WO2014030774A1 - 酵母用培地 - Google Patents

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WO2014030774A1
WO2014030774A1 PCT/JP2013/073238 JP2013073238W WO2014030774A1 WO 2014030774 A1 WO2014030774 A1 WO 2014030774A1 JP 2013073238 W JP2013073238 W JP 2013073238W WO 2014030774 A1 WO2014030774 A1 WO 2014030774A1
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WO
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medium
yeast
growth
strain
concentration
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PCT/JP2013/073238
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English (en)
French (fr)
Inventor
赤田　倫治
Original Assignee
国立大学法人山口大学
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a yeast culture medium, a yeast culture method for culturing yeast in an aerobic condition using the yeast culture medium, and the like.
  • Medium for culturing organisms such as microorganisms and cultured cells can be roughly classified into two types, rich medium and synthetic medium.
  • the efficiency of microorganism growth and useful substance production is often greatly influenced by the composition of the medium, and the composition of the medium is said to be very important.
  • a culture medium for cultivating microorganisms is composed of a carbon source, a nitrogen source, minerals, vitamins, specific growth factors, etc., but a eutrophic medium is optimal for growth.
  • Synthetic media with known types and concentrations of chemicals are said to never exceed rich media in terms of growth.
  • yeast extract yeast extract
  • peptone casein partial degradation product
  • 2% dextrose glucose
  • YPD medium is mostly used from research level to pilot plant level in general companies.
  • the YPD medium contains natural extract as a composition, the detailed constituent chemical components are unknown, and there are variations in components depending on the production lot. As a result, the biological activity such as growth and fermentability varies depending on the lot. It is said that it may fluctuate greatly.
  • yeast media include yeast nutrient medium containing 3.5-10% (W / V) glucose and 0.8-1.2% (W / V) manganese chloride, 1% (W / V) Agar medium for separation and identification of ethanol-producing high-productivity soy sauce main fermenting yeast strains that do not contain salt as described above (for example, refer to Patent Document 1), and the medium contains casamino acid at a concentration of 20 to 160 g / L.
  • mammalian fibroblasts obtained by adding polyvinylpyrrolidone, ascorbic acid phosphate, lipids and cholesterol to a basic medium containing human recombinant epidermal growth factor and the like
  • a complete synthetic medium for example, see Patent Document 8
  • a serum-free completely synthetic medium for culturing human frozen primary hepatocytes after thawing for example, Patent Document 8 containing glucocorticoid, prolactin, cholera toxin and liver cell growth factor 9 is proposed.
  • chemically defined components of the chemically defined medium include glucose, lactose, fructose, sucrose, maltodextrins, carbohydrates such as starch and inulin; glycerin; vegetable oils; hydrocarbons; Alcohols; carbon sources selected from the group consisting of acetates and organic acids such as higher alkanoic acids; urea; ammonia; nitrates; ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium phosphate and ammonium nitrate; and glutamate and lysine, etc.
  • Fermentation of microbial strains on an industrial scale in a fermentation medium which is a chemically defined medium consisting essentially of chemically distinct constituents, characterized by being a nitrogen source selected from the group consisting of amino acids And recovering useful compounds from the fermentation broth
  • a useful compound comprising the steps of (e.g., see Patent Document 10) it has been proposed.
  • Concerning the growth of yeast it contains a method for promoting yeast growth by adding a complex of lipid and protein to the medium (for example, see Patent Document 11) and a composition for promoting fungal growth containing ⁇ -glucan as an active ingredient.
  • a microorganism growth promoting composition containing a culture medium for example, see Patent Document 12
  • a glucose source and apiose for example, a glucose source and apiose
  • a fungus such as a yeast containing 1 part by mass or more of apiose with respect to 100 parts by mass of glucose Waste molasses for enhancing high sugar dough fermenting power by chemically synthesizing accelerating compositions (for example, see Patent Document 13) and flavonoids identified as factors that promote yeast growth in molasses
  • a yeast culture medium for example, see Patent Document 14 that does not use an origin component has been proposed.
  • An object of the present invention is to provide a medium, preferably a chemically synthesized medium, that imparts a growth ability equal to or higher than that of a YPD medium to yeast.
  • the inventors first focused on the fact that when yeast was cultured in a medium supplemented with ammonium sulfate, which is widely used as a nitrogen source, the pH was remarkably lowered. . As a result, it was possible to produce a culture medium with significantly higher growth than when ammonium sulfate was added. However, since the growth performance comparable to that of the YPD medium could not be achieved, further investigation was continued in order to increase the growth ability not contained in the existing synthetic medium in the yeast extract contained in the YPD medium. We searched for possible useful components, but we could not find a specific factor that significantly increased the proliferation.
  • myo-inositol, MM medium (YNB (containing no amino acid, ammonium sulfate and glucose) (Y2030, “Yeast Nitrogen Base w”) is widely used for yeast culture. / O AA, carbohydrate & w / o AS, Biological, USA) 0.17%, about 0.5 times the amount of ammonium sulfate 0.5% as nitrogen source and glucose 2% as carbon source)
  • YNB containing no amino acid, ammonium sulfate and glucose
  • Y2030 “Yeast Nitrogen Base w”
  • the present invention relates to (1) saccharides as carbon sources that can be assimilated by yeast, amino acids as nitrogen sources, vitamins, inositol, zinc ions (Zn 2+ ), potassium ions (K +). ) And magnesium ions (Mg 2+ ), and the inositol concentration is 50 to 10,000 mg / L, and (2) inositol is a growth-limiting factor (1) (3)
  • a medium (4) the yeast medium according to any one of (1) to (3) above, wherein (4) the amino acid as a nitrogen source contains aspartic acid, and (5) a nitrogen source All amino acids are at least selected from aspartic acid, arginine, lysine, proline, glutamic acid, alanine, isoleucine, phenylalanine, valine, tyrosine, methionine, serine, threonine, glycine, asparagine, glutamine, cysteine, leucine, tryptophan, histidine.
  • the yeast medium according to any one of (1) to (7) above, which is not contained (9)
  • the yeast medium according to any one of (1) to (8) above, which does not contain ammonium acetate as a nitrogen source, and (10) vitamins such as biotin, pantothenic acid, niacin A yeast medium according to any one of (1) to (9) above, wherein (11) ⁇ -alanine is included instead of pantothenic acid, wherein at least two types selected from pyridoxine and thiamine are included 1 or 2 selected from glucose, lactose, mannose, fructose, sucrose, maltose, raffinose as a saccharide as a carbon source that can be assimilated by yeast, or (12)
  • the yeast is any one of Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, and Schizosaccharomyces.
  • the present invention relates to (20) an AYD medium for yeast having the medium composition shown in Table 1 below.
  • the present invention also provides (21) a yeast culture method comprising culturing yeast under an aerobic condition in the yeast medium according to any one of (1) to (20) above, (22) (20) It relates to a method for determining the auxotrophy of a yeast by growing the yeast under an aerobic condition in a medium from which a specific component is removed from the AYD medium for yeast described in (20).
  • yeast culture method having high fermentability can be established, and production can be stabilized and costs can be reduced. It can also have a positive impact on the microbiology and fermentation industries, such as the discovery of important factors in yeast culture.
  • FIG. 600 It is a figure which shows the growth property of the yeast in the culture medium which added glucose 2% and polypeptone or a yeast extract to YNB0.17%.
  • the vertical axis represents OD 600 .
  • 2% glucose in YNB0.17% shows a an OD 600 of when cultured yeast in media supplemented with an aspartic acid or ammonium sulfate.
  • the vertical axis represents OD 600 .
  • Is a diagram showing an OD 600 of 24 hours after the culture by the addition of fractionated samples of yeast extract to the medium.
  • the vertical axis represents OD 600 .
  • the medium, the following ingredients were added to the BM medium is a diagram showing an OD 600 of 24 hours after culturing yeast.
  • YPD and YE yeast extract
  • the vertical axis represents OD 600 .
  • A shows the addition result of Acetyl-CoA and CoA
  • RNA yeast RNA
  • c shows the addition result of NAD.
  • glucose in BM medium is a diagram illustrating galactose, raffinose, trehalose, fructose, maltose, mannose, sucrose, ribose, or an OD 600 of 24 hours when DNA were cultured yeast media supplemented with.
  • the vertical axis represents OD 600 .
  • Ethanol BM medium with or without glucose, glycerol was added albumin, a diagram illustrating a an OD 600 of 24 hours after the time of culturing the yeast.
  • A shows the results for ethanol and glycerol
  • (b) shows the results for albumin.
  • the vertical axis represents OD 600 .
  • Is a diagram showing an OD 600 of when cultured yeast in medium supplemented with a mixture of a plurality of sugars to BM medium containing 2% glucose.
  • A The result at the time of adding galactose is shown.
  • (B) shows the result when raffinose or mannose is further mixed and added to 1% of fructose.
  • (C) shows the result when sucrose is further added to 1% of fructose.
  • (D) shows the result when maltose is added. In either case, 2% glucose and YPD were used as controls.
  • the vertical axis represents OD 600 . It is a figure which shows the result of having culture
  • FIG. 1 It is a diagram showing the growth of Saccharomyces cerevisiae RAK3599 strain due to the difference in the concentration of KH 2 PO 4 contained in SynAA medium.
  • the growth of Saccharomyces cerevisiae RAK3599 is shown when 0.1% KCl is added after 20 hours to the medium in which 0.1% NaH 2 PO 4 is added instead of KH 2 PO 4.
  • FIG. Due to the difference in the concentration of MgSO 4 contained in SynAA medium is a diagram showing the growth of Saccharomyces cerevisiae RAK3599 strain. Due to the difference in the MgCl 2 concentration contained in SynAA medium is a diagram showing the growth of Saccharomyces cerevisiae RAK3599 strain.
  • (B) It is a figure which shows the growth property of Saccharomyces cerevisiae RAK3599 strain
  • Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain (leu2 ⁇ 0 ura3 ⁇ 0 his3 ⁇ 1 met15 ⁇ 0), BY4700 strain (ura3 ⁇ 0), BY4712 strain (leu2 ⁇ 0), BY4714 strain (his3 ⁇ 1), BY4725 + URA3 strain (A2D0A culture medium with A4D) .
  • FIG. 41 (a) shows the results of confirming the effects by dividing the amino acids into five groups and removing each group from the medium.
  • FIG. 41 (b) shows the results of studying individual amino acid components of the AY5 group, in which the proliferation was confirmed to be significantly reduced.
  • Biotin, pantothenic acid, zinc, and pyridoxine are studied in (a), and thiamine, iron, and nicotinic acid (niacin) are studied in (b). It is the figure which showed the auxotrophy of the Kurbeiromyces marxianus NCYC587 strain
  • Pantothenic acid, pyridoxine, thiamine, and zinc are studied in (a), and biotin, iron, and nicotinic acid (niacin) are studied in (b). It is the figure which showed the auxotrophy of the Kurbeiromyces marxianus NCYC2791 strain
  • Biotin, iron and nicotinic acid (niacin) are studied in (a), and pantothenic acid, pyridoxine, thiamine and zinc are studied in (b). It is the figure which showed the auxotrophy of Pichia stipitis NBRC10063 strain. Biotin, iron and nicotinic acid (niacin) are studied in (a), and pantothenic acid, pyridoxine, thiamine and zinc are studied in (b). It is the figure which showed the auxotrophy of Candida glabrata BY23876 strain.
  • Biotin, pantothenic acid, zinc and pyridoxine are studied in (a), and thiamine, iron and nicotinic acid (niacin) are studied in (b). It is the figure which showed the auxotrophy of Candida utilis JCM9624 strain. Biotin, pantothenic acid, zinc and pyridoxine are studied in (a), and thiamine, iron and nicotinic acid (niacin) are studied in (b). It is the figure which showed the auxotrophy of Candida albicans JCM1542 strain. Biotin, pantothenic acid, zinc, and pyridoxine are studied in (a), and thiamine, iron, and nicotinic acid (niacin) are studied in (b). The results of culturing Saccharomyces cerevisiae and Klubeiromyces marxianus using SD medium, YPD medium and the medium of the present invention and comparing the proliferative properties are shown in (a) and (b).
  • the yeast medium of the present invention includes a saccharide as a carbon source that can be assimilated by the yeast, amino acids as a nitrogen source, vitamins, inositol, zinc ions, K + And Mg 2+ And the inositol concentration is 50 to 10,000 mg / L.
  • the growth of the bacteria means a phenomenon that the number of bacteria increases in the present invention, and is an indicator of the growth of the bacteria.
  • optical turbidity (OD: Optical Density) of the culture solution can be mentioned.
  • the wavelength for measuring OD can be appropriately determined depending on the sample, measuring device, and measuring method. 600 Can be preferably mentioned.
  • the method for measuring OD can be measured by using a spectrophotometer after diluting a culture solution after a certain period of time if necessary by an ordinary method, or by an automatic measuring instrument.
  • the method for determining the growth by using a specific automatic measuring instrument is superior in that an accurate growth curve in the logarithmic growth phase can be obtained continuously, but the measurement is performed without diluting the culture solution.
  • Eg OD 600 If the value of exceeds the measurement capability of the measuring instrument, it may be impossible to obtain an accurate record of the growth curve.
  • the yeast culture medium of the present invention preferably has a growth curve in the logarithmic growth phase that is very similar to or equivalent to the slope of the growth curve in the YPD medium, or exceeds the slope of the growth curve in the YPD medium.
  • YPD medium is 65% or more, preferably 70% or more, preferably 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, Even more preferably, a medium of 100% or more is preferred.
  • the growth rate of yeast after 24 hours of Saccharomyces cerevisiae RAK3599 was determined as OD. 600
  • the medium that is 80% or more, preferably 90% or more of the YPD medium can be preferably exemplified, and among them, the AYD medium shown in Table 1 above can be particularly suitably exemplified.
  • the yeast is not particularly limited as long as it belongs to the yeast taxonomically.
  • the genus Debaryomyces, the genus Hansenula, the genus Candida, the genus Kluyveromyces, Metschnikowia, Nematospora, Pichia, Saccharomyces, Saccharomyces, Sccharomyces, Sccharomyces Trichosporon, Torulops s), Rhodotorula, Yarrowia and the like and more specifically, C. albicans, C. utilis, Candida C. glabrata, C. bodiniii, C. tropicalis, C. lipolytica, C. flavori Candida Candida yeast such as C.
  • Devariomyces yeast such as D. hansenii, Hansenula anomala (H. a omala) and other yeast of the genus Hansenula, K. africanus, K. lactis, K. marxianus, Kluyveromyces Yeast of the genus Kluyveromyces such as K. phaseolosporus, Yeast of the genus Michinicovia such as M. pulcherrima, P. stititis P. farinosa (P. farinosa) ), Yeasts belonging to the genus Pichia such as P. pastris, P. anomala, R. minuta, R. mutraginosa (R.
  • Rhodotorula yeast such as Saccharomyces kudriavzevy (S. kudriavzevii), S. cerevisiae, S. douglasii, S. ansbergusgenis, S. carsbergensis, S. carp. Saccharomyces Bayanus (S. Bayanus), Saccharomyces manzini (S. manginini), Saccharomyces mikatae (S. mikatae) and other yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Swaniomyces albius (S. alluvius), Shuwaniomyces (S.
  • yeasts of the genus Schwaniomyces such as S. castellii
  • yeast of the genus Saccharomycodes such as S. ludwigi
  • Nematospora such as N. coryli Yeast
  • yeasts of the genus Schizosaccharomyces such as S. pombe
  • yeasts of the genus Trichosporon such as T. pullulans, T. penicillatum
  • Yarrowia Sacharomyco Examples include Yarrowia (saccharomycopsis) lipolytica, and these yeast mutants are also included.
  • yeast mutant strain examples include yeast mutant strains that exhibit the same level of growth as the yeast mutant strain compared to the RAK3599 strain when cultured in the medium of the present invention.
  • yeast mutant strain means a yeast or a population of yeast in which mutation has occurred, and is not limited to those in which mutation has occurred in one gene, but also includes multiple yeast mutant strains in which mutation has occurred in a plurality of genes.
  • the mutation may be a mutation that induces mutation such as UV irradiation or ethyl methane sulfonate (EMS) treatment, or may be a natural mutation, or a mutation is generated using a gene recombination technique. It may be the case.
  • yeast mutants examples include auxotrophic yeast strains, and examples of the auxotrophic yeast include histidine, leucine, lysine, tryptophan, uracil, and / or adenine auxotrophic yeast strains (Brachmann et al.). al., Yeast, Vol. 14, 115-132, 1998, etc.).
  • the saccharide as a carbon source used in the medium composition is not particularly limited as long as it is a saccharide that can be assimilated in the yeast.
  • monosaccharides such as glucose, lactose, mannose, fructose, galactose
  • disaccharides such as sucrose, maltose and lactose
  • trisaccharides such as raffinose, among which glucose is particularly preferable.
  • One or a combination of two or more of these saccharides can be added.
  • the amount added to the culture medium of the present invention at the time of use of the saccharide can be appropriately determined within a range that does not impair the effect of the yeast culture medium of the present invention and / or cost.
