KR100246127B1

KR100246127B1 - 비형 간염 바이러스의 표면항원 프리-에스1에 대한 생쥐 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100246127B1
Application number: KR1019970030695A
Authority: KR
Inventors: 홍효정; 류춘제; 김윤규; 김희선; 현병화; 김명수; 진은희
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1997-07-02
Filing date: 1997-07-02
Publication date: 2000-03-15
Also published as: KR19990008648A

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 (HBV)의 표면항원 프리-S1 (pre-S1)에 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 HBV 표면항원 프리-S1 의 21-28번 아미노산을 포함하는 에피토프를 특이적으로 인식하는 생쥐 단일클론항체에 관한 것으로서, 이는 여러 아형 및 변이 HBV 를 중화시킬 수 있어 HBV 감염을 예방하고 치료하는데 널리 사용될 수 있다.

Description

비형 간염 바이러스의 표면항원 프리-에스1 에 대한 생쥐 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 그의 제조방법.

본 발명은 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus; 이하 " HBV " 라고 약칭함)의 표면항원 프리-S1 (pre-S1)에 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 HBV 표면항원 프리-S1 의 21-28번 아미노산을 포함하는 에피토프를 특이적으로 인식하는 생쥐 단일클론항체에 관한 것으로서, 이는 여러 아형 및 변이 HBV 를 중화시킬 수 있어 HBV 감염을 효과적으로 예방하고 치료하는데 사용될 수 있다.

B형 간염 바이러스 (HBV)는 사람에 침입하여 만성 및 급성 간염을 일으키고, 악화될 경우 간경화와 간암의 원인이 되는 병원체로서, 전세계적으로 3억명에 이르는 사람이 감염된 것으로 추산된다 (Tiollais & Buendia, Sci. Am., 264: 48, 1991).

HBV 에 감염된 경우, 특히 HBV 양성인 모친으로부터 태어나는 신생아, HBV 에 노출된 의료기관 종사자 또는 HBV 관련 간질환으로 인해 간이식 수술을 받은 환자에서 HBV 감염을 방지하기 위해 HB 면역 글로불린 (HB immunoglobulin, HBIG)이 사용되고 있다 (Beasley, et al., Lancet, 2: 1099, 1983; Todo, et al., Hepatol., 13: 619, 1991). 그러나 현재 사용되는 HBIG 는 혈장으로부터 추출되기 때문에, 특이도 (specificity)가 낮고 오염원에 노출되어 있으며, 이를 대량 생산하는데 사람 혈액의 계속적인 공급이 필요하다는 단점이 있다. 이러한 단점은 HBV 의 표면항원에 대한 단일클론항체를 개발하여 사용하면 극복할 수 있다.

HBV 의 피막은 3개의 단백질로 구성되는데, 구체적으로 S 항원을 포함하는 주(major) 단백질, S 항원과 프리-S2 항원을 포함하는 중(middle) 단백질 및 S 항원, 프리-S2 항원과 프리-S1 항원을 포함하는 대(large) 단백질로 구성된다 (Neurath, A. R. and Kent, S. B. H., Adv. Vir. Res. 34: 65-142, 1988). 이 모든 표면항원 단백질들은 HBV를 중화시키고 무력화하는 항체를 유도하며, 특히 프리-S 부위에 의해 유도되는 항체는 바이러스의 제거 및 급성 HBV 감염에서의 회복과 관련이 있고 S항원에 대한 무면역반응(Non-responsiveness)을 극복할 수 있다 (Iwarson, S. et al., J. Med. Virol., 16: 89-96, 1985; Itoh, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 9174-9178, 1986; Neurath, A. R. et al., Vaccine, 7: 234-236, 1989; Budkowska, A. et al., J. Med. Virol., 20: 111-125, 1986; Milich, D. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8168-8172, 1985; Neurath, A. R. et al., J. Med. Virol., 17: 119-125, 1985; Milich, D. R. et al., J. Immunol., 137: 315-322, 1986). 특히 프리-S1 단백질의 21-47번 아미노산 부위는 사람 간세포의 HBV 수용체와 결합하여 바이러스가 간세포에 감염하는데 결정적인 역할하므로, 이 부위에 특이한 단일클론항체는 바이러스 중화에 매우 중요한 역할을 할 수 있다 (Neurath, et al., Cell, 46: 429, 1986; Pontisso, et al., Virol., 173: 533, 1989; Neurath, et al., Vaccine, 7: 234, 1989).

