PL180799B1

PL180799B1 - Sposób wydajnego wytwarzania 7-ADCA poprzez 2-(karboksyetylotio)acetylo-7-ADCA i 3-(karboksymetylotio)-propionylo-7-ADCA

Info

Publication number: PL180799B1
Application number: PL94312746A
Authority: PL
Inventors: Roelof A.L. Bovenberg; Bertus P. Koekman; Andreas Hoekema; Der Laan Jan M. Van; Vroom Erik De
Original assignee: Gist Brocades Bv
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 2001-04-30
Also published as: CZ285604B6; US5726032A; BR9407108A; SK282624B6; ATE277187T1; CN1103814C; DE69434023D1; CA2168431A1; WO1995004148A1; CN1128045A; HUT75377A; HU219259B; KR100336174B1; PL312746A1; CZ15896A3; SK9796A3; HU9600194D0

Abstract

1. Sposób wytwarzania i wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA) przy uzyciu transformowanego szczepu Penicillium chrysogenum, znamienny tym, ze a) transformuje sie szczep Penicillium chrysogenum genem ekspandazy pod tran- skrypcyjna i translacyjna kontrola pedzlakowych sygnalów ekspresji; b) przeprowadza sie fermentacje tego szczepu w osrodku hodowli i dodaje sie do tego osrodka hodowli kwas 3'-karboksymetylotiopropionowy albo jego sól lub ester uzyskujac odpowiednio kwas 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-6-ami- nopenicylanowy, 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-6-APA), które zostaja powiekszone in situ do 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)- propionylo-7-ADCA; c) wydziela sie 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7- ADCA z bulionu fermentacyjnego; d) odacylowuje sie 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7- ADCA; oraz e) wydziela sie krystaliczny 7-ADCA. PL PL

Description

DZIEDZINA WYNALAZKU I KRÓTKI OPIS STANU TECHNIKI

Przedmiotem wynalazku jest biosyntetyczny sposób wytwarzania i wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA).

Antybiotyki β-laktamowe stanowią najważniejszą grupę związków antybiotykowych, o długiej historii zastosowania klinicznego. W grupie tej do najważniejszych należą penicyliny i cefalosporyny. Związki te są wytwarzane w przyrodzie przez pędzlaki, odpowiednio Penicillium chrysogenum i Acremonium chrysogenum.

Dzięki klasycznym technikom usprawniania szczepów poziomy wytwarzania antybiotyków przez Penicillium chrysogenum i Acremonium chrysogenum zdecydowanie wzrosły w ostatnich dziesięcioleciach. Wraz ze wzrostem wiedzy o drogach biologicznych prowadzących do penicylin i cefalosporyn oraz opanowaniem technologii zrekombinowanego DNA dostępne stały się nowe narzędzia poprawy wydajności szczepów i derywatyzacji związków in vivo.

Zidentyfikowano większość enzymów biorących udział w biosyntezie β-laktamów, a ich odpowiednie geny zostały sklonowane; patrz np. Ingolia i Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245-264 (przebieg biosyntezy i enzymy) oraz Aharonowitz, Cohen i Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495 (klonowanie genów).

180 799

Pierwsze dwa etapy biosyntezy penicyliny w P. chrysogenum stanowi kondensacja 3 aminokwasów, kwasu L-5-amino-5-karboksypentanowego (kwasu L-a-aminoadypinowego) (A), L-cysteiny (C) i L-waliny (V) do tripeptydu LLD-ACV, a następnie cyklizacja tripeptydu z utworzeniem izopenicyliny N. Związek ten zawiera typową strukturę β-laktamu.

Trzeci etap obejmuje wymianę hydrofilowego łańcucha bocznego kwasu L-5-amino-5karboksypentanowego na hydrofobowy łańcuch boczny w wyniku działania enzymu acylotransferazy (AT). W przemysłowym procesie wytwarzania penicyliny G wybranym łańcuchem bocznym jest kwas fenylooctowy (PA). W EP-A-0532341 ujawniono zastosowanie adypinianu (5-karboksypentanianu) jako surowca. Wprowadzenie tego substratu prowadzi do pochodnej penicyliny z 5-karboksypentanoilowym łańcuchem bocznym, czyli do kwasu 5karboksypentanoilo-6-aminopenicylanowego. Takie wbudowywanie jest możliwe dzięki temu, ze, jak to stwierdzono, acylotransferaza wykazuje specyficzność względem wielu substratów (Behrens i inni, J. Biol. Chem. 175 (1948), 751-809; Cole, Process Biochem. 1 (1966), 334-338; Ballio i inni, Nature 185 (1960), 97-99). Enzymatyczna reakcja wymiany z udziałem AT przebiega wewnątrz organelli komórkowych, w mikrociele, jak to opisano w EP-A-0448180.

Cefalosporyny są o wiele droższe od penicylin. Jednym z powodów jest to, ze cefalosporyny (np. cefaleksyna) wytwarza się z penicylin w wyniku szeregu przemian chemicznych. Innym powodem jest to, ze jak dotychczas poddawać można fermentacji tylko cefalosporyny z bocznym łańcuchem D-5-amino-5-karboksypentanoilowym. Cefalosporyna C, zdecydowanie najważniejszy materiał wyjściowy stosowany w tym celu dobrze rozpuszcza się w wodzie w pełnym zakresie pH, co wymusza stosowanie długotrwałych i kosztownych sposobów wydzielania z wykorzystaniem skomplikowanej i kosztownej techniki kolumnowej. Uzyskana w ten sposób cefalosporyna C musi być przekształcona w terapeutycznie przydatne cefalosporyny na drodze szeregu przemian chemicznych i enzymatycznych.

Półprodukt 7-ADCA wytwarza się obecnie na drodze chemicznej derywatyzacji penicyliny G. Niezbędne etapy procesu wytwarzania 7-ADCA obejmują powiększenie 5członowej struktury pierścieniowej penicyliny do 6-członowej struktury pierścieniowej cefalosporyny. Enzym ekspandaza z bakterii włóknistych Streptomyces clavuligerus może przeprowadzić takie powiększenie pierścienia. Po wprowadzeniu do P chrysogenum może on przekształcić strukturę pierścienia penicyliny w strukturę pierścienia cefalosporyny, jak to zostało opisane przez Cantwella i innych Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283-289 oraz w EP-A-0532341 i EP-A-0540210. Zarówno enzym ekspandaza, jak i odpowiadający mu gen, zostały dobrze scharakteryzowane (EP-A-0366354), zarówno biochemicznie jak i funkcjonalnie. Przedstawiono zarówno mapy fizyczne genu cefE (EP-A-0233715) jak i sekwencję DNA oraz badania transformacji P chrysogenum za pomocą cefE.

Innym źródłem odpowiedniego enzymu powiększającego pierścień jest bakteria włóknista Nocardia lactamdurans (poprzednio Streptomyces lactamdurans). Opisano zarówno właściwości biochemiczne enzymu jak i sekwencję DNA genu (odpowiednio Cortes i inni, J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3165-3174; oraz Coque i inni, Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453-458).

