KR20130114493A - 황칠나무를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbiferum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 항산화 활성을 나타내며, 피부 주름 개선 내지 피부 노화 방지 효과를 나타낸다.

Description

황칠나무를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 {COSMETIC COMPOSITIONS COMPRISING THE EXTRACT OF DENDROPANAX MORBIFERUM AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 피부 주름 개선 내지 피부 항노화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부 구조는 각질층, 표피, 진피로 이루어져 있으며, 각질형성을 하는 세포, 멜라닌형성세포, 랑거한스세포 등의 표피세포와 섬유아세포, 내피세포, 비만세포, 콜라겐 탄력섬유세포 등의 진피세포로 이루어져 있다.

노화된 세포로부터 과발현되는 콜라게나제(collagenase), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 인터루킨-1(interleukin- 1) 등의 항원 혹은 생물학적 반응 조절물질은 피부와 같은 유사분열 조직의 노화시 나타나는 피부 진피 두께의 감소, 탄력감소, 주름발생, 면역학적 기능의 약화 등 여러 가지 기능적 변화에 중요한 역할을 할 것으로 알려져 있다.

노화에 따른 세포매개성 및 체액면역의 감소는 활성산소종에 의한 산호 스트레스와 밀접한 상관관계를 가지며 표피의 랑게르한스세포와 진피의 항원전달세포, 면역반응과 염증반응을 조절하는 사이토카인들을 비롯한 다양한 생물학적 반응 조절물질들을 생성, 분비 등을 할 수 있는 각질형성세포들이 피부의 면역반응에 중요한 역할을 담당하고 있다.

각질형성세포(keratinocyte)는 주로 물리적 장벽에 의해 외부로부터 개체를 보호하는 역할을 담당하는 표피세포이나 그 기능이 단순한 물리적 장벽의 구축뿐만 아니라 면역학적 반응을 조절하는 사이토카인들을 비롯한 신경펩티드, 에이코사노이드(eicosanoid) 등과 같은 다양한 생물학적 반응 조절물질을 생성, 분비하여 면역반응과 염증반응을 조절하는 요소이다.

피부노화원인으로는 자외선이 가장 큰 요인으로 대두되고 있으며, 활성산소종과 DNA 손상, 메일라드(Maillard) 반응, 사이토카인, 효소, 단백질 합성, 대사활성 등의 광노화 유발인자와 자유 라디칼, 호르몬, 영양, 수면, 스트레스, 생활환경 등의 자연노화 인자라 할 수 있다.

각질형성세포의 증식과 분화는 노화와 직접적으로 관련되며, 각질형성세포의 교체율(turn-over)이 감소하고 각질층이 누적 비후되면 수분함유 능력이 감소하여 각질의 경화가 생겨 최종적으로 주름이 발생하고 기저층 각질형성세포의 기능이 감소하여 세포분열 속도가 느려져 건조피부를 유발하게 된다.

표피와 진피의 경계부(DEJ: Dermal-Epidermal Junction)는 표피세포의 지지 부착 및 영양물질의 이동과 표피분화의 조절 기능을하며 노화에 따른 IV형 콜라겐, VII형 콜라겐의 감소로 인하여 표피와 진피의 지지기능이 감소하고 선별 투과 기능이 약화되어 해로운 성분이 진피에 영향을 주어 최종적인 주름 발생의 원인이 되며 섬유아세포의 활성 저하로 인한 콜라겐 생합성의 감소 및 변성된 엘라스틴을 증가, MMP (Metrix Metalloproteinase)의 증가에 의한 콜라겐이 분해로 진피내 솔라스카(solar scar)가 발생 표피와 진피 경계부가 파괴되는 것 역시 피부 주름 발생의 원인이 된다.

노화된 피부는 자외선 등에 의한 활성산소종 (ROS: Reactive oxygen species)의 발생에 의해 세포가 손상되고, 항산화계효소(SOD, Catalase 등)의 효소 기능 저하 및 항산화 물(Vitamin C, E 등)의 감소로 외부 유해환경에 대한 생체 방어 시스템이 손상되거나, 피부구성 단백질들의 당화(glycation)발생, 비효소적 가교 결합, 콜라겐, 엘라스틴 기능저하 등이 피부 주름을 발생시키는 요인이 되기도 한다.

