KR100604680B1 - 생리활성물질 고정화 담체 및 이의 제조방법,고정화생리활성물질, 시료중의 대상성분 분석방법 및시료중의 대상성분의 분석용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생리활성물질을 고밀도로 매우 효율적으로 고정화시킬 수 있는 담체; 고정화 담체를 이용하여 생물학적 대상 성분을 효과적으로 분석하는 방법; 및 분석용 키트를 제공하고자 한다. 생리활성물질이 표면에 형성된 탄소, 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층을 갖는 담체를 포함하는 생리활성물질 고정화용 담체; 관능기를 갖는 탄소, 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층을 갖는 담체를 생리활성물질과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 생리활성물질 고정화 담체의 제조방법; 담체를 이용하여 시료중 대상 성분을 분석하는 방법 및 상기 담체를 포함하는 시료중의 대상 성분의 분석용 키트.
Description
본 발명은 생리활성물질 고정화 담체, 이의 제조 방법, 담체상에 고정화된 생리활성물질, 상기 담체를 사용하여 시료중의 대상 성분을 분석하는 방법 및 상기 담체를 포함하는 시료중의 대상 성분 분석용 키트를 제공한다.
본원에서의 생리활성물질은 유기체, 또는 생물학적 단백질 또는 펩티드, 등에 특이적 작용을 갖는 물질을 의미한다.
효소 및 항체와 같은 대부분의 생리활성물질은 특정한 물질에 대해 높은 선택성을 가지며, 이와 같은 성질에 기초하여, 이는 특정의 생물학적 성분의 정확한 검출에 이용되어 왔다. 특히, 면역검정이 면역학적 조사에서 많이 사용되며, 이는 적합한 고체상(담체)상에 목적하는 물질과 반응하는 항체를 고정화시킨 후, 이를 검체와 접촉시켜, 목적하는 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 표지된 항체와 반응시키는 것을 포함한다.
그러나, 단백질 및 사카라이드는 상이한 표면 전하를 갖기 때문에 단백질 또는 사카라이드와 같은 생리활성물질을 담체상에 효과적으로 확고하게 고정화시키는 것은 극히 어렵다.
지금까지, 유리 슬라이드 또는 폴리사카라이드 겔과 같은 담체상에 단백질과 같은 생리활성물질을 고정화시키는 방법, 및 시료중의 항원을 담체상의 항체에 결합시키기 위한 고정화 담체를 사용하여 고효율로 항원을 검출하는 방법이 하기 문헌에 보고되어 있다 [Biotechniques, 27, 778-788 (1999); Biosensors & Bioelectronics, Vol. 13, Nos. 3-4, pp. 407-415, 1998; Glin. Chem., 44:9, 2036-2043 (1998); Glin. Chem. Acta, (1990) 194 (1); Anal. Chem., 1999, 71, 3845-3852; J. Immunol. Methods, 136 (1991), 239-246; Anal. Biochem., 278, 123-131 (2000); J. Immunol. Methods, 99 (1987) 107-112; Anal. Biochem., 250, 203-211 (1997); Science, Vol. 289, 1760-1763].
그러나, 상기 보고서의 방법에 따라서는, 고밀도로 담체상에 항체를 고정화시키는 것은 불가능하고, 이 방법은 비록 다량의 항체가 필요하나 고정화 효율이 낮다는 점에서 문제가 있다.
알레르기의 원인(알레르겐)의 동정을 위해서는, 실제적으로 IgE 의 검출방법이 사용된다. 이는 알레르기의 발현을 통해 알레르기의 원인인 알레르겐에 특이적으로 결합하는 IgE 의 생성을 이용한다. 구체적으로는, 환자의 혈청 IgE 를 알레르겐과 반응시키며, 표지된 항-IgE 항체를 이용하여 검출한다.
시료중의 IgE 와 유리 슬라이드상에 고정화된 효소 표지 항-인간 IgE 항체와 반응시킨후, 이것을 효소로 표지된 항-인간 IgE 항체와 반응시켜 항-인간 IgE 항체-IgE-효소 표지 항-인간 IgE 항체 복합체를 생성시키고, 복합체내 표지를 검출하는 것으로 이루어진 방법 (Methods in Enzymology, Vol. 184, 501-507, 1990); 알레르겐을 필터지에 결합시키고, 이를 혈청 시료와 반응시키고, 이를 시프리디나(Cypridina)유래 루시퍼라아제 표지 항-IgE 항체로 검출하는 방법 (JP-A 5-113443); 친화성 컬럼을 이용하는 방법 (JP-T 5-508220 - 용어 “JP-T” 는 본원에서 PCT 특허 출원의 간행된 일본어 번역을 의미한다); 항-IgE 항체를 이 관능성 시약을 이용하여 폴리스티렌 플레이트 또는 유리섬유 필터와 같은 고체상 담체상에 고정화시키는 방법 (JP-T 8-509064), 등이 구체적으로 공지되어 있다.
그러나, 상기 보고서의 상기 방법들에서 조차, 다양한 알레르겐 또는 항-IgE 항체를 담체상에 고밀도로 고정화시키는 것은 여전히 불가능하고, 이 방법들은 비록 다량의 항체가 필요하더라도 고정화 효율은 낮다는 점에서 여전히 문제가 있다.
본 발명은 전술한 상황을 고려하여 이루어진 것이며, 이의 목적은 고정화된 생리활성물질의 밀도가 높고, 고정화 효율이 높은, 생리활성물질 고정화 담체, 고정화 담체의 제조 방법, 고정화 담체를 이용하여 시료중의 대상성분을 효율적으로 분석하는 방법 및 분석용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명자는 상기의 목적을 달성하고자 예의 연구한 결과, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층이 표면상에 형성된 담체를 사용하여 이에 생리활성물 질을 고정화시키는 경우, 담체상에 관능기를 고밀도로 배위시켜, 생리활성물질의 관능기를 담체의 관능기와 결합시킴으로써 담체상에 고정화시킬 수 있으며, 그 결과, 고정화 효율이 증가하고, 생리활성물질 고정화 담체를 이용함으로써 시료중 대상성분의 분석시 효율이 증가됨을 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자는 본 발명에 이르게 되었다.
특히, 청구항 1 의 발명은 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층이 표면상에 형성되고, 층상에 생리활성물질이 고정화된 생리활성물질 고정화 담체를 제공한다.
담체의 표면상에 생리활성물질을 고정화시키기 위해서는, 예컨대, 물리적 흡착 고정화 또는 화학적 결합 고정화중 임의의 자체 공지된 고정화 방법을 이용가능하다. 바람직하게는, 청구항 2 에서와 같이, 상기 물질은 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기를 통해 담체 표면상에 고정화된다. 좀더 바람직하게는, 청구항 3 에서와 같이, 이는 생리활성물질의 관능기의 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기에의 결합을 통해 담체 표면상에 고정화된다.
이 경우, 청구항 4 에서와 같이, 생리활성물질의 관능기 및/또는 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기는 히드록실기, 카르복실기, 술포기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 아미노페닐기 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다.
좀더 바람직하게는, 청구항 5 에서와 같이, 생리활성물질은 유기체 또는 생물학적 단백질 또는 펩티드, 좀더 더 바람직하게는, 청구항 6 에서와 같이, 항원 및/또는 항체에 특이적 작용을 갖는 물질이다. 특히, 청구항 7 에서와 같이, 생리활성물질은 특히 바람직하게는 종양 마커, 호르몬, 호르몬 교란 화학물질, 미생물 유래 단백질 또는 펩티드 또는 당쇄 항원, 수용체, 리간드, 알레르겐, 면역글로불린, 렉틴, 당쇄, 지질, 리포폴리사카라이드 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다.
구체적으로는, 청구항 8 에서와 같이, 생리활성물질은 바람직하게는 알레르겐, 면역글로불린 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다.
또한 바람직하게는, 청구항 9 및 10 에서와 같이, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층은 결정성 탄소 및/또는 비정성 탄소를 포함한다. 좀더 구체적으로는, 청구항 11 에서와 같이, 결정성 탄소는 바람직하게는 다이아몬드 또는 다이아몬드류 탄소이고, 청구항 12 에서와 같이, 비정성 탄소는 바람직하게는 흑연 또는 비정성 탄소이다. 이들중, 결정성 탄소가 좀더 바람직하고, 좀더 더 바람직하게는 다이아몬드이다.
청구항 13 의 발명은 생리활성물질 고정화 담체의 제조 방법을 제공하는 것이며, 이는 생리활성물질과 관능기를 갖는 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층이 표면에 형성된 담체와 접촉시키는 것으로 이루어진다.
좀더 구체적으로는, 청구항 14 에서와 같이, 관능기를 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층이 형성된 담체 표면에 도입한 후, 이를 생리활성물질과 접촉시킨다.
이 경우, 청구항 15 에서와 같이, 담체 표면에 도입되는 관능기는 히드록실 기, 카르복실기, 술포기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 아미노페닐기 및 에폭시기로 이루어진 군에서서 선택된 하나 이상이다.
청구항 16 의 발명은 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층이 형성된 담체상에 고정화된 생리활성물질을 제공하는 것이다.
청구항 17 의 발명은 시료중의 대상성분을 분석하는 방법을 제공하는 것이며, 이에는 청구항 1 내지 12 중 어느 하나의 생리활성물질 고정화 담체가 사용된다.
좀더 구체적으로는, 청구항 17 에서와 같이, 생리활성물질 고정화 담체를 분석코자 하는 대상성분을 포함하는 시료와 접촉시키고, 생성된 생리활성물질 및 대상성분의 복합체를 분석한다.
바람직하게는, 제 19 항에서와 같이, 담체 표면상에 고정화된 생리활성물질은 항원 또는 항체중 임의의 것이고, 대상성분은 생리활성물질에 대한 항원 또는 항체이며; 좀더 바람직하게는, 청구항 20 에서와 같이, 항원 또는 항체는 종양 마커, 호르몬, 호르몬 교란 화학물질, 미생물 유래 단백질 또는 펩티드 또는 당쇄 항원, 수용체, 리간드, 알레르겐, 면역글로불린, 렉틴, 당쇄, 지질, 리포폴리사카라이드 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다. 특히, 청구항 21 에서와 같이, 항원 또는 항체는 좀더 바람직하게는 알레르겐, 면역글로불린, 렉틴 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다.
청구항 22 의 발명은 대상성분 분석용 키트를 제공하며, 이는 청구항 1 내지 11 중 어느 하나의 생리활성물질 고정화 담체를 포함한다.
도 1 은 본 발명의 분석 방법에 의한 IgE 의 분석을 나타내는 모식도이다.
도 2 는 본 발명의 분석 방법에 의한 특정의 알레르겐에 대한 IgE 의 분석을 나타내는 모식도이다.
도 3 은 실시예 1 에서의 IgE 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 실시예 2 에서 음성 혈청 검체로서 사용한 알레르겐 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 실시예 2 에서 삼나무 양성 혈청 검체로서 사용한 알레르겐 분석의 결과를 보여주는 도면이다.
