CN101258160A - 成熟自然杀伤细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诱导前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的Axl受体酪氨酸激酶的配体。而且，本发明还涉及一种成熟自然杀伤细胞的制备方法，即，通过白细胞间介素－7、干细胞因子及Flt3配体处理造血母细胞，由此将其分化为前驱自然杀伤细胞，并在Axl受体酪氨酸激酶的配体的处理下，使前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的方法。

Description

成熟自然杀伤细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及一种诱导前驱自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)分化为成熟自然杀伤细胞的Axl受体酪氨酸(tyrosine)激酶(kinase)的配体。本发明还涉及一种成熟自然杀伤细胞的制备方法，其为利用白细胞间介素-7(interleukin-7)、干细胞因子(SCF)及Flt3配体处理造血母细胞，使之分化为前驱自然杀伤细胞后，再利用Axl受体酪氨酸激酶的配体处理前驱自然杀伤细胞，使之分化为成熟自然杀伤细胞。

背景技术

本发明涉及一种诱导前驱自然杀伤细胞(precusor natural killercell，pNK)分化为成熟自然杀伤细胞(mature natural killer cell，mNK)的Axl受体酪氨酸激酶(Axl Receptor tyrosine kinase，以下简称“Axl”)的配体。尤其涉及一种成熟自然杀伤细胞的制备方法，其为利用白细胞间介素-7、干细胞因子及Flt3配体(类似于Fms的酪氨酸激酶3配体)处理造血母细胞，使之分化为前驱自然杀伤细胞(precursor Natural killercell，pNK)后，再利用Axl的配体处理前驱自然杀伤细胞，使之分化为成熟自然杀伤细胞。

当前的治癌疗法——外科手术法、药物疗法、放疗法等虽有暂时的疗效，但同时还存在耐受性、复发或引发各种副作用的问题。因此，为了开发抗癌剂和诊断试剂，发达国家正在蓬勃发展能够调节免疫反应的免疫治疗法的开发研究，但能够有效地进行对癌的诊断、预防及治疗的免疫细胞治疗法的开发尚处于初级阶段。据报道，自然杀伤细胞(Natural Killercell，NK)干预消灭病原菌、癌细胞、同种异基因细胞(allogeneic cell)等的自然免疫(innate immunity)活动中，其分泌干扰素-γ(interferongamma；IFNg)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞间介素-12等细胞***素(cytokine)，介导适应性免疫(adaptive immunity)，由此对癌具有特异性记忆形成调节能力，但对各种不同的癌，自然杀伤细胞的功能及分化能力有缺陷。已知利用自然杀伤细胞的治癌疗法有，通过白细胞间介素-2活化自然杀伤细胞，以此增加对癌细胞的免疫反应的方法，但这种方法不仅引发副作用，而且每个人对疗效的持续性、耐受性及效果等诸多方面上有所区别。

为了提高自然杀伤细胞的杀癌效果，最重要的是要大量确保高活性自然杀伤细胞。自然杀伤细胞可应用于治疗癌症或难治性病毒感染等疾病，在实际临床上需要100亿个以上自然杀伤细胞。但自然杀伤细胞很难增殖，迄今为止试图用各种方法解决这一问题，但利用白细胞间介素-2或白细胞间介素-15最多只能增殖数十倍，但后来经研究表明，如果混合他人的癌细胞，就能增殖数百倍。2005年发表的最新增殖方法表明，如果共同培养混合有两个遗传基因的他人癌细胞，就能增殖1000倍，但这一方法尚处于研究开发阶段。但要使增殖量至少达到数百倍以上，起码要和他人的癌细胞进行共同培养。不过，和他人的癌细胞共同培养或者使用他人的遗传基因，尚存在安全及伦理问题。

发明内容

本发明的目的在于，通过诱导前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞，提供大量的成熟自然杀伤细胞。

本发明的另一目的在于，提供一种诱导前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的物质。

本发明的另一目的在于，利用少量的白细胞间介素-2处理成熟自然杀伤细胞，以提供活性化成熟自然杀伤细胞。

本发明的再一个目的在于，提供一种包含通过本发明的方法分化并活性化的成熟自然杀伤细胞的免疫细胞治疗剂。

为了达到上述目的，本发明的发明人以相异于现有大部分研究中利用的方法，研究了由造血母细胞分化为成熟自然杀伤细胞的过程(图1)，结果发现了分化促进基因Axl。Axl(p140)是属于Sky、Eyk科(family)的酪氨酸受体磷酸化酶，Axl科中包含Rse(Sky，Brt，Tif，Dtk，Tyro3)、Mer(Eyk，Nyk，Tyro12)，而现有的研究表明在大部分组织上表达Axl、Rse和Mer，但尚没有对其功能的报道。已知Axl的配体有Gas6，这是维生素K依赖性细胞生长因子(vitamin K-dependent growth-potentiating factor)，据推测，从Axl独特的结构来看，其干预细胞的移动、生长、分化。据报道，Axl虽然可以表达在纤维原细胞(fibroblast)、骨髓祖细胞(myeloidprogenitor)、巨噬细胞、神经组织、卵胞、骨骼肌(skeletal muscle)等，但不会在淋巴细胞(lymphocyte)上表达。虽然Axl和Gas6起到对抗原提示细胞的自身稳定性(Homeostasis)及造血母细胞成长的调节作用，但尚没有研究结果表明Axl和Gas6可调节自然杀伤细胞的产生及功能。本发明的发明人经过研究发现，在前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的过程中，Axl将起到必不可少的作用，并基于Axl对自然杀伤细胞的分化调节剂作用，确立了从老鼠骨髓中提取造血母细胞，并利用Axl抗体及/或Gas6，使造血母细胞分化为成熟自然杀伤细胞的***。之后，经改良及变更这种分化***后，将其适用于由人体末梢血液、骨髓或脐带血提取的造血母细胞，由此成功地生产了功能强化的大量成熟自然杀伤细胞。

基于上述成功研究，本发明一方面提供一种诱导造血母细胞分化为成熟自然杀伤细胞的Axl的配体。本申请中所谓″配体″是指，和Axl受体相结合，以使该受体产生功能性反应的多肽或化合物。本发明的配体包含Axl抗体、Gas6及蛋白质S(protein S)。所谓“分化”一般指，较单纯的一个系分成两个以上不同本质的部分系的现象。即，指结构及功能特殊化的现象。成熟自然杀伤细胞中所谓“成熟”是指，自然杀伤细胞具有能够发挥细胞固有功能的能力，例如具备认知癌细胞，并直接杀死癌细胞的能力。自然杀伤细胞是否成熟，可通过将表达物质作为标记来得到确认，而对老鼠和人来说，本领域技术人员已很清楚地了解这些标记。例如，老鼠的标记(marker)有NK1.1、CD122、LY49族(Ly49A、Ly49C、Ly49D、Ly49E、Ly49F、Ly49G、Ly49H、Ly49I)、NKG2A/C/E等，人体的标记有NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD56、CD161。

另一方面，本发明提供一种成熟自然杀伤细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：

i、利用白细胞间介素-7、干细胞因子及Flt3配体处理造血母细胞，使之分化为前驱自然杀伤细胞；

ii、利用Axl的配体处理前驱自然杀伤细胞，使之分化为成熟自然杀伤细胞，由此获得成熟自然杀伤细胞。

做为另一种形态，本发明还提供人体成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述造血母细胞源于人体骨髓、末梢血液或脐带血中一种。

做为另一种形态，本发明所提供的人体成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述Axl的配体选自对Axl蛋白质的抗体、γ-羧化Gas6蛋白质、或者两者的配合物。

做为另一种形态，本发明所提供的人体成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，在与人体基质细胞共同培养条件下，用配体处理前驱自然杀伤细胞。

再一个方面，本发明提供一种活性化成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

i、利用白细胞间介素-7、干细胞因子及Flt3配体处理造血母细胞，使之分化为前驱自然杀伤细胞；

ii、利用Axl抗体处理前驱自然杀伤细胞，使之分化并获得成熟自然杀伤细胞；

iii、利用白细胞间介素-2处理经分化的成熟自然杀伤细胞，以激活成熟自然杀伤细胞。

作为这一方法的一种形态，本发明的特征在于，所述白细胞间介素-2的使用量为8-15ng/ml。

还有，本发明提供一种免疫细胞治疗剂，其特征在于，包含根据本发明的方法制备的活性化成熟自然杀伤细胞。本申请中，所述免疫细胞治疗剂是指其可作为各种抗癌剂或者免疫增强剂使用。活性化成熟自然杀伤细胞中，所谓“活性化”是指，成熟自然杀伤细胞受到白细胞间介素-2的刺激后发挥实质性细胞毒性效能。

此外，本发明还提供一种自身免疫细胞治疗法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从患者的血液及/或骨髓中提取造血母细胞；

2)利用白细胞间介素-7、干细胞因子及Flt3配体处理所述造血母细胞，以使其分化为前驱自然杀伤细胞；

3)在与基质细胞进行共同培养下，用Axl的配体处理前驱自然杀伤细胞，使其分化为成熟自然杀伤细胞；

4)利用白细胞间介素-2处理经分化的成熟自然杀伤细胞，以激活成熟自然杀伤细胞；

5)将活性化成熟自然杀伤细胞注入到该患者身上。

本发明中所谓″自身免疫细胞治疗法″是指，从患者身上提取免疫细胞，或者提取患者本身的造血母细胞后在试管水平上将其分化为免疫细胞，即通过体外培养，增殖能够有选择地杀伤癌细胞的免疫细胞、或者强化其功能后，再向该患者本身体内注入，由此治疗癌症的方法。

此外，本发明还提供一种同种免疫细胞治疗法，其特征在于，从人体的同种脐带血、捐赠的血液及/或骨髓中提取造血母细胞后，用白细胞间介素-7、干细胞因子及Flt3配体处理该造血母细胞，以使其分化为前驱自然杀伤细胞后，在与基质细胞进行共同培养下，用Axl的配体处理前驱自然杀伤细胞，以使其分化为成熟自然杀伤细胞，之后，利用白细胞间介素-2激活所述经分化的成熟自然杀伤细胞后，最后将活性化成熟自然杀伤细胞注入到患者身上。本发明中所谓″同种免疫细胞治疗法″是指，从胎儿的脐带血中提取成熟干细胞，并将其在试管水平上分化为免疫细胞，即通过体外培养，增殖能够有选择地杀伤癌细胞的免疫细胞数量、或者强化其功能后，再将其注入到体内，以治疗癌症的方法。

自然杀伤细胞是作用于自然免疫***的淋巴细胞，所述自然免疫***对特定微生物的感染及新生物质具有认识和破坏等生物功能(Moretta，A.，Bottino，C.，Mingari，M.C.，Biassoni，R.and Moretta，L.，Nat.Immunol.，3，6，2002)。如果以密集在细胞质内的粉红色或紫色的染色颗粒来观察的话，自然杀伤细胞具有类似于大颗粒淋巴细胞(Large GranularLymphocyte，LGL)的形态特征。这些在正常末梢血淋巴细胞的含量约占10-20％，在肝淋巴细胞中约占15-25％，在脾淋巴细胞中约占1-5％。休眠状态的自然杀伤细胞虽然在血液中循环，但在细胞***素的作用下被激活后，它们将会漏出或浸入被病原体感染的、或者含有恶性细胞的大部分组织中(Colucci，F.，Di Santo，J.P.and Leibson，P.J.，Nat.Immunol.，3，807，2002；Kelly J.M.，Darcy P.K.，Markby J.L.，Godfrey D.I.，Takeda K.，Yagita H.，Smyth M.J.，Nat.Immunol.，3，83，2002；Shi F.D.，Wang H.B.，LiH.，Hong S.，Taniguchi M.，Link H.，VanKaer L.，L junggren H.G.，Nat.Immunol.，1，245，2000；Korsgren M.，Persson C.G.，Sundler F.，Bjerke T.，Hansson T.，Chambers B.J.，Hong S.，Van Kaer L.，Ljunggren H.G.，Korsgren O.，J.Exp.Med.，189，553，1999)。通常，自然杀伤细胞的表达形式的特征是，CD56及CD16(人体)、NKR-P1C(老鼠中是NK1.1、人体中是CD161)、DX5、Ly49(老鼠；但限定于老鼠的特定株)等表面抗原的表达及CD3的缺乏。大部分人体自然杀伤细胞(即全部自然杀伤细胞的90％)呈现为CD56低密度表达(比CD56dim具有更强的细胞毒性)，并表达高水平的Fcγ受体III(FcγRIII，CD16)的反面，约有10％的自然杀伤细胞呈CD56^brightCD16^dim或呈CD56^brightCD16^-(Schattner，A.and Duggan，D.B.，Arthritis Rheum.，27，1072，1984)。自然杀伤细胞和其他免疫细胞不同，无需经过事先的训练过程，亦可消除被感染的细胞和肿瘤细胞。自然杀伤细胞通过自身的活性化受体及其配体之间的相互作用，在最初的宿主防御中起到核心作用。

自然杀伤细胞可通过对主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibility Complex，MHC)类I分子具有特异性的自然杀伤细胞抑制受体，识别并区分正常细胞和未表达主要组织相容性复合体类I分子的细胞。自然杀伤细胞的功能通过和目标细胞中主要组织相容性复合体类I分子或与主要组织相容性复合体类I相关的分子等配体相互作用的活性化受体及抑制受体之间的平衡来调节(Rajaram，N.，Tatake，R.J.，Advani，S.H.and Gangal，S.G.，Br.J.Cancer，62，205，1990)。这些受体，结构上可分为两个科，即：免疫球蛋白上位科(白细胞抑制受体、杀伤细胞Ig-类似受体(KIR、CD158)及C-类型外源凝集素-类似科(NKG2D、CD94/NKG2、淋巴细胞抗原49(LY49))。自然杀伤细胞经过其表面受体与配体之间的相互作用后，产生干扰素-γ及肿瘤坏死因子-α等几种细胞***素(Bryson，J.S.and Flanagan，D.L.，J.Hematother.Stem CellRes，.9，307，2000)。

自然杀伤细胞官能基的功能可通过白细胞间介素-2、白细胞间介素-12、白细胞间介素-15、白细胞间介素-18、白细胞间介素-21及I型干扰素-αβ等细胞***素与细胞表面受体有区别的介入相结合得到刺激。而这些官能基不仅可以生成干扰素-γ、白细胞间介素-5、白细胞间介素-10、白细胞间介素-13、干扰素-α及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等免疫调节细胞***素，还可以在自然杀伤细胞受体及其配体之间的相互作用后，会生成大量的趋化因子(Kemokine)(Shi F.D.，Wang H.B.，Li H.，Hong S.，Taniguchi M.，Link H.，Van Kaer L.，Ljunggren H.G.，Nat.Immunol.，1，245，2000)。对人体来说，CD56^bright自然杀伤细胞下位组还可以生成包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、白细胞间介素-10及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Lian R.H.，Maeda M.，Lohwasser S.，Delcommenne M.，Nakano T.，Vance R.E.，Raulet D.H.，Takei F.，J.Immunol.，168，4980，2002)等在内的几种细胞***素，但CD56^dim自然杀伤细胞下位组不能生成这些细胞***素(Colucci，F.，DiSanto，J.P.and Leibson，P.J.，Nat.Immunol.，3，807，2002；Shi F.D.，Wang H.B.，LiH.，Hong S.，Taniguchi M.，Link H.，Van Kaer L.，Ljunggren H.G.，Nat.Immunol.，1，245，2000)。未成熟自然杀伤细胞虽然可以生成白细胞间介素-5及白细胞间介素-13等Th2细胞***素，但最终分化时，其生成Th2细胞***素的能力就会消失。相反，成熟自然杀伤细胞就会获得生成干扰素-γ的能力(Van Beneden K.，Stevenaert F.，De Creus A.，Debacker V.，De Boever J.，Plum J.，Leclercq G.，J.Immunol.，166，4302，2001)。自然杀伤细胞分泌藉由白细胞间介素-15(Crosier，K.E.and Crosier，P.S.，Pathology，29，131，1997；Nakano，T.，Kawamoto，K.，Kishino，J.，Nomura，K.，Higashino，K.andArita，H.，J.Biochem.，323，387，1997；Fridell，Y.W.，Villa，J.，Jr，Attar，E.C.and Liu，E.T.，J.Biol.Chem.，273，7123，1997)或白细胞间介素-2(Goruppi，S.，Ruaro，E.and Schneider，C.，Oncogene，12，471，1996)部分调节的XCL1、CCL1、CCL3、CCL4、CCL5、CCL22及CXCL8(Lundwall，A.，Dackowski，W.，Cohen，E.，Shaffer，M.，Mahr，A.，Dahlback，B.，Stenclrclr，J.and Wydro，R.，Proc.Natl Acad.Sci.，83，6716，1986)等大量趋化因子，并进行反应。这些趋化因子在二次淋巴细胞组织中对于自然杀伤细胞对感染及新生细胞的自导引(Homing)起到重大作用，而在该组织中，所生成的干扰素-γ可直接调节T细胞反应(Lundwall，A.，Dackowski，W.，Cohen，E.，Sbaffer，M.，Mahr，A.，Dahlback，B.，Stenclrclr，J.and Wydro，R.，Proc.Natl Acad.Sci.，83，6716，1986)。休眠状态的CD56^dim/CD16⁺自然杀伤细胞的下位组表达CXCR1、CXCR2、CXCR3及CXCR4，而另一方面，CD56^bright/CD16^-自然杀伤细胞表达高水平的CCR5及CCR7。自然杀伤细胞的细胞溶解活性被CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL10及CXC3L1激活。