황칠나무(Dendropanax morbifera)는 두릅나무과 황칠나무속으로 동아시아, 말레이반도, 중앙 및 남아메리카 등에 약 75종이 분포되어 있으며 우리나라에는 1종이 분포되어 있다. 우리나라 황칠나무의 분포도를 보면 제주도, 전남 완도, 보길도, 대흑산도, 거문도, 전북 어청도, 경남일대 바닷가 등에서 자생하는 상록 활엽 교목으로 겨울에도 낙엽이 지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠(黃漆)이라고 한다.

황칠은 삼국시대부터 황제의 갑옷, 투구, 기타 금속 장식구의 황금색을 발하는 진귀한 도료로 사용되었으며, 옛 문헌상에도 황칠의 채취시기, 사용용도 등이 기록되어 있다.

황칠의 성분으로는 도료 성분인 비휘발 성분 66.7%, 방향성분 10.8%, 수분 8.1%, 고형분 14.4%로 구성되어 있고, 특히 정유분획으로 세스퀴테르펜 (sesquiterpene)류의 β-쿠베벤(cubebene), β-셀리넨(selinene), δ-카디넨(cadinene)으로 이루어져 있다.

현재까지 황칠나무에 대하여 연구된 바로는 자연의 금색을 나타내는 공예품에 사용하는 도료의 원료와 황칠나무 잎 추출물 분획에서 항암, 항산화, 간세포 재생, 당뇨치료 효과, 경조직 세포 재생 등과 방향 성분의 신경계에 대한 진정작용과 강장작용이 있으며, 황칠로부터 얻은 추출물에서 멜라닌을 생성하는 티로시아나제의 활성 억제 기능으로 미백효과에 도움을 준다고 알려져 있다.

본 발명자들은 황칠나무의 줄기 부분만을 이용하여 주름개선에 효능이 있는 기능성 화장품의 상품화를 위한 추출법 개발과 효능실험 및 원료 표준화 등을 통하여 인간 삶의 질을 향상시키는데 목적을 두고 예의 연구를 수행하였다.

대한민국 공개특허공보 제10-2005-0036093호, 2005년 4월 20일 공개 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0078527호, 2011년 7월 7일 공개 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0012918호, 2012년 2월 13일 공개 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0082292호, 2011년 7월 19일 공개

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본 발명은 피부에 독성이 없는 천연물 소재 피부 주름 개선 내지 피부 항노화, 피부 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 황칠나무 추출물이 항산화 활성을 나타내며, 이로부터 피부 주름 개선, 피부 항노화 효과를 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 황칠나무 추출물(Dendropanax morbiferum)을 유효성분을 함유하는 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 황칠나무 추출물을 유효성분을 함유하는 피부 주름 개선 내지 피부 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 황칠나무는 황칠나무의 전체 또는 일부를 포함하는 의미이며, 바람직하게는 황칠나무의 줄기부분이다.

상기 황칠나무 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 예컨대, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 이용한 용매 추출법, 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 등을 이용하여 얻을 수 있다.

상기 추출공정은 황칠나무 무게에 대하여 약 2 내지 20 배, 바람직하게는 약 5 내지 10 배의 상기 1차 추출용매로 추출함으로써 수행할 수 있다. 추출은 당 분야에 알려진 추출방법, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 추출온도는 당업자가 추출 방법에 적절한 다양한 온도 범위를 채택할 수 있으며, 예를 들어, 20 ℃ 내지 100 ℃ 등에서 수행될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 또한, 추출시간은 추출방법에 따라 상이하며, 당업자가 적절한 추출시간을 채택할 수 있으며, 이에 국한되지 않으나, 약 1 시간 내지 수일의 범위에서 단회 또는 복수회로 수행될 수 있다. 상기 1차 추출용매로 추출을 수행하여 얻어진 추출물은 통상의 방법에 따라 여과하여 불순물을 제거한 액상 형태로 얻거나, 얻어진 액상 형태의 추출물을 통상의 방법에 따라 감압농축 및/또는 건조하여 분말 형태로 얻을 수 있다.

