JP2001520018A

JP2001520018A - 低ｐＨの乳酸発酵

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Publication number: JP2001520018A
Application number: JP2000516054A
Authority: JP
Inventors: ティン・リウ・カールソン; ユージーン・マックス・ピーターズ・ジュニア
Original assignee: カーギル・インコーポレイテッド
Priority date: 1997-10-14
Filing date: 1998-10-13
Publication date: 2001-10-30
Also published as: NO20001764D0; CN1276016A; ES2313754T3; CN100467608C; NO320889B1; EP1930408A2; ID25625A; NZ504345A; EP1025254A1; EP1025254B1; AU754069B2; BR9814072A; WO1999019503A1; KR20010030876A; US20060094093A1; KR100586105B1; EP1930408A3; AU9800698A; NO20001764L; ATE399874T1

Abstract

(57)【要約】酸寛容性のラクテート産生微生物、例えば酸寛容性のホモ乳酸型細菌を栄養培地中でインキュベートして、高レベルの遊離乳酸を含む発酵ブロスを得ることを含んでなる乳酸の製造方法が提供される。また、高レベルの遊離乳酸を産生することができる単離された酸寛容性のホモ乳酸型細菌も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (技術分野) 乳酸およびその塩は、これまで、化学、化粧品、食品および医薬工業における
種々の応用分野において広く利用されている。より最近になって、ラクテートに
基づく新規な生物工学材料(例えば、生分解性ラクチドポリマー)が、ラクテート
(特に、遊離酸形態のＬ-またはＤ-ラクテート)の需要の増加を高めている。

【０００２】 (背景技術) 種々の工業用ポリマーの製造における乳酸の使用は、例えば、米国特許Ｎo.５
,１４２,０２３、Ｎo.５,２４７,０５８、Ｎo.５,２５８,４８８、Ｎo.５,３５７,０３５、Ｎo.５,３３８,８２２、Ｎo.５,４４６,１２３、Ｎo.５,５３９,０８１、Ｎo.５,５２５,７０６、Ｎo.５,４７５,０８０、Ｎo.５,３５９,０２６、
Ｎo.５,４８４,８８１、Ｎo.５,５８５,１９１、Ｎo.５,５３６,８０７、Ｎo.５
,２４７,０５９、Ｎo.５,２７４,０７３、Ｎo.５,５１０,５２６およびＮo.５, ５９４,０９５に記載されている[本出願の譲受人であるカーギル・インコーポレ
イテッド(ミネソタ州ミネアポリス)が所有しているこれら１７件の特許の全開示
が本明細書の一部を構成する]。

【０００３】乳酸の製造に化学的方法を使用することができるが、石油化学供給原料の価格
の上昇および通常の化学的方法によって製造されるラセミ体ラクテート混合物を
分割する必要性が、発酵法を、光学異性体の一方に富むラクテートを製造するた
めの魅力的な代替法にしている。生分解性のラクチドポリマーの製造に使用する
方法は、出発原料として遊離酸型のＬ-またはＤ-ラクテートのいずれかを必要と
するのが普通である。しかし、ほとんどの有機酸発酵を用いたときには、有機酸
(本件の場合には乳酸)による最終生成物抑制が、効率的な発酵に対する大きな障
害になりうる。ラクテート発酵に通常使用される細菌株は、ラクテート濃度の他
に低ｐＨによっても抑制されうる。この問題を克服するために、工業的なラクテ
ート発酵法は、比較的高いｐＨ(例えば少なくとも約５.０、さらに６.０またはそれ以上であることも多い)で行われるのが普通である。これは、実質的に全てが塩の形態で存在するラクテート生成物を製造する結果になる。追加の工程が、
カチオン対イオンの除去および所望の遊離乳酸の単離のために必要になるのが普
通である。さらに、高濃度のある種の塩(例えばナトリウムカチオン)は発酵に対
して抑制効果を有することもあるので、存在する塩の種類および／または量も、
発酵効率に影響を与えうる。

【０００４】ラクトバシラス・アミロボラス(Lactobacillus amylovolus)を用いる、酵素減
少させたコーンスターチからのラセミ体ラクテートの製造が報告されている。４
.２程度のｐＨにおいて、比較的高い生産レベルが報告されているが、この発酵はどちらかの光学異性体に富むラクテートを与えるものではない。

【０００５】ラクテート発酵の効率を改善するための多くの方法が報告されている。これら
のいくつかは、連続的に発酵ブロスから遊離乳酸を除去することを包含する。例
えば、発酵ブロスからラクテートを除去することによって最終生成物抑制を低下
させるために電気透析が使用されている。低ラクテート勾配と組合わせる透析膜
の高コストが、一般にこの方法の魅力を低下させている。また、発酵培地からラ
クテートを除去するためのポリビニルピリジンの使用およびイオン交換も報告さ
れている。最近になって記載されたさらに別の方法は、多段階抽出操作を包含す
る。この方法は、さらなるラクテート生成を抑制する値にまでブロスのｐＨが低
下することを抑制する目的で、第三アミンを用いてブロスからラクテートを抽出
することを包含する。しかし、その報告によれば、この方法によって達成される
ラクテート生産レベルは、なお非常に低いレベルである。また、この方法の使用
は、抽出された発酵ブロスを第２の抽出にかけて、第三アミン抽出体の残留濃度
を少なくとも低下させ、次いで、抽出されたブロスを発酵反応に戻して再使用す
ることをも必要とするであろう。

【０００６】ラクトバシラスの発酵に基づいて遊離酸形態にある乳酸を製造するためのこれ
ら全ての方法は、１またはそれ以上の欠点を有している。他のさらに酸寛容性の
微生物の発酵に基づく代替法も報告されている。サッカロミセス・セレビジエ(S
accharomyces cerevisiae)などの酵母は、ラクトバシラスよりもさらに低いｐＨ
で増殖することができる。サッカロミセス・セレビジエ中に細菌(ラクトバシラス)または哺乳動物(ウシ)供給源からのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することによって、組換え酵母株が調製されている。この組換え酵母株は、そ
の報告によれば、乳酸のpＫa(約３.８)以下においてラクテートを産生することができる。しかし、これらの組換え酵母株によって得られる主な発酵生成物はエ
タノールである。これは、ラクテート産生の効率を低下させ、遊離乳酸の分離お
よび精製に関する追加の潜在的な問題を提起する。また、ペレット形態の菌類、
リゾプス・オルギゼ(Rhizopus orgyzae)による乳酸の製造も報告されている。こ
の菌類の発酵は、主な副生成物としてグリセロールおよび／またはエタノールを
も産生するのが普通である。この場合、遊離乳酸の収率は、ポリビニルピリジン
(「ＰＶＰ」)カラムを用いる発酵ブロスからの連続除去によって最適化されてい
る。約２５ｇ／Ｌより高いラクテート濃度が、リゾプス／ＰＶＰ法を用いて低発
酵ｐＨにおいて得られたとは報告されていない。

【０００７】 (発明の開示) 本発明は、発酵によるラクテートの製造に関する。特に本発明は、酸寛容性の
ラクテート産生微生物(例えば酸寛容性の細菌)による発酵によって、高レベルの
遊離乳酸を含む発酵ブロスを生成させることに関する。高レベルの遊離乳酸の存
在は、ブロスから遊離酸の形態でラクテートを単離するのに必要になる下流の処
理を容易にすることができる。

【０００８】一般的に、発酵ブロス(または他の乳酸／乳酸塩混合物)を約４.８またはそれ以下(好ましくは４.５またはそれ以下、最も好ましくは４.３またはそれ以下、通常は３.５〜４.２)のｐＨにするように行われる方法を用いて、全体的に効率的な方法を開発することができることがわかった。この際、生成した乳酸をポリ
マー製造に使用することができ、所望により、回収された乳酸塩を、緩衝剤とし
て発酵系に再循環させることができるか、またはｐＨ制御のために使用すること
ができる。

【０００９】乳酸製造のために本発明において提供される方法は、酸寛容性のラクテート産
生微生物(例えば、酸寛容性のホモ乳酸型ラクトバシラス)を、ラクテート生成物
の大きな部分を遊離酸形態で与えるｐＨの栄養培地中でインキュベートすること
を包含する。本明細書において、「酸寛容性」なる用語を細菌に関連して用いる
ときには、ラクテート生成物の大きな部分を遊離酸形態で与えるのに充分なｐＨ
においてラクテートを産生することができる細菌を指すことを意味する。通常、
酸寛容性の細菌は、少なくとも約２５ｇ／Ｌの遊離乳酸を産生することができる
。通常、このような細菌は、約４.２以下の「平均インキュベートｐＨ」の栄養培地中で、少なくとも約５０ｇ／Ｌのラクテート(即ち、５０ｇ／Ｌの合計ラクテート)を産生することができる。

【００１０】限界ラクテート濃度に到達する点まで発酵を行わないときには、「平均インキ
ュベートｐＨ」は、発酵中に１０またはそれ以上の等しい時間間隔で測定したｐ
Ｈ値の平均に基づいて決定される。本発明の発酵方法は、連続的に行うことがで
きる。このような条件下では、最初の始動相が終了した後に、定常状態条件(ｐＨ、ラクテート濃度および栄養濃度の点で)が達成され、そして維持されるのが普通である。発酵をこのように行うときには、平均インキュベートｐＨは、最初
の始動相が終了した後のブロスの平均ｐＨである(即ち、始動相におけるｐＨは、平均インキュベートｐＨを決定する際には無視される)。