W szczególności w EP-A-0532341 ujawniono zastosowanie in vivo enzymu ekspandazy w P. chrysogenum w kombinacji z bocznym łańcuchem 5-karboksypentanoilowym jako surowcem stosowanym jako substrat dla enzymu acylotransferazy w P. chrysogenum.. Prowadzi to do powstania 5-karboksypentanoilo-6-APA, który przekształcany jest przez enzym ekspandazę wprowadzony do szczepu P. chrysogenum, w 5-karboksypentanoilo-7-ADCA. Na'koniec sugeruje się usuwanie bocznego łańcucha 5-karboksypentanoilowego, tak ze uzyskuje się jako produkt końcowy 7-ADCA. W zgłoszeniu patentowym EP-A-0540210 opisano podobny sposób wytwarzania 7-ADCA, obejmujący dodatkowe etapy przekształcania bocznego łańcucha 3-metylowego przy pierścieniu ADCA w boczny łańcuch 3-acetoksymetylowy występujący w ADCA. Jednakże wyżej wspomniane zgłoszenia patentowe nie ujawniają wydajnego i ekonomicznie opłacalnego sposobu, gdyż przede wszystkim nie został rozwiązany problem czasowy ekspresji enzymu ekspandazy w komórce współtowarzyszący ekspresji enzymu acylotransferazy.

180 799

W przeciwieństwie do powyższego niniejszy wynalazek dostarcza wydajnego sposobu wytwarzania 7-ADCA, w przypadku którego ekspresja ekspandazy i acylotransferazy przebiega równocześnie.

Na dodatek wynalazek dotyczy zastosowania nowego prekursora łańcucha bocznego, a mianowicie kwasu 3'-karboksymetylotiopropionowego. Prekursor ten jest z dużą wydajnością wprowadzany przez P chrysogenum do odpowiednich penicylin, które mają być następnie powiększane w wyniku działania enzymu ekspandazy.

Ponadto dotychczas nie opisano wydajnego sposobu wydzielania pochodnej 7-ADCA z bulionu fermentacyjnego przed jej odacylowaniem. Wynalazek dostarcza wydajnego sposobu ekstrakcji rozpuszczalnikiem stosowanego do wydzielania pochodnej 7-ADCA.

Wynalazek dostarcza rzeczywistego sposobu wydajnego wytwarzania 7-ADCA, obejmującego etapy reakcji nie ujawnione ani nie sugerowane w znanych rozwiązaniach.

Ponadto wykorzystując wynalazek i w sposób analogiczny do opisu podanego w EP-A0540210 wytwarzać można 7-ADCA z dużą ogólną wydajnością.

KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

Figura 1: mapa funkcyjna plazmidu pMcTNE, fig. 2: mapa funkcyjna plazmidu pMcTSE, fig. 3: mapa funkcyjna plazmidu pMcTNde, fig. 4: mapa funkcyjna plazmidu pGNETA, fig. 5: mapa funkcyjna plazmidu pGSETA, fig.6: mapa funkcyjna plazmidu pANETA, fig. 7: mapa funkcyjna plazmidu pASETA, fig. 8: sekwencja DNA cefE Nocardia lactamdurans (Coque i inni, powyżej) (dolne linie) nałożone na sekwencję PCR produktu 1 (górne linie).

KRÓTKI OPIS ZESTAWIENIA SEKWENCJI

Sekwencje ID nr 1-13: oligonukleotydy stosowane w konstrukcji kasety ekspresji P chrysogenum dla genów cefE Streptomyces clavuligerus i Nocardia lactamdurans.

Sekwencja ID nr 14: sekwencja DNA cefE Nocardia lactamdurans (Coque i inni, powyżej).

ISTOTA WYNALAZKU

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania i wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA) przy użyciu transformowanego szczepu Penicillium chrysogenum, charakteryzujący się tym, ze:

a) transformuje się szczep Penicillium chrysogenum genem ekspandazy pod transkrypcyjnąi translacyjnąkontroląpędzlakowych sygnałów ekspresji;

b) przeprowadza się fermentację tego szczepu w ośrodku hodowli i dodaje się do tego ośrodka hodowli kwas 3'-karboksymetylotiopropionowy albo jego sól lub ester uzyskując odpowiednio kwas 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-6-aminopenicylanowy, 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-6-APA), które zostają powiększone in situ do 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA;

c) wydziela się 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7ADCA z bulionu fermentacyjnego;

d) odacylowuje się 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7ADCA; oraz

e) wydziela się krystaliczny 7-ADCA.

Korzystnie w sposobie według wynalazku szczep Penicillium chrysogenum transformuje się genem ekspandazy pod transkrypcyjną i translacyjną kontrolą sygnałów ekspresji genu acylotranslcra/y.

Korzystnie w sposobie według wynalazku etap (e) stanowi etap filtracji.

Korzystnie w sposobie według wynalazku w etapie (c) przeprowadza się filtrację oraz ekstrakcję przesączonego bulionu rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszającym się z wodąprzy pH poniżej około 4,5, a następnie ekstrakcję wodąprzy pH 4-10.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się gen ekspandazy pochodzący ze Streptomyces clavuligerus lub Nocardia lactamdurans.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Wynalazek dotyczy zastosowania funkcyjnych konstruktów genowych w P. chrysogenum w celu powiększania in vivo struktury pierścieniowej penicyliny, w połączeniu z zasto180 799 sowaniem nowego substratu dla biosyntetycznych enzymów, tak aby wytworzyć pochodną kluczowego półproduktu w biosyntezie cefalosporyny, kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA). Budowa chemiczna tej pochodnej umożliwia przeprowadzenie skutecznej ekstrakcji rozpuszczalnikiem, która stanowi ekonomicznie opłacalny sposób wydzielania.

Transformację P. chrysogenum można zasadniczo przeprowadzić doprowadzając DNA w różny sposób, np. przez wychwyt protoplastu z udziałem PEG-Ca, elektroporacja lub techniki wstrzeliwania cząstek, a także dobór transformantów. Patrz np. Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and' Vector Development for Filamentous Fungi, w: Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, redakcja), Cambridge University Press (1991). Opisano zastosowanie dominantowych i niedominantowych selekcyjnych markerów (V an den Hondel, supra). Opisano także selekcyjne markery pochodzenia zarówno homologicznego (pochodzące z P chrysogenum) jak i heterologicznego (nie pochodzące z P chrysogenum).

Zastosowanie różnych markerów selekcji transformantów, homologicznych lub heterologicznych, w obecności lub bez sekwencji wektorowych, fizycznie połączonych lub nie połączonych z nierozróżnialnym DNA, do selekcjonowania transformantów jest dobrze znane.

Korzystnie do selekcjonowania transformantów P chrysogenum stosuje się homologiczny marker selekcji, aby ograniczyć ilość heterologicznego DNA wprowadzanego do P. chrysogenum. Najkorzystniej stosuje się dominantowy marker selekcjonujący, który można selektywnie usunąć z transformowanego szczepu, np. gen amdS z A. nidulans lub innego pędzlaka (europejskie zgłoszenie patentowe nr 94201896.1). Te korzystne charakterystyki markera selekcji transformantów P. chrysogenum są bardzo przydatne w procesie i procedurach rejestracji produktu, gdyż żadne markery odporności na antybiotyki nie biorą udziału w procesie i nie są wprowadzane do otoczenia.