본 발명에서 바람직한 추출 용매로는 에탄올, 더욱 바람직하게는 80% (v/v) 에탄올 수용액을 이용할 수 있다.

또한, 상기 추출공정은 필요에 따라, 유효성분의 함량이 높은 분획을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 상기 1차 추출용매로 추출하여 얻어진 추출물을 물에 분산시킨 후, 적절한 2차 추출용매, 예컨대, 수포화 C4 의 알콜로 추출하는 단계를 수행함으로써, 생성되는 추출물 중의 유효성분 함량을 더욱 높일 수 있다.

또한, 본 발명의 황칠나무 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함할 수 있다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의해 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효 산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출법은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205). 이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다. 지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다.

본 발명의 초임계추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다. 이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다.

또한 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출효율을 증가시키게 된다.

초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 황칠나무 추출물을 약 0.0001∼60 중량%, 바람직하게 약 0.01∼30 중량% 로 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 유분, 분말, 계면활성제, 보습제, 증점제, 저급 알콜, 피막제, 자외선 흡수제, 금속이온 봉쇄제, 유기 아민류, pH 조정제, 약효성분, 당류, 방부제, 비타민류, 산화 방지제, 향료, 물 등을 포함할 수 있다.

유분의 예로서는, 호호바유, 올리브유, 아보가도유, 피마자유, 야자유, 우지, 경화유, 액상 라놀린 등의 천연유지 및 그 유도체, 카르나우바납, 밀랍, 라놀린 등의 납류, 유동 파라핀, 마이크로 크리스탈링 왁스, 스쿠알린, 바셀린 등의 탄 화 수소류, 스테아린산 등의 고급 지방산류, 세틸알콜, 스테아릴알콜 등의 고급 알콜류, 글리세린모노스테아린산 에스테르, 트리옥탄산 글리세릴, 글리세린모노올레이트, 미리스틴산 이소프로필, 사과산 디이소스테아릴, 디2-헵틸운데칸산 글리세린, 트리2-에틸헥실산 트리메티롤프로판, 트리옥탄산 트리메티롤프로판, 세바신산 디2-에틸헥실 등의 에스테르류, 박하유, 장미유, 시트로네랄 등의 정유류, 디메틸폴리실록산, 데카메틸시클로펜타실록산 등의 실리콘유류 등을 들 수 있다. 유분의 화장료 조성물 내 함유량은, 화장료의 형태, 제형 등에 따라서 적당히 선정되지만, 통상, 화장료 조성물 총 중량 중 0.1∼95중량%로 할 수 있다.

분말의 예로서는, 탤크, 마이카, 카올린, 실리카, 아연화, 운모티타늄, 산화 티탄늄, 산화철, 나일론분말 등을 들 수 있다.

계면활성제의 예로서는, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄지방산 에스테르, 글리세린지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌소르비톨지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 변성 폴리실록산 등의 비이온 계면활성제, 팔미트산 나트륨 등의 음이온 계면활성제, 염화스테아릴 트리메틸암모늄 등의 양이온 계면활성제, 베타인, 아미드베타인, 술포베타인, 이미다졸리늄 등의 양성 계면활성화제를 들 수 있다.

보습제의 예로서는, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등을 들 수 있다.

증점제의 예로서는, 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐알콜 등의 수용성 고분자, 벤토나이트 등의 점토광물을 들 수 있다.

