KR100357532B1 - 사람성장호르몬의 분비생산방법 - Google Patents

사람성장호르몬의 분비생산방법 Download PDF

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Abstract

20K hGH를 코딩하는 DNA는 대장균 OppA단백질분비시그널을 코딩하는 유전자 또는 그의 형질전환체, 및 재조합플라스미드를 구축하는 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA에 직접 결합되어 있고, 대장균은 상기 플라스미드에 의해 형질전환되고, 얻어진 대장균 형질전환균주의 세포는 대장균 페리플라즘내의 20K hGH의 분비생산을 위해 배양된다. 이 방법에 의하면, 20K hGH의 효과적인 분비생산이 가능하고, 또, 대장균 페리플라즘내의 불순단백질의 레벨이 낮으므로 페리플라즘분획으로부터 20K hGH의 분리 및 정제가 용이하다.

Description

사람성장호르몬의 분비생산방법{Method for Secretory Production of Human Growth Hormone}
본 발명은 대장균을 이용해서 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 분비생산하는 방법에 관한 것으로, 특히, 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA단편의 5'말단이 대장균(E. coli) 혹은 살모넬라균 OppA분비시그널 또는 대장균 OppA분비시그널의 아미노산형질전환체를 코딩하는 DNA단편의 3'말단에 직렬로 결합되어 있는 DNA단편을 보유하고 있는 재조합플라스미드에 의해 대장균을 형질전환하고, 얻어진 대장균 형질전환체를 배양한 후, 얻어진 배양액, 세포 혹은 그 처리물을 이용해서 생산된 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또, 본 발명은 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA단편과 대장균 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA단편을 보유하고 있는 재조합플라스미드로 대장균을 형질전환시키고, 얻어진 대장균 형질전환체를 배양한 후, 얻어진 배양액, 세포 또는 그 처리물을 이용해서 생산된 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 구조를 지닌 재조합플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 배양할 때 배지조성을 변화시킴으로써 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
뇌하수체유래의 사람성장호르몬(hGH)에는 분자량 약 22,000인 것(이하, 22K hGH라 칭함)과 분자량 약 20,000인 것(이하, 20K hGH라 칭함)의 2종류가 있는 것이 공지되어 있다.
22K hGH는, 뇌하수체부전성 왜소증, 소아만성신부전 등의 치료를 위해, 재조합DNA기술에 의해 의약품을 제조하는 데 이용된다. hGH는 최근 성장촉진활성뿐만 아니라, 면역촉진활성 혹은 지방산분해자극활성 등의 우수한 활성을 지니는 것으로 판명된 바 있어, 장래 적용대상의 확대가 크게 기대되고 있다.
한편, 근년, 22K hGH의 임상에의 사용에 있어서의 부작용의 위험이 널리 보고되어 있어, 임상에서의 GH의 안전성 및 그의 응용의 확대에 있어 중요한 논점으로 되고 있다. 데이터로 보고된 22K hGH의 사용으로부터 발생하는 위험으로서는 백혈병을 유발하고 당뇨병을 일으킬 가능성 등을 들 수 있다. 임상용도를 확대시키고자 할 경우에는 부작용의 위험이 낮은 성장호르몬이 필요하다.
20K hGH는 22K hGH의 N말단으로부터 제 32번째 내지 46번째의 15개의 아미노산잔기가 결여된 이외에는 191개의 아미노산으로 이루어진 22K hGH에 대응하는 아미노산서열을 지니고 있다. 22K hGH에 비해서, 이 20K hGH는 백혈병세포증식활성이나 당뇨병원성의 지표인 글루코스과민성이 낮다고 보고되어 있다. 따라서, 22K hGH에 대해 보고된 부작용의 위험이 20K hGH에서는 적은 것으로 판명되었다. 또한,in vitro실험결과에 의하면, 20K hGH는 GH리셉터에 결합하는 모드에 있어서 22K hGH와는 다르다는 것이 판명되었다. 즉, 엠. 와다 등은, 두 hGH간에 차이가 있다는 것, 즉, 22K hGH가 생리적 농도레벨에서 혈청에 존재하는 GH결합단백질(GH리셉터외부격막단백질)에 결합하기 때문에 세포표면상에서 GH리셉터에 대한 22K hGH의 결합활성이 감소되는 한편, 20K hGH는 생리적 조건하에서 GH결합단백질에 결합하기가 거의 곤란하기 때문에 GH리셉터에 대한 20K hGH의 결합활성의 저감은 일어나지 않는 점과, 성장호르몬이 GH리셉터를 통해 작용하는 데 필요한 1:2복합물(성장호르몬 1몰과 GH리셉터 2몰과의 복합물)에 있어, 22K hGH는 1:1복합물(비활성형)을 형성하는 반면, 20K hGH는 GH리셉터와 1:2복합물(활성형)을 형성하는 점을 분명히 하였다(Mol. Endo 12, 1, 146-156, 1997). 이들 결과로부터, 20K hGH는 22K hGH보다도 높은 활성을 지닐 수 있을 것으로 기대된다. 또, 지방분해촉진활성에 대해서는 명확한 데이터는 없지만, 20K hGH가 22K hGH와 마찬가지로 활성이 있는 것으로 판명되었다(일본국 특허공개공보 제 97/216832호 또는 유럽특허공보 제 0753307호).
상기 언급한 바와 같이, 20K hGH는 22K hGH보다도 위험성이 낮고 활성은 높은 성장호르몬인 것으로 판명되었고, 또, 의약품으로서 유용성이 기대되는 신규의 성장호르몬으로 되었다.
재조합DNA기술의 최근의 발전에 의하면, 숙주유기체로서 미생물을 이용해서 이종단백질을 생산하는 것이 가능하다. 일반적으로, 미생물을 이용한 단백질생산을 위해서는, 세포내발현법과 분비생산법을 이용한다. 세포내발현법에 있어서는, N말단에 메티오닌을 보유하는 단백질이 세포질내에 축적된다. N말단에 메티오닌잔기가 없는 단백질을 얻기 위해서는, 예를 들면, N말단에 메티오닌잔기를 함유하는 아미노산서열을 펩티다제에 의해 효소적으로 절단할 필요가 있다. 또한, 세포내발현법에 의해 얻어진 단백질은 그들의 입체구조에 활성형태가 없어 리폴딩을 필요로 한다. 따라서, 세포내발현법은 반드시 단백질생산에 효과적인 방법으로서 권장되는 것은 아니다.
한편, 대장균을 이용한 분비생산법에 있어서는, 목적단백질이 분비되어 페리플라즘에 축적된다. 페리플라즘추출물로부터의 단백질의 정제는, 불순단백질의 레벨이 세포내발현법에서의 것보다도 낮으므로 용이하다. 게다가, 분비된 단백질은, N말단에 메티오닌을 지니지 않아, 그들의 입체구조에 당연히 활성형태를 지니므로, 분비생산법이 우수하다.
