FI115166B - Diagnostisia menetelmiä - Google Patents
Diagnostisia menetelmiä Download PDFInfo
- Publication number
- FI115166B FI115166B FI20012603A FI20012603A FI115166B FI 115166 B FI115166 B FI 115166B FI 20012603 A FI20012603 A FI 20012603A FI 20012603 A FI20012603 A FI 20012603A FI 115166 B FI115166 B FI 115166B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- pylori
- antigen
- antibodies
- binding fragments
- biosensor
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56922—Campylobacter
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/808—Optical sensing apparatus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/806—Electrical property or magnetic property
Description
115166
Diagnostisia menetelmiä
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee uusia menetelmiä Helicobacter pylori -infektion diagnosoimiseksi. Erityisesti esillä oleva keksintö koskee uusia ei-5 invasiivisia menetelmiä Helicobacter pylori -antigeenin tai -bakteerin tuottaman metabolioin läsnäolon tai puuttumisen toteamiseksi biologisesta näytteestä bioanturiin perustuvalla mittauksella. Esillä oleva keksintö koskee myös bioanturin käyttöä, joka bioanturi sisältää siihen immobilisoituja H. pyloria vastaan muodostettuja spesifisiä vasta-aineita tai niiden antigeeniä sitovia fragmentteja 10 yhdessä biomolekyylejä karkottavien polymeerien kanssa, jotka estävät epäspesifisen sitoutumisen. Keksintö koskee myös menetelmissä käyttökelpoisia testikittejä.
Keksinnön tausta
Helicobacter pylori on käyrämäinen, gramnegatiivinen bakteeri, jota 15 esiintyy ihmisten ylemmässä maha-suolikanavassa. Siitä lähtien, kun bakteeri ensimmäisen kerran eristettiin vuonna 1982, on kertynyt valtava määrä todistusaineistoa H. pylorin yhteydestä lukuisiin erilaisiin mahatauteihin, esimerkiksi dyspepsiaan (närästys, turvotus ja pahoinvointi), mahan limakalvon oireileva tai oireeton tulehdus, joka ilmenee kroonisena mahakatarrina tai kroonisena :v. 20 aktiivisena gastriittina, mahan ja pohjukaissuolen peptisinä haavoina ja jopa ]···. mahasyöpänä ja erilaisina mahan lymfoomina [Dunn, B. E., et ai., Clinical Mic- * * robiology Reviews 10 (1997) 720-740]. Tällä hetkellä uskotaan, että lähes • · · kaikki peptisten haavojen tapaukset, joiden aikaisemmin ajateltiin olevan • · · ’· idiopaattisia, ovat itse asiassa H. pylori -infektion aiheuttamia [NIH Consensus 25 Conference, JAMA 276 (1994) 1710], H. pylori on maailmanlaajuinen ihmispatogeeni. Toinen tunnettu laji, joka kantaa bakteeria, on ei-ihmisapinat. H. pylori -infektiot on liitetty sosioeko-; j nomiseen kehitykseen: kehitysmaissa 70 - 90 % väestöstä kantaa bakteeria, kun taas kehittyneissä maissa infektion esiintyvyys on noin 25 - 50 %. Infektio ‘ . 30 saadaan lapsuudessa tavallisesti ennen 10 vuoden ikää, ja uskotaan, että il- maantuvuusaste laskee parantuneen hygienian myötä. Infektion siirtymisen ';·* reittiä ei kuitenkaan tunneta täsmällisesti, vaikka fekaalis-oraalisten ja oraalis- oraalisten reittien ajatellaan olevan tärkeimpiä (Dunn, B. E., et ai., supra).
·:*· Käytettävissä on lukuisia erilaisia, sekä invasiivisia että ei-inva- 35 siivisia menetelmiä ja määrityksiä H. pylori -infektion diagnosoimiseksi. Inva- 2 1 15166 siivisia menetelmiä ovat esimerkiksi maha- tai pohjukaissuolibiopsiat. Biopsia-näytteet voidaan tutkia visuaalisesti tai histologisesti, viljellä bakteerien suhteen, testata H. pylorin tuottaman ureaasientsyymin suhteen tai analysoida geeniteknisesti. Kaupallisia tuotteita on saatavissa useimmille näistä menetel-5 mistä. Ei-invasiivisia menetelmiä ovat esimerkiksi serologiset testit H. pyloria vastaan muodostuneiden vasta-aineiden toteamiseksi ja urea-hengitystesti, jossa käytetään 13C- tai 14C-leimattua ureaa, joille molemmille menetelmille on saatavissa lukuisia kaupallisia testejä. Lisäksi on kuvattu määritysmenetelmiä, joissa mitataan H. pylorin substraattimetaboliaa seerumissa [Moulton-Barret, 10 R. G., et ai., Am. J. Gastroenterol 88 (1993) 369 - 374] ja virtsassa [Pathak, C. M., et ai, Am. J. Gastroenterol 89 (1993) 734 - 738].
Immuunimäärityksissä mitataan H. pyloria vastaan muodostuneiden IgG-, IgA- tai IgM-vasta-aineiden läsnäolo potilaiden seerumi- tai verinäytteissä (katso esimerkiksi US-patentti 5 262 156; Pyloriset EIA-A ja EIA-G, Orion 15 Diagnostica, Suomi), virtsanäytteissä (katso esimerkiksi US-patentti 5 262 156) ja sylki- tai muissa limaeritysnäytteissä (katso esimerkiksi US-patentti 6 068 985; Home Helicobacter Test, Ani Biotech Oy, Suomi). H. pyloria vastaan muodostuneiden vasta-aineiden määrityksessä on useita haittapuolia, kuten voimakas riippuvuus antigeenivalmisteesta, jota käytetään vasta-aineiden 20 sieppaamiseen, sukulaisbakteerilajeista peräisin olevien vasta-aineiden ristire-aktiot ja suhteellisen pitkä aika, joka tarvitaan luotettavien koetulosten saami-; seen. Lääkäreiden vastaanotoilla käytettäviksi tarkoitettujen niin kutsuttujen 6' *: vieritutkimusten ("office-based" or "near-patient" tests) luotettavuus on heikom- : pi kuin tavanomaisten laboratoriomääritysten. [Cohen, H., et al., Gastroen- : 25 terology 110 (1996) A83; Sadowski, D., et al., Gastroenterology 110 (1996) , : A246]. Mikä tärkeää: nämä määritysmenetelmät, jotka perustuvat H. pyloria vastaan muodostuneiden spesifisten vasta-aineiden toteamiseen, ovat vähemmän sopivia käytettäväksi hoidon ja parantumisen seuraamisen arvioimiseen, koska kohonneet vasta-ainepitoisuudet pysyvät pitkän aikaa infektion : 30 hoidon ja parantumisen jälkeen. Seurantatutkimukset osoittavat, että vasta- ainepitoisuuksien vähenemisessä hoidon jälkeen esiintyy suurta variaatiota • | [Kosunen, T. U., et ai, Lancet 339 (1992) 893 -895; Cutler, A., et ai, Dig. Dis.
·. Sei. 38 (1993) 2262-2266], mutta yleensä tarvitaan useita kuukausia vähe nemiseen, joka luotettavasti ennustaa paranemista.
35 H. pylori -antigeenien tai -metaboliittien toteaminen biologisesta näytteestä H. pyloria vastaan muodostuneiden spesifisten vasta-aineiden sijas- 3 11 516(.
ta vastaa tähän haittapuoleen. US-patenteissa 5 716 791, 5 871 942 ja 5 932 430 kuvataan muun muassa menetelmiä H. pylori -antigeenien toteamiseksi ulostenäytteissä muodostamalla antigeenin kompleksi polyklonaalisen vasta-aineen kanssa ja toteamalla näin muodostunut kompleksi toisella vasta-5 aineella. Kansainvälisessä patenttihakemuksessa WO01/44815 kuvataan H. pylori - antigeenien toteaminen verinäytteistä esimerkiksi ELISA-menetelmällä. Näitä menetelmiä ehdotetaan H. pylori -infektion hoidon vaikutuksen seurantaan.
