罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌数为1×109CFU/g。
用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21对高脂饮食小鼠肥胖和糖脂代谢的影响分析
1)实验方案
1、动物来源：雄性SPF级C57BL/6小鼠，8周龄。
2、饲养条件和饲料：温度为23±2℃，相对湿度为50-55％，无病原体的房间里，控制12h昼夜循环，8:00点为控制时间，自由进食和饮水。
3、实验动物分组：参见表11，将39只小鼠(20.00g±2.00g)分为3组，分别为对照组(CON组)，模型组(HFD组)、罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌组(GF21组)，每组13只小鼠。对照组采用维持饲料，HFD组、GF21组饲料采用高脂饲料(Fat 60％)，持续喂养12周。GF21组采用灌胃方法，给小鼠每日灌胃的菌液中罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌数为1×108CFU(即，采用电子天平称取本实施例制备的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌粉100mg)，对照组和模型组小鼠每日灌胃同等量的麦芽糊精，各组灌胃持续12周。
表11实验动物分组
4、在第12周实验结束前，通过口服糖耐量试验(OGTT)对小鼠的血糖稳态进行评价，具体操作为：小鼠禁食12h后，按照2mg/g体重的剂量灌胃葡萄糖，分别在灌胃前(0min)、灌胃后15、30、60、90、120min尾静脉采集血液，并用血糖试纸测定血糖，并计算曲线下面积。
2)罗伊氏粘液乳杆菌GF21对高脂饮食小鼠体重增加量及血糖稳态的分析
实验进行每周对小鼠进行称重并记录，结果如图4所示，HFD组小鼠体重显著增长，造模成功，GF21组添加罗伊氏粘液乳杆菌GF21干预后，高脂饮食小鼠体重明显下降；相对于对照组，GF21组体重增长量与模型组比较显著下降P<0.05，同时CON组、HFD组、干预组采食量无明显差异，因此，罗伊氏粘液乳杆菌GF21可显著抑制高脂饮食小鼠因高脂饮食诱发的体重增长。
不同高脂饮食小鼠组别的葡萄糖耐量如图5所示，罗伊氏粘液乳杆菌GF21的AUC(曲线下面积)与HFD组相比极其显著降低(P<0.01)，说明：GF21组的高脂饮食小鼠的葡萄糖耐受能力增强，高脂饮食导致的葡萄糖代谢紊乱得到显著改善，罗伊氏粘液乳杆菌GF21具有改善高脂饮食小鼠血糖稳态、增加口服葡萄糖耐受性的作用。
3)罗伊氏粘液乳杆菌GF21对高脂饮食小鼠肝脏脂肪病变的影响
在第12周实验结束后处死小鼠，取小鼠肾脏和肝脏进行称重实验结果如图6，并对肝脏组织进行H&E染色，在400倍显微镜下H&E染色观察各组肝组织切片，实验结果如图7所示。
图6表明CON组、HFD组和GF21干预组，肾脏和肝脏重量无明显差异。图7显示出的CON组小鼠肝脏组织结构完整，着色均匀，脂肪蓄积较少，其肝细胞紧密且均一，呈现规则的形状；而HFD组的小鼠肝脏结构明显受损，出现较多脂肪蓄积，出现明显的病理学变化，肝细胞出现坏死，且其周围呈现脂质空泡化。经罗伊氏粘液乳杆菌GF21干预的GF21组的小鼠肝细胞出现坏死和脂质空泡化细胞面积极少，显著小于HFD组(P<0.0001)，GF21组的肝脏脂肪细胞面积甚至低于CON组，即，罗伊氏粘液乳杆菌GF21有效抑制了高脂饮食小鼠的肝脏脂肪堆积甚至有利于肝脏脂肪的分解，还可以有效防止肝细胞坏死及脂质空泡化等病变现象。
4)罗伊氏粘液乳杆菌GF21对高脂饮食小鼠皮下脂肪重量、附睾脂肪重量的影响
实验结束后处死小鼠，取小鼠皮下脂肪重量和附睾脂肪称量，实验结果分别如图8和9所示。
参见图8，HFD组皮下脂肪重量显著高于CON组(P<0.0001)，GF21组皮下脂肪重量显著低于HFD组(P<0.01)；由图9可知：HFD组附睾脂肪重量显著高于CON组(P<0.0001)，GF21组附睾脂肪重量显著低于HFD组(P<0.05)；因此，罗伊氏粘液乳杆菌GF21可以显著减少高脂饮食小鼠皮下脂肪重量、附睾脂肪的积累，降低高脂饮食小鼠皮下脂肪重量、附睾脂肪的重量。
5)罗伊氏粘液乳杆菌GF21对高脂饮食小鼠白色脂肪、棕色脂肪积累的影响
实验结束后处死小鼠，取小鼠白色脂肪(附睾和皮下)、棕色脂肪(背部)组织并进行H&E染色，并用软件进行统计，实验结果表明：参见图10，在400倍显微镜下H&E染色观察各组白色脂肪组织切片，CON组小鼠白色脂肪细胞面积明显小于HFD组(P<0.0001)，且HFD组中白色细胞的直径显著增大；GF21组明显小于HFD组(P<0.0001)，GF21组小鼠的白色脂肪细胞面积及大小均接近对照组。
参见图11，在400倍显微镜下H&E染色观察各组棕色脂肪组织切片，CON组小鼠棕色脂肪细胞面积显著小于HFD组(P<0.0001)，GF21组棕色脂肪细胞面积明显小于HFD组(P<0.05)，对比CON组和GF21组的棕色脂肪组织切片，罗伊氏粘液乳杆菌GF21显著改善了高脂饮食造成的白色脂肪组织脂质积累，减少脂质浸润与侵袭，逆转了棕色脂肪组织的非正常形态与功能。
6)罗伊氏粘液乳杆菌GF21对高脂饮食小鼠总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的影响
利用生化试剂盒检测小鼠血清中总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，参见图12，与HFD组相比，GF21组的LDL-C、TC都呈下降趋势，其中LDL-C下降显著(P＜0.05)，说明补充罗伊氏粘液乳杆菌GF21改善了小鼠血清中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的积累。