【００１１】ｐＨおよび／または乳酸濃度がさらなるラクテート産生を抑制する点まで発酵
を行うときには、「平均インキュベートｐＨ」は、限界ラクテート濃度の９０％
を産生するのに必要な時間内に１０またはそれ以上の等しい時間間隔で測定した
ｐＨ値の平均に基づいて決定される。本明細書中で用いる「限界ラクテート濃度
」とは、発酵によって得られるｐＨおよび／または乳酸濃度がさらなるラクテー
ト産生を抑制する、所与の組のインキュベート条件下(栄養培地、温度、曝気度)
でのラクテート濃度である。本明細書で用いる「限界インキュベートｐＨ」なる
用語は、ｐＨおよび／または乳酸濃度がさらなるラクテート産生を抑制する、所
与の組のインキュベート条件に対する発酵ブロスのｐＨを意味する。ラクテート
産生の抑制は、産生されるラクテートの量が、同一条件下での約１２時間までの
さらなるインキュベートによって、約３％を越えて増加しないときに起こってい
ると見なされる。この定義は、ラクテート産生のための充分な栄養が発酵ブロス
においてなお利用可能であると仮定している。

【００１２】本明細書における「栄養培地」および「発酵ブロス」なる用語は交換可能に用
いる。これらの用語は、(ｉ)栄養供給源として酸寛容性の細菌に最初に供給され
る形態の培地、および(ii)最初に供給された栄養の一部または全部が消費され、
ラクテートを含む発酵生成物が細菌によって培地中に分泌された後に得られる培
地の両方を指す。

【００１３】本発明の方法においては、酸寛容性の細菌をインキュベートしてラクテートを
産生させた後の発酵ブロスのｐＨは、約４.２以下であるのが普通である(「最終
インキュベートｐＨ」)。本明細書中で言及する「最終インキュベートｐＨ」とは、酸寛容性の細菌の増殖および／またはラクテート産生が止まった時点での発
酵ブロスのｐＨである。増殖および／またはラクテート産生の停止は、反応温度
の変化、発酵ブロス中の１またはそれ以上の必要な栄養の枯渇、ｐＨの意図的な
変化、または細菌細胞からの発酵ブロスの分離の結果であることもある。ラクテ
ート産生を停止させるためにブロスに充分な酸または塩基を添加することによっ
て発酵を抑制する場合には、最終インキュベートｐＨは、この添加の直前の栄養
培地のｐＨであると定義される。また、増殖および／またはラクテート産生は、
１またはそれ以上の発酵生成物の蓄積および／または発酵生成物の蓄積に起因す
るブロスｐＨの変化によって停止することもある(即ち、発酵反応が、所与の組のインキュベート条件に対して自己限界点に到達する)。上記のように、乳酸などの有機酸を産生する細菌発酵にとって、最終生成物抑制を受けることは全く普
通のことである。

【００１４】本出願において使用する「ラクテート」なる用語は、遊離酸または塩のいずれ
かの形態にある２-ヒドロキシプロピオネート(即ち、「全ラクテート」)を意味する。「乳酸」および「遊離乳酸」なる用語は、本明細書においては交換可能に
用い、酸形態、即ち２-ヒドロキシプロピオン酸を指す。塩形態のラクテートを、本明細書においては特に乳酸塩(例えば、乳酸のナトリウム塩または乳酸ナトリウム)と言う。

【００１５】また本発明は、酸寛容性のホモ乳酸型細菌を提供するものである。この酸寛容
性のホモ乳酸型細菌は、通常、少なくとも約４０℃のインキュベート温度で少な
くとも約２５ｇ／Ｌの遊離乳酸を産生することができる。本発明の酸寛容性細菌
の別の態様は、約４.２以下の平均インキュベートｐＨおよび約４０℃を越える温度で、少なくとも約５０ｇ／Ｌのラクテートを産生することができる。通常、
酸寛容性細菌は、ラクテート生産性のこれら尺度の両方を満たすことができる。

【００１６】 (発明を実施するための最良の形態) 細菌学的系による、５.０またはそれ以下、好ましくは４.８またはそれ以下、
通常は３.５〜４.５のｐＨを有する乳酸溶液の生成は、より高い割合(％)の乳酸
形態にあるラクテート物質の生産を導く。乳酸塩ではなく乳酸の形態で発酵過程
から比較的大量の生成物を得ることは、酸性化および／または「塩分割」のよう
なある種の後処理工程の必要性またはその程度を軽減することができるので有利
である。即ち、比較的大量の物質が遊離乳酸として生成するときには、ラクテー
トから乳酸を生成させる処理工程ならびにそれに伴う費用および結果が、軽減ま
たは回避される。ある種の酸性化を行うときであっても、高ｐＨ系の場合と比較
すると、相当に少ない酸添加でよいであろう。一般的に、発酵ブロスを約４.８またはそれ以下(好ましくは４.５またはそれ以下、最も好ましくは４.３またはそれ以下、通常は３.５〜４.２)のｐＨにするように行われる方法を用いて、全体的に効率的な方法を開発することができることがわかった。この際、生成した
乳酸をポリマー製造に使用することができ、回収された乳酸塩を、緩衝剤として
発酵系に再循環させることができるか、またはｐＨ制御のために使用することが
できる。

【００１７】本発明の方法は、適当な栄養培地中での酸寛容性のホモ乳酸型細菌のインキュ
ベートにより、ラクテートの効率的な製造、特に、高濃度の遊離乳酸の効率的な
製造を可能にする。酸寛容性のホモ乳酸型細菌は、工業用トウモロコシ製粉設備
のコーンスチープ水から単離することができる。この種類の異なる細菌がラセミ
体ラクテートまたはＤ-もしくはＬ-異性体のどちらかに富むラクテートを産生す
ることができるが、本発明の方法は、好ましくはＬ-もしくはＤ-ラクテートを多
く産生するホモ乳酸型細菌、最も好ましくは光学的に純粋な形態でＬ-ラクテートを産生するホモ乳酸型細菌を使用する。

【００１８】本発明の方法は、高濃度の遊離酸形態の乳酸の光学異性体の効率的な製造を可
能にする。発酵ブロス中の遊離乳酸の濃度は、方法の全体的な生産性の１つの尺
度となる。本発明の方法は、通常は少なくとも約２５ｇ／Ｌ、好ましくは少なく
とも約３０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも約４０ｇ／Ｌの遊離乳酸を含む
溶液を生成する。最も好ましくは、本方法は、これらレベルの遊離Ｌ-乳酸または遊離Ｄ-乳酸のどちらかを産生する。製造されるラクテート(および遊離乳酸) の光学純度は、好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約
８０％であり、最も好ましくは、ラクテートの一方の光学異性体が実質的に純粋
な形態で製造される。

【００１９】上記のように、本発明の方法によって製造されるラクテートは、多くがＬ-ラクテートの形態にあるのが普通である。例えば、本方法の１つの態様は、酸寛容
性のホモ乳酸型細菌を栄養培地中でインキュベートして、少なくとも約７５重量
％のＬ-ラクテート(即ち、少なくとも約５０％の光学純度を有するＬ-ラクテート)を含むラクテートを生成させる。好ましくは、本発明の方法によって製造されるラクテートの光学純度は少なくとも約８０％であり、さらに好ましくは少な
くとも約９０％(例えば、少なくとも約９５重量％のＬ-ラクテートを含む)である。最も好ましくは、本発明の方法は、実質的に光学的に純粋な形態にあるＬ- またはＤ-ラクテートを与える(即ち、製造されるラクテートは、９９重量％また
はそれ以上の単一の光学異性体を含有する)。

【００２０】発酵ブロスが３.０〜４.５のｐＨ値を有するときには、相当な量の乳酸が未解
離の形態で存在するであろう(図６を参照)。実際のところ、ｐＨ３.０においては、遊離乳酸(未解離)とラクテートイオンの２５℃でのモル比は約７.０であり、ｐＨ約４.５においては、２５℃でのこのモル比は約０.２３である。溶液中に
存在する遊離乳酸の合計量は、溶液のｐＨおよび混合物中のラクテートの合計濃
度の両方の関数である。即ち、所与の溶液(例えば発酵ブロス)に対するこれら２
種類のパラメーターを特定することによって、遊離乳酸の濃度が有効に特定され
る。本発明の方法は、比較的低いｐＨにおいて、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ま
しくは少なくとも約８０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも約１００ｇ／Ｌの
ラクテートを含む溶液を生成することができる。溶液のｐＨが低くなるにつれて
、遊離酸の形態で存在するラクテートの割合(％)が高くなる。例えば、培地ｐＨ
が乳酸のpＫa(約３.８)に等しいときには、５０％のラクテートが遊離酸の形態で存在する。ｐＨ４.２では約３１％のラクテートが遊離酸として、また、ｐＨ４.０および３.９ではそれぞれ約４１％および４７％のラクテートが遊離酸の形
態で存在する。遊離乳酸の割合は、さらに高いｐＨではさらに低くなり、ｐＨ４
.５では１８％であり、ｐＨ５.０では６.６％である。

【００２１】インキュベート工程中のブロスのｐＨを、いくつかの異なる方法(例えば、平均インキュベートｐＨまたは最終インキュベートｐＨ)で表すことができる。本発明の発酵方法は、通常は約４.３以下、好ましくは約４.２以下、さらに好まし
くは約４.０以下の平均インキュベートｐＨにおいて、高レベルのラクテートを製造することができる。別法によれば、インキュベート中のブロスのｐＨを、最
終インキュベートｐＨで表すことができる。本発明の方法は、通常は約４.２以下、好ましくは約４.０以下、さらに好ましくは約３.９以下の最終インキュベー
トｐＨにおいて、高ラクテート濃度の製造を可能にする。本発明の発酵方法の特
に効率的な態様は、約４.０以下の平均インキュベートｐＨおよび／または約３.
９以下の最終インキュベートｐＨにおいて、少なくとも約８０ｇ／Ｌのラクテー
トを製造することができる。