  • the final concentration of saccharide as a carbon source is preferably 1 to 200 g / L, more preferably 5 to 100 g / L, still more preferably 10 to 50 g / L, and particularly preferably 15 to 25 g / L.
  • the amino acid (s) as the nitrogen source contained in the medium of the present invention is not particularly limited as long as it is an amino acid or a derivative thereof, or a salt thereof that does not inhibit the growth of the yeast.
  • aspartic acid Aspartic acid (Asp), arginine (Arg), lysine (Lys), proline (Pro), glutamic acid (Glu), alanine (Ala), methionine (Met), serine (Ser), threonine (Thr), glycine (Gly), asparagine (Asn), Isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Phenylalanine (Phe), Valine (Val), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr), Glutamine (Gln), Histidine (His), Cysteine (Cys) 20
  • Bets can be, these amino acids, respectively L- body is preferred.
  • amino acid salts examples include L-aspartic acid sodium salt monohydrate, L-aspartic acid potassium salt, aspartic acid salt such as L-aspartic acid magnesium salt, arginine salt such as L-arginine monohydrochloride, L -Lysine salts such as lysine hydrochloride, glutamate such as L-glutamic acid monosodium salt, asparagine salts such as L-asparagine monohydrate, derivatives of tyrosine such as acetyltyrosine, cysteine hydrochloride monohydrate Examples include cysteine salts such as histidine and histidine salts such as histidine hydrochloride monohydrate.
  • the amount of each amino acid as the nitrogen source added to the culture medium of the present invention can be appropriately determined within a range that does not impair the effects of the yeast culture medium of the present invention and / or cost.
  • the final concentration of the total amount of amino acids when added to the medium is preferably 1 to 100 g / L, more preferably 10 to 50 g / L, further preferably 20 to 40 g / L, and particularly preferably 25 to 35 g / L. .
  • the content of individual amino acids will be described.
  • the concentration of aspartic acid in the yeast culture medium of the present invention is preferably 0.1 to 10 g / L, more preferably 0.5 to 8 g / L, and more preferably 3 to 7 g, for example, in terms of sodium aspartate monohydrate. / L is more preferable, and 4 to 6 g / L is particularly preferable.
  • the concentration of arginine in the yeast culture medium of the present invention is, for example, preferably 1 to 50 g / L, more preferably 5 to 20 g / L, further preferably 8 to 12 g / L, and more preferably 9 to 11 g in terms of arginine monohydrochloride. / L is particularly preferred.
  • the concentration of lysine in the yeast culture medium of the present invention is preferably 0.1 to 5 g / L, more preferably 0.5 to 3 g / L, and more preferably 0.7 to 2 g / L, for example, in terms of lysine monohydrochloride. Further preferred is 0.8 to 1.2 g / L.
  • the concentration of proline in the yeast medium of the present invention is preferably 0.1 to 5 g / L, more preferably 0.5 to 3 g / L, further preferably 0.7 to 2 g / L, and 0.8 to 1 .2 g / L is particularly preferred.
  • the concentration of glutamic acid in the yeast medium of the present invention is preferably 0.1 to 5 g / L, more preferably 0.5 to 3 g / L, and more preferably 0.7 to 2 g / L, for example, in terms of glutamic acid monosodium salt hydrate. L is more preferable, and 0.8 to 1.2 g / L is particularly preferable.
  • the concentration of alanine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.1 to 5 g / L, more preferably 0.5 to 3 g / L, still more preferably 0.7 to 2 g / L, and 0.8 to 1 .2 g / L is particularly preferred.
  • the concentration of isoleucine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.1 to 5 g / L, more preferably 0.5 to 3 g / L, further preferably 0.7 to 2 g / L, and 0.8 to 1 .2 g / L is particularly preferred.
  • the concentration of phenylalanine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.1 to 5 g / L, more preferably 0.5 to 3 g / L, still more preferably 0.7 to 2 g / L, and 0.8 to 1 .2 g / L is particularly preferred.
  • the concentration of valine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.1 to 5 g / L, more preferably 0.5 to 3 g / L, further preferably 0.7 to 2 g / L, and 0.8 to 1 .2 g / L is particularly preferred.
  • the concentration of tyrosine in the yeast culture medium of the present invention is preferably 0.1 to 5 g / L, for example 0.5 to 3 g / L in terms of N-acetyltyrosine (hereinafter also simply referred to as “acetyltyrosine”). More preferably, 0.7 to 2 g / L is more preferable, and 0.8 to 1.2 g / L is particularly preferable.
  • the concentration of methionine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.01 to 1 g / L, more preferably 0.02 to 0.5 g / L, still more preferably 0.05 to 0.2 g / L, and 0 0.08 to 0.12 g / L is particularly preferable.
  • the concentration of serine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.01 to 5 g / L, more preferably 0.1 to 2 g / L, still more preferably 0.2 to 1.2 g / L, and 0.3 -0.7 g / L is particularly preferred.
  • the concentration of threonine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.01 to 5 g / L, more preferably 0.1 to 2 g / L, still more preferably 0.2 to 1.2 g / L, and 0.3 -0.7 g / L is particularly preferred.
  • the concentration of glycine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.01 to 1 g / L, more preferably 0.02 to 0.5 g / L, still more preferably 0.05 to 0.2 g / L, and 0 0.08 to 0.12 g / L is particularly preferable.
  • the concentration of asparagine in the yeast culture medium of the present invention is preferably 0.01 to 5 g / L, more preferably 0.1 to 2 g / L, and more preferably 0.2 to 1.2 g, for example, in terms of asparagine monohydrate. / L is more preferable, and 0.3 to 0.7 g / L is particularly preferable.
  • the concentration of glutamine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.1 to 7.5 g / L, more preferably 0.5 to 7 g / L, still more preferably 3 to 6.5 g / L, and more preferably 4 to 6 g. / L is particularly preferred.
  • the concentration of cysteine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.001 to 0.08 g / L, more preferably 0.005 to 0.05 g / L, more preferably 0.001 to 0.08 g / L in terms of cysteine hydrochloride monohydrate. It is more preferably from 0075 to 0.025 g / L, particularly preferably from 0.008 to 0.012 g / L.
  • the concentration of leucine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.1 to 5 g / L, more preferably 0.5 to 3 g / L, further preferably 0.7 to 2 g / L, and 0.8 to 1 .2 g / L is particularly preferred.
  • the concentration of tryptophan in the yeast medium of the present invention is preferably 0.01 to 1 g / L, more preferably 0.02 to 0.5 g / L, still more preferably 0.05 to 0.2 g / L, and 0 0.08 to 0.12 g / L is particularly preferable.
  • the concentration of histidine in the yeast medium of the present invention is preferably 0.01 to 1 g / L, more preferably 0.02 to 0.5 g / L in terms of histidine monohydrochloride monohydrate, 0.05 It is more preferably from 0.2 to 0.2 g / L, particularly preferably from 0.08 to 0.12 g / L.
  • amino acid added as the nitrogen source to the yeast culture medium of the present invention is one kind, it is preferable to add aspartic acid.
  • two amino acids are added to the yeast culture medium of the present invention as amino acids as the nitrogen source, aspartic acid and glutamic acid, aspartic acid and arginine, aspartic acid and lysine, aspartic acid and proline, or aspartic acid And alanine, aspartate and isoleucine, aspartate and phenylalanine, aspartate and valine, aspartate and tyrosine, aspartate and methionine, aspartate and serine, aspartate and threonine, aspartate and glycine 19 combinations of aspartic acid and asparagine, aspartic acid and glutamine, aspartic acid and cysteine, aspartic acid and leucine, aspartic acid and tryptophan, aspartic acid and histidine, etc.
  • amino acids aspartic acid, arginine, lysine, proline, glutamic acid, alanine, isoleucine, phenylalanine, valine, tyrosine, methionine, serine, threonine, glycine, asparagine, glutamine, cysteine, leucine, tryptophan, It is preferable that at least three kinds selected from histidine are included.
  • the at least three amino acids selected as the nitrogen source include aspartic acid, glutamic acid and arginine, aspartic acid and glutamic acid and alanine, aspartic acid and glutamic acid and leucine, aspartic acid and glutamic acid and isoleucine, aspartic acid and Glutamic acid and cysteine, aspartic acid and arginine and alanine, aspartic acid and arginine and leucine, aspartic acid and arginine and isoleucine, aspartic acid and arginine and valine, aspartic acid and arginine and glutamine, aspartic acid and arginine Cysteine, aspartic acid and arginine and asparagine, aspartic acid and arginine and tyrosine, aspartic acid and lysine and leucine, aspartic acid and rigid And isoleucine, aspartic acid and lysine and valine, aspartic acid and lysine and glutamine,
  • Acid arginine and alanine and methionine, arginine and leucine and tyrosine, arginine and isoleucine and threonine, alanine and valine and serine, arginine and phenylalanine and glutamine, arginine and proline and cysteine, arginine and asparagine
  • a combination including at least 1140 three kinds of amino acids such as glutamine can be given.
  • nucleic acid such as uracil, adenine, guanine, cytosine, thymine, or derivatives thereof, or their derivatives, as long as the growth of the yeast is not inhibited.
  • these salts can be further added in combination of one or two or more.
  • the derivative include adenine hemisulphate as an adenine derivative.
  • concentration of each nucleic acid in the yeast medium of the present invention is preferably 0.01 to 1 g / L, more preferably 0.02 to 0.5 g / L, still more preferably 0.05 to 0.2 g / L, 0.08 to 0.12 g / L is particularly preferable.
  • the nitrogen source contained in the yeast culture medium of the present invention is preferably a nitrogen source that suppresses an excessive decrease in the pH of the culture medium accompanying the yeast culture and can maintain the growth of the yeast. It is preferable not to contain ammonium ions such as ammonium and ammonium acetate as a nitrogen source that yeast can assimilate.
  • the vitamins contained in the yeast culture medium of the present invention are not particularly limited as long as they are vitamins or derivatives thereof, or salts thereof that do not inhibit the growth of the yeast.
  • biotin, pantothenic acid, niacin, pyridoxine , Thiamin and the like, and pantothenic acid or a derivative thereof, or a salt thereof can be exemplified by calcium pantothenate, sodium pantothenate, panthenol, etc., and niacin or a derivative thereof, or a salt thereof Nicotinic acid, nicotinic acid amide, nicotinic alcohol and the like, and as thiamine derivatives, thiamine hydrochloride, thiamine nitrate, bisthiamine nitrate, thiamine dicetyl sulfate ester salt, fursultiamine hydrochloride, octothiamine, Exemplified photiamine Rukoto can, pyridoxine or a derivative thereof, or as their salts, pyridoxine hydrochloride, pyridoxal (pyridoxal phosphate), can be exemplified
  • the vitamins are preferably contained in two or more types, more preferably in three or more types, and even more preferably in four or more types.
  • yeast belongs to the genus Saccharomyces
  • the above vitamins include biotin, pantothenic acid, biotin, pantothenic acid and niacin, biotin, pantothenic acid and pyridoxine, biotin, pantothenic acid and thiamine, biotin, pantothenic acid, niacin and Examples include pyridoxine, biotin, pantothenic acid, niacin and thiamine, biotin, pantothenic acid, pyridoxine and thiamine, and combinations including biotin, pantothenic acid, niacin, pyridoxine and thiamine.
  • biotin, pantothenic acid and niacin biotin, pantothenic acid, niacin and pyridoxine, biotin, pantothenic acid, niacin and thiamine, biotin, pantothenic acid, A combination containing iacin, pyridoxine and thiamine can be mentioned, and when yeast belongs to the genus Candida, a combination containing one or more selected from pyridoxine, biotin, pantothenic acid, thiamine and niacin as the above vitamins Can be mentioned.
  • the amount of each vitamin added when used in the medium of the present invention can be appropriately determined within a range that does not impair the effect of the medium for yeast of the present invention and / or cost. Can be illustrated as follows.
  • the concentration of pantothenic acid in the medium of the present invention is preferably 10 to 50000 ⁇ g / L, more preferably 100 to 25000 ⁇ g / L, further preferably 1000 to 7500 ⁇ g / L, and particularly preferably 3000 to 5000 ⁇ g / L.
  • the concentration of niacin (nicotinic acid) in the medium of the present invention is preferably 10 to 50000 ⁇ g / L, more preferably 100 to 25000 ⁇ g / L, further preferably 1000 to 7500 ⁇ g / L, and particularly preferably 3000 to 5000 ⁇ g / L.
  • the concentration of pyridoxine in the medium of the present invention is preferably 1 to 5000 ⁇ g / L, more preferably 10 to 2500 ⁇ g / L, still more preferably 100 to 750 ⁇ g / L, and particularly preferably 300 to 500 ⁇ g / L.
  • the concentration of thiamine in the medium of the present invention is preferably 1 to 5000 ⁇ g / L, more preferably 10 to 2500 ⁇ g / L, further preferably 100 to 750 ⁇ g / L, and particularly preferably 300 to 500 ⁇ g / L.
  • Examples of the amount of biotin used in the medium of the present invention include 0.02 to 150 ⁇ g / L, preferably 0.2 to 20 ⁇ g / L, and more preferably 0.5 to 10 ⁇ g / L. 1 to 5 ⁇ g / L is more preferable, and 1.5 to 3 ⁇ g / L is particularly preferable.
  • Inositol in the culture medium of the present invention is myo-inositol, and when added in an effective amount, a growth curve in the logarithmic growth phase equivalent to that of YPD can be obtained, so that it is added as a growth limiting factor in the present invention.
  • the concentration of myo-inositol in the medium of the present invention is 50 to 10,000 mg / L, preferably 100 to 7500 mg / L, more preferably 500 to 5000 mg / L, still more preferably 750 to 3000 mg / L, and 1000 ⁇ 2500 mg / L is particularly preferred.
  • metal ions added to the medium of the present invention include zinc ions (Zn 2+ As long as it is a metal ion that does not inhibit the growth of the yeast, other metal ions can be added as appropriate. As such other metal ions, specifically, iron ions (Fe 3+ And / or Fe 2+ ). Zn 2+ Specifically, zinc sulfate (ZnSO 4 Zn in the culture medium of the present invention. 2+ The concentration of ZnSO 4 In terms of conversion, 1 to 5000 ⁇ g / L is preferable, 50 to 1000 ⁇ g / L is more preferable, 100 to 750 ⁇ g / L is more preferable, and 300 ⁇ g / L to 500 ⁇ g / L is particularly preferable.
  • Fe 3+ Specifically, ferric chloride (FeCl 3 ) In the medium of the present invention. 3+
  • FeCl 3 In terms of (anhydride) 1 ⁇ g / L to 500000 ⁇ g / L can be mentioned, preferably 200 to 40000 ⁇ g / L, more preferably 500 to 10000 ⁇ g / L, still more preferably 1000 to 7500 ⁇ g / L, and 3000 to 5000 ⁇ g / L. L is particularly preferred.
  • the above Fe 2+ As FeSO 4 Anhydrides and hydrates of FeCl 2 Anhydrides and hydrates of The inorganic ion contained in the medium of the present invention is not particularly limited as long as it is an inorganic ion that does not inhibit the growth of the yeast, but potassium ion (K + ) And magnesium ions (Mg 2+ ) Is mandatory.
  • K above + Specifically, dipotassium hydrogen phosphate (K 2 HPO 4 ), Potassium dihydrogen phosphate (KH) 2 PO 4 ), Potassium chloride (KCl), which can be used alone or in combination.
  • K in the medium of the present invention + As the concentration of, for example, KH 2 PO 4
  • 0.1 to 10 g / L is preferable, 0.1 to 5 g / L is more preferable, 0.5 to 2.5 g / L is more preferable, and 0.8 to 1.2 g / L is particularly preferable.
  • Mg 2+ Specifically, it can be added as magnesium sulfate heptahydrate, magnesium chloride hexahydrate, magnesium citrate, magnesium hydrogen phosphate, potassium magnesium chloride, and these can be used alone. In addition, a plurality of them can be mixed and used.
  • Mg in the medium of the present invention 2+ The concentration is preferably 0.01 to 5 g / L, more preferably 0.1 to 2 g / L, still more preferably 0.2 to 1.2 g / L, in terms of magnesium sulfate heptahydrate, 0.3 to 0.7 g / L is particularly preferable.
  • corn steep liquor, yeast extract, polypeptone, meat extract and the like can be added as necessary in the medium of the present invention when emphasizing the enhancement of yeast growth.
  • a medium that does not contain these yeast extract, corn steep liquor, polypeptone, meat extract and the like in terms of the medium can advantageously enjoy the effects of the present invention.
  • the form of the medium of the present invention may be a liquid medium or a solid medium to which a polysaccharide such as agar is added, depending on the amount of bacteria, operability and the like.
  • a liquid medium in order to enhance the growth of yeast, it is preferable to culture under an aerobic condition where oxygen is supplied.
  • a specific method may be used. Examples include shaking culture, aeration and agitation culture, or aerobic rotation culture. High growth properties can be exhibited depending on the growth temperature of each bacterial species. Preferred growth temperatures are 25 to 35 ° C. for Saccharomyces, 25 to 35 ° C. for Candida yeast, and Kluyvero.
