HU213759B

HU213759B - Process for the preparation of pyruvic acid

Info

Publication number: HU213759B
Application number: HU9503773A
Authority: HU
Inventors: David Leroy Anton; Robert Dicosimo; Vincent Gerard Witterholt
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1993-06-25
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 1997-09-29
Also published as: CN1125961A; EP0705345A1; DE69417892T2; CA2165940C; EP0705345B1; HU9503773D0; JP3709202B2; CN1096500C; NZ267894A; KR100274552B1; HUT74223A; DE69417892D1; JPH08511689A; ZA944559B; AU686182B2; CA2165940A1; RU2123529C1; ES2132409T3; AU7056794A; GR3030756T3

Description

A találmány piroszőlősav előállítási eljárására vonatkozik, aminek során L-tejsavat és oxigént vizes oldatban, glikolát-oxidáz [(S)-2-hidroxisav-oxidáz, EC (EnzimKatalógus) 1.1.3.15] és kataláz (EC 1.11.1.6) enzimek jelenlétében reagáltatunk.

A piroszőlősavat különböző szénforrások (például glükóz, élesztőkivonatok és pepton) fermentálásával állították elő, e módszerek azonban a piroszőlősavat alacsony hozammal (a hozzáadott szénforrásra vonatkoztatva), viszonylag kis koncentrációkban, a fermentációs termékek keverékének egyik komponenseként szolgáltatják. A piroszőlősav elválasztása és izolálása ezekből az összetett fermentlevekből általában nehéz és költséges.

Cooper (4 900 668 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1990. február 13.) közölte a piroszőlősav előállítását optikailag tiszta D-(-)-tejsav mikrobiológiai oxidációja útján. Jóllehet ez az eljárás javulást hoz más fermentációs módszerekkel szemben, mivel nem használja fel a D-tejsavat szénforrásként a reakcióhoz szükséges sejttömeg előállítására, azonban egy második szénforrást [például D-(-)-mannitot vagy keményítőszörpöt] tartalmazó szaporítóközeget igényel mind a sejttömeg termeléséhez, mind a D-tejsav fermentációs átalakításához. Ehhez járul, hogy a D-tejsav a természetben nem általánosan elterjedt, és mind előállítása, mind beszerzése sokkal költségesebb, mint az L (+)-tejsavé.

Kimutatták, hogy az L-laktát-oxidáz enzim [L-laktát: oxigén-oxidoreduktaz, nem-dekarboxilező, EC 1.1.3.2; Burdick, B. A. és Schaeffer, J. R.: Biotech. Lett, 9, 253-258 (1987)] alkalmazásával az L-tejsav piroszőlősavvá alakul. A (Pediococcus-ból eredő) L-laktátoxidáz katalizálja az L-laktát oxigénnel végbemenő oxidációját piroszőlősavvá és hidrogén-peroxiddá:

OH O

CH₃CCO₂H + O₂ -> CH₃CCO₂H + H₂O₂

I

H

Az L-laktát-oxidázt a kataláz enzimmel együtt [oxidáz: kataláz =1 : 281 (NE/NE) (NE: nemzetközi egység)] immobilizálták, hogy csökkentsék a piruvát oxidációját a melléktermékként képződő hidrogén-peroxid hatására, aminek eredményeként acetát és szén-dioxid keletkezik. Amidőn 49 mmol/1 koncentrációjú L-laktát oldatokat 0,1 mol/lfoszfátpufferban pH = 7 értéken oxidáltak, akkor a piroszőlősavat 47%-ig terjedő hozamokkal kapták [a piroszőlősavat (2,4-dinitro-fenil)-hidrazon-származékaként izolálták].

A glikolát-oxidáz [(S)-2-hidroxisav-oxidáz, EC 1.1.3.15] - mely általában leveses zöld növényekben és emlősejtekben található - katalizálja a glikolsav oxidációját glioxilsavvá. Ugyanez az enzim az L-tejsav piroszőlősavvá oxidációját is katalizálja, amit hidrogén-peroxid termelődése kísér. Clagett, C. O. és munkatársai (J. Bioi. Chem., 7 78,977-987 (1949)] elsőként ismertettek egy α-hidroxisav-oxidázt (többféle zöld, leveles növényből vonták ki), amely a glikolsav oxidációját katalizálta, és a tej sav L-izomerjére specifikus, 80 mmol/1 koncentrációjú dl-laktát oldatok oxidációja során a pH optimuma 7,6-nak adódott; a reakciótermékeket nem izolálták és nem azonosították. Tolbert, N. E. és munkatársai [J. Bioi. Chem., 181, 905-914 (1949)] dohánylevelekből származó, tisztított α-hidroxisav-oxidázt használtak körülbelül 113 mmol/1 koncentrációjú dl-tejsav oxidációjára foszfátpufferban pH = 8 mellett; a reakcióból származó piroszőlősavat (2,4-dinitro-fenil)hidrazonja alakjában izolálták, a piroszőlősav mennyiségét nem közölték; a reakcióban jelentős mennyiségű szén-dioxid is keletkezett. Richardson, K. E. és Tolbert,

N. E. (J. Bioi. Chem., 236, 1280-1284 (1961)] később közölték, hogy ez az α-hidroxisav-oxidáz enzim általánosabban mint glikolsav-oxidáz (azaz glikolát-oxidáz) néven már ismert.

Zelitch, I. és Ochoa, S. [J. Bioi. Chem., 201, 707-718 (1953)] közölték, hogy a glikolsav-oxidáz katalizálja az L-tejsav oxidációját molekuláris oxigénnel, aminek eredményeként piroszőlősav és hidrogén-peroxid képződik; kataláz hiányában a peroxid a piruváttal nem-enzimes úton reagál, ennek eredményeként acetát, szén-dioxid és víz keletkezik. Az igényelt enzim kofaktoraként flavin-mononukleotidot (FMN) azonosítottak: FMNnak az enzim vizes oldataihoz való hozzáadása lényegesen növelte a glikolsav-oxidáz stabilitását. 3,3 mmol/1 koncentrációjú L-laktát oldatok oxidációja 8,0 pH-értéken 50 mmol/1 foszfátpufferban, az elegyhez feleslegben adott kataláz jelenlétében 3,2 mmol/1 piroszőlősavat eredményezett (kolorimetriás meghatározás alapján); terméket nem izoláltak.