7)罗伊氏粘液乳杆菌GF21对血清中色氨酸代谢物浓度的影响
利用HPLC检测小鼠血清中产物吲哚-3-丙酸(Indole-3-propionic acid,IPA),结果参见图13，罗伊氏粘液乳杆菌GF21干预后显著提升了GF21组小鼠血清中IPA浓度，IPA被认为是肠道微生物衍生的色氨酸代谢产物，与肥胖的发生呈负相关。
综上所述，罗伊氏粘液乳杆菌GF21可抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，干预后小鼠体重增加量，皮下脂肪重量、附睾脂肪重量较HFD组显著降低，同时白色脂肪、棕色脂肪脂肪细胞面积均有显著性的降低，另外，葡萄糖耐量AUC与HFD组相比显著降低(P<0.05)，反映出葡萄糖耐受能力增强，高脂饮食导致的葡萄糖代谢紊乱得到显著改善,同时显著降低了小鼠血清中总胆固醇，另外也减少了低密度脂蛋白胆固醇的积累，通过对小鼠血清的色氨酸代谢物检测发现GF21干预后显著提升了血清中IPA浓度，因此，罗伊氏粘液乳杆菌GF21可有效调节高脂饮食小鼠的糖脂代谢，显著改善高脂饮食引发的肥胖与糖脂代谢紊乱现象。
8)本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌粉在预防/治疗高血压中的应用实验
人群对照实验方法：选取10位具有高血压前期症状的志愿者(18-70岁，知情同意)，即收缩压120mmHg～139mmHg和/或舒张压80mmHg～90mmHg，无严重并发症，能够理解调查内容并配合调查，具备正常的认知能力。排除标准：患肝、肾、肺脑等重要脏器严重病变以及病情危重病人；癌症患者、精神疾患和理解障碍病人；患者个人原因主动退出或失访。采用随机数字表法分为观察组和对照组，每组5例。两组患者性别、年龄、体质量指数、病程和高血压分级等基线资料差异均无统计学意义(P＞0.05)。对照组(5例)早晚服用麦芽糊精固体饮料各1条(2g)。干预组(5例)：使用罗伊氏粘液乳杆菌GF21，每天早晚服用罗伊氏粘液乳杆菌GF21固体饮料各1条(100亿/条，2g)，共60d。
观察指标：分别在患者干预前、后静息状态下使用上臂式电子血压计测量舒张压DBP、收缩压SBP，各测3次，取平均值。统计两组患者治疗期间不良反应发生情况，包括头晕、头疼、恶心等。
表12两组患者血压控制情况比较(mmHg,)
备注：与同组干预前比较，Pa＜0.05；与对照组干预后比较，2)Pb＜0.05。
实验结果见表12，比较对照组与GF21干预组两者基线血压水平差异无统计学意义(P＞0.05)，对照组干预后，收缩压和舒张压统计均无统计学学意义(P＞0.05)。GF21干预组干预后，收缩压和舒张压均低于基线和对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。两组患者治疗期间未发生恶心等不良反应。因此，GF21可以显著降低前期高血压患者的收缩压和舒张压。
基于上述实验结果，申请人提出了本发明的罗伊氏粘液乳杆菌GF21及其发酵组合物在调节血压及糖脂代谢中的应用，优选，在制备预防/治疗高血压和/或糖脂代谢病的药物中的应用，推荐用量为0.2～2g/day。
罗伊氏粘液乳杆菌GF21在生产色氨酸代谢产物中的应用，尤其是，罗伊氏粘液乳杆菌GF21在生产吲哚-3-丁酸中的应用。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物作为发酵剂在泡菜、酸菜等发酵食品中的应用，其用量为2×107CFU/kg发酵食品。
实施例7
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵组合物，为罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌体冻干粉和代谢产物按质量比为1：1混合的混合物，即，罗伊氏粘液乳杆菌GF21在添加20g/L谷氨酸的MRS培养基上，37℃恒温培养箱中静置培养24h后得到的发酵液离心分离，离心沉淀再冷冻干燥得到的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌体冻干粉，其中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌数为1.2×1010CFU/g；以及离心上清液经高温灭活(121℃、15min)、浓缩、喷雾干燥制备而成的GF21代谢产物；GF21活菌体冻干粉和GF21代谢产物按1:1的质量比进行混合而成的混合物。
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物在用于制备预防/治疗高血压、糖脂代谢病药物中的应用。
具体为：
一种含用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的固体饮料，采用本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物与药物载体按重量比1:3混合，得到含用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌数为3×109CFU/g，2g/条的固体饮料。
一种含用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的药物，采用本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物与药物载体按重量比1:9混合，得到含用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌数为1.2×109CFU/g，0.25g/颗的胶囊。
实施例8