【００２２】本発明の発酵方法を連続的に実施することができ、この場合には、発酵の進行
に伴って発酵ブロスの一部を取出す。これは、連続的にまたは定期的な間隔で行
うことができる。通常は、充分な栄養培地を反応器に加えて一定の液量を維持す
る。このような発酵条件下では、最初の始動相が終了した後に、定常状態条件( ｐＨ、ラクテート濃度および栄養濃度の点で)が達成され、そして維持されるのが普通である。発酵をこのように行うときには、ブロスの平均インキュベートｐ
Ｈ(始動相におけるｐＨは無視される)および最終インキュベートｐＨは、本質的
に同一である。このような条件下で、発酵を、通常は約４.２以下、好ましくは約４.０以下、さらに好ましくは約３.９以下のｐＨで行う。

【００２３】本発明のインキュベート法を比較的低い温度、例えば約３０〜３８℃で行うこ
ともできるが、酸寛容性のホモ乳酸型細菌を、通常は少なくとも約４３℃、より
好ましくは約４５〜５２℃の温度の適当な栄養培地中でインキュベートする。最
も好ましくは、発酵を約４７〜５０℃で行う。発酵をこのような温度で行うと多
くの利点が存在する。この温度範囲においては、他の競合生物の増殖による複雑
化の機会が減少する。さらに、比較的高い温度では、一般に反応がより速い速度
で進行し、方法の装置の効率的な利用を可能にする。発酵を高すぎる温度、通常
は約５４℃またはそれ以上の温度で行うと、ホモ乳酸型細菌の増殖および／また
はラクテート産生がないに等しくなるであろう。しかし、通常の選択方法を用い
て、５５℃またはそれ以上の温度で増殖およびラクテート産生が可能な突然変異
のホモ乳酸型細菌株を同定することが可能であろう。

【００２４】本明細書中に記載する「栄養培地」とは、本発明の細菌の増殖に必要な無機物
およびその塩を含む水を基本とする組成物を指す。通常、この栄養培地は、有効
量の炭素源、窒素源、ホスフェート源、スルフェート源、カルシウムおよび微量
元素を含有する。「微量元素」なる用語は、痕跡濃度で、即ち１％よりもさらに
低い濃度(１０００ｐｐｍまたはそれ以下)で、増殖に必須である元素を指す。

【００２５】通常、本発明の細菌は、増殖および／またはラクテート産生に多くの炭素およ
びエネルギー源、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、メリビオー
ス、スクロース、ラフィノースおよび／またはスタキオースを利用することがで
きる。一部の細菌は、これら糖の全てまたは大部分を炭素およびエネルギーの供
給源として利用することができるが、他の菌株には選択性があり、列挙した糖の
１つまたは２つにおいてのみ増殖することができることもある。他の場合には、
デンプン(例えばコーンスターチ)またはその加水分解物を、主な炭水化物供給源
として使用することができる。

【００２６】本明細書において使用する「コーンスチープ水」とは、トウモロコシ浸出タン
クから得られる水、ならびに、これから導かれる実質的に同一の栄養スペクトル
を有する他の溶液を指す。例えば、コーンスチープ液(「重スチープ水」と呼ばれることもある)は、通常は真空下で水および他の揮発性成分を除去することによって得られる濃縮形態のコーンスチープ水である。通常、コーンスチープ液は
、約３５〜５０重量％の乾燥固形分含量を有する。本明細書中の実施例に記載さ
れた実験において使用されるコーンスチープ液は、３６重量％の乾燥固形分含量
を有しており、本明細書中では「ＣＳＬ」と言う。コーンスチープ液を製造する
ために濃縮する直前にトウモロコシ浸出タンクおよび／または関連のラインから
直接得たコーンスチープ水は、約１０〜１５重量％の範囲の乾燥固形分含量を有
するのが普通であり、これを本明細書中では「軽スチープ水」(「ＬＳＷ」)と言
う。軽スチープ水は、約５００ｐｐｍ以下のＳＯ₂含量を有するのが普通である。本発明の方法において使用する栄養培地を補足するために使用するスチープ水
は、好ましくは約３００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは約２００ｐｐｍ以下のＳ
Ｏ₂含量を有する。本明細書中の実施例に記載された実験において使用される軽スチープ水は、１２重量％の乾燥固形分含量を有する。

【００２７】コーンスチープ水から単離した１またはそれ以上のホモ乳酸型菌株を用いてラ
クテートを製造しようとする場合には、栄養培地は、少なくとも約１５ｇ／Ｌの
スチープ水乾燥固形分に相当するコーンスチープ水を含有するのが普通である。
栄養培地は、好ましくは少なくとも約２５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも
約３０ｇ／Ｌのスチープ水乾燥固形分に相当するコーンスチープ水を含有する。

【００２８】本発明の発酵方法に使用するのに適する栄養培地の１つの例は、ＭＲＳ培地[ 例えば、ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickinson & Co.)から市販されて
いるＭＲＳ培地]などである。通常、このＭＲＳ培地に、栄養の一般的供給源および窒素供給源を与えるためにコーンスチープ水を追加し、そして、炭素および
エネルギー供給源としてさらに炭水化物(例えばグルコースまたはフルクトース)
を追加する。また、本発明の方法に使用するのに適する典型的な培地は、マグネ
シウム塩、マンガン塩、リン酸塩、カリウム塩および／またはクエン酸塩をも含
有する。しかし、特定量のこのような塩を培地に加える必要はないであろう。ま
た、栄養培地は、非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンのポリオキシエチレ
ン誘導体の脂肪酸モノエステル[例えば、ツイーン(Tween^R)８０；これはポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエートである]をも含有する。

【００２９】種々の無機成分のそれぞれの供給源として別々の塩を用いて、培地を調製する
ことができる。別法によれば、１を越える成分の供給源として働く１つの塩を用
いて、栄養培地を調製することもできる。例えば、リン酸水素カリウム(Ｋ₂ＨＰ
Ｏ₄)を、カリウムカチオンおよびリン酸アニオンの両方の供給源として添加する
ことができる。栄養培地の調製中に種々の成分を水に溶解した後に、存在する種
々の溶解塩の間でカチオンおよびアニオンの交換が起こることは理解されるであ
ろう。例えば、培地の調製中に硫酸マグネシウムおよびクエン酸アンモニウムを
水に添加すると、得られる溶液は、硫酸マグネシウムおよびクエン酸アンモニウ
ム種に加えて、ある程度の硫酸アンモニウムおよびクエン酸マグネシウム種をも
含有するであろう。本発明の発酵方法に使用するのに特に適する１つの種類の栄
養培地には、追加の炭素およびエネルギー供給源としてグルコースおよび／また
はフルクトースを追加したコーンスチープ水が含まれる。

【００３０】本発明において使用するのに適する培地の１つの例は、以下に挙げる成分を含
有する：約３０〜４５ｇ／Ｌのスチープ水乾燥固形分に相当するコーンスチープ水；約８０〜１２０ｇ／Ｌのグルコース、フルクトースまたはこれらの混合物；約０〜１０ｇ／Ｌの酵母抽出物；約０〜１ｇ／Ｌの非イオン性界面活性剤(ツイーン８０など)；約０〜２ｇ／Ｌのリン酸水素カリウム(Ｋ₂ＨＰＯ₄)；約０〜０.２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム(ＭgＳＯ₄)；約０〜０.０５ｇ／Ｌの硫酸マンガン(ＭnＳＯ₄)；約０〜２ｇ／Ｌのクエン酸アンモニウム；および所望により、約１０〜５０ｇ／Ｌの炭酸カルシウム(ＣaＣＯ₃)。

【００３１】上記した理由から、これら量は、培地を得るために添加した種々の原料の量を
意味し、栄養培地中のこれら種の実際の濃度を意味しない。このような栄養培地
を調製する際には、一般に、非イオン性界面活性剤および炭酸カルシウムを除く
全ての成分を適当量の水に溶解し、オートクレーブ滅菌する。非イオン性界面活
性剤は、なお約１００℃近辺の温度にあるオートクレーブ処理した培地に添加す
るのが普通である。次いで、得られた溶液を、通常は約６０℃またはそれ以下に
冷却し、次いで炭酸カルシウムを添加する。

【００３２】本発明の方法において使用する適当な栄養培地は、少なくとも約５０ｇ／Ｌの
炭水化物を含んでいるのが好ましいことがわかった。より好ましくは、この栄養
培地は、少なくとも約７０ｇ／Ｌの、さらに好ましくは、少なくとも約９０ｇ／
Ｌの炭水化物を含有する。通常、この炭水化物は、グルコース、フルクトース、
ガラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、スタキロースまたは
これらの混合物から構成される。グルコース、フルクトースおよびスクロースが
、栄養培地中の炭素およびエネルギー供給源として使用するのに特に適する。一
般に、約１５０ｇ／Ｌを越える炭水化物を培地中に導入するのは有用ではない。