Kimutatták továbbá, hogy laktát oxidációja piruváttá patkányveséből izolált L-a-hidroxisav-oxidáz alkalmazásával is végbemegy [M. Blanchard és munkatársai: J. Bioi. Chem., 163,137-144 (1946)]. 33 mmol/1 koncentrációjú laktátoldat oxidációja 8,0 pH-értéken,

O, 167 mol/lfoszfátpufferban, feleslegben hozzáadott kataláz jelenlétében 79% hozammal vezetett piruváthoz [amelyet (2,4-dinitro-fenil)-hidrazonja alakjában izoláltak], További, a tej sav piroszőlősavvá végbemenő, oldható enzimekkel katalizált oxidációjára vonatkozó közlemények például: Robinson, J. C. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 237, 2001-2010 (1962) (sertés vesekérgéből származó L-a-hidroxisav-oxidáz); Urbán, P. és munkatársai: Biochemistry, 27, 7365-7371 (1988) (patkányveséből származó L-a-hidroxisav-oxidáz); Fry, D. W. és Richardson, K.E.: Biochim. Biophys. Acta, 568, 135-144 (1979) (emberi májból származó glikolsav-oxidáz); Emes, M. J. és Erismann, K. H.: Int. J. Biochem., 16, 1373-1378 (1984) (Lemna minor L.-ból származó glikolát-oxidáz); Kim, H. S. és Choi, J. D.: Koreán Biochem. J., 20, 350-356 (1987) (spenótból származó glikolát-oxidáz).

Bár az L-tejsav enzimmel katalizált, oxigénnel végbemenő oxidációja jól ismert, a piroszőlősavra irányuló, nagy szelektivitást csak egy vizsgálatban mutatták ki (Zelitch, I. és Ochoa, S.), ahol az L-laktát koncentrációja 3,3 mmol/1 volt; az L-laktátnak ez az alacsony koncentrációja korlátozta a képződött hidrogén-peroxid kon2

HU213 759 Β centrációját, valamint a feleslegben jelenlévő kataláz szintén korlátozta a hidrogén-peroxid piruváttal végbemenő reakcióját is, ami acetát és szén-dioxid képződésével járt. Ilyen alacsony koncentrációjú (körülbelül 3,2 mmol/1) piruvát kinyerése vizes reakcióelegyből gazdaságos gyártó eljárás céljára nem bír gyakorlati jelentőséggel.

Az alábbiakban összefoglaljuk találmányunk lényegét.

A találmány piroszőlősav (vagy valamilyen sója, amint ezt alább részletesen kifejtjük) előállítására vonatkozik L-tejsav (vagy annak valamilyen sója) oxidálásával oxigénnel, vizes oldatban, két enzimkatalizátor, a glikolát-oxidáz [például (S)-2-hidroxisav-oxidáz, EC 1.1.3.15) és kataláz (például EC 1.11.1.6) jelenlétében. Ennek alapján a találmány javított eljárást tesz lehetővé piroszőlősav előállítására; ezen eljárás szerint egy lépésben az L-tej savat oxigénnel vizes oldatban, glikolát-oxidáz enzimkatalizátor és kataláz enzimkatalizátor jelenlétében oxigénnel reagáltatjuk, elegendő időn át az L-tejsav magas hozammal piroszőlősavvá alakulásához

- aminek során az L-tejsav kezdeti koncentrációja körülbelül 0,1-tól körülbelül 0,2-ig terjed -, majd a piroszőlősavat kinyerjük. Figyelembe kell venni, hogy a találmány céljaira a piroszőlősav és L-tejsav elnevezés

- különösen, ha 6-10 pH-tartományú vizes oldatról van szó - pontosabban kifejezve erősen disszociált állapotra vonatkozik, ahol a részben közömbösített vizes oldatban túlnyomóan a piroszőlősav piruvátion, és az L-tejsav L-laktátion alakjában van jelen. A piroszőlősav finomvegyszerek, mezőgazdasági vegyszerek és gyógyszertermékek hasznos kémiai közbenső terméke. Ennélfogva azt is figyelembe kell vermi, hogy találmányunk leírásában a magas hozamokra és a piroszőlősav kinyerésére vonatkozó hivatkozások arra utalnak, hogy egyenértékű egy olyan eljárással, amelyben a piroszőlősav megfelelően magas hozamokkal, piroszőlősav további hasznos származékának közbenső termékeként keletkezik.

A találmány szerint a piroszőlősavat 0,5 M-ig terjedő koncentrációkban vett L-tejsav enzimmel katalizált oxidációjával állítjuk elő, és 96%-os hozammal izoláljuk (tisztasága 98%-os, nátriumsója alakjában). Az L-tejsav kezdeti magas koncentrációja alapján várható lett volna, hogy a szubsztrátum a glikolát-oxidáz enzimet gátolja; ez a reakció sebességét és/vagy a termék végső koncentrációját korlátozná; ugyanígy a piroszőlősav 0,5 mol/1 koncentrációja az enzimet termékgátlás következtében gátolhatta volna, s ennek az eredménye szintén a kapott termék koncentrációjának a korlátozása.

Továbbá - szintén a találmány értelmében - felismertük, hogy egészen 98-99%-ig terjedő hozamokkal kapható a piruvát nem-pufferolt reakciósarzsokban, a pH szabályzása nélkül; ezzel szemben az L-laktát enzimes oxidációit minden alkalommal valamilyen puffer, általában foszfátpuffer alkalmazásával végeztük. A puffer nélkül nyert piruvát magas hozamai azonosak a hozzáadott puffer jelenlétében kapott hozamokkal, vagy annál magasabbak. Hozzáadott puffer nélkül a piruvát előállítása lehetővé teszi a termék egyszerű elkülönítését a reakcióelegyből; a katalizátort szűréssel vagy centrifugálással eltávolítva piroszőlősav sójának a vizes oldatát kapjuk, amelyet a víz eltávolításával könnyen kinyerhetünk (például a vizet csökkentett nyomáson ledesztillálhatjuk, vagy az elegyet liofilizálhatjuk).