Kuitenkin tavanomaiset immuunimääritykset perustuvat merkkimo-10 lekyyliin, kuten radioaktiiviseen leimaan, entsyymileimaan, fluoresenssileimaan tai kemiluminesenssileimaan, ja ne ovat työläitä ja aikaa vieviä, koska tarvitaan useita inkubaatio-, pesu-ja erotusvaiheita ennen varsinaista toteamista. Lisäksi luotettavan toimivuuden takia ne vaativat ammattitaitoisen henkilökunnan ja melko kalliit laitteet. Näyte, erityisesti ulostenäyte, voi myös muodostaa ongel-15 man. Monet potilaat kokevat yhden ulostenäytteen keräämisen, puhumattakaan seurantaan tarvittavista useista ulostenäytteistä, epämiellyttäväksi ja ei-hygieeniseksi ja heidän hoitomyöntyvyytensä voi kärsiä. Samalla tavalla henkilökunta ei välttämättä pidä ulostenäytteiden käsittelystä ja näytteiden valmistamisesta tällaisia määritysmenetelmiä varten siihen sisältyvän infektioriskin 20 takia.
Selvästi tarvitaan uusia parannettuja diagnostisia menetelmiä H. py-lori -infektioiden diagnosoimiseksi.
; Siten esillä olevan keksinnön eräs tarkoitus on antaa käyttöön erit- : täin herkkiä ja spesifisiä menetelmiä ja keinoja H. pylori -antigeenien ja/tai : 25 -bakteerin tuottamien metaboliittien ei-invasiiviseen toteamiseen ja määrittä- : miseen biologisesta näytteestä.
Esillä olevan keksinnön toinen tarkoitus on antaa käyttöön parannettuja menetelmiä ja keinoja H. pylori -infektion vastaisen lääkehoidon vaikutuksen luotettavaan seurantaan ja potilaan parantamisen varmistamiseen : 30 mahdollisimman aiheuttaen mahdollisimman vähän epämukavuutta potilaalla.
• : Esillä olevan keksinnön lisätarkoitus on antaa käyttöön parannettuja • menetelmiä ja keinoja H. pylori -infektion toteamiseksi, joita menetelmiä voi- ·. daan luotettavasti käyttää lääkärin vastaanotoilla ja terveyskeskuksissa, joissa henkilökunnan tekniset taidot ja rutiini eivät ehkä ole yhtä kehittyneet kuin klii-; 35 nisissä laboratorioissa.
115166 4
Esillä olevan keksinnön lisätarkoitus on antaa käyttöön parannettuja menetelmiä ja keinoja H. pylori -infektion toteamiseksi, jotka menetelmät ovat yksinkertaisia, nopeita ja reaaliaikaisia niin, että koetulokset voidaan saada jopa potilaan sairaalakäynnin tai lääkärin vastaanotolla käynnin aikana, jolloin 5 useat potilaskäynnit voidaan välttää.
Keksinnön yhteenveto
Havaittiin yllättäen, että on mahdollista todeta ei-invasiivisesti Helicobacter pylorin läsnäolo tai puuttuminen biologisesta näytteestä käyttäen menetelmiä, jotka perustuvat erittäin spesifisen ja herkän bioanturin käyttöön, ja 10 siten täyttää esillä olevan keksinnön tarkoitukset. Esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoinen bioanturi käsittää kantaja-alustan, jolle on suoraan kiinnitetty H. pyloria vastaan muodostettuja spesifisiä vasta-aineita tai niiden antigeeniä sitovia fragmentteja yhdessä biomolekyylejä karkottavien molekyylien kanssa, jotka peittävät kiinnitettyjen vasta-aineiden tai vasta-ainefragmenttien välisen 15 pinnan. Nämä biomolekyylejä karkottavat molekyylit estävät tehokkaasti biologisessa näytteessä läsnä olevien analyytin ja kontaminoivien (bio)molekyylien ei-toivotun epäspesifisen sitoutumisen ja suuresti lisäävät määritysmenetelmän herkkyyttä. Tällaisen bioanturin käyttö mahdollistaa H. pylori-antigeenien ja/tai -bakteerin tuottamien metaboliittien luotettavan toteamisen mistä tahansa bio-20 logisesta näytteestä.
Esillä oleva keksintö koskee ei-invasiivista menetelmää Helicobac- • * .···. ter pylori -antigeenin tai -bakteerin tuottaman metaboliitin läsnäolon tai puuttu- misen toteamiseksi biologisessa näytteessä, jossa menetelmässä biologinen !* ’. näyte, joka on saatu potilaasta, joka kärsii tai jonka epäillään kärsivän H. pylori ‘ : 25 -infektiosta, saatetaan kosketukseen bioanturin kanssa, joka käsittää kantaja- alustan, jolle on suoraan kovalenttisesti kiinnitetty H. pyloria vastaan muodos- t tettuja vasta-aineita tai niiden antigeeniä sitovia fragmentteja yhdessä biomolekyylejä karkottavien hydrofiilisten molekyylien kanssa, jotka peittävät immobi-; j lisoitujen vasta-aineiden tai niiden antigeenejä sitovien fragmenttien välisen ·* 30 pinnan, ja todetaan signaali, joka on seurauksena vasta-aine-antigeeni- kompleksin muodostumisesta.
*
Esillä oleva keksintö koskee lisäksi bioanturin käyttöä, joka bioanturi käsittää kantaja-alustan, jolle on suoraan kovalenttisesti kiinnitetty spesifisiä H. pyloria vastaan muodostettuja vasta-aineita tai niiden antigeeniä sitovia frag-35 mentteja yhdessä biomolekyylejä karkottavien hydrofiilisten molekyylien kanssa, jotka peittävät immobilisoitujen vasta-aineiden tai niiden antigeenejä sitovi- 115166 5 en fragmenttien välisen pinnan, Helicobacter pylori -antigeenin tai -bakteerin tuottaman metaboliitin läsnä- tai poissaolon toteamiseksi biologisessa näytteessä.
Esillä oleva keksintö koskee myös testikittiä Helicobacter pylori -5 antigeenin tai -bakteerin tuottaman metaboliitin läsnä- tai poissaolon toteamiseksi biologisessa näytteessä, joka testikitti käsittää bioanturin, joka käsittää kantaja-alustan, jolle on suoraan kovalenttisesti kiinnitetty spesifisiä H. pyloria vastaan muodostettuja vasta-aineita tai niiden antigeeniä sitovia fragmentteja yhdessä biomolekyylejä karkottavien hydrofiilisten molekyylien kanssa, jotka 10 peittävät immobilisoitujen vasta-aineiden tai niiden antigeenejä sitovien fragmenttien välisen pinnan, kalibrointiin ja laaduntarkkailuun tarvittavat reagenssit ja apureagenssit, kuten pesuliuokset ja laimennuspuskurit.
Piirustusten kuvaus
Kuvio 1 on kaavamainen esitys kantaja-alustasta/bioanturista, jota 15 käytettiin esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä ja joka sisältää sille kiinnitettyjä H. pyloria vastaan muodostetun vasta-aineen Fab'-fragment-teja yhdessä hydrogeelin kanssa.
Kuvio 2 on kaavamainen esitys kantaja-alustasta/bioanturista, jota käytettiin esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä ja joka sisältää 20 kolloideja/nanopartikkeleita toteamisen/signaalin vahvistamiseen.
: : Kuvio 3 esittää SPR-mittauksen vakiokuvaajan.
Kuvio 4 esittää ulostenäytteistä tehdyn H. pylorin toteamisen SPR-. sitoutumisisotermit. Tanko kuvaa kahta mittausta erillisiä kalvoja käyttäen.