도 6 은 실시예 2 에서 진드기 양성 혈청 검체로서 사용한 알레르겐 분석의 결과를 보여주는 도면이다.
본 발명의 최상의 양태
청구항 1 의 발명인 생리활성물질 고정화 담체가 처음에 설명된다.
본 발명의 청구항 1 의 생리활성물질 고정화 담체는 생리활성물질이 고정화되어진 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 표면상에 갖는 것을 특징으로 한다.
청구항 5 에서와 같이, 생리활성물질은 유기체, 또는 생물학적 단백질 또는 펩티드에 특이적 작용을 갖는 물질이다. 구체적으로는, 이에는 단백질, 단백질 유도체, 펩티드, 펩티드 유도체, 사카라이드, 사카라이드 유도체, 지질, 지질 유도체, 등이 포함된다. 좀더 구체적으로는, 청구항 6 에서와 같이, 항원 및/또는 항 체가 바람직한데, 이는 후술될 것과 같이 항원-항체 반응을 통해 생물학적 대상성분의 정확한 분석이 가능하기 때문이다. 특히, 청구항 7 에서와 같이, 종양 마커 (예, 단백질 항원, 예컨데, AFP, PSA, CEA, PGI, PGH; 당쇄 항원, 예컨대, CA19-9, PIVKA-l1, CA125); 호르몬 (예컨대, PTH, T3, T4, TSH, 인슐린, C-펩티드, LH, FSH, 프로락틴); 호르몬 교란 화학물질 (예컨대, 트리부틸 주석, 노닐페놀, 4-옥틸페놀, 디-n-부틸 프탈레이트, 디시클로헥실 프탈레이트, 벤조페논, 옥타클로로스티렌, 디-2-에틸헥실 프탈레이트); 미생물 유래 단백질 또는 펩티드 또는 당쇄 항원 (예, 미생물 유래 단백질 또는 펩티드 또는 당쇄 항원, 예컨대, 결핵균 (tubercle bacilli), 폐렴 구균 (pneumococci), 디프테리아균 (diphtherococci), 수막염균 (meningococci), 임균 (gonococci), 포도구균 (staphylococci), 연쇄상구균 (streptococci), 장내구균 (enterobacteria), 대장균 (colibacilli), 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori)와 같은 세균; 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 엔테로바이러스, 폴리오바이러스, EB 바이러스, HAV, HBV, HCV, HIV, HTLV와 같은 바이러스; 칸디다균 (Gandida), 크립토코커스 (Cryptococcus)와 같은 진균; 렙토스피레 (leptospire); 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)과 같은 스피로헤테균 (spirochete); 클라미디아 (Chlamydia), 마이코플라즈마(Mycoplasma); 수용체 (예컨대, 에스트로겐에 대한 수용체, TSH); 리간드 (예컨대, 에스트로겐, TSH); 알레르겐 (예컨대, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염과 같은 알레르기의 원인이 되는 흡입성 알레르겐, 예컨대, 식품 알레르겐 - 좀더 구체적으로는, 진드기, 예컨대, 디. 파리내 (D. farinae), 디.테로니시너스 (D.pteronyssinus)와 같은 집안 먼지유래의 알레르겐; 삼나무, 노송나무, 강피, 누더기풀, 큰조아제비, 호밀풀; 고양이, 개, 게와 같은 동물; 벼, 난백과 같은 식품; 및 진균, 곤충, 목재, 약물 및 화학적 물질에서 유래되는 기타 알레르겐, 등); 면역글로불린 (예컨대, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 및 이들의 분해 산물); 렉틴 (예컨대, 콘카나발린 (concanavalin) A, 렌틸 렉틴, 키드니 콩 (kidney bean) 렉틴, 다투라 (datura) 렉틴, 밀배아 렉틴); 당쇄 (예컨대, ABO 항원); 지질 (예컨대, 콜레스테롤과 같은 지질; 카르디오리핀, 포스파티딜콜린과 같은 인지질; 스핑고미엘린과 같은 스핑고인지질; 리포단백질), 리포폴리사카라이드 (예컨대, 엔도톡신), 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 특히 바람직하다.
수용체, 리간드, 렉틴, 종양 마커 (당쇄), 단백질 또는 펩티드중의 임의 것이 생리활성물질로 사용되는 경우, 목적하는 대상성분은 항원-항체 반응 및 수용체-업셉터 반응, 렉틴-당쇄 반응 또는 단백질-펩티드 사슬 반응을 통해 분석할 수 있다.
본 발명의 생리활성물질 고정화 담체를 시료중 대상성분의 분석을 위하여 사용하는 경우, 이를 위해서는 분석코자 하는 대상성분에 특이적으로 결합하는 적합한 생리활성물질이 선택되어야 한다. 예컨대, 시료중 분석코자 하는 대상성분이 항원이면, 항체가 담체상에 고정화된 생리활성물질로 선택되고; 대상성분이 항체이면, 항체에 대한 항원 또는 항체에 대한 항체를 선택한다.
만일 둘 이상의 상이한 생리활성물질을 사용하면, 하나의 시료중의 둘 이상의 상이한 대상성분이 하나의 작업에서 동시에 분석될 수 있거나, 또는 미지의 대 상성분이 분석, 또는 검출 또는 특정 또는 동정될 수 있다.
분석코자 하는 대상성분이 수용체, 리간드, 렉틴, 종양 마커 (당쇄), 단백질 또는 펩티드중 임의의 것이면, 수용체에 대한 리간드, 리간드에 대한 수용체, 렉틴에 대한 당쇄, 종양 마커 (당쇄)에 대한 렉틴, 단백질에 대한 펩티드 사슬, 또는 펩티드에 대한 단백질을 각각 생리활성물질로 선택할 수 있다.
본 발명에서, 알레르겐, 면역글로불린 (특히 IgE) 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생리활성물질을 담체상에 고정화시켜 제조한 생리활성물질 고정화 담체를 청구항 8 에서와 같이 사용하면, 알레르기 관련 분석을 할 수 있으며, 이는 본 발명의 하나의 바람직한 구현예이다.
특히, 예컨대, 알레르겐에 대한 항체를 생리활성물질로 선택하면, 알레르겐 분석을 할 수 있고 (시료중 알레르겐의 존재 유무 및 알레르겐 정량화); 알레르겐을 생리활성물질로 선택하면, 알레르기의 원인인 알레르겐의 특이적 분석을 할 수 있다 (만일 존재한다면, 어떤 알레르겐에 대해 어떤 알레르겐 반응이 존재하는지의 여부 및 알레르기 반응의 정도에 대하여). 항-IgE 항체를 생리활성물질로 선택하면, 시료중의 모든 IgE 양을 정량화할 수 있다 (시료가 알레르기 반응의 어느 정도까지 알레르기 체질을 유발할 수 있는지의 여부에 대하여).
전술한 바와 같이, 둘 이상의 상이한 생리활성물질을 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층이 형성된 담체의 표면상에 고정화시키는 경우, 전술한 바와 같이, 생리활성물질이 고정화되는 위치는 담체의 표면에 주어진 적당한 표시로 명확히 하는 것이 바람직하다 (예컨대, 위치에 번호를 붙인다).
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층이 표면에 형성되어 있는 담체상에 고정화시킬 생리활성물질의 양은, 담체의 표면적 및 생리활성물질의 성질 및 유형에 따라 변하기 때문에 한 마디로 정의할 수는 없다. 예컨대, 이는 통상적으로 담체의 단위 면적 (cm2) 내 고정화시킬 생리활성물질의 양으로, 0.1 ng 내지 1 mg, 바람직하게는 1 ng 내지 100 ㎍ 일 수 있다.
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층이 형성되는, 본 발명에서 사용하기 위한 본 발명의 담체는 (이는 이후 “탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체"라 한다) 담체의 표면이 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물로 피복된 것을 의미한다. 구체적으로는, 청구항 9 및 10 에서와 같이, 탄소 및 금속 또는 반금속 탄소 화합물에는, 탄소, 예컨대, 결정성 탄소 및 비정성 탄소, 및 금속 탄소 화합물 및 반금속 탄소 화합물이 포함된다.
좀더 구체적으로는, 결정성 탄소는, 청구항 11 에서와 같이, 바람직하게는 다이아몬드 또는 다이아몬드류 탄소이고; 및 비정성 탄소는, 청구항 12 에서와 같이, 바람직하게는 흑연 또는 비정성 탄소이다. 금속 탄소 화합물은 바람직하게는 탄화텅스텐 또는 탄화티타늄이고; 반금속 탄소 화합물은 바람직하게는 탄화규소이다. 다이아몬드에는 탄소화를 통해 생성된 합성 다이아몬드, 고압하 생성된 합성 다이아몬드 및 천연 다이아몬드가 포함된다. 이의 구조와 관련하여서는, 결정성 탄소 화합물은 단일 결정 또는 다결정 구조를 가질 수 있다.
이들 탄소, 및 금속 또는 반금속 화합물중의 하나 이상을 본원에서는 단독 또는 배합하여 사용할 수 있다. 다이아몬드 또는 다이아몬드류 탄소와 같은 결정성 탄소, 및 흑연 또는 비정성 탄소 비정성 탄소가 바람직하며, 다이아몬드 또는 다이아몬드류 탄소와 같은 결정성 탄소가 이에 다량의 생리활성물질이 결합될 수 있기 때문에 좀더 바람직하다.
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체를 수득하기 위하여 상기의 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물로 피복시키는 담체는 임의의 무기 담체, 예컨대, 다양한 세라믹, 예컨대, 유리, 실리카겔, 규소, 또는 페라이트, 철, 니켈 또는 코발트를 주성분으로 하는 합금; 또는 유기 담체, 예컨대, 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌 유도체, 말레산 무수물계 중합체, 나일론, 폴리아크릴로니트릴 및 기타 유기 합성 중합체일 수 있다. 담체의 형상은 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 이는 입상, 판상, 봉상, 막상, 디스크상 또는 원반상의 임의의 형상일 수 있다. 이들중, 유리가 저렴하고 입수 용이하여 바람직하다.
담체의 크기는 이의 사용용도에 따라 변하며, 특별히 제한되지는 않는다. 예컨대, 이는 100 cm2 이하, 바람직하게는 50 cm2 이하, 좀더 바람직하게는 25 cm2
이하일 수 있다.
통상적으로, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 두께는 바람직하게는 1 nm 이상이다. 좀더 바람직하게는, 이는 1.5 nm 내지 1000 nm 이다. 만일 층의 두께가 1 nm 미만이 면, 코팅층은 실제적으로 비효과적일 것으며; 만일 1000 nm 을 초과하면, 단지 실제적 코팅층의 극표면만을 이용할 수 있기 때문에, 층의 제조에서의 노력 및 경비의 면에서 무용할 것이다.
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층은 담체에 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물을 임의의 공지된 방법으로 도포하여 형성될 수 있다. 이를 위한 공지의 방법에는 마이크로웨이브 플라즈마 CVD, ECRCVD, IPC, DC 스퍼터링, ECR 스퍼터링, 이온 도금, 아크이온 도금, EB 증착, 저항 가열 증착, 슬러리 코팅이 포함된다 (JP-A 10-95695, 8-296044, 8-165576, 8-74056).