Zgodnie z najkorzystniejszym rozwiązaniem marker selekcji amdS, który można selektywnie usunąć ze szczepu, poprzez wielokrotne powtarzanie transformacji z wykorzystaniem za każdym razem tej samej selekcji dominantowej. Taka cecha uwalniania od markera selekcji nowych szczepów P. chrysogenum wytwarzających w wyniku ekspresji ekspandazę ma decydujące znaczenie dla szybkiego opracowania wysokowydajnych szczepów w przemysłowym programie poprawy szczepów.

Dzięki temu reakcja powiększania pierścienia z udziałem enzymu ekspandazy wytwarzanego w wyniku ekspresji P chrysogenum przebiega w tym organizmie, np. w szczepie Wisconsin 54-1255. Taka reakcja powiększania pierścienia przebiega również w jego mutantach zapewniających zwiększoną wydajność β-laktamu. Zrozumiałe jest, że w takim przypadku warunki hodowli należy nieznacznie zmodyfikować, tak aby uzyskać wydajny wzrost.

Ponadto gen cefE umieszcza się pod transkrypcyjną i translacyjną kontrolą elementów kontrolnych genu pędzlaka, korzystnie pochodzących z genu acylotransferazy (AT) P chrysogenum, co umożliwia jego ekspresję w optymalnym przedziale czasowym zsynchronizowanym z działaniem samego enzymu acylotransferazy. Cechy te wywierają decydujący wpływ na skuteczność reakcji powiększania pierścienia w cząsteczce penicyliny.

Oprócz zsynchronizowanej ekspresji genów kodujących ekspandazę i acylotransferazę wewnątrzkomórkowa współlokalizacja części enzymu ekspandazy z acylotransferazą w mikrociałach (wewnątrzkomórkowa lokalizacja acylotransferazy) może ułatwić opracowanie ekonomicznego procesu produkcyjnego. Takie korzystne rozwiązania przyczynią się do zdecydowanego zmniejszenia ilości produktów ubocznych przy wytwarzaniu penicyliny, które nie są tolerowane w końcowym produkcie 7-ADCA przez władze zatwierdzające.

W podsumowaniu można stwierdzić, ze wynalazek ujawnia, w jaki sposób aktywność enzymu ekspandazy wprowadzonego do P. chrysogenum wykorzystać można do powiększania pierścienia penicyliny w warunkach zsynchronizowanej ekspresji.

Według wynalazku β-laktamowe półprodukty, 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA, wytwarzane są w P chrysogenum w wyniku dodania kwasu 3'-karboksymetylotiopropionowego albo jego soli lub estru. Do odpowiednich soli należy np. sól sodowa lub potasowa. Związki te wydajnie wydziela się z ośrodka na drodze prostej ekstrakcji rozpuszczalnikiem, np. w sposób następujący.

180 799

Bulion sączy się i do przesączu dodaje się rozpuszczalnik organiczny nie mieszający się z wodą. Nastawia się pH tak, aby wyekstrahować cefalosporynę z warstwy wodnej. pH powinno być nizsze od 4,5; korzystnie wynosi ono od 4 do 1, a jeszcze korzystniej od 2 do 1. W taki sposób cefalosporynę oddziela się od wielu innych zanieczyszczeń obecnych w bulionie fermentacyjnym. Korzystnie dodaje się niewielką objętość rozpuszczalnika organicznego uzyskując stężony roztwór cefalosporyny, dzięki czemu osiąga się zmniejszenie szybkości przepływu objętościowego. Drugą możliwość stanowi ekstrakcja pełnego bulionu przy pH od 4 do 1. Korzystnie bulion ekstrahuje się przy pH od 4 do 1 rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszającym się z wodą.

Zastosować można dowolny rozpuszczalnik, który nie oddziaływuje z cząsteczką cefalosporyny. Do odpowiednich rozpuszczalników należy np. octan butylu, octan etylu, metyloizobutyloketon oraz alkohole, takie jak butanol itp. Korzystnie stosuje się 1-butanol lub izobutanol.

Następnie cefalosporynę wyekstrahowuje się wodą przy pH 4-10, korzystnie 6-9. Także w tym przypadku zdecydowanie następuje zmniejszenie ostatecznej objętości. Wydzielanie przeprowadzać można w temperaturze 0-50°C, a korzystnie w temperaturze otoczenia. Na uzyskany w ten sposób wodny roztwór cefalosporyny działa się odpowiednim enzymem w celu usunięcia bocznego łańcucha 2-(karboksyetylotio)acetylowego i 3-(karboksymetylotio)propionylowego, tak aby uzyskać pożądany 7-ADCA.

Korzystnie stosuje się unieruchomiony enzym, tak aby można go było użyć szereg razy. Sposób wytwarzania takich cząstek i unieruchomiania enzymu opisano dokładnie w EP-A0222462. Przy pH roztworu wodnego wynoszącym np. od 4 do 9 następuje ograniczenie do minimum reakcji degradacji cefalosporyny oraz uzyskuje się optymalny stopień konwersji w reakcji enzymatycznej. I tak enzym dodaje się do wodnego roztworu cefalosporyny, utrzymując pH na odpowiednim poziomie, np. w wyniku dodawania odpowiedniej zasady, takiej jak roztwór wodorotlenku potasowego, albo stosując żywicę jonowymienną. Gdy reakcja przebiegnie do końca, unieruchomiony enzym odsącza się. Inną możliwość stanowi zastosowanie unieruchomionego enzymu w kolumnie ze złożem nieruchomym lub fluidalnym, albo stosowanie enzymu w roztworze i usuwanie produktów na drodze filtracji przez membranę. W następnym etapie mieszaninę reakcyjną zakwasza się w obecności rozpuszczalnika organicznego nie mieszającego się z wodą

Odpowiednie enzymy pochodzą np. z drobnoustrojów Pseudomonas SY77, przy czym wykazują one jedną lub więcej mutacji w pozycjach 62, 177, 178 i 179. Można także zastosować enzymy z innych drobnoustrojów Pseudomonas, korzystnie z Pseudomonas SE83, ewentualnie wykazujące mutację w jednej lub więcej pozycji odpowiadających pozycjom 62, 177, 178 i 179 w Pseudomonas SY77.

Po doprowadzeniu pH do około 1,0-1,5 warstwy rozdziela się i warstwę wodną doprowadza się do pH 2-5. Krystaliczny 7-ADCA odsącza się.

Odacylowanie przeprowadzić można również chemicznie, w znany sposób obejmujący np. wytwarzanie bocznego łańcucha iminochlorkowego w wyniku dodania pentachlorku fosforu w temperaturze poniżej 10°C, a następnie dodania izobutanolu w temperaturze otoczenia lub niższej.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając jego istoty.