이에 본 발명자들은 글루타티온-S-전이효소와 결합한 GST-pre-S1 융합 단백질을 이용하여 프리-S1 펩타이드를 제조하고 이에 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin, 이하 " KLH " 라고 약칭함)을 결합시켜 쥐에 주사함으로 하이브리도마 세포주를 제조하고, 이로부터 프리-S1 과 결합하는 단일클론항체를 분리하여 21-28번 아미노산 위치를 포함하는 에피토프를 인식함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 B형 간염 바이러스 (HBV)의 표면항원 프리-S1 에 결합하는 생쥐 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 그의 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명의 단일클론항체 KR359 의 에피토프를 결정하기 위하여 GST-preS1 융합 단백질을 대장균에서 발현시키고 전체 단백질을 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 (a), 웨스팅블럿한 (b) 결과를 나타낸 것이고,

레인 1 : GST; 레인 M : 표준 단백질

레인 2 : GST-preS1(1-11); 레인 3 : GST-preS1(1-20);

레인 4 : GST-preS1(1-28); 레인 5 : GST-preS1(1-35);

레인 6 : GST-preS1(1-42); 레인 7 : GST-preS1(1-49);

레인 8 : GST-preS1(1-56)

도 2는 본 발명의 단일클론항체 KR359 의 항원 결합 친화도를 그래프로 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 단일클론항체 KR359 가 B형 간염 바이러스 (HBV)와 결합하는 능력을 면역침강으로 확인한 것이고,

NC : 음성 대조군

도 4는 본 발명의 단일클론항체 KR359 가 여러 아형 및 변이 HBV 와 결합하는 능력을 확인하기 위하여 여러 아형의 GST-preS1(1-56) 융합 단백질을 대장균에서 발현시키고 전체 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여(A) 웨스턴블럿한(B) 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : GST; 레인 M : 표준 단백질;

레인 2 : adr 아형의 프리-S1(1-56);

레인 3 : adw 아형의 프리-S1(1-56);

레인 4 : ayw 아형의 프리-S1(1-56);

레인 5 : 25번째 아미노산이 루신으로 치환된 adr 아형의 프리-S1(1-56)

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HBV 표면항원 프리-S1 에 KLH 를 결합시켜 생쥐에 면역시키는 과정으로 하이브리도마 세포주를 제조하고, 이로부터 프리-S1 의 21-28번 아미노산을 포함하는 에피토프를 인식하는 생쥐 단일클론항체를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 B형 간염 바이러스 (HBV)의 표면항원 프리-S1 부위를 인식하는 단일클론항체를 얻기 위하여, 우선 프리-S1 의 아미노 말단 56개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 제조한다.

본 발명자들은 HBV 표면항원 프리-S1 의 아미노 말단 56개 아미노산을 암호하는 유전자를 글루타티온-S-전이효소 (glutathione-S-transferase, GST) 유전자와 결합시켜 대장균에서 수용성인 융합 단백질 형태로 상기 프리-S1 단백질을 대량 발현시킨 바 있다 (한국특허출원 95-9865호).

상기에서 방법으로 얻은 융합 단백질로부터 얻은 프리-S1 펩타이드를 KLH (keyhole limpet hemocyanin)와 결합시킨 다음 그의 항원성이 프리-S1 펩타이드 단독보다 큼을 확인하여 본 발명은 KLH-pre S1 융합 단백질을 생쥐를 면역시키는데 사용한다. 다음 상기 항원으로 면역된 생쥐의 비장세포와 마이엘로마 세포를 기존의 방법으로 융합시킨 다음 프리-S1 펩타이드에 특이성을 보이는 클론을 간접 엘리자 방법 등으로 선발한다. 이들중 이소타입이 IgG 인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하고 안정하게 항체를 분비하는 세포는 계속 계대배양한다. 그 결과 프리-S1 의 에피토프에 특이성이 있는 본 발명의 단일클론항체 KR359 (수탁번호 : KCTC 0284 BP)를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다.