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物，为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在添加10g/L谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳中发酵得到的代谢产物，为用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在添加10g/L谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳中，37℃恒温培养箱中静置培养24h，离心分离得到的发酵乳上清液，上清液经高温灭活(121℃、15min)、浓缩、冷冻干燥得到含有血管紧张素转化酶抑制肽、γ-氨基丁酸以及色氨酸代谢产物等活性成分的罗伊氏粘液乳杆菌GF21代谢产物的固体粉末，其中，γ-氨基丁酸的含量≥10g/100g，且血管紧张素转化酶抑制剂的ACE抑制率≥92％。
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物在用于制备防治性高血压、糖脂代谢病药物的应用，其中，用于治疗高血压、糖脂代谢病时，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物的推荐用量为0.5～2g/day；用于预防高血压、糖脂代谢病时，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物的推荐用量为0.1～0.3g/day。
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物在用于产血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。
实施例9
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物，为用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元，即，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在添加10g/L谷氨酸钠的MRS培养基上，37℃恒温培养箱中静置培养24h后，通过细胞裂解、灭活、浓缩、喷雾干燥含有用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21灭活菌体及其代谢产物的固体粉末，其中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21灭活菌体数为5×1010个/g。
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物在制备预防或治疗高血压、糖脂代谢病的药物中的应用，用量为罗伊氏粘液乳杆菌GF21灭活菌体1.0～5×1010个/day。
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物在产γ-氨基丁酸中的应用。
实施例10
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物，为用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21代谢产物固体粉末，即，罗伊氏粘液乳杆菌GF21在添加15g/L谷氨酸钠的MRS培养基上，37℃恒温培养箱中静置培养24h，离心分离得到的发酵液上清液，然后冷冻干燥或喷雾干燥得到的固体粉末为罗伊氏粘液乳杆菌GF21代谢产物固体粉末，该发酵组合物中的γ-氨基丁酸含量≥8g/100g。
一种含本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物的固体饮料，包括分别称取用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21代谢产物固体粉末30重量份、抗性糊精12重量份、山梨糖醇11重量份、低聚半乳糖8重量份、玉米肽10重量份、鹅肌肽1重量份、大豆肽5重量份、低聚木糖4重量份、西兰花种子水提物4重量份、富硒酵母3重量份、三氯蔗糖2重量份、苹果酸2重量份、谷胱甘肽2重量份、维生素E2重量份、维生素C 2重量份、叶酸2重量份。
该组合物的原料先过40目筛网后，按配比混合均匀，使用螺杆背封包装机装袋，制备成2g/袋具有调节血压的固体饮料。
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵组合物在制备预防或治疗高血压药物中的应用，用量为100～1000mg/day。
实施例11
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物，为重量比为1:1的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元和用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21灭活菌体的组合物；所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元为用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在添加10g/L谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳中37℃恒温培养箱中静置培养24h后，发酵乳通过细胞裂解、灭活、浓缩、喷雾干燥含有用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21及其代谢产物的固体粉末，其中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌体数为4×1010个/g；所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21灭活菌体为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基发酵培养结束后得到的发酵液，发酵液离心得到的沉淀经过重悬、细胞裂解、高温灭活(121℃，15min)、离心、浓缩、喷雾干燥得到，其中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21灭活菌体数为5×1010个/g。