  • yeast of the genus Myces examples include 25 to 45 ° C., 25 to 35 ° C. for the yeast of the genus Pichia, and 25 to 35 ° C. for the yeast of the genus Schizosaccharomyces.
  • the amount of yeast added to the medium of the present invention is preferably 1 to 10% (V / V) from the viewpoints of culture operability, growth rate, final concentration arrival time, and the like. However, it is not limited to this range, and depending on the raw material used and purpose, it can be cultured at a higher or lower concentration.
  • concentration setting and necessary component examination data are not limited to the following description, but there are enormous amounts due to the process of trial and error, but only the data necessary to explain the invention-specific matters of the present invention is described. did. 8 to 20 and 22 to 52, the vertical axis represents OD. 600 Indicates.
  • Saccharomyces cerevisiae RAK3599 Saccharomyces cerevisiae RAK2683, Saccharomyces cerevisiae BY4741 (leu2 ⁇ 0 ura3 ⁇ 0 his3 ⁇ 1 met15 ⁇ 0)
  • Saccharomyces cerevisiae BY4700 BY4714 strain his3 ⁇ 1
  • Saccharomyces cerevisiae BY4725 + URA3 strain ade2 ⁇ :: hisG
  • Saccharomyces cerevisiae BY4710 strain Trp ⁇ 63
  • Schizosaccharomyces pombe FY7507 strain Tigosaccharomyces rus7Racromyces RAK5576 , NCYC1429 (RAK3685) Co., Ltd., and NCYC2791 (RAK3686) Ltd.
  • 10% of the yeast extract is divided into a substance having a molecular weight of 5000 or less (M ⁇ 5000) and a substance having a molecular weight of 5000 or more (M> 5000).
  • M ⁇ 5000 a substance having a molecular weight of 5000 or less
  • M> 5000 a substance having a molecular weight of 5000 or more
  • Acetyl-CoA, CoA, yeast RNA (RNA), and NAD are selected as substances having a molecular weight of about 500 ⁇ M ⁇ 1000, and each is added to BM medium. After culturing yeast RAK2683 strain for 24 hours, OD 600 was measured. In addition, the yeast extract (YE) addition culture medium and the YPD culture medium were used as positive controls. The results are shown in FIGS. 4 (a) to (c).
  • Acetyl-CoA, CoA, yeast RNA, and NAD were all at the same level of growth in BM medium, and did not play a significant role as a growth factor, not reaching the growth level of YPD. At this stage, the study of the growth factor contained in the yeast extract was stopped.
  • Study 4 [Investigation of carbon sources] In a BM medium, instead of glucose, 2% each of sugars such as galactose, raffinose, trehalose, fructose, maltose, mannose, sucrose, ribose, or DNA (negative control) were added. OD after incubation for 24 hours at 28 ° C 600 was measured. The results are shown in FIG.
  • yeast RAK2683 strain was cultured for 24 hours in a BM medium supplemented with 0.1-2% albumin and then OD. 600 was measured. The results are shown in FIG.
  • FIG. 8 shows the results of culturing in the medium lacking one of the three component mixes of (Ion).
  • the medium lacking vitamin mix or inorganic ion mix (SynAA-V or SynAA-Ion)
  • no growth was observed.
  • the culture medium lacking the metal ion mix (SynAA-M) was significantly poorer in proliferation than YPD.
  • RAK3599 strain (hereinafter also simply referred to as “RAK3599 strain”), which is a strain of Saccharomyces cerevisiae that does not have special auxotrophy. After this, unless otherwise specified, rotate the culture at 28 ° C for an appropriate time, and 600 Proliferation was examined by measuring.
  • KH contained in SynAA medium 2 PO 4 was adjusted to 0%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, and 1%, respectively, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. Although not shown in FIG. 10, the OD of the 1/100 solution after 42 hours 600 Were 0.02, 0.02, 0.03, 0.11, 0.13, and 0.14, respectively. KH 2 PO 4 OD at a concentration of 0.1% to 1% 600 Reached the maximum. (Na ion) In SynAA medium, KH 2 PO 4 Instead of 0.1% NaH 2 PO 4 (Product No.
  • OD of 1/100 solution after 42 hours 600 are 0.02, 0.04, 0.09, 0.12, 0.13, and 0.13, respectively, and MgSO 4
  • concentration reached a maximum at 0.01% to 1%.
  • MgCl contained in SynAA medium 2 was adjusted to 0.001%, 0.01%, 0.1%, and 1%, respectively, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. MgSO 4 Similarly, the maximum value is reached at 0.01% to 1%, Mg 2+ Has an effect on proliferative but SO 4 2- And Cl ⁇ It was considered that there was no particular difference in.
  • a formulation of medium composition (AKD medium) that is considered to be highly proliferative was created once.
  • a formulation example of AKD is as follows.
  • Saccharomyces cerevisiae RAK3599 strain and Saccharomyces cerevisiae NCYC3233 strain the growth properties in AKD medium and YPD medium were compared. The results are shown in FIG. Although the growth curve of the YPD medium was considerably close, the growth of the YPD medium was higher. Therefore, the composition of the medium was continuously examined, and amino acids were first examined.
  • FIG. 16 (b) shows the results of a similar experiment performed using Saccharomyces cerevisiae RAK3599 strain.
  • concentration of leucine is preferably about 0.1%.
  • Hetidine-requiring strain The concentration of histidine contained in the AKD medium was adjusted to 0.001%, 0.01%, 0.1%, and 1%, respectively, and the growth of the Saccharomyces cerevisiae histidine-requiring BY4714 (his3 ⁇ 1) strain was examined. The results are shown in FIG. The maximum value was reached at 0.01% to 1%. OD of 1/100 solution after 42 hours 600 Were 0.07, 0.18, 0.18, and 0.15, respectively. From the above results, it was found that the concentration of histidine is preferably about 0.01%.
  • the concentration of tryptophan contained in the AKD medium was adjusted to 0.001%, 0.01%, 0.1%, and 1%, respectively, and the growth of the Saccharomyces cerevisiae tryptophan-requiring BY4710 (trp1 ⁇ ) strain was examined. .
  • the results are shown in FIG. OD of 1/100 solution after 48 hours 600 Were 0.08, 0.15, 0.13, and 0.12, respectively. It was confirmed that the proliferation was remarkably increased at 0.01%, and that the proliferation was somewhat inhibited at 0.1%. From the above results, it was found that the tryptophan concentration is preferably about 0.01%.
  • uracil requirements are adjusted to 0.001%, 0.005%, 0.05%, 0.1%, and 0.5%, respectively, by adjusting the concentration of uracil contained in the amino acid mix of AKD medium for convenience.
  • the growth of the sex BY4700 (ura3 ⁇ ) strain was examined. The results are shown in FIG. OD of 1/100 solution after 42 hours 600 Were 0.10, 0.21, 0.21, 0.22, and 0.20, respectively. It was confirmed that the proliferation was low at 0.001%, increased at 0.005%, and significantly increased at 0.05% to 0.1%. It was confirmed that the proliferation was somewhat inhibited at 0.5%.
  • the concentration of uracil is preferably about 0.01%.
  • the concentration of adenine contained in the amino acid mix of the AKD medium for convenience is adjusted to 0%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, and 0.5%, respectively, and Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae The growth property of the siadenine-requiring BY4725 (ade2 ⁇ ) strain was examined. The results are shown in FIG. OD of 1/20 solution after 42 hours 600 Were 4, 15, 18, 18, 13, and 16, respectively. It was confirmed that the proliferation was low at 0, the maximum was 0.01% to 0.05%, and the proliferation was slightly inhibited at 0.1% or more.
  • the concentration of adenine is preferably about 0.01%.
  • (10) Review 10 [AKD 'medium] Based on the above examination results of amino acids, an AKD ′ medium in which the concentrations of leucine, histidine, tryptophan, uracil, and adenine were increased as compared with the AKD medium was prepared as shown in Table 10 below. Each required strain used in Study 9 was cultured at 28 ° C. for 2 days in an AKD ′ agar medium supplemented with 20 g / L of agar (Katayama Chemical Industries, 101-1900). AKD medium was used as a negative control, and YPD medium was used as a positive control. The results are shown in FIG.
  • Biotin, pyridoxine, pantothenic acid, thiamine, nicotinic acid, and inositol were targeted as vitamins.
  • the concentration of biotin contained in the AKD ′ medium was adjusted to 0, 0.02 ng / mL, 0.2 ng / mL, 2 ng / mL, 0.02 ⁇ g / mL, and 0.2 ⁇ g / mL, respectively. It was investigated. The results are shown in FIG. Proliferation was hardly observed when the biotin content was 0, but reached a maximum at 0.2 ⁇ g / L to 20 ⁇ g / L, and it was confirmed that the growth was slightly inhibited at 200 ⁇ g / L.
  • the biotin concentration is preferably about 2 ⁇ g / L.
  • concentration of pyridoxine contained in the AKD ′ medium was adjusted to 0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, 40 ⁇ g / mL, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. Proliferation was observed to some extent even when the pyridoxine content was 0, but the growth increased at 0.04 ⁇ g / mL and reached a maximum at 0.4 ⁇ g / mL to 40 ⁇ g / mL. From these results, it was found that the pyridoxine concentration is preferably about 400 ⁇ g / L.
  • pantothenic acid The concentration of pantothenic acid contained in the AKD ′ medium was adjusted to 0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, 40 ⁇ g / mL, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. When the pantothenic acid content was 0, it was confirmed that the pantothenic acid content was not at all proliferative and at least an essential component in Saccharomyces cerevisiae. It was confirmed that the proliferation increased at 0.04 ⁇ g / mL, reached the maximum at 0.4 ⁇ g / mL to 4 ⁇ g / mL, and that the proliferation was slightly inhibited at 40 ⁇ g / mL.
  • pantothenic acid concentration is preferably about 4000 ⁇ g / L.
  • the concentration of thiamine contained in the AKD ′ medium was adjusted to 0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, and 40 ⁇ g / mL, respectively, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. Proliferation was observed to some extent even when the thiamine content was 0, but reached a maximum at 0.4 ⁇ g / mL to 4 ⁇ g / mL. From these results, it was found that the thiamine concentration is preferably about 400 ⁇ g / L.
  • the nicotinic acid concentration is preferably about 4000 ⁇ g / L.
  • the concentration of myo-inositol contained in the AKD 'medium was adjusted to 0, 0.02 ⁇ g / mL, 0.2 ⁇ g / mL, 2 ⁇ g / mL, 20 ⁇ g / mL, and 200 ⁇ g / mL, respectively, and the growth of the RAK3599 strain was examined. did. The results are shown in FIG. Proliferation increased with increasing inositol content.
  • the concentration of inositol contained in the AKD ′ medium was adjusted to 0, 0.01%, 0.1%, 1%, and 10% (equivalent to 100 g / L), respectively, and the growth of the RAK3599 strain was examined.
  • the results are shown in FIG.
  • the maximum value of 0.01% to 1% exceeds the growth potential of AKD 'that could not be solved so far, and the slope of the growth curve that eliminates the difference from YPD is increased, that is, the line rises (arrow in the figure) ) was confirmed, and the unexpected finding that inositol is the rate-limiting step was obtained.
  • inositol was added at 10%, it was confirmed that the growth ability was lower than that of AKD ′.
  • the concentration of inositol is preferably 50 to 10,000 mg / L.
  • (12) Review 12 [Study of metal ion concentration] Following the inorganic ion concentration, amino acid concentration, and vitamin concentration, the Fe ion concentration, which is a metal ion, was examined. FeCl in AKD 'medium 3 Was adjusted to 0, 0.002, 0.02, 0.2, 2, and 20 ⁇ g / mL, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. Further, although not clearly shown in FIG. 28, the ODs after 24 hours were 10, 9, 11, 10, 13, and 14. High proliferation was exhibited at 2 to 20 ⁇ g / mL.
  • the concentration is preferably about 4000 ⁇ g / L. (13) Review 13 [AID medium] (Medium A of the present invention)
  • the medium 1 (AID medium) of the present invention in which the added amount of iron, pantothenic acid, inositol and the like was increased as compared with the AKD ′ medium.
  • a prescription example of the AID medium is as follows. (Study on AID medium) As shown below, various amino acid concentrations in AID medium and the possibility of substituting pantothenic acid for amino acids were examined. YPD medium was appropriately used as a control.
  • Tyrosine Tyrosine has low solubility and has been studied at a concentration of 0.01 g / L so far.
  • acetyltyrosine (aY) was used instead of tyrosine.
  • acetyltyrosine was used as a tyrosine derivative and that the acetyltyrosine concentration was preferably about 1 g / L.
  • the concentration of alanine in the AID medium (aY-AID medium) supplemented with 1 g / L acetyltyrosine was adjusted to 0, 0.1, 1, 5, 10 mg / mL, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. Although not clearly shown in FIG. 31, the OD after 24 hours 600 Were 17, 18, 18, 17, 18 respectively. From these results, it was determined that the slope of the growth curve was the largest when the alanine content was about 1 mg / mL.
  • the concentration of isoleucine in the aY-AID medium was adjusted to 0, 0.01 mg / mL, 0.1 mg / mL, 0.5 mg / mL, and 1 mg / mL, respectively, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. Although not clearly shown in FIG. 32, the OD after 24 hours 600 Were 16, 17, 16, 17, and 19, respectively. From these results, it was found that the isoleucine content is preferably about 1 g / L.
  • the OD after 24 hours 600 Were 16, 15, 15, 16, and 16, respectively. From these results, it was found that the valine content is preferably about 1 g / L.
  • Serine The concentration of serine in the AID medium was adjusted to 0, 0.01 mg / mL, 0.1 mg / mL, 0.5 mg / mL, and 1 mg / mL, respectively, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. From the results of FIG. 35, it was confirmed that the proliferation property was particularly increased when the serine content was around 0.5 mg / mL. From these results, it was found that the serine content is preferably about 0.5 g / L.
  • the concentration of threonine in the AID medium was adjusted to 0, 0.01, 0.1, 0.5, and 1 mg / mL, respectively, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. It was confirmed that the proliferation was particularly increased when the threonine content was around 0.5 mg / mL. From these results, it was found that the threonine content is preferably about 0.5 g / L.
  • the concentration of asparagine in the AID medium was adjusted to 0, 0.01, 0.1, 0.5, and 1 mg / mL, respectively, and the growth of the RAK3599 strain was examined. The results are shown in FIG. Although not clearly shown in FIG.
  • AYD medium (Medium 3 of the present invention)
  • AYD 'medium medium 2 of the present invention
  • a prescription example of AYD ′ is as follows. (Glutamine, cysteine)
  • the concentrations of glutamine and cysteine were examined using Saccharomyces cerevisiae RAK3599 strain. The results are shown in FIG. As a result of trial and error, it was confirmed that when the glutamine concentration was increased to about 10 times the conventional level, it was confirmed that the growth was very good.
  • a highly proliferative yeast medium was completed as an AYD medium (medium 3 of the present invention).
  • AYD medium the Saccharomyces cerevisiae RAK3599 strain was used to divide the amino acids into five groups as shown in Table 14, and the effects were confirmed by removing each group from the medium. The results are shown in FIG. In the medium (AYD-AY5) excluding the serine, threonine, glycine, methionine, and cysteine groups, it was confirmed that the proliferative ability was remarkably reduced. Therefore, individual amino acid components of the AY5 group were examined.
  • AYD medium was compared with YPD medium and MM medium. The results are shown in FIG.
  • the AYD medium showed a growth property very close to that of the YPD medium in both Klubeiromyces and Saccharomyces.
  • Curvairomyces showed higher growth than Saccharomyces, both showed that the growth in AYD medium was higher than that in YPD medium, confirming the effect of the medium of the present invention.
  • Investigation of auxotrophic strains In the AYD medium, auxotrophy was examined for the following various yeast strains, and the usefulness of the AYD medium was confirmed.
  • Various yeast strains were cultured under the same conditions as in the basic culture method. The results are shown in FIGS.
  • Zn 2+ is preferably contained for the growth of this strain (see FIGS. 43 (a) and (b)).
  • the data are shown when the Tigo Saccharomyces RAK5576 strain was cultured for 24 hours.
  • the OD 600 after 24 hours of the lacking AYD medium and YPD medium was 8 to 10, 2, 1, 2, 8, 6 , 5, 9, 5 to 6, respectively.
  • Tigosaccharomyces RAK5576 strain is biotin-requiring and pantothenic acid-requiring. It was also confirmed that Zn 2+ is preferably contained for the growth of this strain (see FIGS. 44 (a) and (b)).
  • the data when each of the Klubeiromyces marxianus NCYC587 (RAK3684) strain, the NCYC1429 (RAK3685) strain, and the NCYC2791 (RAK3686) strain is cultured for 24 hours are shown. Although not clearly shown in FIGS.
  • AYD medium biotin deficient AYD medium, pantothenic acid deficient AYD medium, Zn 2+ deficient AYD medium, pyridoxine deficient AYD medium, thiamine deficient AYD medium, Fe 3+ deficient AYD medium OD 600 after 24 hours of niacin-deficient AYD medium and YPD medium are 35 to 37, 2 to 7, 0 to 4, 12 to 29, 34 to 45, 26 to 50, 13 to 35, and 1 to 6, respectively. 34-44. These bacteria were confirmed to be biotin-requiring, niacin-requiring, and pantothenic acid-requiring. It was also confirmed that Zn 2+ is necessary for the growth of these strains (see FIGS.