自然杀伤细胞杀伤癌细胞的机理有如下两种。

一种机理是利用细胞受体。自然杀伤细胞在细胞表面表达三种类型的肿瘤坏死因子蛋白质，即Fas配体(fas ligand，FASL)、肿瘤坏死因子及TRAIL因子(TRAIL)，这些因子将与其在癌细胞中的受体相结合，诱导癌细胞的凋亡(apoptosis)(Ashkenazi，A.，Nature Rev.Cancer.，2，420，2002)。自然杀伤细胞杀伤癌细胞的另一种机理是，利用穿孔素(Perforin)或颗粒酶(Granzyme)等细胞质颗粒物。这些物质穿透癌细胞的细胞膜进入后溶解癌细胞，最终使癌细胞凋亡(Trapani，J.A.，Davis，J.，Sutton，V.R.and Smyth，M.J.，Curr.Opin.Immunol.，12，323，2000)。

虽然人们已知自然杀伤细胞源于万能造血母细胞(形成血液细胞及免疫细胞的起源细胞)，但对其产生过程尚没有明确的解释(Lian R.H.，MaedaM.，Lohwasser S.，Delcommenne M.，Nakano T.，Vance R.E.，Raulet D.H.，Takei F.，J.Immunol.，168，4980，2002)。据研究表明，造血母细胞(人体中是Lin^-CD34⁺，老鼠中是Lin^-c-kit⁺Sca2⁺)可源于胎儿胸腺、胎儿肝脏、脐带血及成熟骨髓，而这些是可分化为T细胞或自然杀伤细胞的前驱物质(Lian R.H.，Kumar V.，Semin.Immunol.，14，453，2002；Douagi I.，Colucci F.，Di Santo JP.，Cumano A.，Blood，99，473，2002)，如果在试管水平下将其与白细胞间介素-7、干细胞因子或Flt3配体进行反应后予以培养，其可分化为前驱自然杀伤细胞(Williams N.S.，Klem J.，Puzanov I.J.，Sivakumar P.V.，Bennett M.，Kumar V.，J.Immunol，.163，2648，1999)。在此，所谓“分化”一般指一个较单纯的系分成两个以上具不同性质之部分系的现象，即指结构或功能特殊化的现象。前驱自然杀伤细胞是造血母细胞和成熟自然杀伤细胞间中间阶段细胞，其均匀分布在骨髓、胎儿胸腺、血液、脾及肝等组织。但这些不能生成干扰素-γ，因此不具备细胞溶解能力。本发明中将造血母细胞的标记分别定义为c-kit⁺Lin^-(老鼠)、CD34⁺(人体)。

据报道，如果利用白细胞间介素-15处理前驱自然杀伤细胞(人体中是CD56^-CD122⁺CD34⁺，老鼠中是CD122⁺NK1.1^-DX5^-)并将其培养，其可分化为未成熟自然杀伤细胞(人体中是CD122⁺CD161^-CD56^-KIR^-，老鼠中是CD122⁺CD2⁺NK1.1⁺DX5⁺Ly49^-)。如果在含有白细胞间介素-15的培养基(culture medium)中持续培养前驱自然杀伤细胞，其可分化为早熟的(pseudomature)细胞溶解性自然杀伤细胞(CD122⁺CD2⁺NK1.1⁺DX5⁺CD94/NKG2⁺Ly49^-)，但这些早熟的细胞基本上没有细胞溶解能力。基质细胞可分泌各种细胞***素及可直接与成长中自然杀伤细胞表面受体进行反应的物质。基质细胞所分泌的上述物质在成熟自然杀伤细胞的成长过程中是不可缺少的因素，其可用来在成熟自然杀伤细胞中表达LyS49⁺(Iizuka K.，Chaplin D.D.，Wang Y.，Wu Q.，Pegg L.E.，Yokoyama W.M.，Fu Y.X.，Proc.Natl.Acad.Sci.，96，6336，1999；Briard D.，Brouty-Boye D.，Azzarone B.，Jasmin C.，J.Immunol.，168，4326，2002)。具有细胞溶解能力的Ly49⁺成熟自然杀伤细胞(人体中是CD56⁺KIR⁺CD3^-，老鼠中是CD122⁺CD2⁺NK1.1⁺DX5⁺CD94/NKG2⁺Ly49⁺CD3^-)可通过在添家有白细胞间介素-15的条件下，将前驱自然杀伤细胞及基质细胞共同培养而分化形成(Williams N.S.，Klem J.，Puzanov I.J.，Sivakumar P.V.，Bennett M.，Kumar V.，J.Immunol，.163，2648，1999)。在自然杀伤细胞的成长过程中，其初步阶段中表达CD94、NKG2A、NKG2C及Ly49B，其后表达Ly49G、Ly49C及Ly49I，最后表达Ly49A、Ly49D、Ly49E及Ly49F(Williams N.S.，Kubota A.，Bennett M.，Kumar V.，TakeiF.，Eur.J.Immunol.，30，2074，2000)。本发明中，将前驱自然杀伤细胞标记定义为CD122⁺NK1.1^-(老鼠)。

前驱自然杀伤细胞将表达PU.1、GATA3、Id2及Ets-1等转录因子(transcription factor)(Boggs S.S.，Trevisan M.，Patrene K.，Geogopoulos K.，Nat.Immunol.，16，137，1998)。实验发现，缺失转录因子ikaros、PU.1(Colucci F.，Samson S.I.，DeKoter R.P.，LantzO.，Singh H.，Di Santo J.P.，Blood，97，2625，2001)及Id2(IkawaT.，Fujimoto S.，Kawamoto H.，Katsura Y.，Yokota Y.，Proc.Natl.Acad.Sci，.98，5164，2001)的老鼠身上减少了前驱自然杀伤细胞数。造血母细胞表达myb肿瘤基因(oncogene)、c-myc及Oct 2b等转录因子。这些因子对前驱自然杀伤细胞的增殖及成长起到重大作用(Bar-Ner M.，Messing L.T.，Sega1 S.，Immunobiology，185，150，1992；Melotti P.，CalabrettaB.，Blood，87，2221，1996)。前驱自然杀伤细胞中Fc受体、肿瘤坏死因子受体、白细胞间介素-7受体及趋化因子受体以及CD36等免疫调节剂，在前驱自然杀伤细胞阶段中具有重大作用。

成熟自然杀伤细胞中，RGS(G蛋白质信号调节子，regulator of Gprotein signaling)、淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶及Fyn原癌基因(proto-oncogene)等信号传递分子是干预自然杀伤细胞成熟的物质(IkawaT.，Fujimoto S.，Kawamoto H.，Katsura Y.，Yokota Y.，Proc.Natl.Acad.Sci，.98，5164，2001；Ogasawara K.，Hida S.，Azimi N.，Tagaya Y.，Sato T.，Yokochi-Fukuda T.，Waldmann T.A.，Taniguchi T.，Taki S.，Nature，391，700，1998)。成熟自然杀伤细胞是指能够认知癌细胞，并直接杀死癌细胞的细胞。如果对成熟自然杀伤细胞进行白细胞间介素-2处理，就能诱导成熟自然杀伤细胞的增殖及活性。受体酪氨酸激酶由横跨膜(transmembrane)所生成的蛋白质构成，所述横跨膜将对细胞的繁殖、成长、生存以及移动等细胞外刺激信号传递到细胞内(Ullrich，A.，Schlessinger，J.，Cell，61，203，1990；Fantl，W.J.，Johnson，D.E.，Williams，L.T.，Biochem.，62，453，1993；Heldin，C.，Cell，80，213，1995)。所有的受体酪氨酸激酶均具有细胞质激酶领域，而如果对所述领域结合细胞生长因子，受体酪氨酸激酶将被激活。本发明中将成熟自然杀伤细胞标记定义为CD122⁺NK1.1⁺(老鼠)、CD34⁺(人体)，而在其中，将完全成熟的细胞标记定义为Ly49A⁺、Ly49C⁺、Ly49D⁺、Ly49E⁺、Ly49F⁺、Ly49G⁺、Ly49H⁺、Ly49I⁺、NKG2A/C/E⁺(老鼠)、CD56⁺、NKG2A⁺、CD161⁺、NKP46⁺、NKP30⁺、NKP44⁺、NKG20⁺(人体)。

受体酪氨酸激酶的活性取决于自磷酸化反应(autophosphorylation)及酪氨酸磷酸化反应。Axl(也可称之为ARK、UFO或TYRO7)是最早发现的受体酪氨酸激酶总科(superfamily)之一。受体酪氨酸激酶具有如下共同结构，即，两个和免疫球蛋白相关的领域、与其相连的两个纤维结合蛋白状III重叠领域(fibronectin type III repeat domain)、以及酪氨酸激酶在细胞质内的领域(O′Bryan，J.P.，Frye，R.A.，Cogswell，P.C.，Neubauer，A.，Kitch，B.，Prokop，C.，Espinosa，R.III，Lebeau，M.M.，Earp，H.S.，Liu，E.T.，Mol.Cell.Biol.，11，5016，1991)。Axl表达于胸、骨骼肌、心脏、造血组织、***、卵巢及子宫内膜(Faust，M.，Ebensperger C.，Schulz，A.S.，Schleithoff，L.，Hameister，H.，Bartram，C.R.and Janssen，J.W.，Oncogene，7，1287，1992；Graham，D.K.，Bowman G.W.，Dawson，T.L.，Stanford W.L.，Earp，H.S.，andSnodgrass，H.R.，Oncogen，10，2349，1995；Neubauer，A.，Fiebeler，A.，Graham，D.K.，O′Bryan，J.P.，Schmidt，C.A.，Barckow，P.，Serke，S.，Siegert，W.，Snodgrass，H.R.，Huhn，D.，Blood，84，1931，1994；Berclaz，G.，Altermatt，H.J.，Rohrbach，V.，Kieffer，I.，Dreffer，E.and Andres，A.C.，Ann.Oncol.，12，819，2001；Wimmel，A.，Glitz，D.，Kraus，A.，Roeder，J.and Schuermann，M.，Eur.J.Cancer.，37，2264，2001；Sun，W.S.，Misao，R.，Iwagaki，S.，Fujimoto，J.andTamaya，T.，Mol.Hum.Reprod.，8，552，2002)。Axl由以下领域所构成：即，和细胞外配体结合领域相关的细胞接合分子、类似于免疫球蛋白的两个领域、两个纤维结合蛋白类型III领域。最新研究表明，Axl干预癌细胞的形成、神经和造血组织的成长过程中(Crosier，K.E.andCrosier，P.S.，Pathology，29，131，1997)。

Gas6是生长停滞特异性基因6，是属于维生素K依赖性蛋白科。这一科是对包含Axl、Sky(Rs e、Brt、Tif、Dtk、Etk-2及Tyro3)及Mer(c-Eyk、Nyk及Tyro12)的Axl/sky科的配体(Godowski，P.J.，Mark，M.R.，Chen，J.，Sadick，M.D.，Raab，H.and Hammonds R.G.，Cell，82，355，1995；Varnum，B.C.，Young，C.，Elliott，G.，Garcia，A.，Bartley，T.D.，Fridell，Y.W.，Hunt，R.W.，Trail，G.，Clogston，C.，Toso，R.J.，Nature，373，623，1995；Chen，J.，Carey，K.and Godowski，P.J.，Oncogene，14，2033，1997)。Gas6中46％的氨基酸序列和血液凝固调节相关血清蛋白质，即蛋白质S的序列相同，而且结构相似(Manconrftti，G.，Brancolini，C.，Avanzi，G.and Schneider，C.，Mol.Cell.Biol.，13，4976，1993)。Gas6表达于肠、睾丸、肺内皮、子宫内膜细胞中，而且在子宫内膜癌细胞中也有较多的表达(Prieto，A.L.，Weber，J.L.，Tracy，S.，Heeb，M.J.and Lai，C.，Brain Res.，816，646，1999；Chan，M.C.W.，Mather，J.P.，Mccray，G.and Lee，W.M.，J.Androl.，21，291，2000；Wimmel，A.，Glitz，D.，Kraus，A.，Roeder，J.and Schuermann，M.，Eur.J.Cancer.，37，2264，2001)。

为了使Gas6体现完整的生物活性，必须使之进行维生素K依赖性γ-羧化反应(carboxylation)(Manconrftti，G.，Brancolini，C.，Avanzi，G.and Schneider，C.，Mol.Cell.Biol.，13，4976，1993；Lundwall，A.，Dackowski，W.，Cohen，E.，Shaffer，M.，Mahr，A.，Dahlback，B.，Stenclrclr，J.and Wydro，R.，Proc.Natl Acad.Sci.，83，6716，1986；Chen，J.，Carey，K.and Godowski，P.J.，Oncogene，14，2033，1997)。Gas6在平滑肌细胞(smooth muscle cells)中被凝血酶(thrombin)诱发，其干预细胞的生长(Nakano，T.，Kawamoto，K.，Kishino，J.，Nomura，K.，Higashino，K.and Arita，H.，J.Biochem.，323，387，1997)，而且Gas6又是作为化学诱导分子来干预血管平滑肌细胞因Axl介质而进行的细胞移动中(Davis，J.E.，Smyth，M.J.and Trapani，J.A.，Eur.J.Immunol.，31，39-47，2001)。此外，Gas6保护NIH3T3细胞不致因血清缺乏而死亡，由此维持正常的细胞周期(Goruppi，S.，Ruaro，E.andSchneider，C.，Oncogene，12，471，1996)。据最新报道，Gas6还具有使哺乳类动物细胞中β-连锁蛋白(β-catenin)趋于稳定化及诱导T-细胞因子转录活性的作用(Goruppi，S.，Chiaruttini，C.，Ruaro，M.E.，Varnum，B.and Schneider，C.，Mol.Cell.Biol.，21，902，2001)。

蛋白质S是防止血液凝固的维生素-K依赖性血浆糖蛋白，其在凝血因子Va及VIIIa分解时，作为活化蛋白质C的辅助因子发挥作用。而且，蛋白质S在其他类型的细胞中，起到***素(mitogen)的作用，其为肿瘤形成性Axl科之一员即Tyro3的配体(Wimmel A.et al.，Cancer 1999 Jul1；86(1)：43-9)。蛋白质S和Gas6相同，能够刺激Axl/Sky科之一员。蛋白质S和Gas6具有相似的结构(由氨基末端Gla领域、四个EGF-like领域、以及如信号传递分子等G领域所构成)，并具有能够使Axl/Sky总科磷酸化的功能(Evenas P.，et al.，Biol Chem.2000 Mar；381(3)：199-209)。

蛋白质S以在人血浆中游离状态蛋白质形式及与C4b蛋白质相结合的形式存在(Dahlback & Stenflo(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，2512-2516)。人体蛋白质S可通过如柠檬酸钡(barium citrate)吸附法、DEAE-Sephace离子交换层析法(DEAE-Sephacel chromatography)及蓝色琼脂糖凝胶层析法(Blue-Sepharose chromatography)(Dahlback B.，Biochem.J.(1983)209，837-846)等简单的精制方法制备。此外，蛋白质S还可通过基因重组方法制备(Merel Van Wijnen，et al.，Biochem.J.330，389-396)。

本发明所使用的DNA重组方法一般指在文献[Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)]及/或文献[Ausubelet al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenPublishers Inc.and Wiley and Sons，N.Y.(1994)]中所记载的方法。例如像以下示例，通过向合适的载体内***根据基因重组表达技术对Axl、Gas6或蛋白质S加以编码化的核苷酸序列，以大量生产所希望的核苷酸序列(Nucleotide sequences)。然后，利用上述序列可生成测试探针或放大引物(primer)。或者，也可以通过向合适的载体内***对Axl、Gas6或蛋白质S加以编码化的聚核苷酸后，将所生成的表达载体***适当的宿主内后进行培养，由此大量生产蛋白质。制备核苷酸序列的另一种方法是经过聚合酶链锁反应(Polymerase chain reaction，PCR)。这一方法是，利用逆转录酶制备多聚(A)+RNA，或者由全部RNA制备cDNA。典型的方法是，将两个相辅性引物和如Taq酶等聚合酶，一同加入到对Axl、Gas6或蛋白质S的多肽氨基酸序列加以编码化的cDNA中两个独立的领域中，其中，所述聚合酶放大两个引物之间的cDNA领域。用于对Axl、Gas6或蛋白质S的多肽氨基酸序列进行编码化的核酸分子，可在原核细胞、酵母、昆虫(baculovirus systems)及/或真核宿主细胞中放大及表达(Meth.Enz.vol.185D.V.Goeddel ed.，Academic Press，Sna Diego Calif.，1990)。典型地，表达载体包含用于维持质粒(plasmid)、并用于复制及表达外源核苷酸序列的序列。这种序列包括，启动子、增强子(Enhancer)、复制源、转录终结序列、分泌前导肽序列、脂质体(liposome)结合部分、聚腺苷酸序列、用于***拟表达多肽的编码化核酸的多聚接头(polylinker)及筛选标记。这种侧翼序列(flanking sequence)对本领域技术人员来说是公知技术，且可易于选择使用。