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌组合物在制备用于预防或治疗高血压、糖脂代谢病的药物中的应用。
实施例12
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌的发酵组合物，为按重量比为2:1的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌粉和用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元的组合物，其中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌粉同实施例6所述方法制备，活菌含量为3×1010CFU/g，用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元如实施例9所述方法制备，其中，细胞数为5×1010个/g。
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌的发酵组合物在制备用于预防或治疗高血压、糖脂代谢病的药物中的应用，其用量0.2～3g/day。
实施例13
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌的发酵组合物，包括用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌粉，即罗伊氏粘液乳杆菌GF21在添加10g/L谷氨酸的灭菌新鲜牛乳中37℃发酵培养24h获得的发酵液经离心后干燥所得的菌体冻干粉或喷干粉，含2×1010CFU/g活菌。
本实施例的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌在制备用于改善肥胖与糖脂代谢的生物制剂或功能性食品中的应用，其中生物制剂为粉剂，所述粉剂的制备方法如下：按重量份计，包括用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌粉(2×1010CFU/g)20重量份、麦芽糊精20重量份、山梨糖醇11重量份、低聚半乳糖13重量份、玉米肽10重量份、鹅肌肽1重量份、大豆肽5重量份、低聚木糖4重量份、西兰花种子水提物4重量份、富硒酵母3重量份、三氯蔗糖2重量份、苹果酸2重量份、谷胱甘肽2重量份、维生素E1重量份、维生素C1重量份、叶酸1重量份。
该组合物的原料先过40目筛网后，按配比混合均匀，使用螺杆背封包装机装袋，制备成2g/袋具有改善肥胖与糖脂代谢功效的固体粉剂。
本实施例罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物在制备治疗高血压药物中的应用。
本实施例罗伊氏粘液乳杆菌GF21的发酵组合物作为发酵剂在泡菜、酸菜等发酵食品中的应用，其用量为2×107CFU/Kg发酵食品。
实施例14
本实施例的一种用于预防和/或治疗高血压、糖脂代谢病的药物，为按重量比为2:1的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌粉和用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21代谢产物，其中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌粉同实施例6所述方法制备，活菌含量为3×1010CFU/g，所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21代谢产物为用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基中37℃发酵培养24h后，发酵液通过离心得到的离心上清液经高温灭活(121℃、15min)、浓缩、喷雾干燥制备而成。
本实施例的用于预防和/或治疗高血压、糖脂代谢病的药物，推荐成人用量为0.2～3g/day。
实施例15
本实施例的一种用于预防或治疗高血压、糖脂代谢病的药物，调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元，其中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基中37℃发酵培养24h后，发酵液通过细胞裂解、高温灭活(121℃、15min)、浓缩、喷雾干燥制备而成。
本实施例的用于预防或治疗高血压、糖脂代谢病的药物，用于预防或治疗高血压、糖脂代谢病，其推荐用量为0.5～3g/day，具有良好的疗效。
实施例16