하지만, 미생물을 이용한 분비생산법은, 고도로 복잡한 기술을 필요로 하므로, 거의 공업적 규모에 적용되지는 않고 있다. 그 이유는, 세포질내에서 합성된 전구체단백질은 세포질막을 투과하고, 또 분비시그널은 프로세싱에 의해 정확하게 절단·제거될 필요가 있기 때문이다.
미생물에서의 단백질분비에 대해서는, 그의 메카니즘, 관련인자 및 그들의 기능이 알려져 있다. 이들 지견에 의거해서, 효과적인 분비법에 대해 각종 시도가 행해져 있다.
첫번째로, 분비시그널에 대해 설명한다. 분비시그널은, 세포질격막에 목적단백질을 인도하기 위해 단백질분비에 있어 매우 중요한 역할을 지닌다. 또, 분비시그널의 작용에 대해, 그들의 N말단의 정전하영역에서의 양하전과 중앙부의 소수성 영역의 소수성이 중요하다는 것이 명백하게 되었다(J. Biol. Chem., 267, 4882-4888, 1992). 분비시그널의 구조적 특성에 대한 이 지견에 의거해서, 우다카 등은, 바실루스 브레비스(Bacillus brevis)를 숙주로서 사용하는 분비생산에 있어서, 바실루스 브레비스유래의 MWP(middle wall protein)의 분비시그널의 N말단정전하영역에 염기성 아미노산(Arg)을 부가하고, 또한 중앙부소수성 영역에 소수성 아미노산(Leu)을 부가하는 개변을 행하여, 혀가자미어류성장호르몬의 분비효율을 60mg/ℓ까지 향상시킨 것이 보고되어 있다(일본 농예화학회지, 67(3), 372, 1993).
그러나, 이 분비시그널의 아미노산서열의 개변에 대해서는 보편적인 지도원리는 없어, 시행착오에 의해 바람직한 서열을 발견하지 않으면 안되는 것이 현실이다. 또, 분비생산되는 목적단백질에 대해서 어떠한 분비단백질유래의 분비시그널을 선택하는가에 대해서는 현재 명확한 지침은 없으므로, 분비생산되는 개개의 목적단백질에 대해 적절한 분비시그널을 발견하지 않으면 안된다.
상기 문제점은 예를 들면 일본국 특허공개공보 제 296491/94호의 설명으로부터 알 수 있다. 이 공보에는, 22K hGH의 분비생산에 효과적인 알칼리포스파타제 혹은 엔테로톡신으로부터 유래된 분비시그널이 수종류의 진핵단백질의 분비생산에 반드시 효과적인 것은 아니라고 기재되어 있다. 즉, 분비시그널과 분비단백질의 조합에 의존해서, 단백질이 합성되지 않는 경우나, 혹은 단백질이 세포질내에서 발현되지만 분비되지 않고, 전구체단백질이 세포질내에 남은 채로 있었던 경우가 보고되어 있다.
따라서, 개개의 분비단백질에 적합한 분비시그널을 선택할 필요가 있지만, 아직까지, 어떠한 단백질의 분비에도 유용한 분비시그널은 발견되지 않았다.
두번째로, 분비생산의 개량을 위한 단백질의 공발현의 이용에 대해 설명한다. 지금까지, GH이외의 단백질의 분비생산에 있어서의 개량은, 예를 들면, SecE 및 prlA4(SecY의 변종단백질)의 공발현에 의한 인터로이킨 6에 대한 것(BIO/TECHNOLOGY, 12, 178-180, 1994)과, 샤프롱단백질의 공발현에 의해 사람의 과립체콜로니자극인자(G-SCF)에 대한 것(Biochem. Biophys. Res. Commun., 210(2), 524-529, 1995)이 보고되어 있다.
20K hGH의 분비생산에 관해서는, 글루타티온리덕타제가 20K hGH와 공발현되는 방법(일본국 특허공개공보 제 322586/96호; 유럽특허공보 제 0735140호)과, 대장균 Sec단백질이 20K hGH와 공발현되는 방법(일본국 특허공개공보 제 313191/97호; 유럽특허공보 제 0798380호)이 보고되어 있다.
상기 일본국 특허공개공보 제 322586/96호 (또는 유럽특허공보 제 0735140호)에 따른 글루타티온리덕타제와의 공발현에 의해 20K hGH를 생산하는 방법에 의하면, 배양액 1ℓ당 약 70㎎의 생산이 가능했지만, 보다 높은 생산성이 요망되고 있다.
따라서, 글루타티온리덕타제와의 공발현에 의해 분비생산의 생산성을 향상시킬 수 있지만, 본 발명자들의 연구에 의하면, 이 방법에서는, 목적단백질인 20K hGH이외의 불순단백질이 삽투압충격법에 의해 셀(즉, 균체)로부터 얻어진 페리플라즘유체추출물중에 상당량 함유되어 있는 것을 알게 되었다. 그 결과, 페리플라즘유체추출물로부터 20K hGH의 정제는 많은 공정을 구비하고 있어, 20K hGH를 의학적으로 허용가능한 등급으로 정제하는 데는 높은 비용을 초래하게 된다.
본 발명의 일목적은 미생물을 이용해서 20K hGH를 분비생산하는 보다 효과적인 방법을 제공하는 데 있고, 본 발명의 다른 목적은, 페리플라즘유체추출물중에존재하는 불순단백질의 레벨을 저감시킨, 미생물을 이용해서 20K hGH를 분비생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은, 20K hGH를 코딩하는 DNA의 5'말단과, 대장균 OppA의 개변형 분비시그널인 분비시그널을 코딩하는 DNA의 3'말단이 결합된 DNA단편을 함유하는 플라스미드, 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체 및 상기 대장균 형질전환체를 이용해서 20K hGH를 분비생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 기타 목적은, 20K hGH를 코딩하는 DNA와 대장균 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA를 지닌 재조합플라스미드, 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체 및 상기 대장균 형질전환체를 이용해서 20K hGH를 분비생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은, 일본국 특허공개공보 제 322586/96호(또는 유럽특허공보 제 0735140호)에 기재된 공지의 균주, 즉 공발현단백질로서 대장균으로부터 유래된 글루타티온리덕타제와 분비시그널로서 바실루스 아밀로리퀴파시엔스의 중성프로데아제로부터 유도된 개변형 분비시그널을 이용해서 20K hGH를 분비생산가능한 대장균 형질전환체 MT-10765(FERM BP-5020)를 형질전환하려고 시도했다.
첫째로, 20K hGH를 보다 효과적으로 분비생산할 수 있는 새로운 분비시그널을 연구하였다.
새로운 분비시그널의 효과를 확인하기 위해서는, 20K hGH의 분비생산량에 대한 그들의 효과를 확인할 필요가 있다. 그 확인절차는, 상이한 분비시그널을 코딩하는 DNA의 3'말단이 20K hGH를 코딩하는 DNA의 5'말단에 결합된 DNA단편을 각각 함유하는 플라스미드를 구축하는 공정, 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균을 분리하는 공정, 얻어진 형질전환체를 배양하는 공정 및 20K hGH의 분비생산량을 측정하는 공정으로 이루어진다.