자외선 흡수제의 예로서는, 파라아미노 안식향산(이하 PABA로 약기함), 글리세릴 PABA, 에틸디히드록시프로필 PABA, 옥틸메톡시신나메이트, 2-에톡시에틸-p-메톡시신나메이트, 2,4-디히드록시벤조페논, 2-히드록시-4-메톡시벤조페논, 2-히드록시-4-메톡시-4-메틸벤조페논, 2-히드록시-4-메톡시-4-메틸벤조페논술폰산염, 우로카닌산 에틸에스테르, 2-페닐-5-메틸벤조키사졸, 4-메톡시-4-t-부틸디벤조일메탄, 파라메톡시신남산 에틸헥실 등을 들 수 있다.

금속이온 봉쇄제의 예로서는, 에데트산 4나트륨, 구연산 등을 들 수 있다. 저급 알콜의 예로서는, 에탄올 등을 들 수 있다. 유기아민류의 예로서는, 모노에탄올아민, 트리에탄올아민 등을 들 수 있다. pH 조정제의 예로서는 유산-유산나트륨, 구연산-구연산 나트륨 등의 완충제를 들 수 있다.

약효성분의 예로서는, 판토테닐에틸에테르, 글리실리진산염 등을 들 수 있다. 비타민류의 예로서는 비타민E 또는 그 유도체 등을 들 수 있다. 산화방지제의 예로서는, 토코페롤류, 디부틸히드록시톨루엔, 갈산 프로필 등을 들 수 있다.

당류의 예로서는, 에리스리톨, 자당, 히알론산 등을 들 수 있다. 방부제의 예로서는, 에틸파라벤, 부틸파라벤, 안식향산 나트륨 등을 들 수 있다. 그 외, 후기하는 의약 및 식품에 배합할 수 있는 성분 중에서 선택되어 배합할 수도 있다.

본 발명은 피부외용제 형태일 수 있으며, 이러한 피부외용제는 부형제, 안정제, 보습제, 유화제, 흡수촉진제, pH 조정제, 계면활성제, 희석제, 담체 등의 여러가지 첨가성분을 포함할 수 있다. 이들 첨가성분의 구체예로서는, 예를 들면, 전분, 유당과 같은 당류, 황산마그네슘, 탤크, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체, 대두유, 참깨유와 같은 식물유, 동물유 또는 합성유, 고무, 생리식염수 등과 같은 물, 에탄올, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리알킬렌글리콜 등과 같은 알콜류 등을 들 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내지 피부외용제는, 본 발명의 유효성분과 상기 임의 배합성분의 1종 또는 2종 이상을 혼합해서, 임의의 형태, 제형으로 조제할 수 있다.

본 발명의 피부 화장료 화장료 조성물 및 피부외용제는 개별적으로 피부에 직접 적용하는 것이 바람직하다.

처리되는 영역은 대상의 전체 피부 표면이거나 또는 필요한 영역만을 의미할 수 있다. 조성물의 적용은 피부의 주름 개선 또는 항노화 상태를 유지하도록 주기적으로 반복되어야 한다.

본 발명의 화장료 조성물 및 피부외용제는 생체내 조건하에서 케라티노사이트 세포 피부층으로 유효성분을 전달할 수 있는 화장품학적으로 허용가능한 량의 국부 담체를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 이 담체는 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 생체내 조건하에서 시약을 케라티노사이트 세포 피부층으로 전달할 수 있는 기타 다른 형태를 포함할 수 있다. 바람직하게는 유효성분이 본 발명에 기술된 것과 같은 기능을 수행하도록 담체가 실질적으로 시약과 상호 작용하지 않아야 한다.

담체의 성분 및 함량은 본 발명의 조성물에 사용되는 유효성분의 함량 등에 의존하며, 담체는 조성물 총 중량에 대하여 약 0.1% 내지 약 99중량%의 양으로 포함될 수 있다. 바람직하게는 담체는 알코올을 포함한다. 다르게는 담체는 당업자에게 공지된 것과 같은 리포솜 또는 수화된 지질 박막층상 (hydrated lipidic lamellar phases)일 수 있다.

담체의 바람직한 배합물은 알코올 (예컨대, 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올) 및 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 카르보폴 등의 증점제 및 트랜스커톨 (transcutol)과 같은 침투 강화제가 포함된다.