【００３３】例えば、炭酸カルシウム(ＣaＣＯ₃)、水酸化ナトリウム(ＮaＯＨ)、水酸化アンモニウム(ＮＨ₄ＯＨ)および／または炭酸水素ナトリウム(ＮaＨＣＯ₃)などの塩基を含有させるのが有利になることもあることがわかった。通常、少なくとも
約３０ｇ／Ｌの炭酸カルシウム(または当量の他の塩基)を栄養培地に添加する。
本方法の一部の態様、例えば比較的高レベルのラクテートを産生させる態様にお
いては、栄養培地中に約４０ｇ／Ｌまでの炭酸カルシウムを含有させるのが好ま
しいであろう。さらに高レベルの塩基を使用することもできるが、炭酸カルシウ
ム塩の溶解性の制限および比較的低いブロスｐＨを維持する必要性のゆえに、一
般に、約１００ｇ／Ｌを越える炭酸カルシウムを培地中に導入するのは有用では
ない。存在する炭酸カルシウムの全体量が、最初は栄養培地に溶解しないことが
非常に多いであろう。発酵が進行するにつれて、炭酸カルシウムの一部が乳酸と
反応して、乳酸カルシウムを生成するであろう。これが起こるにつれて、未溶解
の炭酸カルシウムの追加部分が溶液中に取込まれるであろう。全体的な効果は、
生成する乳酸の一部を中和すること、およびブロスのｐＨが所望のレベル以下( 例えば、約３.８〜３.９以下)に低下するのを防止することである。

【００３４】この効果を達成するために炭酸カルシウムなどの塩基を添加する必要はないで
あろう。乳酸塩(例えば、乳酸カルシウム、乳酸ナトリウムまたは乳酸アンモニウム)を含む溶液を添加して、発酵ブロスのｐＨを緩衝させる助けとすることができる。これが起こるであろう過程の１つの例は、インキュベート細菌からの発
酵ブロスの分画の分離、および、この分画中に含まれる遊離乳酸の一部または全
部を除去した後のこの分画の発酵への再循環を包含するであろう。別法によれば
、乳酸カルシウムが発酵ブロスから単離(例えば、固体形態で)され、発酵に添加
される栄養培地と混合されるであろう。一般に、緩衝塩として乳酸塩を添加する
のが有利になりうる。その理由は、これにより発酵ブロスに添加される中和用塩
基の量が最少化され、塩形態に変換される産生ラクテートの量が最少化されるた
めである。

【００３５】少なくとも約７０ｇ／Ｌのグルコースおよび／またはフルクトースならびに少
なくとも約２０ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含む栄養培地が、本発明の方法におい
て使用するのに特に適する。また、本方法に使用する細菌株に依存して、コーン
スチープ水(例えば、少なくとも約２５ｇ／Ｌのコーンスチープ水乾燥固形分に等しい量にある)をこの栄養培地に導入するのが好ましいであろう。発酵過程によって生成させるラクテートの同一キラル形態のみを含むコーンスチープ水を添
加するのが特に有用である。

【００３６】ホモ乳酸型細菌の菌株および発酵条件は、通常、遊離乳酸が、少なくとも約０
.５ｇ／Ｌ／時、好ましくは少なくとも約１.０ｇ／Ｌ／時、さらに好ましくは少
なくとも約２.０ｇ／Ｌ／時、最も好ましくは少なくとも約４.０ｇ／Ｌ／時の全
体速度で産生されるように選択する。本発明においては、ラクテートまたは遊離
乳酸(またはラクテート)のいずれかの産生の全体速度は、産生された遊離乳酸( ラクテート)の全体量をインキュベート時間で割ることによって計算される。限界ラクテート濃度が得られる発酵に対しては、遊離乳酸(ラクテート)の全体産生
速度は、遊離乳酸(ラクテート)濃度の限界の９０％を産生するのに必要な時間で
計算される。

【００３７】また、本発明の方法の生産性を、ラクテートの全体産生速度として表すことも
できる。本発明の発酵方法は、通常、少なくとも約１.０ｇ／Ｌ／時、好ましくは少なくとも約２.０ｇ／Ｌ／時、さらに好ましくは少なくとも約３.０ｇ／Ｌ／
時の全体速度でラクテートを産生する条件下で行う。本明細書中に示したように
、好ましくはラクテートを、平均インキュベートｐＨが約４.１以下、さらに好ましくは約４.０以下であるブロスにおいて、上記速度で産生させる。

【００３８】本発明の発酵方法において使用するホモ乳酸型細菌の適当な例は、コーンスチ
ープ水の試料(例えば、工業用トウモロコシ製粉設備において見い出される)から
容易に単離することができる。さらに、異なる供給源から単離されたある種の他
のホモ乳酸型細菌も、高レベルの遊離乳酸の効率的な低ｐＨ産生を可能にする必
要な能力を有するであろう。

【００３９】コーンスチープ水中で見い出されるホモ乳酸型細菌は、増殖のためにコーンス
チープ水を含む栄養培地を必要とするのが普通であるので、このような細菌を同
定および単離するための方法における最初の工程は、通常、スチープ水含有培地
(例えば、１０容量％ＣＳＬ-ＭＲＳ寒天)に試料をプレーティングし、次いで接種された培地を嫌気的に約４５〜５０℃でインキュベートすることを包含する。
細菌単離体は、低い方の相にスチープ水のみを含む二相培地に単離体を通すこと
によって、ヘテロ乳酸型産生を容易に調べることができる。次いで、増殖性の菌
株を、二相試験管の底部におけるガスの生成についてモニターする。単離した菌
株は、低温(例えば、４℃またはそれ以下)で好都合に保存するか、または、スチ
ープ水／トマトジュース／ＭＲＳ寒天増殖培地中の卓上保存物として維持するこ
とができる。所望により、コーンスチープ水からこのように単離した１またはそ
れ以上の酸寛容性の菌株を、乳酸発酵における接種体として使用することができ
る。

【００４０】このような方法を用いて、米国内の５カ所の異なるトウモロコシ製粉設備なら
びにトルコ、イギリスおよびニユージーランドにある３カ所のトウモロコシ製粉
設備から入手したスチープ水試料につき、ラクテート産生微生物を調べた。初め
に、単離した微生物をヘテロ乳酸型(即ち、ラクテートに加えて他の発酵生成物を産生することができる)またはホモ乳酸型として特徴付けた。ホモ乳酸型の菌株を、特に、全ラクテート産生、産生されるラクテートの光学活性、および多く
の場合には、発酵培地に添加した塩基(ＣaＣＯ₃)の非存在下での最終インキュベ
ートｐＨに基づいてさらに特徴付けた。合計して１５５の細菌株が単離された。
特徴付けた１０９の菌株のうち、９８菌株(９０％)が唯一の発酵生成物としてラ
クテートを産生した(「ホモ乳酸型」菌株)。本明細書中で使用する「ホモ乳酸型
」なる用語は、発酵生成物として実質的に乳酸のみを産生する細菌株を指す。残
りの１１菌株(１１％)は、ラクテートに加えて他の発酵生成物を産生した(「ヘテロ乳酸型」菌株)。９８のホモ乳酸型菌株のうち、２２株がＬ-ラクテート産生
体であり、１８株がＤ-ラクテート産生体であり、５８株がラセミ体ラクテートを産生した。

【００４１】本発明のホモ乳酸型細菌は、通常、少なくとも約２５ｇ／Ｌの遊離乳酸を産生
することができる。最も好ましくは、これら細菌は、少なくとも約３０ｇ／Ｌの
遊離Ｌ-乳酸を産生することができるホモ乳酸型細菌である。本発明の別の態様においては、これらホモ乳酸型細菌は、約４.３以下の平均インキュベートｐＨにおいて、少なくとも約４０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約７５ｇ／Ｌ、さら
に好ましくは少なくとも約９０ｇ／Ｌのラクテートを含む溶液を生成することが
できる。本明細書中の他の箇所に記載したように、本発明のホモ乳酸型細菌の特
に効率的な菌株は、約４.０以下の平均インキュベートｐＨおよび／または約３.
９以下の最終インキュベートｐＨにおいて、上記レベルのＬ-ラクテート(または
Ｄ-ラクテート)を産生することができる。

【００４２】本発明の酸寛容性のホモ乳酸型細菌は、通常、約３５〜５３℃の温度で増殖お
よび乳酸産生を行うことができる。増殖のための最適温度は、通常、約４３〜５
２℃、好ましくは約４７〜５０℃の範囲内であるが、ホモ乳酸型細菌は室温また
はその近辺の温度で増殖できることがわかった。温度が約５３℃を越えるかまた
は約３０℃を下回ると、細菌による無視される量のラクテート産生が起こるのが
普通である。この発酵過程を約４７〜５２℃で行うのが好ましいが、これは、酵
母およびヘテロ乳酸型ラクトバシラスの耐熱性が低く、一般にこれら温度では増
殖するとしても充分には増殖しないであろうためである。即ち、ラクテート産生
の増強に加えて、高温での酸寛容性ホモ乳酸型細菌の発酵は、他の生物による汚
染に関連した問題の可能性を減少させることができる。

【００４３】本発明のホモ乳酸型細菌は、通常、少なくとも約３.７〜６.５のｐＨ範囲内で
、好ましくは少なくとも約３.８〜５.０のｐＨ範囲内で、増殖およびラクテート
産生を行うことができる。細菌が中性に近いｐＨ(例えば、６.０〜６.５)でラク
テートを産生することができる場合であっても、本発明の方法において使用する
細菌は、ラクテートの大きな部分が遊離酸の形態で存在するｐＨにおいて、高レ
ベルのラクテートを産生することができる。酸寛容性ホモ乳酸型細菌の好ましい
形態は、４.２またはそれ以下のｐＨにおいて、相当な量のラクテート産生(例え
ば、少なくとも約５０ｇ／Ｌ)が可能である。

【００４４】種々の反応器の配置(充填ベッド反応器、連続撹拌タンク反応器、回転式生物学的接触反応器、順次バッチ反応器および流動床反応器を含む)を、本発明の方法に用いることができる。全反応を、発酵ブロスの温度を制御するための適当な
手段を有する単一容器中で行うことができ、また別法によれば、発酵を第１容器
中で行い、ブロスを、熱交換器(例えば、プレート熱交換器)に通すことによって
所望の温度に維持し、発酵反応に再循環させることもできる。後者の配置は、反
応混合物のより迅速な冷却を与えることができ、ある場合には、ブロスを膜分離
モジュールに通してブロスの一部を除去するのと同時に行うことができる(例えば、熱交換器および膜モジュールを連続して結合しているところで)。