: BSF37 ja BSF48 ovat näytteitä, jotka saatiin potilaista, jotka olivat positiivisia #! 25 Helicobacter pyloriWe ja BSF51 on näyte, joka saatiin potilaalta, joka oli negatii vinen Helicobacter pyloriWe. "ref" osoittaa nollanäytettä.
s
Kuvio 5 esittää virtsanäytteistä tehdyn H. pylorin toteamisen SPR-sitoutumisisotermit. Näytteet 1 ja 3 ovat näytteitä, jotka saatiin potilaista, jotka i olivat positiivisia Helicobacter pyloriWe ja näyte 2 on näyte, joka saatiin potilaal- 30 ta, joka oli negatiivinen Helicobacter pyloriWe. "ref " osoittaa nollanäytettä ja ..: BSU osoittaa potilaan virtsanäytettä.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ,,;j* Esillä oleva keksintö perustuu sellaisten menetelmien ja keinojen :**: kehittämiseen, jotka ovat tarpeeksi herkkiä ja spesifisiä toteamaan ja/tai mit- 35 taamaan alhaiset määrät vasta-aine-antigeeni-komplekseja, jotka muodostuvat 6 115166 H. pylori -bakteerille, sen antigeenille ja/tai -bakteerin tuottamalle metaboliitille spesifisen immobilisoidun vasta-aineen tai sen antigeeniä sitovan fragmentin ja H. pylorista peräisin olevan antigeenin välisessä immunologisessa reaktiossa. Tällaisilla menetelmillä ja keinoilla H. pylori -antigeenit ja/tai -bakteerin tuot-5 tamat metaboliitit voidaan todeta mistä tahansa biologisesta näytteestä, joka voidaan saada ei-invasiivisesti potilaista, jotka kärsivät H. pylori -infektiosta.
Termit “H. pylori -antigeeni” ja “H. pylorista peräisin oleva antigeeni" tässä käytettynä viittaavat pinta-antigeeniin tai antigeeniin, joka syntyy H. pylori -bakteerin hajoamisesta tai metaboliasta . Termit “antigeeniä sitova fragmentti” 10 ja “vasta-ainefragmentti” tässä käytettynä viittavat H. pylori -antigeeneille spesifisten vasta-aineiden (Fab’)2- tai Fab’-fragmentteihin.
Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään hyväksi erityistä kantaja-alustaa ja bioanturia, joka käsittää tällaisen kantaja-alustan. Nämä kantaja-alustat ja bioanturit on kuvattu yleisesti suomalaisessa 15 patenttihakemuksessa 2001 1877, joka sisällytetään tähän viitteeksi. Esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoiset kantaja-alustat sisältävät spesifisiä vasta-aineita, jotka on nostatettu H. pylori -bakteeria tai H. pylori -antigeenejä vastaan, tai näiden vasta-aineiden antigeeniä sitovia fragmentteja, jolloin vasta-aineet on kiinnitetty kantaja-alustalle. Lisäksi kantaja-alustat sisältävät myös 20 biomolekyylejä karkottavia monomeeri/polymeerimolekyylejä, jotka on kiinnitetty samalle kantaja-alustalle kuin vasta-aineet tai vasta-ainefragmentit estä-mään biologisessa näytteessä läsnä olevien analyyttien ja ei-toivottujen kon-;**: taminoivien (bio)molekyylien epäspesifinen sitoutuminen.
. Erityisesti alustassa on vasta-aineita H. pyloria tai niiden antigeeniä 25 sitovia fragmentteja, jotka on immobilisoitu vasta-aineissa tai vasta-aine- • «♦ ! fragmenteissa olevan funktionaalisen ryhmän kautta suoraan kantaja-alustan ... kiinteälle pinnalle muodostamaan orientoituneiden, antigeeniä sitovien kohtien *'·* kerroksen (kuvio 1). Vasta-aineet tai vasta-ainefragmentit itsejärjestäytyvät pinnalle siten, että aktiivinen antigeeniä sitova kohta on esillä ja funktionaalini i 30 nen ryhmä, jolla on affiniteettiä alustaan, sitoutuu pintaan.
:...: Vapaat sulfhydryyliryhmät vasta-aineissa tai vasta-ainefragmen- teissä toimivat funktionaalisina ryhminä ja voivat adsorboitua kemiallisesti me- ,···. tallipinnoille, kuten kulta-, hopea-, kupari-, alumiini-ja palladiumpinnoille, me- • · '·* talliatomien ja rikkiatomien välisten kovalenttisten sidosten kautta ja siten 35 muodostaa yksikerroksen. Muita ryhmiä, joita voi olla läsnä vasta-aineissa tai vasta-ainefragmenteissa ja jotka kykenevät itsejärjestäytymään, ovat tioli-, di- 115166 7 sulfidi- ja sulfidiryhmät, jotka adsorboituvat kemiallisesti spontaanisti metalli-pinnoille rikkiä sisältävien funktionaalisten ryhmien välityksellä. Tarvittaessa ja haluttaessa myös uusia funktionaalisia ryhmiä voidaan lisätä vasta-aineeseen tai vasta-ainefragmenttiin muuttamalla sen rakenteellinen osa funktionaaliseksi 5 ryhmäksi tai käyttämällä välittäjämolekyylejä, jotka sisältävät funktionaalisen ryhmän.
Vaihtoehtoisesti tunnettuja menetelmiä vasta-aineiden kontrolloidun immobilisaation saamiseksi voidaan käyttää edellyttäen, että spesifisyys- ja herkkyyskriteerit täyttyvät. Tällaisia menetelmiä ovat mm. selektiivinen sitomi-10 nen proteiini A:n tai proteiini G:n välityksellä [katso esimerkiksi Lekkala, J. ja Sadowsky, J., Chemical Sensor Technology 5 (1994) 199 - 213], kovalenttinen kiinnittäminen vapaan sulfhydryyliryhmän välityksellä Fab’-fragmenttien sarana-alueelle [katso esimerkiksi Fischer, B., et ai., Langmuir 9 (1993) 136 - 140], ja biotinyloidut vasta-aineet, jotka on kytketty pinnalle biotiini/(strept)-15 avidiinikemialla [Morgan, H. ja Taylor, D. M., Biosens. Bioelectron. 7 (1992) 405-410]. Suora kiinnittäminen H. pylon -vasta-aineissa tai -vasta-aine-fragmenteissa läsnä olevan funktionaalisen ryhmän välityksellä on edullinen.
Samalla tavalla biomolekyylejä karkottavat molekyylit myös itsejär-jestäytyvät vapaan sulfhydryyliryhmän tai muun rikkiä sisältävän ryhmän väli-20 tyksellä ja peittävät kiinteän pinnan, joka jää vasta-aineiden tai vasta-aine-fragmenttien väliin. Termi "biomolekyylejä karkottava molekyyli" tässä käytet- ί * : tynä viittaa molekyyleihin, jotka kiinnittyvät kiinteään pintaan muodostaen hyd- :' ‘: rofiilisen pinnan immobilisoitujen vasta-aineiden väliin ja joiden vetovoimat ovat • · t : pienempiä kuin hylkimisvoimat suhteessa analyyttiin ja kontaminoiviin (bio)-
IM
: 25 molekyyleihin. Esillä olevan keksinnön mukaisessa bioanturissa käyttökelpoi- siä biomolekyylejä karkottavia molekyylejä ovat neutraalit, hydrofiiliset mono- * · (...t meerit tai polymeerit, kuten polyakryyliamidi, poly-N,N-dimetyyliakryyliamidi, polyvinyylialkoholi, etyleeni-vinyylialkoholikopolymeeri, poly(hydroksietyylimet-akrylaatti), poly(etyleenioksidi) ja poly(etyleeniglykoli). Myös muita polymeere-; ’ 30 jä, kuten polyetyleeniftalaattia, polytetrafluorietyleeniä, polyuretaania ja saman- .: laisia biologisesti sopivia polymeerejä, voidaan käyttää. Edullisia biomolekyyle- .· jä karkottavia molekyylejä, jotka ovat käyttökelpoisia esillä olevassa keksin- ·. nössä, ovat polyakryyliamidi ja poly-N,N-dimetyyliakryyliamidi, jolloin N-[tris- (hydroksimetyyli)metyyli]akryyliamidi on erityisen edullinen.
; 35 Biomolekyylejä karkottavat molekyylit kiinnitetään kiinteään pintaan : kovalenttisesti polymeeriketjun toisessa päässä olevan sopivan funktionaalisen 8 115166 ryhmän (terminaalisen ankkuriryhmän), kuten sulfidi-, disulfidi- tai tioliryhmän, välityksellä. Tyypillisesti biomolekyylejä karkottavat polymeerit sisältävät OH-ryhmiä molekyylien toisessa päässä muodostaen siten hydrofiilisen kerroksen. Biomolekyylejä karkottavien molekyylien kerroksen paksuus on edullisesti jon-5 kin verran matalampi kuin kiinteällä pinnalla oleva vasta-ainekerros.
Esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoinen kantaja-alustan kiinteä pinta on tyyppiä, joka voi indusoida muutoksen signaalissa, joka emittoituu alustaan, ollen vuorovaikutuksessa alustan, immobilisoitujen vasta-aineiden tai vasta-ainefragmenttien ja sitoutuneen analyytin yhdistelmän kanssa, ja todet-10 taessa signaalin muutos osoittaa aineen massan lisääntymistä alustalla (ts. alustan pintaan immobilisoituihin biomolekyyleihin selektiivisesti sitoutuneiden analyyttimolekyylien kasaantumista).
Käytettävä kiinteän pinnan materiaali riippuu valitusta analyysimenetelmästä ja se on sopivan paksuinen ja sopivaa materiaalia oleva kalvo, jota 15 voidaan käyttää lisääntyneen massan toteamiseen sen pinnalla. Siten kiinteä pinta voi olla pintaplasmoniresonanssiin (SPR) yhteensopivaa materiaalia, kuten kultaa, hopeaa, kuparia, alumiinia, palladiumia tai muuta sopivaa metallia, edullisesti kultaa, oleva kalvo, kun analyysissä käytetään SPR-mittausta, elektrodi, joka on peitetty kullalla tai muulla sopivalla metallilla, kuten jollakin edellä 20 mainituista metalleista, edullisesti kullalla, kun käytetään kvartsikidemikrovaa-ka (QCM) -tekniikkaa, tai sopiva metallipäällyste pinta-akustiset aallot (SAW) -i laitteessa tai elektrodilla, kun käytetään SAW-pohjaisia tekniikoita tai vastaa- :" *: vasti elektrokemiallisia menetelmiä.
; Mahdollisesti voidaan haluttaessa sisällyttää reaktioseokseen erilli- • t · : 25 siä partikkeleita, kuten kolloideja tai nanopartikkeleita, jotka ovat samalla taval- la päällystettyä materiaalia kuin mitä käytettiin kiinteässä pinnassa, toteamis-... _ signaalin vahvistamiseksi (kuvio 2).
Esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoiset vasta-aineet ja vasta-ainefragmentit voivat olla mitä tahansa polyklonaalisia tai monoklonaalisia vas- « » ;· > 30 ta-aineita tai vasta-ainefragmentteja, jotka kykenevät sitomaan H. pylori -antigeeniä. Myös eri H. pylori -kantoja vastaan nostatettujen vasta-aineiden tai vasta-ainefragmenttien seoksia voidaan kiinnittää kantaja-alustaan totea-,···. misherkkyyden ja -spesifisyyden varmistamiseksi. Edullisesti käytetään mo- nosspesifisiä polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita, edullisimmin i t i ·: 35 monoklonaalisia vasta-aineita, tai niiden antigeeniä sitovia fragmentteja. Oike- an orientaation varmistamiseksi vasta-ainefragmentit, ts. (FabV ja Fab’- 9 115166 fragmentit, ovat edullisia, jolloin Fab’-fragmentit ovat kaikkein edullisimpia lisääntyneen herkkyyden vuoksi. Kuvaavia esimerkkejä ovat kaupalliset monoklonaaliset anti-H. pylori -vasta-aineet, joita tuottavat kloonit 7101 ja 7102 ja jotka ovat saatavissa Medix Biochemica -yhtiöstä, Kauniainen, Suomi, tai nii-5 den antigeeniä sitovat fragmentit.
Edullisesti kantaja-alustaan kiinnitetään IgG-luokkaan kuuluvia vasta-aineita tai vasta-ainefragmentteja. Kuitenkin, silloin kun on sopivaa, voidaan käyttää myös vasta-aineita tai vasta-ainefragmentteja, jotka kuuluvat IgM- tai IgA-immunoglobuliiniluokkiin.
10 Kantaja-alustan valmistukseen käytettävien vasta-aineiden tai vas- ta-ainefragmenttien määrät samoin kuin vasta-ainefragmenttien valmistus tarvittaessa sisältyvät alan ammattimiehen tietoihin. Samalla tavalla kantaja-alustan valmistukseen käytettävien biomolekyylejä karkottavien molekyylien määrät alan ammattimies voi määrittää käyttäen normaalia menetelmää. Ta-15 vallisesti sekä vasta-aineita tai niiden antigeeniä sitovia fragmentteja että biomolekyylejä karkottavia molekyylejä käytetään ylimäärin kantaja-alustan optimaalisen suorituskyvyn varmistamiseksi. Tässä suhteessa viitataan alla esitettyyn esimerkkiin 1 ja myös suomalaiseen patenttihakemukseen 2001 1877, joka on liitetty tähän viitteeksi. Kantaja-alustan valmistuksessa vasta-aine tai 20 vasta-ainefragmentti ja biomolekyylejä karkottavat molekyylit voidaan kiinnittää samanaikaisesti tai peräkkäin. Vaihtoehtoisesti biomolekyylejä karkottavat mo- : lekyylit voidaan kiinnittää kantaja-alustaan, joka jo sisältää immobilisoidut vas- ta-aineet.
i I * : Vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin sisältävä kerros voidaan re- »· · : 25 generoida sopivalla liuoksella, kuten 0,1 M HCI-glysiiniliuoksella, pH 1-2, tai 0,1 M fosfaattipuskurilla, pH 2-7. Tämä antaa lisäedun kantaja-alustalle, ts.
• · ...t alustaa voidaan käyttää uudelleen jopa 10 kertaa, mikä tuottaa oleellisia etuja sekä kustannuksissa että käyttömukavuudessa.
Analysoitava biologinen näyte voi olla mikä tahansa nestemäinen tai : 30 liukoinen biologinen näyte. Siten biologinen näyte voi olla kokoveri, seerumi, virtsa, sylki tai muu limaerite, kyynelneste tai uloste. Myös biopsianäytteestä .· peräisin oleva näyte voidaan haluttaessa analysoida esillä olevan keksinnön ·. mukaisilla menetelmillä. Näyte voidaan analysoida sellaisenaan tai konsentroi- [ tuna tavanomaisia menetelmiä käyttäen.
* : 35 Spesifisten vasta-aineiden tai vasta-ainefragmenttien oikea orien- taatio ja biomolekyylejä karkottavien molekyylien käyttö esillä olevan keksin- 115166 10 nön mukaisessa kantaja-alustassa tuottavat yksinkertaisen ja nopean ei-invasiivisen H. pylori -infektion toteamisen biologisista näytteistä. Lisäksi nämä piirteet tuottavat riittävän korkean spesifisyyden ja herkkyyden kvantitatiivisen tai puolikvantitatiivisen H. pylori -antigeenien mittauksen suorittamiseksi halut-5 taessa kvalitatiivisen mittauksen lisäksi. Tämä on edullista erityisesti H. pylori -infektion lääkehoidon tehokkuuden seurannassa, jolloin tavallisesti melko raskasta ja pitkää hoitoprotokollaa voidaan muuttaa aikaisessa vaiheessa, jos valittu hoito ei ole tehokas. Kokonaisparantuminen voidaan osoittaa paljon aikaisemmin kuin vasta-ainemittauksella. Myös uudet tai uusiutuneet infektiot voi-10 daan helposti todeta. H. pylori -antigeenien kvantitatiivinen mittaus saattaa myös antaa tietoa infektion kestosta ja vakavuudesta, mikä voi auttaa hoidon valinnassa.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä potilaasta, joka sairastaa tai jonka epäillään sairastavan H. pylori -infektiota, saatu biologinen näyte saate-15 taan kosketukseen bioanturin edellä yksityiskohtaisesti kuvatun kantaja-alustan kanssa ja vasta-aine-antigeeni-kompleksin muodostumisesta seuraava signaali todetaan. Keksinnön mukaista kantaja-alustaa ja bioanturia voidaan käyttää missä tahansa standardisovelluksissa, joita käytetään bioanturiin perustuvissa mittauksissa. Kuitenkin esillä olevan keksinnön mukaisessa mene-20 telmässä erityisen sopivia toteamismenetelmiä ovat pintaplasmoniresonanssi (SPR), paksuusleikkausmoodiresonaattoritekniikka, kuten kvartsikidemikro-vaaka (QCM), pinta-akustiset aallot (SAW-laitteet) ja elektrokemialliset mitta- :*''; ukset. Pintaplasmoniresonanssi (SPR) on erityisen edullinen.