Megmutattuk génsebészeti úton kapott, permeabilizált teljes-sejtes katalizátorok (azaz mint glikolát-oxidázt és katalázt tartalmazó mikróba-transzformáns) alkalmazását az L-laktát piruváttá végbemenő oxidációjára. Ezen teljes-sejtes katalizátorok használata a találmány megvalósításában számos előnyt nyújtott az oldható enzimek, mint katalizátorok alkalmazásával szemben. A teljes-sejtes katalizátort tartalmazó oldatok oxigénnel vagy oxigéntartalmú gázzal finom eloszlásban kezelhetők, ami a reakció sebességét növeli; ezzel szemben oldható enzimeket tartalmazó reakcióelegy permetezése a glikolát-oxidáz enzim gyors, irreverzibilis denaturálódását idézi elő. A reakció befejeződése után a teljes-sejtes katalizátor könnyen kinyerhető szűréssel vagy centrifugálással, és ismét felhasználható; míg az oldható enzimek nem centrifugálhatok, és szűrésűk következtében az oldható glikolát-oxidáz aktivitás nagy része elvész. A teljes-sejtes katalizátorok esetében az újra felhasználható enzimaktivitás kinyerési százaléka rendkívül magas: minden egyes katalizátor-visszavitel (újra felhasználás, reciklizálás) hozama legalább 95%, míg az oldható glikolát-oxidáz maradék aktivitása egyetlen reakció után általában 40-60%. Az inért hordozóra kötött vagy azon immobilizált glikolát-oxidáz és kataláz alkalmazása számos ilyen előnyt mutat, tehát a találmány céljaira egyenértékűnek tekinthető.

Összehasonlítottuk 0,50 mmol/1 koncentrációjú Llaktát oldatok oxidációjának az eredményeit. 1) oldható glikolát-oxidáz (g.o.) és oldható kataláz, 2) Hansenula polymorpha permeabilizált-sejtes katalizátor és 3) Pichia pastoris permeabilizált-sejtes katalizátor alkalmazásával, azonos reakciókörülmények között. Eredményeinket az alábbi táblázatban összegeztük (a reakciókörülményekre vonatkozóan lásd az 5.,12. és 13. példákat).

Katalizátor	g.o. (NE/ml)	Kataláz (NE/ml)	Reakcióidő (óra)	Piruvát (%)	Acetát (%)	Laktát (%)
Oldható enzimek	6,0	10 000	5	95,3	4,5	0,9
H.polymorpha	6,4	5 000	2	97,0	2,5	0,4
Pichia pastoris	6,3	10 000	3	98,2	1,2	0,6

HU 213 759 Β

A piruvát hozama magasabb, és a melléktermékként képződött acetát termelődése csekélyebb, ha bármelyik, permeabilizált-sejtes katalizátorral kapott eredményeket az oldható glikolát-oxidáz és kataláz enzimkatalizátorokkal kapott eredményekkel összevetjük. Ha H. polymorpha permeabilizált-sejtes katalizátort alkalmazunk ugyanabban a glikolát-oxidáz koncentrációban, mint az oldható enzimmel végzett kísérletben, akkor kevesebb acetát képződik (a melléktermékként kapott hidrogén-peroxidnak a piruváttal végbemenő reakciója következtében), még akkor is, ha az endogén sejtes kataláz koncentrációja a reakcióelegyben fele akkora, mint az oldható enzimmel végzett reakcióban. Ezek az eredmények, valamint a példákban bemutatott eredmények szemléltetik a piruvát-hozamokban katalizátorokként permeabilizált-sejtes transzformánsok alkalmazásával kapott, váratlan javulást.

Az L-tejsav vagy alkalmas sójának katalitikus oxidációját célszerűen úgy végezzük, hogy az L-tej savat valamely molekuláris oxigénforrással olyan enzimkatalizátor jelenlétében érintkeztetjük, amely az L-tejsav O₂-vel végbemenő, piroszőlősav keletkezését eredményező oxidációját katalizálja. Ilyen katalizátor a glikolát-oxidáz enzim (EC 1.1.3.15), amely glikolsav-oxidáz néven is ismert. A glikolát-oxidáz számos, a szakterületen jól ismert forrásból izolálható (lásd fentebb). A reakcióban alkalmazott glikolát-oxidáznak hatékony koncentrációban, általában körülbelül 0,01 NE/ml és körülbelül 1000 NE/ml közötti koncentrációban, előnyösen körülbelül 0,1 NE/ml és körülbelül 10 NE/ml közötti koncentrációban kell jelen lennie. Az NE (Nemzetközi egység) definíció szerint az enzimek azon mennyisége, amely percenként 1 pmol szubsztrátum átalakulását katalizálja. Ez az enzim Zelitch, I. és Ochoa, S. módszerével mérhető [J. Bioi. Chem., 201, 707-718 ( 1953)]. Ezt a módszert alkalmazzuk a kinyert vagy reciklizált (ismételten felhasznált) glikolát-oxidáz aktivitásának mérésére is.

A glikolát-oxidáznak katalizátorként az L-tejsav piroszőlősavvá végbemenő oxidatív átalakulásában való alkalmazása során a legjobb eredményeket úgy équk el, hogy a reakcióelegybe hidrogén-peroxid lebomlását elősegítő katalizátor oldatát foglaljuk. Ilyen peroxid-bontó katalizátor - amely glikolát-oxidázzal kombinálva is hatékony - a kataláz enzim (EC 1.11.1.6). A kataláz katalizálja a hidrogén-peroxid lebomlását vízzé és oxigénné; nézetünk szerint a találmány szerinti eljárásban a piroszőlősav hozamát azáltal javítja, hogy meggyorsítja annak a hidrogén-peroxidnak a lebomlását, amely a tej sav O₂-vel végbemenő, glikolát-oxidázzal katalizált reakciójában a piroszőlősavval együtt termelődik. A kataláz koncentrációjának 50-50 000 NE/ml-nek, előnyösen 2000-15 000 NE/ml-nek kell lennie. A kataláz és a glikolát-oxidáz koncentrációit a fenti tartományokon belül úgy állítjuk be, hogy a kataláznak glikolát-oxidázhoz viszonyított aránya (mindkét enzimet NE-ben mérve) legalább körülbelül 250 : 1.

Az oldható enzimek katalizátorokként végzett alkalmazásán kívül előállítottunk olyan mikróba-transzformánsokat, amelyek mind glikolát-oxidáz aktivitást, mind endogén kataláz aktivitást kifejeznek, és bemutattuk alkalmazásukat mikrobiális katalizátor minőségében a találmányunkban. A találmányban alkalmazott mikrobiális (mikróbás) sejtkatalizátor a Hansenula polymorpha egyik transzformánsa (metilotróf élesztő). Több, elegendő glikolát-oxidáz aktivitással rendelkező H. polymorpha transzformánst hoztunk létre úgy, hogy a glikolát-oxidázért felelős DNS-t a formiát-dehidrogenáz (FMD) promoter szabályzó (kontroll) hatása alatt egy expressziós (kifejező) vektorba építettük. A H. polymorpha-t e vektorral transzformáltuk, elkülönítettünk (szelektáltunk) egy törzset, amely a glikolát-oxidázt nagy koncentrációkban termelte, és ezt a törzset H. polymorpha GO 1-nek neveztük el [a törzset az ARS Patent Culture Collection intézményben a Northern Régiónál Research Laboratory Y-21065 tételszámán helyeztük letétbe (U.S.D.A. Peoria, Illinois)).