【００４５】１つの普通に使用される配置には、膜再循環バイオリアクターが含まれる。こ
の種の反応器は、通常、２つのモジュール、即ち発酵容器１０および膜モジュー
ル１５を含んでいる(例えば、図１を参照)。これら２つのモジュールは、パイプ
によって結合することができ、また、単一装置の一部であることができる。

【００４６】本発明の１つの態様においては、酸寛容性のホモ乳酸型細菌を、発酵容器中の
栄養培地の第１部分においてインキュベートして、少なくとも約２５ｇ／Ｌの遊
離Ｌ-乳酸を含む第１生成物溶液を生成させることができる。得られた発酵ブロスを分離して、遊離乳酸を含み、細菌細胞を実質的に含まない第１分画を得るこ
とができる。これは、細胞分離器(例えば、中空ファイバー細胞分離器)を通して
発酵の一部をポンプ輸送することによって行うことができる。細胞を含む分画は
発酵容器に再循環させるのが普通であり(例えば、図１を参照)、一方、乳酸を含
む分画はさらに処理するために分離する。通常は、追加の栄養培地を添加して、
発酵容器中の液容量を一定レベルに維持する。発酵をこのようにして行うと、最
初の始動相が終了した後に、定常状態条件(ｐＨ、ラクテート濃度および栄養濃度の点で)が達成され、そして維持されるのが普通である。このように発酵を行うときには、本発明の発酵を、ブロスのｐＨが約４.２またはそれ以下、好ましくは約３.７〜４.０の範囲内に維持されるように行うのが普通である。

【００４７】分離した乳酸含有分画を、多数の既知の方法を用いて処理して、溶液の他成分
から遊離乳酸を分離することができる。例えば、乳酸を、第三アミンを含む抽出
物質を用いて溶液から抽出することができる。適当な抽出物質の１つの例は、オ
クチルアルコール中のアラミン(Alamine)３３６の溶液である。乳酸の単離に使用することができる他の方法には、溶液と固体吸着物質(例えばイオン交換樹脂、例えばポリビニルピリジンカラム)との接触、乳酸を含む分画の蒸留、または膜分離による除去が含まれる。任意のこれら種類の分離方法を用いて乳酸含有分
画を処理して、乳酸を激減させた分画およびラクテート単離体の分画を生成させ
ることができる。乳酸を激減させた分画は、一部のラクテートを乳酸塩(例えば乳酸カルシウム)の形態で含むことができる。ラクテート単離体の分画は、任意の種々の既知方法を用いてさらに処理して、より純粋な形態の遊離乳酸を得るこ
とができる。

【００４８】また、乳酸含有分画を処理して、乳酸塩(例えば乳酸カルシウム)を固体または
溶液の形態で分離し、遊離乳酸に富む溶液を残すこともできる。乳酸塩を、適当
な方法、例えば抽出、結晶化、膜分離および固体材料(例えばアニオン交換樹脂)
への吸着を用いて分離することができる。乳酸塩を発酵容器に戻すこともでき、
ここで乳酸塩は、溶液のｐＨを緩衝するように、およびブロスのｐＨが所望のレ
ベル以下に低下するのを防止するように働くことができる。例えば、緩衝剤とし
て充分量の乳酸カルシウムを再循環させることによって、発酵ブロスのｐＨを、
乳酸のpＫａに近い値に維持することができる。理論に基づくと、乳酸塩は、ｐＨ３.８５において当量の新規乳酸産生の産生を緩衝するであろう。ｐＨ４.０に
おいては、１当量の乳酸塩が、０.７当量の新規乳酸産生の産生を緩衝するであろう。

【００４９】種々の方法が、ラクテート／乳酸溶液の処理のために利用可能である[大量の乳酸の生成を含む；例えば、発酵ブロスからのｐＨ約４.８以下(好ましくは約４
.２または４.３以下)の溶液において；乳酸塩(通常は、乳酸カルシウム、乳酸カ
リウム、乳酸ナトリウムおよび／または乳酸アンモニウム)の同時の単離(および
所望により再循環)を伴う]。このような方法は、例えば、共通して譲渡された同
時出願の米国特許出願に記載されている[即ち、ミネソタ州ミネトンカのカーギル社に譲渡された「LACTIC ACID PROCESSING; METHODS; ARRANGEMENTS; AND, PR
ODUCTS」と題する米国特許出願；発明者は、John N. Starr、Aharon M. Eyal、R
iki Canari、Betty HazanおよびRod Fisherである；以下においては、Ｓtarrらの出願と言う]。このＳtarrらの出願は、本出願と同じ日付(１９９７年１０月１
４日)で出願されたものであり、本明細書の一部を構成する。有利な全体的過程は、大規模装置において全体的にコスト効率の高い効率的な処理スキームを最も
容易に助けるものを、種々のアプローチの中で選択することに、部分的には依存
するであろう。

【００５０】全体的過程を選択する際の要点は、以下に挙げる２つの目的を調整するように
システムを設計することに関係する：１．後処理のために、例えばポリマーを生成させるために乳酸生成物を単離す
ること；および２．好ましくは発酵ブロスに再循環させるのに望ましい形態で乳酸塩を単離す
ること。

【００５１】以下に挙げる３つの一般的アプローチが関係する：１．溶液から乳酸を分離して乳酸塩を後に残すこと；および所望により、該分
離後に乳酸塩を含む残留溶液を発酵器に向けること；２．溶液から乳酸塩を単離すること；所望により乳酸塩を発酵器に向けること
；および乳酸塩分離の後に、残留溶液から乳酸生成物を後単離すること；および３．乳酸を一方の流れに、および乳酸塩を別の流れに同時分離して、残留混合
物を残すこと。

【００５２】上記目的の一方または両方を達成するためにＳtarrらが記載している方法を、
ラクテート物質の種々の溶液(即ち、乳酸および溶解した乳酸塩の溶液)に対して
実施することができる。これらの溶液は、発酵ブロス、または発酵器から取出さ
れ、ある種の方法(例えば、濾過またはｐＨ調節)によって修飾されたブロスを含
んでなることができる。実際的には、これらの方法を、同じように他の方法によ
って調製された溶液にも適用することができる。

【００５３】しかし、これに記載された方法および提案は、特に、発酵ブロス溶液(特に、比較的酸性度の高い溶液)の効率的な処理に焦点を当てて開発されており、ここでは、酸の添加によるｐＨ修飾は必要ではなく、好ましくは行わない。これらの
方法を適用することができる典型的な組成物は、ｐＨについては少なくとも０. ８６および６.０未満であろう。即ち、これらの方法が実施されるであろう典型的な組成物は、この範囲内のｐＨを有するであろう。このような組成物に対して
は、遊離乳酸と解離した酸または溶解した乳酸塩との２５℃でのモル比は、約１
,０００：１〜０.００７：１である。さらに好ましい処理は、約１.９８〜５.０
０程度のｐＨを有する溶液(ＨＬＡ：ＬＡ比が約７５：１〜０.０７０：１の範囲
内である)が関係し、最も好ましい処理は、約３.０〜４.５の範囲内のｐＨを有する溶液(ＨＬＡ：ＬＡ比が約７.０：１〜０.２３：１の範囲内である)が関係す
る。

【００５４】上に示したように、上記の最も好ましいｐＨ範囲内の溶液は、本発明の発酵方
法により、高濃度のラクテート物質をその中に含んで容易に得られる。別法によ
れば、他の発酵ブロスを用いることもできる(例えば、最も好ましいｐＨ範囲が得られるように、通常は酸の添加によるｐＨ調節を伴う)。

【００５５】本明細書において、乳酸および乳酸塩を含む組成物からの乳酸の「優先分離」
、または、乳酸および乳酸塩を含む組成物からの乳酸塩の「優先分離」について
言及することがある。本明細書におけるこの「優先分離」なる用語およびその変
形用語は、２種類の成分(乳酸または乳酸塩)の一方を他方に対して優先的に除去
する分離方法を意味する。本発明に従う典型的に好ましい処理においては、乳酸
および乳酸塩の混合物を２つの「生成物流」に分ける。一方の生成物流(即ち、遊離乳酸に富む流れ)においては、得られる遊離乳酸と乳酸塩のモル比は、好ましくは少なくとも２／１であり、さらに好ましくは少なくとも３／１である。上
記した方法のいずれかを用いて、少なくとも５／１の比、さらに１０／１または
それ以上の比も容易に得ることができる。

【００５６】他方の生成物流は、乳酸塩に富む流れである。この流れにおいては、遊離乳酸
と乳酸塩のモル比は、好ましくは０.５を越えない。本明細書中に記載した典型的に好ましい処理を用いて、０.３以下、好ましくは０.２以下、最も好ましくは
０.１またはそれ以下の比を容易に得ることができる。

【００５７】上記の２つのパラグラフに示したように使用するときの本明細書中の「流れ」
なる用語は、単離された相または生成物セグメントが溶液、固体または物質混合
物であるか否かにかかわりなく、これら相または生成物セグメントを意味する。
即ち、「乳酸に富む流れ」とは、単に、処理された最初の混合物と比較して、乳
酸に富む(乳酸塩に対して)相または混合物であり、「乳酸塩に富む流れ」とは、
処理された最初の混合物と比較して、乳酸塩に富む(乳酸に対して)流れである。

