KR100461889B1 - 크로마토그래피 측정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 해당 반응에 실제로 참여하는 표지 시약의 양을 표지 시약의 측정 영역(6)에서 측정하고, 피검사 용액 중의 측정 성분과의 반응을 반응 결과 측정 영역(7)에서 측정하며, 상기 반응에 실제로 참여한 표지 시약의 양을 반응 결과 측정 영역(7)에서 측정된 결과에 반영시킴을 특징으로 하는, 바이오센서를 이용하는 크로마토그래피 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 외적 환경 요인, 피검사 용액의 성질에서 유래한 요인, 측정 조작시의 오조작 등의 불리한 영향을 크게 감소시키면서, 보다 고정확도 및 고신뢰성을 갖는 바이오센서를 이용한 크로마토그래피 측정 방법을 제공할 수 있다.
Description
바이오센서는 항체, 효소 등이 갖는 특이적 반응을 이용한 것으로, 체액 등의 피검사 용액 중의 측정 성분을 검출함으로써, 임상 분야 등에 응용될 수 있다.
이러한 바이오센서에 의해 검출된 피검사 용액(시료) 중의 측정 성분을 크로마토그래피를 이용하여 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 대표예로서, 면역 크로마토센서(chromatosensor)가 있다. 이 면역 크로마토센서는 피검사 용액을 전개시키는 전개층을 가지며, 이 전개층은 그 일부에 시약이 고정화된 시약 부분과, 다른 일부에 피검사 용액의 전개에 의해 용출가능한 표지 시약이 건조 상태로 보유된 표지 시약 보유 부분을 포함하는데, 피검사 용액을 전개시켰을 때에 상기 시약 고정화 부분에서 결합이 생겨, 그 결합량을 측정함으로써 피검사 용액 중의 측정 성분을 측정할 수 있다.
상기 면역 크로마토센서의 일반적인 것으로는, 피검사 용액을 첨가하는 피검사 용액 첨가 부분과 다수의 전개층으로 구성되고, 이 전개층의 일부인 시약 고정화 부분에 항체가 고정화되어 있으며, 또한 상기 전개층의 상기 시약 고정화 부분보다도 상류측에 있는 표지 시약 보유 부분에 금 콜로이드 입자 등의 표지물에 의해 표지된 항체가 상기 피검사 용액에 의해 용출가능한 건조 상태로 보유되어 있다.
이와 같은 면역 크로마토센서에 필요량의 피검사 용액을 첨가하면, 피검사 용액이 상기 표지된 항체를 용출시키면서 다공질 재료 속으로 침투하여 이동한다. 그리고, 시약 고정화 부분에서, 상기 피검사 용액에 의해 용출된 표지 항체가 시약 고정화 부분의 항체와 결합한 표지 항체량을 측정함으로써, 피검사 용액 중의 측정 성분을 검출할 수 있다. 또한, 표지 항체의 결합량은, 시약 고정화 부분에서 표지 항체가 결합하고 남은 금 콜로이드 입자 등의 표지물의 양을 육안으로 확인함으로써 측정할 수 있게 되어 있다. 즉, 피검사 용액에 포함되는 항원(측정 성분)의 농도에 따라, 상기 시약 고정화 부분의 발색도(색의 농도)가 변화하기 때문에, 피검자가 이것을 육안 관찰함으로써 측정할 수 있다.
또한, 여기서는 항원 항체 반응의 샌드위치 반응을 측정 원리로 한 경우를 진술했지만, 그 밖의 경합 반응을 측정 원리로 해도 마찬가지로 항체 고정화부에서의 표지 시약의 결합 상태로 측정 결과를 얻을 수 있다.
또한, 전술한 예로는 측정 결과를 육안으로 정성적으로 판정하여 얻는 경우에 대하여 상술했지만, 이러한 육안 관찰에 의한 판정의 낮은 재현성이나 개인차를개선하기 위해, 시험편에 대한 시약 고정화 부분의 발색도를 CCD로 촬영하여 자동 판정하는 방법이 일본 특허 공개공보 제 96-334511 호에 기재되어 있다. 또한, 상기 측정 결과로서 반정량 또는 그것보다도 정확도가 높은 판정이 필요한 경우에는, 일본 특허 공개공보 제 98-274624 호에 개시된, 광학 판독 장치를 이용하여 투과 방식에 의해 판독하는 방법이나, 일본 특허 공개공보 제 98-274653 호에 개시된, 카메라 등에서의 화상으로서 판독하고 연산 처리하는 방법이 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 종래의 피검사 용액 내의 측정 대상물의 측정 방법에서는, 상기 센서의 건조 상태, 센서 속의 시약의 보존 상황 또는 센서 제작시의 환경에 의한 센서 속의 시약 농도 오차 등에서 유래한 요인, 피검사 용액의 성질에서 유래한 요인, 또는 측정시 오조작이나 측정시의 환경 등에서 유래한 요인 등에 의해, 피검사 용액에 의해 표지 시약 보유 부분으로부터 용출되는 표지 항체의 용출량이 변화하게 된다.