A H. polymorpha sejtkatalizátorokat általában úgy állítottuk elő, hogy előbb egy H. polymorpha transzformánsból 500 ml YPD (Difco) keverékben, 4,4 pH-értéken inokulumot (oltványt) növesztettünk. Ezt a tenyészetet olyan fermentorba oltottuk, amely 10 liter élesztőnitrogén-bázist (alapanyagot) (YNB, Difco) aminosavak (14 g) nélkül, 50 g ammónium-szulfátot és 100 g metanolt tartalmazott 5,0 pH-értékkel. A fermentort 37 °C hőmérsékleten 42,5 órán át működtettük 400 rpm keverési sebességgel, 5,0 állandó pH-érték megtartásával, 40% oldott oxigénnel (ezt szabályoztuk), és 97 kPa nyomású levegővel. A fermentáció befejeződésekor 1,0 kg glicerint adtunk hozzá, a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, cseppfolyós nitrogénben fagyasztottuk, és -80 °C-on tároltuk.

A találmány megvalósításában második mikróbás sejtkatalizátorként egy Pichia pastoris transzformánst (metilotróf élesztő) használtunk fel, amely kifejezi spenótból a glikolát-oxidáz enzimet, valamint egy endogén katalázt fejez ki. A P. pastoris több, megfelelő glikolátoxidáz aktivitással rendelkező transzformánsát állítottuk elő úgy, hogy a spenót glikolát-oxidáz génjét tartalmazó DNS-fragmentumot egy P. pastoris kifejező vektorba (pHIL-D4) építettük a metanollal indukálható alkohol-oxidáz promoter kontrollja alatt, s így a pMPl plazmidhoz jutottunk. A pMPl plazmiddal transzformáltuk a P. pastoris GTS115 (NRRL Y-15851) törzsét, és szelektálással elvégeztük a linearizált pMPl plazmid integrálását a kromoszóma alkohol-oxidáz I helyére, valamint az alkohol-oxidáz gén kicserélését a glikolát-oxidáz génre. Ezt követően az ilyen transzformánsoknak egy készletéből az expressziós készlet integrált példányainak maximális számát szelektáltuk. Nagyszámú transzformánst izoláltunk, ezt P. pastoris GS 115-MSP 10 névvel láttuk el, és NRRL Y-21001 jelzéssel letétbe helyeztük.

A P. pastoris sejteket általában úgy állítottuk elő, hogy 100 ml, 1 % glicerint tartalmazó YNB-ben inokulumot növesztettünk. 48 órás 30 °C-on végzett szaporítás után a sejteket olyan fermentorba vittük át, amely 134 g élesztő-nitrogén-bázist (YNB) aminosavak nélkül, 100 g glicerint és 20 mg biotint tartalmazott 10 1 közegtérfogatban. A fermentációt 5,0 pH-értéken (NH4OH-val

HU 213 759 Β szabályoztuk), 30 °C-on, 200 rpm keverési sebességgel, 5 slpm levegőztetéssel, 34 kPa levegőnyomással végeztük, miközben az oldott oxigén koncentrációját legalább a telítettség félértékén tartottuk. Amikor a glicerin elfogyott, a sejteket a glikolát-oxidáz kifej ezésére indukáltuk úgy, hogy azonos közegben szaporítottuk, kivéve, hogy glicerin helyett 50 g metanolt használtunk. Az indukció után a keveréket 1 kg glicerinnel kezeltük, majd a sejteket összegyűjtöttük. Ezt követően a sejteket cseppfolyós nitrogénben fagyasztottuk, és -80 °C-on tároltuk.

A glikolsavnak glioxilsavvá végbemenő oxidációja céljára a H. polymorpha és P. pastoris transzformáns sejtjeit a katalizátorként való alkalmazás előtt permeabilissá kellett tenni. Többféle, ismert permeabilizáló módszer alkalmas volt olyan sejtek előállítására, amelyek elegendő glikolát-oxidáz aktivitással rendelkeztek [lásd: Félix, H.: Anal. Biochemistry, 120, 211-234 (1982)] ; általában 10 tömeg% nedves sejtet 0,1 térfogat% TRITON Χ-100-at tartalmazó 20 mmol/1 foszfátpufferban (pH = 7,0) 15 percig kevertünk, majd cseppfolyós nitrogénben fagyasztottuk, felolvasztottuk, és 20 mmol/1 foszfát és 0,1 mmol/1 FMN puffer elegyével mostuk (pH = 7,0). A permeabilizálás egy második eljárása szerint 10 tömeg% nedves sejtet 0,2 tömeg/térfogat% benzalkónium-kloridot tartalmazó 20 mmol/1 foszfátpufferban (pH = 7,0) 60 percig kevertünk, majd a permeabilizált sejteket 20 mmol/1 foszfát és 0,1 mmol/1 FMN puffer keverékével (pH = 7,0) mostuk. Permeabilizálás után a teljes-sejtes katalizátor reakcióhoz szükséges mennyiségét úgy választottuk meg, hogy a glikolát-oxidáz és kataláz fentebb, a megfelelő oldható enzimek esetében leírt aktivitásaihoz szükséges koncentrációkat biztosítsa. A glikolát-oxidáz és kataláz aktivitásának a kezdeti értékekhez viszonyított több, mint 100%os kinyerése annak tulajdonítható, hogy a reakció során a sejtek permeabilitása növekedett.