适于哺乳动物细胞中、并用来转录对Axl、Gas6或蛋白质S进行编码化的DNA的启动子有，SV40启动子(Subramani et al.，Mol.Cell Biol.1(1981)，854-864)、MT-1(metallothione in gene)启动子(Palmiter et al.，Science 222(1983)，809-814)、CMV启动子(Boshart et al.，Cell41：521-530，1985)或者腺病毒2主要晚期启动子(adenovirus-2majorlate promoter)(Kaufman and Sharp，Mol.Cell.Biol，2：1304-1319，1982)等。适于昆虫细胞的启动子有，多角体基因(polyhedrin)启动子(美国专利第4,745,051号；Vasuvedan et al.，FEBS Lett.311，(1992)7-11)、P10启动子(J.M.Vlak et al.，J.Gen.Virology 69，1988，pp.765-776)、杆状病毒(baculovirus)即刻早期基因1(immediate-earlygene 1)启动子(美国专利第5,155,037号及第5,162,222号)或杆状病毒39K晚早期基因(delayed-early gene)启动子(美国专利第5,155,037号及第5,162,222号)等。适于酵母宿主细胞的启动子有，酵母糖酵解基因(glycolysis gene)启动子(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080；Alber and Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)、醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)基因启动子(Young etal.，in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender et al，eds.)，Plenum Press，New York，1982)、TPI1启动子(美国专利4,599,311)或ADH2-4c启动子(Russell et al.，Nature 304(1983)，652-654)等。适于真菌宿主细胞的启动子有，ADH3启动子(McKnight et al.，The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或tpiA启动子等。或者还有源于A.oryzae TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天门冬氨酸蛋白酶(aspartic proteinase)、A.niger中性α-淀粉酶、A.niger酸稳定性α-淀粉酶、A.niger或A.awamori糖化酶(gluA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉(A.oryzae)碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶(A.oryzae triose phosphate isomerase)或A.nidulans乙酰胺酶(acetamidase)编码基因。

必要时，DNA序列可连接于人体生长激素终结子(Palmiter et al.，Science 222，1983，pp.809-814)、TPI1(Alber and Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1，1982，pp.419-434)或ADH3(McKnight et al.，The EMBO J.4，1985，pp.2093-2099)终结子，并发挥作用。表达载体也可在启动子的下游位置和DNA序列***部分的上游位置包含一组RNA剪接部分。较佳的RNA剪接部分可从腺病毒及/或免疫球蛋白基因获取。另外，表达载体在***部分的下游位置包含聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal)。特别是，较佳的聚腺苷酸化信号是来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信号、来自腺病毒5Elb领域的聚腺苷酸化信号或者人体生长激素基因终结子(DeNoto et al.Nucl.Acids Res.9：3719-3730，1981)。表达载体还可在启动子和RNA剪接部位之间包含腺病毒2三联先导序列(tripatiiteleader sequence)等非编码病毒先导序列，并可包含SV40增强子等增强子序列。

为了将本发明的蛋白质导向宿主细胞的分泌渠道，可对重组载体提供分泌信号序列(也可称之为“先导肽序列”、“prepro序列”或“pre序列”)。分泌信号序列以正确的读码框(reading frame)结合于肽编码DNA序列。分泌信号序列通常位于肽编码序列中5’端。分泌信号序列可与肽正常结合，或者可起源于其他分泌序列的编码基因。为了从酵母细胞分泌蛋白质，只要是能够通过细胞分泌渠道可充分表达多肽的分泌信号序列均可使用。信号肽可以是天然信号肽或者其功能上的一部分，也可以是合成肽。合适的信号肽是α-因子信号肽(美国专利第4,870,008号)、老鼠唾液淀粉酶(O.Hagenbuchle et al.，Nature 289，1981，pp.643-646)、变形羧肽酶(carboxypeptidase)信号肽(L.A.Valls et al.，Cell 48，1987，pp.887-897)、酵母BAR1信号肽(PCT/WO 87/02670)或酵母天门冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(M.Egel-Mitani et al.，Yeast 6，1990，pp.127-137)。为了从酵母充分分泌蛋白质，前导肽编码序列可***信号序列的下游和编码DNA序列的上游。前导肽的功能是，促使为了向培养基分泌而表达的肽，从内质网(endoplasmic reticulum)移向高尔基体(Golgi complex)和分泌囊(即，蛋白质沿着细胞壁或经由细胞膜分泌到细胞质周围。)。前导肽可以是酵母α-因子前导肽(美国专利第4,546,082号、美国专利第4,870,008号、EP123294、EP123544及EP163529)，或者也可以是合成前导肽。所述合成前导肽可通过如PCT/WO89/02463或W92/11378所公开的方法制备。在真菌中使用的信号肽较方便的来源是曲霉菌(Aspergillus)种淀粉酶、糖化酶编码基因、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶编码基因。在昆虫中使用的信号肽较方便的来源是Lipidoptera Manduca sexta adipokinetic激素前驱信号肽(美国专利第5,023,328号)等昆虫基因(PCT/WO90/05783)。

对哺乳动物进行DNA序列转染(transfection)及表达的方法如文献[Kaufman and Sharp，J.Mol.Biol.159(1982)，601-621；Southern andBerg，J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341；Loyter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)，422-426；Wigler et al.，Cell 14(1978)，725；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics 7(1981)，603，Graham and van der Eb，Virology 52(1973)，456；Neumann et al.，EMBO J.1(1982)，841-845]所述。被复制的DNA序列通过磷酸钙(Wigleret al.，Cell 14：725-732，1978；Corsaro and Pearson，Somatic CellGenetics 7：603-616，1981；Graham and Van der Eb，Virology52d：456-467，1973)或者通过电穿孔(Neumann et al.，EMBO J.1：841-845，1982)方式***经培养的哺乳动物细胞内。为了筛选出表达外源DNA的细胞，提供选择表现型(筛选标记)的基因一般和相应基因或cDNA一同进入细胞内。较佳的筛选标记包括对新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycine)及甲氨蝶呤(methotrexate)等药物具有耐受性的基因。筛选标记可以是可放大性筛选标记。较佳的放大性筛选标记是二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)序列。筛选标记可与相应基因进入不同的质粒内，或者与相应基因一同进入相同的质粒内。如果筛选标记和相应基因进入同一个质粒，则筛选标记和相应基因可受不同启动子或同一个启动子的调节，而后者可产生双顺反子(dicistronic)信息。这种类型的制备产物是已公开的技术(美国专利第4,713,339号)。另外，向细胞内***物质时，如果把另外的传递体DNA追加于混合物中，将有利于基因转染。

细胞吸收DNA后在适当的培养基中培养1-2天后即开始表达相应基因。所谓“适当的培养基”是指，含有对细胞的成长及相应蛋白质的表达所必需的营养素及其他成分的培养基。一般来说，培养基包含碳源、氮源、必要氨基酸、必要糖、维生素、盐、磷脂质、蛋白质及生长因子。为了生成γ-羧化蛋白质，培养基含有维生素K，其较佳浓度约为0.1-5mug/ml。之后，利用合适的药物筛选方式，筛选出在药物条件下生长、并稳定地表达筛选标记的细胞。对于以放大性筛选标记转柒的细胞，可通过增加药物浓度来筛选出序列复制量多的细胞，并以此来加强表达水平。接着，从稳定转染的克隆细胞中筛选出表达相应蛋白质的细胞。

将导入相应的肽编码DNA序列的宿主细胞，只要是在转录后能够生成变形肽的细胞均可使用，其包含酵母、真菌及高级真核细胞。本发明所使用的哺乳动物细胞株可以是COS-1(ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)及293(ATCC CRL 1573；Graham et al.，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞株，较佳的BHK细胞株是tk-ts13BHK细胞株(ATCC CRL 10314)(Waechterand Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：1106-1110，1982)。另外，还可以使用其他细胞株，如白鼠Hep I(白鼠肝肿瘤；ATCC CRL 1600)、白鼠Hep II(白鼠肝肿瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)、CHO(ATCC CCL 61)及DUKX细胞(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，1980)。较适合的酵母菌有，Saccaromyces种或裂殖酵母菌种(Schizosaccharomyces)细胞，尤其是酿酒酵母(Saccaromycescerevisiae)或Saccharomyces kluyveri。美国专利第4,599,311、第4,870,008、第5,037,743及第4,845,075号公开了利用异种DNA转化酵母细胞，生成异种多肽的方法。转基因细胞通过筛选标记筛选，所述筛选标记通常是在没有耐药性或者在没有亮氨酸(leucine)等特定营养素的条件下可生长的表现型。较佳的酵母载体是公开在美国专利第4,931,373号的POT1载体。其他丝状菌细胞是，如曲霉菌种(Aspergillus)、链孢霉种(neurospora)、镰刀酶菌种(Fusarium)或株木霉种(Trichoderma)等，尤其是A.oryzae、A.nidulans或A.niger细胞株。在欧洲专利EP 272277、EP 238 023及EP 184 438等中记载了通过曲霉菌种的蛋白质表达技术。F.oxysporum的转化可按照记载在文献[Malardier et al.，1989，Gene78：147-156]中的方法实施。株木霉种(Trichoderma)的转化可按照记载在欧洲专利EP 244 234的方法实施。将丝状菌作为宿主细胞使用时，较简便的方法是通过将DNA制备产物***于宿主染色体，以获得重组宿主细胞。这种向染色体内的***，具有可使DNA序列稳定地维持在细胞内的优点。将DNA制备产物组合于宿主染色体内，其可按照通常的方法，即按照同种或异种重组方式去实施。昆虫细胞的转化及异种多肽的生成可按照美国专利第4,745,051号、第4,879,236号、第5,155,037号、第5,162,222号及欧洲专利EP 397,485实施。作为宿主使用的昆虫细胞株，以最好是Spodoptera frugiperda细胞或Trichoplusia ni细胞等鳞翅类(Lepidoptera)细胞株(美国专利第5,077,214号)。较佳的培养条件可以是PCT WO89/01029或WO89/01028中所述的条件。

在容许表达蛋白质的条件下，可在适当的营养培养基中培养上述转基因或转染宿主细胞后，从培养物中回收所生成的全部或部分蛋白质。为培养细胞而使用的培养基可以是适于培养宿主细胞的通常的培养基，例如，含有适当添加剂的最小或复合培养基，合适的培养基可由制造商购买，或者可按照公知技术制造(如，ATCC型录)。接着，按照通常的步骤，可从培养基回收由细胞生成的蛋白质。通常的步骤包括：1、通过离心分离或过滤方式，从培养基分离宿主细胞；2、通过加入盐类(如硫酸氨)，沉淀上清液或过滤液中的水溶性蛋白质成分；3、利用各种层析法(如，离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等)，进行精制。

按照本发明所使用的Axl抗体可以是多克隆(polyclonal)或单克隆(monoclonal)抗体。Axl抗体可由Santa Cruz Biotech购买。此外，在本发明中所使用的抗体可按照公知方法制备。

多克隆抗体(polyclonal antibodies)可通过对动物皮下或腹腔内多次注入抗原和助剂而获得。制备抗体较有效的方法是，通过血清诱导剂(如，MALEIMIDO Benzoyl Sulfosuccimide ester)，在需进行免疫的种群中，对免疫源性蛋白(如，钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole-limpet hemocyanin))结合相关抗原来制备。

对动物的抗原、免疫源性结合体或诱导体，可通过把100g或5g的蛋白质或结合体(分别是兔子或老鼠)，和三次接种份量的弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)配制后，在不同的部位经皮注射上述溶液而进行免疫。一个月后，将弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)中肽或结合体最初使用量的1/5至1/10的量，以皮下注射方式接种于动物身上各部位。7至14日后，从动物身上采血，并对血清进行抗体效价鉴定(Antibody Identification)。

之后以最低浓度到最高浓度顺序，对动物进行接种。所述接种，最好是利用相同抗原的结合体进行，但也可以将该抗体和其他蛋白质及/或其他交联试剂结合使用。另外，结合体是蛋白质融合物，其可通过培养重组细胞而制备。另外，为了增强免疫反应，可适当使用明矾(Alum)等凝固剂。

单克隆抗体实际上从均匀的抗体群中获得。即，除了有可能发生的少数自然突变之外，该群中每个抗体均一致。因此，变形单克隆抗体并不是每个抗体的混合物，表现出只识别一种抗原的特性。例如，单克隆抗体可按照文献[Kohler et al.，Nature，256：495(1975)]中记载的杂交瘤方法(hybridoma)制备，或者通过DNA重组方法(美国专利第4,816,567号)制备。杂交瘤方法中，老鼠或其他适当的宿主动物(如仓鼠(hamster))经过上述免疫过程后，产生和用于免疫化的蛋白质进行特异性结合的抗体，或者诱发淋巴细胞生成该抗体。另一种杂交瘤方法是，在试管中对淋巴细胞进行免疫化后，使用聚乙二醇等适当的融合剂，将该淋巴细胞和骨髓瘤(myeloma)细胞相融合而形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，pp.59 103(Academic Press，1986))。通过上述方法制备的杂交瘤细胞，最好在含有至少一种对非融合骨髓瘤母细胞的生长及生存具有抑制作用的培养基中进行培养。例如，如果骨髓瘤母细胞不含有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguanine phosphoribosyl transferase，HGPRT或HPRT)，典型的杂交瘤细胞培养基应该包含次黄嘌呤(Hypoxantine)、氨基喋呤(aminopterin)及胸腺嘧啶(thymidine)(HAT培养基)。

这些物质抑制缺乏HGPRT的细胞的成长。较佳的骨髓瘤细胞应是可有效地进行融合，并可藉由被选择的抗体生成细胞，支持稳定而高水平的抗体生成，而且对如HAT等培养基敏感反应的细胞。其中，较佳的骨髓瘤细胞株是老鼠的骨髓瘤细胞株，如，可由美国加利福尼亚州圣地牙的SalkInstitute Cell Distribution Center获取的MOPC-21及PMC-11老鼠肿瘤、以及可由美国ATCC获取的SP-2或X63-Ag8-653细胞。人体骨髓瘤及老鼠-人体异种骨髓瘤细胞株又可以用于生成人体单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；and Brodeur et al.，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51 63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。对杂交瘤细胞培养基进行检测，观察对抗原的单克隆抗体的生成情况。检测时，由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性，最好是通过免疫沉降法，或者通过如放射能免疫测定或酶-连接免疫吸附测定等试管结合测定法来确定。单克隆抗体的结合亲和性，可通过文献[Munson et al.，Anal.Biochem.，107：220(1980)]所述的Scatchard分析法来确定。筛选出可生成具有预期的特异性、亲和性及/或者活性的抗体的杂交瘤细胞后，通过有限稀释法进行亚克隆而获得克隆细胞，之后用标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59 103(Academic Press，1986))进行培育。适于这一目的的培养基是如D-MEM或RPMI-1640等培养基。此外，杂交瘤细胞可作为腹水肿瘤，在动物生体内进行培育。通过亚克隆而分泌的单克隆抗体根据如蛋白质A-琼脂糖凝胶(A-Sepharose)、羟磷灰石(HYDROXYLAPATITE)层析法、凝胶电泳、透析或亲和性层析法等通常的抗体精制过程，由培养基、腹水液或血清予以分离。

造血母细胞具有自体再生能力，是某一个体平生受任的前驱细胞(committed progenitor cell)的起源。未受任或受任的造血母细胞一般特征是，其可表达CD34抗原，所述CD34抗原可通过利用CD34单克隆抗体进行的荧光激活细胞分选器(下称FACS)检测。

造血母细胞源于骨髓、末梢血液、脐带血等。脐带血是造血母细胞最丰富的来源。分娩后直接从胎盘获得的脐带血富含造血母细胞，而这些造血母细胞比骨髓及末梢血液所提供的细胞具有更强的增殖力。如注入颗粒细胞集落刺激因子等红细胞生成素(Erythropoietin)，可以较好地促进CD34⁺细胞的活性(Beyer J et al.，Hematopoietic rescue after high-dosechemotherapy using autologous peripheral-blood progenitor cells orbone marrow：a randomized comparison.J Clin Oncol1995；13：1328-1335；and Smith TJ et al.，Economic analysis of arandomized clinical trial to compare filgrastim-mobilizedperipheral-blood progenitor-cell trnasplantation and autologousbone marrow transplantation in patients with Hodgkin′s andnon-Hodgkin′s lymphoma.J Clin Oncol 1997；15：5-10)。在造血母细胞的提取期间，每天皮下注入300-960ug的颗粒细胞集落刺激因子。造血母细胞的分离及精制有很多方法，其中包括，利用荧光(Preffer FI，et al.，Lineage-negative side-population(SP)cells with restrictedhematopoietic capacity circulate in normal human adult blood：immunophenotypic and functional characterization.STEM CELLS 2002；20：417427)或免疫磁分离技术(Przyborski SA.Isolation of humanembryonal carcinoma stem cells by immunomagnetic sorting.Stem Cells2001；19：500504)，并根据特定细胞表面标记分离细胞的方法；或者在塑料培养皿中利用干细胞variation plating efficiency的方法(Friedenstein AJ，et al.，Fibroblast precursors in normal andirradiated mouse hematopoietic organs.Exp Hematol 1976；4：267274)；还有柱层析分离技术(Huss R.Isolation of primary and immortalizedCD34 hematopoietic and Mesenchymal stem cells from various sources.STEMCELLS 2000；18：19)。

为了激活成熟自然杀伤细胞，使用白细胞间介素-2已不是鲜为人知的技术。目前公开的白细胞间介素-2的处理方法有两种，一种是，直接把白细胞间介素-2注入到患者体内，并通过所注入的白细胞间介素-2，在生体内增殖自然杀伤细胞，并使之活性化的方式；另一种是，从患者身上采血，并由血液中分离出成熟自然杀伤细胞后，利用白细胞间介素-2激活该细胞，之后再把被激活的成熟自然杀伤细胞注入到患者体内的方式。这两种方法的目的均在于，通过白细胞间介素-2激活自然杀伤细胞，并通过被激活的自然杀伤细胞破坏癌细胞。但这两种方法由于使用高浓度(约150ng/ml)的白细胞间介素-2，因此伴随着副作用。这两种方式所引发的副作用有，剧毒性、发热及肺浮肿，还可能导致昏撅现象。而产生这些副作用的原因是，白细胞间介素-2刺激T淋巴细胞生成肿瘤坏死因子、干扰素-γ等其他细胞***素，而这些细胞***素作用于血管内皮及其他细胞。为了解决上述问题，人们正研究使用低浓度白细胞间介素-2进行处理的方法，但尚没有得到令人满意的研究结果(M.J.Smyth，Y.Hayakawa，K.Takeda，H.Yagita，NatRev Cancer.2，850，2002；M.A.Caligiuri，et al.，J.Exp.Med.171，1509，1990)。