본 발명자들은, 미생물에서 다량 분비되는 단백질의 분비시그널을 이용해서 20K hGH의 생산성을 증가시키고자 시도하였으나, 종래의 방법에 의한 것보다도 이 방법에 의해서 보다 효과적으로 20K hGH를 생산하는 분비시그널을 발견할 수 없었다.
단백질분비는, 단백질이 에너지의존방식에 의해 세포막을 투과하는 데 있어서의 물리화학적 현상이다. 따라서, 본 발명자들은 20K hGH와 그 구조가 고도로 유사한(즉, 상동성을 지닌) 단백질의 분비시그널을 이용하는 것이 바람직한 것으로 가정하였다. 그들의 구조가 20K hGH와 유사한 단백질로서는, 20K hGH와 고도로 유사한 아미노산조성을 지닌 단백질과 20K hGH와 마찬가지로 정제컬럼상에서의 거동을 지닌 단백질이 선택되었다. 아미노산서열의 상동성 탐색에 의하면, 그들의 아미노산서열이 고도로 유사한 단백질로서는 TRBC(Meneewannakul, S. et al., J. Bacteriol., 173, 3872-3878, 1991) 및 DPPA(Periplasmic Dipeptide Transport Protein Precursor(Dipeptide-binding Protein))(Olson, E. R., et al., J. Bacteriol., 173, 234-244, 1991)가 선택되었다. 또, 정제컬럼상에서의 거동이 20K hGH와 유사한 단백질로서는, 이온교환컬럼 및 친화도컬럼상에서의 거동이 20K hGH와 유사한 본 발명자들에 의해 명백해진 대장균 OppA(Periplasmic, Oligopeptide Binding Protein, K. Kashiwagi et al., J. Biol. Chem., 265, 8387-8391, 1990)가 선택되었다.
20K hGH의 분비생산시의 상기 3종류의 단백질의 분비시그널의 효과에 대한 연구에 의하면, TRBC 및 DPPA로부터 유래된 분비시그널에 의한 20K hGH의 분비생산량은 1㎎/ℓ미만이었으며, 즉 20K hGH의 분비생산시에 증가가 없었음을 알 수 있다. 그러나, 놀랍게도, 대장균 OppA 분비시그널을 이용한 20K hGH의 분비생산량은, 일본국 특허공개공보 제 322586/96호 (또는 유럽특허공보제 0735140호)에 기재된 MT-10765(FERM BP-5020)에 대한 것보다도 많은 것으로 드러났다.
또한, 본 발명자들은 OppA유래의 분비시그널을 개변함으로써 20K hGH의 분비생산을 더욱 향상시키고자 시도하였다. 그 결과, 염기성 아이노산인 리신의 적절한 수의 서열이 N말단서열영역의 정전하영역에 삽입되어 있고, 소수성 아미노산인 로이신의 적절한 수의 서열이 중앙부 소수성영역에 삽입되어 있는 분비시그널을 사용함으로써, 배양액 1ℓ당 110㎎이상, 즉 천연형 OppA유래의 분비시그널을 사용하는 것보다도 높은 생산성을 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.
또, 대장균 OppA분비시그널이 대장균의 분비생산에 있어서 단백질분비에 효과적인 역할을 지니는 것은 이미 공지되어 있는 바, 본 발명의 범위내에 포함되지 않는다. 그러나, OppA분비시그널의 개변이 상기 이미 알려진 정보로부터 언급한 바와 같이 20K hGH의 분비생산에 매우 효과적인 것인지의 여부를 예상하는 것을 불가능하다.
본 발명자들은, 본 발명의 목적을 달성하기 위한 두번째 시도로서 단백질의공발현의 개량을 조사하였다.
그 결과, 본 발명자들은, 대장균유래의 시그널펩티다제 1의 사용에 의해 20K hGH의 분비생산을 일본국 특허공개공보 제 322586/96호(또는 유럽특허공보 제 0735140호)에 기재된 글루타티온리덕타제의 사용에 의해 얻어진 것과 거의 동일한 레벨까지 가져갈 수 있는 것을 발견하였다.
또한, 놀랍게도, 삽투압충격법에 의해 배양세포로부터 추출한 페리플라즘용액중에 존재하는 20K hGH이외의 불순단백질의 비율이, 글루타티온리덕타제에 의한 공발현에 의한 것에 비해서 시그널펩티타제 1에 의한 공발현에 있어 매우 낮은 것으로 판명되었다. 그 이유는 명백하지는 않지만, 시그널펩티다제 1은 세포가 20K hGH발현에 의해 받는 응력을 강하게 억제하고, 그 결과, 배양세포의 세포용해경향(즉, 용균경향)이 감소하고, 이에 따라 페리플라즘추출액중에 세포질단백질의 오염이 저감되는 것으로 추측되었다. 이러한 페리플라즘용액중의 불순단백질의 저감은, 페리플라즘분획추출액으로부터의 20K hGH의 정제를 용이하게 하고, 따라서, 20K hGH제조시의 정제효율향상 및 비용저감의 향상에 현저하게 기여한다.
시그널펩티타제 1은, 세포질내에서 생성된 전구체단백질이 격막을 투과한 경우 분비시그널을 절단하는 효소이다. 잔 마텐 반 디즐(Jan Maarten van Dijl)등은, 각종 분비시그널에 결합된 경우의 베타락타마제의 분비생산시의 시그널펩티타제 1의 과잉공발현효과를 연구하였다(Jan Maarten van Dijl et al., Mol. Gen. Genet., 227, 40-48, 1991). 이들은, 프로세싱(시그널의 결단)효율에 대한 시그널펩티타제 1의 공발현효과가 전구체 및 분비되는 목적단백질에 있어서의 분비시그널서열의 조합에 따라 다르다고 보고하고 있다.
그러나, 시그널펩티다제 1의 공발현이 20K hGH의 분비효율을 향상시키는 데 효과적인 지의 여부는 상기 보고로부터는 전혀 명백하지 않고, 또한, 배양세포로부터 추출된 페리플라즘용액중의 불순단백질의 양이 공발현시에 감소되도록 세포의 용균경향이 낮은 점에 대해서는 전혀 공지되어 있지 않다.
또한, 본 발명자들은 20K hGH의 분비생산의 더욱 개량을 결정하기 위하여 배양조건을 변경하였다. 그 결과, 본 발명자들은 일본국 특허공개공보 제 322586/96호(유럽특허공보 제 0735140호에 있어서도 마찬가지)에 기재된 공지의 균주(MT-10765(FERM BP-5020))를 이용해서, 배지중의 탄소원의 농도를 증가시킴으로써 20K hGH의 생산량을 82㎎/ℓ까지 높이는 데 성공하였다.
따라서, 이 방법을 본 발명의 MT-10852(FERM BP-6290) 및 MT-10853(FERM BP-6291)에 또한 적용하였다. 그 결과, 예를 들면 3.5% 글리세롤 및 1.5% 숙신산에 의해, 종래의 생산량의 4∼5배, 즉, MT-10852(FERM BP-6290)를 이용한 경우에는 350㎎/ℓ까지, MT-10853(FERM BP-6291)을 이용한 경우에는 350㎎/ℓ까지 생산량이 성공적으로 증가하였다.