» I * . . ·. Esillä olevan keksinnön mukainen testikitti sisältää reagenssit esillä 25 olevan keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi. Erityisesti, testikitti • · > ‘, j sisältää bioanturin, joka käsittää kantaja-alustan, jolle on kiinnitetty suoraan H.
• · pyloria vastaan muodostettuja spesifisiä vasta-aineita tai niiden antigeeniä si-** tovia fragmentteja yhdessä biomolekyylejä karkottavien molekyylien kanssa, jotka peittävät immobilisoitujen vasta-aineiden tai vasta-ainefragmenttien väli-: 30 sen pinnan, ja mittaukseen tarvittavat reagenssit, kuten standardit, kontrollit, pesuliuokset ja laimennusliuokset.
j Esillä olevaa keksintöä valaistaan seuraavilla ei-rajoittavilla esimer keillä.
» : · 11 51 6 f 11
Esimerkki 1
Yleinen menetelmä keksinnön mukaisen kantaja-alustan valmistamiseksi
Kantaja-alustan valmistamiseksi valmistettiin ensin Fab'-fragmentit spesifisestä monoklonaalisesta anti-H. pylori -vasta-aineesta seuraavasti. En-5 siksi F(ab')2-fragmentit valmistettiin ImmunoPure F(ab')2 Preparation Kit -kitillä (PIERCE, USA) monoklonaalisista anti-H. pylori -vasta-aineista, kuten mono-klonaalisista anti-H. pylori -vasta-aineista kloonit 7101 ja 7102 (Medix Bio-technica, Kauniainen, Suomi). Muita tunnettuja kaupallisia kittejä ja menetelmiä voidaan yhtä hyvin käyttää. Sitten F(ab')2-fragmentit halkaistiin Fab'-frag-10 menteiksi ditiotreitolilla (DTT, Merck) HEPES/EDTA-puskurissa, joka sisältää 150 mM NaCI:a, 10 mM HEPES:iä, 5 mM EDTA:ta, pH 6,0, tyypillisesti yön yli mikrodialyysiletkussa, kuten Ishikawa on kuvannut [Ishikawa, E., J. Immunoassay 4 (1983) 209 - 320]. Lyhyesti kuvattuna F(ab')2-fragmentit pitoisuutena 0,2-0,5 mg/ml sekoitettiin HEPES/EDTA-puskuriin ja 6,25 mM DTT-15 liuokseen mikrodialyysiletkussa. Dialyysiletku upotettiin 250 ml:aan argonilla huuhdottua HEPES/EDTA-puskuria ja dialysoitiin yön yli huoneen lämpötilassa argonin alla. Fab-fragmentteja pidettiin argonin alla ja ne käytettiin välittömästi kiinnittämiseen.
Kiinteä pinta valmistettiin seuraavasti. Lasiset objektilasit päällystet-20 tiin ensin ohuella titaanikalvolla kullan adheesion lisäämiseksi ja sitten ohuella ·: kultakaivolla vakuumihaihdutusta käyttäen. Välittömästi ennen käyttöä objekti- • » · lasit puhdistettiin kuumalla H202:NH4:H20-liuoksella (1:1:5) ja huuhdeltiin ve-Μ.ί della. Objektilasit kiinnitettiin SPR:n prismaan taitekertoimeltaan sopivalla öljyl- lä pintaplasmoniresonanssilaitteeseen (SPRDEVI, VTT, Tampere, Suomi), vir- · -: 25 tauskyvetti asetettiin prisman päälle ja virtauskyvetti huuhdeltiin perusteellisesti puskuriliuoksella, joka sisälsi 10 mM HEPES:iä, 150 mM NaCkia, pH 6, ja joka oli valmistettu erittäin puhtaaseen veteen (18,2 MQcm; Milli-Q system, Millipo-·. re Co., Bedford, USA).
Fab-fragmentit (850 μ\) pitoisuutena 70 jt/g/ml 10 mM HEPES/-30 EDTA-puskurissa, pH 6, lisättiin virtauskyvettiin. Fab’-fragmenttien annettiin oi-la vuorovaikutuksessa kullalla päällystetyn pinnan kanssa tyypillisesti 5 minuut-tia, minkä jälkeen pintaa huuhdeltiin HEPES/EDTA-puskurilla 5 minuuttia. Sit-ten puskuri vaihdettiin 0,1 M fosfaatilla puskuroiduksi fysiologiseksi suolaliuok-seksi (PBS), pH 7,2, ja 1 - 1,5 ml:n N-[tris(hydroksimetyyli)metyyli]akryyliamidi-35 liuosta pitoisuutena 0,15 mg/ml PBS-puskurissa annettiin olla vuorovaikutuk- 12 11516( sessa pinnan kanssa 5 minuuttia. Sitten pinta blokattiin naudan seerumin albumiinilla (BSA).
Esimerkki 2
Yleinen menetelmä H. pylori -antigeenien mittaamiseksi SPR:llä 5 H. pylori -antigeenit voidaan mitata biologisesta näytteestä seuraavalla yleisellä SPR-menetelmällä. Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla valmistettu kantaja-alustan pinta huuhdellaan PBS:llä, pH 7,2. Negatiivinen näyte (nollanäyte) ajetaan ensin. Käytetty negatiivinen näyte riippuu mitattavasta biologisesta näytteestä. Siten kun esimerkiksi mitataan ulostenäyte, negatiivinen näyte on 10 H. pylorin suhteen negatiivinen ulostenäyte, kun mitataan virtsanäytettä, negatiivinen näyte on virtsanäyte, joka on saatu potilaasta, jolla ei ole H. pylori -infektiota, ja kun on mitattava seeruminäyte, negatiivinen näyte on seerumi-näyte, joka on saatu henkilöstä, jolla ei ole H. pylori -infektiota. Sitten kantaja-alustan pinta tuodaan peräkkäin kosketukseen vakioliuosten, positiivisten ja 15 negatiivisten kontrollien ja näytteiden kanssa täyttämällä mittauslaitteen vir-tauskyvetti kulloinkin 10 minuutiksi mitattavalla liuoksella ja otetaan talteen SPR-signaali. Virtauskyvettiä huuhdellaan PBS:llä, pH 7,2, viisi minuuttia mittausten välillä.
Esimerkki 3 : * » '' · · ’ 20 Vakiokuvaajan valmistus ja mittauksen toistettavuus • * » H. pylori -antigeeni, jota käytettiin vakiona, uutettiin H. pylori -kan- » * · • · nan ATCC 49503 bakteerimassasta käyttäen glysiini-happouuttomenetelmää, : jonka ovat kuvanneet Rautelin ja Kosunen [J. Clin. Microbiol. 25 (10) (1987) 1944 - 1951]. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä [Bradford, 25 Anal. Biochem. 72 (1976) 248]. Vakiot laimennettiin 0,1 M PBSiään, pH 7,2, pitoisuuksiin 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 ja 270 //g/ml ja ajettiin esimerkissä 2 > · : kuvattua yleistä menetelmää käyttäen. Kolme erillistä mittausta suoritettiin pe räkkäisinä päivinä toistettavuuden analysoimiseksi.
> ·
Tulokset esitetään kuviossa 3A. Kuviossa 3A esitetystä vakiokuvaa-30 jasta näkyy, että vaste on suoraan verrannollinen antigeenipitoisuuteen puoli-:· logaritmisella asteikolla. Taulukossa 1 esitetään peräkkäisinä päivinä tehtyjen ,-·· vakiokuvaajan kolmen erillisen mittauksen standardipoikkeamat (kuvio 3B).
Saadaan erinomainen toistettavuus.
13 115166
Taulukko 1: Vakioilla saatu SPR-intensiteetti H. pylori Intensiteetin
-pitoisuus muutos SD
[/yg/ml]__[mV]__[mV] 0,001__0,004__ 0,01__0,005__0,001 0,1__0,009__0,004 J__0,014__0,005 JO__0,031__0,004 100__0,062__0,014 ~270 10,102 10,010
Esimerkki 4 5 H. pylori-antigeenin toteaminen virtsa-ja ulostenäytteistä
Potilaista, joilla on H. pylori -infektio (infektio varmistettu biopsialla), ja infektoitumattomasta potilaasta otetut virtsa- ja ulostenäytteet analysoitiin SPR:llä esimerkissä 2 kuvatun yleisen menetelmän mukaisesti. Potilaiden H. pylori -infektio oli diagnosoitu biopsianäytteestä kaupallisella nopealla ure-: 10 aasitestillä ja varmistettu patologin arvioinnilla.