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면은 평활할 수 있거나, 의도적으로 조면화될 수 있다. 이의 표면의 조면화는 담체의 표면적이 증가되어, 표면상에 다량의 생리활성물질을 고정화시키는데 유리하다.
담체의 표면상에 생리활성물질을 고정화시키기 위하여, 예컨대, 물리적 흡착 고정화 또는 화학적 결합 고정화중 임의의 자체 공지된 고정화 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 청구항 2 에서와 같이, 상기 물질은 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기를 통해 담체 표면상에 고정화된다. 좀더 바람직하게는, 청구항 3 에서와 같이, 이는 생리활성물질의 관능기의 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기에의 결합을 통해 담체 표면상에 고정화된다.
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기는 직접적으로 또는 스페이서 등을 통해 간접적으로 생리활성물질에 결합할 수 있는 임의의 것일 수 있다. 구체적으로는, 청구항 4 에서와 같이, 이는 히드록실기, 카르복실기, 술포기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 아미노페닐기 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
마찬가지로, 또한 생리활성물질의 관능기는 직접적으로 또는 스페이서 등을 통해 간접적으로, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기에 결합할 수 있는 임의의 것일 수 있다. 이의 구체적인 예로서, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기로 전술한 것을 들 수 있다.
이러한 관능기의 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면으로의 도입은 담체 표면을 화학적으로 수식하고 활성화시키는 것에 의해서 행해질 수 있다.
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체 표면의 화학적 수식을 위해서, 히드록실기, 카르복실기, 술포기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 아미노페닐기 또는 에폭시기와 같은 관능기를 담체 표면에 직접적으로 결합시킬 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 이러한 관능기는 상기에 탄소수 1 이상, 좀더 바람직하게는 1 내지 12, 좀더 더 바람직하게는 1 내지 6의 탄화수소기와 같은 스페이서를 통해 결합될 수 있다. 예컨대, 관능기가 카르복실기이면, 모노카르복실산, 예컨대, 포름산, 아세트산 또는 프로피온산, 또는 디카르복실산, 예컨대, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산 또는 푸마르산, 또는 폴리카르복실산, 예컨대, 트리멜리트산, 바람직하게는 옥살산 또는 숙신산을 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 표면에 결합시킬 수 있다.
이러한 관능기를 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 화학적 수식 표면에 직접적으로 또는 스페이서를 통해 도입하기 위해서는, 예컨대, 담체 표면을 산소 플라즈마로 산화시킨 후, 이를 스팀으로 가공처리하는 방법; 또는 담체 표면을 스팀으로 가공 처리한 후, 염소가스하 UV 선에 노출시켜 담체 표면을 염소화시키고, 이어 이를 알칼리 용액에서 가수분해시켜 히드록실화시키는 방법; 또는 담체 표면을 산소 플라즈마로 산화시킨 후, 이를 염소화시키고, 이어 이를 알칼리 용액에서 가수분해하여 가수분해시키는 방법; 또는 담체 표면을 수소화시킨 후, 이를 염소가스하 UV 선에 노출시켜 염소화시키고, 이어 이를 비수성용매에서 소듐 카르복실레이트와 반응시키는 방법을 이용할 수 있다.
좀더 구체적으로는, 예컨대, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 카르복실기에 의해서 화학적으로 수식되는 경우, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면은 수소화, 염소화, 아민화 및 이어 카르복실화하는 것이 바람직하다.
자세히는, 담체 표면을 수소화한 후, 담체상의 탄소 물질의 표면을 염소가스하 UV 선에 노출시켜 염소화시키고, 이어서 이를 암모니아 가스하 UV 선에 노출시켜 아민화시키고, 또 이어 디카르복실산과 축합시키는 것이 바람직하다.
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체상의 생리활성물질의 고정화는 담체 표면에 존재하는 관능기의 유형에 기초하여, 후술되는 방식으로 행해질 수 있다 (예컨대, Methods in Enzymology, Vol. 44, pp. 11-148 (1976))
(1) 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 관능기가 아미노기인 경우:
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 아미노기로 화학적으로 수식되면, 생리활성물질의 카르복실기는 N-히드록시숙신이미드 또는 카르복시디이미드와 같은 축합시약을 이용하여 담체 표면내 아미노기에 결합시켜 생리활성물질을 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다.
이와 별도로, 담체 표면의 아미노기는 포스겐과의 반응을 통해 이소시안화시킨 후, 이를 생리활성물질 유래 아미노기에 결합시켜 생리활성물질을 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다. 또한, 담체 표면의 아미노기는 티오포스겐과의 반응을 통해 이소티오시안화시킨 후, 이를 생리활성물질 유래 아미노기에 결합시켜 생리활성물질을 또한 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다.
또한, 담체 표면의 아미노기는 글루타르알데히드와 반응시킬 수 있으며, 이는 생리활성물질 유래 아미노기 또는 페놀기와 반응시켜 생리활성물질을 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다.
생리활성물질이 당단백질과 같은 사카라이드 또는 사카라이드 유도체이면, 이는 처음에 과옥소산과 반응시킨 후 담체 표면의 아미노기와 반응시키고, 이어서 이를 소듐 보로히드라이드 등으로 환원하여, 상기 물질을 담체 표면에 고정화시킬 수 있다.
한편, 담체 표면의 아미노기는 말레이미도기를 갖는 이관능성 스페이서, 예컨대, m-말레이미도벤조일 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 또는 피리딜디티오술피도기를 갖는 이관능성 스페이서, 예컨대, 4-숙신이미딜옥시카르보닐-α-(2-피리딜디티오) 톨루엔으로 말레이미드화 또는 피리딜디티오술피드화될 수 있으며, 생성된 말레이미드화 또는 피리딜디티오술피드화 담체는 생리활성물질의 티올기와 반응시켜 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다.
(2) 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 관능기가 카르복실기인 경우:
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 카르복실기로 화학적으로 수식되면, 담체 표면의 카르복실기는 N-히드록시숙신이미드 또는 카르보디이미드와 같은 축합시약을 이용하여 생리활성물질의 아미노기와 반응시켜, 생리활성물질을 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다. 이와 별도로, 담체 표면의 카르복실기는 티오닐 클로라이드와 반응시켜 카르복시 클로라이드를 형성시킬 수 있다. 생성된 카르복시 클로라이드는 생리활성물질 유래 아미노기와 반응시켜 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다.
또한, 담체 표면의 카르복실기는 염산 및 메탄올을 첨가하여 이와 반응시킨 후, 여기에 또한 히드라진을 첨가하여 반응시켜 히드라진을 형성시키고, 생성된 히드라지드에 소듐 니트라이드 및 염산을 첨가하여 아실아지드화시켜 담체 표면을 활성화시킨 후, 이렇게 활성화된 담체 표면을 생리활성물질 유래 아미노, 티올 또는 히드록실기와 반응시켜 상기 물질을 담체 표면에 고정화시킬 수 있다.
또한, 담체 표면의 카르복실기는 이의 무수물로 전환되며, 이는 (탈수축합을 통해) 생리활성물질 유래 아미노기와 반응하여 상기 물질을 담체 표면에 고정화시킨다.
(3) 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 관능기가 히드 록실기인 경우:
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 히드록실기로 화학적으로 수식되면, 피복된 담체 표면의 히드록실기는 염화시아눌산과 반응시켜 트리아지닐 유도체를 형성시키고, 이에 생리활성물질 유래 아미노기를 결합시켜, 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킨다.
이와 별도로, 담체 표면이 히드록실기로 화학적으로 수식되면, 담체 표면의 히드록실기는 아세틸화 또는 브롬화될 수 있으며, 이어서 이를 NaI 와 반응시켜 브롬을 요오드로 치환시켜 담체 표면을 활성화시킨 후, 이를 생리활성물질 유래 아미노, 티올 또는 히드록실기와 반응시켜 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킨다.
또한, 담체 표면의 히드록실기는 시아노겐 브로마이드와의 반응을 통해 활성화될 수 있으며, 이는 생리활성물질 유래 아미노기에 공유결합되어 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다.
(4) 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 관능기가 에폭시기인 경우:
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 에폭시기로 화학적으로 수식되면, 이를 생리활성물질 유래 히드록실기 (티로신 또는 세린에서 유래된 것), 또는 아미노 또는 티올기와 반응시켜 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다.
(5) 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 관능기가 술포기인 경우:
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 술포기에 의해 화학적으로 수식되면, 담체 표면의 술포기는 클로로술폰산과 반응하여 술폰 클로라이드를 형성할 수 있으며, 이어서 이를 생리활성물질 유래 아미노, 이미다졸, 티올 또는 페놀기와 반응시켜 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킨다.
(6) 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 관능기가 아미노페닐기인 경우:
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 아미노페닐기로 화학적으로 수식되면, 담체 표면의 아미노페닐기는 소듐 술피트 및 염산으로 활성화시킬 수 있으며, 이어서 이를 생리활성물질 유래 아미노, 티올, 페놀, 이미다졸 또는 구아니디노기와 디아조늄 커플링 방식으로 반응시켜 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킨다.
(7) 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 관능기가 시아노기인 경우:
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 시아노기로 화학적으로 수식되면, 시아노기는 산촉매 존재하 가수분해된 후 카르복실기로 전환될 수 있다. 이를 이용하여, 담체는 생리활성물질 고정화에 대한 상기 (2) 와 동일한 방식으로 가공처리될 수 있다.
(8) 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 관능기가 니트로기인 경우:
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 니트로기로 화학적으로 수식되면, 니트로기는 리튬 알루미늄 히드라이드와 같은 환원제로 환원된 후 아미노기로 전환될 수 있다. 이를 이용하여, 담체는 생리활성물질 고정화에 대한 상기 (1) 과 동일한 방식으로 가공처리될 수 있다.
(9) 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 관능기가 티올기인 경우:
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면이 티올기로 화학적으로 수식되면, 생리활성물질의 아미노기는 말레이미도기를 갖는 이관능 스페이서, 예컨대, m-말레이미도벤조일 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 또는 피리딜디티오술피도기를 갖는 이관능성 스페이서, 예컨대, 4-숙신이미딜옥시카르보닐-α-(2-피리딜디티오) 톨루엔으로 말레이미드화 또는 피리딜디티오술피드화될 수 있으며, 생리활성물질을 담체 표면의 티올기와 반응시켜 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킨다.
전술한 이관능성 스페이서 대신에 비스말레이미도헥산 또는 1,4-디-[3'-2'-피리딜디티오(프로피온아미도)]부탄과 같은 상이한 이관능성 스페이서를 이용하여, 담체 표면의 티올기를 생리활성물질의 티올기와 반응시켜 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시킬 수 있다.
담체 표면의 관능기 및 생리활성물질의 관능기가 상기의 방법의 것과 상이하더라도, 전술한 방법은 상호간 결합시키고자 하는 관능기의 조합이 상기 방법과 동일한 임의의 기타 경우에도 적용가능하다.