PRZYKŁADY

Przykład 1. Ekspresja genu Streptomyces i Nocardia cefE w Penicillium chrysogenum.

a. Ogólne procedury klonowania genu i transformacji genu

W zgłoszeniu wykorzystano znane techniki stosowane w procedurach klonowania genów. Do technik tych należą polimerazowe reakcje łańcuchowe (PCR), synteza syntetycznego oligonukleotydu, analiza sekwencji nukleotydów w DNA, enzymatyczne ligowanie i restrykcja DNA, subklonowanie wektora E coli, transformowanie i selekcja transformantów, wydzielanie i oczyszczanie DNA, charakteryzowanie DNA metodą blottingu Southema oraz sond znaczonych ³²P, a także przypadkowe znakowanie DNA za pomocą ³²P. Techniki takie są dobrze znane i odpowiednio opisane w wielu publikacjach. Patrz np. Sambrook i inni, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA (1989), Innes i inni, PCR

180 799

Protocol, a Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990) oraz McPherson i inni, PCR, a Practical Approach, IRL Press (1991).

Do ogólnych procedur wykorzystywanych przy transformowaniu pędzlaków i selekcji transformantów należy preparowanie protoplastów grzybowych, warunki przenoszenia DNA i regenerowanie protoplastu oraz oczyszczanie i charakteryzowanie transformantów. Wszystkie takie procedury są znane i dobrze udokumentowane w pracach: Filkenstein i Ball (red.), Biotechnology of Filamentous Fungi, Technology and Projects, Butterworth-Heinemann (1992); Bennet i Lasure (red.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Turner, w Puhler (red.), Biotechnology, drugie całkowicie zmienione wydanie, VCH (1992).

W szczególności zastosowanie technologii klonowania genu i transformacji genu w odniesieniu do Penicillium chrysogenum jest bardzo dokładnie opisane w pracach Bennet i Lasure (supra) oraz Finkelstein i Ball (supra).

- syntetyczne oligonukleotydy DNA wytwarzano z wykorzystaniem dostępnego w handlu syntetyzatora (Applied Biosystems, CA, USA), zgodnie z instrukcjami producenta;

- PCR przeprowadzano z wykorzystaniem zautomatyzowanego aparatu PCR (Perkin Elmer, USA) i polimerazę Ultma DNA (Perkin Elmer), zgodnie z instrukcjami producenta;

- procedurę hGC pCr (Dutton i inni, Nucleic Acids Res. 21 (nr 12) (1993), 2953-2954) wykorzystano, aby umożliwić amplifikację regionu kodującego cefE w chromosomowym DNA N lactamdurans i C clavuligerus;

- enzymy restrykcyjne i inne enzymy modyfikujące DNA otrzymano z BRL (MD, USA), stosując je zgodnie z instrukcjami producenta;

- wektor pBluescript® z E. coli otrzymano ze Stratagene (CA, USA);

- wszystkie inne stosowane chemikalia były odczynnikami o czystości analitycznej, otrzymanymi od różnych dostawców;

- analizę sekwencji nukleotydów DNA wykonano za pomocą zautomatyzowanego aparatu do analizy sekwencji DNA (Applied Biosystems), którego działanie opiera się na wykrywaniu specyficznego w stosunku do sekwencji znakowania fluorescencyjnego, zgodnie z instrukcjami producenta.

b. Hodowla drobnoustrojów

Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 hodowano w tryptynowym bulionie sojowym (Difco). Chromosomowy DNA z tego szczepu zastosowano do wydzielania genu cefE (Kovacevic i inni, J. Bacteriol. (1989), 754-760).

Nocardia lactamdurans ATCC 27382 również hodowano w tryptynowym bulionie sojowym (Difco). Chromosomowy DNA z tego szczepu zastosowano do wydzielania genu cefE (Coque i inni, supra).

Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) hodowano w pełnym ośrodku YPD (YPD: 1% ekstraktu drozdzowego, 2% peptonu, 2% glukozy) Chromosomowy DNA z tego szczepu zastosowano do wydzielania obszarów regulacyjnych 5' i 3' genu penDE, niezbędnych w ekspresji genu cefE. Penicillium chrysogenum ATCC 28089 stosowano także jako gospodarza w eksperymentach transformacji genu cefE. Przydatne są również inne szczepy Penicillium chrysogenum, w tym mutanty szczepu Wisconsin 54-1255, o zwiększonej wydajności β-laktamu. W zależności od stosowanego markera selekcji transformantów wykorzystać można szczepy P. chrysogenum zawierające mutacje w genach pyrG, niaD lub facA. Takie szczepy mutantowe otrzymać można powszechnie znanymi sposobami (Cantoral, Bio/Technol. 5 (1987), 494-497; Gouka i inni, J. Biotechn. 20 (1991), 189-200; oraz Gouka i inni, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514-519).

Hodowlę P chrysogenum w celu wytworzenia protoplastów stosowanych w transformacjach prowadzono również w ośrodku YPD.

Wiadomo, ze procedury wytwarzania protoplastów i regeneracji mogą różnić się nieznacznie, zależnie od konkretnego stosowanego szczepu Penicillium chrysogenum oraz od zastosowanego sposobu selekcji transformantów.

Szczepy E coli WK6 (Zell i Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809-1815), XLI-Blue (Stratagene) i HB101 (Boyer i Roulland-Dussoix, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459; Bolivar i Backman,

180 799

Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) utrzymywano i hodowano z wykorzystaniem standardowych ośrodków hodowli E coli (Sambrook, supra).

c. Konstrukcja kaset ekspresji cefE

Kasety ekspresji cefE zestawiono w tabeli 1, w której wyjaśniono także nomenklaturę wykorzystywaną w odniesieniu do tych plazmidów.

Tabela 1

Zestawienie skonstruowanych kaset ekspresji cefE

Plazmid	Promotor	Gen	Docelowe mikrociało	Terminator
pMCTSE	tac¹	S. cla cefE		FdT
pMCTNE	tac	N lac cefE		FdT
pGSE	gpd²	S. cla cefE		-
pGNE	gpd	N. Iac cefE		-
pGNETA	gpd	N lac cefE	+ + cel	AT³
pGNEWA	gpd	N lac cefE	Wt	AT
pANETA	AT⁴	N. lac cefE	+ cel	AT
pANEWA	AT	N lac cefE	Wt	AT
pGSETA	gpd	S cla ceiE	+ cel	AT
pGSEWA	gpd	S. cla cefE	Wt	AT
pASETA	AT	S clacefE	+ cel	AT
pASEWA	AT	S cla cefE	Wt	AT

tac = promotor hybrydowy trp-lac gpd = koniec 5'genu gpdA A nidulans

AT = koniec 3 ' genu penDE P chrysogenum

AT = koniec 5 'genu penDE P chrysogenum

Do konstruowania syntetycznych oligonukleotydów zestawionych w tabeli 2 wykorzystano opublikowane sekwencje nukleotydowe genu cefE 5. clavuligerus cefE (Kovacevic, supra); genu cefE N. lactamdurans (Coque, supra); genu gpdA A nidulans (Punt i inni, Gene 69 (1988), 49-57) oraz genu penDe P. chrysogenum (Barredo i inni, Gene 83 (1989), 291300; Diez i inni, Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572-576).

