KR100484054B1 - Ｂ형 간염 바이러스의 표면항원 ｓ에 대한 인간화 항체 및그의 제조방법 - Google Patents

Ｂ형 간염 바이러스의 표면항원 ｓ에 대한 인간화 항체 및그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B형 간염바이러스 (hepatitis B virus, HBV)의 표면항원 (surface antigen) S에 특이적인 인간화 항체 (humanized antibody) 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 CDR-이식 (grafting) 방법으로 제조된 HBV 표면항원 S에 대한 인간화항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 (heavy and light chain variable region) 내 각 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 LCDR1, LCDR2, LCDR3 부분의 아미노산 잔기를 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 유래 아미노산 잔기로 치환시킨 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄로 이루어진 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체, 또한 상기 인간화 중쇄로부터 MHC class II와 결합하는 펩타이드 서열을 제거하여 더욱 HAMA (human anti-mouse antibody) 반응을 최소화시킨 인간화항체, 상기 인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄 유전자 각각을 포함하는 발현벡터, 상기 중쇄 발현벡터 및 경쇄 발현벡터에 의해 형질전환되어 상기 인간화 항체를 생산할 수 있는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 인간화 항체를 대량생산하는 인간화 항체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간화 항체는 기존의 인간화 항체보다 더 인간화되어 인체 내에서의 면역유발 반응성은 감소된 반면, 우수한 항원 결합능을 나타내어 B형 간염 바이러스 감염의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

Ｂ형 간염 바이러스의 표면항원 Ｓ에 대한 인간화 항체 및 그의 제조방법{A humanized antibody to surface antigen S of hepatitis B virus and a preparing method thereof}
본 발명은 B형 간염바이러스 (hepatitis B virus, HBV)의 표면항원 (surface antigen) S에 특이적인 인간화 항체 (humanized antibody) 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 CDR-이식 (grafting) 방법으로 제조된 HBV 표면항원 S에 대한 인간화항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 (heavy and light chain variable region) 내 각 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 LCDR1, LCDR2, LCDR3 부분의 아미노산 잔기를 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 유래 아미노산 잔기로 치환시킨 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄로 이루어진 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체, 또한 상기 인간화 중쇄로부터 MHC class II와 결합하는 펩타이드 서열을 제거하여 더욱 HAMA (human anti-mouse antibody) 반응을 최소화시킨 인간화항체, 상기 인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄 유전자 각각을 포함하는 발현벡터, 상기 중쇄 발현벡터 및 경쇄 발현벡터에 의해 형질전환되어 상기 인간화 항체를 생산할 수 있는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 인간화 항체를 대량생산하는 인간화 항체의 제조방법에 관한 것이다.
B 형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, 이하 "HBV"라 약칭함)는 인간에 침입하여 만성 및 급성 간염을 유발하며, 악화될 경우 간경화와 간암의 원인이 되는 병원체로서 전세계적으로 3억 명에 이르는 환자들이 HBV에 감염된 것으로 추산되고 있다 (Tiollais & Buendia, Sci. Am., 264, 48, 1991). HBV의 피막은 3개의 단백질로 이루어져 있는데, 구체적으로 S 항원을 포함하는 주 (major) 단백질, S 항원과 프리 S2 항원을 포함하는 중 (middle) 단백질 및 S 항원, 프리 S2 항원과 프리 S1 항원을 포함하는 대 (large) 단백질로 구성되어 있다 (Neurath, A.R. and Kent, S.B.H., Adv. Vir. Res., 34: 65-142, 1988). 상기한 모든 HBV 표면항원 단백질들은 HBV를 중화시키고 무력화하는 항체를 유도하는데, 그 중 S 항원은 전체 피막 단백질의 약 80%를 차지하며, 모든 아형의 HBV에 공통으로 존재하는 "Common a"라는 중화 에피토프 (Neutralizing epitope)를 가지고 있다.