그리고, 시약 고정화 부분에 표지 항체가 용출되어 옴으로써 결합되는 표지 항체의 결합량은, 상기 표지 항체의 용출량이 일정하면, 상기 피검사 용액 중의 측정 대상물 농도를 보다 정확하고 균일하게 측정할 수 있지만, 상기 요인에 의해 표지 항체의 용출량이 변화하면, 상기 피검사 용액 중의 측정 대상물 농도가 일정하다고 하더라도 측정할 때마다 시약 고정화 부분에 결합하는 표지 항체량이 변화하게 된다.
즉, 정성적인 측정 결과를 구하는 측정을 실시할 때에, 상기 요인에 의해 표지 항체의 용출량에 변화가 생긴 경우는, 특히 측정 한계 고감도 부근에 있어서 그릇된 측정 결과가 수득된다는 문제가 있었다.
또한, 표지 항체의 용출량이 극단적으로 적은 경우에는, 시약 고정화 부분에 있어서 정확한 결합량을 얻을 수 없다는 문제도 있었다.
또한, 반정량적 또는 정량적 측정 결과가 필요한 측정을 실시하는 경우에 대해서도, 상기 요인에 의해 표지 항체의 용출량이 변화함에 따라, 시약 고정화 부분의 표지 항체 결합량에 변화가 생겨, 정확도가 낮은 측정 결과밖에 얻을 수 없다는 문제가 있었다. 이 때문에, 전술한 방법으로는 정성적 또는 반정량적 측정을 실시하는데 한계가 있으며, 정량적 측정을 실현할 수 없었다.
본 발명은, 이와 같은 상황을 감안하여 성립된 것으로, 보다 고정확도의 측정 결과를 얻을 수 있고, 정량적 측정에 있어서도 그 정확도를 향상시킬 수 있는 크로마토그래피 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 크로마토그래피 측정 방법에 관한 것으로, 특히 크로마토그래피를 이용한 바이오센서에 의해 피검사 용액의 측정 방법을 개량시키는 것에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 실시 형태 1의 면역 크로마토센서의 구성을 도시하는 사시도이다.
도 2a, 2b 및 2c는 본 발명의 실시 형태 1의 면역 크로마토센서에서의 피검사 용액 첨가 후의 상태를 도시하는 도면이다. 도 2a는 피검사 용액을 첨가하고 나서 초기의 상태를 나타내고, 도 2b 및 2c는 표지 시약 결합량 측정시의 상태를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 실시 형태 1의 크로마토그래피 측정 방법에서 바이오센서가 측정할 영역의 순서의 일례를 도시하는 사시도이다. 도 3a는 최초로 측정할 영역을 도시하는 도면이고, 도 3b는 다음으로 측정할 영역을 도시하는 도면이다.
도 4a, 4b 및 4c는 본 발명의 실시 형태 1에서 바이오센서에 의해 측정된 hCG(사람 융모성 성선자극 호르몬)의 각 농도에서의 흡광도의 합 AT+ BT와, 흡광도 CT의 관계를 나타내는 도면이다.
도 5a 및 5b는 본 발명의 실시 형태 1에서 바이오센서에 의해 측정된 각 hCG 농도에서의 보정 전의 측정 결과(도 5a)와 보정 후의 측정 결과(도 5b)를 도시하는 도면이다.
도 6a 및 6b는 본 발명의 실시 형태 1의 크로마토그래피 측정 방법에서 바이오센서가 측정할 영역의 순서의 다른 일례를 나타내는 사시도이다. 도 6a는 최초로 측정할 영역을 도시하는 도면이고, 도 6b는 다음으로 측정할 영역을 도시하는 도면이다.
본 발명의 하기 청구의 범위 제 1 항에 기재된 크로마토그래피 측정 방법은, (a) 피검사 용액을 전개시키는 전개층, (b) 상기 전개층의 일부에 시약을 고정화시켜 형성된 시약 고정화부, 및 (c) 상기 전개층의 다른 일부에 피검사 용액의 전개에 의해 용출가능하게 표지 시약을 보유시킴으로써 형성된 표지 시약 보유부를 갖는 바이오센서를 이용하여, 피검사 용액에 포함된 측정 성분을 크로마토그래피를 이용하여 측정하는 크로마토그래피 측정 방법에 있어서, 상기 시약 고정화부에서의 상기 표지 시약의 결합량을 측정함으로써 피검사 용액 중의 측정 성분을 정성 또는 정량하는 동시에, 상기 표지 시약 성분의 용출량 또는 용출되지 않은 잔존량을 측정하는 것이다.