Tabela 2

Sekwencje oligonukleotydów stosowane w konstrukcji kaset ekspresji P chrysogenum dla genu cefE N lactamdurans i 5 clavuligerus

1	5'- GCT GAA GGA GCT GAG CAT ATG ACG GAC GCG CCG-3'
2.	5- CCC GGG TCT AGA TCT AGA TCA CCG GGC GGC GGC GGT CTT CCG GAT GTT-3 '
3 3.	5'- GAT CAG TGA GAG TTG CAT ATG GAC ACG ACG GTG CCC ACC TTC AGC ACT-3'
4.	5'- CCC GGG TCT AGA TCT AGA CTA TGC CTT GGA TGT GCG GCG GAT GTT-3'
5	5'- GAG CTC TGT GAA TTC ACA GTG ACC GGT GAC TCT TTC-3'
6.	5 - GGC AGC CAT ATG GAT GTC TGC TCA AGC GGG GTA GTC-3'
7.	5'- AGA ACG GAT TAG TTA GTC TGA ATT CAA CAA GAA CGG CCA GAC-3'
8.	5'- GAC AGA GGA TGT GAA GCA TAT GTG CTG CGG GTC GGA AGA TGG-3'
9.	5'- ACA TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCG CCG CCC GGT GAA GGC TCT TCA TGA-3'
10.	5'- GGA CTA GTG TCG ACC CTG TCC ATC CTG AAA GAG TTG-3'

180 799 cd tabeli 2

11.	5 - ACA TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCG CCG CCC GGC TTT GAA GGC TCT TCA-3'
12.	5 - TTC GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAG ACC GCC ACG TTC CAG GAT TGG ATC GGG GGC AAC TAC GTG AAC ATC CGC CGC ACA TCC AAG GCA TGA AGG CTC TTC ATG ACG-3'
13.	5 - GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAG ACC GCC ACG TTC CAG GAT TGG ATC GGG GGC AAC TAC GTG AAC ATC CGC CGC ACA TCC AAG CTA TGA AGG CTC TTC ATG ACG-3'

c1. Konstrukcja plazmidów ekspresji pMCTSE i pMCTNE genu cefE E. coli

W pierwszej PCR z wykorzystaniem chromosomowego DNA N. lactamdurans oraz oligonukleotydów 1 i 2 otrzymano otwartą ramkę odczytu cefE N. lactamdurans w postaci produktu PCR o 0,9 kb, zawierającego unikatowe miejsce restrykcyjne Ndel przy końcu 5' oraz unikatowe miejsce XbaI przy końcu 3'.

PCR, 2: cefE S clavuligerus

W drugiej PCR z wykorzystaniem chromosomowego DNA S. clavuligerus oraz oligonukleotydów 3 i 4 otrzymano otwartą ramkę odczytu cefE S. clavuligerus w postaci produktu PCR o 0,9 kb, zawierającego unikatowe miejsce restrykcyjne Ndel przy końcu 5' oraz unikatowe miejsce XbaI przy końcu 3'.

Aby doprowadzić do ekspresji genów cefE w E coli i scharakteryzować produkty PCR metodą analizy sekwencji DNA, przeprowadzono klonowanie produktów PCR 1 i 2 w wektorze pMCTNde, pochodnej pMC-5 (Stranssens i inni, Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). Plazmid pMCTNde otrzymano z pMC5-8 (europejskie zgłoszenie patentowe nr 0351029) przez insercję fragmentu kodującego promotor tac za miejscem RBS i miejscem klonowania Ndel (fig. 3).

Produkty PCR 1 i 2 strawiono za pomocą Ndel i XbaI, a następnie zligowano z wektorem pMCTNde strawionym za pomocą NdeI-XbaI. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania E coli WK6. Przeprowadzono selekcję transformantów pod względem odporności na chloramfenikol. Transformanty te użyto do wydzielania plazmidowego DNA. Insert kasety ekspresji cefE zanalizowano najpierw przeprowadzając trawienie enzymami restrykcyjnymi na przewidywaną generację fragmentów restrykcyjnych. Plazmidy zawierające przewidywane miejsca dla enzymów restrykcyjnych zanalizowano na koniec w zautomatyzowanym analizatorze sekwencji DNA.

Sekwencja DNA otwartej ramki odczytu cefE S clavuligerus w plazmidzie pMCTSE (fig. 2) była w 100% identyczna z sekwencją opublikowaną (Kovacevic, supra).

Sekwencja DNA (fig. 8) wszystkich zanalizowanych klonów zawierających otwartą ramkę odczytu cefE N. lactamdurans różniła się od sekwencji opublikowanej (Coque, supra).

Pochodna sekwencja aminokwasów opublikowanego genu cefE N lactamdurans zawierała prolinę w pozycji aminokwasu 41 (patrz Seq. ID nr 14). Prolina ta opuszczona jest w klonach uzyskanych w PCR 1. Plazmidowi temu nadano nazwę pMCTNE (fig. 1).

c2. Konstrukcja plazmidów ekspresji cefE P. chrysogenum

PCR 3: promotor gpdA

W trzeciej PCR stosuje się plazmidowy DNA pAN7-1 (Punt i inni, Gene 56 (1987), 117-124) zawierający gen hph E coli pod kontrolą promotora gpdA A. nidulans oraz oligonukleotydy 5 i 6 otrzymano promotor gpdA w postaci produktu o 0,9 kb zawierającego unikatowe miejsce restrykcyjne EcoRI przy końcu 5' oraz unikatowe miejsce NdeI przy końcu 3'.

PCR 4: promotor AT

W czwartej PCR chromosomowy DNA z P. chrysogenum oraz oligonukleotydy 7 i 8 zastosowano w celu otrzymania fragmentu promotora AT o 1,5 kb, który również zawierał unikatowe miejsce restrykcyjne EcoRI przy końcu 5' oraz unikatowe miejsce NdeI przy końcu 3'.

PCR 5: Terminator AT i koniec 3' genu cefE N. lactamdurans

W piątej PCR otrzymano obszar terminatora pen(DE) o 0,5 kb stosując chromosomowy DNA z P chrysogenum oraz odpowiednio oligonukleotydy 9 i 10 oraz 11 i 10. Uzyskane w ten sposób produkty PCR zawierały 3'-końcową sekwencję genu cefE wraz z sygnałem ukierunkowującym na mikrociało lub bez tego sygnału, obejmując sekwencję ARL C-końcowego aminokwasu (Muller i inni, Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210-213).

180 799

Oligonukleotydy skonstruowano w taki sposób, ze unikatowe miejsce BspEI wprowadzono na końcu 5' produktu PCR, a unikatowe miejsce Spel wprowadzono na końcu 3' produktu PCR.