A mikróbás sejt-transzformánsok glikolát-oxidáz aktivitását úgy mértük, hogy körülbelül 5-10 mg nedves sejtet (szűrőpapíron a fölös nedvességet eltávolítva) pontosan bemértünk egy 3 ml-es kvarcküvettába, amely mágneses keverőt és 2,0 ml oldatot tartalmazott, mely utóbbi oldat 0,12 mmol/1 2,6-diklór-fenol-indofenolból (DCIP) és 80 mmol/1 TRIS [trisz(hidroxi-metil)-amino-metán] pufferból állt (pH = 8,3). A küvettát gumifedéllel zártuk, és az oldatot nitrogén 5 perces átbuborékoltatásával oxigénmentesítettük. Ezután a küvettába injekciós fecskendővel 40 μΐ 1,0 mol/1 koncentrációjú glikolsavat és 1,0 mol/1 TRIS-t tartalmazó elegyet adtunk (pH = 8,3), és az elegyet kevertük, miközben az abszorpció idő szerinti változását 605 nm hullámhosszon (ε = 22 000) mértük. A kataláz aktivitását úgy mértük, hogy körülbelül 2-5 mg nedves sejtet (szűrőpapíron a fölös nedvesség eltávolítása után) pontosan bemértünk egy 3 ml-es kvarcküvettába, amely mágneses keverőt és 2,0 ml desztillált vizet tartalmazott, majd 1,0 ml 59 mmol/1 hidrogén-peroxidot 50 mmol/1 foszfátpufferban (pH = 7,0) tartalmazó oldatot adtunk hozzá, és mértük az abszorpció idő szerinti változását 240 nm hullámhosszon (ε = 39,4). A H. polymorpha vagy P. pastoris különböző közegekben tenyésztett, permeabilizált nedves sejtjeinek glikolát-oxidáz és kataláz aktivitásai a glikolát-oxidáz esetében 20-120 DCIP NE/g nedves sejttartományban, az endogén kataláz esetében 30 000—200 000 NE/g nedves sejttartományban adódtak.

Tetszés szerinti, gyakran azonban kedvező komponens a reakcióelegyben a flavin-mononukleotid (FMN), amelyet általában körülbelül 2,0 mmol/1 koncentrációig teijedő értékben, előnyösen körülbelül 0,01-0,2 mmol/1 koncentrációtartományban alkalmazunk. Nézetünk szerint az FMN növeli a glikolát-oxidáz termelékenységét, amin a glioxilsavvá alakult glikolsavnak az enzim egységére vonatkoztatott mennyiségét értjük. Ezt úgy kell érteni, hogy a hozzáadott FMN koncentrációja összeadódik az enzimben jelenlévő FMN-nel, mivel FMN-t gyakran adnak az enzimhez az enzim előállítása során. Az FMN szerkezete és elemzésének módszere a következő helyen található: Yagai, K.: „Methods of Biochemical Analysis” (Biokémiai elemzési módszerek), X. kötet, Interscience Publishers, New York, 319-355. old. (1962).

Az L-tejsav kereskedelmi forgalomból beszerezhető. A találmány szerinti reakcióban kezdeti koncentrációja 0,10-2,0 mol/1 tartományban, előnyösen 0,25 mol/1 és 1,0 mol/1 közötti tartományban van. A reakcióban felhasználható sav vagy valamilyen összeegyeztethető, azaz olyan sója formájában, amely vízben oldható, és kationja az L-tej savnak piroszőlősawá végbemenő, kívánt átalakulását nem zavarja. Az alkalmas és összeegyeztethető sóképző kationos csoportok kísérleti úton könnyen meghatározhatók. E célra alkalmas sók például az alkálifém-, alkáliföldfém-, ammónium-, szubsztituált ammónium-, foszfónium- és szubsztituált foszfóniumsók. A fermentáció útján előállított L-tejsav szubsztrátumként közvetlenül - mint a fermentorból származó, szűrt oldat - tisztítás vagy a fermentléből való izolálás nélkül felhasználható.

Az L-tejsav piroszőlősawá alakítása vizes közegben könnyen és előnyösen végrehajtható. A reakcióelegy pH-értékét 6 és 10, előnyösen 7 és 9 közé állítjuk. Ezen pH-tartományokon belül a kívánt pH pontos értéke bármely összeegyeztethető, nem zavaró hatású bázis hozzáadásával beállítható; ilyenek például (azonban korlátozás nélkül) az alkálifém-hidroxidok, karbonátok, -hidrogén-karbonátok és -foszfátok. Nem pufferolt reakcióelegy pH-értéke a reakció előrehaladtával mintegy 2 pHegységgel csökken, ezért gyakran előnyös a reakciót a maximális enzimaktivitás pH-tartományának felső határán - körülbelül 9,0-8,5 tartományban - indítani és a reakció alatt ezt az értéket csökkenni hagyni; a nem pufferolt reakcióelegyek végső pH-értéke általában körülbelül 6,7-7,5. A pH-értékét adott esetben a reakciót nem befolyásoló (nem zavaró) szervetlen vagy szerves puffer külön hozzáadásával tarthatjuk fenn; ehhez olyan puffer alkalmas, amelynek pufferkapacitása 7,5 pH körüli, mivel az L-laktát oxidációja szempontjából az optimális enzimaktivitás ehhez az értékhez közel esik; alkalmas puffer használata esetén a kezdeti pH-érték 7,5. Belátható, hogy az L-tejsav és a piroszölősav vízben erősen disszociálva van, és 7 és 10 közötti pH-tartományban nagymértékben - ha nem lényegesen - L-laktát, illetve piruvát ionok alakjában van jelen.

HU 213 759 Β

Az oxigént (0₂), mint oxidálószert az L-tejsav piroszőlősavvá alakítására, a reakcióhoz gáz formájában, a folyadéknak a keverése közben a gáz-folyadék határfelületen vagy egy oxigén számára átj árható membránon át adagoljuk a reakcióhoz. Amennyiben permeabilizált teljes-sejtes katalizátort használunk, akkor az oxigént oxigén vagy oxigéntartalmú gáz átbuborékoltatásával adhatjuk a reakcióelegyhez. A legtöbb esetben a reakció sebessége legalább részben szabályozható azzal a sebességgel, amellyel az oxigén a vizes közegben oldódni képes. így tehát - bár az oxigén a reakcióelegyhez levegő formájában is adható - az oxigénnek viszonylag tiszta formája is alkalmazható. Jóllehet az oxigén nyomásának felső határa nem ismert, 5 MPa-ig terjedő oxigénnyomást alkalmazhatunk előnyösen; a felső határ 1,5 MPa. A keverés lényeges az oxigén gyors oldódása, s így a nagyobb reakciósebesség elérésére. Bármely célszerű keverési forma alkalmas: erős, nyíróhatású keverés, amely habot képezhet, csökkentheti az oldható enzim(ek) aktivitását, tehát oldható enzimkatalizátor esetén kerülnünk kell.