이로써, 상기 시약 고정화부에서의 상기 표지 시약의 결합량에 의해 피검사 용액 내의 측정 대상물을 검출하는 경우, 그 결합량에 영향을 미치는 표지 성분의 실질적인 용출량 또는 잔존량을 측정함으로써, 고정화 부분에서의 표지 시약 성분의 결합량의 타당성(결합량 데이터의 신뢰성)을 알 수 있고, 측정 조작의 정확성을 향상시키는 효과가 수득되며, 또한 상기 용출량 또는 잔존량을 계측함으로써, 시약 고정화 부분에서의 표지 시약 성분의 결합량에 대하여, 용출량에 따른 보정을 추가함으로써, 실제 측정에 관여하는 표지 시약 성분의 양을 반영시킬 수 있어, 보다 고정확도의 바이오센서를 이용한 크로마토그래피 측정 방법을 실현할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 청구의 범위 제 2 항에 기재된 크로마토그래피 측정 방법은 청구의 범위 제 1 항에 기재된 크로마토그래피 측정 방법에 있어서, 시약 고정화부에서의 표지 시약의 결합량을 표지 시약 성분의 용출량 또는 용출되지 않은 잔존량을 이용하여 보정하는 것이다.
이로써, 실제 측정에 관여한 표지 시약 성분의 양을 반영시키는 것이 가능해져, 보다 고정확도의 바이오센서를 이용한 크로마토그래피 측정 방법을 실현할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 청구의 범위 제 3 항에 기재된 크로마토그래피 측정 방법은, 청구의 범위 제 1 항 또는 청구의 범위 제 2 항에 기재된 크로마토그래피 측정 방법에 있어서, 표지 시약 성분의 용출량 또는 용출되지 않은 잔존량을 광학 검출기를 이용하여 측정하는 것이다.
이로써, 표지 시약 성분의 용출량을 보다 정확하게 수치화하는 것이 가능해져, 보다 고정확도의 바이오센서를 이용한 크로마토그래피 측정 방법을 실현할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 청구의 범위 제 4 항에 기재된 크로마토그래피 측정 방법은 청구의 범위 제 1 항 내지 청구의 범위 제 3 항중 어느 한 항에 기재된 크로마토그래피 측정 방법에 있어서, 표지 시약 성분의 용출량을 시약 고정화부 이외의 부분에서 측정하는 것이다.
이로써, 측정 대상 성분의 양에 영향을 미치지 않는 시약 고정화부 이외의 부분에서 표지 시약 성분의 용출량을 측정함으로써, 보다 정확한 표지 시약의 용출량을 측정할 수 있어, 보다 고정확도의 바이오센서를 이용한 크로마토그래피 측정 방법을 실현할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 청구의 범위 제 5 항에 기재된 크로마토그래피 측정 방법은 청구의 범위 제 1 항 내지 청구의 범위 제 4 항중 어느 한 항에 기재된 크로마토그래피 측정 방법에 있어서, 시약 고정화부에서 표지 시약의 결합량을 측정하기 전에, 표지 시약 성분의 용출량을 측정하는 것이다.
이로써, 시약 고정화부에서 발생하는 결합에 관여하는 표지 시약의 양을 미리 알 수 있고, 측정 조작의 정확성을 높이는 동시에, 보다 신속한 판단을 가능하게 하여, 보다 고정확도의 바이오센서를 이용한 크로마토그래피 측정 방법을 실현할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
실시 형태 1
이하에, 본 발명의 실시 형태 1에 관해서, 도 1 내지 도 6b를 이용하여 설명한다.
도 1은 본 발명의 실시 형태 1에 의한 크로마토그래피 측정 방법을 실시할 때에 사용하는 면역 크로마토센서의 구성을 도시한 도면이다.
도 1에 있어서, 본 발명의 실시 형태 1의 면역 크로마토센서는 피검사 용액을 첨가하는 피검사 용액 첨가부(1), 표지 시약 보유부(2)와 항체 고정화부(4)(시약 고정화부)를 포함하는 항체 고정화막(3)(전개층) 및 흡수부(5)로 구성되어 있다.