본 발명은 상기 하이브리도마 세포주에서 생산되는 단일클론항체 KR359 가 반응하는 정확한 프리-S1 부위의 에피토프를 결정하기 위하여, 프리-S1 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 이용하여 프리-S1 유전자의 3'-말단의 일부가 절단된 다양한 플라스미드 벡터를 제조한다.

구체적으로 플라스미드 벡터 pGSTpreS1-56 에 존재하는 프리-S1 유전자를 3'-말단부터 절단하여 프리-S1 부위의 1-11번, 1-20번, 1-28번, 1-42번, 1-49번, 1-56번 아미노산 등을 암호하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 제조하고, 이를 이용하여 다양한 크기의 프리-S1 펩타이드를 생산한다.

상기에서 발현시킨 펩타이드들을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 본 발명의 단일클론항체 KR 359 는 프리-S1 부위의 21-28번 아미노산을 포함하는 에피토프를 인식함을 확인한다 (도 1참조)

본 발명은 상기 단일클론항체 KR359 를 이용하여 항체 결합능 및 항원 결합 친화도 등을 간접 엘리자 방법으로 조사하고 (도 2참조), HBV 입자 면역 침강을 서던 블럿으로 분석한다 (도 3참조).

또한 본 발명은 상기 단일클론항체 KR359 가 다양한 HBV 아형 및 변이체와 결합함을 확인하기 위하여, 다양한 아형의 HBV 프리-S1 변이체를 제조하고 이를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한다 (도 4참조). 그 결과 본 발명의 단일클론항체는 adr 아형을 포함한 adw, ayw 아형 등 전반적인 HBV 에 대하여 우수한 면역 활성을 나타낸다

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 프리-S1 아미노 말단 56개 아미노산으로 구성된 펩타이드의 제조

플라스미드 벡터 pGSTpreS1-56 (KCTC 8645P)를 포함하는 대장균 BL21(DE3)을 1 리터 LB 배지에서 흡광도 (OD)가 0.5 되도록 배양하고, 이에 0.1 mM IPTG 를 첨가하여 37℃ 에서 3시간 동안 배양한 다음 4000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 침전물을 회수하여 트리스 완충액 (50mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1mM PMSF, 0.02% NaN₃) 20ml 에 녹였다. 이 현탁액에 초음파를 처리하여 세포를 파쇄하고 12000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다.

상기에서 발현시킨 융합 단백질로부터 프리-S1 단백질을 정제하기 위하여, 우선 트리스 완충액으로 평형시킨 글루타티온-아가로스 칼럼 (Sigma사, 미국)에 상기 파쇄된 세포의 상층액을 적용하고, 5mM 환원형 글루타티온액으로 흘려주어 결합된 융합 단백질을 회수하였다. 다음 상기 융합 단백질 50 μg 을 분해 완충액 (50mM Tris-HCl, pH8.0, 150mM NaCl, 2.5mM CaCl₂) 50 μl 에 녹이고, 트롬빈 0.2 μg 을 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 다음 상기의 글루타티온-아가로스 칼럼에 적용하여 칼럼에 결합하지 않은 프리-S1 펩타이드를 융합 단백질로부터 분리하였다.

<실시예 2> KLH-preS1 단백질의 제조

실시예 1 에서 얻은 프리-S1 펩타이드 0.55mg (0.09 μM)을 50mM 인산완충액 (pH 8.6)에 녹이고, 0.025mg (0.18 μM) 2-이미노티올레인 (2-iminothiolane)을 첨가하여 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 반응액을 세파덱스 G-25 칼럼에 적용하여 부산물을 제거한 다음, 말레이미드로 활성화시킨 KLH (maleimide activated KLH; keyhole limpet hemocyanin, Pierce사 제품) 1mg 을 첨가하여 상온에서 2.5시간 동안 반응시키고, 50mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.4)을 사용하여 2일 동안 투석하였다. 그 투석액을 세파크릴 S-200 컬럼에 로딩하고, 트리스-염산 완충액 (50mM Tris-HCl, pH7.4, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 0.5M NaCl, NaN₃0.02%)으로 KLH 와 결합한 프리-S1 단백질 (KLH-preS1)을 용출하였다.

상기에서 얻은 용출액을 단백질 정량 키트인 BCA 키트 (피어스사 제품)를 사용하여 정량한 결과, 최종 단백질 농도는 0.175 mg/ml 이었고 이로부터 총 1.7ml 의 항원을 얻었다.