根据本发明，即便使用约8-15ng/ml的少量白细胞间介素-2处理经分化的成熟自然杀伤细胞，也能够给成熟自然杀伤细胞以充分的刺激，以使其活性化。白细胞间介素-2较佳使用量约为10ng/ml。据观察，在这一程度的低使用量下，被激活的成熟自然杀伤细胞不会引发毒性。细胞的保管可以采用几种方法，最常用的保管方法是超低温保管法(cryopreservation)，另外还可以使用HypoThermosolTM(BioLifeSolutions Inc.)系列及二甲亚砜溶液(dimethyl sulfoxide，DMSO)来予以保管。本发明另一个要点是，在给患者投药的前后，可对本发明的自然杀伤细胞进行超低温保管。美国专利第60168991号公开了超低温保管的代表性方法。在进行小规模超低温保管时，可以200×10⁶/ml的浓度，将细胞重悬浮在预先冷藏的5％人体血清白蛋白(HAS)溶液中，然后，在上述HAS溶液中滴入等量的20％二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。之后以1ml/vial的量，将所得混合物分取在超低温小瓶中，并置放于-80℃的超低温室(NalgeneTM)中，使之冻结一整夜。进行大规模超低温保管时，可以600×10⁶/ml的浓度，将细胞重悬浮在AIM V培养液中，然后，逐渐增加等量的20％AIM V培养液。所得混合物，利用控速冻结***，以20ml/vial的冻结于冻结容器(Cryocyte，Baxter)中。被激活成熟自然杀伤细胞的毒性有效量，可根据试管及生体内的用途、以及杀伤细胞最终目标细胞的量及类型不同而有所不同。

在此，所述“细胞毒性有效量”是指能够使成熟自然杀伤细胞破坏癌细胞的(即，可发挥药理作用的)药物分量。此外，由于上述有效量根据患者的健康状态及病情的轻重有所不同，投药时，专业医生应适当考虑所有的情况而决定投药量。通常，对成人癌患者的每次投药量是10⁶～10¹²个细胞，较佳的投药量是10⁸～10¹¹个细胞，最佳投药量是10⁹～10¹⁰个细胞。根据本发明方法增殖的成熟自然杀伤细胞，可与药学上允许的载体(如，生理盐水溶液)一同注入到患者的皮下、肌肉内、静脉内、硬脑膜(dura mater)内，以进行治疗。使用各种不同的生体材料(细胞传递体)，可提高自然杀伤细胞向目标(target)部分的传递效率及自然杀伤细胞的杀癌效率。细胞传递体有，多糖类系列甲基纤维素(methyl cellulose)(M.C.Tate，D.A.Shear，S.W.Hoffman，D.G.Stein，M.C.LaPlaca，Biomaterials 22，1113，2001)、壳聚糖(Suh JKF，Matthew HWT.Biomaterials，21，2589，2000；Lahi ji A，Sohrabi A，Hungerford DS，et al.，J Biomed Mater Res，51，586，2000)及N-异丙基丙烯酰胺(isopropyl acrylamide)共聚合物系列P(NIPAM-co-AA)(Y.H.Bae，B.Vernon，C.K.Han，S.W.Kim，J.Control.Release 53，249，1998 H.Gappa，M.Baudys，J.J.Koh，S.W.Kim，Y.H.Bae，Tissue Eng.7，35，2001)等，此外还有聚(乙撑氧)/聚(D，L-乳酸-co-乙醇酸)(B.Jeong，K.M.Lee，A.Gutowska，Y.H.An，Biomacromolecules 3，865，2002)、P(PF-co-EG)(Suggs LJ，Mikos AG.Cell Trans，8，345，1999)、PEO/PEG(Mann BK，Gobin AS，Tsai AT，Schmedlen RH，West JL.，Biomaterials，22，3045，2001 Bryant SJ，Anseth KS.Biomaterials，22，619，2001)、聚乙烯醇(PVA)(Chih-Ta Lee，Po-Han Kung and Yu-Der Lee，Carbohydrate Polymers，61，348，2005)、胶原质(Lee CR，Grodzinsky AJ，Spector M.，Biomaterials 22，3145，2001)、藻酸盐(alginate)(Bouhadir KH，Lee KY，Alsberg E，Damm KL，Anderson KW，Mooney DJ.Biotech Prog 17，945，2001 Smidsrd O，Skjak-Braek G.，Trends Biotech，8，71，1990)等。在组织工程中，这些物质均作为用于进行细胞治疗的细胞传递体来使用。

附图说明

图1是公知技术中从老鼠骨髓中分离造血母细胞，并诱导该母细胞分化为成熟自然杀伤细胞的过程示意图(其中，BM表示骨髓；HSC表示造血母细胞；pNK表示前驱自然杀伤细胞；mNK表示成熟自然杀伤细胞)。

图2是按照公知方法，从老鼠骨髓中分离的造血母细胞分化为成熟自然杀伤细胞过程中，对每一阶段细胞纯度进行的FACS分析结果图。

图3是分别对从老鼠骨髓中分离的造血母细胞、由按照公知方法分离的造血母细胞所分化形成的前驱自然杀伤细胞、以及分别在有无OP9基质细胞条件下，培养所述前驱自然杀伤细胞，并由此分化形成的成熟自然杀伤细胞，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)后利用电泳法分析其特异性基因表达的结果图。

图4是通过FACS所进行的，在有无基质细胞(细胞名为OP9)的共同培育条件下，由老鼠前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的最终分化程度分析图。

图5是利用基因表达系列分析法(SAGE)所进行的、在造血母细胞分化为成熟自然杀伤细胞的每一阶段中，每一细胞所表达的特异性基因的挖掘模式图。

图6是在老鼠造血母细胞分化为成熟自然杀伤细胞时，对每一阶段中细胞所表达的Axl所进行的电泳结果及SAGE结果的比较图，其表示两个结果一致。

图7是利用FACS法所进行的、本发明Axl多克隆抗体对老鼠前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的影响分析图。

图8是通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)后电泳分析法所进行的、本发明Axl多克隆抗体对老鼠前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的影响分析图。

图9是利用FACS分析法所进行的、根据本发明在未与基质细胞进行共同培养下，低浓度的白细胞间介素-15及Axl多克隆抗体对老鼠前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的影响分析图。

图10是通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)后电泳分析法所进行的、根据本发明在未与基质细胞进行共同培养下，低浓度的白细胞间介素-15及Axl多克隆抗体对老鼠前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的影响分析图。

图11是本发明Axl多克隆抗体对成熟自然杀伤细胞生成干扰素-γ能力的影响分析图。

图12是本发明Axl多克隆抗体对前驱自然杀伤细胞增殖的影响分析图。

图13是老鼠的重组Gas6对老鼠的自然杀伤细胞分化的影响分析图。

图14是杀鼠灵(Warfarin)对老鼠的自然杀伤细胞分化的影响分析图。

图15是对复制老鼠Gas6 cDNA的本发明重组载体的分析图。

图16是对本发明的重组老鼠Gas6表达载体制备结果的分析图。

图17是对本发明的老鼠Gas6cDNA的复制及表达载体制备结果的分析图。

图18是在本发明的老鼠Gas6转染体中对Gas6表达的分析结果图。

图19是利用FACS法所进行的、本发明老鼠Gas6转染体对老鼠前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的影响分析图。

图20是利用RT-PCR后电泳分析法所进行的、本发明老鼠Gas6转染体对老鼠前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的影响分析图。

图21是本发明的老鼠Gas6转染体对成熟自然杀伤细胞生成干扰素-γ能力的影响分析图。

图22是本发明的老鼠天然(Native)Gas6对前驱自然杀伤细胞增殖的影响分析图。

图23是本发明的老鼠Axl cDNA复制及被复制在逆转录酶病毒载体(pLXSN)的Axl cDNA方向分析图。

图24是本发明的老鼠Axl-Fc表达载体的制备结果分析图。

图25是本发明的老鼠Axl-Fc融合蛋白质对自然杀伤细胞分化的影响分析图。

图26是在本发明中使用的、以自身-惰性(Self-inactivating Lenti)病毒为基础的载体***示意图。

图27是在本发明中使用的双启动子siRNA表达盒(siRNA expressioncassette)与siRNA模板(template)低聚物的结构示意图。

图28是本发明的Axl siRNA复制结果分析图。

图29是对293T细胞被pFIV-U6/H1-GFP病毒感染的感染程度分析图。

图30是对老鼠的造血母细胞及前驱自然杀伤细胞被pFIV-U6/H1-GFP病毒感染的感染程度分析图。

图31是本发明的Axl siRNA对老鼠的自然杀伤细胞分化的影响分析图。

图32是对根据本发明利用Axl多克隆抗体所分化形成的自然杀伤细胞抗癌活性能力的动物实验分析图。

图33是对根据本发明利用Axl多克隆抗体所分化形成的自然杀伤细胞杀癌能力的细胞实验分析图。

图34是通过动物试验所进行的、对经由癌诱变的老鼠身上注入根据本发明通过Axl多克隆抗体分化形成的自然杀伤细胞时老鼠生存率的分析结果图。

图35是表达人体Axl的、本发明重组表达载体pET-hAxl/ECD的示意图。

图36是表达人体Ga s6的、本发明重组表达载体phGas6的示意图。

图37是从人体脐带血分离的造血母细胞在SCF、Flt3-L及白细胞间介素-7的处理下分化成前驱自然杀伤细胞，再于白细胞间介素-15的处理下分化成成熟自然杀伤细胞后，对该成熟自然杀伤细胞所进行的FACS分析结果图。

图38是从人体脐带血分离的造血母细胞在SCF、Flt3-L及白细胞间介素-7的处理下分化成前驱自然杀伤细胞，再于白细胞间介素-15的处理下分化成成熟自然杀伤细胞后，对该成熟自然杀伤细胞的穿孔素及颗粒酶的表达所进行的、RT-PCR后电泳分析结果图。

图39是从人体脐带血分离的造血母细胞在SCF、Flt3-L及白细胞间介素-7的处理下分化成前驱自然杀伤细胞，再于白细胞间介素-15的处理下分化成成熟自然杀伤细胞后，通过细胞实验，对该成熟自然杀伤细胞的杀癌能力所进行的分析结果图。

图40是根据本发明从人体脐带血分离的造血母细胞分化成前驱自然杀伤细胞，再于人体Axl多克隆抗体的处理下分化成成熟自然杀伤细胞后，对该成熟自然杀伤细胞所进行的FACS分析结果图。

图41是根据本发明从人体末梢血液分离的造血母细胞分化成前驱自然杀伤细胞，再于人体Axl多克隆抗体的处理下分化成成熟自然杀伤细胞后，对该成熟自然杀伤细胞所进行的FACS分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明进行更为详细的说明。本发明的实施例只是对本发明的较佳实施方式，而不是用来限定本发明的保护范围。

实施例1.挖掘老鼠的自然杀伤细胞分化的每一阶段中所表达的特定基因

(A)从老鼠的骨髓中分离造血母细胞的方法及自然杀伤细胞的分化方法

从生后8-12周龄的老鼠(C57BL/6，从Korea Reasearch Bioscience andBiotechnology购买后，在无菌状态下按照动物管理指南予以管理)全部骨头中分离出骨髓细胞后，用细胞溶解缓冲液(0.2％NaCl、1.6％NaCl)除去红细胞，之后在冰中将细胞和2.4G2上清液反应10分钟后，利用含2mM EDTA的磷酸盐缓冲液(buffer A)予以清洗。接着将细胞悬浮于缓冲液A(1X108/500μl)，并加以附有维生素H(biotin)的抗体混合物(antibodycocktail)(Mac-1，Gr-1，B220，NK 1.1，CD2，TER-119，Pharmingen)后，在4℃温度下反应10分钟，然后用缓冲液A清洗所述细胞后，对1×10⁸细胞加以900μl缓冲液A和100μl抗生物素蛋白(streptavidin)-微珠载体(microbeads)(Miltenyi Biotec)，之后在4℃温度下将其反应15分钟。清洗细胞后，将其悬浮于MACS(免疫磁珠细胞分选器)缓冲液(含有2mM EDTA和0.5％BSA的磷酸盐缓冲液)中后，用尼龙筛网(70μm)过滤。将磁式分离柱(CS column，Miltenyi Biotech)设置在超大MACS上，之后让标有磁珠的细胞通过后，用MACS缓冲液充分洗涤磁柱，接着对经过磁柱的液体进行离心分离，获得Lin^-细胞。对Lin^-细胞(1×10⁷)加以标有FITC的抗-c-kit(Pharmingen)，并使之在4℃温度下反应10分钟后进行洗涤，之后重新和抗-FITC微珠载体(Miltenyi Biotec)在4℃温度下反应15分钟后，将其悬浮于500μl的MACS缓冲液，之后在磁场内使之通过MS磁柱。接着，充分洗涤磁柱，用1ml的MACS缓冲液推出并获得c-kit⁺细胞后，将所得c-kit⁺细胞作为造血母细胞使用。为了将经过如上步骤分离得出的造血母细胞分化为前驱自然杀伤细胞，每隔三天，将培养基的一半更新为含有干细胞因子(30ng/ml，Biosource)、白细胞间介素-7(0.5ng/ml，PeproTech)、Flt3配体(50ng/ml，PeproTech)、吲哚美辛(2μg/ml，Sigma)、庆大霉素(2μg/ml，Sigma)的RPMI(Gibco)培养基，并以1×10⁶/ml浓度，将所述细胞培养在24孔培养板(24 well plate)中。如此，添加上述细胞***素培养6天后，添加CD122-FITC抗体和multisort微珠载体，并使之反应后进行MACS分离而获得CD122⁺前驱自然杀伤细胞。为了使前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞，重新利用含白细胞间介素-15(20ng/ml)、吲哚美辛(2μg/ml)、庆大霉素(2μg/ml)的RPMI培养基培养6天后通过以下两种方法进行分化，即，一种是，在与基质细胞(ATCC)进行共同培养(co-culture)下，使前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞(mature NK-2)；另一种是在未与基质细胞进行共同培养下，使之分化成未完全成熟的自然杀伤细胞(mature NK-1)。通过上述两种方法，获得细胞后，分析自然杀伤细胞表面分子的表达(图1)。

(B)老鼠造血母细胞及其分化为成熟自然杀伤细胞各阶段中被分离细胞的纯度

按照实施例1(A)所述的方法，从生后8-12周龄的8只老鼠(C57BL/6)中获取2×10⁸个全部骨髓细胞后，从中分离出4×10⁶个Lin^-、c-kit⁺造血母细胞。由所述造血母细胞中获取CD122⁺前驱自然杀伤细胞后，在添加有白细胞间介素-15的条件下，将其与基质细胞进行共同培养(+OP9)或者进行单独培养(-OP9)，从而获得两种类型成熟自然杀伤细胞后，通过以下方法分析在每个分化阶段中的细胞纯度(purity)。为了通过对各种细胞表面分子的抗体，对从造血母细胞到成熟自然杀伤细胞每个分化阶段中的细胞特性进行免疫染色，将细胞调节成1×10⁶，并以染色缓冲液(含有20mMHEPES、3％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、0.1％NaN₃的磷酸盐缓冲液，pH 7.4)清洗一次。之后将FITC(fluoresceinated isothiocyanate，附有荧光素(fluorescein)的异硫氰酸酯(isothiocyanates))或结合有PE(phycoerythrin，藻红蛋白)荧光物质的自然杀伤细胞各分化阶段标记(细胞标识)，即c-kit(Pharmingen)、lineage(Pharmingen)、NK1.1(Pharmingen)、CD122(Pharmingen)等抗体添加于细胞样品中，并使之于0℃下反应30分钟后用染色缓冲液洗涤二次，之后进行FACS(BD/Aria)分析。而进行FACS分析时，造血母细胞使用了c-kit和lineage(Pharmingen)标记(c-kit⁺Lin^-)，前驱自然杀伤细胞(CD122⁺NK1.1^-)和成熟自然杀伤细胞(CD122⁺NK1.1⁺)使用了CD122(Pharmingen)和NK1.1(Pharmingen)抗体。结果发现，各阶段的获得率分别为，造血母细胞为96％，前驱自然杀伤细胞为95％，成熟自然杀伤细胞(-OP9)为94％，成熟自然杀伤细胞(+OP9)为96％(图2)。