【００５８】遊離乳酸に富む生成物流が、混合物(例えば発酵ブロス)からの遊離乳酸の分離
の結果として得られたときには、遊離乳酸の除去後の残存する水性混合物は、遊
離乳酸が「激減した」と言うこともある。同様に、乳酸塩に富む流れが、遊離乳
酸および乳酸塩を含む混合物からの乳酸塩の分離の結果として得られたときには
、残存する混合物は、乳酸塩が「激減した」と言うこともある。

【００５９】好ましくは、処理される溶液が発酵ブロスであるときには、乳酸塩に富む生成
物流を提供および生成させて、発酵器からの不純物とその中の乳酸塩との重量比
が、発酵ブロス中の重量比よりも、好ましくは少なくとも５のファクターで低く
なるようにする。これは、乳酸塩の単離に対して選択した特定のアプローチの制
御に関連して本明細書中に記載した方法によって、ならびに、バック洗浄または
再結晶などの種々の精製方法として用いることによって行うことができる。

【００６０】好ましくは、最終的にラクテート生成物流を、発酵系に好都合に再循環させる
ために、水溶液または水性相と固体相の混合物として単離して、水バランスを維
持する。ブロス中の水バランスを助けるために水溶液の濃縮を用いるときには、
好ましくは逆浸透および蒸気再圧縮などの比較的低コストの濃縮方法を用いる。

【００６１】

【実施例】

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、説明
のためのものであり、本明細書中に記載した本発明の範囲を限定するものではな
い。本発明の概念の範囲内での変更が明らかであろう。

【００６２】実施例１標準の発酵条件他に記載することがなければ、以下の実施例に記載する発酵反応は、以下に挙
げる標準プロトコールに従い、種々の増殖培地を用いて行った。細胞(２５０μl)を、４０％トマトジュース／４０％ＬＳＷ-ＭＲＳ寒天ボトム
相／ＭＲＳトップ相の二相培地(ＴＪ-ＳＷ-ＭＲＳ二相培地)中の特定菌株のベン
チストック(bench stock)から、新鮮なＴＪ-ＳＷ-ＭＲＳ二相培地に通し、静的条件下に４７℃で１８〜２４時間インキュベートした。

【００６３】ＭＲＳ培地(ｐＨ＝６.２) １０ｇ／Ｌのゼラチンの膵液消化物８ｇ／Ｌの牛肉抽出物４ｇ／Ｌの酵母抽出物２０ｇ／Ｌのグルコース２ｇ／ＬのＫ₂ＨＰＯ₄ １ｇ／Ｌのツイーン(Tween^R)８０５ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム５ｇ／Ｌのクエン酸アンモニウム０.２ｇ／ＬのＭgＳＯ₄ ０.０５ｇ／ＬのＭnＳＯ₄

【００６４】新鮮なＴＪ-ＳＷ-ＭＲＳ二相培地中のインキュベート物の一部(１.０ｍｌ)を、シールした血清びん中の、１０％ＣＳＬ、グルコース(６０ｇ／Ｌの全体濃度)
および炭酸カルシウム(２０ｇ／Ｌ)を追加した培地Ｂ(８０ｍｌ)に接種し、周囲
振盪器中にて４７℃で１８時間撹拌しながらインキュベートした。

【００６５】培地Ｂ(ｐＨ＝４.７) ８〜１２容量％のコーンスチープ液５ｇ／Ｌの酵母抽出物５０〜１００ｇ／Ｌのグルコース２ｇ／ＬのＫ₂ＨＰＯ₄ １ｇ／Ｌのツイーン(Tween^R)８０２ｇ／Ｌのクエン酸アンモニウム０.２ｇ／ＬのＭgＳＯ₄ ０.０５ｇ／ＬのＭnＳＯ₄ ２０〜４０ｇ／ＬのＣaＣＯ₃

【００６６】所望のレベルのグルコースおよび炭酸カルシウム(例えば、９０ｇ／Ｌのグルコースおよび３３.４ｇ／Ｌの炭酸カルシウム)を含む培地Ｂを入れた発酵器に、
１０％(ｖ/ｖ)の１８時間経過した培養物を接種した。発酵ジャーを７０〜８０％充填にし、１５０ｒｐｍで撹拌しながら、４７〜４９℃で発酵を行った。この
液量レベルで発酵ジャーを操作することによって、培地が高度に好気的にならな
いことを確実にした。

【００６７】実施例２ｐＨ制御をしない酸寛容性のホモ乳酸型菌株の単離ホモ乳酸型の細菌株を、８つの異なる工業用トウモロコシ製粉設備から入手し
たコーンスチープ水の試料から単離した。これらの設備は、Ｂlair(ネブラスカ州)、Ｅdyville(アイオワ州)、Ｃedar Rapids(アイオワ州)、Ｄayton(オハイオ州)、Ｍemphis(テネシー州)、Ｉstanbul(トルコ)、Ｔillbury(イギリス)、およびＢergen Ｏp Ｚoon(ニュージーランド)に存在していた。

【００６８】工業用トウモロコシ製粉設備からスチープ水の試料を入手することによって菌
株を単離した。試料を１０％ＣＳＬ-ＭＲＳ寒天プレート(ｐＨ＝５.０)にプレー
ティングし、４７℃で嫌気的にインキュベートした。コロニーを、１０％ＣＳＬ
-ＭＲＳ寒天プレート上で単離のために再度画線した。次いで、単離体を、維持の目的で、４０％ＬＳＷ-４０％トマトジュース-ＭＲＳボトム相／ＭＲＳトップ
相の二相培地(ｐＨ６.０)に通した。これら単離した菌株を、試験管の底部におけるガス(ＣＯ₂)の生成をモニターすることによって、ヘテロ乳酸型の産生についてスクリーニングした。次いで、ホモ乳酸型の単離体を、１０容量％のＣＳＬ
および３０ｇ／Ｌのグルコースを追加したＭＲＳ培地において、ラクテート収量
および産生されたラクテートの光学純度についてスクリーニングした。これらの
結果を以下の表１に示す。

【００６９】単離した細菌株を、ホモラクテート産生体(「ホモ乳酸型」)またはヘテロラク
テート産生体(「ヘテロ乳酸型」)のどちらかとして同定した。１０容量％のコー
ンスチープ液(「ＣＳＬ」)を追加したＭＲＳ培地における発酵に基づいて、単離
したホモ乳酸型の細菌株を、全ラクテート産生、最終発酵ｐＨおよび産生された
Ｌ-ラクテートの％の項目で特徴付けた(以下の表１を参照)。添加したコーンスチープ液(「ＣＳＬ」)中の約５０％のラクテートがＤ-ラクテートであるのが普通であるので、少なくとも約７０％のＬ-ラクテートを産生した菌株を、Ｌ-ラク
テート産生菌株であると考えた。この仮定を、栄養培地中に存在するスチープ水
から生成する生成物中のＤ-ラクテート汚染のレベルが比較的低かった条件下[例
えば、より高いラクテート産生レベルまたは８０％を越えるＬ-ラクテート(全ラ
クテートの関数として)を有するコーンスチープ水を用いる]でのその後の実験に
よって確認した。発酵は、実施例１に記載した標準条件下に４８℃で行った。これらの結果を以
下の表１に示す。

【００７０】

【表１】

【００７１】実施例３添加塩基を用いる酸寛容性のホモ乳酸型菌株の単離別組のホモ乳酸型菌株を、Ｅdyville(アイオワ州)、Ｃedar Rapids(アイオワ州)、およびＢlair(ネブラスカ州)のトウモロコシ製粉設備から入手したコーンスチープ水試料から単離した。使用した単離操作は実施例２の記載と同様であっ
た。単離したホモ乳酸型菌株を、１０容量％のＣＳＬ、９０ｇ／Ｌのグルコース
および３３ｇ／ＬのＣaＣＯ₃を追加した培地Ｂ中で行った発酵に基づいて特徴付
けた。全ラクテート産生および／または産生されたＬ-ラクテートの割合(％)を、この組の菌株について測定した。これらの結果を以下の表２に示す。

【００７２】

【表２】

【００７３】実施例４ラクテート産生に対する添加塩基の効果Ｌ-ラクテート産生体と同定された実施例２に記載した多数の菌株をスクリーニングして、ラクテート産生に対する添加塩基(ＣaＣＯ₃)の効果を調べた。発酵
は、１０％ＣＳＬおよび３０ｇ／Ｌグルコースを追加したＭＲＳ培地中、４８℃
で行った。添加塩基の存在下に行った測定のためには、１０％ＣＳＬ、３０ｇ／
Ｌグルコースおよび２０ｇ／ＬＣaＣＯ₃を追加したＭＲＳ培地を用いた。

【００７４】

【表３】

【００７５】実施例５Ｌ-ラクテート産生実施例２に記載した多数の菌株につき、Ｌ-ラクテート産生のレベルを調べた。発酵は、１０％ＣＳＬ、３０ｇ／Ｌグルコースおよび２０ｇ／ＬＣaＣＯ₃を追加したＭＲＳ培地中、４８℃で行った。