本实施例的用于预防或治疗混合性高血压、糖脂代谢病的药物，包括用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌粉，所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌粉为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基中37℃发酵培养20h获得的发酵液经离心后离心沉淀干燥所得的菌体冻干粉或喷干粉，含4×1010CFU/g活菌。
所述药物为胶囊剂型，所述胶囊剂的制备方法如下：按重量份计，包括用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21(4.0×1010CFU/g)40重量份、淀粉40重量份、葡萄糖5重量份，羟丙基甲基纤维素5重量份，乳糖醇5重量份，硬脂酸镁5重量份。
该组合物的原料先过40目筛网后，按配比混合均匀后装入胶囊或包装成粉剂，包装即得。
本发明的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌可以根据应用不同，选择相应的罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵组合物的成分及用量，如实施例6中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21菌粉在制备用于改善肥胖及糖脂代谢的微生物制剂中的应用，其用量还可以为5×108CFU/day，实施例8中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21代谢产物作为组合物还可以在制备产γ-氨基丁酸中的应用，实施例9中用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21后生元作为组合物在制备预防或治疗高血压的药物中的应用，其用量还可以为2×109个/day，以上技术特征的改变，本领域的技术人员通过文字描述可以理解并实施，故不再另作附图加以说明。
Claims (10)
1.一株用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF21(Limosilactobacillus reuteri GF21)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231528。
2.如权利要求1所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌，其特征在于，所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21通过发酵产生血管紧张素转化酶抑制肽、γ-氨基丁酸、短链脂肪酸及色氨酸代谢产物，进而调节血压及糖脂代谢。
3.一种发酵组合物，其特征在于，所述发酵组合物通过使用权利要求1所述的用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21发酵生产制得。
4.如权利要求3所述的发酵组合物，其特征在于，所述发酵组合物为罗伊氏粘液乳杆菌GF21在MRS培养基、或添加10～20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的MRS培养基、或添加10～20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠的灭菌新鲜牛乳中发酵生产制得，所述发酵组合物包括如权利要求1所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌GF21活菌、罗伊氏粘液乳杆菌GF21的灭活菌体、代谢产物、后生元中的一种或多种。
5.如权利要求1所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌或如权利要求3或4所述的发酵组合物在产血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。
6.如权利要求1所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌或如权利要求3或4所述的发酵组合物在产γ-氨基丁酸以及色氨酸代谢产物中的应用。
7.如权利要求1所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌作为发酵剂在发酵食品中的应用。
8.如权利要求1所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌或如权利要求3或4所述发酵组合物在制备用于防治高血压和/或糖脂代谢病的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的用于防治高血压和/或糖脂代谢病的药物，其特征在于，所述药物包括如下至少一种作用：
a)高效抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和血管紧张素转化酶的活性；
b)显著抑制高脂饮食小鼠的体重增加；
c)显著改善高脂饮食小鼠的血糖稳态；
d)显著抑制高脂饮食小鼠的肝脏脂肪堆积，减小肝细胞出现坏死和脂质空泡化；
e)显著降低皮下脂肪、附睾脂肪、白色脂肪、棕色脂肪的积累；
f)降低血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇浓度，提高血清中吲哚-3-丙酸浓度；
g)可以显著降低高血压前期患者的收缩压和舒张压。
10.如权利要求1所述用于调节血压及糖脂代谢的罗伊氏粘液乳杆菌或如权利要求3或4所述发酵组合物在制备用于改善肥胖与糖脂代谢的生物制剂或功能性食品或药物中的应用。
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