(C)老鼠自然杀伤细胞中特异性表达基因的确认

利用上述所得细胞，并通过逆转录聚合酶链反应(Reversetranscriptase-polymerase chain reaction)确认自然杀伤细胞中特异性表达基因CD122和穿孔素的表达。逆转录聚合酶链反应可通过以下方法进行。为了从每个细胞中获得全部RNA，将2×10⁶的LK1细胞用磷酸盐缓冲液清洗一次后，将500μl的RNA分离液(RNAzol B，TEL-TEST)添加于每个样品后轻柔地进行移液，从而裂解细胞后放入50μl氯仿(chloroform)，并将此均匀搅拌后在冰中静置5分钟。接着在4℃温度下，以12,000rpm的转速离心15分钟后提取上清液，并加入同量的异丙醇(isopropyl alcohol)后，在冰中静置20分钟。之后，再于4℃温度下，以12,000rpm的转速离心20分钟后，将其沉淀用80％乙醇进行洗涤及干燥后，加入含0.1％焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate)的20μl水，并进行均匀溶解。从如此获得的RNA，通过MMLV逆转录脢(Roche)合成出单股cDNA，并以此作为模板，分别利用基因特异性引物CD122：5′-gtcgacgctcctctcagctgtgatggctaccata-3′及5′-ggatcccagaagacgtctacgggcctcaaat tccaa-3′；穿孔素：5′-gtcacgtcgaagtacttggtg-3′及5′-aaccagccacatagcacacat-3′；β-肌动蛋白(β-actin)：5′-gtggggcgccccaggcacca-3′及5′-ctccttaatgtcacgcacgatttc-3′，进行如下逆转录聚合酶链反应。在42℃温度下，使5μl的5x反应缓冲液(Roche)、2μl的dNTP(分别为5μM的dATP、dCTP、dGTP、TTP，Roche)、1μl的3′引物(20pmol)、1μl蒸馏水、10μl全部细胞RNA、1μl逆转录酶(200U)的混合物(总量为20μl)反应30分钟后，在90℃下停止反应5分钟。在如此获得的反应生成物中，加入如下试剂以进行聚合酶链反应。即，将20μl的上述反应生成物、8μl的聚合酶链反应10x缓冲液(Roche)、1μl的5′引物(20pmol)、1μl的3′引物(20pmol)、69μl的蒸馏水、1μl的Taq聚合酶(Takara)(2.5U)的反应生成物(总量为100μl)在95℃下静置5分钟，由此抑制某些其他酶的活性后，依次在95℃、55℃、72℃温度下反应90秒、1分钟、2分钟，并将此过程重复进行30次，最后，依次在95℃、55℃、72℃温度下反应90秒、1分钟、5分钟。从如此获得的反应生成物中取10μl，并将其在1％琼脂糖凝胶中，在100V电压下进行电泳30分钟。结果发现，每一分化阶段中细胞的表达形态和以往研究中所确认的CD122及穿孔素的表达形态相同。在成熟自然杀伤细胞中CD122的表达多于在前驱自然杀伤细胞中CD122的表达，而在与基质细胞的共同培养下，发现有更多的表达。至于穿孔素，其在成熟自然杀伤细胞中得以表达，而在与基质细胞的共同培养下，发现其表达有所增加(图3)。

(D)在与老鼠基质细胞进行共同培养下和未进行共同培养下的成熟自然杀伤细胞的分化程度

利用上述成熟自然杀伤细胞(-OP9及+OP9)，并利用NK1.1及Ly49抗体(Pharmingen)，通过如(B)所述的FACS，分析比较成熟自然杀伤细胞表面分子(NK1.1及Ly49)的表达。在由白细胞间介素-15进行处理的条件下，与基质细胞进行共同培养的前驱自然杀伤细胞所分化形成的成熟自然杀伤细胞，可表达未与基质细胞进行共同培养下分化形成的细胞所没有表达的NK1.1及Ly49细胞表面分子，由此可知，基质细胞对自然杀伤细胞的最终分化具有不可缺少的作用及特异性。与基质细胞进行共同培养下分化形成的成熟自然杀伤细胞中，Ly49A⁺NK1.1⁺细胞的获得率为1.2％、Ly49C/I⁺NK1.1⁺细胞的获得率为25％、Ly49D⁺NK1.1⁺细胞的获得率为2.1％、Ly49G2⁺NK1.1⁺细胞的获得率为30％。而在未与基质细胞进行共同培养下，没有获得具有上述特征的成熟自然杀伤细胞(图4)。

(E)通过SAGE，挖掘老鼠成熟自然杀伤细胞的分化诱导物质

为了挖掘经分离的造血母细胞、前驱自然杀伤细胞以及由两种成熟自然杀伤细胞在细胞分化的各个阶段中特异性表达的基因，进行基因表达系列分析(Serial Analysis of gene expression，SAGE)(图5)。通过如(C)所述的方法，从每个分化阶段中的细胞，即造血母细胞、前驱自然杀伤细胞以及两种成熟自然杀伤细胞分离出全部RNA，并取每一细胞的RNA 5μg，使之与oligo(dT)25微珠(Dynal A.S.)进行反应而分离出mRNA。利用所分离的mRNA及在5′端上具有维生素H、在3′端上具有寡聚(dT)的引物，并通过cDNA合成试剂盒(Life Technology)合成出cDNA。利用T4DNA连接酶连接cDNA和与其进行反应的SAGE标签，并利用T4DNA连接酶(Roche)，将该反应生成物***于用限制性内切酶sphI(Roche)处理过的pZero-1载体(Invitrogen)内。利用M13F引物和M13R引物，进行如(C)所述的聚合酶链反应，获得反应生成物。之后，利用Big-Dye测序试剂盒(sequencingkit)与ABI1377测序仪(Perkin-elmer Applied Biosystems)，对上述反应生成物进行碱基序列分析。利用SAGE 300软件，提取标签序列。参考SAGE标签数据库由基因序列数据库(GenBank)中已知老鼠表达序列构成，而这些序列在各转录因子方向(orientation)、poly(A)信号(0AATAAA，EH为ATTAAA)、poly(A)tail及序列末端具有CATG剪接部位。通过计算机程序，即GIST(Gene Identification and Sequence Topography)，并利用SAGE标签和参考SAGE数据库进行分析。结果发现，仅在前驱自然杀伤细胞中表达，但没有在其他分化阶段中表达的基因中，Axl基因仅在这一细胞中特异性表达，且数量很多(表1)。对数据统计分析的显著性水平(p-value)是通过paired Student t test软件进行分析(可适用实施例中所有数据)，而对SAGE标签表达的评价是通过“v2，Audic，and Claverie method”(http://telethon.bio.unipd.it/bioinfo/IDEG6_form，一种统计软件名称)进行分析。

【表1】前驱自然杀伤细胞中的特异性表达基因

通过如(C)所述的逆转录聚合酶链反应分析前驱自然杀伤细胞中上述基因表达是否与SAGE结果相一致，结果发现SAGE标签数与Axl的表达相一致。即，在前驱自然杀伤细胞中，增加了Axl的表达数量(图6)。

实施例2.Axl多克隆抗体对自然杀伤细胞分化的影响

(A)在与基质细胞进行共同培养下，由Axl多克隆抗体所刺激分化的成熟自然杀伤细胞特异性受体的表达：

在老鼠造血母细胞分化为自然杀伤细胞的过程中，用1μg的Axl多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.sc-1096)处理前驱自然杀伤细胞(7天)，之后利用如实施例1所述的方法，在添加有白细胞间介素-15(40ng/ml)的条件下，将所述前驱自然杀伤细胞与基质细胞共同培养6天，由此前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞后，用NK1.1抗体及对自然杀伤细胞特异性受体的抗体(Ly49G2、Ly49A、Ly49C/F/I、Pharmingen)染色所得成熟自然杀伤细胞，之后以实施例1(B)所述方法进行FACS分析。结果发现，和经过山羊抗体(goat Ig，R&D)处理的对照组与未经过该处理的对照组(即通过实施例1(B)所述方法获得的组群)相比，经过Axl多克隆抗体处理的细胞中，Ly49A⁺NK1.1⁺细胞含量由1.2％增至3.2％、Ly49C/I⁺NK1.1⁺细胞含量由1％增至3.5％、Ly49G⁺NK1.1⁺细胞含量由1.2％增至3.2％，即成熟自然杀伤细胞的完全分化程度约为2倍左右，说明Axl多克隆抗体对自然杀伤细胞的分化具有一定的影响(图7)。

(B)在与基质细胞进行共同培养下，由Axl多克隆抗体所刺激分化的成熟自然杀伤细胞特异性基因的表达：

通过如实施例1(C)中所述的逆转录聚合酶链反应，从与(A)相同条件下的自然杀伤细胞分析，和自然杀伤细胞相关的基因表达(即，干扰素-γ：5′-agcggctgactgaactcagattg-3′及5′-gcacagttttcagctctatagg-3′；白细胞间介素-15Ra：5′-ccaacatggcctcgccgcagct-3′及5′-ttgtagagaaagcttctggctc-3′；白细胞间介素-18：5′-aggtacaaccgcagtaatacgg-3′及5′-agtgaacattacagatttatccc-3′；以及穿孔素：5′-gtcacgtcgaagtacttggtg-3′及5′-aaccagccacatagcacacat-3′的表达)。结果发现，经过Axl多克隆抗体处理的细胞中上述基因的表达量多于经过山羊抗体处理的对照组，由此确认到如果通过Axl多克隆抗体的处理，就会增加成熟自然杀伤细胞的完全分化程度(图8)。

(C)在未与基质细胞进行共同培养下，由Axl多克隆抗体所刺激分化的成熟自然杀伤细胞特异性受体的表达：

为了确认在其他条件下由Axl多克隆抗体所刺激分化的成熟自然杀伤细胞的分化效果，在未与基质细胞进行共同培养下，以更小浓度的白细胞间介素-15(25ng/ml)及Axl多克隆抗体(Polyclonal antibody)(500ng/ml)直接处理前驱自然杀伤细胞的同时，将其贴附于培养皿上并予以固定后，用NK1.1抗体及对自然杀伤细胞特异性受体的抗体(即Ly49G2、Ly49A、Ly49C/F/I、NKG2A/C/E)对其进行染色，之后通过如实施例1(B)所述的方法对成熟自然杀伤细胞的分化程度进行FACS分析。结果发现，在未与基质细胞共同培养的条件下，和没有经过Axl多克隆抗体处理时相比，经过Axl多克隆抗体处理的细胞中Ly49A+NK1.1⁺细胞含量由8.4％增至9.8％及9.3％、Ly49C/F/I⁺NK1.1⁺细胞含量由2.5％增至4％及5.3％、NKG2A/C/E⁺NK1.1⁺细胞含量由9.3％增至18％及16％(图9)。

(D)在未与基质细胞进行共同培养下，由Axl多克隆抗体所刺激分化的成熟自然杀伤细胞特异性基因的表达：

通过如实施例1(C)所述的逆转录聚合酶链反应，从与实施例2(C)相同条件下的自然杀伤细胞中，分析和自然杀伤细胞相关的基因表达(即，CD122、穿孔素及颗粒酶b的表达)。结果发现，经过Axl多克隆抗体处理的细胞中上述基因的表达量多于对照组中的表达，由此确认到即使在未与基质细胞的共同培养下，经过Axl多克隆抗体的处理，也会增加成熟自然杀伤细胞的完全分化程度(图10)。

实施例3.Axl多克隆抗体对自然杀伤细胞的干扰素-γ生成的影响

将由实施例1(B)所获得的前驱自然杀伤细胞，在有Axl多克隆抗体(500ng/ml)、白细胞间介素-15(10ng/ml)的条件下，和基质细胞进行共同培养，由此获得成熟自然杀伤细胞后，用人体白细胞间介素-2(10ng/ml，R&D)处理并激活所述成熟自然杀伤细胞的活性。24小时后，利用干扰素-γ酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(BD Pharmingen)，检测干扰素-γ的生成量，结果发现，经过Axl多克隆抗体处理的实验组的干扰素-γ的生成量多于对照组(图11)。

实施例4.Axl多克隆抗体对前驱自然杀伤细胞增殖的影响

将基质细胞以1×10⁴的数平铺于96孔微型培养板中，一天后将由实施例1(B)所获得的前驱自然杀伤细胞分株成每一孔中的细胞数为2.5×10⁴。在均包含白细胞间介素-15(25ng/ml)的条件下，分别用500ng/ml的山羊抗体、Axl多克隆抗体(a-Axl)和Axl-Ig处理前驱自然杀伤细胞，接着在48小时后，通过MTS检测法(CellTiter 96AQueous Assay，Promega，Madison，WI)分析前驱自然杀伤细胞的增殖程度。所述MTS检测是利用四唑(tetrazolium)化合物[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt；MTS]及电子耦合(electron-coupling)试剂，即吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)所进行的显色分析法，其在细胞培养的最后一天，在每一孔中分别加入0.025ml的MTS/PMS混合液，并使其反应30分钟后，在495nm波长下通过酶联免疫分析测读仪(ELISA Reader)(Molecular Devices Co.Sunnyvale，CA，USA)检测吸光度。结果发现，经过Axl多克隆抗体处理的前驱自然杀伤细胞的增殖量比未经过Axl多克隆抗体处理的对照组大两倍，而利用Axl-Ig处理时，前驱自然杀伤细胞的增殖量减少，由此可见，经由Axl多克隆抗体的Axl信号传递对前驱自然杀伤细胞的增殖具有重大作用(图12)。

实施例5.Axl及其配体Gas6的相互作用对自然杀伤细胞分化的影响

为了了解Gas6及Axl的结合所进行的信号传递对自然杀伤细胞分化的影响，在细胞分化过程中利用老鼠重组Gas6(500ng/ml，R&D)进行处理。结果发现，老鼠重组Gas6对自然杀伤细胞的分化并没有产生大的影响(图13)。由此判断为了使Gas6发挥生物活性，需要进行γ-羧化反应。在这一认识基础上，在以后实验中使用了在基质细胞中表达的Gas6。为了抑制Gas6作为前驱自然杀伤细胞中表达的Axl的配体起作用，使用杀鼠灵(Sigma)检测其对Axl信号传递的影响。将造血母细胞分化成前驱自然Axl多克隆抗体杀伤细胞后，使用25ng/ml的白细胞间介素-15，并分别使用1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml的杀鼠灵进行处理后，和基质细胞(2×10⁴)共同培养七天，然后通过如实施例1(B)所述的FACS分析仪分析由前驱自然杀伤细胞向成熟自然杀伤细胞的分化程度。结果发现，在自然杀伤细胞中特异性表达的NK1.1、NKG2A/C/E及Ly49C/F/H/I等受体随着杀鼠灵浓度的增加而减少(NK1.1⁺NKG2A/C/E⁺依次减少为25％、16％、16％、8.8％；NK1.1⁺Ly49C/F/H/I⁺依次减少为2.3％、1.9％、1.6％、0.5％。)(图14)。从这一结果可看出，Axl及其配体Gas6的相互作用对前驱自然杀伤细胞向成熟自然杀伤细胞的分化中起到重大作用。

实施例6.老鼠的Gas6表达载体及逆转录酶病毒载体(retrovirusvector)的制备

为了获得活性化Gas6，利用从老鼠的基质细胞分离的RNA及Gas6引物(5′-ggcctcgagcatgccgccaccgcccgggc-3′及5′-ggcgaattccggtctagggggtggca tgc-3′)，进行如实施例1(C)所述之逆转录聚合酶链反应，由此放大Gas6 cDNA(100ng)后，将其复制到用限制性内切酶EcoRI(1U，Roche)处理过的pCR4-TOPO(50ng，Invitrogen)中(图15)。对复制产物进行碱基序列分析后，从中选择具有和参考碱基序列(gene ID；AK086187)相同碱基序列的复制产物的cDNA，并将其使用在老鼠的Gas6表达载体及逆转录酶病毒载体的制备上。用EcoRI(1U)处理逆转录酶病毒载体pLXSN(Invitrogen)后，对其***经由对pCR4-Gas6#8进行EcoRI(1U)限制性内切酶的处理(50ng)而分离得到的老鼠Gas6 cDNA(100ng)，并利用T4DNA连接酶(1U，Roche)予以连接而获得重组pLXSN-Gas6(图16，左侧)。而且，通过EcoRI(1U)及CIP酶(小牛肠内磷酸酶)(1U)处理pcDNA 3.1(+)后，对其***经由对pCR4-Gas6#8进行EcoRI(1U)限制性内切酶的处理而分离得出的老鼠Gas6cDNA(100ng)，并利用T4DNA连接酶(ligase)(1U)予以连接而获得重组pcDNA3.1-Gas6(图16，右侧)。所制得的上述表达载体中，分别利用限制性内切酶XhoI(1U，Roche)确认对老鼠Gas6 cDNA的病毒及CMV启动子的方向，并对启动子正义及反义克隆分别命名为pLXSN-Gas6/F、pLXSN-Gas6/R及pcDNA3.1-Gas6/F、pcDNA3.1-Gas6/R(图17)。

实施例7.老鼠Gas6转染体的制备

利用脂质体转染(Lipofectamine)试剂(Invitrogen)，分别将pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-Gas6/F、pcDNA3.1-Gas6/R转染到未表达Gas6基因的NIH3T3细胞株(ATCC)上，之后从含有G418抗生素的培养基中分别筛选出转染体后，利用有限稀释法获得过量表达老鼠Gas6基因的克隆。另一方面，为了制备老鼠的Gas6表达逆转录酶病毒，将Gas6逆转录酶病毒载体pLXSN-Gas6/F、pLXSN-Gas6/R转染到能够形成病毒结构物的细胞株PT67上，并将其从含有G418的培养基中选取后进行有限稀释法，之后利用Gas6引物(5′-ggcctcgagcatgccgccaccgcccgggc-3′及5′-ggcgaattccggtctagggggtggcatgc-3′)，并通过如实施例1(C)所述的逆转录聚合酶链反应法(A)及蛋白质转移吸印分析法(Western blot)(B)，分析从每个克隆所生成的逆转录酶病毒感染细胞株-NIH3T3细胞中的Gas6表达程度(图18)。所述Western blot如以下方法进行。从细胞培养皿收回细胞后，用细胞溶解缓冲液(细胞裂解液，20mM HEPES pH 7.9、100mM KCL、300mM NaCl、10mM EDTA、0.5％Nonidet P-40、1mM Na 3VO4、1mM PMSF、100mg/ml aprotinin、以及1mg/ml亮抑酶肽(leupeptin))溶解细胞后在冰中静置30分钟。蛋白质浓度由考马斯亮蓝(Bradford)检测试剂(Bio-Rad，Hercules，CA)进行检测。即，将等量的蛋白质溶解物加载于10％SDS-PAGE进行电泳后，将经过电泳的蛋白质移至PVDF膜(Millipore，Marl borough，MA)。之后，利用封闭缓冲液(blocking buffer solution)(1％BSA and 5％ skim milk in PBS)使PVDF膜(Membrane)在4℃温度下反应一整夜后，用TBST(50mM Tris.pH 7.4，150mM NaCl，0.05％Tween20)清洗三次。之后在室温下，利用山羊抗老鼠Gas6抗体(Santa Cruz)对含有蛋白质的PVDF膜进行第一次反应，反应时间为2小时。然后在室温下，利用接合有HRP的抗山羊IgG(Santa Cruz)进行第二次反应，反应时间为1小时。接着用TBS液将上述膜清洗三次后，通过ECL***(Amersham-Pharmacia Biotech，Arlington Heights，IL)检测其信号。