상기 피검사 용액 첨가부(1)는 피검사 용액을 첨가하는 부분으로, 피검사 용액이 습윤시킬 수 있는 재료인 부직포로 구성된다. 이 피검사 용액 첨가부(1)에 사용하는 재료로는 부직포 이외에도 피검사 용액이 습윤시킬 수 있는 재료이면 유리 섬유 여과지, 막 필터 등, 임의의 재료를 이용하여 구성할 수 있다.
또한, 상기 표지 시약 보유부(2)는 항체 고정화막(3)의 일부분으로서, 표지 시약을 보유하는 부분이다. 이 표지 시약은 표지물인 금 콜로이드에 의해 표지된 항체이고, 상기 피검사 용액의 침투에 의해 용출가능하도록 건조 상태로 보유되어있다. 본 발명의 실시 형태 1에 있어서는, 상기 표지 시약으로서 금 콜로이드에 의해 표지된 항체를 사용하고 있지만, 상기 표지물로는 금 콜로이드 이외에도 효소, 단백질, 색소, 형광 색소, 금속 졸(sol), 비금속 졸, 라텍스 등의 착색 입자 등이 선택가능하고, 또한 상기 표지물에 의해 표지된 시약으로는 항체 이외에 항원, 하프텐(haptene), 단백질 등도 마찬가지로 사용할 수 있다.
또한, 상기 항체 고정화부(4)는 항체 고정화막(3)의 상기 표지 시약 보유부(2) 이외의 일부분으로서, 항체를 건조 상태로 고정하여 보유하는 부분이다. 이 항체는 피검사 용액에 의해 용출되지 않고, 피검사 용액에 의해 용출되는 상기 표지 시약 보유부(2)의 표지 시약과 결합하는 성질을 갖는 것이다. 그 때문에, 상기 항체 고정화부(4)의 항체는 상기 항체 고정화부(4)에서 표지 시약을 결합 포착할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시 형태 1의 면역 크로마토센서에서는 샌드위치 반응을 이용하는 경우, 즉 표지 시약 보유부(2)에 항체를 설치하고, 피검사 용액 중의 측정 대상물을 항원으로 하는 경우에 대하여 예시하고 있지만, 경합 반응을 이용하는 경우는 피검사 용액 중의 측정 대상물을 항원으로 하고, 표지 시약 보유부(2)에 항원을 설치함으로써 실시할 수 있으며, 또한 그 밖에 항원 항체 반응을 이용하는 경우에도 사용자의 선택에 의해 다양한 패턴으로 마찬가지로 실시할 수 있다.
상기 항체 고정화막(3)은 상기 표지 시약 보유부(2)와 항체 고정화부(4)를 포함하고, 니트로셀룰로오스로 구성된다. 이 항체 고정화막(3)에 이용되는 재료는 니트로셀룰로오스 이외에도 피검사 용액이 습윤시킬 수 있는 재료이면 마찬가지로사용할 수 있다.
또한, 상기 흡수부(5)는 상기 항체 고정화막(3)을 통과한 피검사 용액을 흡수하는 것으로, 유리 섬유 여과지로 구성된다. 이 흡수부(5)의 재료로는 유리 섬유 여과지 이외에도, 부직포, 수지 다공질 재료 등, 피검사 용액이 습윤시킬 수 있는 재료이면 임의의 재료로 구성될 수 있다.
본 발명의 실시 형태 1에서는 이와 같이 구성된 면역 크로마토센서에 피검사 용액을 적하하고, 상기 항체 고정화막(3) 상에 전개시켜, 상기 표지 시약 보유부(2)로부터 용출되는 상기 표지 시약의 용출량 또는 용출된 후의 상기 표지 시약 보유부(2) 상의 잔존량을 검지함으로써, 측정 조작의 정확성을 향상시키며, 또한 상기 항체 고정화부(4)에서의 상기 표지 시약의 결합량에 대하여, 표지 시약의 용출량에 따른 보정을 추가함으로써, 실제 측정에 관여한 상기 표지 시약의 양을 반영시킬 수 있어, 보다 고정확도로 피검사 용액에 포함된 측정 대상물을 측정할 수 있는 크로마토그래피 측정 방법을 실현하는 것이다.
이하, 본 발명의 실시 형태 1의 면역 크로마토센서로 피검사 용액에 포함된 측정 대상물을 검출하는 크로마토그래피 측정 방법에 대하여 설명한다.
도 2a, 2b 및 2c는 피검사 용액 첨가부(1)에 피검사 용액을 첨가한 후의 면역 크로마토센서의 상태를 나타내고 있다.