PCR 6: Terminator AT i koniec 3' genu cefE S. clavuligerus

W szóstej PCR otrzymano obszar terminatora pen(DE) o 0,5 kb stosując chromosomowy DNA z P chrysogenum oraz odpowiednio oligonukleotydy 12 i 10 oraz 13 i 10. Uzyskane w ten sposób produkty PCR zawierały 3'-końcową sekwencję genu cefE S clavuligerus wraz z sygnałem ukierunkowującym na mikrociało lub bez tego sygnału, obejmując sekwencję SKL C-końcowego aminokwasu (De Hoop i inni, Biochem. J. 286 (1992), 657-669).

Oligonukleotydy skonstruowano w taki sposób, ze unikatowe miejsce BglI wprowadzono na końcu 5' produktu PCR, a unikatowe miejsce SpeI wprowadzono na końcu 3' produktu PCR.

W celu osiągnięcia ekspresji genów cefE w P chrysogenum promotor gpdA i fragment promotora AT zligowano z fragmentami cefE z plazmidów pMCTNE i pMCTSE. Następnie przeprowadzono klonowanie tych zligowanych fragmentów w wektorze pBluescript II KS.

PCR 3 strawiono za pomocą EcoRI i NdeI. pMCTNE i pMCTSE strawiono za pomocą NdeI i XbaI. Fragmenty restrykcyjne rozdzielono metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Z żelu agarozowego wydzielono oczyszczone fragmenty 0,9 kb kodujące cefE. Fragment EcoRI-NdeI promotora zligowano wraz z fragmentami NdeI-XbaI z cefE w strawionym EcoRI-XbaI wektorze pBluescript II KS. Uzyskano w ten sposób plazmidy pGSE i pGNE.

W celu uzyskania optymalnej ekspresji genów cefE w P chrysogenum wybrano do klonowania sekwencję sygnałową terminacji AT poza genami cefE w plazmidach ekspresji P chrysogenum wspomnianych powyżej.

pGNETA-pGNEWA

Produkty PCR 5 strawiono BspEI i SpeI, a następnie zligowano ze strawionym za pomocą BspEI i SpeI wektorem pGNE. Mieszaniny ligacyjne zastosowano do transformowania E. coli HB101. Przeprowadzono selekcję transformantów pod względem odporności na ampicylinę. Plazmidy wydzielone z tych transformantów scharakteryzowano przeprowadzając analizę fragmentów restrykcji, a następnie analizę sekwencji DNA. Uzyskano w ten sposób plazmidy pGNEWA i pGNETA (fig. 4).

pGSETA-pGSEWA

Produkty PCR 6 strawiono BglI i SpeI, a następnie zligowano ze strawionym za pomocą BglI i SpeI wektorem pGSE. Mieszaniny ligacyjne zastosowano do transformowania E coli HB101. Przeprowadzono selekcję transformantów pod względem odporności na ampicylinę. Plazmidy wydzielone z tych transformantów również scharakteryzowano przeprowadzając analizę fragmentów restrykcji, a następnie analizę sekwencji dNa. Uzyskano w ten sposób plazmidy pGSEWA i pGSETA (fig. 5).

pANETA, pANEWA, pASETA i pASEWA

Plazmidy pGNETA, pGNEWA, pGSETA i pGSEWA strawiono EcoRI i NdeI. Fragmenty restrykcyjne rozdzielono metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Z żelu agarozowego wydzielono oczyszczone fragmenty 4,5 kb.

Produkt PCR 4 strawiono EcoRI i NdeI, po czym zligowano z oczyszczonymi fragmentami wspomnianymi powyżej. Po przeprowadzeniu transformowania mieszanin ligacyjnych z E. coli HB101 przeprowadzono selekcję transformantów pod względem odporności na ampicylinę. Transformanty hodowano, a ich plazmidy wydzielono i scharakteryzowano przeprowadzając analizę fragmentów restrykcji, a następnie analizę sekwencji dNa. Uzyskano w ten sposób pożądane konstrukty, a mianowicie pANETA (fig. 6), pANEWA, pASETA (fig. 7) i pASEWA.

d. Transformowanie P chrysogenum

Zastosowano procedurę transformacji protoplastów z udziałem Ca-PEG.

Zgodnie z procedurami, które opisali Cantoral (supra), Gouka i inni (J. Biotechn., supra) oraz Gouka i inni (Appl. Microbiol. Biotechnol., supra), pełny plazmid lub oczyszczoną kasetę ekspresji cefE (pozbawioną sekwencji wektora E. coli) zastosowano do transformowania szczepów P. chrysogenum odpowiednio z genami pyrG, niaD, facA lub amdS (Beri i inni, Curr. Genet. 11 (1987), 639-641) jako markerami selekcyjnymi.

180 799

Stosując homologiczne markery selekcyjne pyrG, niaD lub facA w oczyszczonej formie, pozbawione sekwencji wektora E. coli, otrzymano transformowane szczepy P chrysogenum nie zawierające bakteryjnych genów odporności.

W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 94201896.1 opisano sposób otrzymywania zrekombinowanych szczepów pozbawionych markera selekcyjnego. Sposób ten z powodzeniem wykorzystano w odniesieniu do transformantów P. chrysogenum zawierających gen amdS A. nidulans jako dominujący marker selekcyjny.

Jedyne elementy o charakterze heterologicznym stanowi wówczas obszar kodujący cefE o 0,9 kb i ewentualnie obszar promotora gpdA o 0,9 kb.

e. Analiza transformantów

Transformanty P. chrysogenum oczyszczono przeprowadzając kolejne hodowle na selektywnej pożywce. Pojedyncze trwałe kolonie zastosowano do przygotowywania stoków agarowych w celu otrzymania spor, które selekcjonowano tak, aby uzyskać transformanty zawierające kasetę ekspresji cefE. Gotowanie fragmentu świeżej grzybni z transformantów na płytce agarowej zastosowano w celu uzyskania takiej ilości matrycowego DNA, aby przeprowadzić skuteczną selekcję setek transformantów pod względem obecności genu cefE, z wykorzystaniem techniki PCR (patrz Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), skrót w Fungal Genetics Newsletter 38, 55). W ten sposób oszacowano wydajność transformacji.

Przeprowadzono także selekcjonowanie transformantów z wykorzystaniem testów biologicznych. Transformanty hodowano na pożywce agarowej zawierającej wybrany prekursor bocznego łańcucha. E coli zastosowano jako bakterię wskaźnikową w przykryciu agarowym zawierającym również penazę Bacto, tak aby było można było rozróżnić wytwarzanie penicyliny i cefalosporyny, zgodnie ze znanymi metodami opisanymi np. przez Guttiereza i innych, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 46-64).

Spory zastosowano do zaszczepiania ośrodka hodowli P chrysogenum w sposób opisany w części d. Po hodowaniu przez 72 godziny w 25°C z grzybni wydzielono chromosomowy DNA. DNA strawiono enzymem restrykcyjnym z sekwencją rozpoznawania o 6 bp, takim jak EcoRI lub PstI.