实施例8.老鼠Gas6对自然杀伤细胞分化的影响

在含有干细胞因子(30ng/ml)、白细胞间介素-7(0.5ng/ml)、Flt3配体(50ng/ml)、吲哚美辛(indomethacin)(2μg/ml)、庆大霉素(gentamycin)(2μg/ml)的RPMI培养基中，以1×10⁶/ml浓度培养从老鼠骨髓中获取的Lin^-、c-kit⁺造血母细胞，培养容器为24孔培养板。在37℃温度和5％CO₂氛围下培养六天后，将所获得的前驱自然杀伤细胞和白细胞间介素-15(20ng/ml)及老鼠Gas6转染体一同培养24小时后，以2,000rpm转速离心10分钟，之后再将所获得的培养上清液样品和老鼠Gas6及Axl多克隆抗体一同培养六天，以使所述上清液样品分化为成熟自然杀伤细胞。收回所述细胞后，通过如实施例1(B)中所述的FACS分析法分析自然杀伤细胞表面分子的表达。结果发现，在每一阶段上的细胞纯度均为95％左右以上。为了了解由老鼠Gas6转染体分泌的老鼠Gas6是否与在前驱自然杀伤细胞中表达的Axl相结合，由此影响前驱细胞向成熟自然杀伤细胞的分化，将前驱自然杀伤细胞分别与正常的NIH3T3细胞对照组、被载体转染的对照组、以及过量表达老鼠Ga s6的转染体进行共同培养，或者分别用上述对照组或转染体的培养上清液进行处理后分析前驱自然杀伤细胞向自然杀伤细胞的分化能力。结果发现，经过和老鼠Gas6转染体共同培养的前驱自然杀伤细胞和对照组相比，其分化能力得到了促进(即，未经过共同培养的细胞分化率为14％，经过共同培养的细胞分化率为47％)(图19)。不仅如此，在分化过程中使用过量表达Gas6的转染体(5×10³)的培养上清液(以1∶20的比例进行稀释)进行处理时，通过如实施例1(C)所述的方法分析成熟自然杀伤细胞中特异性表达基因的表达。结果发现，利用过量表达Gas6的转染体(5×10³)的培养上清液进行处理的细胞中，穿孔素、白细胞间介素-18、干扰素-γ等基因的表达多于对照组(图20)。由此可以确认，造血母细胞向自然杀伤细胞分化的过程中，Axl与Gas6的结合所实现的信号传递对自然杀伤细胞的分化产生大的影响。

实施例9.Gas6对自然杀伤细胞的干扰素-γ生成的影响

将由实施例1(B)所获得的前驱自然杀伤细胞和白细胞间介素-15(10ng/ml)及基质细胞进行共同培养，并分别用Gas6抗体(500ng/ml)、Axl-Ig(500ng/ml)、杀鼠灵(500ng/ml)对其进行处理。接着将通过Gas6转染体的培养上清液(稀释比例为1∶20)进行处理而获得的成熟自然杀伤细胞作为实验组，并将通过仅***载体的转染体的培养上清液(稀释比例为1∶20)进行处理而获得的成熟自然杀伤细胞作为对照组，由此获得成熟自然杀伤细胞后，利用人体白细胞间介素-2(10ng/ml，R&D)进行处理。24小时后，通过干扰素-γELISA试剂盒(BD Pharmingen)检测干扰素-γ的生成量。结果发现，通过Gas6转染体的培养上清液进行处理的实验组的干扰素-γ生成量有所增加。而在实验组中，和未做任何处理的群组相比，经由Gas6抗体(500ng/ml)、Axl-Ig(500ng/ml)、杀鼠灵(500ng/ml)处理的群组的干扰素-γ生成量有所减少，由此可见，Gas6通过Axl传递其信号，并由此干预自然杀伤细胞的活性(图21)。

实施例10.Gas6对前驱自然杀伤细胞增殖的影响

将基质细胞以1×10⁴的数平铺于96孔微型培养板，一天后，将由实施例1(B)所获得的前驱自然杀伤细胞分株成每一孔中的细胞数为2.5×10⁴。在均包含白细胞间介素-15(25ng/ml)的条件下，分别用500ng/ml的Axl-Ig、Gas6抗体(a-Gas6)进行处理后，添加由实施例8中获得的Gas6的培养上清液，并经过48小时后，通过如实施例4所述的MTS检测，分析前驱自然杀伤细胞的增殖程度。结果发现，使用过量表达Gas6的转染细胞的培养上清液进行处理的实验组，比起使用仅由载体转染的细胞的培养上清液进行处理的对照组，其前驱自然杀伤细胞的增殖量有所增加，而利用Axl-Ig或Gas6抗体进行处理时，其前驱自然杀伤细胞的增殖量有所减少。由此可见，Axl及Gas6的相互作用，可导致前驱自然杀伤细胞的增殖(图22)。

实施例11.构建老鼠的Axl表达***

从Axl高表达老鼠RAW264.7巨噬细胞株分离出全部RNA，并利用该RNA和Axl引物(正义(sense)：5′-ggtgcccatcaacttcggaa；反义(antisense)：5′-ggatgtcccaggtggaagatt)进行如实施例1(C)所述的逆转录聚合酶链反应，由此将2,750bp的老鼠Axl cDNA(100ng)复制到经过限制性内切酶EcoRI(1U)处理的pCR4-TOPO(50ng)(图23)。另外，对逆转录酶病毒载体pLXSN进行EcoRI(1U)及CIP酶(1U)处理后，加入经由EcoR I限制性内切酶处理而从pCR4-Axl#4分离的Axl cDNA(100ng)，并通过T4 DNA连接酶(1U)加以连接后，制得重组pLXSN-Axl。在逆转录酶病毒载体中，对Gas6cDNA启动子的方向是通过由位于复制部分下游的引物及Axl的引物所进行的聚合酶链反应及碱基序列分析来确认，而对启动子的正义及反义克隆分别命名为pLXSN-Axl/F、pLXSN-Axl/R。

实施例12.制备老鼠的Axl-IgG融合蛋白质(fusion protein)

为了通过和Gas6表达逆转录酶病毒的制备方法相同的方式转染PT67细胞株，并由此制备表达Axl-IgG融合蛋白质的细胞株，在老鼠的IgG1Fc(constant fragment)部分的5′端和3′端上分别***BamHI和Xho I连接子(linker)，并通过和实施例1(C)相同的方法，通过聚合酶链反应进行放大后将其复制到pCR4-TOPO(获得pCR4-Fc)。另外，在Axl基因的细胞外领域(extracellular domain，ECD)的3′端上***BamHI连接子并予以放大后，将其复制到pCR4-TOPO(获得pCR4-Axl/ECD)。之后，对pCR4-Fc进行Xho I(1U)及BamHI(1U，Roche)处理，分离出约820bp的Fc部分；对pCR4-Axl/ECD进行EcoRI(1U)及BamHI(1U)处理，分离出约1350bp的Axl/ECD部分(100ng)后，将二者复制到pcDNA3.1(50ng)的EcoRI-XhoI领域中，之后利用BamHI(1U)、BamHI(1U)/XhoI(1U)限制性内切酶制备DNA克隆(图24)。最后，将pcDNA3.1/Axl-Fc质粒转染到293T细胞后，从含有G418的培养基筛选出转染体，之后通过有限稀释法获得过量表达Axl-IgG融合蛋白质的克隆。

实施例13.老鼠Axl-IgG融合蛋白质对自然杀伤细胞分化的影响

为了了解在阻断Axl信号传递的情况下，自然杀伤细胞的分化所受到的影响，将经过分化的前驱自然杀伤细胞和基质细胞(2×10⁴)共同培养7天，并在其间进行白细胞间介素-15(25ng/ml)及Axl-Ig的处理后，用NK1.1及NKG2A/C/E、Ly49G2抗体对其进行染色。之后，通过FACS法分析前驱自然杀伤细胞向成熟自然杀伤细胞的分化程度。结果发现，通过Axl-Ig阻断Axl及其配体Gas6的作用时，成熟自然杀伤细胞标记-NK1.1及NKG2A/C/E、Ly49G2呈阳性的细胞减少。由此可知，Axl-Gas6的作用对前驱自然杀伤细胞向成熟自然杀伤细胞的分化具有重大影响(图25)。

实施例14.抑制Axl表达下，自然杀伤细胞的分化所受到的影响

本实施例中，为了从自然杀伤细胞去除Axl，使用了慢病毒载体(lentiviral vector)(图26)。

(1)制备siRNA

为了有选择地封闭Axl功能部分的基因表达，制备如下低聚核苷酸(oligonucleotide)。为了封闭Axl功能部分而所选择的目标碱基序列为gtctcccgtacttcctgga(#1)、ctcacccactgcaacctgc(#2)、agacctacacagtttcctc(#3)。将所述每个目标碱基序列作为正方向(sense)，分别制备在5′端上包含悬垂(overhangs)有aaag的碱基序列的引物及与此相对应的引物，即在5′端上包含悬垂有aaaa的碱基序列的引物(图7中低聚核苷酸以#2为例所示)。在95℃的温度下，对上述每个低聚物进行退火(annealing)处理并将其分成两股后，利用BbsI(Roche)分解双启动子pFIV-H1/U6 siRNA-GFP表达载体，之后对其加以精制、复制(图27)。完成复制过程后，为了从转化克隆中寻找包含siRNA的克隆，通过U6聚合酶链反应引物及反义(anti-sense)siRNA低聚核苷酸进行聚合酶链反应，由此在包含siRNA的克隆中约100bp处确认到聚合酶链反应产物(图28)。

(2)确立慢病毒siRNA表达***

为了制备可感染到自然杀伤细胞的慢病毒，使用了表达siRNA的慢病毒载体和辅助载体VSVG、RSV-REV、pMDL g/pRRE。将约5×10⁵个能够形成病毒结构物的细胞株-293T细胞(ATCC)置放于10cm²培养碟中，并大约经过24小时后，利用质子转染氨(lipofectamine)，分别将1.5μg上述载体转染到上述细胞中。接着，大约经过4小时后，将培养基更换成新的DMEM培养基，并于37℃温度下，在CO₂培养器中进行培养。大约经过48小时后，将培养基以3000rpm转速离心5分钟，由此去除细胞残骸，之后，用Millex-HV 0.45um PVDF过滤器过滤培养上清液，并予以保存。为了从上述培养上清液确认病毒的生成情况，分别将1×10⁵的293T细胞放入6孔培养板中，并经过24小时后，将病毒质粒及含有10％胎牛血清的DEME培养基以1∶1的比例混合，之后利用该混合物处理293T细胞。此时，为了加强病毒壳体(capsid)对细胞膜的结合程度，添加8μg/ml的凝聚胺(polybrene)。由病毒感染24小时后，将培养基更换成含有10％胎牛血清的DMEM培养基，并重新培养48小时。之后利用荧光显微镜进行观测，并进行如实施例1(B)所述的FACS分析。通过上述过程，可确认到标有GFP的pFIV表达载体已有效转导(transduction)到细胞中(图29)。

(3)在造血母细胞分化成自然杀伤细胞的过程中的慢病毒感染

从老鼠的骨髓细胞中分离出造血母细胞后，加入约1×10⁶/cell的病毒质粒，并经过24小时的感染过程后，利用包含白细胞间介素-7(0.5ng/ml)、FLT3配体(50ng/ml)、干细胞因子(30ng/ml)的培养基培养6天左右。收回前驱自然杀伤细胞后，通过如实施例1(B)所述的FACS法分析转导情况。结果发现，慢病毒的感染情况比较良好，由此增加了GFP的表达，并由于抑制Axl，自然杀伤细胞的分化也随之受到抑制(图30，图31)。

实施例15.通过癌症动物模型探明，自然杀伤细胞对癌的抑制作用

为了确立癌症动物模型，对生后7-8周龄的C57BL/6老鼠，静脉注射5×10⁴个源于C57BL/6的癌细胞-B16F10黑素瘤细胞。第二天，分别将1×10⁶的经由对照组抗体(1μg/ml)及人体白细胞间介素-2(10ng/ml，Sigma)的处理，或者经由Axl多克隆抗体(1μg/ml)及白细胞间介素-2(10ng/ml)的处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞，静脉注射于老鼠身上。2周后，从老鼠肺中测出上述B16F10黑素瘤细胞的数量后，分析其转移能力及抗癌效果。结果发现，从注射由Axl多克隆抗体所刺激的成熟自然杀伤细胞的肺组织中观察到的癌细胞集落数，少于注射由对照组抗体处理的成熟自然杀伤细胞的肺中癌细胞集落数(后者为前者的约4-10倍)，而注射经由Axl-Ig处理的成熟自然杀伤细胞的肺组织中，癌细胞集落数却有显著的增长。由此可见，Axl能够激活自然杀伤细胞的活性，由此不仅可以调整癌细胞的形成，而且还可以调整癌细胞的转移能力(图32)。

实施例16.从动物癌模型探明，自然杀伤细胞的癌细胞杀伤能力

为了比较自然杀伤细胞的癌细胞杀伤能力，从实施例15中老鼠分离出脾细胞，之后利用人体白细胞间介素-2(10ng/ml)对其加以48小时的刺激后，将其与利用⁵¹Cr(100uci)进行2小时标记的YAC-1细胞分别以1∶100、1∶50、1∶25的比例混合并使之进行反应，经过4小时后，用培养上清液检测⁵¹Cr的分泌量。结果发现，注射经由对照组抗体处理而分化的自然杀伤细胞的实验组癌细胞杀伤率为58％，注射经由Axl多克隆抗体处理而分化的自然杀伤细胞的实验组癌细胞杀伤率为75％，两者和具有30％左右的癌细胞杀伤率的对照组相比，表现出显著的杀癌能力(图33)。

实施例17.在癌症动物模型中，自然杀伤细胞对癌诱变老鼠生存率的影响分析

将源于C57BL/6的癌细胞——B16F10黑色瘤细胞，以5×10⁴的数量注射于生后7-8周龄的C57BL/6老鼠皮下，以使该些老鼠引起癌诱变。这些经由癌诱变的老鼠中，对第一组未做任何处理；对第二组老鼠的皮下注射经由对照组抗体(1μg/ml)及人体白细胞间介素-2(10ng/ml，R&D)处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞；对第三组老鼠的皮下注射经由对照组抗体(1μg/ml)及人体白细胞间介素-2(10ng/ml，R&D)处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞和树脂状细胞；对第四组老鼠的皮下注射经由Axl多克隆抗体(1μg/ml)及白细胞间介素-2(10ng/ml)处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞，所注射的细胞数量分别为1×10⁶。结果发现，每一组老鼠的生存日分别为21天、15天、36天以及47天，注射经由Axl多克隆抗体(1μg/ml)及白细胞间介素-2(10ng/ml)处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的老鼠生存日最长。这一组的生存日比注入树脂状细胞的一组还要长，由此可知，对于癌治疗，经过分化的成熟自然杀伤细胞更有效(图34)。

实施例18.制备人体的Axl大肠菌表达载体

通过和实施例1(C)相同的方法，从表达Axl的细胞株HUVEC(HumanUmbilical Vein Endothelial Cell，ATCC)中分离出全部RNA后，利用Axl引物(sense：5′-cca tat gga aag tcc ctt cgt ggg caa c，antisense及5′-cct cga gca cca gct ggt gga ctg gct g)进行逆转录聚合酶链反应，从而放大去除信号传递序列的细胞外领域(Extra Cellular Domain，ECD)hAxl cDNA切片后，获得1214bp的cDNA。之后通过T4DNA连接酶(1U)，将Axl cDNA(100ng)片段复制到pET29a(50ng)的限制性内切酶NdeI(1U，Roche)及XhoI(1U)部分之间，并以使所述Axl cDNA(100ng)片段的C-末端上加有6个组氨酸(histidine)。将如此经过复制的复制产命名为pET-hAxl/ECD(图34)。

实施例19.制备人体的Axl抗原

为了表达Axl-(his)6蛋白，分别将pGEX-4T-3-Axl/F、pGEX-4T-3-Axl/R转染到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。将如此被转染的集落接种于含有细菌抗生素(kanamycin)的培养液(LB broth，Gibco)中，之后添加0.5mMIPTG(Sigma)后，将其在25℃的培养器中培养4小时。将浮游细菌以6,000rpm转速离心10分钟后，回收细菌并将其悬浮在1×PBS溶液中。接着，将所述溶液置放于冰中，并利用超声波破碎仪(Sonicatr)将细菌完全分解后，将其在12,000rpm转速下离心分离30分钟，由此从细菌残骸分离上层液。为了从细菌溶解物(上层液)中的水溶性及非溶性hAxl/ECD，精制融合蛋白质，通过HiTrapTM chelating HP(Amersham pharmacia)精制细菌溶解物，从而获得Axl-(his)6融合蛋白质。