또한, 상기 명세서에 기재된 방법에 따른 일본국 특허공개공보 제 322586/96호(또는 유럽특허공보 제 0735140호의 명세서)에 기재된 공지의 균주인 MT-10765(FERM BP-5020)의 세포로부터 추출된 페리플라즘용액중의 비율이 1이 되도록 설정해서, 전체단백질에 대한 20K hGH의 비율을 비교하였다. 그 결과, 글루타티온리덕타제에 의한 공발현시의 MT-10853(FERM BP-6291)은 3.4, 시그널펩티타제 1에 의한 공발현시의 MT-10852(FERM BP-6290)는 8.3이었다. 따라서, 본 발명의 MT-10852(FERM BP-6290) 및 MT-10853(FERM BP-6291)에서 추출한 20K hGH의 생산성 및 정제법은 종래의 방법에 비해서 현저하게 개량되어 20K hGH생산비를 저감할 수 있었다.
본 발명은 다음과 같이 해서 완성되었다.
즉, 본 발명은 다음과 같이 구성되어 있다:
(1) 대장균 OppA분비시그널에 대해서 60%이상 상동성을 지닌 분비시그널(단, 대장균 OppA분비시그널 및 살모넬라균 OppA분비시그널은 제외),
(2) 상기 (1)항에 있어서의 분비시그널을 코딩하는 DNA,
(3) 대장균 OppA분비시그널에 대해 60%이상의 상동성을 지닌 분비시그널을 코딩하는 DNA단편과 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA단편을 함유하는 재조합플라스미드에 있어서, 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA가 상기 분비시그널을 코딩하는 DNA의 바로 뒤에 결합된 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드,
(4) 상기 (3)항의 제조합플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체,
(5) 상기 (4)항의 형질전환체를 배양하고, 얻어진 세포로부터 페리플라즘분획을 추출한 후, 얻어진 페리플라즘분획용액을 정제하여 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 얻는 것을 특징으로 하는 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬의 생산방법,
(6) 분비시그널을 코딩하는 DNA단편과, 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA단편과, 대장균 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA단편을 함유하는 재조합플라스미드에 있어서, 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA의 5'말단과 상기 분비시그널을 코딩하는 DNA의 3'말단이 결합된 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드,
(7) 상기 (6)항의 재조합플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체,
(8) 상기 (7)항의 형질전환체를 배양하고, 얻어진 세포로부터 페리플라즘분획을 추출한 후, 얻어진 소량의 불순단백질을 지닌 페리플라즘분획용액을 정제하여 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 얻는 것을 특징으로 하는 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬의 생산방법.
본 발명은, 또한, 상기 재조합플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체에 의해 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬의 생산시에 배지조성을 변화시켜, 즉, 0.01-10% 글리세롤 및 0.01-5% 숙신산의 적어도 1종을 함유하는 배지를 이용해서 생산을 증가시키는 방법도 포함한다.
본 발명은 종래의 방법보다도 다량의 20K hGH의 분비생산을 가능하게 하는 대장균을 이용한 20K hGH의 분비생산방법을 제공한다.
도 1은 20K hGH분비플라스미드 pGHR52의 구축법을 표시한 도면
도 2는 20K hGH분비플라스미드 pGHR521-529의 구축법을 표시한 도면
도 3은 20K hGH분비플라스미드 pGHS525의 구축법을 표시한 도면
〈도면의 주요부분에 대한 부호의 설명〉
NP프로모터: 바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 중성프로테아제유전자의 프로모터영역
20K hGH: 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬
GR: 대장균유래의 글루타티온리덕타제유전자
tac: tac프로모터유전자
lacIq: lacIq유전자
tetr: 테트라사이클린내성유전자
oppA: 대장균 OppA단백질의 분비시그널
m-oppA시그널: 대장균 OppA단백질의 개변형 분비시그널
SPI: 시그널펩티다제 1
rop: pBR322유래의 롭(rop)유전자
ori: pBR322유래의 복제기원
이하, 본 발명을 바람직한 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에 사용되는 분비시그널은 대장균 또는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 OppA단백질의 분비시그널(대장균 OppA분비시그널 또는 살모넬라균 OppA분비시그널) 및 대장균 OppA분비시그널의 아미노산서열을 개변시켜 분비시그널로서의 기능과 60%이상의 상동성을 유지시키도록 한 개변형 분비시그널(개변형 OppA분비시그널)을 포함한다.
대장균 OppA분비시그널은 서열목록에서 서열번호 1의 아미노산서열을 지닌다. 개변형 OppA분비시그널의 예로서는, 다음의 개변형중 적어도 1종을 들 수 있다:
(1)서열번호 1의 제 2번째 내지 제 7번째 단편에 있어서 1 내지 3개의 염기성 아미노산을 삽입한 것,
(2)서열번호 1의 제 2번째 내지 제 7번째 단편에 있어서 1 내지 3개의 산성 혹은 중성 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환한 것,
(3)서열번호 1의 제 9번째 내지 제 23번째 단편에 있어서 1 내지 9개의 소수성 아미노산을 삽입한 것 및
(4)서열번호 1의 제 9번째 내지 제 23번째 단편에 있어서의 1 내지 9개의 비소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로 치환한 것.
상기 (1)항 및 (2)항의 개변형에 있어서의 염기성 아미노산의 예로서는 Lys 및 Arg를 들 수 있고, 이들중 적어도 1종을 이용할 수 있다. 상기 (3)항 및 (4)의 개변형에 있어서의 소수성 아미노산으로서는, Leu, Ile, Val 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 아미노산을 이용할 수 있다.
상기 개변형 OppA시그널의 예로서는, 서열번호 2 내지 27의 아미노산서열을 지닌 것을 들 수 있다. 이들 바람직한 서열번호 2 내지 27의 개변형 OppA분비시그널중, 서열번호 23의 개변형 OppA분비시그널이 가장 높은 분비생산성을 나타내는 가장 바람직한 예이다.
살모넬라균 OppA분비시그널은 대장균 OppA분비시그널에 대해 매우 높은 상동성을 지닌다. 살모넬라균 OppA분비시그널은 이미 공지되어 있어, 본 발명의 범위내는 아니다. 그러나, 살모넬라균 OppA분비시그널의 개변형(예를 들면, 살모넬라균 OppA분비시그널에 대해 그들의 아미노산서열에 있어 60%이상 상동성을 지닌 개변형 분비시그널)은 대장균 OppA분비시그널 또는 그의 개변형과 동등한 효과가 있으므로, 해당 개변형 살모넬라균 OppA분비시그널은 본 발명의 범위내이다.
본 발명의 재조합DNA는, 20K hGH를 코딩하는 DNA의 5'말단이 대장균 또는 살모넬라균 OppA분비시그널 혹은 그들의 개변형을 코딩하는 DNA의 3'말단에 직접 결합되어있는 구조를 지니며, 숙주내에 발현되어 대장균 또는 살모넬라균 OppA분비시그널 혹은 그들의 개변형이 20K hGH의 N말단에 결합되어 있는 프로세서를 얻을 수 있다.