<실시예 3> KLH-preS1 단백질의 항원성 조사

실시예 2 에서 제조한 KLH-preS1 단백질 1μg, KLH 1μg, 실시예 1 에서 제조한 프리-S1 펩타이드 100ng 을 각각 엘리자 플레이트 웰에 코팅 완충액을 사용하여 고정시켰다. 이에 프리-S1 단백질의 아미노 말단 10-20번 아미노산 부위에 대한 에피토프를 인식하는 단일클론항체 1B3 (Kim, et al., Korean J. Immunol., 18 : 367, 1996)를 웰당 1.5-100 ng 을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.05% 트윈 20 을 첨가한 인산완충액으로 플레이트를 세척하고, 항-생쥐 IgG-HRP (Sigma사 제품)와 반응시킨 다음, OPD (o-phenylenediamine)와 과산화수소가 포함된 기질 용액을 첨가하고, 492nm 에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표 1 에 나타난 바와 같다.

1B3(ng)면역원	0	1.56	3.13	6.25	12.5	25	50	100
KLH	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
KLH-preS1	0.05	0.2	0.29	0.58	0.81	1.18	1.6	2.2
preS1	0.05	0.09	0.13	0.19	0.32	0.55	0.85	1.27

KLH 만을 고정하면 흡광도가 증가하지 않은 반면 프리-S1 단백질과 KLH-pre-S1 단백질은 농도가 증가함에 따라 흡광도가 증가하므로, KLH-pre-S1 단백질은 면역원으로 작용함을 확인하였다. 특히 KLH 를 결합시키는 경우에는 반응성이 증가하므로 본 발명은 KLH 를 부착하는 실험을 이용하였다.

<실시예 4> 생쥐 단일클론항체 KR359 의 제조

실시예 2 에서 제조한 KLH-pre-S1 단백질 20 μg 와 동일 부피의 항원성 증강제 (Hunter's Titer Max adjuvant, Sigma사 제품)를 혼합하고, 이를 10주된 암컷 Balb/c 생쥐의 복강과 피하에 각각 17.5 μg 및 8.7 μg 씩 주사한 다음 이 과정을 한달 간격으로 4회 반복하였다. 4차 복강 주사를 한 다음 높은 항체 역가를 보이는 생쥐를 세포 융합용으로 선발하였다.

피더 (feeder) 세포를 채취하기 위하여, 세포 융합 하루전에 건강한 생쥐의 복막에 0.34M 농도의 설탕 용액 8 ml 을 가하고, 이는 다시 빨아내어 복강 내에 있는 세포를 채취한 다음 원심분리하고 HAT 배지 (GIBCO사 제품)에 부유하여 웰당 만개의 세포가 되도록 96-웰 플레이트에 분주하고 37℃, CO₂배양기에서 배양하였다. 또한, 2주전부터 비장세포와 융합할 SP2/0-Ag14 마이엘로마 세포주도 IMEM (GIBCO사 제품)과 10% 소태아 혈청을 섞어 만든 배지에서 배양하였다.

상기에서 선발한 생쥐에서 비장을 꺼내 DMEM (GIBCO사 제품)으로 잘 씻고 유리봉으로 페트리 디쉬에서 잘 분쇄한 다음 세포 부유물을 15ml 튜브에 방치하여 찌꺼기가 가라앉으면 상층액을 새로운 튜브로 옮겨두었다. 또한, SP2/0-Ag14 마이엘로마 세포주도 원심분리하여 수확하고 10 ml DMEM 에 현탁하여 위의 비장세포와 함께 세포수를 측정하였다. 천만개의 SP2/0-Ag14 마이엘로마 세포와 일억개의 비장세포를 50ml 튜브에 옮겨 섞은 다음 200 x g 로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 37℃ 물이 채워진 비이커에 2분 동안 방치하였다. 또한, 튜브는 가볍게 쳐서 세포를 부드럽게 만들고 37℃ 물에 담근 상태로 천천히 흔들면서 1ml의 PEG 용액 (GIBCO사 제품)을 1분 동안 가하였다. 다음 100 x g 로 2분 동안 원심분리하고 5ml DMEM 용액을 3분에 걸쳐 서서히 넣고 다시 5 ml의 DMEM 용액을 2분에 걸쳐 서서히 넣은 다음 200 x g 로 원심분리하여 세포들을 회수하고 30 ml 의 HAT 배지에 조심스럽게 현탁하였다. 이를 37℃, CO₂배양기에서 30분 동안 방치한 다음 미리 배양하여 둔 피더 세포가 깔린 96-웰 플레이트에 웰당 100 μl 씩 분주하고 4일 후 70 μl HAT 배지를 더하여 2주 이상 키우면서 자라는 콜로니를 관찰하였다.