본 발명의 화장료 조성물 내지 피부 외용제는 피부를 통해 활성화 물질을 침투시켜 피부의 주름을 개선하고, 피부 노화를 방지하기 위한 다양한 방법으로 국부 적용될 수 있다. 상기 조성물을 피부 상에서 손으로 문지를 수 있는 겔, 로숀 또는 용액 형태가 바람직하다. 적용 가능한 다른 방법은 에어로졸 스프레이 또는 도포병의 사용이 가능하다. 전형적으로 0.3 내지 1㎖/5-50㎠의 투여량으로 피부상에 적용된다. 이 배합물은 적용을 필요로 하는 부위에 1시간-2시간-6시간-8시간-12시간 주기로 자주 적용될 수 있다. 본 발명에 기재된 투여량이란 피부에 대한 조성물의 적용량 및 횟수를 의미한다. 조성물은 폴리비닐 피롤리돈 또는 폴리메틸피롤리돈과 같은 필름 형성제를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내지 피부 외용제는 다른 용매, 보습제, 습윤제, 오일, 유화제, 증점제, 희석제, 표면 활성화제, 향미제, 보존제, 산화 방지제, 비타민 및 무기물을 함유하는 화장품용 및 치료용으로 허용 가능한 다른 담체 또는 전색제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내지 피부 외용제는 또한 부가적으로 피부 관리 제품에서 통상 사용되는 물질, 예컨대 액체 또는 고체 연화제, 실리콘 오일, 용제, 농축제, 자외선차단제, 피부 미백제, 분사제, 기타 특수 피부-유익성 활성제를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형도, 용액계, 가용화계, 유화계, 분말계, 분말분산계, 유액계, 겔계, 연고계, 에어졸계, 물-오일 2층계, 물-오일-분말 3층계 등, 다양할 수 있으며, 예를 들면, 연고제, 용액, 크림, 유액, 화장수, 로션, 젤, 에센스(미용액), 파운데이션, 팩마스크, 루즈, 스틱, 입욕제, 목욕 또는 샤워 젤 또는 비누 (액체 비누 포함) 등 다양한 제품의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물 내지 피부 외용제는 당업계의 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 유효성분과 함께 배합되는 성분들은 제형에 따라 당업자가 적의 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.

이상 기술한 내용 뿐 아니라, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 명세서에 기재된 바로부터 발명의 구현 형태를 적절히 변경 내지 응용할 수 있으며, 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본 발명의 황칠나무 추출물은 우수한 항산화 활성을 나타내며, 피부 주름 개선 내지 피부 노화 방지 효과를 나타낸다.

도 1은 황칠나무 추출물 내 β-시토스테롤 함유를 확인한 고속액체크로마토그래프 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 지표물질인 β-시토스테롤의 고속액체크로마토그래프 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 황칠나무 추출물 (20 ppm)의 MMP-1 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 황칠나무 추출물 (200 ppm)의 MMP-1 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 황칠나무 추출물 (2000 ppm)의 MMP-1 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 황칠나무 추출물에 의한 섬유아세포 증식 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 황칠나무 추출물을 처리한 섬유아세포의 형태를 나타낸 사진이다.
도 8은 황칠나무 추출물과 비교군인 α-토코페롤의 DPPH 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 황칠나무 추출물과 비교군인 α-토코페롤의 유사 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

< 실시예 1> 황칠나무 추출물의 제조

전라남도 생물소재인 전라남도 신안군 흑산면에서 자생하는 황칠나무를 건조된 소재를 구입하여 분쇄기(HMF-502, 한일전기)로 분쇄한 다음 분말 20g 을 14 메쉬(mesh) 분체를 통과한 것만을 실험재료로 사용하였다.

아래 도에 나타난 것과 방법으로, 분쇄한 황칠나무를 천연물에 대한 열수 추출법, 용매(80%, 50%, 20% 에탄올) 추출법 및 초임계 추출법 등으로 추출하여 추출조건을 확립하였으며, 최종 평가에 있어서는 80% 에탄올 추출법으로 하였다.