20K hGH를 코딩하는 DNA로서는, 20K hGH의 mRNA서열에 의거한 화학적으로 합성된 DNA 혹은 cDNA를 포함하는 공지의 DNA단편이면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 또, 2종류의 상이한 아미노산인 세린과 메티오닌은 20K hGH의 N말단 아미노산서열로부터 제 14번째 아미노산으로 보고되어 있다. 즉, 마스다, 엔. 등(Biophysica acta, 949, 125, 1988)은, N말단으로부터 제 14번째아미노산을 코딩하는 cDNA염기서열이 AGT(세린용 코드)라고 보고하고 있는 반면, 마티알, 제이.에이. 등(Science, 205, 602, 1979)은 mRNA의 N말단으로부터의 14번째 아미노산을 코딩하는 RNA염기서열이 AUG(메티오닌용 코드)라고 보고하고 있다. 본 발명에 있어서는, 상기 어느 한쪽의 아미노산을 코딩하는 DNA도 사용할 수 있다. 또한, 아미노산서열중 1 내지 5개의 아미노산이 20K hGH의 특징과 기능을 저해하지 않는 범위내에서 치환, 결실, 손실 또는 삽입된 20K hGH도 본 발명의 범위내이다.
본 발명의 20K hGH의 생산용 재조합플라스미드는, 이 재조합DNA를 대장균용의 pBR322 및 pUC19 등의 플라스미드에 편입시킴으로써 구축하여, 숙주세포에서의 발현을 가능하게 하는 프로모터와의 조합에 있어 숙주세포내의 증폭가능한 증폭기원을 지닌다. 프로모터는, 숙주세포내의 재조합DNA의 발현을 가능하게 하는 한 사용되는 숙주의 종류에 따라 선택할 수 있다.
숙주로서는, 병원성이 아니고 편재해서 이용되는, JM109, HB101 및 W3110(ATCC 27325) 등의 대장균균주가 바람직하다. ATCC는 "American Type Culture Collection"의 약자이다.
재조합플라스미드의 예로서는, 프로모터, 리보솜결합부위, 분비시그널을 코딩하는 DNA 및 20K hGH를 코딩하는 DNA가 5'말단에서 3'말단방향으로 차례로 모두결합되어 있는 것을 들 수 있다.
공발현시스템에 의한 20K hGH의 분비생산에 사용되는 시그널펩티다제 1은, 대장균으로부터 유래하는 것이다. 또, 본 발명에서 의도하는 바와 같이 공발현에 의해 20K hGH의 분비를 향상시킬 수 있는 범위에서 대장균유래의 시그널펩티다제 1의 아미노산서열의 1종 또는 2종의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실되어 있는 서열도 본 발명의 범위내이다.
시그널펩티다제 1유전자는 원래 대장균 염색체에 있으므로 대장균유래의 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA를 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 숙주로서 대장균을 이용할 경우, 공발현은, 숙주로부터 유래하는 것이외에 인공적으로 도입된 부가DNA의 발현에 기인한다.
프로모터로서는, 숙주에서 기능하는 것처럼 길게 시그널펩티다제 1을 발현하는 것이면 어떠한 프로모터라도 이용할 수 있다. 시그널펩티다제 1의 공발현은 20K hGH의 분비레벨에 악영향을 미치므로, 과잉발현은 바람직하지 않다. 따라서, 이하의 각 실시예에 기재된 바와 같이, tac프로모터에 의해 시그널펩티다제 1의 발현레벨을 억제하는 lacIq를 사용하는 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 또, 시그널펩티다제 1의 공발현은, 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA와 20K hGH를 코딩하는 DNA를 동일플라스미드속에 편입시키거나, 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA와 20K hGH를 코딩하는 DNA를 개별의 플라스미드에 편입시키거나, 시그널펩티다제유전자가 천연적으로 존재하는 대장균 염색체DNA속으로 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA를 추가적으로 편입시킴으로써 행할 수 있다.
동일플라스미드속에 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA 및 20K hGH를 코딩하는 DNA를 편입시킴으로써 구축된 공발현용 재조합플라스미드의 예는, 프로모터, 리보솜결합부위, 분비시그널을 코딩하는 DNA, 20K hGH를 코딩하는 DNA, 프로모터 및 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA가 5'말단에서 3'말단방향으로 이 순서로 결합되어 있는 구조를 지닌다.
공발현계용의 제조합플라스미드속에 편입시키는 분비시그널로서는, 20K hGH의 분비를 가능하게 하는 것이면 어떠한 분비시그널도 사용가능하다. 바람직한 예로서는, 상기 대장균 또는 살모넬라균 OppA분비시그널 혹은 이들의 개변형을 들 수 있다. 이 계에 있어서, 상기 20K hGH를 코딩하는 DNA 및 DNA의 발현을 위한 프로모터, 복제기원 등도 사용가능하다.
본 발명의 대장균 형질전환체는, 공지의 방법에 의해 상기 재조합플라스미드를 숙주에 편입시킴으로써 얻어질 수 있다. 이 숙주는, 통상의 방법, 예를 들면 염화루비듐법에 의해 컴피턴트셀(competent cell)을 제조하고, 얻어진 컴피턴트셀과 플라스미드를 혼합한 후, 그 혼합물을 42℃에서 1분간 열충격을 행하여 숙주세포속으로 플라스미드를 편입시키는 방법에 의해 재조합플라스미드에 의해 용이하게 형질전환된다.
얻어진 형질전환체에 있어, 분비시그널과 20K hGH가 결합된 전구체는, 프로모터 및 리보솜결합부위서열의 제어하에 세포질내에 발현되며, 이 전구체가 내부격막을 투과한 경우, 시그널펩티다제 1에 의해 분비시그널이 절단된 후, 천연형 20K hGH가 분비된다. 숙주로서 대장균을 이용할 경우, 대장균의 페리플라즘에 천연형 20K hGH가 분비·축적된다.
20K hGH의 분비생산을 위한 본 발명의 대장균 형질전환체의 예로는, MT-10853(FERM BP-6291) 및 MT-10852(FERM BP-6290)를 들 수 있다. 이들 균주는, 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국 이바라켕 츠쿠바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 특허수속상의 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약에 따라 상기 수탁번호로 기탁되어 있다.
숙주로서 대장균을 이용한 20K hGH의 분비생산용의 대장균 형질전환체는 플라스크 혹은 자(jar)발효기에서 적절하게 배양시킬 수 있다. 배양온도는 바람직하게는 25-37℃, 보다 바람직하게는 28-30℃이다. 통상의 대장균 배양에 사용되는 배지라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 바람직한 배지로서는, 0.01-10%, 바람직하게는 0.1-5% 글리세롤 및 0.01-5%, 바람직하게는 0.1-4%, 더욱 바람직하게는 0.1-3% 숙신산을 함유한 2배농도의 LB배지(20g/ℓ폴리펩톤, 10g/ℓ효모추출물)를 들 수 있다. 글리세롤 및 숙신산의 함유효과는 조합해서 첨가한 경우 현저하다. 그러나, 글리세롤 또는 숙신산을 그 자체로 첨가한 경우에도 효과를 볼 수 있다.