바람직하게는, 담체의 표면에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합 물 층에 생리활성물질이 고정화된 본 발명의 생리활성물질 고정화 담체는 임의의 비특이적 흡착에 의한 분석에의 영향을 방지하기 위하여, 블록킹제, 좀더 구체적으로는, 알부민, 글로불린, 카제인, 폴리비닐 알코올, 계면활성제, 실란 커플링제, 티타늄 커플링제, 알루미늄 커플링제 등으로 블록킹한다. 본 발명의 담체는 상이하고 다양한 조건, 예컨대, 건조, 냉동, 동결건조후, 또는 적합한 버퍼중에서 저장될 수 있다.
버퍼는, 예컨대, 트리스-버퍼, 포스페이트 버퍼, 베로날 버퍼, 보레이트 버퍼, 굿(Good)버퍼, 등을 포함한 당해 기술에서 통상적으로 사용하는 임의의 것일 수 있다. 이런 유형의 버퍼는 알부민, 글로불린, 수용성 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 안정화제, 계면활성제 및 사카라이드중 임의의 것을 포함할 수 있다.
담체 표면에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 둘 이상의 상이한 생리활성물질이 고정화된 본 발명의 생리활성물질 고정화 담체를 제조하기 위해서는, 생리활성물질로 상이한 둘 이상의 적합한 생리활성물질을 사용하는 것 이외에는 상기한 방법에 준하여 행할 수 있다.
다음에는 담체의 표면에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 생리활성물질이 고정화된 본 발명의 생리활성물질 고정화 담체의 제조 방법이 설명된다.
청구항 13 에서와 같이, 생리활성물질을 표면상에 관능기를 갖는 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층이 형성된 담체와 반응시키고, 상기 물질을 전술한 바와 같은 임의의 자체 공지된 고정화 방법, 예컨대, 담체가 물리적으로 상기 물질을 흡착하도록하여 상기 물질을 고정화하는 방법 (물리적 결합 방법)으로 담체의 표면에 고정화시킨다. 이 방식으로, 담체의 표면상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 생리활성물질이 고정화된, 목적하는 생리활성물질 고정화 담체가 제조된다.
바람직하게는, 표면에 관능기가 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체와 생리활성물질을 접촉시켜, 상기 물질과 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기의 화학적 결합을 통해 (화학적 결합 방법) 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시키며, 이로 담체 및 생리활성물질 사이의 결합을 좀더 공고히 할 수 있다. 특히, 생리활성물질의 관능기를 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기에 화학적으로 결합시켜 상기 물질을 담체 표면상에 고정화시키는 것이 좀더 바람직하다.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 생리활성물질, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 및 담체의 구체적인 예 및 구현예, 및 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 형성방법은 전술한 바와 동일할 수 있다.
또한, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 도입시키는 관능기의 유형 및 조합, 및 전자에 결합되는 생리활성물질의 관능기 또한 전술한 바와 동일할 수 있다. 생리활성물질의 관능기 및 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 관능기는 직접적으로 또는 스페이서 등을 통해 간접적으로 상호간 결합될 수 있는 임의의 것일 수 있다. 구체적으로는, 청구항 15 에서와 같이, 이것은 히드록실기, 카르복실기, 술포기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 아미노페닐기 및 에폭시기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 제조 방법은, 예컨대, 하기와 같이 수행할 수 있다.
물리적 결합 방법에 있어서, 예컨대, 생리활성물질 함유 용액을 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체에, 예컨대, 코팅, 드롭핑 적용 또는 분무 방식으로 적용시키거나, 또는 담체를 상기 용액에 침지시키거나, 또는 시판용 스탬핑 장치 (예컨대, Nippon Laser Electronics)을 사용하여 담체를 생리활성물질과 접촉시킨다. 이렇게 처리된 담체를 건조시켜 물리적 흡착을 통해 담체의 표면상에 생리활성물질이 고정화되도록 한다. 이러한 방식으로, 담체 표면상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 생리활성물질이 고정화된 목적하는 생리활성물질 고정화 담체가 제조된다.
화학적 결합 방법에 있어서, 예컨대, 생리활성물질 함유 용액을 표면에 관능기를 갖는 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체에, 예컨대, 코팅, 드롭핑 적용 또는 분무 방식으로 적용시키거나, 또는 담체를 상기 용액에 침지시키거나, 또는 시판용 스탬핑 장치 (예컨대, Nippon Laser Electronics)을 사용하여 담체를 생리활성물질과 접촉시킨다. 이를 이용하여, 담체의 관능기를 생리활성물질, 구체적으로는 생리활성물질의 관능기와 반응시켜 이 둘사이의 자체 공지된 화학적 결합을 통해 이 둘을 화학적으로 결합시켜 담체 표면상에 생리활성물질을 고정화시킨다. 이러한 방식으로, 담체의 표면상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 생리활성물질이 고정화된 목적하는 생리활성물질 고정화 담체가 제조된다.
탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체가 생리활성물질이 결합하기에 적합한 관능기를 갖지 않는 경우, 적합한 관능기는 처음에 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면에 도입한 후, 청구항 14 에서와 같이, 담체를 전술한 방식으로 생리활성물질과 접촉시킬 수 있다.
전술한 방법에 있어서, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층 형성 담체의 표면에 관능기의 도입 방법은 전술한 바대로이다.
전술한 방법에 있어서, 당해 기술에서 통상적으로 사용하는 임의의 것을 생리활성물질 함유 용액의 제조에서 사용할 수 있다. 예컨대, 이에는 트리스-버퍼, 포스페이트 버퍼, 베로날 버퍼, 보레이트 버퍼 및 굿 버퍼가 포함된다. 고정화를 위한 이의 용액내 존재하는 생리활성물질의 양은 한마디로 정의될 수 없고, 사용하는 생리활성물질의 성질 및 유형에 따라 변한다. 통상적으로, 이는 1 ng/ml 내지 1000 mg/ml, 바람직하게는 1 ㎍/ml 내지 10 mg/ml, 좀더 바람직하게는 10 ㎍/ml 내지 2 mg/ml 일 수 있다. 이런 유형의 생리활성물질 함유 용액을 사용하여, 상기 물질을 담체 표면에 고정화시켜 이의 농도를 전술한 범위내로 할 수 있다.
청구항 16 의 발명은 탄소 또는 금속 또는 반금속 화합물 층이 형성된 담체상에 고정화된 생리활성물질에 관한 것이다.
이런 유형의 고정화 생리활성물질은 이제까지 알려져 있지 않으며, 생리활성물질에 결합 성질을 갖는 시료중의 대상성분을 정확하고 고감도로 검출할 수 있다.
이런 유형의 고정화 생리활성물질에 있어서, 생리활성물질, 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 및 담체의 구체적인 예 및 구현예, 및 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 형성 방법 및 고정화 방법은 전술한 바와 동일할 수 있다.
담체 표면에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 생리활성물질이 고정화된 담체를 전술한 방법에 의해 수득한 후, 담체는 당해기술에서 통상적으로 사용하는 보통의 방법, 예컨대, 알부민, 글로불린, 카제인, 폴리비닐 알코올, 계면활성제, 실란 커플링제, 티타늄 커플링제, 알루미늄 커플링제 등을 함유하는 용액에 담체를 침지시켜 블록킹하는 것이 바람직하다.
다음에는 시료중 대상 성분을 분석하기 위한 본 발명의 청구항 17 의 방법을 설명한다.
본 발명의 청구항 17 의 방법에서는, 청구항 1 내지 12 중의 어느 하나의 생리활성물질 고정화 담체를 사용한다. 생리활성물질 고정화 담체를 사용함으로써, 시료중의 대상 성분을 효과적이고, 고감도로 정확하게 분석할 수 있다.
좀더 구체적으로는, 청구항 18 에서와 같이, 청구항 1 내지 12 의 생리활성물질 고정화 담체는 처음에 분석코자하는 대상성분이 함유된 시료와 접촉시켜 담체상에 고정화된 생리활성물질과 시료중의 대상성분의 복합체를 형성시킨다. 이어서, 생성된 복합체를 분석하여 시료중 대상성분을 분석한다.
본 발명의 분석 방법에서 사용하기 위한 생리활성물질 고정화 담체가 담체상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층의 표면상에 고정화된 둘 이상의 상이한 생리활성물질을 가지면, 시료중 목적하는 대상 성분은 좀더 효과적 이고, 좀더 민감하며, 좀더 정확하게 분석될 수 있으며, 또한, 하나의 시료중의 둘 이상의 상이한 대상 성분을 하나의 작업에서 동시에 분석할 수 있으며, 미지의 대상 성분을 분석(특정, 동정)할 수 있다.
좀더 구체적으로는, 시료는 시료중의 모든 대상성분이 담체상에 고정화된 둘 이상의 상이한 생리활성물질과 실질상 동시에 접촉할 수 있는 방식으로 담체의 표면상에 적용되며, 생성된 각각의 고정화된 생리활성물질과 시료중의 각각의 대상 성분의 복합체를 분석하여 시료중의 목적하는 대상성분을 분석한다.
본원에서 분석코자 하는 대상성분은 특이적으로 생리활성물질에, 예컨대, 항원-항체 반응, 수용체-리간드 반응, 렉틴-당쇄 반응 또는 단백질-펩티드 사슬 반응을 통해 결합하는 능력을 가진 성분이다. 좀더 구체적으로는, 이에는 전술한 생리활성물질이 포함된다. 생리활성물질 및 분석코자 하는 대상성분의 조합은 전술한 바대로이다.
시료에는, 예컨대, 혈청, 혈장, 골수액, 활액, 림프액 등의 체액; 소변, 대변과 같은 배설물; 객담, 고름, 피부 유래물 등의 생체유래 시료; 식품, 음료, 수도물, 해수, 호수물, 늪물, 하천수, 공장폐액, 반도체용 세척수, 및 의료기구 등의 세척후의 세척액등의 기타 환경시료; 및 이를 물 또는 당해 기술에서 통상적으로 사용하는 버퍼, 예컨대, 트리스-버퍼, 포스페이트 버퍼, 베로날 버퍼, 보레이트 버퍼 또는 굿버퍼에 용해시켜 이들로부터 재구성한 처리물이 포함된다.
본 발명의 분석방법에 있어서, 담체 표면상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층상에 생리활성물질이 고정화된 생리활성물질 고정화 담체와 분석코자 하는 대상성분을 포함하는 시료를 접촉, 및 시료중의 분석코자하는 대상성분 모두와 둘 이상의 상이한 유형의 생리활성물질이 고정화된 생리활성물질 고정화 담체를 실질적으로 동시에 접촉시키기 위해서는, 예컨대, 코팅 또는 드롭핑 적용방식으로 시료를 담체에 적용하는 방법 또는 시료에 담체를 침지시키는 방법을 사용할 수 있다.