프리-S1 단백질에 특이성을 보이는 클론을 선발하기 위하여 간접 엘리자 방법을 사용하였다. GST-preS1-56 융합단백질을 웰당 1 μg씩 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양액 100 μl을 가해 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 다시 HRP (horseradish peroxidase, Sigma사 제품)가 결합된 항-생쥐 IgG 또는 IgM 의 1/1000 희석액과 1시간 더 반응시켰다. 0.05% 트윈 20 을 첨가한 인산완충액으로 플레이트를 세척하고, OPD (Sigma사 제품)와 H₂O₂가 포함된 기질용액을 첨가하여, 492nm 에서 흡광도를 측정하였다.

프리-S1에 대한 특이성을 보이는 하이브리도마 세포주를 선발한 다음, 샌드위치 엘리자 방법으로 이소타이핑 키트 (Isotyping kit, BM사, 독일)를 사용하여 그들의 이소타입을 결정하고, 이들중 IgG 형 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주들을 선발하였다. 그 결과는 표 2 에 나타난 바와 같다.

클론	이소타입
KR1	IgG2a, κ
KR2	IgG1, κ
KR3	IgG1, κ
KR4	IgG1, κ
KR5	IgG, κ
KR6	IgG2a, κ

이중 비교적 안정하게 항체를 분비하는 클론 KR1 을 계속 계대배양하며 웰당 0.2개 세포가 들어가게 하는 희석방법으로 세포를 서브클로닝하여, 확실하게 안정성을 유지하고 프리-S1 에피토프에 대한 특이성을 유지한 단일클론항체 KR359 를 선발하였다. 본 발명은 단일클론항체 KR359 만을 선택하여 그 특성을 다양한 과정으로 조사하였다.

본 발명의 단일클론항체 KR359 를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1996년 11월 14일자로 수탁번호 KCTC 0284BP 로 기탁하였다.

<실시예 5> 단일클론항체 KR359 의 에피토프 결정

실시예 1 의 플라스미드 벡터 pGSTpreS1-56 내 프리-S1 유전자를 3'-말단부터 일부 절단하여 프리-S1 부위의 1-11번, 1-20번, 1-28번, 1-35번, 1-42번, 1-49번, 1-56번 아미노산을 암호하는 유전자를 함유하도록 PCR 방법으로 7개의 플라스미드 벡터를 제조하였다.

이 때 5'-말단의 경우 프라이머로는 모두 하기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다.

5'-CGAGGATCCATGGGAGGTTGGTCTTCC-3'

또한, 3'-말단의 경우는 각각 하기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다.

11번째까지는 5'-CGTGAATTCGCCTTGTCGAGGTTTGGA-3',

20번째까지는 5'-GCTGAATTCATTGGGAACAGAAAGATT-3',

28번째까지는 5'-GCTGAATTCGTGATCGGGAAAGAATCC-3',

35번째까지는 5'-GCTGAATTCTCCGAACGCAGGGTCCAA-3',

42번째까지는 5'-GCTGAATTCATCTGGATTGTTGGAGTT-3',

49번째까지는 5'-GCTGAATTCCTTGTTGGGGTTGAAGTC-3',

56번째 까지는 5'-CCGAATTCATTTCCGTCTGGCCAGTG-3'

이렇게 만들어진 플라스미드를 CaCl₂방법으로 대장균 DH5α 에 형질전환시킨 다음 LB 배지에서 배양하였다.

각각의 대장균으로부터 실시예 1 의 방법으로 융합 단백질의 발현을 유도하고, 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)한 다음 (도 1a참조), 상기 단일클론항체 KR359 를 사용하여 웨스턴 블럿하였다 (도 1b참조).