Fragmenty DNA rozdzielono metodą elektroforezy na żelu agarozowym i naniesiono na membrany Gene z siatki nylonowej (New England Nuclear). Bioty Southema zhybrydyzowano z produktem PCR 2 znaczonym ²³P jako sondą dla sekwencji genu cefE. Oczyszczony produkt PCR 2 znaczony 32p otrzymano przeprowadzając przypadkowe znakowanie w obecności c^P dCTP, z wykorzystaniem dostępnego w handlu zestawu do znakowania (Boehringer Mannheim).

Transformanty zawierające sekwencję kodującą cefE zbadano pod względem zdolności do ekspresji genu cefE, określanej w opisie jako aktywność ekspandazowa.

Wybrane transformanty hodowano w ośrodku do wytwarzania penicyliny (patrz przykład 2).

W doświadczeniu, w którym badano wpływ czasu, próbki grzybni zbierano po 48, 72 i 96 godzinach fermentacji. Wykonano ekstrakty grzybniowe i w surowych ekstraktach oznaczano aktywność ekspandazową w sposób opisany przez Rollinsa i innych, Can. J. Microbiol. 34 (1988), 1196-1202. W przypadku transformantów z aktywnością ekspandazową oznaczano również aktywność acylotransferazową sposobami opisanymi przez Alvareza i innych, Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675-1682.

Na podstawie tych analiz transformanty o różnych poziomach enzymatycznej aktywności acylotransferazowej i ekspandazowej wybrano do wytwarzania pochodnych 7-ADCA na drodze fermentacji.

Przykład 2. Wytwarzanie na drodze fermentacji 2-(karboksyetylotio)acetyloi 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA i ich. wydzielanie.

Szczep P chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) transformowany jednym z konstruktów DNA w sposób opisany w przykładzie 1 zastosowano do zaszczepienia w ilości 2 x 10⁶ konidiów/ml ośrodka zaczynowego zawierającego (w g/litr): glukozę - 30; (NbUASO.t - 10; KH2PO4 - 10; roztwór pierwiastków śladowych I (MgSO4 · 7H2O - 25;

180 799

FeSO4 · 7H₂O - 10; CuSO4 · 5H₂O - 0,5; ZnSO4 · 7H₂O - 2; Na₂SO4 - 50; MnSO4 · H₂O - 2; CaCl₂ · 2H2O - 5) - 10 (pH przed sterylizacją 6,5).

Hodowlę zaczynową inkubowano przez 48-72 godziny w 25-30°C, po czym zastosowano ją do zaszczepienia 10-20 objętości środka produkcyjnego zawierającego (w g/litr): laktozę - 80; maltozę - 20; CaSO4 - 4; mocznik - 3; MgSO4 · 7H₂O - 2; KH2PO4 - 7; NaCl - 0,5; (NH4)2SO4 - 6; FeSO4 · 7H₂O - 0,1; kwas 3-karboksymetylotiopropionowy - 5; roztwór pierwiastków śladowych II (CuSO4 · 5H2O - 0,5; ZnSO4 · 7H2O - 2; MnSO4 · H2O - 2; Na2SO4 - 50) - 10 (pH przed sterylizacją 5,5-6,0). Inkubowanie prowadzono następnie przez 96-120 godzin.

Po zakończeniu fermentacji produkcyjnej grzybnię oddzielono przez odwirowanie lub filtrację i zawartość 2-(karboksyetylotio)acetylo- oraz 3-(knrboksymet.yiotio)propionylo-7-ADCA oznaczono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w kolumnie z odwróceniem faz. Zastosowano aparat HPLC Beckman System Gold, w którego skład wchodzi programowalny układ rozpuszczalników model 126, autopróbnik model 507, detektor diodowomatrycowy model 168 i układ danych System Gold (5.11). Jako fazę stacjonarną zastosowano dwie kolumny Chromsphere C18 (100 x 3 mm, Chrompack) w połączeniu szeregowym. Fazę ruchomą stanowił układ z liniowym gradientem od 100% 0,07 M buforu fosforanowego o pH 4,8 do 25% acetonitrylu/75% buforu fosforanowego o pH 4,8, w ciągu 15 minut przy szybkości przepływu 0,5 ml/minutę. Powstawanie 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA oznaczano ilościowo przy 260 nm stosując syntetyczny 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA jako substancje wzorcowe.

Piki identyfikowano przez bezpośrednie porównanie widm UV i NMR.

Po przesączeniu bulionu do przesączu dodano około 0,1 objętości 1-butanolu. pH doprowadzono do 2 rozcieńczonym kwasem solnym i mieszaninę mieszano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po oddzieleniu warstwę organiczną odparowano i poddano odacylowaniu chemicznemu (przykład 3) lub wyekstrahowano 0,33 objętościami wody przy pH 8 i poddano odacylowaniu enzymatycznemu (przykłady 4 i 5).

Przykład 3. Odacylowanie 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA.

Do mieszaniny 3 g (8 mmoli) 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA, 3,5 ml (36 mmoli) N,N-dimetyloaniliny, 13 ml chlorku metylenu dodano 2,6 ml (21 mmoli) trimetylochlorosilanu w temperaturze otoczenia. Po mieszaniu przez 30 minut mieszaninę reakcyjną schłodzono do około -50°C i dodano w jednej porcji 1,8 g (8,5 mmola) pentachlorku fosforu. Temperaturę -40°C utrzymywano przez 2 godziny, po czym mieszaninę reakcyjną schłodzono do -65°C. Dodano 12 ml (137 mmoli) izobutanolu z taką szybkością, aby temperatura nie wzrosła powyżej -40°C. Po dodatkowym mieszaniu przez 2 godziny roztwór wylano do 15 ml wody i natychmiast dodano 5 ml 4,5 N amoniaku. pH doprowadzono do 4 powoli dodając stały wodorowęglan amonowy. Po schłodzeniu do 5°C mieszaninę przesączono, a uzyskany krystaliczny 7-ADCA przemyto 5 ml mieszaniny woda/aceton (1:1) i oddzielono.

Przykład 4. Enzymatyczne odacylowanie 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA z wykorzystaniem mutantowej acylazy z Pseudomonas SY77.

Konwersję 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA przeprowadzono jednoetapowo w procesie enzymatycznym stosując specyficzną acylazę otrzymaną z Pseudomonas SY77 na drodze miejscowo ukierunkowanej mutagenezy. Konstrukcję i identyfikację mutantowej acylazy Pseudomonas SY77 o zwiększonej aktywności w odniesieniu do bocznych łańcuchów 2-(karboksyetylotio)acetylowych i 3-(karboksymetylotio)propionylowych podano w EP-A-0453048. W mutancie tyrozyna w pozycji L78 α-podjednostki acylazy Pseudomonas SY77 została zastąpiona histydyną. Mutantowa acylaza wytwarzana jest w E. coli. Komórki zbiera się przez odwirowanie i ponownie zawiesza się wlO mM buforze fosforanowym o pH 7,4, zawierającym 140 mM NaCl. Następnie komórki rozbija się przez obróbkę ultradźwiękami. Po usunięciu szczątków komórek zebrano supernatanty z aktywną acylazą. Acylazę oczyszczano przeprowadzając szereg etapów chromatografowania: (1) chromatografię jonowymienną na Q-Sepharose z szybkim przepływem przy

180 799 pH 8,8; (2) hydrofobową chromatografię interakcyjną na Phenyl-Sepharose; oraz (3) chromatografię żelową w kolumnie Sephacryl S200HR.