A reakció hőmérséklete fontos változó, mivel a reakció sebességét és az enzimek stabilitását érinti. Általában körülbelül 40 °C hőmérséklet alkalmazható a katalitikus aktivitás lényeges vesztesége nélkül, míg az előnyös reakcióhőmérsékleti tartomány körülbelül 0 °C-tól körülbelül 15 °C-ig terjed. Az előnyös hőmérséklettartományban való alkalmazás maximálissá teszi a reakció végén visszanyert enzimaktivitást. A hőmérsékletnek nem szabad olyan alacsonynak lennie, hogy a vizes oldat fagyása elkezdődjék. A hőmérséklet a szokásos módszerekkel, így például (azonban korlátozás nélkül) köpennyel ellátott reakcióedénnyel, és megfelelő hőmérsékletű folyadéknak a köpenyen át történő vezetésével szabályozható. A reakcióedény bármely anyagból készíthető, amely a reakció komponenseivel szemben inért.

A reakció befejeződése után az oldható enzimkatalizátorok szűréssel vagy centrifugálással eltávolíthatók, és adott esetben újra felhasználhatók. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy ezeket az enzimkatalizátorokat hevítéssel - például 5 percig 70 °C hőmérsékleten melegítve - denaturáljuk és kicsapjuk; és/vagy a reakcióelegyben hagyhatjuk, ha jelenlétük nem kifogásolható. A permeabilizált sejtkatalizátorok a reakcióelegyekből elkülöníthetők centrifugálással vagy szűréssel, reciklizálás céljára. Az oldható enzim- vagy mikróbás sejtkatalizátorok eltávolítása után a flavin-mononukleotid (FMN) adott esetben az oldat aktivált-szenes kezelésével eltávolítható. A kívánt piroszőlősav (azaz piroszőlősav és piruvátsók) az oldatból elkülöníthetők önmagukban, vagy a kapott oldat töményíthető, és a piroszőlősav a víz eltávolításával kinyerhető; ez például a víz csökkentett nyomás alatti ledesztillálásával, liofilizálással (fagyasztó szárítással) vagy bármilyen más, a szakterületen általánosan ismert módszerrel végezhető.

Az alábbi példák a találmány további szemléltetését szolgálják; ha más, erre vonatkozó megjegyzést nem teszünk, akkor a piruvát és acetát, valamint a visszanyert L-laktát hozama a reakció kezdetén jelenlévő L-tejsav teljes mennyiségére vonatkoztatott százalékos értékek.

A reakcióelegyek elemzését nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC), a szerves savak elemzését BioRad HPX-87H oszlop alkalmazásával végzetük.

A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük.

1. példa ml-es Fischer-Porter aeroszol-üvegreakciós edénybe mágneses keverőt és 10 ml vizes oldatot helyezünk, amely 0,75 mol/1 lítium-L-laktátot, 0,01 mmol/1 FMN-t, 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard), 0,788 bicinepuffert, 1,0 NE/ml spenót-glikolát-oxidázt és 1400 NE/ml Aspergillus niger katalázt tartalmaz (pH = 8,9). A reakcióedényt bezárjuk, és a reakcióelegyet 5 °C-ra hütjük, oxigénnel öblítjük 480 kPa nyomásra töltve, majd atmoszféranyomásra bocsátva ötszöri ismétléssel keverés közben. Ezután az edényt 480 kPa oxigénnyomásra töltjük, és a reakcióelegyet 5 °C-on keverjük. 0,10 ml alikvot részeket veszünk ki injekciós fecskendővel egy mintavevő nyíláson át (az edény nyomásának csökkenése nélkül) szabályszerű időközökben HPLC-elemzés céljára, a reakció előrehaladásának figyelése céljából. 28,5 óra elmúltával a HPLC alapján a piruvát hozama 47,7%, az acetáté 43,6%, míg 11,5% laktát változatlanul megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve katalázmaradék aktivitása kezdeti értékük 40%-a, illetve 100%-a.

2. példa

Az 1. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot használunk, amely 0,750 mol/1 L-tejsavat (96% L-izomer, 4% D-izomer), 0,750 mol/1 KH₂PO₄-t, 0,01 mmol/1 FMN-t, 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard), 1,0 NE/ml spenót-glikolát-oxidázt és 14 000 NE/ml Aspergillus niger-ból eredő oldható katalizátort tartalmaz (pH = 8,1, 5 °C hőmérsékleten). 48 óra elmúltával a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 79,6%, illetve 3,8%, míg 20,2% laktát változatlanul marad. A glikolát-oxidáz, illetve katalázmaradék aktivitása a 18 órás reakció után kezdeti értékük 22%-a, illetve 100%-a.

3. példa

Az 1. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot alkalmazunk, amely 0,500 mol/1 L-tej savat (96% L-izomer, 4% D-izomer), 0,50 mol/1 KH₂PO₄-t, 0,01 mmol/1 FMN-t, 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard), 2,0 NE/ml spenót-glikolát-oxidázt és 14 000 NE/ml oldható, Aspergillus niger-ből eredő katalázt tartalmaz (pH = 8,3, 5 °C hőmérsékleten). 18 óra elmúltával a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 90,5%, illetve 4,2%, míg 6,4% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz maradék aktivitása kezdeti értékük 57%-a, illetve 100%-a.

4. példa

Az 1. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot alkalmazunk, amely 0,500 mol/1 nátrium-L-laktátot, 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső

HU 213 759 Β standard), 2,0 NE/ml spenót-glikolát-oxidázt és 20 000 NE/ml oldható, Aspergillus niger-bcA eredő katalázt tartalmaz (pH = 9,0, beállítása 50%-os NaOH-dal; hőmérséklet 15 °C; puffért nem adunk hozzá). 7 óra elmúltával a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 91,6%, illetve 0,6%, és 7,1% laktát változatlanul marad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz maradék aktivitása kezdeti értékük 21 %-a, illetve 100%-a.

5. példa

Az 1. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot alkalmazunk, amely 0,500 mol/1 nátrium-L-laktátot, 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard), 6,0 NE/ml spenót-glikolátoxidázt és 10 000 Ne/ml Aspergillus niger-böl eredő oldható katalázt tartalmaz (pH = 9,0, 50%-os NaOHdal állítjuk be; hőmérséklet 15 °C; puffért nem adunk hozzá). 5 óra elmúltával a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 95,3%, illetve 0,9%, míg 4,5% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve katalázmaradék aktivitása kezdeti értékükre vonatkoztatva 68%, illetve 100%.