전술한 방법에서 담체상에 고정화된 생리활성물질과 시료중의 대상 성분의 복합체를 분석하기 위해서는, 통상적으로, 대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 성질을 가진 표지된 결합 물질을 복합체와 접촉시켜, 고정화된 생리활성물질, 시료중의 대상성분 및 표지된 결합 물질의 복합체 (표지된 복합체)를 형성하여, 표지된 복합체내 표지 물질을 검출한다. 이러한 검출 데이타에 근거하여, 생리활성물질 및 시료중의 대상성분의 복합체를 분석한다.
분석코자 하는 대상성분이 일부 방법에서 직접적으로 검출가능한 성분, 예컨대, 효소, 염료, 형광물질, 발광물질, 또는 UV 흡수성물질인 경우, 이는 전술한 표지된 결합 물질이 항상 필요한 것은 아니다. 고정화된 생리활성물질과 시료중의 대상 성분의 복합체와 복합체에 특이적으로 결합하는 특성을 가진 표지된 결합 물질의 접촉은 담체상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층상에 생리활성물질이 고정화된 생리활성물질 고정화 담체를 대상성분 함유 시료와 접촉시키는 경우와 동일한 방식으로 수행할 수 있다.
대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 특성을 가진 표지된 결합 물질은 대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 성질을 가지며, 일부 방법에서 검 출될 수 있는 물질이다. 통상적으로, 이는 표지 물질로 표지되고, 대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 물질이다. 대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 물질은 전술한 생리활성물질과 동일하며, 이는 통상적으로 대상성분 또는 복합체에 대한 항체 또는 항원이다.
본 발명에서 사용하기 위한 표지 물질은 효소 면역분석 (EIA), 방사선 면역분석 (RIA), 형광 면역분석 (FIA), 하이브리드화 등을 위해 당해 기술에서 통상적으로 사용가능한 임의의 것일 수 있다. 예컨대, 이에는 알칼리 포스파타아제 (ALP), β-갈락토시다아제 (β-Gal), 퍼옥시다아제 (POD), 마이크로퍼옥시다아제, 글루코오스 옥시다아제 (GOD), 글루코오스-6-포스페이트 디히드로게나아제 (G6PDH), 말레이트 디히드로게나아제, 루시퍼라아제와 같은 효소; 쿠마시 브릴런트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R250, 메틸 오렌지와 같은 염료; 99mTc, 131I, 125
I, 14C, 3H, 32P, 35S 와 같은 방사선 동위원소; Cy3, 플루오레세인 (fluorescein), 로다마인 (rhodamine), 단실 (dansyl), 플루오레사민(fluorescamin), 쿠마린(coumarin), 나프틸아민(naphtylamine) 및 이의 유도체; 유로피윰 (Eu)과 같은 형광물질; 루시페린, 이소루미놀, 루미놀, 비스(2,4,6-트리클로로페닐)옥살레이트와 같은 발광물질; 페놀, 나프톨, 안트라센 및 이들의 유도체와 같은 UV 흡수성 물질; 통상의 옥실기 함유 화합물, 예컨대, 4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-l-옥실, 3-아미노-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-1-옥실, 2,6-디-t-부틸-α-(3,5-디-t-부틸-4-옥소-2,5-시클로헥사디엔-1-일리덴)-p-톨릴옥실과 같은 스핀 표지제로 서의 성질을 갖는 물질이 포함된다.
대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 표지 물질에 의한 대상성분 또는 복합체의 표지화는 당해 기술에서 통상적으로 사용할 수 있는 임의의 통상적 방법, 예컨대, 자체 공지된 EIA, RIA, FIA 또는 하이브리드화에서 통상적으로 사용하는 자체 공지된 방법 [예컨대, Medicochemical Experiment Lecture, Vol. 8, Yuichi Yamamura 감수, 1st Ed., Nakayama Publishing, 1971; Illustrated Fluorescent antibody, Akira Kawao 저, 1st Ed., Softscience, 1983; Enzyme Immunoassay, Eiji Ishikawa 편, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, 3rd Ed., Igaku Shoin, 1987; Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., J. Sambrook, E. F. Frish, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 또는 아비딘 (또는 스트렙토아비딘) 및 바이오틴의 반응을 이용하는 임의의 기타 통상의 방법에 따라 수행할 수 있다.
본 발명의 분석 방법에 있어서, 시료중 목적하는 대상 성분의 존재 여부는 담체상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 하나 이상의 상이한 생리활성물질이 고정화된 생리활성물질 고정화 담체와 시료중의 분석대상으로 형성된 복합체에서 분석 성분의 성질, 또는 담체상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 하나 이상의 상이한 생리활성물질이 고정화된 생리활성물질 고정화 담체, 시료중의 대상 성분, 및 대상 성분 또는 생리활성물질 및 대상성분의 복합체에 특이적으로 결합하는 성질을 가진 표지된 결합 물질의 복합체(표지 복합체)에서 표지 물질의 성질에 기초한 대상 성분의 검출을 통해 확인한다.
또한, 본 발명의 분석 방법에서, 대상 성분 및 표지 물질의 성질에 따라 대상 성분의 복합체중의 이의 양 또는 표지 물질의 복합체중의 이의 양을 측정하는 것이 가능하며, 상기 측정된 데이타에 근거하여, 시료중의 대상성분의 양을 정량적으로 또는 반정량적으로 측정하는 것이 가능하다.
대상 성분의 측정량 또는 표지 물질의 측정량에 근거하여 시료중의 대상 성분의 양을 산출하기 위해서는, 예컨대, 각각 공지 농도의 대상 성분을 포함하는 시료 (표준 시료)를 상기와 동일한 방식으로 분석하여 대상 성분 농도와 측정 데이타 (복합체중의 대상 성분의 측정 데이타 또는 표지된 복합체중의 표지 물질의 측정 데이타)사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하고, 시료중 목적하는 대상 성분의 양을 상기와 같이 작성된 검량선에 근거하여 구한다.
본 발명의 분석 방법을 좀더 구체적으로 설명한다.
처음에, 담체의 표면에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 하나 이상의 상이한 생리활성물질이 고정화된 생리활성물질 고정화 담체를 목적하는 대상 성분이 포함된 시료와 전술한 방식으로 접촉시켜, 생리활성물질과 대상성분의 복합체를 형성시킨다. 이어서, 담체를 면역분석의 하이브리드화 분야에서 사용하는 버퍼, 예컨대, 트리스-버퍼, 포스페이트 버퍼, 베로날 버퍼, 보레이트 버퍼, 굿 버퍼 또는 SSC 버퍼로 세정하여 시료내 복합체 형성에 참여하지 않은 대상 성분을 제거한다. 이어서, 짧게, 상기에서 형성된 복합체를 대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 성질을 가진 표지 결합 물질과 접촉시켜 고정화 생리활성물질, 대상성분 및 표지 결합 물질의 표지된 복합체를 형성시킨 후, 담체를 전 술한 바와 같은 버퍼로 세정시켜, 표지된 복합체의 형성에 참여하지 않은 유리된 표지 결합 물질을 제거한다. 이어서, 복합체중의 대상성분 및 표지된 복합체중의 표지 물질을 이의 성질에 따라 소정의 방법으로 측정하고, 이렇게 측정된 데이타에 근거하여, 시료중의 대상 성분을 분석할 수 있다.
전술한 방법과는 별도로, 시료중의 목적하는 대상성분은 또한 임의의 기타 방법, 예컨대, 시료중의 대상 성분이 동일한 유형이나 표지 물질로 표지된 대상성분과 경쟁적으로 반응하는 경합 분석을 통해 분석할 수 있다.
구체적으로는, 담체의 표면에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 하나 이상의 상이한 생리활성물질이 고정화된 생리활성물질 고정화 담체를 목적하는 대상성분을 포함하는 시료 및 목적하는 대상성분과 유형이 동일하나 표지 물질로 표지된 대상 성분과 접촉시켜, 생리활성물질 및 표지된 대상성분의 표지된 복합체, 및 생리활성물질 및 대상성분의 복합체를 형성시킨다. 이어서, 담체를 전술한 바와 같은 버퍼로 세정하여 시료중의 대상 성분 및 복합체 형성에 참여하지 않은 유리된 표지 대상성분을 제거한다. 이어서, 표지된 복합체중의 표지 물질 또는 제거된 유리 표지 대상 성분에 결합된 표지 물질을 이의 성질에 따라 소정 방법으로 측정하고, 이렇게 측정된 데이타에 근거하여, 시료중의 목적하는 대상 성분을 분석할 수 있다.
상기 구현예에서, 대상성분을 표지 물질로 표지화하는 방법 및 생리활성물질 고정화 담체와 시료 및 표지 대상성분을 접촉시키는 방법은 대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 물질을 전술한 바와 같은 표지 물질로 표지화 하는 방법과 동일할 수 있으며, 생리활성물질 고정화 담체와 대상성분 함유 시료를 접촉시키는 방법, 각각, 및 기타의 것들 또한 전술한 바와 동일하다.
전술한 방법에서, 복합체중의 대상 성분 또는 표지된 복합체중의 표지 물질의 측정은 대상성분 및 표지 물질의 유형에 따라 소정의 방식으로 수행할 수 있다. 예컨대, 구하고자 하는 물질의 성질이 효소적 성질이면, EIA 또는 하이브리드화의 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 측정은 하기 문헌에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있다 [Enzyme Immunoassay, Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Separate Edition, No. 31, Tsunehiro Kitagawa 편, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, pp. 51-63, Kyoritsu Publishing 간행, September 10, 1987]. 검출코자 하는 물질이 방사선 물질이면, 이는 RIA 또는 하이브리드화의 임의의 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 구체적으로는, 액침형 GM 카운터, 액체 신틸레이션 카운터 또는 우물형 신틸레이션 카운터와 같은 적합한 기구를 방사선 물질에 의해서 방사되는 방사선의 유형 및 강도에 따라 선택 및 사용하여, 상기 물질을 검출 및 측정한다 (예컨대, 참조 Medicochemical Experiment Lecture, Vol. 8, Yuichi Yamamura 감수, 1st Ed., Nakayama Publishing, 1971; Biochemical Experiment Lecture 2, Tracer Experiment Method, latter edition, by Shosuke Takemura, You Honsho, pp. 501-525, Tokyo Kagaku Dojin 간행, February 25, 1977). 측정코자 하는 물질의 성질이 형광이면, 상기 물질은 형광광도계 또는 공초점 레이져 현미경의 측정 기구를 이용하는 FIA 또는 하이브리드화의 임의의 공지의 방법으로 측정할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 이를 위해서는 하기 문헌에 기 재된 방법을 이용할 수 있다 [Illustrated Fluorescent Antibody, Akira Kawao 저, 1st Ed., Softscience, 1983; Biochemical Experiment Lecture 2, Chemistry of Nucleic Acid III, by Minero Jitsuyoshi, pp. 299-318, Tokyo Kagaku Dojin 간행, December 15, 1977]. 측정코자 하는 물질의 성질이 발광이면, 상기 물질은 광자 카운터와 같은 측정 기구를 이용하는 임의의 공지 방법으로 측정할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 이를 위해서는 하기 문헌에 기재된 방법을 사용할 수 있다 [Enzyme Immunoassay, Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Separate Edition, No. 31, Tsunehiro Kitagawa 편, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, pp. 252-263, Kyoritsu Publishing 간행, September 10, 1987]. 측정코자 하는 물질의 성질이 UV 흡수성이며, 상기 물질은 분광광도계와 같은 측정 기구를 이용한 임의의 공지 방법으로 측정할 수 있다. 측정코자 하는 물질의 성질이 색 발현성이면, 상기 물질은 분광광도계 또는 현미경과 같은 측정 기구를 이용한 임의의 공지 방법으로 측정할 수 있다. 검출코자 하는 물질의 성질이 스핀성이면, 전자 스핀 공명 장치를 이용하는 통상의 방법을 상기 물질의 측정에 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 이를 위해서는 하기 문헌에 기재된 방법을 사용할 수 있다 [Enzyme Immunoassay, Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Separate Edition, No. 31, Tsunehiro Kitagawa 편, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, pp. 264-271, Kyoritsu Publishing 간행, September 10, 1987].