도 2a는 피검사 용액을 피검사 용액 첨가부(1)에 첨가하여 경과 시간이 비교적 빠른 시점에서의 면역 크로마토센서의 상태를 나타내고, 이때 6은 표지 시약의 용출량을 측정하는 영역을 도시하고 있다. 도 2a에 있어서, 피검사 용액첨가부(1)에 첨가된 피검사 용액은 표지 시약 보유부(2)의 표지 시약을 용출시키면서 흡수부(5)를 향해 침투를 개시하며, 이 시점에서는 피검사 용액에 의해 용출된 표지 시약은 항체 고정화부(4)에는 도달하고 있지 않다.
도 2b는 항체 고정화부(4)에서 표지 시약의 결합량을 측정하는 시점에서의 면역 크로마토센서의 상태를 나타내고, 이때 7은 항체 고정화부(4)에서의 표지 시약의 결합량 측정 영역을 나타낸다. 도 2b에서는 항체 고정화막(3)을 통과한 피검사 용액이 흡수부(5)에 흡수되고, 항체 고정화부(4)에서는 피검사 용액 중의 측정 대상물 양에 따른 반응을 볼 수 있다.
도 2c는 도 2b와 동일 시점에서의 면역 크로마토센서의 상태를 나타내는 것으로, 이때 8은 표지 시약의 용출 잔존량을 측정하는 영역을 나타낸다.
이와 같이, 표지 시약 성분의 용출량을 상기 항체 고정화부(4) 이외의 부분에서 측정하는 것은, 상기 항체 고정화부(4)에서는 피검사 용액 중의 측정 대상물의 양에 의해 표지 시약의 결합량이 변화하기 때문에, 측정 개시 후 일정 시간을 나누어서 표지 시약을 판독하려고 한 경우에, 그 값이 측정 대상물의 결합 반응에 기인하는지 기인하지 않는지를 판단할 수 없기 때문이다.
또한, 표지 시약의 용출량을 상기 항체 고정화부(4)에서의 표지 시약의 결합량을 측정하기 전에 (상류측에서) 측정하는 것은, 측정 조작시 피검사 용액을 첨가함에 따라, 피검사 용액은 항체 고정화막(3)상을 전개해 나가지만, 상기 항체 고정화부(4)를 통과하기 전에 표지 시약 보유부(2)를 통해 표지 시약 성분을 용출시키기 때문에, 측정 부분인 상기 항체 고정화부(4)를 표지 시약이 통과하기 전에 그 표지 시약의 용출량을 미리 측정해두면, 상기 항체 고정화부(4)에서 결합한 표지 시약의 양을 측정할 때 신속하게 이러한 용출량을 반영시킬 수 있기 때문이다.
또한, 이와 같은 신속한 보정을 실행하지 않아도 지장을 초래하지 않는 경우는 상기 항체 고정화부(4)상의 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서 표지 시약을 측정한 후, 그 값에 도 2c의 상태에서의 표지 시약의 용출 잔존량 측정 영역(8)에서 얻어진 측정값을 반영시키는 방법도 있다.
이하에, 본 발명의 실시 형태 1에 의한 바이오센서를 사용한 크로마토그래피 측정 방법의 구체예로서, 뇨 중의 hCG(사람 융모성 성선자극 호르몬)를 정량하는 예를 들어, 도 1 내지 도 6b를 이용하여, 본 발명의 실시 형태 1에서의 크로마토그래피 측정 방법에 대하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태 1의 측정 방법은 hCG의 정량에 한정되는 것이 아니다.
우선, 본 발명의 실시 형태 1의 시험편(면역 크로마토센서)으로서, 니트로셀룰로오스 막 중에 항 hCG-β항체 고정화 라인(line), 및 항 hCG-α항체와 금 콜로이드의 복합체의 넓은 밴드(band)를 포함하는 면역 크로마토그래피 시험편을 제조했다.
상기 시험편은, 도 1에 도시하는 바와 같이, 항 hCG-β항체를 고정화시킨 항체 고정화부(4) 및 그 보다도 전(상류측)에 있는 항 hCG-α항체와 금 콜로이드의 복합체가 함유된 표지 시약 보유부(2)를 포함하는 니트로셀룰로오스 막으로 구성된 항체 고정화막(3)과, 부직포로 구성된 피검사 용액 첨가부(1)와, 유리 섬유로 구성된 흡수부(5)로 구성되어 있다.
본 발명의 실시 형태 1은 hCG 용액을 도 1에 도시하는 상기 시험편에 첨가하고, 반사형 분광 광도계(CS9300;시마쯔 제작소)에 의해, 도 3a에 도시하는 바와 같이, 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에 광원(100)으로부터 검사광을 조사하고 그 반사광을 검출기(200)로 수광함으로써, 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에서의 반사 흡광도를 측정하며, 다음으로, 도 3b에 도시하는 바와 같이, 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 반사 흡광도를 도 3a와 마찬가지로 반사형 분광 광도계에 의해 측정하며, 또한 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에서의 흡광도를 이용하여 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 흡광도를 보정하는 보정 방법을 사용한 것이다.