  • AYD medium biotin deficient AYD medium, Fe 3+ deficient AYD medium, niacin deficient AYD medium, pantothenic acid deficient AYD medium, pyridoxine deficient AYD medium, thiamine deficient AYD medium, Zn 2+
  • the OD 600 after 24 hours of the lacking AYD medium and the YPD medium was 28-30, 1, 18, 1, 0, 27, 29, 6 , 45, respectively.
  • AYD medium biotin deficient AYD medium, Fe 3+ deficient AYD medium, niacin deficient AYD medium, pantothenic acid deficient AYD medium, pyridoxine deficient AYD medium, thiamine deficient AYD medium, Zn 2+
  • the OD 600 after 24 hours of the lacking AYD medium and YPD medium were 35 to 38, 4, 12, 40, 34, 38, 35, 22, 58, respectively. Pichia stipitis has been confirmed to be biotin-requiring but not pantothenic acid. It was also confirmed that Zn 2+ and iron ions were preferably contained for the growth of this strain (see FIGS. 49 (a) and (b)).
  • Candida glabrata BY23876 strain was confirmed to be biotin-requiring, pyridoxine-requiring, thiamine-requiring, and nicotine-requiring (see FIGS. 50 (a) and (b)).
  • the Candida utilis JCM9624 strain was confirmed to be thiamine-requiring, although not biotin-requiring. It was also confirmed that Zn ions are preferably contained for the growth of this strain (see FIGS. 51 (a) and (b)).
  • the Candida albicans JCM1542 strain was confirmed to be biotin-requiring. It was also confirmed that Zn 2+ is preferably contained for the growth of this strain (see FIGS. 52 (a) and (b)).
  • Saccharomyces cerevisiae and Klubeiromyces marxianus were cultured using an SD medium, a YPD medium, and the medium of the present invention, which have been widely used as a synthetic medium for yeasts, and their growth properties were compared.
  • the results are shown in FIGS. 53 (a) and (b).
  • the medium of the present invention exhibits a growth property close to or equivalent to that of a rich medium, and if the effect of the medium of the present invention is used, it can be said that it provides a medium useful for the fermentation industry and the like.

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Abstract

本発明の課題は、ロットによる成分の濃度にばらつきを排した培地を提供するべく、ＹＰＤ培地と同程度又はそれ以上の増殖能力を酵母に付与する培地、好ましくは化学合成培地を提供することにある。酵母が資化可能な炭素源としての糖類と、窒素源としてのアミノ酸類と、ビタミン類と、イノシトールと、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）と、カリウムイオン（Ｋ＋）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）とが含まれ、かつ、イノシトール濃度が５０～１００００ｍｇ／Ｌである、酵母用培地を提供する。

Description

酵母用培地
　本発明は、酵母用培地や、該酵母用培地で酵母を好気的条件下で培養する酵母の培養方法等に関する。
　微生物や培養細胞等の培養できる生物を培養する培地としては、富栄養培地（Ｒｉｃｈ　ｍｅｄｉｕｍ）と合成培地の２種類に大別される。微生物の増殖や有用物質生産の効率は培地組成によって大きく左右されることも多く、培地組成は非常に重要であるといわれている。通常、微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、ミネラル、ビタミン、特定の増殖因子等で構成されていることが知られているが、富栄養培地が増殖に至適とされ、個々の化学物質の種類と濃度がわかっている合成培地が、増殖性において富栄養培地を超えることはないとされている。
　従来、酵母の培養に用いられる富栄養培地としては、１％のＹｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ（酵母抽出エキス）と２％ペプトン（カゼイン部分分解物）と２％ｄｅｘｔｒｏｓｅ（＝グルコース）とで構成されるＹＰＤ培地が広く用いられているが、コスト的にも高価である。そのため、ＹＰＤ培地は、一般の企業では、研究レベルからパイロットプラントレベルまでの使用が大部分であるとされる。しかし、ＹＰＤ培地は、天然抽出物を組成として含むために詳細な構成化学物質成分が不明であり、製造ロットによる成分のばらつきがあり、その結果として、増殖性や発酵性など生物活性がロットにより大きく変動することがあるといわれている。また、大量発酵製造の際には、安価な廃糖蜜が使用されることがほとんどであるが、近年廃糖蜜についてもコストの上昇傾向がみられ、廃糖蜜に代わる安価な培地が求められている。
　一方、酵母の培養に用いられる合成培地としては、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍにより１９４６年に作製されたＹＮＢ培地（イーストニトロジェンベース）が安価で入手できるため、未だに変異株の栄養要求性の検討等の研究に際しては広く用いられているが、富栄養培地と比べ酵母を培養した場合の増殖速度は遅いため、大規模な発酵生産を行う場合などには利用されておらず、また、構成成分が明確ではあるものの、いかなる構成成分が増殖や発酵においてどのような役割を果たしているかは明確になっていない。その他、０．６７％ＹＮＢ培地ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｗ／ｏ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｆａｔｅに０．５％（ＮＨ４）２ＳＯ４と２％グルコースを添加したＭＭ培地等が実験用合成培地として用いられている。
　その他酵母用培地としては、酵母用栄養培地に３．５~１０％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．８~１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地（例えば、特許文献１参照）や、培地が２０~１６０ｇ／Ｌの濃度のカザミノ酸を含むことを特徴とする、酵母細胞から外来遺伝子生成物を発現させるための培地（例えば、特許文献２参照）や、炭素源としてのペントース及び窒素源としてのアミノ酸が少なくとも配合されていることを特徴とする４−ハイドロキシ−２（又は５）−エチル−５（又は２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノン製造用培地組成物（例えば、特許文献３参照）や、チゴサッカロミセス・ベイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｂａｉｌｉｉ）及びチゴサッカロミセス・ビスポラス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）の酵母のための鑑別又は選択培地であって、例えばミオイノシトール４．０％（ｗ／ｖ）等のビタミン、微量元素、唯一の炭素源及びエネルギー源としてのグルコース及びギ酸、適合した酸−塩基指示薬、及び任意により抗生物質細菌発育阻止剤及び寒天で補足された基礎無機培地を含む培地（例えば、特許文献４参照）や、乳酸合成能力を有する酵母を含む微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地であって、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下含む乳酸製造用培地（例えば、特許文献５参照）や、オレイン酸、乳酸、パルミチン酸、グルタミン酸、クエン酸、カリウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、第二鉄イオン、マンガンイオン、ビオチン、チアミン、ピロドキシン、イノシトール、ニコチンアミド、葉酸、リボフラビン及びコリンイオンから構成される、酵母細胞抽出物を含まない、溶液での酵母発酵培地（例えば、特許文献６参照）や、自動的にｐＨを調整する乾燥粉末培養培地を用いて酵母細胞、植物細胞を含む真核細胞を培養する方法（例えば、特許文献７参照）が提案されている。
　微生物や細胞の増殖用の完全合成培地としては、ヒト組換型上皮細胞増殖因子等を含有する基本培地に、ポリビニルピロリドン、アスコルビン酸リン酸エステル、脂質類及びコレステロールを添加した哺乳動物線維芽細胞用完全合成培地（例えば、特許文献８参照）や、グルココルチコイド、プロラクチン、コレラトキシンおよび肝臓細胞増殖因子を含有する、融解後のヒト凍結初代肝細胞培養用無血清完全合成培地（例えば、特許文献９参照）が提案されている。また、化学的に明確な培地の化学的に明確な構成成分が、グルコース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトデキストリン類、澱粉およびイヌリン等の炭水化物；グリセリン；植物油；炭化水素類；メタノールおよびエタノール等のアルコール類；酢酸塩およびより高級なアルカン酸等の有機酸からなる群から選ばれる炭素源と、尿素；アンモニア；硝酸塩；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩；並びにグルタミン酸塩およびリシン等のアミノ酸類からなる群から選ばれる窒素源であることを特徴とする、本質的に化学的に明確な構成成分からなる化学的に明確な培地である発酵培地において工業的規模で微生物株の発酵を行うこと、および発酵培養液から有用化合物を回収することの各工程を含む有用化合物の生産方法（例えば、特許文献１０参照）が提案されている。
　酵母の増殖に関しては、脂質と蛋白質の複合体を培地に添加する酵母増殖の促進方法（例えば、特許文献１１参照）や、β−グルカンを有効成分として含有する真菌増殖促進用組成物を含有する培地（例えば、特許文献１２参照）や、グルコース供給源およびアピオースを含有する微生物増殖促進組成物であり、グルコース１００質量部に対し、アピオースを１質量部以上含有する酵母等の真菌を含む微生物増殖促進組成物（例えば、特許文献１３参照）や、廃糖蜜中における酵母の増殖を促進する因子として同定されたフラボノイド類を化学合成して添加した、高糖生地発酵力を増強するための廃糖蜜由来成分を用いない酵母培養培地（例えば、特許文献１４参照）等が提案されている。
特許３９０４１８７号公報 特公平７−１０６１４１号公報 特開２００１−１２０２９３号公報 特表２００３−５０１０４７号公報 特開２００８−３０１７６６号公報 特表２００５−５０３７８４号公報 特開２００９−１６５４８５号公報 特開２００６−１５８３８８号公報 特開２００２−２３３３９９号公報 特開２００８−２０００５３号公報 特開２００６−０８１４４６号公報 特開２００９‐１４８２０１号公報 特開２００８‐２４５６０２号公報 特開２００７‐２５２３４２号公報
　高い発酵能を持つパン酵母の探索において、現在一般に使用されているＹＰＤ培地は、ロットにより成分の濃度にばらつきがあり、その結果として、増殖性など生物活性がロットにより大きく変動することが知られている。したがって、ロットごとの結果の相違に検討を要したり、優良ロットを選択するために労力と時間を費やしたりしなければならないという問題があり、ロットによる成分の濃度にばらつきを排した培地の提供が望まれている。
　本発明の課題は、ＹＰＤ培地と同程度又はそれ以上の増殖能力を酵母に付与する培地、好ましくは化学合成培地を提供することにある。
　発明者らは、まず、窒素源として広く用いられている硫酸アンモニウムを添加した培地で酵母を培養すると、ｐＨが顕著に低くなることに着目し、硫酸アンモニウムをアミノ酸に代替して、増殖性を検討した。その結果、硫酸アンモニウムを添加した場合よりも著しく増殖性が高い培地を作製することができた。しかしながら、ＹＰＤ培地に匹敵するほどの増殖性を達成することはできなかったため、さらに検討を続け、ＹＰＤ培地に含まれる酵母抽出液中において、既存の合成培地に含まれていない増殖性を高めるために有用な成分があるのではないかと探索をおこなったが、顕著に増殖性を増大させる特定の因子を見いだすことはできなかった。そこで、既存の化学合成培地から構成成分を１又は２以上ドロップアウトさせることで、特に増殖性に有用と思われる成分を探索し、いくつかの成分が、酵母の増殖にとって必須であることや、いくつかの成分が、酵母の増殖にとって必須ではなく、あるいは悪影響を与えることを確認した。また、ＹＮＢに添加されているマンガン、銅、ホウ酸、ナトリウム、モリブデン、葉酸、ＰＡＢＡ、リボフラビンは、酵母の増殖性には特によい影響を与えることはないということを確認した。しかし、アミノ酸を全く添加しなければ増殖性は落ちるが、アミノ酸を一つずつドロップアウトさせても特に増殖性を減少させるアミノ酸は確認できず、構成成分が組み合わされることにより、酵母の増殖性に貢献するものであろうと推測せざるを得なかった。このように、ＹＰＤと同等の増殖性を有する培地の成分構成を決定することは困難を極めた。しかし、その後も試行錯誤を続け、驚くべきことにｍｙｏ−イノシトールについて、酵母の培養に広く用いられているＭＭ培地（ＹＮＢ（アミノ酸、硫酸アンモニウム、及びグルコースを含まない）（Ｙ２０３０、“Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ＡＡ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　＆　ｗ／ｏ　ＡＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＵＳＡ社製）０．１７％に、窒素源として硫酸アンモニウム０．５％と、炭素源としてグルコース２％を添加した組成）の約５００倍の量を添加したところ、ＹＰＤ培地と同程度の増殖性を示すことを確認した。ｍｙｏ−イノシトールが律速段階となるよう他の構成成分について添加量を検討し、ＹＰＤと同等の増殖性を有する培地を有する成分構成を決定し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、（１）酵母が資化可能な炭素源としての糖類と、窒素源としてのアミノ酸類と、ビタミン類と、イノシトールと、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）と、カリウムイオン（Ｋ＋）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）とが含まれ、かつ、イノシトール濃度が５０~１００００ｍｇ／Ｌである、酵母用培地や、（２）イノシトールが増殖制限因子であることを特徴とする上記（１）記載の酵母用培地や、（３）さらに、窒素源として、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミンから選ばれる１又は２以上の核酸塩基が含まれる上記（１）又は（２）記載の酵母用培地や、（４）窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸が含まれることを特徴とする上記（１）~（３）いずれか記載の酵母用培地や、（５）窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、プロリン、グルタミン酸、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンから選ばれる少なくとも３種類が含まれることを特徴とする上記（１）~（３）のいずれか記載の酵母用培地や、（６）チロシンに代えてアセチルチロシンが含まれることを特徴とする上記（５）記載の酵母用培地や、（７）窒素源として、硫酸アンモニウムを含まないことを特徴とする上記（１）~（６）のいずれか記載の酵母用培地や、（８）窒素源として、塩化アンモニウムを含まないことを特徴とする上記（１）~（７）のいずれか記載の酵母用培地や、（９）窒素源として、酢酸アンモニウムを含まないことを特徴とする上記（１）~（８）のいずれか記載の酵母用培地や、（１０）ビタミン類として、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン、チアミンから選ばれる少なくとも２種類が含まれることを特徴とする上記（１）~（９）のいずれか記載の酵母用培地や、（１１）パントテン酸に代えてβ−アラニンが含まれることを特徴とする上記（１０）記載の酵母用培地や、（１２）酵母が資化可能な炭素源としての糖類として、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラフィノースから選ばれる１又は２以上の糖類が含まれることを特徴とする上記（１）~（１１）のいずれか記載の酵母用培地や、（１３）酵母抽出エキスを含まないことを特徴とする上記（１）~（１２）のいずれか記載の酵母用培地や、（１４）サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の２４時間後の酵母の増殖性をＯＤ６００で表した場合、ＯＤ６００の値が、ＹＰＤ培地の８０％以上であることを特徴とする上記（１）~（１３）のいずれか記載の酵母用培地や、（１５）ＹＰＤ培地の９０％以上であることを特徴とする上記（１４）記載の酵母用培地に関する。
　また、本発明は、（１６）酵母が、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のいずれかに属することを特徴とする上記（１）~（１５）のいずれか記載の酵母用培地や、（１７）酵母がサッカロマイセス属に属し、ビタミン類としてパントテン酸及びビオチンが含まれることを特徴とする上記（１６）記載の酵母用培地や、（１８）酵母がクルベイロマイセス属に属し、ビタミン類としてパントテン酸、ビオチン、及びナイアシンが含まれることを特徴とする上記（１６）記載の酵母用培地や、（１９）酵母がキャンディダ属に属し、ビタミン類としてピリドキシン、ビオチン、パントテン酸、チアミン、及びナイアシンから選ばれる１又は２以上が含まれることを特徴とする上記（１６）記載の酵母用培地に関する。
　さらに本発明は、（２０）以下の表１に示される培地組成を有する酵母用ＡＹＤ培地に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　本発明はまた、（２１）上記（１）~（２０）のいずれか記載の酵母用培地で酵母を好気的条件下で培養することを特徴とする酵母の培養方法や、（２２）上記（２０）記載の酵母用ＡＹＤ培地から、特定成分を除去した培地にて酵母を好気的条件下で増殖させることにより、該酵母の栄養要求性を判定する方法に関する。
　本発明によると、製パン酵母にとどまらず、酒、味噌、醤油、つけもの等の醸造飲食品の製造に使用される酵母など産業上有用な酵母の研究室レベルでの検討がより効率のよいものとなり、高い発酵能を持つ酵母培養法が確立でき、生産の安定化やコスト削減が可能となる。また、酵母培養における重要な因子の発見等、微生物学・発酵産業によりよい影響を与えることができる。