6. példa ml-es Fischer-Porter aeroszol-üveg reakcióedénybe mágneses keverőt és 10 ml olyan vizes oldatot helyezünk, amely 0,500 mol/1 nátrium-L-laktátot, 0,50 mol/1 KH₂PO4-t, 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard) tartalmaz (pH = 9,0, beállítása 50%-os NaOH-dal; hőmérséklet 5 °C). Ezután a reakcióedénybe 0,75 g Pichia pastoris GS 115-MSP 10 transzformánst adunk (65,2 NE glikolát-oxidáz és 101 000 NE kataláz); a transzformánst 0,1 % benzalkónium-kloriddal kezelve permeabilizáltuk (LONZA BARQUAT OJ50); majd a reakcióedényt zárjuk, és a reakcióelegyet 5 °C-ra hütjük. Az edényt 480 kPa oxigénnyomással öblítjük, majd atmoszféranyomásra csökkentjük, és ezt keverés közben ötször ismételjük, majd az edényt 480 kPa oxigénnyomásra töltjük, és az elegyet 5 °C hőmérsékleten keverjük. A mintavevő nyíláson át fecskendővel 0,10 ml térfogatú alikvotokat veszünk ki (az edény nyomásának csökkenése nélkül) szabályszerű időközökben HPLC-elemzés céljára, a reakció előrehaladásának monitorozására. Öt óra eltelte után a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 97,6%, illetve 2,5%, míg 0,3% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz megmaradt permeabilizált-sejt aktivitása kiindulási értékeikre vonatkoztatva 104%, illetve 105%.

7. példa

A 6. példában leírt reakciót ismételjük, 0,5 mol/1 bicinepuffert alkalmazunk, 0,50 mol/1 KH₂PO₄ helyett. Öt óra eltelte után a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 93,1%, illetve 6,3%, míg 0,4% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz megmaradó permeabilizált-sejt aktivitása kezdeti értékükre vonatkoztatva 107%, illetve 122%.

8. példa

A 6. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot használunk, amely 0,5 mol/1 nátrium-L-laktátot és 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard) tartalmaz (pH = 9,0, beállítása 50 %-os NaOHdal), és amelyhez 0,75 gPichiapastoris GS 115-MSP 10 transzformánst adunk (65,2 NE glikolát-oxidáz és 101 000 NE kataláz), amelyet előzőleg 0,1% benzalkónium-kloriddal (LONZA BARQUAT OJ-50) kezelve permeabilizáltunk; puffért nem adunk hozzá. Öt óra elmúltával a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 99,0%, illetve 0,7%, míg 0,4% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizált-sejt aktivitásának maradéka kezdeti értékükhöz viszonyítva 119%, illetve 113%.

9. példa

A 6. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot alkalmazunk, amely 0,500 mol/1 nátrium-L-laktátot és 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard, beállítása 50%-os NaOH-dal), amelyhez 0,35 g Pichia pastoris GS115-MSP1O transzformánst adunk (22,6 NE glikolát-oxidáz és 50 000 NE kataláz), s amelyet előzőleg 0,1% benzalkónium-kloriddal (LONZA BARQUAT OJ-50) kezelve permeabilizáltunk; puffért nem adunk hozzá. Nyolc óra elmúltával a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 97,4%, illetve 2,3%, míg 0,4% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizált-sejt aktivitásának maradéka kezdeti értékük 123%-a, illetve 150%-a.

10. példa

A 6. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot használunk, amely 0,500 mol/1 nátrium-L-laktátot és 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard) tartalmaz (pH = 9,0, beállítása 50%-os NaOHdal), s amelyhez 0,18 g Pichia pastoris GS 115-MSP 10 transzformánst (11,3 NE glikolát-oxidáz és 25 000 NE kataláz) adunk, amelyet előzőleg 0,1% benzalkónium-kloriddal (LONZA BARQUAT OJ-50) kezelve permeabilizáltunk; puffért nem teszünk hozzá. Tíz óra elmúltával HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 92,9%, illetve 5,0%, míg 3,3% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizált-sejtes maradék aktivitása kezdeti értékük 121 %-a, illetve 228%-a.

11. példa

A 6. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot alkalmazunk, amely 1,00 mol/1 nátrium-L-laktátot és 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard) tartalmaz (pH = 9,0, beállítása 50%-os NaOHdal), melyhez 0,71 g Pichia pastoris GS 115-MSP 10 transzformánst adunk (45,9 NE glikolát-oxidáz és 100 000 NE kataláz), s amelyet előzőleg 0,1% benzalkónium-kloriddal (LONZA BARQUAT OJ-50) permeabilizáltunk; puffért nem adunk hozzá. Nyolc óra múlva a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 89,1%, illetve 8,4%, míg 1,3% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizált-sejtes aktivitásának maradéka kezdeti értékük 124%-a, illetve 145%-a.

HU 213 759 Β

12. példa

A 6. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot használunk, amely 0,50 mol/1 nátrium-L-laktátot és 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard) tartalmaz (pH = 9,0, beállítása 50%-os NaOHdal), amelyhez 0,66 g Pichia pastoris GS 115-MSP 10 transzformánst adunk (62,7 NE glikolát-oxidáz és 100 000 NE kataláz), s amelyet 0,1% benzalkónium-kloriddal (LONZA BARQUAT OJ-50) permeabilizáltunk; puffért nem adunk hozzá. A reakció hőmérséklete 15 °C, az oxigén nyomása 480 kPa. Három óra elmúltával a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 98,2%, illetve 1,2%, míg 0,6% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizált-sejtes aktivitásának maradéka kezdeti értékük 127%-a, illetve 130%-a.

13. példa

A 12. példában leírt eljárást követjük, azonban 10 ml olyan vizes oldatot alkalmazunk, amely 0,50 mol/1 nátrium-L-laktátot és 0,100 mol/1 izovajsavat (HPLC belső standard) tartalmaz (pH = 9,0, beállítása 50%-os NaOHdal), amelyhez 1,04 g Hansenula polymorpha GOI transzformánst adunk (64,7 NE glikolát-oxidáz és 50 000 NE kataláz), s amelyet előzőleg 0,1% benzalkónium-kloriddal (LONZA BARQUAT OJ-50) permeabilizáltunk; puffért nem adunk hozzá. A reakció hőmérséklete 15 °C, az oxigén nyomása 480 kPa. Két óra elmúltával a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 97,0%, illetve 2,5%, míg 0,4% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizált-sejtes aktivitásának maradéka kezdeti értékükhöz viszonyítva 99%, illetve 155%.

14. példa

A 13. példában leírt reakciót 5 °C hőmérsékleten, 830 kPa oxigénnyomáson ismételjük. Négy óra eltelte után a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 93,1%, illetve 3,7%, míg 2,2% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizált-sejtes aktivitásának maradéka kezdeti értékük 66%-a, illetve 180%-a.