도 1 에 나타난 바와 같이 단일클론항체 KR359 는 프리-S1 의 아미노산 1-20번 까지의 펩타이드가 융합된 GST-preS1(1-20) 단백질까지에는 결합하지 않고 (레인 1-2), 프리-S1 의 아미노산 1-28번까지의 펩타이드가 융합된 GST-preS1(1-28)부터는 결합하는 것으로 보아 (레인 3-8), 단일클론항체 KR359 의 에피토프는 프리-S1 의 21-28번 아미노산 위치를 포함하는 것을 알 수 있었다.

<실시예 6> 단일클론항체 KR359 의 항원 결합능 조사

단일클론항체 KR359 를 PFMHII (Gibco사 제품) 배지에서 1주일 동안 배양하여 프로테인-G 친화 크로마토그래피 (Protein G-affinity chromatography)로 분리·정제한 다음, GST-pre-S1 융합 단백질 1μg 을 엘리자 플레이트에 결합시키고 다음과 같은 여러 농도의 단일클론항체 KR359 를 반응시켜 항-생쥐 IgG-H게 를 사용한 간접 엘리자 방법을 수행하여 항원 결합능을 측정하였다. 그 결과는 표 3 에 나타난 바와 같다.

KR359(ng)	0	0.25	0.5	1	2	4	6	8	10	12	15	20	40	80	100	200
A492	0.06	0.13	0.18	0.31	0.51	0.88	1.16	1.50	1.64	1.75	2.02	2.29	2.97	3.28	3.31	3.35

표 3에 나타난 바와 같이 단일클론항체 KR359 는 GST-preS1 단백질 6 ng 에 결합하여 492nm 에서 흡광도 1.16 을 나타내었다.

<실시예 7> 단일클론항체 KR359 의 항원 결합 친화도 조사

단일클론항체 KR359 6ng 을 다음과 같은 여러 농도의 프리-S1 경쟁 항원과 결합시킨 다음, 이 혼합물을 1 μg 프리-S1 항원이 코팅된 웰에 가하고 간접 엘리자 방법을 수행하여 친화도를 측정하였다 (도 2참조).도 2에 나타난 바와 같이 단일클론항체 KR359 의 프리-S1 펩타이드에 대한 친화도는 약 2 x 10⁸/M 으로 나타났다.

<실시예 8> 단일클론항체 KR359 의 HBV 입자 면역 침강 조사

HBV 를 준비하기 위하여 이미 제조된 바 있는 adr 아형의 HBV 게놈 DNA 를 갖는 플라스미드 벡터 pHBV5.2 (Ryu, et al., J. Med. Virol., 52: 226-233, 1997) 30 μg 을 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법으로 3x10⁷개의 HepG2 세포에 감염시키고, H 배지에서 15일 동안 배양하였다. 이 배양액에 최종 농도 6% 가 되도록 PEG 6000 을 첨가하고 4℃에서 12시간 동안 반응시켜 HBV 를 침전시키고, 10000 x g 에서 30분 동안 원심분리하였다. 바이러스 입자를 25% 소태아 혈청을 첨가한 인산완충액 1/50 부피에 현탁시키고, 영하 70℃에서 보관하였다.

단일클론항체 KR359 10 μg 을 프로테인 A-아가로스 (protein A-agarose, 파마시아사 제품)에 결합시키고, 상기의 바이러스 입자와 혼합하여 실온에서 하루밤 동안 반응시켰다. 이를 인산완충액으로 5회 세척한 다음, tRNA 10 μg 을 면역복합물에 첨가하고, 바이러스 DNA 를 허트 (Hirt) 방법으로 추출하였다 (Hirt, J. Mol. Biol., 26 : 365, 1967). 바이러스 DNA 는 방사능으로 표지한 α-P³²HBV 게놈 DNA 를 프로브로 서던 블럿하여 분석하였다. 그 결과, 원형 (Relaxed Circular) 형태의 HBV 게놈 DNA 밴드를 관찰하여 (도 3참조), 단일클론항체 KR359 가 HBV 입자에 결합하여 HBV 를 면역침강시킴을 확인하였다.

<실시예 9> 단일클론항체 KR359 의 HBV 여러 아형에 대한 결합능 조사

본 발명의 단일클론항체 KR359 의 여러 아형의 HBV 에 대한 결합능을 조사하기 위하여, GenBank 라이브러리에 수록되어 있는 여러 변종의 HBV 프리-S1의 아미노산 서열을 조사하여 다음과 같이 나열하였다.