전술한 방법에서, 분석코자 하는 대상 성분 및 대상 성분의 복합체에 특이적으로 결합하는 성질을 가진 표지 결합 물질의 양은 사용하는 표지 결합 물질의 유 형에 따라 변하기 때문에, 한 마디로 정의할 수는 없다. 그러나, 통상적으로, 상기의 양은 담체상에 고정화된 모든 생리활성물질에 결합할 수 있는 물질의 농도 이상이다.
마찬가지로, 표지 물질로 표지된 대상 성분의 양은 분석코자 하는 대상 성분의 유형에 따라 변할 수 있기 때문에 한마디로 정의할 수는 없다. 그러나, 통상적으로, 이는 담체상에 고정화된 모든 생리활성물질에 결합할 수 있는 대상 성분의 농도 이상이다.
전술한 방법에서, 반응동안의 pH 및 온도 또한 한 마디로 정의할 수 없으며, 사용하는 생리활성물질 및 분석코자 하는 대상 성분의 유형에 따라 변할 수 있다. 이는 생리활성물질 및 대상성분의 복합체, 또는 생리활성물질, 대상성분 및 표지 물질의 표지된 복합체, 또는 생리활성물질 및 표지된 대상 성분의 복합체의 형성을 방해하지 않는 범위내 일 수 있다. 구체적으로는, pH 는 통상적으로 2 내지 10, 바람직하게는 5 내지 9 이고; 온도는 통상적으로 0 내지 90℃, 바람직하게는 20 내지 80℃ 이다. 반응 시간은 복합체를 형성시키는 대상 성분의 성질에 따라 적절하게 결정할 수 있는데, 이는 전술한 바와 같이 복합체를 형성시키는데 필요한 시간은 구성 대상 성분의 성질에 따라 변하기 때문이다. 통상적으로, 대상 성분은 수 초 내지 수 시간동안 적절하게 반응시킬 수 있다.
본 발명의 분석 방법에서, 청구항 19 에서와 같이, 항원 또는 항체를 담체 표면상에 고정화된 생리활성물질로 선택하면, 시료중의 생리활성물질에 대한 항체 또는 항원은 단순한 방식으로 정확하게 분석할 수 있다. 청구항 20 에서와 같이, 하나 이상을 종양 마커, 호르몬, 호르몬 교란 화학물질, 미생물 유래 단백질 또는 펩티드 또는 당쇄 항원, 수용체, 리간드, 알레르겐, 면역글로불린 (특히 IgE), 렉틴, 당쇄 및 이들에 대한 항체로 구성된 군에서 선택하면, 시료중의 상기 자체 또는 상기 생리활성물질에 대한 항체를 단순한 방식으로 분석할 수 있고, 이는 본 발명의 유용한 구현예이다.
수용체, 리간드, 렉틴, 종양 마커 (당쇄), 단백질 또는 펩티드를 생리활성물질로 선택하면, 이것은 항원-항체 반응 뿐만 아니라 수용체-리간드 반응, 렉티온-당쇄 반응 또는 단백질-펩티드 사슬 반응을 통해 분석될 수 있다.
또한, 본 발명의 분석 방법을 청구항 21 에서와 같이 생리활성물질이 알레르겐, 면역글로불린 (특히 IgE) 및 이들에 대한 항체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 본 발명의 생리활성물질 고정화 담체를 이용하여 수행하면, 알레르기 관련 분석은 단순한 방식으로 정확하게 행해질 수 있으며, 이 구현예가 특히 본 발명에 유용하다.
구체적으로는, 예컨대, 알레르겐에 대한 항체를 생리활성물질로 사용하면, 이는 알레르겐 분석에 유용하다 (시료중 알레르겐 존재 여부 및 알레르겐의 양의 관점에서). 한편, 알레르겐이 생리활성물질로 사용되면, 이는 알레르기의 원인인 알레르겐의 특정 분석에 유용하다 (어떤 유형의 알레르겐에 대해 어떤 유형의 알레르기 반응이 발생하는지에 대해 및 알레르기 반응의 정도가 어떠한지에 대하여). 항-IgE 항체를 생리활성물질로 사용하면, 이는 시료중 전체 IgE 양의 측정에 유용하다 (시료가 어느 정도의 알레르기 반응까지 알레르기 체질을 유발할 수 있지에 대한 여부에 대하여).
본 발명의 분석 방법은 알레르기 관련 분석을 예로 들어 이하에 보다 구체적으로 설명한다.
(1) 알레르겐의 분석:
처음에, 분석코자 하는 대상 성분 (알레르겐)을 포함하는 시료를 생리활성물질이 알레르겐에 대한 항체인 생리활성물질 고정화 담체에 드롭핑 적용 또는 코팅 방식으로 적용하거나, 또는 담체를 시료에 침지시켜, 이 둘이 상호간 접촉되도록 하여 항체 및 알레르겐의 복합체를 형성시킨다. 이어서, 담체를 적합한 버퍼로 세정하여 복합체 형성에 참여하지 않은 시료중의 대상 성분 (예컨대, 유리 알레르겐)을 제거한다. 이어서, 이렇게 형성된 복합체를 표지 물질(대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 성질을 가진 표지 결합 물질)로 표지된 알레르겐에 대한 항체와 전술한 바와 동일한 방식으로 접촉시켜 알레르겐에 대한 고정화 항체, 알레르겐 및 알레르겐에 대한 표지 항체의 표지된 복합체를 형성시킨다. 이어서, 이것을 적합한 버퍼로 세정하여 표지된 복합체의 형성에 참여하지 않은 유리된 표지 항체를 제거한다. 이어서, 표지된 복합체중의 표지 물질을 전술한 방법에 따라 측정하며, 이로 시료중 알레르겐의 존재 여부가 명확해진다.
또한, 전술한 방법에서 표지된 복합체중의 표지 물질의 양은 전술한 방법에 따라 측정하며, 이렇게 측정된 표지 물질의 양을 각각 공지의 알레르겐 농도를 가진 다른 시료 (표준 시료)를 이용하여 전술한 바와 동일한 방식으로 측정한 알레르겐 농도와 실제적으로 측정된 데이타 (본원에서 실제적으로 측정된 표지된 복합체 중의 표지 물질의 양)사이의 관계를 나타내는 검량선에 적용한다. 이 방법으로 시료중 존재하는 알레르겐의 양을 정량적으로 또는 반정량적으로 측정할 수 있다.
전술한 방법에서, 둘 이상의 상이한 알레르겐에 대한 둘 이상의 상이한 항체를 담체상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 고정화시키고, 이렇게 고정화된 담체를 사용하면, 하나의 시료중에 상이한 유형의 여러종의 알레르겐을 하나의 작업에서 특정, 동정 및 정량화할 수 있어, 이는 본 발명의 유용한 구현예이다.
(2) 알레르기의 원인인 알레르겐의 특정 분석:
처음에, 분석코자 하는 대상 성분 (알레르겐에 대한 IgE)을 포함하는 시료를 담체 표면상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 생리활성물질로 알레르겐 (항원)이 고정화된 생리활성물질 고정화 담체에 드롭핑 적용 또는 코팅 방식으로 적용하거나, 또는 담체를 시료에 침지시켜, 이 둘이 상호간 접촉되도록 하여 알레르겐 및 알레르겐에 대한 IgE의 복합체를 형성시킨다. 이어서, 담체를 적합한 버퍼로 세정하여 복합체 형성에 참여하지 않은 시료중의 대상 성분 (예컨대, 분석대상이 아닌 유리 IgE)을 제거한다. 이어서, 이렇게 형성된 복합체를 표지 물질(대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 성질을 가진 표지 결합 물질)로 표지된 항-IgE 항체와 전술한 바와 동일한 방식으로 접촉시켜, 고정화된 알레르겐, 알레르겐에 대한 IgE 및 표지된 항-IgE 항체의 표지된 복합체를 형성시킨다. 이어서, 이것을 적합한 버퍼로 세정하여 표지된 복합체의 형성에 참여하지 않은 유리된 표지 항-IgE 항체를 제거한다. 이어서, 표지된 복합체중의 표지 물질 을 전술한 방법에 따라 측정하며, 이로 시료중 생리활성물질인 특정 알레르겐에 대한 IgE의 존재 여부가 명확해지거나, 또는 즉, 이로 본원에서 분석된 시료 제공자가 특정 알레르겐에 대한 알레르기 반응의 원인을 가질 수 있는지의 여부에 대하여 명확해지거나, 또는, 환언하면, 알레르기의 원인인 알레르겐을 특정할 수 있다.
또한, 전술한 방법에서 표지된 복합체중의 표지 물질의 양은 전술한 방법에 따라 측정하며, 이렇게 측정된 표지 물질의 양을 각각 공지의 IgE 농도를 가진 다른 시료 (표준 시료)를 이용하여 전술한 바와 동일한 방식으로 측정한 IgE 농도와 실제적으로 측정된 데이타 (본원에서 실제적으로 측정된 표지된 복합체중의 표지 물질의 양)사이의 관계를 나타내는 검량선에 적용한다. 이 방법으로 시료중에 존재하는 생리활성물질인 알레르겐에 대한 항체 (IgE)의 양을 정량 또는 반정량적으로 측정할 수 있다. 이는 특정 알레르겐에 대한 시료 제공자의 감수성의 강도, 또는 즉, 시료 제공자에서 발생할 수 있는 특정 알레르겐에 대한 알레르기 반응의 정도를 보여준다.
전술한 방법의 개요는 도 1 에 나타내었다.
전술한 방법에서, 둘 이상의 상이한 알레르겐을 담체상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 고정화시키고, 이렇게 고정화된 담체를 사용하면, 시료중의 각각의 IgE 가 반응하는 각각의 알레르겐의 유형을 특정 및 동정할 수 있으며 (또는 즉, 이로 시료 제공자가 어떤 유형의 알레르겐에 대해 알레르기 반응을 가질 수 있는지의 여부에 대하여 명확해진다), 이는 시료 제공자의 상기 특정 및 동정된 알레르겐의 감수성의 강도를 보여주여, 이는 본 발명의 유용한 구현 예이다.