추출한 시료는 20 ㎖의 원형 플라스크에 옮겨 회전 진공 증발기 (rotary vaccum evaporator)를 이용하여 농축하고 동결건조기을 이용하여 건조 후 시험에 이용하였다.

[표 1]

[ 실험예 ]

< 실험예 1> 황칠나무의 지표성분 (β- 시토스테롤 ) 함량 분석

황칠나무는 도료 성분인 비휘발 성분 66.7%, 방향성분 10.8%, 수분 8.1%, 고형분 14.4%로 구성되어 있고, 특히 정유분획으로 세스퀴테르펜(Sesquiterpene)류의 β-쿠베벤(Cubebene), β-셀리넨(Selinene), δ-카디넨(Cadinene)으로 이루어져 있다. 식물의 스테롤 성분으로 많이 알려진 β-시토스테롤(sitosterol)은 항염활성물질로서 전립선비대증, 전립선염, 신경성전립선 질환, 전립선 수술전후 방광기능장애(배뇨장애, 야뇨증, 요실금증, 빈뇨증 등) 치료제로 사용되는 전립선비대증 치료제("시토닐":현대약품)의 주성분으로 알려져 있다. 본 실험에서는 항염에 효과가 있는 β-시토스테롤을 지표성분으로 설정하였고, 아래와 같은 정량법으로 정량하였다.

상기 실시예에서 감압농축한 원료 추출물 0.1mg을 정량하여 80%-에탄올 10㎖를 정확히 넣어 검액 시료로 사용하며, β-시토스테롤 표준품 0.1mg에 80%-에탄올 10 ㎖를 정확히 넣어 표준액으로 조성하였다.

검액 및 표준액 10㎕ 씩을 가지고 다음 조건으로 고속액체크로마토그래프법(High Performance Liquid Chromatography)에 따라 시험하여 검액 및 표준품의 피크면적 A _T 및 A _s를 측정하였다.

β-시토스테롤(C₂₉H₅₀O)의 양 (mg) = β-시토스테롤의 양 (mg) X A _T / A _s

<HPLC (Waters, LC Module I plus) 측정 조건>

검출기 : 자외부 흡광광도계 (측정파장 196 nm)

컬럼 : SunFire^TM C₁₈ (5 ㎛, 4.6×250 ㎜, Waters)

흐름 속도 : 1.0 ㎖ / 분

주입 부피 : 5 ㎕

컬럼 오븐 온도 : 25.0 ℃

이동상 : A - 에탄올 : 아세토니트릴 (15 : 85 v/v)

[표 2]

그 결과를 아래 표 3 및 도 1에 나타내었다. 지표물질인 β-시토스테롤에 대한 HPLC 측정 피크는 도 2에 나타내었다.

[표 3]

< 실험예 2> 황칠나무 추출물의 MMP -1 억제 효과 확인

MMP-1 형광정량 약물 검출 키트 (MMP-1 fluorimetic drug discovery kit)-BML-AK405 키트(QuantiZyme^TM Assay System)는 MMP-1 억제제를 탐색하는데 유용하게 이용되는 키트이다. OmniMMP 형광정량 기질(fluorimetric substrate)은 하기 도에 나타난 것과 같은 원리로 MMP-1 저해제가 해당기질에 대하여 촉매 활성을 보이지 않으면 퀘엔칭(quenching) 현상이 보이고, 반대의 경우 형광을 나타내므로 MMP-1 억제율을 효율적으로 분별할 수 있다.

황칠나무 각각의 20% EtOH추출물, 50% EtOH추출물, 80% EtOH 추출물, H₂O(열수) 추출물, CO₂(초임계) 추출물을 실시예에 기재된 방법으로 농축하여, 20 ppm, 200 ppm, 2000 ppm의 농도로 MMP-1 촉매 활성을 확인하였다.

시료처리 10분 후의 형광을 측정하여 상대적 형광광도 (Relative fluorescence) (유니트)로 표시하고, 효소 활성으로 환산하여 무처리구를 100% 활성으로 하여 비교 분석하였다.