D23680(adr) 20 NPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWP 53

X14193(adr) 20 -------------------------------R-- 53

A32621(adw) 20 -------------------------------Q-- 53

M74498(adw) 20 ----------------------------I----- 53

A32626 20 -------------V--------------I----- 53

X01587 65 -------------------H-------------- 98

S81946(adr) 20 -----L---------------------------- 53

A32624 20 ----------------------------V--D-- 53

U55223(ayw) 7 TS---------------R---------------T-- 42

A32622(ayw) 7 TS---------------R--TA-----------T-- 42

단일클론항체 KR359 에 존재하는 HBV 의 다른 아형이나 변이체에 대한 항원 결합 능력을 조사하기 위하여, adr, adw, ayw, 그리고 adr 아형중의 25번째 아미노산 페닐알라닌이 루신으로 치환된 프리-S1 변이체의 각각 첫 번째 아미노산부터 56번째 아미노산까지를 포함하는 DNA 를 PCR 에 의하여 합성하였다. 이 때 사용한 프라이머의 염기 서열과 주형으로 사용한 플라스미드 DNA 는 표 4 에 나타난 바와 같다.

	주형 DNA	5' 프라이머	3' 프라이머
adr 아형	pHBV315	5'-CGAGGATCCATGGGAGGTTGGTCTTCC-3'	5'-CCGAATTCATTTCCGTCTGGCCAGTG-3'
adw 아형	pAM6	5'-CGAGGATCCATGGGAGGTTGGTCTTCC-3'	5'-CCGAATTCGTTGGCTGCTGGCCAGTG-3'
ayw 아형	pREP8-preS1	5'-CGGAATTCATATGGGGACGAATCGGGCC-3'	5'-CCGAATTCGTTGGCGTCTGGCCAGGT-3'
adr(F→L)아형	pHBV315	5'-CGAGGATCCATGGGAGGTTGGTCTTCC-3'5'-AATCCTCTGGGATTCCTTCCCGATCACCAG-3'(변이 프라이머)	5'-CCGAATTCATTTCCGTCTGGCCAGTG-3'5'-CTGGTGATCGGGAAGGAATCCCAGAGGATT-3'(변이 프라이머)

상기 각 프리-S1 변이체에 대한 DNA 를 실시예 1 의 플라스미드 벡터 pGSTpreS1-56 의 클로닝 위치에 들어있는 프리-S1 DNA 와 치환시켜 삽입시키고 대장균에 형질전환시킨 다음 실시예 1과 동일한 방법으로 융합 단백질의 생산을 유도하였다. 이 재조합 대장균의 세포 추출물들을 각각 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한 다음 (도 4a참조), 니토로셀룰로스 막으로 옮겨서 단일클론항체 KR359 로 웨스턴 블럿하였다 (도 4b참조).

그 결과도 4에 나타난 바와 같이 단일클론항체 KR359 는 다른 아형 및 변이체 바이러스의 프리-S1 항원에 잘 결합하고 있음을 나타내고 있다. 따라서 본 발명의 단일클론항체 KR359 (KCTC 0284BP)는 adr 아형은 물론, adw, ayw 등 전반적인 HBV 모두에 대하여 우수한 면역 활성을 나타냄을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체는 프리-S1 펩타이드의 특정 아미노산을 인지하여 바이러스를 중화시킬 뿐만 아니라 다양한 아형 및 변이체 HBV 감염으로 유발되는 각종 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

B형 간염 바이러스 (HBV)의 표면항원 프리-S1 (pre-S1)의 21-28번 아미노산을 포함하는 에피토프를 인식하는 생쥐 단일클론항체.
제 1항에 있어서, 아미노산 부위 중 21-28번 아미노산을 포함하는 에피토프를 인식하는 단일클론항체 KR359 (수탁번호 : KCTC 0284 BP).
제 1항의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
HBV 표면항원 프리-S1 에 KLH 를 결합시켜 생쥐를 면역화한 다음 그 생쥐의 비장세포를 마이엘로마 세포와 융합하고 이로부터 제 1항의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 것을 특징으로 하는 제 3항의 세포주의 제조방법.