ＹＮＢ０．１７％に、グルコース２％と、ポリペプトン又は酵母抽出エキスとを添加した培地における酵母の増殖性を示す図である。縦軸はＯＤ６００を示す。 ＹＮＢ０．１７％にグルコース２％と、アスパラギン酸又は硫酸アンモニウムとを添加した培地における酵母を培養したときのＯＤ６００を示す図である。縦軸はＯＤ６００を示す。 酵母抽出エキスの分画試料を培地に添加して培養した２４時間後のＯＤ６００を示す図である。縦軸はＯＤ６００を示す。 ＢＭ培地に以下の成分を添加した培地に酵母を培養した２４時間後のＯＤ６００を示す図である。ＹＰＤ及びＹＥ（酵母抽出エキス）をコントロールとした。縦軸はＯＤ６００を示す。（ａ）はＡｃｅｔｙｌ−ＣｏＡとＣｏＡの添加結果を、（ｂ）はイーストＲＮＡ（ＲＮＡ）の添加結果を、（ｃ）はＮＡＤの添加結果を示す。 ＢＭ培地においてグルコースの代わりに、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、フルクトース、マルトース、マンノース、スクロース、リボース、又はＤＮＡを添加した培地に酵母を培養したときの２４時間後のＯＤ６００を示す図である。縦軸はＯＤ６００を示す。 グルコースを含む又は含まないＢＭ培地にエタノール、グリセロール、アルブミンを添加し、酵母を培養したときの２４時間後のＯＤ６００を示す図である。（ａ）は、エタノール、グリセロールの結果を、（ｂ）はアルブミンの結果を示す。縦軸はＯＤ６００を示す。 グルコースを２％含むＢＭ培地に複数の糖を混合して添加した培地に酵母を培養したときのＯＤ６００を示す図である。（ａ）ガラクトースを添加した場合の結果を示す。（ｂ）は、フルクトース１％に、さらにラフィノース又はマンノースを混合して添加した場合の結果を示す。（ｃ）は、フルクトース１％に、さらにスクロースを添加した場合の結果を示す。（ｄ）はマルトースを添加した場合の結果を示す。いずれの場合もグルコース２％とＹＰＤとをコントロールとした。縦軸はＯＤ６００を示す。 ＳｙｎＡＡ培地から、ビタミンミックス（Ｖ）、金属イオンミックス（Ｍ）、及び無機イオンミックス（Ｉｏｎ）の３つの成分ミックスのうち１つずつ欠如させた培地で培養した結果を示す図である。 ＳｙｎＡＡ培地から無機イオンミックスを構成する成分について、一成分ずつ排除した培地で培養した結果を示す図である。凡例１（Ｉｏｎ　ｍｉｘ）は、ＳｙｎＡＡ培地の（ポジティブコントロール）の結果を示す。 ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＫＨ２ＰＯ４の濃度の相違によるサッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＳｙｎＡＡ培地において、ＫＨ２ＰＯ４の代わりに０．１％のＮａＨ２ＰＯ４を添加した培地に、２０時間経過後に０．１％ＫＣｌを添加した場合のサッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＭｇＳＯ４の濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＭｇＣｌ２の濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＳｙｎＡＡ培地からビタミンミックスを構成する成分について、一成分ずつ排除した培地で培養した結果を示す図である。（ａ）の凡例６及び（ｂ）のｖｉｔａｍｉｎ　ｍｉｘは、ＳｙｎＡＡ培地の（ポジティブコントロール）の結果を示す。 サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株とサッカロマイセス・セルビシエＮＣＹＣ３２３３株を用いて、ＡＫＤ培地とＹＰＤ培地における増殖性を比較した図である。 （ａ）ＡＫＤ培地に含まれるロイシンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエロイシン要求性ＲＡＫ７７８株の増殖性を示す図である。（ｂ）ＡＫＤ培地に含まれるロイシンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＫＤ培地に含まれるヒスチジンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエヒスチジン要求性ＢＹ４７１４株の増殖性を示す図である。 ＡＫＤ培地に含まれるトリプトファンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエトリプトファン要求性ＢＹ４７１０株の増殖性を示す図である。 ＡＫＤ培地に含まれるウラシルの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエウラシル要求性ＢＹ４７００株の増殖性を示す図である。 ＡＫＤ培地に含まれるアデニンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエアデニン要求性ＢＹ４７２５株の増殖性を示す図である。 サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７４１株（ｌｅｕ２Δ０　ｕｒａ３Δ０　ｈｉｓ３Δ１　ｍｅｔ１５Δ０）、ＢＹ４７００株（ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７１２株（ｌｅｕ２Δ０）、ＢＹ４７１４株（ｈｉｓ３Δ１）、ＢＹ４７２５＋ＵＲＡ３株（ａｄｅ２Δ０）のＡＫＤ培地とＡＫＤ′培地における増殖性を示す図である。 ＡＫＤ′培地に含まれるビオチンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＫＤ′培地に含まれるピリドキシンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＫＤ′培地に含まれるパントテン酸の濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＫＤ′培地に含まれるチアミンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＫＤ′培地に含まれるニコチン酸の濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＫＤ′培地に含まれるイノシトールの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。（ａ）と（ｂ）とで濃度を変えて検討した。 ＡＫＤ′培地に含まれるＦｅＣｌ３の濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＩＤ培地に添加するアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、グルタミン、システインそれぞれのアミノ酸（ａ）、及びアスパラギン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンそれぞれのアミノ酸（ｂ）の濃度阻害を示す図である。 ＡＩＤ培地に含まれるアラニンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＩＤ培地に含まれるアセチルチロシンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＩＤ培地に含まれるイソロイシンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＩＤ培地に含まれるフェニルアラニンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＩＤ培地に含まれるバリンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＩＤ培地に含まれるセリンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＩＤ培地に含まれるスレオニンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＩＤ培地に含まれるアスパラギンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 ＡＩＤ培地に含まれる各種ビタミンや金属イオン等について検討をした図を示す。 パントテン酸の代替可能性について検討した図（ａ）、及び、β−アラニンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図（ｂ）である。 ＡＹＤ培地に含まれるグルタミンとシステインの濃度の相違によるＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。 アミノ酸の併用効果を検討した図である。アミノ酸を５つのグループに分け、グループごとに培地から除いて影響を確認した結果を図４１（ａ）に示す。増殖性が顕著に低下することが確認されたＡＹ５グループの個別のアミノ酸成分について検討をした結果を図４１（ｂ）に示す。 クルベイロマイセスＤＭＫＵ３−１０４２株とサッカロマイセスを用いてＡＹＤ培地と、ＹＰＤ培地及びＭＭ培地との比較を行った図である。 シゾサッカロミセス・ポンベＦＹ７５０７株の栄養要求性を検討した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。 シゾサッカロミセスＲＡＫ５５７６株の栄養要求性を検討した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ５８７株の栄養要求性を示した図である。パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については（ａ）で、ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。 クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ１４２９株の栄養要求性を示した図である。パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については（ａ）で、ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。 クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ２７９１株の栄養要求性を示した図である。パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については（ａ）で、ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。 クルベイロマイセス・ラクチスＮＲＲＬＹ−１１４０株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については（ａ）で、パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については、（ｂ）で検討されている。 ピキア・スチピチスＮＢＲＣ１００６３株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については（ａ）で、パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については、（ｂ）で検討されている。 キャンディダ・グラブラタＢＹ２３８７６株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。 キャンディダ・ウティリスＪＣＭ９６２４株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。 キャンディダ・アルビカンスＪＣＭ１５４２株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている ＳＤ培地とＹＰＤ培地と本発明の培地を用いてサッカロマイセス・セレビシエとクルベイロマイセス・マルキシアヌスを培養し、増殖性を比較した結果を（ａ）及び（ｂ）に示す。
　本発明の酵母用培地としては、酵母が資化可能な炭素源としての糖類と、窒素源としてのアミノ酸類と、ビタミン類と、イノシトールと、亜鉛イオンと、Ｋ＋とＭｇ２＋とが含まれ、かつイノシトール濃度が５０~１００００ｍｇ／Ｌである培地であれば特に制限されず、本発明において菌の増殖とは、菌数が増える現象を意味し、菌の増殖の指標となる値の一つとしては、培養液の光学的濁度（ＯＤ：Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｄｅｎｓｉｔｙ）を挙げることができる。ＯＤを測定する波長は、試料、測定装置、測定方法により適宜決定できるが、例えば、ＯＤ６００を好適に挙げることができる。ＯＤを測定する方法は、常法により、一定時間経過後の培養液を必要に応じて希釈して吸光光度計を用いて測定することもでき、また、自動測定機器により行うこともできる。特定の自動測定機器により増殖性を判定する方法は、対数増殖期の正確な増殖カーブを連続的に得ることができる点で優れているが、培養液を希釈せずに測定するため、機器によって、例えばＯＤ６００の値が測定機器の測定能力を超えた場合は、増殖カーブの正確な記録を得ることができなくなる場合がある。また、本発明の酵母用培地としては、対数増殖期の増殖カーブがＹＰＤ培地における増殖カーブの傾きと非常に近似であるか、同等であるか、ＹＰＤ培地における増殖カーブの傾きを超えるものが好ましく、例えば、培養開始後６時間後、１２時間後、２４時間後、２８時間後、４８時間後、７２時間後等適宜時間経過後のＯＤ６００の値が、ＹＰＤ培地の６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは１００％以上の培地が好ましい。具体的には、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の２４時間後の酵母の増殖性をＯＤ６００で表した場合、ＹＰＤ培地の８０％以上、好ましくは９０％以上である培地を好適に挙げることができ、中でも上記表１に示されるＡＹＤ培地を特に好適に挙げることができる。
　上記酵母としては、分類学上酵母に属するものであれば特に制限されず、例えば、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕａｌａ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、メチニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ネマトスポラ属（Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイコデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ヤローウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）等を挙げることができ、より具体的には、キャンディダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、キャンディダ・ウティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・ボイジニィ（Ｃ．ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・リポリティカ（Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、キャンディダ・フレーベリ（Ｃ．ｆｌａｖｅｒｉ）キャンディダ・ビルサチルス（Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）等のキャンディダ属の酵母、デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ）等のデバリオマイセス属の酵母、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈ．ａｎｏｍａｌａ）等のハンゼヌラ属の酵母、クルイベロマイセス・アフリカヌス（Ｋ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロマイセス・ファゼオロスポラス（Ｋ．ｐｈａｓｅｏｌｏｓｐｏｒｕｓ）等のクルイベロマイセス属の酵母、メチニコウィア・プルテェリマ（Ｍ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）等のメチニコウィア属の酵母、ピキア・スチピチス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ピキア・ファリノサ（Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓ）、ピキア・アノマラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）等のピキア属の酵母、ロドトルラ・ミニュータ（Ｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ロドトルラ・ムシラギノーザ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）等のロドトルラ属の酵母、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ドウグラシ（Ｓ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・マンジニ（Ｓ．ｍａｎｇｉｎｉ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓ．ｍｉｋａｔａｅ）等のサッカロマイセス属の酵母、シュワニオマイセス・アルビウス（Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シュワニオマイセス　オシデンタリス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、シュワニオマイセス・カステリ（Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、等のシュワニオマイセス属の酵母、サッカロマイコデス・ルドウイギ（Ｓ．ｌｕｄｗｉｇｉｉ）等のサッカロマイコデス属の酵母、ネマトスポラ　コリリ（Ｎ．ｃｏｒｙｌｉ）等のネマトスポラ属の酵母、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロミセス属の酵母、トリコスポロン・プルランス（Ｔ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、トリコスポロン・ペニシァタム（Ｔ．ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｍ）等のトリコスポロン属の酵母、ヤローウィア（サッカロマイコプシス）・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などを例示することができ、これらの酵母変異株も含む。
　上記酵母変異株としては、本発明の培地に培養した場合に当該酵母変異株がＲＡＫ３５９９株と比較して同程度の生育を示すような酵母変異株を例示することができる。また、上記酵母変異株は、変異が生じた酵母、又は酵母の集団を意味し、１つの遺伝子に変異が生じたものに限定されず、複数の遺伝子に変異が生じた多重酵母変異株も含まれ、変異としては、ＵＶ照射、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理等の変異誘導を行なう変異であっても、自然変異であってもよいし、遺伝子組換技術を用いて変異を生じさせた場合であってもよい。上記酵母変異株としては、栄養要求性酵母株を例示でき、上記栄養要求性酵母としては、ヒスチジン、ロイシン、リジン、トリプトファン、ウラシル、及び／又はアデニン要求性酵母株等が公知である（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，Ｖｏｌ．１４　１１５−１３２，１９９８等参照）。
　上記培地組成に用いられる炭素源としての糖類としては、上記酵母において資化可能な糖類であれば特に制限されず、具体的には、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類や、ラフィノース等の三糖類などを挙げることができるが、中でもグルコースが特に好ましい。これら糖類は、１又は２以上組み合わせて添加することができる。
　上記糖類の使用時の本発明の培地への添加量としては、本発明の酵母用培地の効果を損なわない範囲で及び／又はコスト的に勘案して適宜決定することができ、培地へ添加される際の炭素源としての糖類終濃度としては、１~２００ｇ／Ｌが好ましく、５~１００ｇ／Ｌがより好ましく、１０~５０ｇ／Ｌがさらに好ましく、１５~２５ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の培地に含まれる窒素源としてのアミノ酸（類）としては、上記酵母の増殖性を阻害しないアミノ酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩であれば特に制限されず、具体的には、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アラニン（Ａｌａ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、システイン（Ｃｙｓ）の２０種類のアミノ酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩を例示することができ、これらのアミノ酸は、各々Ｌ−体が好ましい。
　上記アミノ酸の塩類としては、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム等のアスパラギン酸の塩や、Ｌ−アルギニン一塩酸塩等のアルギニンの塩、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの塩や、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩等のグルタミン酸塩や、Ｌ−アスパラギン一水和物等のアスパラギン塩や、アセチルチロシン等のチロシンの誘導体や、塩酸システイン一水和物等のシステインの塩や、ヒスチジン塩酸塩一水和物等のヒスチジンの塩を例示することができる。
　上記窒素源としての各アミノ酸の本発明の培地への使用時の添加量としては、本発明の酵母用培地の効果を損なわない範囲で及び／又はコスト的に勘案して適宜決定することができ、培地へ添加される際のアミノ酸総量の終濃度としては、１~１００ｇ／Ｌが好ましく、１０~５０ｇ／Ｌがより好ましく、２０~４０ｇ／Ｌがさらに好ましく、２５~３５ｇ／Ｌが特に好ましい。以下、個別のアミノ酸の含量について説明する。