【００７６】

【表４】

【００７７】実施例６ＡＴＣＣに寄託されたラクトバシラス菌株によるラクテート産生コーンスチープ水以外の供給源から単離した多数の既知のラクトバシラス菌株
のラクテート生産性を調べた。１１種類の異なる菌株の試料を、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ：Rockville, Maryland)から入手し、７５ｇ／Ｌグルコースおよび３０ｇ／Ｌ炭酸カルシウムを追加したＭＲＳ培地
中での３７℃の発酵に基づいて、合計ラクテート産生および最終インキュベート
ｐＨについてスクリーニングした。これらの結果を以下の表５に示す。全ての菌
株が、４７℃での増殖に劣ることを示し、栄養培地中のコーンスチープ水の存在
によって阻害された。ＡＴＣＣ寄託された菌株の栄養要求は、コーンスチープ水
から単離された菌株とは異なっていたが、ＡＴＣＣ寄託された菌株のいくつかは
、比較的高濃度の遊離乳酸を産生することができるようである。特に、Lactobac
illus helviticus (ＡＴＣＣ＃１５００９；最終インキュベートｐＨ４.０３において６６ｇ／Ｌのラクテート)、Lactobacillus paracasei tolerans (ＡＴＣＣ＃２５５９９；最終インキュベートｐＨ４.０４において６６ｇ／Ｌのラクテート)およびLactobacillus salivarius salivarius (ＡＴＣＣ＃１１７４１；最
終インキュベートｐＨ４.１２において６４ｇ／Ｌのラクテート)が、高生産性の
遊離乳酸産生体としての可能性を供するようである。多数の菌株によって産生さ
れるラクテートの光学純度を調べた。比較的高濃度の遊離乳酸を産生することが
できる菌株のいずれも、Ｌ-ラクテート産生菌株ではなかった。

【００７８】

【表５】

【００７９】実施例７ホモ乳酸型菌株＃４１のＳＯ₂寛容性ホモ乳酸型菌株＃４１のラクテート生産性に対する変化量の二酸化イオウ(ＳＯ₂)の効果を調べた。ラクテート産生に対する変化する二酸化イオウ濃度の効果
を、菌株＃４１を用いて調べた。発酵は、実施例１に記載した標準の発酵プロト
コールにより、１０容量％ＣＳＬ、３０ｇ／Ｌグルコースおよび２０ｇ／ＬＣa
ＣＯ₃を追加したＭＲＳ培地中で行った。これらの結果を以下の表６に示すが、菌株＃４１は、少なくとも約６００ｐｐｍまでのＳＯ₂濃度の存在下にラクテートを産生することができることを示した。８００ｐｐｍの存在下に行った同様の
発酵において、菌株＃４１は、１４４時間の休眠相の後にラクテートを産生し始
めた。

【００８０】

【表６】

【００８１】実施例８ラクテート産生に対する温度の効果ホモ乳酸型菌株＃４１のラクテート生産性を、４１〜５４℃の温度範囲にわた
って調べた。発酵は、１０容量％ＣＳＬ、６０ｇ／Ｌグルコースおよび２０ｇ／
Ｌ炭酸カルシウムを追加した培地Ｂ中で行った。これらの結果を以下の表７に示
すが、菌株＃４１によるラクテート産生の最適温度範囲は４４〜５４℃であるこ
とがわかった。

【００８２】

【表７】

【００８３】実施例９ラクテート産生に対するスチープ水濃度の効果実施例２に記載した多数のＬ-ラクテート産生菌株を用いる発酵を行って、ラクテート産生に対する、変化量の増殖培地中のコーンスチープ液の効果を調べた
。発酵は、５０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／ＬＣaＣＯ₃および１％、５％または１０％ＣＳＬを追加した培地Ａ(以下を参照)中で４８℃にて行った。

【００８４】培地Ａ(ｐＨ＝５.０) １０ｇ／Ｌの酵母抽出物０.２％のＫ₂ＨＰＯ₄ １ｇ／Ｌのツイーン(Tween^R)８００.２％のクエン酸アンモニウム０.００５％のＭnＳＯ₄ ４Ｈ₂Ｏ０.０２％のＭgＳＯ₄ ７Ｈ₂Ｏ炭素／エネルギー源を添加窒素源を添加ｐＨ調整のためにＣaＣＯ₃を添加

【００８５】

【表８】

【００８６】実施例１０リボタイプに基づくホモ乳酸型菌株の特性化コーンスチープ水から単離した多数のＬ-ラクテート産生ホモ乳酸型細菌株を、リボプリント(riboprint)パターン分析[例えば、Jaquetら(Zbl.Bakt., 276, 3
56-365 (1992))を参照]に基づいて分類した。この方法は、ＥciＲＩ制限酵素を用いる上記菌株の単一コロニー由来のＤＮＡの消化、ならびに、大腸菌由来の化
学的にラベルしたｒＲＮＡオペロンとの、アガロースゲルにおいてサイズ分離し
た後のハイブリダイゼーションに基づいている。得られるパターンは、生物間の
遺伝的関係の直接の指標となり、このパターンを用いて、細菌の４種類の属[サモネラ(Samonella)、リステリア(Listeria)、スタフィロコッカス(Staphylococc
us)および大腸菌(E.coli)]の間の同定ならびに密接に関連したグラム陽性および
グラム陰性菌株の分類学的同定を行った。

【００８７】コーンスチープ水から単離した７種類のラクテート産生菌株のリボタイプ試験
の結果を図２に示す。同一のリボグループの識別を与えた菌株は、同一の分類群
レベルに同定される可能性が高い。図２に示した７種類の菌株が示すリボタイプ
は、市販されている実験室コンピューターデータベース中の３０種類の異なる乳
酸細菌株のいずれのパターンとも一致しなかった。一致を与えなかったデータベ
ース中の菌株には、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus animalis、Lac
tobacillus delbrueckii、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus amylovor
usおよびLactobacillus salivariusが含まれる。また、図２に挙げた菌株のリボ
タイプは、Lactobacillus agilis、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buch
neri、Lactobacillus confusus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus
curvatus、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus kefir、Lactobacillus m
urinus、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus s
akeおよびLactobacillus suebicusからのパターンとの一致をも与えなかった。さらに、図２に示すリボタイプパターンは、Lactococcus garviae、Lactococcus
lactisおよびLactococcus raffinolactisとの一致、あるいは、Leuconostoc ca
rnosum、Leuconostoc citreum、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc para
mesenteroides、Pediococcus acidilactici、Pediococcus dextrinicusおよびPe
diococcus pentoxaceusとの一致をも与えなかった。

【００８８】図２に示す７種類の菌株のリボタイプパターンは、３種類のリボグループに分
類される。２つの菌株(＃１１４および＃１１９)は同一リボタイプを有する。こ
れら菌株の一方はヘテロ乳酸型菌株(＃１１９)であり、他方はラセミ体ラクテー
トを産生するホモ乳酸型菌株(＃１１４)である。１つのＤ-ラクテート産生菌株(
＃７９)は、他の６種類とは異なるリボタイプパターンを示した。残りの４種類の菌株(＃９０、１２７、１３２および１４０)は同じリボグループに分類され、
これらのリボタイプパターンが同一ではないという事実にもかかわらず、同一の
分類群レベルに同定される可能性が高いと考えられた。ＭＩＬ４-１１３２パタ
ーンを有する４種類の菌株のうち、３種類はＬ-ラクテート産生菌株(＃９０、１
３２および１４０)であり、一方、第４の菌株(＃１２７)はラセミ体ラクテートを産生した。

【００８９】実施例１１ラクテート産生に対する添加塩基の効果ホモ乳酸型菌株＃４１のラクテート生産性に対する、変化量のＣaＣＯ₃の添加
の効果を調べた。実験は、８容量％ＣＳＬ、２００ｇ／Ｌグルコースおよび変化
量の添加炭酸カルシウム(３０〜９０ｇ／Ｌ)を追加した培地Ａ中で４７℃にて行
った。これらの結果を以下の表９に示す。

【００９０】

【表９】

【００９１】実施例１２１２％のＣＳＬ、９０ｇ／Ｌのグルコースおよび３３.４ｇ／ＬのＣaＣＯ₃を含む菌株＃４１の発酵プロフィール図３は、代表的な発酵実験の経過中の時間の関数として、発酵ブロス中の有機
成分およびｐＨのプロフィールを示すものである。図３に示すプロフィールは、
１０容量％のＣＳＬ、１００ｇ／Ｌのグルコースおよび３３.４ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを追加した培地Ｂ中での、菌株＃４１の４７℃でのインキュベートによ
って得られる結果に基づくものである。

【００９２】実施例１３９０ｇ／Ｌのグルコース、３３.４ｇ／ＬのＣaＣＯ₃および１２％ＣＳＬ／３６％ＬＳＷを含む菌株＃４１の発酵プロフィール図４は、菌株＃４１を用いる代表的な発酵実験の経過中の時間の関数として、
ラクテート産生を示すものである。図４に示すプロフィールは、９０ｇ／Ｌのグ
ルコース、３３.４ｇ／Ｌの炭酸カルシウム、および１２容量％のＣＳＬ(３６重
量％の乾燥固形分)または３６容量％のＬＳＷ(１２重量％の乾燥固形分)のどちらかを追加した培地Ｃ中での、４７℃での菌株＃４１のインキュベートによって
得られる結果に基づくものである。以下の表１０にまとめた結果は、コーンスチ
ープ水のどちらかの供給源を用いたときの約４０ｇ／Ｌの最終遊離乳酸レベルを
示す。ラクテートがＬ-ラクテート産生菌株(＃４１)によって産生されるので、少なくとも約３５ｇ／Ｌの遊離Ｌ-乳酸がこれら発酵の終了時に存在する(この残
りは、添加したスチープ水中に存在する遊離Ｄ-ラクテートである)。