이하, A. 시험편의 제조 방법, B. 피검사 용액의 제조 방법, 및 C. 보정 방법의 검토에 대하여 설명한다.
A. 크로마토그래피 시험편의 제조
인산 완충액으로 희석하여 농도를 조제한 항 hCG-β항체 용액을 준비했다. 이 항체 용액을 용액 토출 장치를 이용하여, 니트로셀룰로오스 막상에 도포했다. 이에 따라, 니트로셀룰로오스 막상에 검출용 항체 고정화 라인(항체 고정화부(4))이 얻어졌다. 이 니트로셀룰로오스 막을 건조시킨 후, 1% 탈지유를 함유하는 Tris-HCl 완충액 중에 침지하여 30분간 완만하게 진탕시켰다. 30분 후, Tris-HCl 완충액조에 막을 이동시켜, 10분간 완만하게 진탕시킨 후에, 별도의 Tris-HCl 완충액조에서 10분간 더 완만하게 진탕시켜 막을 세정했다. 2회 세정한 후에 막을 세정액으로부터 빼내어 실온에서 건조시켰다.
금 콜로이드는 0.01% 염화금산의 환류 중인 10O℃ 용액에 1% 구연산 용액을 첨가함으로써 제조했다. 30분간 계속 환류시킨 후 냉각했다. 0.2M의 탄산칼륨 용액으로 pH 9로 조제한 상기 금 콜로이드 용액에 항 hCG-α 항체를 첨가하여 수분간 교반한 후에, 10% BSA(소혈청 알부민) 용액 pH 9를 최종 1%가 되는 양만 첨가하여 교반함으로써, 항체 금 콜로이드 복합체(표지 항체)를 제조했다. 상기 표지 항체 용액을 4℃, 20000G로 50분간 원심분리하여 표지 항체를 단리하고, 이것을 세정 완충액(1% BSA·인산 완충액) 중에 현탁시킨 후, 상기 원심분리를 실행하여 표지 항체를 세정 단리했다. 이 표지 항체를 세정 완충액에 현탁시키고, 0.8㎛의 필터로 여과한 후에, 당초의 금 콜로이드 용액량의 10분의 1로 조제하여 4℃로 저장했다.
상기 표지 항체 용액을 용액 토출 장치에 설치하고, 항 hCG-β항체가 고정화된 건조막상의 항체 고정화 부분으로부터 떨어진 위치에 도포한 후에 막을 건조시켰다. 이로써, 항체 고정화막(3)상에 표지 항체 보유부(표지 시약 보유부)(2)가 얻어졌다.
이와 같이 제조된 항체 고정화 라인(4) 및 표지 항체 보유부(2)를 포함하는 항체 고정화막(3)을 반응층 담체 지지체(도시하지 않음)상에 부착하고, 부직포를 피검사 용액 첨가부(1)로서 부착하고, 또한 유리 섬유 여과지를 흡수부(5)로서 부착하고 나서, 0.5㎝ 폭의 작은 조각으로 절단하여 시험편을 제조했다.
B. 피검사 용액의 제조
사람 뇨 중에 이미 농도가 밝혀져 있는 hCG 용액을 첨가함으로써, 이미 밝혀져 있는 각종 농도의 hCG 용액을 제조했다.
C. 보정 방법의 검토
이하에서, 표지 시약의 결합량 측정 시간을 5분 후로 하고, 표지 시약의 용출량 측정 시간을 1분 후 및 3분 후로 한 경우의 반사 흡광도를 사용한 보정 방법에 관해 설명한다.
보정을 하기 위해서는, 미리 장치(시험편) 고유의 계수를 구하는 것이 필요하다. 우선, 제작한 장치의 계수를 구하기 위해서, hCG 농도 1000IU/l을 함유하는 뇨를 제조하고, 시험편(시험편수 N=10)의 피검사 용액 첨가부(1)에 200㎕ 이상 첨가한다. 상기 피검사 용액 첨가시를 출발 시간으로 하고, 측정 개시 1분 후 및 3분 후에 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에서의 반사 흡광도를 반사형 분광 광도계(CS9300; 시마쯔 제작소 제품)를 이용하여 계측했다. 그리고, 5분 후에 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 발색 상황을 상기 동일한 반사형 분광 광도계를 이용하여 계측했다. 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에서의 1분 후의 흡광도를 흡광도 AT, 3분 후의 반사 흡광도를 흡광도 BT, 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 계측 결과를 흡광도 CT로 하고, 그 측정 결과를 그래프로 나타내어 하기 수학식 1을 도출했다. 이 측정 결과는 도 4b에 도시되어 있다.