Ulostenäytteet valmistettiin seuraavasti. 0,1 g ulostetta suspendoitiin 500 pl:aan 0,1 M fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta, pH 7,2, ja se-•. * : koitettiin Vortex-sekoittimella 15 sekuntia. Suspensiota sentrifugoitiin 5 minuut- :*·: tia kierrosnopeudella 5000 rpm ja supernatanttia käytettiin mittauksessa. Virt- 15 sanäytteet analysoitiin sellaisinaan.
» » ·
Kaksi mitatuista ulostenäytteistä, näytteet BSF37 ja BSF48, olivat ,·. potilaista, joilla oli biopsialla varmistettu H. pylori -infektio. Kolmas näyte, V BSF51, oli potilaalta, joka oli negatiivinen H. pylorin suhteen. Mittaukset suori- Γ tettiin kahdella erillisellä kalvolla. Tulokset esitetään kuviossa 4. Epäspesifinen ‘ : 20 sitoutuminen kerrokseen oli 0,0013 ± 0,0006 mV (n = 3, verrattiin kahta eri ker- J rasta). Potilasnäytteen BSF48 vaste oli 0,0136 ± 0,0004 mV ja potilasnäytteen BSU37 vaste oli 0,0113 mV, ts. kymmenkertainen ja vastaavasti kahdeksan-kertainen taustaan verrattuna. Negatiivinen potilasnäyte BSF51 antoi intensi » 115166 14 teetin 0,00096 mV. Tulokset osoittavat selvästi, että keksinnön mukainen menetelmä spesifisesti toteaa ulostenäytteissä olevan H. pylori -antigeenin.
Kaksi mitatuista virtsanäytteistä, näytteet 1 ja 3, olivat potilaista, joilla oli biopsialla varmistettu H. pylori -infektio. Kolmas näyte, näyte 2, oli poti-5 laalta, joka oli negatiivinen H. pylorin suhteen. Mittaukset suoritettiin kahdella erillisellä kalvolla. Tulokset esitetään kuviossa 5. Epäspesifinen sitoutuminen kerrokseen oli 0,0185 ± 0,0050 mV. Potilasnäytteen 1 vaste oli 0,117 mV mV ja potilasnäytteen 3 vaste oli 0,044 mV mV, ts. 6,3-kertainen ja vastaavasti 2,4-kertainen taustaan verrattuna. Negatiivinen potilasnäyte 2 antoi intensiteetin 10 0,008 mV. Tulokset osoittavat selvästi, että keksinnön mukainen menetelmä spesifisesti toteaa virtsanäytteissä olevan H. pylori -antigeenin.
* « > · * · · • 4 1 «- k • 4 t 1 t 4 j » 1 4 * I · 4 4 4 ; » 4 4
Claims (8)
1. Ei-invasiivinen menetelmä Helicobacter pylori -antigeenin tai -bakteerin tuottaman metaboliitin läsnäolon tai puuttumisen toteamiseksi biolo-5 gisessa näytteessä, tunnettu siitä, että biologinen näyte, joka on saatu potilaasta, joka kärsii tai jonka epäillään kärsivän H. pylori -infektiosta, saatetaan kosketukseen bioanturin kanssa, joka käsittää kantaja-alustan, jolle on suoraan kovalenttisesti kiinnitetty H. pylo-ria vastaan muodostettuja vasta-aineita tai niiden antigeeniä sitovia fragment- 10 teja yhdessä biomolekyylejä karkottavien hydrofiilisten molekyylien kanssa, jotka peittävät immobilisoitujen vasta-aineiden tai niiden antigeenejä sitovien fragmenttien välisen pinnan, ja todetaan signaali, joka on seurauksena vasta-aine-antigeeni-kompleksin muodostumisesta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biomolekyylejä karkottavat hydrofiiliset molekyylit ovat neutraaleja hydrofii-lisiä monomeerejä tai polymeerejä.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biomolekyylejä karkottavat hydrofiiliset molekyylit ovat polyakryyliamidia, 20 poly-N,N-dimetyyliakryyliamidia, polyvinyylialkoholia, etyleeni-vinyylialkoholi- kopolymeeria, poly(hydroksietyylimetakryylaatti)a, poly(etyleenioksidi)a ja po-,,,·' ly(etyleeniglykoli)a ja polyetyleeniftalaattia, polytetrafluorietyleeniä, polyuretaa- : : : nia tai samanlaista biologisesti yhteensopivaa polymeeriä.
4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu 25 siitä, että biomolekyylejä karkottavat molekyylit ovat polyakryyliamidia ja poly- ,··. Ν,Ν-dimetyyliakryyliamidia, edullisesti N-[tris(hydroksi-metyyli)metyyli]akryyli- amidia.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen menetelmä, tun-nettu siitä, että kantaja-alustan kiinteä pinta on pintaplasmoniresonanssin 30 (SPR) kanssa yhteensopivaa materiaalia, kuten kultaa, hopeaa, kuparia, alu-*: miinia, palladiumia tai muuta sopivaa metallia, edullisesti kultaa, oleva kalvo.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toteaminen suoritetaan pintaplasmoniresonanssi (SPR) -menetelmällä. * 115166
7. Bioanturin käyttö, joka bioanturi käsittää kantaja-alustan, jolle on suoraan kovalenttisesti kiinnitetty spesifisiä H. pyloria vastaan muodostettuja vasta-aineita tai niiden antigeeniä sitovia fragmentteja yhdessä biomolekyylejä karkottavien hydrofiilisten molekyylien kanssa, jotka peittävät immobilisoitujen 5 vasta-aineiden tai niiden antigeenejä sitovien fragmenttien välisen pinnan, Helicobacter pylori -antigeenin tai -bakteerin tuottaman metaboliitin läsnä- tai poissaolon toteamiseksi biologisessa näytteessä.