实施例20.制备人体Axl蛋白质的特异性多克隆抗体

从大肠杆菌(E.coli)获得人体重组Axl抗原后，将其作为用于获得抗兔子人体Axl抗体的抗原使用。为了获得对抗原的特异性多克隆抗体，将以1mg/ml浓度溶解于磷酸缓冲液中的精制人体Axl蛋白质300μg，以同量的弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant)进行乳化后，将所得乳化物注射于生后10周龄的兔子身上，由此做第一次接种。第一次接种后，和第一次接种时的使用量相同的抗原和弗氏佐剂(Freundadjuvant)(incomplete Freund′s adjuvant)的乳化物，依次以2周、1周、1周间隔进行肌注，由此做第二次、第三次、第四次接种。做第四次接种起一周后，通过心脏穿孔法进行采血。将采集到的血液在室温下放置30分钟，之后在4℃下过夜放置，从而使之完全凝固后，在2,500rpm的转速下离心30分钟，并由此提取上清液而获得血清。将所述血清用1×PBS稀释5倍后在蛋白质A柱上进行精制。

实施例21.制备人体Axl蛋白质的特异性单克隆抗体

将精制的人体Axl 25μg/100μl，以相同量的弗氏佐剂进行乳化后，每隔2周，将其注入到生后6-8周龄的BALB/c老鼠，注入次数为3次。最后一次注入后，通过ELISA分析法分析Axl抗体的生成，并经过2周后，用25μg的人体Axl进行最后一次接种。由此过5天后，从老鼠身上提取脾细胞，并将其以10∶1的比例，与Sp2/0骨髓瘤细胞混合后，将所述混合液置于50％聚乙二醇1500溶液中3分钟，并使之进行细胞融合反应。之后，将所得产物在1,200rpm转速下离心分离8分钟，由此获得细胞沉淀后，将所述沉淀以3.5×10⁶/ml的浓度悬浮于含10％胎牛血清的HAT RPMI-1640培养基中，之后以0.1ml/孔的量分株于96孔培养板上并予以培养。三天后，以0.1ml/孔的量，于培养板中添加含10％胎牛血清的HAT RPMI-1640培养基，并每隔4天，用新的培养基更换培养基的约一半。对经过培养的培养液进行ELISA后，回收抗体效价高的孔中的细胞，并以有限稀释法进行培养。以0.5细胞/孔的量，将培养液中的细胞分株于96孔培养板后，对其进行ELISA，由此筛选出抗原特异性并具有较高活性度的杂交瘤细胞。选择培养HAT后，通过酶联免疫检测法测定杂交瘤细胞的抗体生成情况。即以0.01M碳酸盐-重碳酸盐(carbonate-bicarbonate)缓冲液(pH 9.6)，将在上述免疫中所使用的人体Axl稀释成0.1μg/ml，之后将其对每孔中加入50μl后，在4℃条件下涂敷一整夜。之后将其用PBST(phosphate buffersaline，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.15％Tween20)清洗4次，并以0.1％的白蛋白，在37℃温度下予以封闭30分钟。对每一个孔中加入50μl的细胞培养上清液，之后在室温下反应2小时后，用PBST清洗4次。之后用0.1％BSA-PBST稀释附有维生素H的二次抗体即抗老鼠免疫球蛋白抗体，以使其浓度变成1μg/ml后，对每一个孔中加入50μl的所述抗体，并使其在37℃下反应一个小时。之后，再以PBST清洗4次后，用0.1％的BSA-PBST将抗生物素蛋白-过氧化物酶(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)稀释1000倍，之后对每一个孔中加入50μl，并使之在37℃温度下反应30分钟后，再以PBST溶液清洗4次。将四甲基联苯胺(Tetra-Methylbenzidine，TMB)溶液作为酶反应底物，对每一个孔中加入50μl后，使之在室温下进行反应。之后用2N-硫酸停止反应后，在450nm波长下，通过酶联免疫分析测读仪(ELISA reader)测定其吸光度。由此确认抗人体Axl抗体的生成情况后，通过有限稀释法，对从呈阳性的孔中获得的细胞进行三次亚克隆(subcloning)而使每一个孔中的细胞变成0.3细胞，之后对其加以培养，使之成为单克隆，并由此而获得生产抗人体Axl单克隆抗体的杂交瘤细胞。为了从杂交瘤细胞的培养上清液中获得抗人体Axl单克隆抗体，通过GC柱分离抗体，并予以透析后，获得抗人体Axl单克隆抗体。

实施例22.制备人体Gas6表达载体

通过如实施例1(C)所述的方法，从表达Gas6的人体细胞株HUVEC(American Type Culture collection)分离出全部RNA后，利用Gas6引物(sense：5′-ggcccgtggccccttcgctct；antisense：ggcctaggctgcggcgggct)进行逆转录聚合酶链反应，从而放大2041bp的cDNA。之后将其复制到PCR克隆载体后，分析碱基序列。接着，用EcoRI(1U)切断经过分析的所述人体Ga s 6cDNA，并予以分离。另外，用EcoRI限制性内切酶(1U)处理pcDNA3.1载体后，通过T4DNA连接酶(1U)，将人体的Gas 6cDNA(100ng)复制到pcDNA3.1载体(50ng)中，由此制备人体Gas6表达载体pchGas6(图35)。

实施例23.制备经γ-羧化的人体Gas6

为了获得经γ-羧化的人体Gas6，通过lipfectamine试剂(Invitrogen，Carlslbad，CA)将人体Gas6表达载体pchGas6转染到人体293(ATCC)细胞中，之后从含有0.75mg/ml G418(Gibco)抗生素的培养基中分别筛选出转染体后，通过有限分析法获得过量表达人体Gas6基因的克隆。被染上人体Gas6的293细胞将向培养上清液分泌过量的经γ-羧化反应的人体Gas6，而通过如实施例8所述的方法进行蛋白质转移吸印(Western blot)分析，确认其为过量表达人体Gas6基因的克隆。并通过在人体自然杀伤细胞的分化诱导过程中使用被柒上人体Gas6的293细胞的培养上清液(稀释比例为1∶20)，确认包含在该培养上清液中、并经过γ-羧化的人体Gas6的作用。

实施例24.利用Axl多克隆抗体(Santa cruz)所进行的、源于人体脐带血的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

(A)源于人体脐带血的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

通过以下方法，从脐带血中分离造血母细胞。在50ml试管中，分别盛装25ml的人体脐带血后(1袋＝100ml)，对其加入同量的1×PBS(25ml)，并缓慢地予以混合。在新的50ml试管中分别盛装20ml的Picoll后，对其加入人体脐带血及1×PBS的混合液(混合比例为1∶1)至50ml，加入混合液时注意不要破坏层。之后，在2000rpm转速、25℃温度下离心分离20分钟(在解除封闭的状态下进行)。完成离心分离后，仅提取最上层的黄色部分(血清)及最底下澄清部分之间的白色部分(细胞层＝约10ml)，并将其移至盛装有20ml 1×PBS的50ml试管中后，在2000rpm、25℃温度下离心10分钟。如出现下沉的沉淀物(Pellet)，就除去上清液后，用手轻敲所述沉淀物，以使之打匀，之后倒入10ml左右的ACK缓冲液(0.15M NH4Cl、1mMKHCO₃、0.1mM EDTA(disodium salt)，pH 7.2)并予以混合后，在37℃下静置10分钟。接着在2500rpm转速、4℃温度下，离心分离10分钟后，除去上清液，并用手轻敲所述试管，以打匀沉淀物。放入约2ml的MACS缓冲液(将2mM的EDTA和0.5％BSA溶解于1×PBS后进行过滤)后，用吸管使所述沉淀悬浮，之后通过设置在新试管(50ml)上的过滤器进行过滤后，再将约10ml的MACS缓冲液倒入原盛装有细胞的试管中，并予以清洗，之后再将其过滤。由此反复进行上述动作而使50ml的试管填满。

用细胞计数器(HEMOCYTOMETER，MARIENFELD)计算装在50ml试管内的细胞。之后在4℃温度下，以2000rpm转速离心10分钟后，以1×10⁸细胞数作为一次反应量，并对应于一次反应量，加入1ml的MACS缓冲液，从而悬浮沉淀物后，将其装入1.5ml试管内。以1700rpm转速离心3分钟后，除去上清液，并利用缓冲液打匀沉淀物，由此方法将沉淀反复清洗三次。最后，加入500μl MACS缓冲液，打匀沉淀物后，向容积为1.5ml的每一支试管中，分别加入CD34⁺微粒25μl和封闭试剂25μl，并予以混合。之后，在4℃温度下使之反应30分钟后，每隔5分钟，将试管重复倒置10次。过30分钟后，以1700rpm转速离心3分钟后除去上清液，并将此过程重复三次。最后，加入500μl的MACS缓冲液后，打匀沉淀物。在MACS分选器上安装MACS分离柱后，用3ml的MACS缓冲液清洗所述分离柱。在缓冲液完全下去之前，小心倒入经打匀的沉淀物，等沉淀物完全下去之后，重新加入5ml的MACS缓冲液，并重新往分离柱内加入2ml的MACS缓冲液后予以收回。

从MACS拆开分离柱后，将5ml的MACS缓冲液放入分离柱内，并通过活塞将分离柱内的溶液推入15ml试管中后，重新加入5ml的MACS缓冲液，并再一次将分离柱内的溶液推入试管内。然后检测所得细胞的数量后，将其分株成每孔造血母细胞培养液(30ng/ml的人体干细胞因子(Pepro Tech)、50ng/ml的人体FLT3配体(Pepro Tech)、10ng/ml的人体白细胞间介素-7，(Pepro Tech))1ml中的细胞数为1×10⁶/ml后，分别放入24孔培养板中，并于37℃、5％CO₂培养器中予以培养。为了使人体造血母细胞分化为前驱自然杀伤细胞，将分选的CD34⁺细胞以1×10⁶/ml的浓度悬浮于含人体干细胞因子(30ng/ml)、Flt-3L(50ng/ml)、白细胞间介素-7(10ng/ml)的Myelocult H5100(Gibco)培养基，并于24孔培养板进行培养。之后每隔三天，将一半培养基更换成新的培养基，以进行传代培养(subculture)。由此进行14天的培养后，获得人体前驱自然杀伤细胞。为了使人体前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞，将经过14天的培养所生成的前驱自然杀伤细胞及由脐带血分离的基质细胞，共同培养在含有人体白细胞间介素-15(20ng/ml，Pepro Tech)的MyeloCult培养基(Gibco)中，由此获得成熟自然杀伤细胞。其中，所述基质细胞的分离方法如下：从脐带血分离出造血母细胞后，将CD34^-细胞平铺于10％RPMI培养基中，并于5％(CO₂)培养器中培养2小时。收回悬浮在培养液中的细胞，并利用10％RPMI培养基，将所述细胞平铺于新的培养皿中。分别过4天、7天后更换培养液，并于第8天除去培养基后，加入3ml的1×PBS，并于培养器中静置5分钟。将1ml的胰岛素-EDTA处理1分钟后，用10％的RPMI培养基清洗所述细胞。并通过离心分离收集细胞后，将其平铺在24孔培养板中，且使每一孔的细胞数成4×10⁴。通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化程度。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A(Pharmingen)、CD161(Pharmingen)、NKP46(Pharmingen)、NKP30(Pharmingen)、NKP44(Pharmingen)、NKG20(Pharmingen)及CD56(Pharmingen)。结果发现，本实施例和同种型(isotype)对照组相比，所分化的细胞中呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺以及CD56⁺NKG2D的细胞含量分别为8.8％、35％、6.2％、4.6％、24％、13％(图37)。

对如此获得的细胞进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PGR)，以确认在经分化形成的成熟自然杀伤细胞中特异性表达基因——穿孔素和颗粒酶的表达(图38)。所述逆转录-聚合酶链反应通过如实施例1(C)所述的方法进行。

为了比较经分化的自然杀伤细胞对癌细胞的杀伤能力，分别以1、5、10ng/ml浓度的人体白细胞间介素-2，将所述自然杀伤细胞刺激62小时后，分别以10∶1、5∶1、2.5∶1的比例，将其与通过⁵¹Cr(50uci)标记2小时的K562血癌细胞(ATCC)进行混合，并使之进行反应。4小时后，对分泌于培养上清液中的⁵¹Cr进行检测的结果，发现所使用的成熟自然杀伤细胞越多，其对癌细胞的杀伤力也就越高(图39)。

(B)在未与基质细胞进行共同培养下，由人体前驱自然杀伤细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与(A)相同的条件下，但未使用人体基质细胞的条件下，将人体前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞后，通过与实施例1(B)相同的方法，对包含CD56(Pharmingen)的成熟自然杀伤细胞表面分子的表达进行FACS分析。结果发现，其表达程度远低于在与人体基质细胞进行共同培养下的表达程度。由此可知，诱导人体前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的过程中，人体基质细胞将起到必不可少的作用。

(C)在使用Axl多克隆抗体(Santa cruz)下，源于人体脐带血的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与(A)相同的条件下，由Ax1多克隆抗体(Santa Cruz)取代白细胞间介素-15，来处理由(A)获得的前驱自然杀伤细胞，且其处理量为1μg/ml。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化程度。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A(Pharmingen)、CD161(Pharmingen)、NKP46(Pharmingen)、NKP30(Pharmingen)、NKP44(Pharmingen)、NKG20(Pharmingen)及CD56(Pharmingen)。结果发现，当使用Axl多克隆抗体进行处理时，与使用山羊抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞分化率约高2-3倍(图36)。

另外，在相同条件下，通过Axl抗体(Santa Cruz)及白细胞间介素-15(Pepro Tech)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。其中，所述Axl抗体及白细胞间介素-15的比例为1∶1，处理量为1μg/ml。结果发现，和单独使用Axl抗体处理时相比，其分化率有所增加。

实施例25.在使用Axl多克隆抗体下，源于人体脐带血的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例24(A)相同的条件下，利用由实施例20所获得的Axl多克隆抗体取代白细胞间介素-15，来处理由实施例24(A)获得的前驱自然杀伤细胞，且其处理量为1μg/ml。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A(Pharmingen)、CD161(Pharmingen)、NKP46(Pharmingen)、NKP30(Pharmingen)、NKP44(Pharmingen)、NKG20(Pharmingen)及CD56(Pharmingen)。结果发现，当使用Axl多克隆抗体进行处理时，与使用山羊抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞分化率约高2-3倍。这与通过购买的Axl多克隆抗体进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，通过Axl抗体(Santa Cruz)及白细胞间介素-15(Pepro Tech)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。其中，所述Axl抗体及白细胞间介素-15的比例为1∶1，处理量为1μg/ml。结果发现，和单独使用Axl抗体处理时相比，其分化率有所增加。

实施例26.在使用Axl单克隆抗体下，源于人体脐带血的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例24(A)相同的条件下，利用由实施例21所获得的Axl单克隆抗体取代白细胞间介素-15，处理由实施例24(A)获得的前驱自然杀伤细胞，且其处理量为1μg/ml。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A(Pharmingen)、CD161(Pharmingen)、NKP46(Pharmingen)、NKP30(Pharmingen)、NKP44(Pharmingen)、NKG20(Pharmingen)及CD56(Pharmingen)。结果发现，当使用Axl单克隆抗体进行处理时，与使用山羊抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞分化率约高2-3倍。这与通过购买的Axl多克隆抗体进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，通过Axl单克隆抗体及白细胞间介素-15(PeproTech)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。其中，所述Axl抗体及白细胞间介素-15的比例为1∶1，处理量为1μg/ml。结果发现，和单独使用Axl单克隆抗体处理时相比，其分化率有所增加。

实施例27.在使用经γ-羧化的人体Gas6下，源于人体脐带血的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例24(A)相同的条件下，利用由实施例23所获得的、经由Gas6的转染后所形成的培养上清液的稀释液(稀释比例为1∶20)取代白细胞间介素-15，处理由实施例24(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP 30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当使用经γ-羧化的人体Gas6进行处理时，和只使用经转染的培养上清液的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞的分化率约高2-3倍。这与通过Axl多克隆抗体或Axl单克隆抗体进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，同时使用经γ-羧化的人体Gas6和白细胞间介素-15(Pepro Tech)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。结果发现，和单独使用经γ-羧化的人体Gas6处理时相比，其分化率有所增加。

实施例28.在同时使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6下，源于人体脐带血的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例24(A)相同的条件下，使用1μg/ml的Axl多克隆抗体(SantaCruz)及由实施例23所获得的、经由Gas6的转染后所形成的培养上清液的稀释液(稀释比例为1∶20)以取代白细胞间介素-15，处理由实施例23(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当同时使用经γ-羧化的人体Gas6和Axl多克隆抗体进行处理时，和只使用经Gas6转染的培养上清液或者只使用Axl多克隆抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞的分化率有所增加。

另外，在相同条件下，同时使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6及白细胞间介素-15(Pepro Tech)(所述抗体与白细胞间介素-15的比例为1∶1)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。结果发现，和只使用Axl多克隆抗体及经γ-羧化的人体Gas6进行处理时相比，其分化率有所增加。

实施例29.在同时使用Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6下，源于人体脐带血的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例24(A)相同的条件下，同时使用从实施例20所获得的Axl多克隆抗体1μg/ml及由实施例23所获得的、经由经γ-羧化的人体Gas6的转染后所形成的培养上清液的稀释液(稀释比例为1∶20)取代白细胞间介素-15，处理由实施例24(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当同时使用经γ-羧化的人体Gas6和Axl多克隆抗体进行处理时，和只使用经Gas6转染的培养上清液或者只使用Axl多克隆抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞的分化率有所增加。这与同时使用经购买的Axl多克隆抗体和经Gas6转染的培养上清液进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，同时使用Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6及白细胞间介素-15(Pepro Tech)(所述抗体与白细胞间介素-15的比例为1∶1)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。结果发现，和只使用Axl多克隆抗体及经γ-羧化的人体Gas6进行处理时相比，其分化率有所增加。