상기 식에서,
Y는 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 흡광도이고, 도 4a, 4b 및 4c에서는종축을 형성하며;
X는 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에서의 흡광도의 합, 즉 AT+ BT를 나타내고, 도 4a, 4b 및 4c에서는 횡축을 형성하며;
D는 정수이다.
다음으로, 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에서의 측정 결과의 중심값을 구한다. 본 발명의 실시 형태 1의 예에서는 전체 측정의 중심값은 0.29였다.
이와 같이 하여, 장치(바이오센서) 고유의 계수, E= 1.12, F=0.29를 얻었다. 이 장치 고유의 계수 E는 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)과 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 흡광도 사이의 관계식의 기울기이며, 또한 F는 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에서 얻어지는 흡광도의 중심값이다.
다음으로, 이미 농도가 밝혀져 있는 사람 뇨 중의 hCG 용액을 첨가함으로써, 100, 1000, 10000IU/l의 hCG를 함유하는 뇨를 제조하고, 상기 3종류의 이미 농도가 밝혀져 있는 피검사 용액을 이용하여, 본 발명의 실시 형태 1의 크로마토그래피 측정 방법으로 측정함으로써, 보정 전의 측정값과 보정 후의 측정값을 비교한다.
우선, 각 hCG 농도의 뇨에 대하여 시험편상의 피검사 용액 첨가부(1)에 상기 hCG를 포함하는 뇨를 200㎕ 이상 첨가하고, 흡수부(5) 방향으로 전개시켜 측정을 시작한다. 피검사 용액 첨가시를 출발 시간으로 하고, 개시 1분 후 및 3분 후의 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에서의 반사 흡광도를 반사형 분광 광도계(CS9300; 시마쯔 제작소 제품)를 이용하여 계측했다. 그 후, 5분 후의 표지시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 발색 상황을 상기와 동일하게 반사형 분광 광도계를 이용하여 계측했다. 표지 시약의 용출량 측정 영역(6)에서의 1분 후의 흡광도를 흡광도 AT, 3분 후의 반사 흡광도를 흡광도 BT, 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 5분 후의 계측 결과를 흡광도 CT로 한다.
도 4a, 4b 및 4c는 피검사 용액 중의 측정 대상물인 hCG 각 농도에서의 흡광도 AT와 흡광도 BT의 합과, 흡광도 CT의 관계를 나타내는 도면이다. 도 4a는 hCG 농도 100IU/l, 도 4b는 hCG 농도 1000IU/l, 도 4c는 hCG 농도 1OOOOIU/l인 경우의 흡광도 AT와 흡광도 BT의 합과, 흡광도 CT의 관계를 도시한 것이다. 도 4a 내지 4c로부터, hCG 각 농도에서 흡광도 AT와 흡광도 BT의 합과, 흡광도 CT사이에 상관 관계가 있음을 알 수 있다.
다음으로, 상기 측정 결과 및 상기 장치의 계수를 사용하고, 하기 수학식 2를 이용하여, 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 계측 결과중 흡광도 CT를 보정하여 보정값 CH를 구한다:
상기 식에서,
CH는 보정 결과를 나타내고;
AT, BT, CT, E 및 F는 각각 상기 정의한 바와 같다.
도 5a 및 5b는 각 hCG 농도에서의 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 보정 전 측정 데이터와 보정 후 측정 데이터를 나타내는 도면이다. 도 5a는 보정 전인 도 4a, 4b 및 4c의 결과를 hCG 각 농도마다 그래프로 나타내어 고친 도면이고, 도 5b는 상기 도 4a, 4b 및 4c로 나타낸 측정 결과에 수학식 2를 이용하여 보정한 후의 측정 결과를 hCG 각 농도마다 그래프로 나타낸 도면이다.
보정 전의 hCG 동일 농도 내의 CV값(변동 계수)은 각각 11.1%, 10.8%, 13.8%이지만, 보정 후의 CV값(변동 계수)은 각각 8.9%, 4.1%, 1.9%로 되어, 전체 농도 영역에서 대폭으로 측정값의 정확도가 향상하고 있다는 것을 알 수 있다. 이와 같이 보정을 실시함으로써, 측정값의 정확도가 비약적으로 향상되며, 표지 시약 성분의 용출량에 변화가 생긴다고 해도, hCG 농도가 동일하면 측정값은 변동의 영향을 그다지 받지 않게 되어, 정량 정확도가 대폭 향상된다는 것을 알 수 있다.