　本発明の酵母用培地におけるアスパラギン酸の濃度としては、例えばアスパラギン酸ナトリウム塩一水和物換算で、０．１~１０ｇ／Ｌが好ましく、０．５~８ｇ／Ｌがより好ましく、３~７ｇ／Ｌがさらに好ましく、４~６ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるアルギニンの濃度としては、例えばアルギニン一塩酸塩換算で、１~５０ｇ／Ｌが好ましく、５~２０ｇ／Ｌがより好ましく、８~１２ｇ／Ｌがさらに好ましく、９~１１ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるリジンの濃度としては、例えばリジン一塩酸塩換算で、０．１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７~２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるプロリンの濃度としては、０．１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７~２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるグルタミン酸の濃度としては、例えばグルタミン酸モノナトリウム塩水和物換算で、０．１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７~２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるアラニンの濃度としては、０．１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７~２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるイソロイシンの濃度としては、０．１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７~２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるフェニルアラニンの濃度としては、０．１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７~２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるバリンの濃度としては、０．１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７~２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるチロシンの濃度としては、例えばＮ−アセチルチロシン（以下単に、「アセチルチロシン」ともいう）換算で、０．１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７~２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるメチオニンの濃度としては、０．０１~１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２~０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５~０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８~０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるセリンの濃度としては、０．０１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．１~２ｇ／Ｌがより好ましく、０．２~１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３~０．７ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるスレオニンの濃度としては、０．０１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．１~２ｇ／Ｌがより好ましく、０．２~１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３~０．７ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるグリシンの濃度としては、０．０１~１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２~０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５~０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８~０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるアスパラギンの濃度としては、例えばアスパラギン一水和物換算で、０．０１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．１~２ｇ／Ｌがより好ましく、０．２~１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３~０．７ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるグルタミンの濃度としては、０．１~７．５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~７ｇ／Ｌがより好ましく、３~６．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、４~６ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるシステインの濃度としては、システイン塩酸塩一水和物換算で、０．００１~０．０８ｇ／Ｌが好ましく、０．００５~０．０５ｇ／Ｌがより好ましく、０．００７５~０．０２５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．００８~０．０１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるロイシンの濃度としては、０．１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．５~３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７~２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるトリプトファンの濃度としては、０．０１~１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２~０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５~０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８~０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地におけるヒスチジンの濃度としては、ヒスチジン一塩酸塩一水和物換算で、０．０１~１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２~０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５~０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８~０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　上記窒素源としてのアミノ酸類として本発明の酵母用培地に添加するアミノ酸が１種類の場合、アスパラギン酸を添加することが好ましい。
　上記窒素源としてのアミノ酸類として本発明の酵母用培地に添加するアミノ酸が２種類の場合、アスパラギン酸とグルタミン酸や、アスパラギン酸とアルギニンや、アスパラギン酸とリジンや、アスパラギン酸とプロリンや、アスパラギン酸とアラニンや、アスパラギン酸とイソロイシンや、アスパラギン酸とフェニルアラニンや、アスパラギン酸とバリンや、アスパラギン酸とチロシンや、アスパラギン酸とメチオニンや、アスパラギン酸とセリンや、アスパラギン酸とスレオニンや、アスパラギン酸とグリシンや、アスパラギン酸とアスパラギンや、アスパラギン酸とグルタミンや、アスパラギン酸とシステインや、アスパラギン酸とロイシンや、アスパラギン酸とトリプトファンや、アスパラギン酸とヒスチジン等の１９種類の組合せを例示することができる。
　また、上記窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、プロリン、グルタミン酸、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンから選ばれる少なくとも３種類が含まれることが好ましい。
　上記窒素源として選ばれる少なくとも３種類のアミノ酸類としては、アスパラギン酸とグルタミン酸とアルギニンや、アスパラギン酸とグルタミン酸とアラニンや、アスパラギン酸とグルタミン酸とロイシンや、アスパラギン酸とグルタミン酸とイソロイシンや、アスパラギン酸とグルタミン酸とシステインや、アスパラギン酸とアルギニンとアラニンや、アスパラギン酸とアルギニンとロイシンや、アスパラギン酸とアルギニンとイソロイシンや、アスパラギン酸とアルギニンとバリンや、アスパラギン酸とアルギニンとグルタミンや、アスパラギン酸とアルギニンとシステインや、アスパラギン酸とアルギニンとアスパラギンや、アスパラギン酸とアルギニンとチロシンや、アスパラギン酸とリジンとロイシンや、アスパラギン酸とリジンとイソロイシンや、アスパラギン酸とリジンとバリンや、アスパラギン酸とリジンとグルタミンや、アスパラギン酸とリジンとシステインや、アスパラギン酸とリジンとアスパラギンや、アスパラギン酸とリジンとチロシンや、アスパラギン酸とプロリンとロイシンや、アスパラギン酸とプロリンとイソロイシンや、アスパラギン酸とプロリンとバリンや、アスパラギン酸とプロリンとグルタミンや、アスパラギン酸とプロリンとシステインや、アスパラギン酸とプロリンとアスパラギンや、アスパラギン酸とプロリンとチロシンや、グルタミン酸とアルギニンとアラニンや、グルタミン酸とアルギニンとロイシンや、グルタミン酸とアルギニンとイソロイシンや、グルタミン酸とアルギニンとバリンや、グルタミン酸とアルギニンとグルタミンや、グルタミン酸とアルギニンとシステインや、グルタミン酸とアルギニンとアスパラギンや、グルタミン酸とアルギニンとチロシンや、グルタミン酸とリジンとロイシンや、グルタミン酸とリジンとイソロイシンや、グルタミン酸とリジンとバリンや、グルタミン酸とリジンとグルタミンや、グルタミン酸とリジンとシステインや、グルタミン酸とリジンとアスパラギンや、グルタミン酸とリジンとチロシンや、グルタミン酸とプロリンとロイシンや、グルタミン酸とプロリンとイソロイシンや、グルタミン酸とプロリンとバリンや、グルタミン酸とプロリンとグルタミンや、グルタミン酸とプロリンとシステインや、グルタミン酸とプロリンとアスパラギンや、グルタミン酸とプロリンとチロシン等の、アスパラギン酸又はグルタミン酸や、アルギニンとアラニンとメチオニンや、アルギニンとロイシンとチロシンや、アルギニンとイソロイシンとスレオニンや、アラニンとバリンとセリンや、アルギニンとフェニルアラニンとグルタミンや、アルギニンとプロリンとシステインや、アルギニンとアスパラギンとグルタミン等少なくとも１１４０通りの３種類のアミノ酸類を少なくとも含む組合せを挙げることができる。
　本発明の酵母用培地に含まれる窒素源として、上記酵母の増殖性を阻害しない限りにおいて、アミノ酸に加えて、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン等の核酸（類）若しくはその誘導体、又はそれらの塩を１又は２以上組み合わせてさらに添加することができる。上記誘導体としては、アデニンの誘導体として、アデニンヘミサルフェイトを例示することができる。本発明の酵母用培地における各核酸の濃度としては、０．０１~１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２~０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５~０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８~０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の酵母用培地に含まれる窒素源としては、さらに上記酵母の培養に伴う培地のｐＨの過剰な低下を抑制し、かつ酵母の増殖性を維持できる窒素源が好ましいため、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウムイオンを酵母が資化可能な窒素源として含まないことが好ましい。
　本発明の酵母用培地に含まれるビタミン類としては、上記酵母の増殖性を阻害しないビタミン類若しくはその誘導体、又はそれらの塩であれば特に制限されず、例えば、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン、チアミン等を挙げることができ、パントテン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩としては、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パンテノール等を例示することができ、ナイアシン若しくはその誘導体、又はそれらの塩としては、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチニックアルコール等を例示することができ、チアミン誘導体としては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、ベンフォチアミン等を例示することができ、ピリドキシン若しくはその誘導体、又はそれらの塩としては、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール（リン酸ピリドキサール）、ピリドキサミン等のピリドキシンを例示することができる。上記ビタミンは、２種類以上含まれることが好ましく、３種類以上含まれることがより好ましく、４種類以上含まれることがさらに好ましい。
　酵母がサッカロマイセス属に属する場合、上記ビタミン類として、ビオチン、パントテン酸や、ビオチン、パントテン酸及びナイアシンや、ビオチン、パントテン酸及びピリドキシンや、ビオチン、パントテン酸及びチアミンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン及びピリドキシンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン及びチアミンや、ビオチン、パントテン酸、ピリドキシン及びチアミンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン及びチアミンを含む組合せを挙げることができ、酵母がクルベイロマイセス属に属する場合は、ビオチン、パントテン酸、及びナイアシンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン及びピリドキシンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン及びチアミンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン及びチアミンを含む組合せを挙げることができ、酵母がキャンディダ属に属する場合は、上記ビタミン類として、ピリドキシン、ビオチン、パントテン酸、チアミン、及びナイアシンから選ばれる１又は２以上を含む組合せを挙げることができる。
　上記各ビタミンの本発明の培地への使用時の添加量としては、本発明の酵母用培地の効果を損なわない範囲で及び／又はコスト的に勘案して適宜決定することができ、具体的には、以下のとおり例示できる。
　本発明の培地におけるパントテン酸の濃度としては、１０~５００００μｇ／Ｌが好ましく、１００~２５０００μｇ／Ｌがより好ましく、１０００~７５００μｇ／Ｌがさらに好ましく、３０００~５０００μｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の培地におけるナイアシン（ニコチン酸）の濃度としては、１０~５００００μｇ／Ｌが好ましく、１００~２５０００μｇ／Ｌがより好ましく、１０００~７５００μｇ／Ｌがさらに好ましく、３０００~５０００μｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の培地におけるピリドキシンの濃度としては、１~５０００μｇ／Ｌが好ましく、１０~２５００μｇ／Ｌがより好ましく、１００~７５０μｇ／Ｌがさらに好ましく、３００~５００μｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の培地におけるチアミンの濃度としては、１~５０００μｇ／Ｌが好ましく、１０~２５００μｇ／Ｌがより好ましく、１００~７５０μｇ／Ｌがさらに好ましく、３００~５００μｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の培地におけるビオチンの使用時における添加量としては、例えば、０．０２~１５０μｇ／Ｌを挙げることができ、０．２~２０μｇ／Ｌが好ましく、０．５~１０μｇ／Ｌがより好ましく、１~５μｇ／Ｌがさらに好ましく、１．５~３μｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の培地におけるイノシトールは、ｍｙｏ−イノシトールであり、有効量添加されることで、ＹＰＤと同等の対数増殖期の増殖曲線を得ることができることから本発明における増殖制限因子として添加されることが必須であり、本発明の培地におけるｍｙｏ−イノシトールの濃度は５０~１００００ｍｇ／Ｌであり、１００~７５００ｍｇ／Ｌが好ましく、５００~５０００ｍｇ／Ｌがより好ましく、７５０~３０００ｍｇ／Ｌがさらに好ましく、１０００~２５００ｍｇ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の培地に添加される金属イオンとしては、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）を挙げることができ、上記酵母の増殖性を阻害しない金属イオンであれば適宜他の金属イオンをさらに加えることができ、かかる他の金属イオンとしては、具体的には、鉄イオン（Ｆｅ３＋及び／又はＦｅ２＋）を挙げることができる。
　上記Ｚｎ２＋としては、具体的には、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）等として添加することができ、本発明の培地におけるＺｎ２＋の濃度としては、ＺｎＳＯ４換算で、１~５０００μｇ／Ｌが好ましく、５０~１０００μｇ／Ｌがより好ましく、１００~７５０μｇ／Ｌがさらに好ましく、３００μｇ／Ｌ~５００μｇ／Ｌが特に好ましい。
　上記Ｆｅ３＋としては、具体的には、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）の無水物や水和物として添加することができ、本発明の培地におけるＦｅ３＋の使用時における添加量としては、例えば、ＦｅＣｌ３（無水物）換算で、１μｇ／Ｌ~５０００００μｇ／Ｌを挙げることができ、２００~４００００μｇ／Ｌが好ましく、５００~１００００μｇ／Ｌがより好ましく、１０００~７５００μｇ／Ｌがさらに好ましく、３０００~５０００μｇ／Ｌが特に好ましい。また、上記Ｆｅ２＋としては、ＦｅＳＯ４の無水物や水和物、ＦｅＣｌ２の無水物や水和物等を挙げることができる。
　本発明の培地に含まれる無機イオンとしては、上記酵母の増殖性を阻害しない無機イオンであれば特に制限されないが、カリウムイオン（Ｋ＋）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）は必須である。
　上記Ｋ＋は、具体的には、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、塩化カリウム（ＫＣｌ）として添加することができ、これらは単独でも用いることができるし、複数で混合して用いることができる。本発明の培地におけるＫ＋の濃度としては、例えばＫＨ２ＰＯ４換算で、０．１~１０ｇ／Ｌが好ましく、０．１~５ｇ／Ｌがより好ましく、０．５~２．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８~１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
　上記Ｍｇ２＋は、具体的には、硫酸マグネシウム・７水和物、塩化マグネシウム・６水和物、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、塩化カリウムマグネシウムとして添加することができ、これらは単独でも用いることができるし、複数で混合して用いることができる。本発明の培地におけるＭｇ２＋濃度としては、例えば、硫酸マグネシウム・７水和物換算で、０．０１~５ｇ／Ｌが好ましく、０．１~２ｇ／Ｌがより好ましく、０．２~１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３~０．７ｇ／Ｌが特に好ましい。
　その他、本発明の培地において、酵母の増殖性を高めることを特に重視する場合には、コーンスチープリカー、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス等を必要に応じて適宜添加することができるが、化学合成培地とする点でこれら酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリペプトン、肉エキス等を含まない培地が、本発明の効果を有利に享受できる。
　本発明の培地の形態としては、菌量、操作性等に応じて、液体培地でもよいし、寒天等の多糖類などを添加した固体培地でもよい。液体培地の場合、酵母の増殖性を高めるために、酸素が供給される好気的条件下で培養することが好ましく、好気的条件で培養を行う方法としては、公知の手段により、具体的には、振盪培養、通気攪拌培養、又は好気的回転培養を挙げることができる。
　各菌種の生育温度に応じて高い増殖性を示すことができるが、好ましい生育温度としては、サッカロマイセス属の場合は２５~３５℃、キャンディダ属の酵母の場合は２５~３５℃、クルイベロマイセス属の酵母の場合は２５~４５℃、ピキア属の酵母の場合は２５~３５℃、シゾサッカロマイセス属の酵母の場合は２５~３５℃を例示することができる。
　本発明の培地への酵母の添加量としては、１~１０％（Ｖ／Ｖ）が培養操作性、増殖速度、最終濃度到達時間等の点から好ましい。しかし、この範囲に限定されるわけではなく、使用原料や目的によっては、これより高い又は低い濃度で培養することができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例の記載順序は、概ね実験の時系列に沿うものである。また、濃度の設定や必要成分の検討データは、以下の記載に限らず、試行錯誤の過程による莫大な量があるが、本発明の発明特定事項を説明するために必要となるデータのみを記載した。また、図８~２０及び図２２~５２までのグラフの縦軸はＯＤ６００を示す。
（１）検討１
［材料と方法］
（供試酵母株）