(3) 시료중 전체 IgE 양의 측정 :
처음에, 분석코자 하는 대상 성분 (IgE)을 포함하는 시료를 담체 표면상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 생리활성물질로 항-IgE 항체가 고정화된 생리활성물질 고정화 담체에 드롭핑 적용 또는 코팅 방식으로 적용하거나, 또는 담체를 시료에 침지시켜, 이 둘이 상호간 접촉되도록 하여 항-IgE 항체 및 IgE 의 복합체를 형성시킨다. 이어서, 담체를 적합한 버퍼로 세정하여 복합체 형성에 참여하지 않은 시료중 대상 성분을 제거한다. 이어서, 이렇게 형성된 복합체를 표지 물질(대상성분 또는 복합체에 특이적으로 결합하는 성질을 가진 표지 결합 물질)로 표지된 항-IgE 항체와 전술한 바와 동일한 방식으로 접촉시켜 고정화 항-IgE 항체, IgE 및 표지된 항-IgE 항체의 표지된 복합체를 형성시킨다. 이어서, 이것을 적합한 버퍼로 세정하여 표지된 복합체의 형성에 참여하지 않은 유리된 항-IgE 항체를 제거한다. 이어서, 표지된 복합체중 표지 물질의 양을 전술한 방법에 따라 측정한다. 이렇게 측정된, 표지된 복합체중의 표지 물질의 양을 각각 공지의 IgE 농도를 가진 다른 시료 (표준 시료)를 이용하여 전술한 바와 동일한 방식으로 측정한 IgE 농도와 실제적으로 측정된 데이타 (본원에서 실제적으로 측정된 표지된 복합체중의 표지 물질의 양)사이의 관계를 나타내는 검량선에 적용한다. 이로 시료중의 전체 IgE의 양을 정량 또는 반정량적으로 측정할 수 있다. 이는 통상의 알레르겐에 대한 시료 제공자의 감수성의 강도를 보여주거나, 또는 즉, 시료 제공자가 알레르기 체질인지의 여부(구체적으로는 시료 제공자의 알레르기 체질 의 정도를 보여줌)에 대하여 보여준다.
전술한 방법의 개요는 도 2 에 나타내었다.
상기에서, 항-IgE 항체 및 둘 이상의 상이한 알레르겐 모두가 담체상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 고정화되고, 이렇게 고정화된 담체를 (2) 및 (3)의 두 방법을 동시에 수행하는데 사용하면, 시료중의 IgE 에 대한 알레르겐의 유형을 특정 및 동정할 수 있고 (또는, 즉 시료 제공자가 어떤 알레르겐에 대하여 알레르기 반응을 어떻게 가질 수 있는지에 대하여), 그리고/또는 이로 시료 제공자의 상기에서 특정 및 동정된 알레르겐에 대한 감수성의 정도를 명확히 할 수 있으며, 또한 시료 제공자의 통상의 알레르겐에 대한 감수성의 정도를 보여주어(시료 제공자가 알레르기 체질을 갖는지의 여부에 대하여), 본 발명의 구현예로 유용하다.
구체적으로는, 분석코자 하는 대상 성분 (IgE)을 포함하는 시료를 담체 표면상에 형성된 탄소 또는 금속 또는 반금속 탄소 화합물 층에 생리활성물질로 항-IgE 항체 및 둘 이상의 상이한 알레르겐 모두가 동일 표면에 고정화된 생리활성물질 고정화 담체에 드롭핑 적용 또는 코팅 방식으로 적용하거나, 또는 담체를 시료에 침지시켜, 이 둘이 상호간 접촉되도록하여 상이한 알레르겐 IgE 의 복합체 및 항-IgE 항체 및 IgE 의 복합체 모두를 형성시킨다. 이어서, 담체를 적합한 버퍼로 세정하여 복합체 형성에 참여하지 않은 시료중의 대상 성분을 제거한다. 이어서, 이렇게 형성된 복합체를 표지 물질로 표지된 항-IgE 항체와 전술한 바와 동일한 방식으로 접촉시켜 모든 고정화 알레르겐, IgE 및 표지된 항-IgE 항체의 표지된 복합체 및 고정화된 항-IgE 항체, IgE 및 표지된 항-IgE 항체의 표지된 복합체를 형성시킨다. 이어서, 이것을 적합한 버퍼로 세정하여 표지된 복합체의 형성에 참여하지 않은 유리된 표지 항-IgE 항체를 제거한다. 이어서, 이렇게 형성된 표지된 복합체중, 각각 고정화된 알레르겐 관련 표지된 복합체중의 표지 물질을 전술한 방법에 따라 측정하며, 이는 시료중의 둘 이상의 고정화된 알레르겐중의 어디에 항체(IgE)가 존재하는지의 여부를 보여주거나, 또는 즉, 이로 시료중의 IgE 에 대한 알레르겐의 유형이 특정 또는 동정케 된다. 또한, 환원하면, 이로 시료 제공자가 어떤 알레르기에 대하여 알레르기 반응을 가질 수 있는지의 여부에 대하여 명확해진다. 또한, 시료중의 상기와 같이 특정 및 동정된 알레르겐에 대한 항체 (IgE)의 양을 전술한 방법에 따라 측정한 표지 물질의 양에 근거하여 전술한 방법에 따라 정량적 또는 반정량적으로 구하면, 시료 제공자의 상기에서 특정 및 동정된 알레르겐에 대한 감수성의 정도가 명확해지거나, 또는 즉, 시료 제공자가 본원에서 특정 및 동정된 알레르겐에 대하여 알레르겐 반응을 가질 수 있는 알레르겐 반응의 정도를 명확히 할 수 있다. 또한, 시료중의 전체 IgE 양을 전술한 방법에 따라 측정한 표지 물질의 양에 근거하여 전술한 방법에 따라 정량적 또는 반정량적으로 구하면, 시료 제공자의 통상의 알레르겐에 대한 감수성의 정도가 명확해지거나, 또는 즉, 시료 제공자가 알레르기 체질을 가졌는지의 여부에 대하여(구체적으로는 시료 제공자의 알레르기 체질의 정도를 보여줌) 보여준다.
다음에는 시료중 대상 성분의 분석용인 본 발명의 청구항 22 의 키트를 설명한다.
본 발명의 청구항 22 의 키트에는 청구항 1 내지 12 중 어느 하나의 생리활성물질 고정화 담체를 포함한다. 키트내 담체상에는, 키트로 분석코자하는 대응하는 하나 이상의 대상성분에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 생리활성물질이 고정화되어 있다.
본 발명의 키트에서, 생리활성물질 고정화 담체의 바람직한 구현예 및 구체적인 예는 전술한 바와 동일하다. 본원에서의 담체와 별도로, 본 발명의 키트는 목적하는 대상성분 또는 대상성분의 복합체에 특이적으로 결합하는 성질을 가진 표지 결합 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 청구항 1 내지 12 중 어느 하나의 생리활성물질 고정화 담체를 포함하며, 이와 별도로, 키트는 당해 기술에서 통상적으로 사용하는 임의의 시약을 포함할 수 있다. 예컨대, 이는 버퍼와 같은 용액 (세정액), 및 산화성 착색 시약과 같은 착색제 및 커플링제를 포함할 수 있으며; 키트내 표지 물질이 효소인 경우, 이는 효소에 대한 기질, 효소반응 종결용 반응 종결제와 같은 시약을 포함할 수 있으며; 이는 키트로 분석코자 하는 대상 성분의 표준 산물을 포함할 수 있다. 키트내 존재할 수 있는 각각의 시약 및 각각의 표준 산물의 농도는 당해 기술에서 통상적으로 사용하는 임의의 것일 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예를 참조로 설명된다.
(실시예 1)
도 1 의 공정에 따라, IgE 를 항-IgE 항체 결합 다이아몬드 피복 담체를 이 용하여 분석하였다.
1. 관능기의 활성화:
카르복실기로 피복된 다이아몬드 피복 담체를 20 mM N-히드록시숙신이미드 및 0.1 M 1-(3-(디메틸아미노)프로필)-3-에틸카르보디이미드를 포함하는 0.1 M 포스페이트 버퍼 (pH 6)에 30 분간 침지시켰다. 침지후, 다이아몬드 피복 담체를 멸균 증류수로 2 회 세정하고, 원심분리하여 수분을 완전히 제거하였다.
2. 항-인간 IgE 항체의 고정화:
항-인간 IgE 항체를 50 mM MOPS 버퍼 (pH 7.5)로 소정의 농도를 갖도록 처리하고, 상기에서 제조된 활성화된 다이아몬드 피복 담체에 스탬핑 머신 (Nippon Laser Electronics’GT-MASS) 를 이용하여 스포팅하였다.
스포팅후, 이를 미리 65℃ 로 조절된 50 % 포름아미드를 함유하는 가습쳄버에서 1 시간동안 인큐베이션시켰다.
3. 블록킹 :
상기 2 에서 제조한 IgE 항체-고정화 다이아몬드 피복 담체를 2 % 소 혈청 알부민 함유 50 mM MOPS 버퍼 (pH 7.5)로 실온에서 하루종일 블록킹하였다. 블록킹후, 이를 1000 rpm 에서 1 분간 원심분리하였다.
4. 검체와의 반응:
분석코자 하는 대상 성분인 인간 IgE 를 2 % 소 혈청 알부민 함유 50 mM MOPS 버퍼 (pH 7.5)로 처리하여 소정의 농도의 검체를 제조하였다. 각 검체를 10 ㎕ 씩 담체의 칩에 도포하고, 유리 커버를 덮어 기포가 발생하지 않도록한 후, 하 이브리드화 쳄버에 넣어 실온에서 1 시간동안 반응시켰다. 반응후, 유리 커버를 제거하고, 각 칩을 SSC (0.15 M NaCl-0.0l5 M 트리소듐 시트레이트 용액)으로 3 회 세정하고, 1000 rpm 에서 1 분간 원심분리하였다.
5. 담체에 결합된 인간 IgE 의 검출:
10 ㎕ 의 Cy3 표지 항-인간 IgE 항체 (0.86 μmg/ml) 을 칩에 도포하고, 유리 커버를 덮어 기포가 발생하지 않도록한 후, 하이브리드화 용액에 넣고, 실온에서 1 시간동안 반응시켰다. 반응후, 유리 커버를 제거하고, 각 칩을 SSC (0.15 M NaCl-0.0l5 M 트리소듐 시트레이트 용액)으로 5 회 세정하고, 1000 rpm 에서 1 분간 원심분리하였다.
공초점 레이져 스캐너 (GSI Lumonicus)를 이용하여, Cy3 표지 항-인간-IgE 항체의 양을 측정하였으며, 이는 각 칩상의 항원-항체 반응의 정도를 나타낸다. 이 데이타는 표 1 및 도 3 에 나타내었다.
| IgE 농도 | ||||
| 0 IU/ml | 0.7 IU/ml | 7 IU/ml | ||
| 고정화된 항-인간 IgE 항체 농도 | 0.1mg/ml | 5335 | 9950 | 11035 |
| 0.5mg/ml | 13957 | 21119 | 22578 | |
| 1mg/ml | 20233 | 39233 | 45382 | |
표 1 및 도 3 의 데이타로부터, 본 발명의 방법으로 인간 IgE 를 검출 및 정량화할 수 있다는 것을 알 수 있다.