Oczyszczoną acylazę unieruchomiono na cząstkach z mieszaniny żelatyny i chitozanu. Cząstki poddano obróbce aldehydem glutarowym tuz przed dodaniem enzymu.

Konwersję 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA prowadzono w reaktorze z mieszadłem. Najpierw do reaktora dodano wodny roztwór cefalosporyny. Następnie temperaturę roztworu doprowadzono do 30°C przy stałym mieszaniu i pH , doprowadzono do 8 za pomocą wodorotlenku potasowego. Dodano wówczas unieruchomiony enzym, tak że rozpoczęła się konwersja. W czasie konwersji pH w reaktorze rejestrowano w sposób ciągły i utrzymywano na poziomie 8. Kwas 3'-karboksymetylotiopropionowy uwolniony w czasie reakcji zobojętniano KOH. Ilość dodanego KOH sumowano i rejestrowano za pomocą rejestratora wstęgowego. Konwersję śledzono pobierając próbki z reaktora i oznaczając w nich 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA oraz 7-ADCA, metodą HPLC w sposób opisany w przykładzie 2.

Po zakończeniu reakcji unieruchomiony enzym odsączano, do przesączu dodano octan butylu i pH doprowadzono do 1. Warstwy rozdzielono i pH fazy wodnej zawierającej 7-ADCA doprowadzono do 3. Krystaliczny 7-ADCA odsączono.

Przykład 5. Enzymatyczne odacylowanie 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA z wykorzystaniem acylazy z Pseudomonas SE83.

Konwersję 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA prowadzono jak w przykładzie 4, ale z zastosowaniem acylazy Pseudomonas SE83, osiągając taki sam rezultat.

180 799

1. Sposób wytwarzania i wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA) przy użyciu transformowanego szczepu Penicillium chrysogenum, znamienny tym, ze

a) transformuje się szczep Penicillium chrysogenum genem ekspandazy pod transkrypcyjnąi translacyjną kontrolą pędzlakowych sygnałów ekspresji;

e) wydziela się krystaliczny 7-ADCA.

<tS34 ,Nde I

Fig. 1

180 799

4Θ25 Ndo I

Fig. 2

180 799

2935.Scj

2013 .Pi tl Bgll.1921

Fig. 3

180 799

5304 EcoRi

Sdc 1.233?

Fig· 4

180 799

5302 EcoRI

SjcI 2395

Fig. 5

180 799

4436 Bgi 1

Fig. 6

180 799

. 1050

Fig. 7

180 799

Fig. 8 atgacggacgcgaccgtgccgaccttcgatctggccgagctgcgtgagggcttgcaccag

ATGACGGACGCGACCGTGCCGACCTTCGATCTGGCCGAGCTGCGTGAGGGCTTGCACCAG

GAGGAGTTCCGCCACTGCCTGCGCGAGAAGGGCGTGTTCTACCTCAAGGGCACCGGGCT

GAGGAGTTCCGCCACTGCCTGCGCGAGAAGGGCGTGTTCTACCTCAAGGGCACCGGGCTG

120

121

C G CCGAGGCGGACCACGCCTCGGCGCGGGAGATCGCGGTGGACTTCTTCGACCACGGC CCGGCCGAGGCGGACCACGCCTCGGGCCGGGAGATCGCGGTGGACTTCTTCGACCACGGC * * * *

178

181

ACCGAGGCCGAGAAGAAGGCGGTGATGACGCCGATCCCGACCATCCGGCGCGGGTACGCC

238

241

GGGCTGGAGTCCGAGAGCACCGCGCAGATCACGAACACCGGCAAGTACACCGACTACTCG

298

301

ATGTCGTACTCGATGGGCACCGCGGACAACCTGTTCCCCAGCGCCGAGTTCGAGAAGGCG

358

361

TGGGAGGACTACTTCGCGCGGATGTACCGCGCTTCGCAGGACGTCGCGCGGCAGGTGCTG

4] 8 4 21

ACCTCGGTCGGCGCGGAACCCGAGGTCGGCATGGACGCCTTCCTCGACTGCGAACCCCTG

180 799

Fig. 8 cd.

478

481

CTGCGCCTGCGCTACTTCCCCGAGGTGCCCGAGGATCGCGTGGCCGAGGAGCAGCCGCTG

538

541

CGGATGGCCCCGCACTACGACCTCTCGATCGTCACCCTGATCCACCAGACCCCTTGCGCG

598

601

AACGGGTTCGTCAGCCTGCAGGTCGAGGTGGACGGGTCCTATGTGGACATCCCGGCGCAG

658

661

CCGGGCGCGGTGCTGGTGTTCTGCGGCGCGGTGGCGACGCTGGTGGCCGACGGCGCGATC

718

721

AAGGCGCCCAAGCACCACGTGGCCGCGCCCGGCGCGGACAAGCGGGTGGGCAGCAGCCGC

778

781

ACCTCCAGCGTGTTCTTCCTGCGCCCCAACGGGGACTTCCGCTTCTCGGTGCCGCGGGCC

838

841

AGGGAGTGCGGGTTCGACGTCAGCATCCCGGCCGAGACCGCCACCTTCGACGACTGGATC

898

901

GGCGGCAACTACATCAACATCCGGAAGACCGCCGCCGCCCGG 939

GGCGGCAACTACATCAACATCCGGAAGACCGCCGCCGCCCGG 942

Zgodne = 937

Długoś

942 Zgodne/dlugość

99.5 ^%

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania i wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA) przy użyciu transformowanego szczepu Penicillium chrysogenum, znamienny tym, że

a) transformuje się szczep Penicillium chrysogenum genem ekspandazy pod transkrypcyjną i translacyjną kontrolą pędzlakowych sygnałów ekspresji;

b) przeprowadza się fermentację tego szczepu w ośrodku hodowli i dodaje się do tego ośrodka hodowli kwas 3'-karboksymetylotiopropionowy albo jego sól lub ester uzyskując odpowiednio kwas 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-6-aminopenicylanowy, 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-6-APA), które zostają powiększone in situ do 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7-ADCA;

c) wydziela się 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7ADCA z bulionu fermentacyjnego;

d) odacylowuje się 2-(karboksyetylotio)acetylo- i 3-(karboksymetylotio)propionylo-7ADCA; oraz

e) wydziela się krystaliczny 7-ADCA.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze szczep Penicillium chrysogenum transformuje się genem ekspandazy pod transkrypcyjną i translacyjną kontrolą sygnałów ekspresji genu acylotransferazy.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etap (e) stanowi etap filtracji
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze w etapie (c) przeprowadza się filtrację oraz ekstrakcję przesączonego bulionu rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszającym się z wodąprzy pH poniżej około 4,5, a następnie ekstrakcję wodą przy pH 4-10.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen ekspandazy pochodzący ze Streptomyces clavuligerus lub Nocardia lactamdurans.

* * *