대장균 형질전환체로부터의 20K hGH는, 단백질을 페리플라즘으로부터 추출 및 정제하는 통상의 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들면, 삼투압충격법(Nossal G.N., J. Biol. Chem.,241(13), 3055-3062, 1996)을 이용할 수 있다. 추출한 페리플라즘분획은 통상의 단백질정제법, 예를 들면 컬럼크로마토그래피법에 의해 정제할 수 있다. 이 때, 이온교환컬럼크로마토그래피법에서는 단백질을 우선 담체상에 보유시킬 필요가 있어, 본 발명에 있어서는 페리플라즘액체분획이 20K hGH이외의 불순단백질을 저레벨로 함유하므로 컬럼의 체적이 적은 것을 이용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 다음의 각종 예에 의해 상세히 설명하나, 본 발명은 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: OppA분비시그널의 유용성에 대한 연구
[1] OppA분비시그널유전자를 함유하는 20K hGH분비플라스미드의 구축
서열번호 28 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드를 PCR(Polymerase Chain Reation)에 의해 2중표준사슬로 만들고, 얻어진 사슬을 제한 엔도뉴클레아제 SacI 및 PstI에 의해 절단하여 OppA분비시그널의 전반부와 바실루스 아밀로리퀴파시엔스의 중성프로테아제유래의 프로모터를 코딩하는 DNA단편(1)을 얻었다. 주형으로서, 일본국 특허공개공보 제 322586/96호에 기재된 균주 MT-10765(FERM BP-5020)유래의 분비플라스미드 pGHR10을 이용해서 OppA분비시그널의 후반부를 코딩하는 DNA단편 및 20K hGH를, 서열번호 30 및 서열번호 31의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 얻어진 PCR생성물을 제한효소 PstI 및 XbaI로 절단하여 DNA단편(2)를 얻었다. 또, 분비플라스미드 pGHR10을 제한효소 SacI 및 XbaI로 절단하여 벡터측단편(3)을 얻었다. 이들 DNA단편(1), (2) 및 (3)을 라이게이트(ligate)하여 분비플라스미드 pGHR52를 구축하였다. 이들 공정의 프로세스는 도 1에 표시되어있다.
[2] 개변형 OppA분비시그널유전자를 함유하는 20K hGH분비플라스미드의 구축
주형으로서 상기 [1]항에서 구축한 pGHR52를 이용해서, OppA분비시그널의 개변부 및 바실루스 아밀로리퀴파시엔스의 중성프로테아제유래의 프로모터를 코딩하는 DNA단편을, 서열번호 32의 올리코뉴클레오티드 및 서열번호 33-39의 각종 올리고뉴클레오티드를 선택적으로 이용한 PCR에 의해 증폭하였다. 얻어진 PCR생성물을 제한효소 SacI 및 PstI에 의해 절단해서 단편(4), (5), (6), (7), (8), (9) 및 (10)을 얻었다. 다음에 , 상기 단편(2), (3) 및 단편(4)를 혼합해서 라이게이트한 후, 대장균 세포의 형질전환에 이용하여(즉, 도 1의 단편(1)대신에 단편(4)를 이용함), 분비플라스미드 pGHR521을 얻었다. 마찬가지로, 단편(4)대신에 단편(5)를 이용해서 분비플라스미드 pGHR523을 얻었다. 또, 단편(1)대신에 각각 단편(6), (7), (8), (9) 및 (10)을 이용해서 분비플라스미드 pGHR525, pGHR527, pGHR529, pGHR524 및 pGHR526을 얻었다(도 2).
[3] OppA분비시그널유전자를 함유하는 20K hGH분비플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체의 평가
대장균 W3110균주(ATCC 27325)의 세포를 상기 [1]항에서 구축된 분비플라스미드 pGHR52에 의해 형질전환하여 대장균 형질전환균주 W3110/pGHR52를 얻었다.
이 형질전환균주의 세포를, 10㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유한 LB한천배지에서 30℃에서 18시간 배양하였다. 얻어진 세포를, 액체배지(20g/ℓ폴리펩톤, 10g/ℓ효모추출물, 10g/ℓ숙신산, 10g/ℓ 글리세롤 및 30㎎/ℓ테트라사이클린)에서 30℃에서 24시간 배양하였다. 배양후, 분비·축적된 20K hGH를 함유하는 페리플라즘분획을, 삼투충격법에 의해 세포로부터 회수하고, 해당 페리플라즘유체분획중의 20K hGH농도를, 사람성장호르몬에 대한 항체를 이용한 효소-면역측정법에 의해 측정하였다. 이 측정결과로부터 배양액 1ℓ당 분비된 20K hGH의 양을 산출하였다. 분비생산량을 비교하기 위해, MT-10765(FERM BP-5020)의 세포를 마찬가지로 배양하였다. 그 결과는 표 1에 표시되어 있다.
<상이한 분비시그널을 이용한 20K hGH의 분비생산량의 차이>
플라스미드 pGHR10 pGHR52
분비시그널 바실루스 아밀로리퀴파시엔스유래(개변형) 대장균 OppA유래
생산량(㎎/ℓ) 76 89
표 1에 표시한 결과로부터, OppA분비시그널유전자를 보유하는 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체가, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스의 중성프로테아제유래의 개변형 분비시그널용 유전자를 보유하는 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체에 비해 20K hGH의 분비생산에 있어 우수하다는 것을 알 수 있다.
[4] 개변형 OppA분비시그널용의 유전자를 보유하는 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체의 평가
대장균 W3110균주(ATCC 27325)의 세포를 상기 [2]항에서 구축한 분비플라스미드에 의해 형질전환시켜 대장균 형질전환균주를 얻었다. 얻어진 형질전환체의 세포를 상기 [3]항에 기재된 바와 같이 배양시켜, 마찬가지로 분비량을 측정하였다. 그 결과는 표 2에 표시되어 있다.
<각종 개변형 OppA분비시그널에 의한 20K hGH의 분비차>
플라스미드 생산량(㎎/ℓ)
pGHR521pGHR523pGHR524pGHR525pGHR526pGHR527pGHR529 891001151201089089
표 2의 결과로부터, 개변형 OppA분비시그널용 유전자를 보유하는 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체가, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스의 중성프로테아제유래의 개변형 분비시그널용 유전자를 보유하는 플라스미드에 의해 형질전환된 종래의 대장균 형질전환체에 비해 20K hGH의 분비생산에 있어 우수하다는 것을 알 수 있다. 특히, 서열번호 3의 개변형 OppA분비시그널용 유전자를 보유하는 pGHR525에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체 MT-10853(FERM BP-6291)이 최대의 분비생산량을 표시하였다.