【００９３】

【表１０】

【００９４】実施例１４８〜１２％のＣＳＬ、９０ｇ／Ｌのグルコースおよび３６.６ｇ／ＬのＣaＣＯ₃を含む菌株＃４１のラクテート産生図５は、菌株＃４１を用いる代表的な発酵実験の経過中の時間の関数として、
ラクテート産生を示すものである。この発酵は、実施例１に記載した方法を修飾
して行った。菌株＃４１の細胞を、８００ｍｌの培地中で予備増殖させ、次いで
培地から分離した。次いで、予備増殖させた細胞を、８００ｍｌの新鮮な培地に
再懸濁させた。図５に示すプロフィールは、９０ｇ／Ｌのグルコース、３６.６ｇ／Ｌの炭酸カルシウム、および８容量％のＣＳＬ(３６重量％の乾燥固形分)、
１２容量％のＣＳＬ、２４容量％のＬＳＷ(１２重量％の乾燥固形分)または３６
容量％のＬＳＷのいずれかを追加した培地Ｂ中での、４７℃での予備増殖させた
細胞のインキュベートによって得られる結果に基づくものである。

【００９５】

【表１１】

【００９６】実施例１５ラクテート産生に対する添加グルコースの効果ラクテート産生に対する変化量の添加炭水化物供給源(グルコース)の効果を、
ホモ乳酸型菌株＃４１について調べた。発酵は、実施例１に記載した標準の発酵
方法を用いて、１０容量％のＣＳＬ、２０ｇ／ＬのＣaＣＯ₃および表示した量の
グルコースを追加した培地Ａ中での、４８℃での菌株＃４１のインキュベートに
よって行った。また、この培地は、コーンスチープ液に由来するさらに１〜１５
ｇ／Ｌの発酵可能な糖(主に、グルコースおよびフルクトース)を含んでいた。こ
れらの結果を以下の表１２に示す。この実験の結果は、少なくとも添加した塩基
の量(２０ｇ／ＬのＣaＣＯ₃)については、ラクテートの生産性を、少なくとも約
５０ｇ／Ｌの炭水化物供給源(例えばグルコース)の添加によって高めうることを
示唆する。

【００９７】

【表１２】

【００９８】本発明を、種々の特定の好ましい態様および方法を参照しながら説明した。し
かし、本発明は、明細書中に記載した特定の態様に限定されるものとみなすべき
ではない。本発明の思想および範囲内で多くの変更および修飾を行いうることを
理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】一体化した遊離乳酸の除去を含む発酵過程の流れ図である。

【図２】コーンスチープ水から単離した多数のラクテート産生細菌株のリ
ボタイプパターンを示すグラフである。

【図３】１０容量％のコーンスチープ液、１００ｇ／Ｌのグルコースおよ
び３３.４ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを含む栄養培地中での菌株＃４１のインキュベートに対する、グルコース、フルクトースおよびラクテートの発酵プロフィー
ルを示すグラフである。

【図４】９０ｇ／Ｌのグルコース、３３.４ｇ／Ｌの炭酸カルシウム、および１２容量％のコーンスチープ液または３６容量％の軽スチープ水を含む栄養
培地中での菌株＃４１のインキュベートからのラクテート産生を示すグラフであ
る。

【図５】９０ｇ／Ｌのグルコース、３６.６ｇ／Ｌの炭酸カルシウムおよび変化量のコーンスチープ水を含む栄養培地中でのホモ乳酸型菌株＃４１のイン
キュベートに対する、グルコース、フルクトースおよびラクテートの発酵プロフ
ィールを示すグラフである。

【図６】未解離の乳酸(「遊離乳酸」)の割合(％)をｐＨの関数として示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B064 AD33 CC03 CC07 CD02 CD09 DA01 DA10 DA16 4B065 AA30X AC05 AC14 BA22 BB02 BB15 BB16 BC02 BC03 CA10 CA41 CA44 CA50 CA54

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】乳酸の製造方法であって、酸寛容性のラクテート産生微生物を栄養培地中でインキュベートして、約４. ８以下の最終インキュベートｐＨにおいて、少なくとも約５０％の光学純度を有
する少なくとも約４０ｇ／Ｌのラクテートを含む溶液を得ることを含んでなる方
法。
【請求項２】酸寛容性のホモ乳酸型細菌を栄養培地中でインキュベートし
て、約４.５以下の最終インキュベートｐＨにおいて、少なくとも約４０ｇ／ＬのＬ-ラクテートまたは少なくとも約４０ｇ／ＬのＤ-ラクテートを含む溶液を得
ることを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】栄養培地が、少なくとも約１５ｇ／Ｌのコーンスチープ水乾
燥固形分を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】栄養培地が、少なくとも約５０ｇ／Ｌの、グルコース、フル
クトース、ガラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、スタキオ
ースまたはこれらの混合物を含む炭水化物を含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項５】細菌を約３５〜５３℃でインキュベートすることからなる請
求項２に記載の方法。
【請求項６】細菌を、約４.５以下の平均インキュベートｐＨの栄養培地中でインキュベートして、少なくとも約７５ｇ／ＬのＬ-ラクテートを含む溶液を得ることを含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項７】栄養培地が塩基を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項８】塩基が、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモ
ニウム、炭酸水素ナトリウムまたはこれらの混合物を含んでなる請求項７に記載
の方法。
【請求項９】栄養培地が乳酸塩を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】乳酸塩が、乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム、乳酸アンモ
ニウムまたはこれらの混合物を含んでなる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】乳酸の製造方法であって、酸寛容性のホモ乳酸型細菌を、約４.３以下の平均インキュベートｐＨの栄養培地中でインキュベートして、少なくとも約５０％の光学純度を有する少なくと
も約４０ｇ／Ｌのラクテートを含む溶液を得ることを含んでなる方法。
【請求項１２】細菌を栄養培地中でインキュベートして、少なくとも約８
０％の光学純度を有するＬ-ラクテートを産生させることを含んでなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】細菌を栄養培地中でインキュベートして、少なくとも約２
.０ｇ／Ｌ／時の全体速度でラクテートを産生させることを含んでなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】酸寛容性のホモ乳酸型細菌を栄養培地中でインキュベート
して、約４.０以下の最終インキュベートｐＨにおいて、少なくとも約４０ｇ／ＬのＬ-ラクテートまたは少なくとも約４０ｇ／ＬのＤ-ラクテートを含む溶液を
得ることを含んでなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】乳酸の製造方法であって、酸寛容性のホモ乳酸型細菌を栄養培地中でインキュベートして、少なくとも約
２５ｇ／Ｌの遊離Ｌ-乳酸または少なくとも約２５ｇ／Ｌの遊離Ｄ-乳酸を含む溶
液を得ることを含んでなる方法。
【請求項１６】細菌を、約４.２以下の平均インキュベートｐＨを有する栄養培地中でインキュベートすることを含んでなる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】約４.８以下の最終インキュベートｐＨにおいて、少なくとも約５０％の光学純度を有する少なくとも約４０ｇ／Ｌのラクテートを含む溶
液を生成することができる酸寛容性のホモ乳酸型細菌。
【請求項１８】約４.３以下の平均インキュベートｐＨを有する栄養培地中でインキュベートして、少なくとも約５０％の光学純度を有する少なくとも約
４０ｇ／Ｌのラクテートを含む溶液を生成することができる請求項１７に記載の
ホモ乳酸型細菌。
【請求項１９】桿状のグラム陽性のエアー・インディファレント細菌であ
る請求項１７に記載のホモ乳酸型細菌。
【請求項２０】少なくとも約８０％の光学純度を有するラクテートを産生
することができる請求項１７に記載のホモ乳酸型細菌。
【請求項２１】約４.２以下の平均インキュベートｐＨおよび少なくとも約４７℃のインキュベート温度において、少なくとも約８０ｇ／ＬのＬ-ラクテートを産生することができる請求項１７に記載のホモ乳酸型細菌。
【請求項２２】少なくとも約１５ｇ／Ｌのコーンスチープ水乾燥固形分を
含む栄養培地中でインキュベートしたときに、少なくとも約４０ｇ／Ｌのラクテ
ートを産生することができる請求項１７に記載のホモ乳酸型細菌。
【請求項２３】少なくとも約２５ｇ／Ｌの遊離Ｌ-乳酸または少なくとも約２５ｇ／Ｌの遊離Ｄ-乳酸を含む溶液を生成することができる酸寛容性のホモ乳酸型細菌。
【請求項２４】乳酸の製造方法であって、以下の工程を含んでなる方法：酸寛容性のラクテート産生微生物を第１部分の栄養培地中でインキュベートし
て、約４.８以下の最終インキュベートｐＨにおいて、少なくとも約５０％の光学純度を有する少なくとも約４０ｇ／Ｌのラクテートを含む第１生成物溶液を生
成させ、該第１生成物溶液を分離して、(ｉ)ラクテートを含み、微生物を実質的に含ま
ない第１分画、および(ii)微生物を含む第２分画を生成させ、該第１分画を処理して、乳酸を激減させた第３分画および乳酸を豊富化した第
４分画を生成させる。
【請求項２５】以下の工程をさらに含んでなる請求項２４に記載の方法： (ｉ)第３分画の少なくとも一部、(ii)第２部分の栄養培地、および(iii)微生物を含む混合物を生成させ、該混合物をインキュベートして、約４.８以下の最終インキュベートｐＨにおいて、少なくとも約５０％の光学純度を有する少なくとも約４０ｇ／Ｌのラクテ
ートを含む第２生成物溶液を生成させる。
【請求項２６】乳酸を激減させた第３分画が乳酸塩を含む請求項２４に記
載の方法。
【請求項２７】乳酸の製造方法であって、以下の工程を含んでなる方法：酸寛容性のラクテート産生微生物を第１部分の栄養培地中でインキュベートし
て、約４.８以下の最終インキュベートｐＨにおいて、少なくとも約５０％の光学純度を有する少なくとも約４０ｇ／Ｌのラクテートを含む第１生成物溶液を生
成させ、該第１生成物溶液を処理して、乳酸を激減させた第３分画および乳酸を豊富化
した第４分画を生成させる。