8. Testikitti Helicobacter pylori -antigeenin tai -bakteerin tuottaman metaboliitin läsnä- tai poissaolon toteamiseksi biologisessa näytteessä, t u n - 10. e 11 u siitä, että se käsittää bioanturin, joka käsittää kantaja-alustan, jolle on suoraan kovalenttisesti kiinnitetty spesifisiä H. pyloria vastaan muodostettuja vasta-aineita tai niiden antigeeniä sitovia fragmentteja yhdessä biomolekyylejä karkottavien hydrofiilisten molekyylien kanssa, jotka peittävät immobilisoitujen vasta-aineiden 15 tai niiden antigeenejä sitovien fragmenttien välisen pinnan, kalibrointiin ja laaduntarkkailuun tarvittavat reagenssit ja apureagenssit, kuten pesuliuokset ja laimennuspuskurit. * · » · * · I * · » I IM • » · • f · * · * • · • · · • · • · * · · · · I · I « t * ♦ 115166
Priority Applications (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI20012603A FI115166B (fi) | 2001-12-31 | 2001-12-31 | Diagnostisia menetelmiä |
US10/164,555 US7544504B2 (en) | 2001-12-31 | 2002-06-10 | Diagnostic methods |
CNB028284186A CN100480703C (zh) | 2001-12-31 | 2002-09-24 | 幽门螺旋杆菌抗体及其抗原结合片段在传感器制备中的应用 |
PCT/FI2002/000762 WO2003056338A1 (en) | 2001-12-31 | 2002-09-24 | Diagnostic methods |
BR0215416-1A BR0215416A (pt) | 2001-12-31 | 2002-09-24 | Métodos de diagnóstico |
EP02762478A EP1468292A1 (en) | 2001-12-31 | 2002-09-24 | Diagnostic methods |
RU2004123636/15A RU2309408C2 (ru) | 2001-12-31 | 2002-09-24 | Способы диагностики |
JP2003556810A JP4323318B2 (ja) | 2001-12-31 | 2002-09-24 | ヘリコバクターピロリを検出するための非侵襲的方法 |
CA002472230A CA2472230A1 (en) | 2001-12-31 | 2002-09-24 | Diagnosis of helicobacter pylori with surface plasmon resonance |
AU2002327860A AU2002327860A1 (en) | 2001-12-31 | 2002-09-24 | Diagnostic methods |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI20012603 | 2001-12-31 | ||
FI20012603A FI115166B (fi) | 2001-12-31 | 2001-12-31 | Diagnostisia menetelmiä |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI20012603A0 FI20012603A0 (fi) | 2001-12-31 |
FI20012603A FI20012603A (fi) | 2003-07-01 |
FI115166B true FI115166B (fi) | 2005-03-15 |
Family
ID=8562607
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI20012603A FI115166B (fi) | 2001-12-31 | 2001-12-31 | Diagnostisia menetelmiä |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7544504B2 (fi) |
EP (1) | EP1468292A1 (fi) |
JP (1) | JP4323318B2 (fi) |
CN (1) | CN100480703C (fi) |
AU (1) | AU2002327860A1 (fi) |
BR (1) | BR0215416A (fi) |
CA (1) | CA2472230A1 (fi) |
FI (1) | FI115166B (fi) |
RU (1) | RU2309408C2 (fi) |
WO (1) | WO2003056338A1 (fi) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FI118061B (fi) * | 2001-09-24 | 2007-06-15 | Beanor Oy | Menetelmä ja bioanturi analyysiä varten |
FI115166B (fi) * | 2001-12-31 | 2005-03-15 | Biofons Oy | Diagnostisia menetelmiä |
US8151116B2 (en) * | 2006-06-09 | 2012-04-03 | Brigham Young University | Multi-channel user authentication apparatus system and method |
JP5003902B2 (ja) * | 2007-11-09 | 2012-08-22 | Jsr株式会社 | 生体関連物質の非特異吸着防止剤および物品のコーティング方法 |
US9128083B2 (en) | 2007-11-09 | 2015-09-08 | Jsr Corporation | Nonspecific adsorption inhibitor of substance relating to living body and method for coating article |
JP2009286968A (ja) * | 2008-05-30 | 2009-12-10 | Canon Inc | グラフトポリマー含有基体、その製造方法および磁気バイオセンサ |
CN101608210B (zh) * | 2008-06-18 | 2012-01-04 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 幽门螺旋杆菌核酸定量检测试剂盒 |
US8521821B2 (en) * | 2009-03-17 | 2013-08-27 | Brigham Young University | Encrypted email based upon trusted overlays |
JP5414422B2 (ja) * | 2009-08-25 | 2014-02-12 | 日本電信電話株式会社 | 病原体検出方法 |
ES2440368B1 (es) * | 2012-07-26 | 2015-03-06 | Univ Zaragoza | Biosensor con nanoparticulas metálicas |
CN104359867A (zh) * | 2014-10-27 | 2015-02-18 | 李博 | 一种以钯为靶材制备表面等离子体共振芯片的方法 |
Family Cites Families (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1237645A (en) * | 1982-12-21 | 1988-06-07 | John H. Fisher | Assay technique |
US4775637A (en) * | 1984-12-10 | 1988-10-04 | Purtec Limited | An immunoassay apparatus having at least two waveguides and method for its use |
US5135876A (en) * | 1987-09-24 | 1992-08-04 | University Of Utah | Method and apparatus for the regulation of complex binding |
SE462454B (sv) | 1988-11-10 | 1990-06-25 | Pharmacia Ab | Maetyta foer anvaendning i biosensorer |
SE8804074D0 (sv) * | 1988-11-10 | 1988-11-10 | Pharmacia Ab | Sensorenhet och dess anvaendning i biosensorsystem |
FI85768C (fi) | 1990-07-04 | 1992-05-25 | Valtion Teknillinen | Foerfarande foer utfoerning av ytplasmonresonansmaetning samt i foerfarandet anvaendbar givare. |
US5200321A (en) * | 1990-09-07 | 1993-04-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Microassay on a card |
DE59106527D1 (de) | 1990-11-14 | 1995-10-26 | Hoffmann La Roche | Immunsensorischer Wandler und Verfahren zu seiner Herstellung. |
US5262156A (en) | 1991-08-12 | 1993-11-16 | Hycor Biomedical, Inc. | Antigenic compositions and their use for the detection of Helicobacter pylori |
CA2067603A1 (en) | 1992-04-29 | 1993-10-30 | Auspharm International Ltd. | Rapid in vitro test for helicobacter pylori using saliva |
GB9212416D0 (en) * | 1992-06-11 | 1992-07-22 | Medical Res Council | Reversible binding substances |
US5733740A (en) * | 1992-10-13 | 1998-03-31 | Vanderbilt University | Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration and gastric carcinoma |
US5919712A (en) * | 1993-05-18 | 1999-07-06 | University Of Utah Research Foundation | Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays |
US5677196A (en) * | 1993-05-18 | 1997-10-14 | University Of Utah Research Foundation | Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays |
US5788687A (en) * | 1994-02-01 | 1998-08-04 | Caphco, Inc | Compositions and devices for controlled release of active ingredients |
GB2307987A (en) * | 1995-12-06 | 1997-06-11 | Univ Manchester | Epitopes of the urease of Helicobacter pylori as dignostic agents; pharmaceuticals comprising such epitopes or the antibodies thereto |
US5716791A (en) | 1996-05-09 | 1998-02-10 | Meridian Diagnostics, Inc. | Immunoassay for H. pylori in fecal specimens |
US5932430A (en) | 1996-05-09 | 1999-08-03 | Meridian Diagnostics, Inc. | Immunoassay for H. pylori in fecal specimens |
JP2000505902A (ja) * | 1996-12-05 | 2000-05-16 | イデゴ・アーペーエス | 生物学的流体中の標的分子をイムノアッセイにより検出するためのセンサー積層体及び多区画流体送達装置 |
IT1289578B1 (it) | 1996-12-06 | 1998-10-15 | Sanitaria Scaligera Spa | Immunopurificazione di un antigene dall'apparente peso molecolare di 16 +- 2 kda dell' helicobacter pylori e metodi per la sua |
US6245574B1 (en) * | 1997-07-03 | 2001-06-12 | Novartis Ag | Sensors |
DE19806642A1 (de) | 1998-02-18 | 1999-08-19 | Huels Chemische Werke Ag | Biosensor mit neuartiger Passivierungsschicht |
US6322963B1 (en) * | 1998-06-15 | 2001-11-27 | Biosensor Systems Design., Inc. | Sensor for analyte detection |
WO2000002049A1 (fr) * | 1998-07-01 | 2000-01-13 | Nitto Denko Corporation | Test immunologique et kit de test immunologique |
AU1157100A (en) | 1998-10-29 | 2000-05-22 | Connex Gmbh | Detection of acid-resistant micro-organisms in a stool |
GB9825904D0 (en) * | 1998-11-27 | 1999-01-20 | Univ Cranfield | Diagnosis of gastric and lung disorders |
US6833267B1 (en) * | 1998-12-30 | 2004-12-21 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Tissue collection devices containing biosensors |
US6770488B1 (en) * | 1999-03-19 | 2004-08-03 | The University Of Wyoming | Practical method and apparatus for analyte detection with colloidal particles |
GB9906569D0 (en) * | 1999-03-22 | 1999-05-19 | Univ London | Detection of bacterial infection |
AU769571B2 (en) | 1999-04-28 | 2004-01-29 | Universitat Zurich | Polyionic coatings in analytic and sensor devices |
US6503701B1 (en) * | 1999-06-15 | 2003-01-07 | Biosensor Systems Design, Inc. | Analytic sensor apparatus and method |
WO2000077522A1 (en) * | 1999-06-15 | 2000-12-21 | Biosensor Systems Design, Inc. | Analytic sensor apparatus and method |