또한, 이상의 설명으로는 표지 시약의 용출량을 측정하여 보정하는 경우에 관해서 상세히 설명했지만, 표지 시약의 잔존량을 계측하여 보정하는 경우는 도 3a 및 3b와 같은 반사형 분광 광도계에 의해 먼저 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 반사 흡광도를 구하고(도 6a 참조), 다음으로 표지 시료의 용출 잔존량 측정 영역(8)에서의 반사 흡광도를 구하며(도 6b 참조), 상기 표지 시료의 용출 잔존량 측정 영역(8)에서의 반사 흡광도로 표지 시약의 결합량 측정 영역(7)에서의 반사 흡광도를 보정한 후, 전술한 표지 시약의 용출량 계측 경우와 같이 하여 장치 고유의 값을 산출하고, 이것을 이용하여 수학식 2에 의해 보정할 수 있다.
이상과 같이 본 발명의 실시 형태 1의 크로마토그래피 측정 방법에 의하면, 센서의 건조 상태, 센서 중의 시약 성분의 보존 상황, 센서 제작시의 온도, 습도, 제작 시간 등의 외적 상황 등의 센서부에서의 요인, 또는 피검사 용액의 성질에 있어서의 요인, 측정 조작에 있어서의 오조작, 측정 조작시의 환경 등, 측정 조작에서의 요인 등에 의해, 표지 시약 성분의 용출량에 변화가 생긴 경우에 있어서도 그 표지 시약의 용출량 또는 잔존량을 검지함으로써, 측정 조작의 정확성을 향상시킬 수 있으며, 또한 상기 용출량 또는 잔존량을 계측함으로써 시약 고정화부에서의 표지 시약 성분의 결합량에 대하여 용출량에 따른 보정을 추가함으로써 보다 고정확도의 크로마토그래피 측정 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시 형태 1에서는 도 1에 도시하는 바와 같은 시험편을 이용한 경우의 보정 방법의 일례에 관해서 설명했지만, 시험편의 형상은 도 1의 것에 한정되지 않고 적절히 선택가능하다.
또한, 상기 장치 고유의 값 E, F는 표지 시약 보유 농도, 표지 시약 보유 면적, 표지 시약 보유량, 표지 시약 종류, 유속, 시료 용매 종류, 표지 시약 보유 영역과 고정화 시약의 위치 등의 요인으로 변화되며, 필요에 따라 적절히 선택가능하다.
그 밖에, 용출량의 계측 방법, 용출량 측정 영역의 장소, 보정 연산식 등의 선택 등도 필요에 따라 적절히 선택가능하다.
본 발명의 크로마토그래피 측정 방법은 시약 고정화부에서의 표지 시약의 결합량을 측정하여 피검사 용액의 측정 성분을 정성 또는 정량하는 경우에, 보다 고정확도의 측정 결과를 얻는 방법으로서 유용하다.
Claims (5)
- (a) 피검사 용액을 전개시키는 전개층,(b) 상기 전개층의 일부에 시약을 고정화시켜 형성된 시약 고정화부, 및(c) 상기 전개층의 다른 일부에 상기 피검사 용액의 전개에 의해 용출가능하게 표지 시약을 보유시킴으로써 형성된 표지 시약 보유부를 갖는 바이오센서를 이용하며, 이때 상기 시약 고정화부에서의 상기 표지 시약의 결합량을 측정함으로써 피검사 용액 중의 측정 성분을 정성 또는 정량하는 동시에, 상기 표지 시약 성분의 용출량 또는 용출되지 않은 잔존량을 측정함을 특징으로 하는, 피검사 용액에 포함된 측정 성분을 크로마토그래피를 이용하여 측정하는 크로마토그래피 측정 방법.
- 제 1 항에 있어서,시약 고정화부에서의 표지 시약의 결합량을 표지 시약 성분의 용출량 또는 용출되지 않은 잔존량을 이용하여 보정함을 특징으로 하는 크로마토그래피 측정 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,표지 시약 성분의 용출량 또는 용출되지 않는 잔존량을 광학 검출기를 이용하여 측정함을 특징으로 하는 크로마토그래피 측정 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,표지 시약 성분의 용출량을 시약 고정화부와 표지 시약 보유부 사이의 부분에서 측정함을 특징으로 하는 크로마토그래피 측정 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,시약 고정화부에서 표지 시약의 결합량을 측정하기 전에, 표지 시약 성분의 용출량을 측정함을 특징으로 하는 크로마토그래피 측정 방법.
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