실시예 2: 시그널펩티다제 1의 유용성에 대한 연구
[1] 개변형 OppA분비시그널을 이용한 시그널펩티다제 1의 공발현용의 20K hGH분비플라스미드의 구축
대장균 W3110의 염색체유전자로부터, 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA분획을, 서열번호 40 및 서열번호 41의 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 얻어진 PCR생성물을, 제한효소 MunI 및 PstI로 절단해서 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA단편(11)을 얻었다. 이 단편(11) 및 일본국 특허공개공보 제 322586/96호에 기재된 pGHR10을 제한효소 EcoRI 및 PstI로 절단해서 생성한 벡터측단편(12)를 혼합해서 통상의 방법으로 라이게이트한 후, 대장균 W3110(ATCC 27325)의 형질전환에 이용해서, 분비플라스미드 pGHS15를 얻었다(도 3). 얻어진 pGHS15를 제한효소SacI 및 XbaI로 절단하여 벡터측단편(13)을 얻었다. 또, 실시예 1에서 얻어진 재조합플라스미드 pGHR525를 제한효소 SacI 및 XbaI로 절단하여 20K hGH발현카세트측단편(14)를 얻었다. 다음에, 단편(13) 및 단편(14)를 혼합해서 라이게이트하여 분비플라스미드 pGHS525를 얻었다(도 3). 이 플라스미드를 이용해서 대장균 W3110균주를 형질전환하여 형질전환체 W3110/pGHS525(MT-10852(FERM BP-6290))를 얻었다.
[2] 시그널펩티다제 1용의 DNA를 보유하는 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체의 평가
상기 [1]항에서 구축된 형질전환체W3110/pGHS525균주의 세포를 실시예1의 [3]항에 기재된 바와 마찬가지 방식으로 배양해서 20K hGH의 분비량을 측정하였다.W3110/pGHR10, W3110/pGHR525 및 W3110/pGHS525의 배양액으로부터 회수한 페리플라즘분획중의 총단백질의 양을 그로브즈(Groves) 등의 방법(Groves, W.E. et al., Anal. Biochem., 22, 195-210, 1968)에 의해 측정하고, W3110/pGHR10용 페리플라즘분획중의 총단백질에 대한 20K hGH의 비를 1로 설정해서 비교를 행하였다. 그 결과는 표 3에 표시되어 있다.
<20K hGH의 분비생산에 대한 시그널펩티다제 1의 이용효과>
플라스미드 pGHR10 pGHR525 pGHS525
생산량(㎎/ℓ) 76 110 115
페리플라즘추출분획배양액중의 총단백질에 대한 20K hGH의 비 1 1.6 4.8
표 3의 결과로부터, 시그널펩티다제 1이 공발현되는 재결합플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체에 의한 20K hGH의 분비생산레벨은, 글루타티온 리덕타제가 공발현되는 종래의 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체에 의한 것보다도 높았고, 페리플라즘추출액중의 총단백질에 대한 20K hGH의 비가 크게 향상된 것을 알 수 있다.
실시예 3: 변경된 배양조건에서의 20K hGH생산성의 평가
실시예 1의 [4]항에서 구축한 대장균 형질전환체 W3110/pGHR525(MT-10853(FERM BP-6291))와 비교용의 W3110/pGHS525(MT-10852(FERM BP-6290)) 및 일본국 특허공개공보 제 322586/96호(또는 유럽특허공보 제 0735140호)에 기재된 공지의 균주 W3110/pGHR10(MT-10765(FERM BP-5020))을 변경된 배지에서 배양하고 얻어진 배양물을 평가하였다.
10㎍/㎖ 테트라사이클린을 함유한 LB한천배지상에서 상기 각 형질전환균주의 세포를 30℃에서 18시간 배양하였다. 얻어진 세포를, 액체배지(20g/ℓ폴리펩톤, 10g/ℓ효모추출물, 15g/ℓ숙신산, 36g/ℓ 글리세롤 및 30㎎/ℓ테트라사이클린)에서 30℃에서 42시간 배양하였다. 배양후, 분비·축적된 20K hGH를 함유하는 페리플라즘분획을, 삼투압충격법에 의해 세포로부터 회수하고, 해당 페리플라즘유체분획중의 20K hGH농도를, 사람성장호르몬에 대한 항체를 이용한 효소-면역측정법에 의해 측정하였다. 이 측정결과로부터 배양액 1ℓ당 분비된 20K hGH의 양을 산출하였다. 각 페리플라즘분획중의 총단백질의 양을 그로브즈(Groves) 등의 방법(Groves, W.E. et al., Anal. Biochem., 22, 195-210, 1968)에 의해 측정하고, 실시예 1의 [3]항에 기재된 방법에 의해 페리플라즘분획에 대해 배양·추출한 W3110/pGHR10용의 페리플라즘분획중의 총단백질에 대한 20K hGH의 비를 1로 설정해서 비교를 행하였다. 그 결과는 표 4에 표시되어 있다.
<변경된 배지조성에 있어서의 20K hGH의 생산량 및 페리플라즘유체추출물중의 총단백질에 대한 20K hGH의 비>
균주 W3110/pGHR10 W3110/pGHR10 W3110/pGHR525 W3110/pGHS525
글리세롤 10g/ℓ 36g/ℓ 36g/ℓ 36g/ℓ
숙신산 10g/ℓ 15g/ℓ 15g/ℓ 15g/ℓ
20K hGH생산량 76㎎/ℓ 82㎎/ℓ 350㎎/ℓ 360㎎/ℓ
페리플라즘분획중의 총단백질에 대한 20K hGH의 비 1 1.1 3.4 8.3
이상, 본 발명은, 20K hGH의 분비생산레벨이 종래의 방법에 의해 얻어지는 것보다도 높은 것을 특징으로 하는, 대장균 세포를 이용한 20K hGH의 분비생산방법을 제공한다.
또, 본 발명에 의해 얻어진 페리플라즘추출액에 있어서의 불순단백질의 레벨을, 해당 추출액으로부터 용이하게 정제할 수 있으므로, 다량의 고순도의 20K hGH를 저렴한 비용으로 생산할 수 있다.
또한, 적어도 1종의 0.01-10% 글리세롤 또는 0.01-5% 숙신산을 함유하는 배지를 이용함으로써 20K hGH의 생산효율을 더욱 향상시킬 수 있다.