　酵母株としては、ＢＹ系列の酵母（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．１９９８．Ｙｅａｓｔ　１４：１１５−１３２等参照）と、ＲＡＫ系列の酵母を使用した。具体的には、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ２６８３株、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７４１株（ｌｅｕ２Δ０　ｕｒａ３Δ０　ｈｉｓ３Δ１　ｍｅｔ１５Δ０）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７００株（ｕｒａ３Δ０）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７１２株（ｌｅｕ２Δ０）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７１４株（ｈｉｓ３Δ１）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７２５＋ＵＲＡ３株（ａｄｅ２Δ：：ｈｉｓＧ）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７１０株（ＴｒｐΔ６３）、シゾサッカロミセス・ポンベＦＹ７５０７株、チゴサッカロミセスＲＡＫ５５７６株、クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ５８７（ＲＡＫ３６８４）株、ＮＣＹＣ１４２９（ＲＡＫ３６８５）株、及びＮＣＹＣ２７９１（ＲＡＫ３６８６）株クルベイロマイセス・ラクチスＮＲＲＬＹ−１１４０株、ピキア・スチピチスＮＢＲＣ１００６３（ＲＡＫ５１２８）株、キャンディダ・グラブラタＢＹ２３８７６株等の酵母株を用いた。実施例記載の酵母株は国立大学法人山口大学工学部にて保管されており、一定条件下で分譲可能である。
（基本培養方法）
　増殖性検討対象となる培地での培養実験の手順としては、特段の定めがない場合、検討する酵母をＹＰＤ液体培地で２８℃にて２４時間前培養後、ＯＤ６００＝２０になるように調整した。その後Ｌ型試験管に分注した検討用各培地５ｍＬにその培養液５μＬを植菌し（最終ＯＤ６０＝０．０２）、２８℃にて好気的に回転培養し、自動計測分光度計（バイオフォトレコーダーＴＶＳ０６２ＣＡ　アドバンテック社）で連続的にＯＤを測定した。また、分光光度計（Ｃｅｌｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃｅｔｅｒ　ｃｏ８０００　ＷＰＡ社）でＯＤ６００を１５分毎に測定した。以下、自動計測分光度計を用いた場合のグラフをデータとして示すが、これらは主として対数増殖期の増殖カーブの傾きを培地ごとに比較するために用いており、希釈せずにＯＤ６００を計測するため、ＯＤ６００＝３~３．５以上の値については、不正確な場合もある。
［予備実験］
　酵母の増殖性を高めるための合成培地の組成を確立するため、まず、目標となる増殖性を有する富栄養培地であるＹＰＤ培地と、最小合成培地として選択したＭＭ培地とにおける酵母の増殖性を検討した。ＭＭ培地としては、以下の表２に示すＹＮＢ（アミノ酸、硫酸アンモニウム、及びグルコースを含まない）（Ｙ２０３０、“Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ＡＡ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　＆　ｗ／ｏ　ＡＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＵＳＡ社製）０．１７％に、窒素源として硫酸アンモニウム０．５％と、炭素源としてグルコース２％を添加した組成の培地を用いた。また、ＹＰＤ培地の組成としては、イーストエキストラクト１％、ペプトン２％、グルコース２％、ｐＨ５．６~６．０を用いた。市販のパン酵母株を１ｍＬのそれぞれの液体培養液（ＯＤ６００＝３５）中に１０ｍＬ植菌し、一日後に１／２０溶液について、ＯＤ６００とｐＨとを測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 （増殖性と培養液ｐＨとの関連）
　ＹＰＤ培地ではＯＤ６００の値が０．８２であり、ｐＨが６．０であったのに対し、ＭＭ培地では、ＯＤ６００の値が０．３５であり、ｐＨが２．４であった。ＹＰＤ培地と比較してＭＭ培地における培養後のｐＨが非常に低いため、培地のｐＨの変化について検討した。
（培地のｐＨの検討）
　以下の表３に示された１ｍＬあたりの液体培地組成において、培養前の培地のｐＨを６．０に調整し、市販のパン酵母株の培養を２４時間行った。その結果、（１）のＭＭ＋バッファーは、ｐＨはそれほど低下しなかったが、増殖性は、（６）ＭＭｐＨ６（バッファーなし）に及ばなかった。（２）のＭＭ＋２％ＰＰ培地と（３）のＭＭ＋１％ＹＥ培地は、ｐＨはそれほど低下せず増殖性も（１）のＭＭ＋バッファーと比較するとよかったが（５）のＹＰＤ培地には及ばなかった。したがって、ｐＨの低下と増殖性が直接的な相関を見いだすことはできなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 （２）検討２
［酵母抽出エキスに含まれる増殖因子の検討］
　上記表３において、（２）のＭＭ＋２％ＰＰ培地と（３）のＭＭ＋１％ＹＥ培地を用いた場合の増殖性が比較的高かったので、ＹＮＢ０．１７％（ｗ／ｏ　ＡＡ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　＆　ｗ／ｏ　ＡＳ）にグルコース２％と、ポリペプトン又は酵母抽出エキスとを添加した組成の培地を用いてＹＰＤ培地における増殖性と比較した。結果を図１に示す。２％の酵母抽出エキスを加えることでＹＰＤ培地レベル以上の増殖性が達成されたが、ポリペプトンでは増殖性はＹＰＤ培地レベルまでには高くならなかった。したがって、酵母抽出エキス中に含まれると予測される増殖因子について検討を行うことにした。
（３）検討３
［窒素源の検討］
　ＭＭ培地における窒素源として、硫酸アンモニウムの代わりに、以下の表４に示す各種アミノ酸を単独で使用するか、あるいは、硫酸アンモニウム以外の他のアンモニウム塩としてリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム（シグマＵ４４２６）、蟻酸アンモニウム（シグマ０４５０７ＡＣ）、酢酸アンモニウム（シグマＵ９４６９）をそれぞれ用いた培地で、酵母ＲＡＫ２６８３株を２４時間培養後、ＯＤ６００、ｐＨ等について検討した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　上記表４より硫酸アンモニウムを添加すると、他の窒素源と比較して、ｐＨが低下するとともに、増殖性も非常に悪いことが確認された。また、アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン等を単独で添加すると良好な増殖性を示し、他方グリシン、ヒスチジン、スレオニン、リジンを単独で添加するとほとんど増殖性を示さなかった。また、硫酸アンモニウムに限らず、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の窒素源としてのアンモニウム塩は総じて良好な増殖性を示さなかった。
　上記表４において、４８時間後のＯＤ６００の値が一番高かったアスパラギン酸（Ａｓｐ）を硫酸アンモニウムと代替した培地を作製し、ＭＭ培地とＹＰＤとにおける酵母（市販のパン酵母株）の増殖性を比較した。結果を図２に示す。ＹＰＤの増殖性レベルには到達しなかったものの、０．５~２．０％のアスパラギン酸を添加した培地は、硫酸アンモニウムを添加した培地よりも増殖性が顕著によくなることがわかった。かかる知見に基づき、ＹＮＢ０．１７％とグルコース２％に、窒素源としてアスパラギン酸２％を添加したＢＭ培地を検討対象とした。
　酵母抽出エキスに含まれる増殖因子を特定するために、まず分子量に着目し、酵母抽出エキス１０％を分子量５０００以下（Ｍ＜５０００）の物質と分子量５０００以上（Ｍ＞５０００）の物質とに分画し、両方の分画物を各種濃度で含む培地でＲＡＫ２６８３株を培養したところ、酵母抽出エキス（Ｍ＜５０００）の濃度の低下による増殖の減少は、通常の酵母抽出エキスの増殖の減少と変わらなかった。そのため、目的の重要な増殖因子は、Ｍ＜５０００に含まれるものと推定した。次いで、酵母抽出エキス（Ｍ＜５０００）をさらに分画し増殖性を試験した。結果を図３に示す。図３における分画数４~６に含まれる物質（約５００＜Ｍ＜１０００）が増殖性を高めるのではないかと推定した。約５００＜Ｍ＜１０００の分子量を有する物質として、Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ、ＣｏＡ、イーストＲＮＡ（ＲＮＡ）、ＮＡＤを選択し、それぞれをＢＭ培地に添加し、酵母ＲＡＫ２６８３株を２４時間培養後、ＯＤ６００を測定した。なお、酵母抽出エキス（ＹＥ）添加培地及びＹＰＤ培地をポジティブコントロールとした。結果を図４（ａ）~（ｃ）に示す。Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ、ＣｏＡ、イーストＲＮＡ、及びＮＡＤはいずれも、ＢＭ培地における増殖性と同程度であり、ＹＰＤの増殖レベルには及ばず増殖因子として顕著な役割を果たしているとはいえなかった。この段階で、酵母抽出エキスに含まれる増殖因子の検討を中止した。
（４）検討４
［炭素源の検討］
　ＢＭ培地において、グルコースの代わりに、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、フルクトース、マルトース、マンノース、スクロース、リボース等の糖、又はＤＮＡ（ネガティブコントロール）をそれぞれ２％添加した培地で、酵母市販のパン酵母株を２８℃にて２４時間培養後にＯＤ６００を測定した。結果を図５に示す。トレハロース、リボース又はＤＮＡをグルコースの代わりに単独で添加した場合には、酵母はまったく増殖性を示さず、トレハロースやリボースは炭素源として用いられることが困難であることがわかった。
　グルコースを含む又は含まないＢＭ培地にエタノール、グリセロールを添加した培地にて、酵母ＲＡＫ２６８３株を２４時間培養後にＯＤ６００を測定した。結果を図６（ａ）に示す。また、ＢＭ培地にアルブミンを０．１~２％添加した培地に、酵母ＲＡＫ２６８３株を２４時間培養後にＯＤ６００を測定した。結果を図６（ｂ）に示す。培地にグルコースを添加せずにエタノール、グリセロール、又はアルブミンを添加した場合には、酵母はほとんど増殖性を示さず、エタノールやグリセロールやアルブミンは炭素源として用いることが困難であることが確認された。
　ＢＭ培地に、ガラクトース、ラフィノース、フルクトース、マルトース、マンノース、スクロース等の各糖について０．５~２％の濃度を混合した各種培地を作製し、増殖性の実験を行った。結果を図７（ａ）~（ｄ）に示す。いずれの糖も資化性はあることが確認されたが、グルコース２％のみの場合と比べて特に高い増殖性は示されず、複数の糖を混合してもＹＰＤ培地のレベルの増殖性を示したものはなかった。これ以降、炭素源としては、グルコース２％に固定して検討を続けることとした。
（５）検討５
［各種成分ミックスの検討］
　以下の表５~８記載の４種の成分ミックス、すなわち、アミノ酸ミックス（ＡＡ）、ビタミンミックス（Ｖ）、金属イオンミックス（Ｍ）、及び無機イオンミックス（Ｉｏｎ）をそれぞれ構成成分とする各種成分ミックスを調製した。これら４つの成分ミックスとグルコース２０ｇ／Ｌと硫酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌとを混合した培地（以下「ＳｙｎＡＡ培地」ともいう）から、ビタミンミックス（Ｖ）、金属イオンミックス（Ｍ）、及び無機イオンミックス（Ｉｏｎ）の３つの成分ミックスのうち１つずつ欠如させた培地で培養した結果を図８に示す。ビタミンミックス又は無機イオンミックスを欠如した培地（ＳｙｎＡＡ−Ｖ又はＳｙｎＡＡ−Ｉｏｎ）では増殖性がまったく見られなかった。また金属イオンミックスを欠如した培地（ＳｙｎＡＡ−Ｍ）は、ＹＰＤと比較すると顕著に増殖性は悪かった。ビタミンミックス、無機イオンミックス及び金属イオンミックスの構成成分の中にそれぞれ酵母の増殖に必須の又は重要な成分が含まれていると推測した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 （６）検討６
［無機イオン濃度の検討］
　上記無機イオンミックスを構成する成分について、ＳｙｎＡＡ培地から一成分ずつ排除した培地を作製し、ＯＤ６００を測定した。結果を図９に示す。ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（図中ではＭｇで表される）又はＫＨ２ＰＯ４を添加しないイオンミックスは、非常に増殖性が低かったことが確認された。以下、無機イオン濃度について具体的に検討を行うこととした。なお、図９中の２（ＳｙｎＡＡ培地から硫酸アンモニウムを除いたもの）で示されるとおり、硫酸アンモニウムを添加しない培地が、無機イオンミックスを添加した培地よりも高い増殖性を示したため、硫酸アンモニウムは窒素源として必須ではないと判断した。サッカロマイセス・セルビシエの特別な栄養要求性を持たない株であるＲＡＫ３５９９株（以下、単に「ＲＡＫ３５９９株」ともいう）を用いて検討を行った。これ以降特段の定めがない限り、２８℃にて適宜時間回転培養を行い、ＯＤ６００を測定することで増殖性を検討した。
（Ｋイオン）
　ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＫＨ２ＰＯ４の濃度を０％，０．０００１％，０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図１０に示す。なお図１０には示されていないが、４２時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．０２，０．０２，０．０３，０．１１，０．１３，０．１４であった。ＫＨ２ＰＯ４の濃度が０．１％~１％でＯＤ６００が最大値に達した。
（Ｎａイオン）
　ＳｙｎＡＡ培地において、ＫＨ２ＰＯ４の代わりに０．１％のＮａＨ２ＰＯ４（製品番号２８−３７９０、片山社製）を添加してＲＡＫ３５９９株を培養したところ、２０時間経過後も増殖が起こらなかった。しかし、２０時間経過後に０．１％ＫＣｌを添加したところ増殖が始まった。この結果を図１１に示す。この結果より、本発明の培地においては、Ｎａイオンではなく、Ｋイオンが増殖性に重要な影響を与えていると考えられた。
（Ｍｇイオン）
　ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＭｇＳＯ４の濃度を０％，０．０００１％，０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図１２に示す。４２時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．０２，０．０４，０．０９，０．１２，０．１３，０．１３であり、ＭｇＳＯ４の濃度が０．０１％~１％で最大値に達した。次に、ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図１３に示す。ＭｇＳＯ４同様に０．０１％~１％で最大値に達し、Ｍｇ２＋は、増殖性に影響があるが、ＳＯ４ ２−とＣｌ−における相違は特にないものと考えられた。
（７）検討７
［ビタミンについての検討］
　上記ビタミンミックスを構成する成分について、ＳｙｎＡＡ培地をコントロールとして、ＳｙｎＡＡ培地から一成分ずつ排除した培地を作製し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図１４（ａ）及び（ｂ）に示す。また、パントテン酸又はビオチンが、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を高めるために必要な成分であることが確認された。また、葉酸、ホウ酸（ｂｏｒｉｃ　ａｃｉｄ）、リボフラビンは必須の成分ではないと判断した。ビオチン、イノシトール、ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン、パントテン酸は、必要量の検討がさらに必要と思われた。
（８）検討８
［ＡＫＤ培地］
　これまでの検討結果に基づいて、増殖性が高いと考えられる培地組成の処方（ＡＫＤ培地）を一度作成してみた。ＡＫＤの処方例は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　ここで、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株とサッカロマイセス・セルビシエＮＣＹＣ３２３３株を用いて、ＡＫＤ培地とＹＰＤ培地における増殖性を比較した。結果を図１５に示す。かなりＹＰＤの増殖カーブに近くなってきたが、ＹＰＤ培地の増殖性がより高かったので、培地組成につき、引き続き検討を行うこととし、まずアミノ酸から検討した。
（９）検討９
［アミノ酸濃度の検討］
（栄養要求性株）
　本発明の課題の一つは、栄養要求性酵母株であっても、本発明の培地において培養することにより高い増殖性を維持できる培地を作製することにあるところから、栄養要求性株を用いて検討を行った。
（ロイシン要求性株）
　ＡＫＤ培地に含まれるロイシンの濃度を０％，０．０００１％，０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエロイシン要求性ＲＡＫ７７８株（ＢＹ４７１２（ｌｅｕ２Δ０）株）の増殖性を検討した。結果を図１６（ａ）に示す。ロイシンの濃度が０．００１％未満では増殖性はほとんどみとめられなかったが、０．０１％で増殖性は上昇し、０．１％で最大値に達し、１％においては増殖性が阻害されることが確認された。同様の実験をサッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株を用いて行った結果を図１６（ｂ）に示す。ロイシンの濃度が０~０．１％の場合、高い増殖性を示したが、１％においては増殖性が阻害されることが確認された。以上の結果より、ロイシンの濃度は、０．１％程度が好ましいことがわかった。
（ヒスチジン要求性株）
　ＡＫＤ培地に含まれるヒスチジンの濃度を０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエヒスチジン要求性ＢＹ４７１４（ｈｉｓ３Δ１）株の増殖性を検討した。結果を図１７に示す。０．０１％~１％で最大値に達した。４２時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．０７，０．１８，０．１８，０．１５であった。以上の結果より、ヒスチジンの濃度は、０．０１％程度が好ましいことがわかった。
（トリプトファン要求性株）
　ＡＫＤ培地に含まれるトリプトファンの濃度を０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエトリプトファン要求性ＢＹ４７１０（ｔｒｐ１△）株の増殖性を検討した。結果を図１８に示す。４８時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．０８，０．１５，０．１３，０．１２であった。０．０１％で増殖性が顕著に高くなることが確認され、０．１％では増殖性が多少阻害されることが確認された。以上の結果より、トリプトファンの濃度は、０．０１％程度が好ましいことがわかった。
（ウラシル要求性株）
　ＡＫＤ培地のアミノ酸ミックスに便宜上含まれているウラシルの濃度を０．００１％，０．００５％，０．０５％，０．１％，０．５％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエウラシル要求性ＢＹ４７００（ｕｒａ３△）株の増殖性を検討した。結果を図１９に示す。４２時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．１０，０．２１，０．２１，０．２２，０．２０であった。０．００１％では増殖性は低く、０．００５％で高くなり、０．０５％~０．１％で顕著に高くなることが確認された。０．５％では増殖性が多少阻害されることが確認された。以上の結果より、ウラシルの濃度は、０．０１％程度が好ましいことがわかった。
（アデニン要求性株）
　ＡＫＤ培地のアミノ酸ミックスに便宜上含まれているアデニンの濃度を０％，０．００５％、０．０１％，０．０５％，０．１％，０．５％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエアデニン要求性ＢＹ４７２５（ａｄｅ２△）株の増殖性を検討した。結果を図２０に示す。４２時間後の１／２０溶液のＯＤ６００は、それぞれ４，１５，１８，１８，１３，１６であった。０では増殖性は低く、０．０１％~０．０５％で最大であり、０．１％以上では増殖性がやや阻害されることが確認された。以上の結果より、アデニンの濃度は、０．０１％程度が好ましいことがわかった。
（１０）検討１０
［ＡＫＤ′培地］
　以上のアミノ酸の検討結果に基づいて、ＡＫＤ培地と比較してロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、アデニンの濃度を増やしたＡＫＤ′培地を以下の表１０の通り作製してみた。寒天（片山化学工業社製、１０１−１９００）を２０ｇ／Ｌ添加したＡＫＤ′寒天培地において検討９で用いた各要求株を２８℃にて、２日培養した。ネガティブコントロールとしてＡＫＤ培地を、ポジティブコントロールとしてＹＰＤ培地を用いた。結果を図２１に示す。その結果、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７４１株（ｌｅｕ２Δ０　ｕｒａ３Δ０　ｈｉｓ３Δ１　ｍｅｔ１５Δ０）、ＢＹ４７００株（ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７１２株（ｌｅｕ２Δ０）、ＢＹ４７１４株（ｈｉｓ３Δ１）、ＢＹ４７２５＋ＵＲＡ３株（ａｄｅ２Δ０）のすべての増殖性がＲＡＫ３５９９と同様、ＡＫＤ培地と比較して非常によくなったが、培地組成を引き続き検討することにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 （１１）検討１１
［ビタミン濃度の検討］
　上述したように、無機イオン濃度及びアミノ酸濃度について詳細に検討してきた。次に、ビタミン濃度について検討することとした。ビタミンとして、ビオチン、ピリドキシン、パントテン酸、チアミン、ニコチン酸、イノシトールを対象とした。
（ビオチン）
　ＡＫＤ′培地に含まれるビオチンの濃度を、０，０．０２ｎｇ／ｍＬ，０．２ｎｇ／ｍＬ，２ｎｇ／ｍＬ，０．０２μｇ／ｍＬ，０．２μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２２に示す。ビオチン含有量が０では増殖性はほとんどみとめられなかったが、０．２μｇ／Ｌ~２０μｇ／Ｌで最大値に達し、２００μｇ／Ｌにおいては増殖性がやや阻害されることが確認された。これらの結果から、ビオチン濃度は２μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（ピリドキシン）
　ＡＫＤ′培地に含まれるピリドキシンの濃度を、０，０．００４，０．０４，０．４，４，４０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２３に示す。ピリドキシン含有量が０でもある程度増殖性は認められたが、０．０４μｇ／ｍＬで増殖性は上昇し、０．４μｇ／ｍＬ~４０μｇ／ｍＬで最大値に達した。これらの結果から、ピリドキシン濃度は、４００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（パントテン酸）