그 결과를 도 3 내지 5, 및 표 4 에 나타내었다

[표 4]

모든 시료를 20 ppm의 농도로 하였을 때 도 3과 같이 무처리구인 대조군을 100%로 하였을 때 황칠나무 20% EtOH추출물 및 황칠나무 CO₂추출물 처리구가 각각 48.7%, 16.8%의 저해율을 보였다.

< 실험예 3> 황칠나무의 섬유아세포 증식 활성 확인

(1) 인간 피부 섬유아세포의 초대배양 및 세포의 배양

인간 피부 섬유아세포의 초대배양은 성인의 포피(foreskin)으로부터 얻어 10% 신생우아혈청(fetal calf serum), 2 mM 글루타민, 페니실린 (100 U/mL), 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖)이 포함된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified eagle medium (DMEM))를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 섬유아세포는 90% 정도 자라면 계대 배양하였고, 세포는 5 세대 이후부터 실험에 이용하였다.

섬유아세포는 FBS가 들어간 완전 배지를 이용하여 37의 5% CO₂의 조건에서 3~6일 마다 계대 배양한 후 웰 플레이트 각 일정양을 시딩하여 세포생존도 실험을 진행하였다.

세포주는 뱅킹 바이알(banking vial)에 세포를 주입하고 액체질소 탱크에 보관하며 실험에 이용하였다.

(2) 세포 생존율 측정

실시예에서 추출한 시료 20㎖ 를 원형 플라스크에 옮겨 회전 진공 증발기로 농축하여 다음과 같은 양을 확보하였다.

[표 5]

황칠나무 추출물에 관한 시료를 위 표와 같이 추출물 5개에 대하여 200 ppm의 농도로 섬유아세포 (fibroblast)에 처리하여 세포독성실험을 수행하였다. 초임계추출물과 80% EtOH 추출물의 경우 200, 100, 50 ppm의 농도에서 자세히 관찰하였다.

섬유아세포의 수는 일정 양을 취하여 트리판-블루(trypan-blue)로 염색하고 혈구계산기(hematocytometer)를 이용하여 계수한 후 일정 농도를 웰 플레이트(well plate)에 시딩하고 배양 24시간 후 시료를 처리 혹은 무처리하여 일정시간 배양하였다.

일정기간 배양 후 세포의 생존율 측정을 위하여 배양중인 세포에 MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액 (5 ㎎/㎖)을 20㎕ 첨가하여 37℃에서 4시간 반응 후 상등액을 제거하고 200㎕의 디메틸설폭시드를 첨가하여 포르마잔 (formazan) 생성물을 녹였다.

이를 ELISA 판독기를 이용하여 570 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 실험결과는 대조구 대비 흡광도를 백분율로 표현하였으며, 6반복 시행하여 mean±SEM으로 표시하였다. 대조구로서 시료를 첨가하지 않은 배지를 이용하거나, 시료를 녹인 용매를 동일 조건으로 처리하였다.

시료 처리구 9개에 대한 세포의 생존도 실험(MTT) 결과, 200 ppm의 동일 농도에서는 각 처리구가 20%, 40%, 67%, 79%, 90%의 생존도를 보이며 초임계 추출 > 80% EtOH 추출 >50% EtOH 추출 >20% EtOH 추출물의 순으로 독성을 확인할 수 있었다. 초임계추출물의 경우 50 ppm의 저 농도에서도 30% 가량의 독성을 보였으나, 80% EtOH 추출물은 50 ppm의 저 농도에서 독성이 감소함을 확인하였다 (도 6).

(3) 세포 형태 관찰

배양 중인 섬유아세포에 특정 농도의 시료를 처리 후 세포의 생존도를 측정함과 동시에 세포의 형태를 현미경 (Olympus CKX31, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 40 ×, 100 × 배율에서 관찰하고 이를 이미지 분석 (IMT I-solution capture)을 이용하여 정리하였다. 각 추출방법에 따른 세포 형태에 대한 경향을 도 7에 나타내었다.