(실시예 2)
도 2 의 공정에 따라, 알레르겐을 항-IgE 항체 결합 다이아몬드 피복 담체를 이용하여 분석하였다.
1. 다이아몬드 피복 담체의 활성화:
카르복실기로 피복된 다이아몬드 피복 담체를 20 mM N-히드록시숙신이미드 및 0.1 M 1-(3-(디메틸아미노)프로필)-3-에틸카르보디이미드를 포함하는 0.1 M 포스페이트 버퍼 (pH 6)에 30 분간 침지시켰다. 침지후, 이를 멸균 증류수로 2 회 세정하고, 원심분리하여 수분을 완전히 제거하였다.
2. 알레르겐의 고정화:
알레르겐 (진드기 항원 또는 삼나무 항원) 을 50 mM MOPS 버퍼 (pH 7.5)로 0.5 mg/ml의 농도를 갖도록 처리하고, 상기에서 제조된 활성화된 다이아몬드 피복 담체에 스탬핑 머신 (Nippon Laser Electronics’GT-MASS) 를 이용하여 스포팅하였다.
스포팅후, 이를 50 % 포름아미드를 함유하는 가습쳄버에 1 시간동안 인큐베이션시켰다.
3. 블록킹:
10 ㎕ 의 2 % 소 혈청 알부민 함유 50 mM MOPS 버퍼 (pH 7.5) 를 다이아몬드 피복 담체에 도포하고, 이에 기포 발생 방지를 위해 유리 커버로 덮은후, 2 시간동안 블록킹하였다.
유리 커버를 제거하고, 담체를 1 x SSC 로 3 회 세정한 후, 원심분리하여 과 량의 수분을 제거하였다.
4. 검체의 적용:
삼나무 또는 진드기와의 알레르겐 반응에 양성인 인간 혈청 (삼나무 양성 혈청 또는 진드기 양성 혈청), 및 이 둘에 음성인 인간 혈청 (음성 혈청)을 검체로서 제조하였다. 10 ㎕ 의 각 혈청 검체를 담체의 마이크로어레이에 적용하고, 유리 커버를 덮어 기포 발생을 방지한 후, 4℃ 에서 하루종일 반응시켰다. 반응후, 유리 커버를 제거하고, 각 마이크로어레이를 1 x SSC 로 3 회 세정한 후, 원심분리하여 과량의 수분을 제거하였다.
5. 표지된 항체와의 반응:
2 % 소 혈청 알부민 함유 50 mM MOPS 버퍼 (pH 7.5)중의 10 ㎕ 의 Cy3 표지 항-인간 IgE 항체 (4.3 ㎍/ml)을 마이크로어레이에 도포하고, 유리커버를 덮어 기포 발생을 방지한 후, 3 시간동안 반응시켰다. 반응후, 유리 커버를 제거하고, 각각의 마이크로어레이를 1 x SSC 로 3 회 세정하고, 원심분리하여 과량의 수분을 제거하였다.
6. 결 과:
공초점 레이져 스캐너 (GSI Lumonicus)를 이용하여, Cy3 표지 항-인간-IgE 항체 유래 형광을 측정하였으며, 이는 각각의 마이크로어레이상의 항원-항체 반응의 정도를 나타낸다. 음성 혈청 검체의 결과는 도 4 에 나타내었다; 삼나무 양성 혈청 검체의 결과는 도 5 에 나타내었으며; 진드기 양성 혈청 검체의 결과는 도 6 에 나타내었다.
도 4 의 결과로부터, 음성 혈청 검체는 마이크로어레이상의 삼나무 항원 고정화 부위 및 진드기 고정화 부위 모두에서 Cy3 표지 항-인간 IgE 항체 유래 형광을 거의 보이지 않음을 알 수 있다. 도 5 의 결과로부터, 삼나무 양성 혈청 검체는 마이크로어레이상의 삼나무 항원 고정화 부위에서 투명한 Cy3 표지 항-인간 IgE 항체 유래 형광을 보이나, 진드기 고정화 부위에서는 거의 보이지 않음을 알 수 있다. 도 6 의 결과로부터, 진드기-양성 혈청 검체는 마이크로어레이상의 진드기 항원 고정화 부위에서 강한 Cy3 표지 항-인간 IgE 항체 유래 형광을 보임을 알 수 있다.
도 6 에서, 약한 Cy3 표지 항-인간 IgE 항체 유래 형광이 약간 마이크로어레이상의 삼나무 항원 고정화 부위에서 발견된다. 이와 관련하여, 진드기-양성 혈청 제공자를 상세히 검사하였다. 그 결과, 제공자는 어느 정도 진드기 알레르기 반응 및 삼나무 알레르기 반응에 양성이거나, 또는 즉, 본원에서 시험한 진드기-양성 혈청은 진드기 및 삼나무 모두와의 알레르기 반응 모두에 대해 양성임을 발견하였다.
이 결과로부터, 본 발명의 방법으로 알레르기 원인인 알레르겐을 특이적으로 동정하는 것이 가능하고, 검체 제공자의 상기에서 동정된 알레르겐에 대한 감수성의 정도를 측정하는 것이 가능함을 알 수 있다.
본 발명의 담체는 이에 생리활성물질을 고밀도로 고정화시킬 수 있으며, 생리활성물질 고정화 담체는 다량의 생리활성물질의 소비없이 높은 고정화 효율을 실현할 수 있다. 또한, 담체는 다양한 표면 전하를 가진 생리활성물질에 대해서 조 차 높은 고정화 효율을 확보할 수 있다.
본 발명의 방법은 담체를 효과적으로 생성시킨다.
시료중의 대상 성분을 분석하기 위한 본 발명의 방법에서, 담체를 사용하며, 이 방법은 시료중의 다양한 대상 성분의 정확한 분석을 가능케한다.
또한, 본 발명의 키트를 사용하여, 시료중의 대상성분을 좀더 단순한 방식으로 분석하는 것이 가능하다.
특히, 항-IgE 항체가 고정화된 담체는 알레르겐과 반응하여 알레르기와 밀접한 관련이 있는 IgE 를 정확하게 분석할 수 있기 때문에, 이는 알레르기의 원인을 측정하기 위한 다양한 면역진단에 유용하다.
따라서, 본 발명은 다양한 분야, 예컨대, 의약 분야에서의 질병 진단 및 생화학 및 분자 생물학 분야에서의 연구에 유용하다.
Claims (22)
- 생리활성물질이 고정화된 다이아몬드, 다이아몬드류 탄소, 흑연, 탄화텅스텐, 탄화티타늄, 또는 탄화규소로 이루어진 층이 히드록실기, 카르복실기, 술포기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 아미노페닐기 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택된 1 또는 2 이상의 관능기를 통해 담체 표면에 형성되어 있는 담체로 이루어진 생리활성물질 고정화 담체.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 생리활성물질은 그 물질이 가지는 관능기와 다이아몬드, 다이아몬드류 탄소, 흑연, 탄화텅스텐, 탄화티타늄, 또는 탄화규소로 이루어진 층의 히드록실기, 카르복실기, 술포기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 아미노페닐기 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택된 1 또는 2 이상의 관능기와의 결합에 의해, 상기 다이아몬드, 다이아몬드류 탄소, 흑연, 탄화텅스텐, 탄화티타늄, 또는 탄화규소로 이루어진 층의 표면에 고정화되어 있는 생리활성물질 고정화 담체.
- 삭제
- 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 생리활성물질은 유기체 또는 생물학적 단백질 또는 펩티드에 특이적 작용을 갖는 물질인 생리활성물질 고정화 담체.
- 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 생리활성물질은 항원, 항체, 또는 항원 및 항체인 생리활성물질 고정화 담체.
- 제 6 항에 있어서, 항원, 항체, 또는 항원 및 항체는 종양 마커, 호르몬, 호르몬 교란 화학물질, 미생물 유래 단백질 또는 펩티드 또는 당쇄 항원, 수용체, 리간드, 알레르겐, 면역글로불린, 렉틴, 당쇄, 지질, 리포폴리사카라이드 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1 또는 2 이상인 생리활성물질 고정화 담체.
- 제 7 항에 있어서, 항원, 항체, 또는 항원 및 항체는 알레르겐, 면역글로불린 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1 또는 2 이상인 생리활성물질 고정화 담체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 히드록실기, 카르복실기, 술포기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 아미노페닐기 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택된 1 또는 2 이상의 관능기를 가지는 다이아몬드, 다이아몬드류 탄소, 흑연, 탄화텅스텐, 탄화티타늄, 또는 탄화규소로 이루어진 층이 표면에 형성된 담체와 생리활성물질을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 생리활성물질 고정화 담체의 제조방법.
- 다이아몬드, 다이아몬드류 탄소, 흑연, 탄화텅스텐, 탄화티타늄, 또는 탄화규소로 이루어진 층이 형성된 담체 표면에 히드록실기, 카르복실기, 술포기, 시아노기, 니트로기, 티올기, 아미노기, 아미노페닐기 및 에폭시기로 이루어진 군에서 선택된 1 또는 2 이상의 관능기를 도입하고, 다음으로 이것과 생리활성물질을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 생리활성물질 고정화 담체의 제조방법.
- 삭제
- 다이아몬드, 다이아몬드류 탄소, 흑연, 탄화텅스텐, 탄화티타늄, 또는 탄화규소로 이루어진 층이 형성되어 있는 담체 표면에 고정화된 생리활성물질.
- 제 1 항 또는 제 3 항의 생리활성물질 고정화 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 시료중의 대상성분의 분석방법.
- 제 17 항에 있어서, 제 1 항 또는 제 3 항의 생리활성물질 고정화 담체와 대상성분을 포함하는 시료와 접촉시키고, 상기 담체 표면에 고정화된 생리활성물질과 시료중의 대상성분으로부터 생성된 복합체를 분석하는 것을 특징으로 하는 시료중의 대상성분의 분석방법.
- 제 17 항에 있어서, 담체 표면에 고정화된 생리활성물질은 항원 또는 항체중의 임의의 것이고, 시료중의 대상성분은 생리활성물질에 대한 항원 또는 항체인 시료중의 대상성분의 분석방법.
- 제 19 항에 있어서, 항원 또는 항체는 종양 마커, 호르몬, 호르몬 교란 화학물질, 미생물 유래 단백질 또는 펩티드 또는 당쇄 항원, 수용체, 리간드, 알레르겐, 면역글로불린, 렉틴, 당쇄, 지질, 리포폴리사카라이드 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1 또는 2 이상인 시료중의 대상성분의 분석방법.
- 제 20 항에 있어서, 항원 또는 항체는 알레르겐, 면역글로불린 및 이들에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1 또는 2 이상인 시료중의 대상성분의 분석방법.
- 제 1 항 또는 제 3 항의 생리활성물질 고정화 담체를 포함하는 시료중의 대상성분의 분석용 키트.
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