　ＡＫＤ′培地に含まれるパントテン酸の濃度を、０，０．００４，０．０４，０．４，４，４０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２４に示す。パントテン酸含有量が０では、増殖性はまったくなく少なくともサッカロマイセス・セルビシエにおける必須の成分であることが確認された。０．０４μｇ／ｍＬで増殖性は上昇し、０．４μｇ／ｍＬ~４μｇ／ｍＬで最大値に達し、４０μｇ／ｍＬにおいては増殖性がやや阻害されることが確認された。これらの結果から、パントテン酸濃度は、４０００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（チアミン）
　ＡＫＤ′培地に含まれるチアミンの濃度を、０，０．００４，０．０４，０．４，４，４０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２５に示す。チアミン含有量が０でもある程度増殖性は認められたが、０．４μｇ／ｍＬ~４μｇ／ｍＬで最大値に達した。これらの結果から、チアミン濃度は、４００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（ニコチン酸）
　ＡＫＤ′培地に含まれるニコチン酸の濃度を、０，０．００４，０．０４，０．４，４，４０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２６に示す。図２６には明確には示されていないが、２８時間後のＯＤ６００は、それぞれ９，１０，１０，９，１０，８であった。ニコチン酸含有量が０でもかなりの程度増殖性は認められたが、０．０４μｇ／ｍＬで増殖性は上昇し、４μｇ／ｍＬで最大値に達した。４０μｇ／ｍＬにおいては増殖性がやや阻害されることが確認された。これらの結果から、ニコチン酸濃度は、４０００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（イノシトール）
　ＡＫＤ′培地に含まれるｍｙｏ−イノシトールの濃度を、０，０．０２μｇ／ｍＬ，０．２μｇ／ｍＬ，２μｇ／ｍＬ，２０μｇ／ｍＬ，２００μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２７（ａ）に示す。イノシトール含有量の上昇に比例して増殖性は上昇した。そこで、ＡＫＤ´培地に含まれるイノシトールの濃度を、０、０．０１％，０．１％，１％，１０％（１００ｇ／Ｌ相当）にそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２７（ｂ）に示す。０．０１％~１％で最大値において、今まで解決できなかったＡＫＤ′の増殖性を上回り、ＹＰＤとの差を解消する増殖性のカーブの傾きの増加、すなわちラインの上昇（図の矢印）が確認され、イノシトールが律速段階であるという予想外の知見が得られた。なお、イノシトールを１０％添加した場合には増殖性がＡＫＤ′よりも下回ることが確認された。したがって、イノシトールの濃度は、５０~１００００ｍｇ／Ｌが好ましいことがわかった。
（１２）検討１２［金属イオン濃度の検討］
　無機イオン濃度、アミノ酸濃度、及びビタミン濃度に引き続いて、金属イオンであるＦｅイオン濃度について検討することとした。ＡＫＤ′培地に含まれるＦｅＣｌ３の濃度を、０，０．００２，０．０２，０．２，２，２０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２８に示す。また、図２８には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤは、１０，９，１１，１０，１３，１４であった。２~２０μｇ／ｍＬにおいて、高い増殖性を示した。これらの結果から、ＦｅＣｌ３濃度は、４０００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（１３）検討１３
［ＡＩＤ培地］（本発明の培地Ａ）
　以上、Ｆｅイオン濃度及びビタミン濃度の検討結果を踏まえて、ＡＫＤ′培地に比較して鉄、パントテン酸、イノシトール等の添加量を増やした本発明の培地１（ＡＩＤ培地）を作製した。ＡＩＤ培地の処方例は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 （ＡＩＤ培地における検討）
　以下に示すように、ＡＩＤ培地における各種アミノ酸濃度や、パントテン酸のアミノ酸への代替可能性について検討した。適宜ＹＰＤ培地をコントロールとした。
（アラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、グルタミン、システイン、アスパラギン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン）
　ＡＩＤ培地に添加するアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、グルタミン、システインそれぞれのアミノ酸について０．０６２５％，０．１２５％，０．２５％，０．５％，１％に培地添加濃度を調整し、ＯＤ６００を測定した。結果を図２９（ａ）に示す。次に、アスパラギン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンそれぞれのアミノ酸について、０．１５６％，０．０３１２％，０．０６２５％，０．１２５０％，０．２５００％に培地添加濃度を調整し、２４時間後にＯＤ６００を測定した。図２９（ａ）及び（ｂ）の結果より、メチオニン、スレオニン、グリシン、グルタミン、システイン、アスパラギンについては、高濃度に添加すると、増殖性がむしろ阻害することが確認された。一方、アラニン、セリン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンについては高濃度に添加しても増殖性に対してよい影響を与えることが示唆された。
（チロシン）
　チロシンは溶解性が低く、これまで０．０１ｇ／Ｌの濃度で検討してきたが、溶解性を増加させるためチロシンに代えてアセチルチロシン（ａＹ）を用いることとした。アセチルチロシン（Ａ２５１３、シグマ社製）の濃度を０，０．０１，０．１，０．５，１，２ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整したＡＩＤ培地におけるＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３０に示す。図３０には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１３，１４，１５，１４，１５，１８であった。これらの結果から、これ以降、チロシンの誘導体としてアセチルチロシンを用いることとし、かつアセチルチロシン濃度としては１ｇ／Ｌ程度が好ましいと判断した。
（アラニン）
　１ｇ／Ｌアセチルチロシン添加ＡＩＤ培地（ａＹ−ＡＩＤ培地）におけるアラニンの濃度を、０，０．１，１，５，１０ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３１に示す。図３１には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１７，１８，１８，１７，１８であった。これらの結果から、アラニン含有量が１ｍｇ／ｍＬ程度において、一番増殖カーブの傾きが大きいと判断した。
（イソロイシン）
　ａＹ−ＡＩＤ培地におけるイソロイシンの濃度を、０，０．０１ｍｇ／ｍＬ，０．１ｍｇ／ｍＬ，０．５ｍｇ／ｍＬ，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３２に示す。図３２には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１６，１７，１６，１７，１９であった。これらの結果から、イソロイシン含有量は、１ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（フェニルアラニン）
　ａＹ−ＡＩＤ培地におけるフェニルアラニンの濃度を、０，０．０１，０．１，０．５，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３３に示す。図３３には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１７，１７，１９，１９、１９であった。これらの結果から、フェニルアラニン含有量は、１ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（バリン）
　ａＹ−ＡＩＤ培地におけるバリンの濃度を、０，０．０１，０．１，０．５，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３４に示す。図３４には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１６，１５，１５，１６、１６であった。これらの結果から、バリン含有量は、１ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（セリン）
　ＡＩＤ培地におけるセリンの濃度を、０，０．０１ｍｇ／ｍＬ，０．１ｍｇ／ｍＬ，０．５ｍｇ／ｍＬ，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３５に示す。図３５の結果より、セリン含有量が０．５ｍｇ／ｍＬ前後において増殖性が特に上昇したことが確認された。これらの結果から、セリン含有量は、０．５ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（スレオニン）
　ＡＩＤ培地におけるスレオニンの濃度を、０，０．０１，０．１，０．５，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３６に示す。スレオニン含有量が０．５ｍｇ／ｍＬ前後において増殖性が特に上昇したことが確認された。これらの結果から、スレオニン含有量は、０．５ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（アスパラギン）
　ＡＩＤ培地におけるアスパラギンの濃度を、０，０．０１，０．１，０．５，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３７に示す。図３７には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１５，１６，１６，１７、１６であった。これらの結果から、アスパラギン含有量は、０．５ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（ビタミン濃度の検討）
　ＡＩＤ培地に含まれるビタミンについて検討をした。結果を図３８に示す。この結果より、パラアミノ安息香酸（図中Ａｍｉで表す）は増殖性を特に増加させる効果はないと判断した。
（パントテン酸の代替可能性）
　次に、パントテン酸と代替できる物質を検討した。結果を図３９（ａ）に示す。β−アラニンがパントテン酸と代替されることが確認された。次に、β−アラニンの濃度について検討した。結果を図３９（ｂ）に示す。β−アラニンが０．４μｇ／ｍＬ以上添加されるとパントテン酸と代替できることが確認された。
（ＡＹＤ培地の完成）（本発明の培地３）
　上記ＡＩＤ培地やａＹ−ＡＩＤ培地における検討結果に基づいて、さらに増殖性が高い培地組成の処方を作成し、ＡＹＤ′培地（本発明の培地２）と名づけた。ＡＹＤ′の処方例は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 （グルタミン、システイン）
　上記ＡＹＤ′培地において、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株を用いて、グルタミンとシステインの濃度について検討した。結果を図４０に示す。試行錯誤するうちグルタミンの濃度を、これまでの１０倍程度にしたところ、非常に生育がよくなったことが確認されたので、グルタミンは５ｇ／Ｌ、システインは０．０１ｇ／Ｌ程度が適当であると判断した。
　ＡＹＤ培地（本発明の培地３）として増殖性の高い酵母用培地を完成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 （アミノ酸の併用効果）
　上記ＡＹＤ培地において、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株を用いて、アミノ酸を上記表１４に示される通り、５つのグループに分け、グループごとに培地から除いて影響を確認した。結果を図４１（ａ）に示す。セリン、スレオニン、グリシン、メチオニン、システインのグループを除いた培地（ＡＹＤ−ＡＹ５）では、増殖性が顕著に低下することが確認されたので、ＡＹ５グループの個別のアミノ酸成分について検討をした。結果を図４１（ｂ）に示す。この結果から、メチオニンが欠如すると増殖性が低下することがわかった。かかる結果は、前記ＡＩＤ培地におけるメチオニン単独添加における検討結果と一致していない。前記表２に示されるように、ＡＩＤ培地においてはメチオニンをアミノ酸として単独で添加した場合、酵母はほとんど増殖せず、また、高濃度で添加しても増殖性によい影響を与えないことが確認されていた。また、上記ＡＹＤ′培地においてグルタミンの濃度を、５ｇ／Ｌにしたところ、さらに生育がよくなったことが確認された。これらのことから、アミノ酸の複数併用の場合と、アミノ酸の単独使用の場合とでは、そのアミノ酸が酵母の増殖性に及ぼす影響は必ずしも一致しないことが示唆されている。
（ＹＰＤ培地との比較）
　ＡＹＤ培地と、ＹＰＤ培地及びＭＭ培地との比較を行った。結果を図４２に示す。ＡＹＤ培地は、クルベイロマイセス、サッカロマイセスのどちらにおいても、ＹＰＤ培地と非常に近い増殖性を示した。クルベイロマイセスのほうがサッカロマイセスよりも高い増殖性を示したが、双方ともＡＹＤ培地における増殖性が、ＹＰＤ培地における増殖性よりも高いことが示され、本発明の培地の効果が確認された。
（栄養要求性株の検討）
　ＡＹＤ培地において、以下の各種酵母株について、栄養要求性を検討し、ＡＹＤ培地の有用性を確認した。各種酵母株は、上記基本培養方法と同じ条件で培養した。結果を図４３~図５２に示す。
　シゾサッカロミセス・ポンベＦＹ７５０７株を７０時間培養したときのデータを示す。図４３には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の７２時間後のＯＤ６００は、それぞれ１８~２０，１，１５，８，１９，１９，１７，２，１５~１７であった。シゾサッカロミセス・ポンベＦＹ７５０７株は、ビオチン要求性であるとともに、ニコチン要求性であることが確認された。また、この菌株の増殖にはＺｎ２＋が含有されることが好ましいことも確認された（図４３（ａ）と（ｂ）参照）。
　チゴサッカロミセスＲＡＫ５５７６株を２４時間培養したときのデータを示す。図４４には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ、８~１０，２，１，２，８，６，５，９，５~６であった。チゴサッカロミセスＲＡＫ５５７６株は、ビオチン要求性であるとともに、パントテン酸要求性であることが確認された。この菌株の増殖にはＺｎ２＋が含有されることが好ましいことも確認された（図４４（ａ）と（ｂ）参照）。
　クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ５８７（ＲＡＫ３６８４）株、ＮＣＹＣ１４２９（ＲＡＫ３６８５）株、及びＮＣＹＣ２７９１（ＲＡＫ３６８６）株をそれぞれ２４時間培養したときのデータを示す。図４５~４７には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ、３５~３７，２~７，０~４，１２~２９，３４~４５，２６~５０，１３~３５，１~６，３４~４４であった。これらの菌は、ビオチン要求性、ナイアシン要求性であるとともに、パントテン酸要求性であることが確認された。これらの菌株の増殖にはＺｎ２＋が必要なことも確認された（図４５（ａ）と（ｂ），図４６（ａ）と（ｂ）及び図４７（ａ）と（ｂ）参照）。
　同様に、クルベイロマイセス・ラクチスＮＲＲＬＹ−１１４０株を２４時間培養したときのデータを示す。図４８には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ、２８~３０，１，１８，１，０，２７，２９，６，４５であった。クルベイロマイセス・ラクチスは、ビオチン要求性、ナイアシン要求性であるとともに、パントテン酸要求性であることが確認された。これらの菌株の増殖にはＺｎ２＋が必要なことも確認された（図４８（ａ）と（ｂ）参照）。
　ピキア・スチピチスＮＢＲＣ１００６３（ＲＡＫ５１２８）株を２４時間培養したときのデータを示す。図４９には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ、３５~３８，４，１２，４０，３４，３８，３５，２２，５８であった。ピキア・スチピチスは、ビオチン要求性であることが確認されたが、パントテン酸要求性ではなかった。この菌株の増殖にはＺｎ２＋や鉄イオンが含有されることが好ましいことも確認された（図４９（ａ）と（ｂ）参照）。
　キャンディダ・グラブラタＢＹ２３８７６株はビオチン要求性であるとともに、ピリドキシン要求性、チアミン要求性、ニコチン要求性であることが確認された（図５０（ａ）と（ｂ）参照）。キャンディダ・ウティリスＪＣＭ９６２４株は、ビオチン要求性ではないが、チアミン要求性であることが確認された。また、この菌株の増殖にはＺｎイオンが含有されることが好ましいことも確認された（図５１（ａ）と（ｂ）参照）。キャンディダ・アルビカンスＪＣＭ１５４２株は、ビオチン要求性ではあることが確認された。この菌株の増殖にはＺｎ２＋が含有されることが好ましいことも確認された（図５２（ａ）と（ｂ）参照）。
　従来酵母用合成培地として広く用いられてきたＳＤ培地とＹＰＤ培地と本発明の培地を用いてサッカロマイセス・セレビシエとクルベイロマイセス・マルキシアヌスを培養し、増殖性を比較した。結果を図５３（ａ）及び（ｂ）に示す。本発明の培地は、富栄養培地に近い又は同等の増殖性を示し、本発明の培地の効果をもってすると、発酵産業等に有用な培地を提供するものといえる。

Claims (22)

  1. 酵母が資化可能な炭素源としての糖類と、窒素源としてのアミノ酸類と、ビタミン類と、イノシトールと、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）と、カリウムイオン（Ｋ＋）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）とが含まれ、かつ、イノシトール濃度が５０~１００００ｍｇ／Ｌである、酵母用培地。
  2. イノシトールが増殖制限因子であることを特徴とする請求項１記載の酵母用培地。
  3. さらに、窒素源として、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミンから選ばれる１又は２以上の核酸塩基が含まれる請求項１又は２記載の酵母用培地。
  4. 窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸が含まれることを特徴とする請求項１~３いずれか記載の酵母用培地。
  5. 窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、プロリン、グルタミン酸、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンから選ばれる少なくとも３種類が含まれることを特徴とする請求項１~３のいずれか記載の酵母用培地。
  6. チロシンに代えてアセチルチロシンが含まれることを特徴とする請求項５記載の酵母用培地。
  7. 窒素源として、硫酸アンモニウムを含まないことを特徴とする請求項１~６のいずれか記載の酵母用培地。
  8. 窒素源として、塩化アンモニウムを含まないことを特徴とする請求項１~７のいずれか記載の酵母用培地。
  9. 窒素源として、酢酸アンモニウムを含まないことを特徴とする請求項１~８のいずれか記載の酵母用培地。
  10. ビタミン類として、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン、チアミンから選ばれる少なくとも２種類が含まれることを特徴とする請求項１~９のいずれか記載の酵母用培地。
  11. パントテン酸に代えてβ−アラニンが含まれることを特徴とする請求項１０記載の酵母用培地。
  12. 酵母が資化可能な炭素源としての糖類として、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラフィノースから選ばれる１又は２以上の糖類が含まれることを特徴とする請求項１~１１のいずれか記載の酵母用培地。
  13. 酵母抽出エキスを含まないことを特徴とする請求項１~１２のいずれか記載の酵母用培地。
  14. サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の２４時間後の酵母の増殖性をＯＤ６００で表した場合、ＯＤ６００の値が、ＹＰＤ培地の８０％以上であることを特徴とする請求項１~１３のいずれか記載の酵母用培地。
  15. ＹＰＤ培地の９０％以上であることを特徴とする請求項１４記載の酵母用培地。
  16. 酵母が、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のいずれかに属することを特徴とする請求項１~１５のいずれか記載の酵母用培地。
  17. 酵母がサッカロマイセス属に属し、ビタミン類としてビオチン及びパントテン酸が含まれることを特徴とする請求項１６記載の酵母用培地。
  18. 酵母がクルベイロマイセス属に属し、ビタミン類としてパントテン酸、ビオチン、及びナイアシンが含まれることを特徴とする請求項１６記載の酵母用培地。
  19. 酵母がキャンディダ属に属し、ビタミン類としてピリドキシン、ビオチン、パントテン酸、チアミン、及びナイアシンから選ばれる１又は２以上が含まれることを特徴とする請求項１６記載の酵母用培地。
  20. 以下の表１に示される培地組成を有する酵母用ＡＹＤ培地。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  21. 請求項１~２０のいずれか記載の酵母用培地で酵母を好気的条件下で培養することを特徴とする酵母の培養方法。
  22. 請求項２０記載の酵母用培地から、特定成分を除去した培地にて酵母を好気的条件下で増殖させることにより、該酵母の栄養要求性を判定する方法。
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