< 실험예 4> 황칠나무의 항산화 활성 ( DPPH 저해능 ) 확인

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 그 자체가 매우 안정한 자유 라디칼로서 517㎚에서 특정적인 광흡수를 나타내는 진한 보라색의 화합물로써, 라디칼 소거활성이 있는 항산화제에 의해 정량적으로 탈색됨으로 항산화 활성을 쉽게 측정할 수 있다. 이 라디칼에 대한 소거활성은 지질과산화 억제활성을 비롯한 항산화 활성과 상관관계를 보이므로 항산화제 검색에 널리 이용되고 있다.

※ 항산화 활성 추출물과 α-토코페롤과 비교

라디칼 소거능 실험은 Blois DPPH법을 변형하여 측정하였다. 즉, 추출물과 α-토코페롤 각각을 EtOH를 이용하여 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1㎎/㎖의 농도로 단계별로 희석하였다. 단계별로 희석한 시료 0.2㎖씩에 0.2mM DPPH 0.8ml로 첨가한 후 25 내지 30 분 반응시킨 후 분광광도계(Spectrophotometer, optizen 2120UV)를 이용하여 517㎚에서 측정하였다. 대조군은 DMSO 0.2㎖에 DPPH 0.8㎖로 첨가한 후 위와 같은 방법으로 측정하였다. 추출물과 α-토코페롤 등이 대조군(무처리군)의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(㎎/㎖)을 IC₅₀을 구하고 각 시료의 최종 농도를 계산하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성 = (A 대조군 - A 시료)/ A 대조군 × 100

A 대조군 : 추출물 무첨가구의 흡광도

A 시료 : 추출물 첨가구의 흡광도

그 결과를 도 8 및 표 6에 나타내었다. 황칠나무 80%-에탄올 추출물의 항산화 효과 IC₅₀은 39.952%로서 0.2㎎/㎖의 비교적 좋은 평가가 나타남을 알 수 있으며, 이는 대조군인 α-토코페롤의 경우 64.115%의 저해율에 필요한 농도는 0.025 ㎎/㎖ 로서 황칠나무의 약 8배의 차이가 나타남을 알 수 있었다. 따라서 황칠나무 추출물은 비교적 높은 항산화 활성이 관찰됨을 알 수 있었다.

[표 6]

< 실험예 5> 유사항산화( SOD - like ) 활성 확인

SOD 유사활성은 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1㎎/㎖로 희석한 추출물 0.3㎖에 0.3ml Tris-HCl 완충액(PH 8.5)와 7.2mM 피로갈롤(pyrogallol) 0.3㎖을 가하여 25에서 45분 반응시킨 후 분광광도계 (Spectrophotometer, optizen 2120UV)을 사용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 무처리구에는 0.3㎖의 DMSO로 처리하여 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 SOD 유사활성은 아래의 식에 의해 계산하여 나타내었으며, 추출물과 α-토코페롤 등이 대조군(무처리군)의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(㎎/㎖)을 피로갈롤을 50% 저해하는 농도인 SC₅₀을 구하고 시료의 최종 농도를 계산하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 황칠나무 추출물 시료에 대한 SOD 유사활성 IC₅₀ 값은 아래 표 7과 같았다. 그 결과, 황칠나무 추출물은 우수한 유사황산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

[표 7]

Claims (6)

1. 황칠나무(Dendropanax morbiferum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화활성을 갖는 화장료 조성물.
2. 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 항노화용 화장료 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 황칠나무 추출물은 황칠나무 줄기 추출물인 화장료 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 황칠나무 추출물은 초임계추출법 또는 에탄올 추출법에 의하여 추출된 화장료 조성물.
5. 제4항에 있어서, 황칠나무 추출물은 80% 에탄올 추출물인 화장료 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 연고제, 용액, 크림, 유액, 화장수, 로션, 젤, 에센스, 파운데이션, 팩마스크, 스틱, 입욕제, 목욕 또는 샤워 젤, 또는 비누의 제형인 화장료 조성물.

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