实施例30.在同时使用Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6下，源于人体脐带血的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例24(A)相同的条件下，同时使用从实施例21所获得的Axl单克隆抗体1μg/ml和由实施例23所获得的、经由经γ-羧化的人体Gas6的转染后所形成的培养上清液的稀释液(稀释比例为1∶20)以取代白细胞间介素-15，处理由实施例24(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当同时使用经γ-羧化的人体Gas6和Axl单克隆抗体进行处理时，和只使用经Gas6转染的培养上清液或者只使用Axl单克隆抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞的分化率有所增加。这与同时使用经购买的Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6转染的培养上清液进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，同时使用Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6及白细胞间介素-15(Pepro Tech)(所述抗体与白细胞间介素-15的比例为1∶1)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。结果发现，和只使用Axl单克隆抗体及经γ-羧化的人体Gas6进行处理时相比，其分化率有所增加。

实施例31.通过癌症动物模型探明，在Axl多克隆抗体(Santa Cruz)的诱导下，由源于人体脐带血的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在Axl多克隆抗体(Santa Cruz)的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，利用生后5周龄的雄性裸鼠(Nude Balb/c mouse，缺乏免疫功能的转基因老鼠，由Orient Corporation提供)检测抗癌活性。按照动物管理指南，在无菌动物室内管理裸鼠。通过含10％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液(Gibco)，在37℃，CO₂培养器中培养源于人体的癌细胞(包括胃癌细胞，KCLB no.00638；子宫癌细胞，KCLB no.10002；***癌细胞，KCLB no.30022；肾癌细胞，KCLBno.30044；黑色瘤细胞，KCLB no.30068；肺癌细胞，KCLB no.30053；卵巢癌细胞，KCLB no.30077等等)。用1×PBS清洗经培养的癌细胞后，用胰岛素-EDTA(Gibco)进行处理而收回癌细胞。从细胞中消除胰岛素-EDTA后，用1×PBS悬浮细胞，之后计算细胞数，使每0.1μl的细胞数为10⁸个后备用。用胰岛素注射器(Pharmingen)将10⁸个癌细胞注入到裸鼠的皮下后培养一周左右，以使所述癌细胞的直径大小约成0.8mm。通过人体白细胞间介素-2(10ng/ml)激活所述利用Axl克隆抗体(Santa Cruz)分化形成的人体成熟自然杀伤细胞(1×10⁶)，并将其注入到癌组织。按时间检测癌组织的体积，发现注入经由Axl多克隆抗体(Santa Cruz)的处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入经由山羊抗体的处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织的体积有了明显的缩小。

实施例32.通过癌症动物模型探明，在Axl多克隆抗体的诱导下，由源于人体脐带血的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在人体Axl多克隆抗体的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入经由Axl多克隆抗体的处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入经由山羊抗体的处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织的体积有了明显的缩小。这与使用由购买的Axl多克隆抗体进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，癌组织体积的缩小相差无几。

实施例33.通过癌症动物模型探明，在Axl单克隆抗体的诱导下，由源于人体脐带血的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在人体Axl单克隆抗体的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入经由Axl单克隆抗体的处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入经由山羊抗体的处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织的体积有了明显的缩小。这与使用通过购买的Axl多克隆抗体进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，癌组织体积的缩小相差无几。

实施例34.通过癌症动物模型探明，在经过γ-羧化的人体Gas6的诱导下，由源于人体脐带血的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在经过γ-羧化的人体Gas6的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入通过经γ-羧化的人体Gas6的处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入通过经转染载体的培养上清液进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织的体积有了明显的缩小。这与使用经由Axl多克隆抗体的处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，癌组织体积的缩小相差无几。

实施例35.通过癌症动物模型探明，在Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6的诱导下，由源于人体脐带血的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入同时使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入仅使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)或仅使用经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织体积的缩小率有所增加。

实施例36.通过癌症动物模型探明，在Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6的诱导下，由源于人体脐带血的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入同时使用Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入仅使用Axl多克隆抗体或仅使用经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织体积的缩小率有所增加。这与使用由购买的Axl多克隆抗体及由γ-羧化人体Gas6转染的培养上清液进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，其癌组织体积的缩小相差无几。

实施例37.通过癌症动物模型探明，在Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6的诱导下，由源于人体脐带血的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入同时使用Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入仅使用Axl单克隆抗体或仅使用经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织体积的减小率有所增加。这与使用由购买的Axl多克隆抗体及经γ-羧化人体Gas6转染的培养上清液进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，其癌组织体积的缩小相差无几。

实施例38.在使用Axl多克隆抗体(Santa cruz)下，源于人体骨髓的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

(A)源于人体骨髓的造血母细胞向自然杀伤细胞的分化

为了从人体骨髓中分离出造血母细胞，分别将25ml的人体骨髓装入50ml试管中，之后通过如实施例24(A)所述的方法，分离出造血母细胞和前驱自然杀伤细胞后进一步将其分化为成熟自然杀伤细胞。在此使用的人体基质细胞由人体骨髓中获得，而从骨髓中分离基质细胞时，采取了如实施例24(A)所述的由脐带血分离基质细胞的方法。

(B)在使用Axl多克隆抗体(Santa cruz)下，向成熟自然杀伤细胞的分化

在与(A)相同的条件下，由1μg/ml的Axl多克隆抗体(Santa Cruz)取代白细胞间介素-15，处理由(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当使用Axl多克隆抗体进行处理时，和经过山羊抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞的分化率约高2-3倍(图36)。

另外，在相同条件下，通过Axl多克隆抗体(Santa Cruz)及白细胞间介素-15(Pepro Tech)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。其中，所述Axl多克隆抗体及白细胞间介素-15的比例为1∶1，处理量为1μg/ml。结果发现，和单独使用Axl抗体处理时相比，其分化率有所增加。

实施例39.在使用人体Axl多克隆抗体下，源于人体骨髓的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例38(A)相同的条件下，利用由实施例20所获得的Axl多克隆抗体取代白细胞间介素-15，来处理由实施例38(A)所获得的前驱自然杀伤细胞，且其处理量为1μg/ml。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当使用Axl多克隆抗体进行处理时，与使用山羊抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞分化率约高23倍。这与通过购买的Axl多克隆抗体进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，通过Axl多克隆抗体及白细胞间介素-15(PeproTech)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。其中，所述Axl多克隆抗体及白细胞间介素-15的比例为1∶1，处理量为1μg/ml。结果发现，和单独使用Axl多克隆抗体处理时相比，其分化率有所增加。

实施例40.在使用人体Axl单克隆抗体下，源于人体骨髓的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例38(A)相同的条件下，利用由实施例21所获得的Axl单克隆抗体取代白细胞间介素-15，来处理由实施例38(A)所获得的前驱自然杀伤细胞，且其处理量为1μg/ml。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当使用Axl单克隆抗体进行处理时，与使用山羊抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD1619⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞分化率约高2-3倍。这与通过购买的Axl多克隆抗体进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，通过同时使用Axl单克隆抗体及白细胞间介素-15(Pepro Tech)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。其中，所述Axl单克隆抗体及白细胞间介素-15的比例为1∶1，处理量为1μg/ml。结果发现，和单独使用Axl单克隆抗体处理时相比，其分化率有所增加。

实施例41.在使用经γ-羧化的人体Gas6下，源于人体骨髓的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例38(A)相同的条件下，利用由实施例23所获得的、经由Gas6的转染后所形成的培养上清液的稀释液(稀释比例为1∶20)取代白细胞间介素-15，处理由实施例38(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当使用经γ-羧化的人体Gas6进行处理时，和只使用经转染的培养上清液的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞分化率约高2-3倍。这与通过Axl多克隆抗体或Axl单克隆抗体进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，同时使用经γ-羧化的人体Gas6和白细胞间介素-15(Pepro Tech)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。结果发现，和单独使用经γ-羧化的人体Gas6处理时相比，其分化率有所增加。

实施例42.在同时使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6下，源于人体骨髓的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例38(A)相同的条件下，使用1μg/ml的Axl多克隆抗体(SantaCruz)及由实施例23所获得的、经由Gas6的转染后所形成的培养上清液的稀释液(稀释比例为1∶20)以取代白细胞间介素-15，处理由实施例38(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当同时使用经γ-羧化的人体Gas6和Axl多克隆抗体进行处理时，和只使用经转染的培养上清液或者只使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞的分化率有所增加。

另外，在相同条件下，同时使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6及白细胞间介素-15(Pepro Tech)(所述抗体与白细胞间介素-15的比例为1∶1)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。结果发现，和只使用Axl多克隆抗体及经γ-羧化的人体Gas6进行处理时相比，其分化率有所增加。

实施例43.在同时使用Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6下，源于人体骨髓的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例38(A)相同的条件下，同时使用从实施例20所获得的Axl多克隆抗体1μg/ml及由实施例23所获得的、通过经γ-羧化的人体Gas6的转染后所形成的培养上清液的稀释液(稀释比例为1∶20)以取代白细胞间介素-15，处理由实施例38(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当同时使用经γ-羧化的人体Gas6和Axl多克隆抗体进行处理时，和只使用经Gas6转染的培养上清液或者只使用Axl多克隆抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞的分化率有所增加。这与同时使用经购买的Axl多克隆抗体和由经过γ-羧化的人体Gas6转染的培养上清液进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，同时使用Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6及白细胞间介素-15(Pepro Tech)(所述抗体与白细胞间介素-15的比例为1∶1)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。结果发现，和只使用Axl多克隆抗体及经γ-羧化的人体Gas6进行处理时相比，其分化率有所增加。

实施例44.在同时使用Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6下，源于人体骨髓的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例38(A)相同的条件下，同时使用从实施例21所获得的Axl单克隆抗体1μg/ml及由实施例23所获得的、通过经γ-羧化的人体Gas6的转染后所形成的培养上清液的稀释液(稀释比例为1∶20)以取代白细胞间介素-15，处理由实施例38(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了NKG2A、CD161、NKP46、NKP30、NKP44、NKG20及CD56。结果发现，当同时使用经γ-羧化的人体Gas6和Axl单克隆抗体进行处理时，和只使用经Gas6转染的培养上清液或者只使用Axl单克隆抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺NKG2A⁺、CD56⁺CD161⁺、CD56⁺NKP46⁺、CD56⁺NKP30⁺、CD56⁺NKP44⁺及CD56⁺NKG20⁺的细胞的分化率有所增加。这与使用经购买的Axl多克隆抗体和由经过γ-羧化的人体Gas6转染的培养上清液进行处理时的分化率相差无几。

另外，在相同条件下，同时使用Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6及白细胞间介素-15(Pepro Tech)(所述抗体与白细胞间介素-15的比例为1∶1)，处理前驱自然杀伤细胞并分析其分化率。结果发现，和只使用Axl单克隆抗体及经γ-羧化的人体Gas6进行处理时相比，其分化率有所增加。

实施例45.通过癌症动物模型探明，在Axl多克隆抗体(Santa Cruz)的诱导下，由源于人体骨髓的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在Axl多克隆抗体(Santa Cruz)的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过和实施例31相同的方法进行实验。结果发现，注入经由Axl克隆抗体(Santa Cruz)的处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入经由山羊抗体的处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织的体积有了明显的缩小。

实施例46.通过癌症动物模型探明，在Axl多克隆抗体的诱导下，由源于人体骨髓的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在人体Axl多克隆抗体的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入经由Axl多克隆抗体的处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入经由山羊抗体的处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织的体积有了明显的缩小。这与使用由购买的Axl多克隆抗体进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，癌组织体积的缩小相差无几。

实施例47.通过癌症动物模型探明，在Axl单克隆抗体的诱导下，由源于人体骨髓的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在人体Axl单克隆抗体的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入经由Axl单克隆抗体的处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入经由山羊抗体的处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织的体积有了明显的缩小。这与使用由购买的Axl多克隆抗体进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，癌组织体积的缩小相差无几。

实施例48.通过癌症动物模型探明，在经过γ-羧化的人体Gas6的诱导下，由源于人体骨髓的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在经过γ-羧化的人体Gas6的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入通过经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入通过经转染载体的培养上清液进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织的体积有了明显的缩小。这与使用经由Axl多克隆抗体的处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，癌组织体积的缩小相差无几。

实施例49.通过癌症动物模型探明，在Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6的诱导下，由源于人体骨髓的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入同时使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)和经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入仅使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)或仅使用经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织体积的减小率有所增加。

实施例50.通过癌症动物模型探明，在Axl多克隆抗体和γ-羧化人体Gas6的诱导下，由源于人体骨髓的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入同时使用Axl多克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入仅使用Axl多克隆抗体或仅使用经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织体积的减小率有所增加。这与使用由购买的Axl多克隆抗体及通过经由γ-羧化的人体Gas6转染的培养上清液进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，其癌组织体积的缩小相差无几。

实施例51.通过癌症动物模型探明，在Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6的诱导下，由源于人体骨髓的造血母细胞分化形成的成熟自然杀伤细胞的抗癌活性

为了观察在Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6的作用下分化形成的人体成熟自然杀伤细胞是否能够杀伤人体癌细胞，通过如实施例31所述的方法进行实验。结果发现，注入同时使用Axl单克隆抗体和经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化形成的人体成熟自然杀伤细胞的组群，比起注入仅使用Axl单克隆抗体或仅使用经γ-羧化的人体Gas6进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞的对照组，其癌组织体积的缩小率有所增加。这与使用由购买的Axl多克隆抗体及通过经由γ-羧化的人体Gas6转染的培养上清液进行处理而分化形成的成熟自然杀伤细胞时相比，其癌组织体积的缩小率相差无几。

实施例52.在使用Axl多克隆抗体(Santa Cruz)下，源于人体末梢血液的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

(A)源于人体末梢血液的造血母细胞向成熟自然杀伤细胞的分化

通过以下方法，从末梢血液中分离出造血母细胞。在50ml试管中，分别盛装25ml的人体末梢血液后，和实施例24(A)相同的方法分离造血母细胞及前驱自然杀伤细胞，并将其分化为成熟自然杀伤细胞。在此使用的人体基质细胞由人体末梢血液中分离，而从末梢血液分离基质细胞的方法和实施例24(A)中由脐带血分离基质细胞的方法相同。

(B)在使用Axl多克隆抗体(Santa cruz)的下，向成熟自然杀伤细胞的分化

在与实施例24(A)相同的条件下，添加1μg/ml的Axl多克隆抗体(SantaCruz)处理由(A)所获得的前驱自然杀伤细胞。进行14天的分化后，通过如实施例1(B)所述的方法对人体成熟自然杀伤细胞进行FACS分析，以了解其分化率。实验中，对人体的成熟自然杀伤细胞的标记使用了CD56。结果发现，当使用Axl多克隆抗体进行处理时，和经过山羊抗体进行处理的对照组相比，呈CD56⁺的细胞分化率约高2-3倍(图41)。

临床试验报告：

临床试验对象为二名大肠癌远程转移患者、一名因***癌转移到肺而复发的患者、一名非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)患者及一名急性淋巴性白血病患者。每位患者分别按照适当的治疗方案接受化疗，并于第10天，经皮注射600-900ug/d的颗粒细胞-集落刺激因子。等恢复白细胞(WBC)的数量后(每升血液中的数量＞1×10⁹)，立即每天监测CD34⁺PBSC。当每升血液中的CD34⁺细胞数为20×10⁶时进行采血。CD34⁺细胞的绝对数由FACScan分析仪(Becton Dickinson/Aria)及和适当的同种型(isoType)相一致的阴性对照组进行评价。按照实施例23中所述的方法，从采自患者身上的末梢血液分离出造血母细胞，并将其分化为成熟自然杀伤细胞后，用白细胞间介素-2(10ng/ml)激活所述经分化的成熟自然杀伤细胞，并将其注射给患者，由此让患者接受自身治疗。虽然病例比较少，但患者均有了肿瘤缩小的显著的疗效。

Claims (10)

1. 一种Ax1的配体，其诱导前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞。

2. 如权利要求1所述的Ax1的配体，其为对Ax1的抗体。

3. 如权利要求1所述的Ax1的配体，其为经γ-羧化的Gas6蛋白质。

4. 一种成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

i、利用白细胞间介素-7、干细胞因子及Flt 3配体处理造血母细胞，使之分化为前驱自然杀伤细胞；

ii、利用Ax1的配体处理前驱自然杀伤细胞，使之分化并获得成熟自然杀伤细胞。

5. 如权利要求4所述的成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述造血母细胞源于人体骨髓、末梢血液或脐带血中一种。

6. 如权利要求5所述的成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述Ax1的配体选自对Ax1蛋白质的抗体、经γ-羧化的Gas6蛋白质、或者两者的配合物。

7. 如权利要求6所述的成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，将前驱自然杀伤细胞和人体基质细胞共同培养下，用配体处理前驱自然杀伤细胞。

8. 一种活性化成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

i、利用白细胞间介素-7、干细胞因子及Flt3配体处理造血母细胞，使之分化为前驱自然杀伤细胞；

ii、利用Ax1抗体处理前驱自然杀伤细胞，使之分化并获得成熟自然杀伤细胞；

iii、利用白细胞间介素-2处理经分化的成熟自然杀伤细胞，以使其活性化。

9. 如权利要求8所述的活性化成熟自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述白细胞间介素-2的使用量为8-15ng/ml。

10. 一种免疫细胞治疗剂，其特征在于，包含根据权利要求8所述方法制备的活性化成熟自然杀伤细胞。

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