Claims (21)

  1. 대장균 혹은 살모넬라균 OppA분비시그널과는 다르지만, 아미노산서열에 있어서는 상기 대장균 OppA분비시그널에 대해 60%이상 상동성을 지닌 분비시그널에 있어서,
    상기 분비시그널을 코딩하는 DNA의 3'말단이 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA의 5'말단에 직접 결합된 재조합DNA를 지닌 미생물을 이용해서 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 분비생산할 수 있고,
    서열목록중 서열번호1의 아미노산서열에 있어서의 서열의 이하의 개변형의 적어도 1종을 지닌 것을 특징으로 하는 분비시그널:
    (1)서열번호1의 제 2번째 내지 제 7번째 단편에 있어서 1 내지 3개의 염기성 아미노산을 삽입한 것,
    (2)서열번호1의 제 2번째 내지 제 7번째 단편에 있어서 1 내지 3개의 산성 혹은 중성 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환한 것,
    (3)서열번호1의 제 9번째 내지 제 23번째 단편에 있어서 1 내지 9개의 소수성 아미노산을 삽입한 것 및
    (4)서열번호1의 제 9번째 내지 제 23번째 단편에 있어서의 1 내지 9개의 비소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로 치환한 것.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 서열목록의 서열번호1의 제 2번째 내지 제 7번째 단편에 있어서 삽입 또는 치환되는 염기성 아미노산이 Lys 및 Arg로부터 선택되고, 서열목록의 서열번호1의 제 9번째 내지 제 23번째 단편에 있어서 삽입 또는 치환되는 소수성 아미노산이 Leu, Ile, Val 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 분비시그널.
  4. 제 3항에 있어서, 서열목록의 서열번호2 내지 27중 어느 하나의 아미노산서열을 지닌 것을 특징으로 하는 분비시그널.
  5. 제 1항, 제 3항 및 제 4항중 어느 한 항의 분비시그널을 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  6. 분비시그널을 코딩하는 DNA와 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합DNA에 있어서,
    상기 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA의 5'말단과 상기 분비시그널을 코딩하는 DNA의 3'말단이 직접 결합되어 있고,
    상기 분비시그널이 하기 분비시그널 i) 내지 iii)중 하나인 것을 특징으로 하는 재조합DNA:
    i) 대장균 OppA분비시그널;
    ii) 살모넬라균 OppA분비시그널; 및
    iii) 대장균 혹은 살모넬라균 OppA분비시그널과는 다르지만, 아미노산서열에 있어서는 상기 대장균 OppA분비시그널에 대해 60%이상 상동성을 지니며, 서열목록중 서열번호1의 아미노산서열에 있어서의 서열의 이하의 개변형(1) 내지 (4)중 적어도 1종을 지니는 개변형 분비시그널:
    (1)서열번호1의 제 2번째 내지 제 7번째 단편에 있어서 1 내지 3개의 염기성 아미노산을 삽입한 것,
    (2)서열번호1의 제 2번째 내지 제 7번째 단편에 있어서 1 내지 3개의 산성 혹은 중성 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환한 것,
    (3)서열번호1의 제 9번째 내지 제 23번째 단편에 있어서 1 내지 9개의 소수성 아미노산을 삽입한 것 및
    (4)서열번호1의 제 9번째 내지 제 23번째 단편에 있어서의 1 내지 9개의 비소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로 치환한 것.
  7. 삭제
  8. 제 6항에 있어서, 상기 개변형 분비시그널이 제 3항 또는 제 4항의 분비시그널인 것을 특징으로 하는 재조합DNA.
  9. 프로모터와 제 6항 또는 제 8항의 재조합DNA를 함유하고, 상기 DNA가 상기 프로모터에 의해 발현가능하게 되는 위치에 편입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 프로모터가 대장균에 있어서의 상기 재조합DNA의 발현을 가능하게 하고, 또 대장균에 있어서의 복제기원을 지니는 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드.
  11. 제 9항 또는 제 10항의 재조합플라스미드에 의해 형질전환된 것을 특징으로 하는 대장균 형질전환체.
  12. 제 11항에 있어서, 대장균 형질전환체가 FERM BP-6219인 것을 특징으로 하는 대장균 형질전환체.
  13. 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 생산하는 방법에 있어서, 제 11항 또는 제 12항의 대장균 형질전환체의 세포를 배양하고, 얻어진 세포로부터 페리플라즘분획을 추출함으로써 얻어진 페리플라즘추출액을 정제해서 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 얻는 것을 특징으로 하는 사람성장호르몬의 생산방법.
  14. 제 13에 있어서, 대장균 형질전환체의 세포배양에는 0.01-10% 글리세롤 및 0.01-5% 숙신산의 적어도 1종을 함유하는 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는 사람성장호르몬의 생산방법.
  15. 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 코딩하는 DNA의 5'말단과 분비시그널을 코딩하는 DNA의 3'말단이 직접 결합된 재조합DNA 및 대장균 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA를 구비한 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드.
  16. 제 14항에 있어서, 분비시그널을 코딩하는 DNA가 대장균 혹은 살모넬라균 OppA분비시그널을 코딩하는 DNA 또는 제 5항의 DNA중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 대장균에 있어서의 상기 재조합DNA의 발현을 가능하게 하는 프로모터, 상기 대장균 시그널펩티다제 1을 코딩하는 DNA의 발현을 가능하게 하는 프로모터 및 대장균내의 복제기원을 또 구비한 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드.
  18. 제 16항 또는 제 17항의 재조합플라스미드에 의해 형질전환된 것을 특징으로 하는 대장균 형질전환체.
  19. 제 18항에 있어서, 대장균 형질전환체가 FERM BP-6290인 것을 특징으로 하는 대장균 형질전환체.
  20. 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 생산하는 방법에 있어서, 제 18항 또는 제 19항의 대장균 형질전환체의 세포를 배양하고, 얻어진 세포로부터 페리플라즘분획을 추출함으로써 얻어진, 불순단백질레벨이 낮은 페리플라즘추출액을 정제해서 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬을 얻는 것을 특징으로 하는 사람성장호르몬의 생산방법.
  21. 제 20항에 있어서, 대장균 형질전환체의 세포배양용 배지에는 0.01-10% 글리세롤 또는 0.01-5% 숙신산의 적어도 1종을 이용하는 것을 특징으로 하는 사람성장호르몬의 생산방법.
    [서열목록]
    서열번호: 1
    Met Thr Asn Ile Thr Lys Arg Ser Leu Val Ala Ala Gly Val Leu
    Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala
    서열번호: 2
    Met Thr Asn Ile Thr Lys Arg Ser Leu Leu Val Ala Ala Gly Val
    Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala
    서열번호: 3
    Met Thr Asn Ile Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly
    Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala
    서열번호: 4
    Met Thr Asn Ile Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala
    Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala
    서열번호: 5
    Met Thr Asn Ile Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala
    Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala
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    Met Thr Asn Ile Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val
    Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu
    Ala
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    Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala
    Leu Ala
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    Met Thr Asn Ile Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
    Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val
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    Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala
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    Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly
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    Met Thr Asn Ile Thr Lys Lys Arg Ser Leu Val Ala Ala Gly
    Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala
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    Met Thr Asn Ile Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Val
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    Ala
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    Met Thr Asn Ile Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu
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    Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly
    Asn Val Ala Leu Ala
    서열번호: 27
    Met Thr Asn Ile Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu
    Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala
    Gly Asn Val Ala Leu Ala
    서열번호: 28
    ttcgagctcg gtacccggag tctagtttta tattgcagaa tgcgagattg ctggtttatt
    atacaatata agttttcatt
    서열번호: 29
    cgcctgcagc tactaaactt ctcttggtga tgttggtcat atgaaatccc cctttttgaa
    aataatgaaa acttatattg tat
    서열번호: 30
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