IL149062A0 (en) | 1999-10-12 | 2002-11-10 | Connex Ges Zur Optimierungvon | Improved method for detecting acid resistant microorganisms in the stool |
WO2001040801A2 (en) | 1999-12-03 | 2001-06-07 | Meridian Bioscience, Inc. | Diagnosis and treatment for helicobacter pylori induced colic |
TWI237695B (en) * | 1999-12-14 | 2005-08-11 | Joy Biomedical Corp | Helicobacter pylori antigens in blood |
DE10002895B4 (de) | 2000-01-17 | 2006-02-09 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Koimmobilisierung mehrerer chemischer Spezies |
US6316205B1 (en) * | 2000-01-28 | 2001-11-13 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Assay devices and methods of analyte detection |
DE60122721T2 (de) * | 2000-07-03 | 2007-10-11 | Utku, Nalán, Dr. | Diagnostische verwendungen des t-zell proteins tzon7, der davon abgeleiteten peptide und des antikörpers |
JP2002022654A (ja) * | 2000-07-11 | 2002-01-23 | Suzuki Motor Corp | Sprセンサプレート及びこれを用いた免疫反応測定装置 |
AU7595701A (en) * | 2000-07-17 | 2002-01-30 | Harvard College | Surfaces that resist the adsorption of biological species |
WO2002010358A2 (en) * | 2000-07-31 | 2002-02-07 | Maxygen, Inc. | Nucleotide incorporating enzymes |
GB0025414D0 (en) * | 2000-10-16 | 2000-11-29 | Consejo Superior Investigacion | Nanoparticles |
US7575939B2 (en) * | 2000-10-30 | 2009-08-18 | Sru Biosystems, Inc. | Optical detection of label-free biomolecular interactions using microreplicated plastic sensor elements |
US6844026B2 (en) * | 2001-02-12 | 2005-01-18 | Rhodia Chimie | Preparation of particles by hydrolysis of a metal cation in the presence of a polymer |
CN1303013A (zh) | 2001-02-20 | 2001-07-11 | 重庆大学 | 压电基因诊断芯片 |
KR100878093B1 (ko) * | 2001-04-11 | 2009-01-14 | 라피드 바이오센서 시스템스 리미티드 | 생물학적 측정 시스템 및 이를 사용하여 병원체를 검출하는 방법 |
US20030103901A1 (en) * | 2001-04-23 | 2003-06-05 | Mcgill University | ELISA kit for the determination of CYP2C19 metabolic phenotypes and uses thereof |
US7052854B2 (en) * | 2001-05-23 | 2006-05-30 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Application of nanotechnology and sensor technologies for ex-vivo diagnostics |
EP1393069A1 (en) * | 2001-05-24 | 2004-03-03 | The University Of Florida | Method and apparatus for detecting environmental smoke exposure |
JP2002350447A (ja) * | 2001-05-24 | 2002-12-04 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 生理活性物質固定化担体及びその製造方法、固定化生理活性物質、試料中の対象成分分析方法、並びに試料中の対象成分分析用キット |
WO2003000845A2 (en) * | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Ludwig Institute For Cancer Research | Methods for detection of disease-associated antibodies in urine |
US6844028B2 (en) * | 2001-06-26 | 2005-01-18 | Accelr8 Technology Corporation | Functional surface coating |
FI118061B (fi) * | 2001-09-24 | 2007-06-15 | Beanor Oy | Menetelmä ja bioanturi analyysiä varten |
US20050101841A9 (en) * | 2001-12-04 | 2005-05-12 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Healthcare networks with biosensors |
FI20012608A0 (fi) * | 2001-12-31 | 2001-12-31 | Biofons Oy | Diagnostiset menetelmät |
FI115166B (fi) * | 2001-12-31 | 2005-03-15 | Biofons Oy | Diagnostisia menetelmiä |
AU2003228711C1 (en) * | 2002-04-26 | 2010-01-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and system for the detection of cardiac risk factors |
WO2004046164A2 (en) * | 2002-05-10 | 2004-06-03 | Engeneos, Inc. | Unique recognition sequences and methods of use thereof in protein analysis |
US7460960B2 (en) * | 2002-05-10 | 2008-12-02 | Epitome Biosystems, Inc. | Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis |
US7618788B2 (en) * | 2002-05-10 | 2009-11-17 | Millipore Corporation | Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis |
US20040100376A1 (en) * | 2002-11-26 | 2004-05-27 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Healthcare monitoring system |
US7597936B2 (en) * | 2002-11-26 | 2009-10-06 | University Of Utah Research Foundation | Method of producing a pigmented composite microporous material |
US20040101860A1 (en) * | 2002-11-27 | 2004-05-27 | Jones Alison M. | Predicting animal performance |
US7408640B2 (en) * | 2003-11-05 | 2008-08-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Fluorescence polarization instruments and methods for detection of exposure to biological materials by fluorescence polarization immunoassay of saliva, oral or bodily fluids |
-
2001
- 2001-12-31 FI FI20012603A patent/FI115166B/fi not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-06-10 US US10/164,555 patent/US7544504B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-24 CN CNB028284186A patent/CN100480703C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-24 JP JP2003556810A patent/JP4323318B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-24 RU RU2004123636/15A patent/RU2309408C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-09-24 AU AU2002327860A patent/AU2002327860A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-24 CA CA002472230A patent/CA2472230A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-24 WO PCT/FI2002/000762 patent/WO2003056338A1/en active Application Filing
- 2002-09-24 EP EP02762478A patent/EP1468292A1/en not_active Ceased
- 2002-09-24 BR BR0215416-1A patent/BR0215416A/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2005513504A (ja) | 2005-05-12 |
RU2004123636A (ru) | 2005-04-20 |
US7544504B2 (en) | 2009-06-09 |
WO2003056338A1 (en) | 2003-07-10 |
AU2002327860A1 (en) | 2003-07-15 |
US20030124632A1 (en) | 2003-07-03 |
EP1468292A1 (en) | 2004-10-20 |
BR0215416A (pt) | 2004-11-09 |
RU2309408C2 (ru) | 2007-10-27 |
CN1623092A (zh) | 2005-06-01 |
FI20012603A (fi) | 2003-07-01 |
CA2472230A1 (en) | 2003-07-10 |
CN100480703C (zh) | 2009-04-22 |
JP4323318B2 (ja) | 2009-09-02 |
FI20012603A0 (fi) | 2001-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102759631B (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
US6916626B1 (en) | Detection of Candida | |
FI115166B (fi) | Diagnostisia menetelmiä | |
KR20210013646A (ko) | 바이러스 및 박테리아 감염의 복합 검출을 위한 방법 및 장치 | |
JP2004529350A5 (fi) | ||
AU2002248996A1 (en) | Detection of candida | |
Auer et al. | Rapid and sensitive detection of norovirus antibodies in human serum with a biolayer interferometry biosensor | |
US10921322B2 (en) | Methods for detecting a marker for active tuberculosis | |
CN202916286U (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
Silva et al. | A Vicia villosa agglutinin biosensor for cancer-associated Tn antigen | |
KR19980703302A (ko) | 글루타치온 s-트랜스퍼라제의 하나 또는 그 이상의 아이소엔자임 검출에 기초한 장기 상태 평가를 위한 쾌속 검정법 | |
JP4115728B2 (ja) | フロースルー式検査法用組成物、これを用いたキット及び検査法 | |
Wang et al. | Novel immunoassay for Toxoplasma gondii-specific immunoglobulin G using a silica nanoparticle-based biomolecular immobilization method | |
JP2002541457A (ja) | リポ多糖の免疫測定法と試験装置 | |
JP3493544B2 (ja) | 抗体アッセイ装置 | |
EP0687910B1 (en) | Test kit and method for competitive specific binding assay | |
US9500648B1 (en) | Rapid Lyme antigen test for detection of Lyme disease | |
CZ20023063A3 (cs) | Způsob detekce Helicobacter pylori a heilmanii ve vzorcích stolice, slin a bioptickém materiálu | |
US20030124633A1 (en) | Diagnostic methods | |
EP1596198B1 (en) | METHOD OF MEASURING OXIDIZED LDL-beta2-GPI-CRP COMPLEX | |
CA2497883A1 (en) | Method for distinguishing ulcerative colitis from crohn's disease by detecting the presence of fecal anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (anca) | |
WO2008066996A2 (en) | A method to detect treponema pallidum immunological markers for the diagnosis of syphilis | |
NL2016913B1 (en) | Solid substrate comprising antigens immobilised thereto and use thereof in a method for detecting the presence of mycobacterial material in a sample | |
JPH1164334A (ja) | 尿中トリプシンインヒビターの測定方法 | |
WO1996012188A1 (en) | Diagnostic method and apparatus for performing the method |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG | Patent granted |
Ref document number: 115166 Country of ref document: FI |
|
PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: BEANOR OY Free format text: BEANOR OY |
|
MM | Patent lapsed |