75. példa

A 13. példában leírt reakciót ismételjük 30 °C hőmérsékleten, 480 kPa oxigénnyomás alatt. Három óra eltelte után a HPLC alapján a piruvát, illetve acetát hozama 89,9%, illetve 6,5%, míg 0,6% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizáltsejtes aktivitásának maradéka kezdeti értékük 45%-a, illetve 140%-a.

16. példa

300 ml térfogatú EZE-Seal keverős autoklávjába - amely Dispersimax Impeller eszközzel felszerelve 100 ml olyan oldatot helyezünk, amely 5,50 g (0,50 mol/1) nátrium-L-laktátot tartalmaz. Ezután az autoklávba 6,70 g Pichia pastoris GS 115-MSP 10 transzformáns törzset adunk (670 NE glikolát-oxidáz és 1 177 000 NE kataláz), amelyet előzőleg 0,1% benzalkónium-kloriddal (LONZA BARQUAT MB-50) kezelve permeabilizáltunk. A reakcióelegyet 50%-os NaOH-dal 9,0 pH-ra állítjuk, és 5 °C-ra hűtjük. A reaktort oxigénnel öblítjük, majd a reakcióelegyet 750 rpm sebességgel keverjük, és turbinaberendezés segítségével 5 °C hőmérsékleten 276 kPa oxigénnyomáson oxigént buborékoltatunk a reakcióelegyen keresztül. A reakció előrehaladását úgy figyeljük, hogy szabályszerű időközökben a reakcióelegyből 0,40 ml alikvot térfogatokat veszünk ki, ezt Millipore Ultrafree-MC 10 000 NMWL szűrőegység alkalmazásával szűrjük, és a szürletet HPLC segítségével elemezzük; belső standardként a mintához 0,10 mol/1 izovajsavat adunk. Három óra múlva a HPLC szerint a piruvát, illetve acetát hozama 99,2%, illetve 1,4%, míg 0,6% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizált-sejtes aktivitását 107%-kal, illetve 106%-kal nyerjük vissza a kezdeti értékükre vonatkoztatva.

A reakcióelegyből a permeabilizált-sejtes katalizátort centrifugálással eltávolítjuk, és a felülúszót 0,2 mm szűrőnyílású nylon szűrőn át szűrjük. A kapott szűrlet pHértékét 1,0 N sósavoldattal 4,6-ra állítjuk, majd az oldatot megfagyasztjuk, és a vizet liofilizálással eltávolítjuk. így 5,20 g nátrium-piruvátot kapunk (az izolált termék hozama 96%, a HPLC elemzés alapján 98% a nátriumpiruvát hozama).

7. példa

109,9 g/1 ammónium-laktátot (97,8% L-laktát, 2,2% D-laktát) 0,8 g/1 acetátot és 2,8 g/1 maltázt tartalmazó fermentlevet az anyagrészecskék eltávolítása céljából centrifugálunk, majd 0,45 mm szürőnyílású szűrőn át szűrjük. Az így kapott oldatban az ammónium-laktát koncentrációja 1,10 mohi (a HPLC elemzés alapján 118,6 g/1). Dispersimax Impeller berendezéssel (beszerzési helye: Autoclave Engineers) felszerelt 300 ml-es EZE-Seal autoklávba keverés közben 45 ml 1,10 mol/1 koncentrációjú szűrt fermentlevet helyezünk, 55 ml desztillált vizet adunk hozzá, s így 0,50 mol/1 ammónium-laktátot tartalmazó, 100 ml vizes oldatot kapunk. Ekkor a reaktorba adunk 6,70 g reciklizált Pichia pastoris GS 115-MSP 10 transzfonnáns törzset (666 NE glikolát-oxidáz és 1 107 000 NE kataláz), amelyet előzőleg 0,1% benzalkónium-kloriddal (LONZA BARQUAT OJ-50) kezelve permeabilizáltunk, az elegy pH-értékét 50%-os NaOH-dal 7,5-re állítjuk, és 5 °C-ra hütjük. A reaktort oxigénnel öblítjük, és az elegyet 750 rpm sebességgel keverjük, miközben (turbinás keverővei keverve) 5 °C hőmérsékleten 276 kPa nyomáson oxigént buborékoltatunk át. A reakció előrehaladását úgy figyeljük, hogy szabályszerű időközökben a reakcióelegyből 0,40 ml térfogatú alikvot részeket veszünk ki, ezt Millipore Ultrafree-MC 10 000 NMWL szűrőegység alkalmazásával szűrjük, és a szürletet HPLC segítségével 0,10 mol/1 izovajsav, mint belső standard alkalmazásával elemezzük. Három óra múlva a HPLC szerint a piruvát, illetve acetát hozama 94,1% (az L-laktátra alapozva 96,2%), illetve 2,8%, míg 2,5% laktát megmarad. A glikolát-oxidáz, illetve kataláz permeabilizált-sejtes, visszanyert aktivitása 101%, illetve 56% kiindulási értékükre vonatkoztatva.

HU 213 759 Β

A fentiekben találmányunkat bizonyos mértékű részletességgel leírtuk, és példákban bemutattuk. Nyilvánvaló azonban, hogy az alábbi igénypontok a leírtakra nem korlátozhatók, hanem terjedelmük az igénypont minden egyes elemének megfogalmazásával és azok 5 ekvivalenseivel összemérhető.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás piroszölősav előállítására, azzaljellemezve, j 0 hogy egylépésben L-tejsavat oxigénnel vizes oldatban, glikolát-oxidáz enzimkatalizátor és kataláz enzimkatalizátor jelenlétében reagáltatunk az L-tejsav magas hozammal piroszőlösavvá alakulásához elegendő időn átaminek során az L-tejsav kezdeti koncentrációja j5 0,1 mol/1 és 2,0 mol/1 között van majd a piroszőlősavat kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimkatalizátorokként egy, a glikolát-oxidát és katalázt kifejező mikróba-transzformáns permeabilizált teljes sejtjeit alkalmazzuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy az eljárást hozzáadott puffer nélkül és a pH szabályozása nélkül hajtjuk végre.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 6-tól 10-ig terjedő pH-tartományban, 0,01—1000 NE/ml glikolát-oxidáz aktivitás és 50-50 000 NE/ml kataláz aktivitás jelenlétében hajtjuk végre.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,1-10 NE/ml glikolát-oxidáz aktivitást és 2000-15 000 NE/ml kataláz aktivitást alkalmazunk, ahol a kataláz aktivitásának a glikolát-oxidáz aktivitásához viszonyított aránya NE/ml-ben kifejezve legalább 250 : 1.