HBV에 의해 감염된 경우, 예를 들어 HBV 양성인 모친으로부터 태어나는 신생아나 HBV에 노출된 의료기관 종사자들 또는 HBV 관련 간질환 환자로부터의 간이식 수술시 수혜자의 HBV 감염을 방지하기 위해 HB 면역글로뷸린 (immunoglobulin, IG)이 사용되어 왔다 (Beasley et al., Lancet, 2, 1099, 1983; Todo et al., Hepatol., 13, 619, 1991). 그러나, 현재 사용되고 있는 HBIG는 인간의 혈장으로부터 추출되기 때문에 항원에 대한 특이도 (specificity)가 낮고, 오염원에 노출될 수 있으며, 인간의 혈액을 계속적으로 공급해야 하는 단점이 지적되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 마우스의 HBV 표면항원에 대한 단일클론 항체를 사용하는 방법이 개발되었다. 일반적으로 마우스 단일클론 항체는 항원에 대한 친화도가 높고 대량생산이 가능하다는 장점을 가지지만, 인간에게 투여되었을 경우에 인체 내에서의 인간 항-마우스 항체 반응 (human anti-mouse antibody response, 이하 "HAMA 반응"이라 약칭함)을 유발하는 단점이 있다 (Shawler et al., J. Immunol., 135, 1530, 1985).
이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로서, 마우스 유래 단일클론 항체의 높은 친화도와 특이성을 유지하면서 HAMA 반응을 최소화할 수 있는 방법으로서 마우스 단일클론 항체의 상보성 결정 부위 (complementarity determining regions, 이하 "CDRs"라 약칭함)만을 인간 항체에 이식시킨 "인간화 항체 (humanized antibody)"가 개발되었고, 이와 같은 인간화 항체는 유전공학적으로 대량배양이 가능하고 유전자의 대부분을 인간화하였기 때문에 인체 내에서의 면역반응을 현저하게 감소시킬 수 있는 장점을 가지고 있다 (Riechmann et al., Nature, 332, 323, 1988; Nakatani et al., Protein Engineering, 7,435, 1994).
기존의 인간화 항체의 제조방법으로는 CDR-이식(grafting) 방법이 일반적으로 사용되고 있는데, CDR-이식 방법은 마우스 단일클론 항체 가변영역 중에서 항원에 결합하는 부위인 CDRs의 유전자를 이와 상동성을 가지는 인간 항체의 유전자 부위에 이식시킨 후 CDRs의 형태 (conformation)에 영향을 주는 골격구조 부위 (framework region)의 몇몇 아미노산 잔기를 인간 항체의 것으로부터 원래의 마우스 단일클론 항체의 것으로 치환시켜 인간화 항체를 제조하는 방법이다 (Riechmann et al., Nature, 332, 323, 1988; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86, 10029, 1989; Nakatani et al., Protein Engineering, 7,435, 1994). 그러나, 이와 같이 제조된 인간화 항체 역시 항체 내 존재하는 마우스 유래의 CDRs가 인체에 반복 투여될 경우 HAMA 반응을 유발할 수 있다는 문제점을 가지고 있음이 보고되었다 (Stephens et al., Immunology, 85, 668-674, 1995; Sharkey et al., Cancer Research, 55, 5935s-5945s, 1995). 따라서, 상기 인간화 항체 내 마우스 항체 유래의 CDRs 아미노산 잔기들을 인간 항체의 잔기들로 치환시키면 HAMA 반응을 감소시킬 수 있을 것으로 기대되고 있다
항체 분자의 가변영역에는 3개의 중쇄 CDR 루프 (loop) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 3개의 경쇄 CDR 루프 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이 존재하는데, 기존의 방식대로 CDR-이식 방법을 이용하여 인간화 항체를 제조하기 위해서는 상기 6개의 CDR 루프 모두를 이식한다. 그러나 CDR 내 일부의 아미노산 잔기들만이 항원과 직접 결합한다는 사실(Padlan et al., FASEB J., 9, 133, 1995)에 착안하여, 항원 결합에 직접적으로 관여하는 특이 결정 잔기 (specificity determining residues, 이하 "SDRs"라 약침항)만을 인간 항체에 이식시키는 SDR-이식 방법을 이용하여 기존의 인간화 항체보다 HAMA 반응을 덜 유발하면서 치료효과가 개선된 인간화 항체를 개발하고자 노력하였다.
그 결과, 본 발명자들은 대한민국 특허등록 제 163163 호 (1998. 9. 3)에서 HBV의 표면항원 S에 대한 마우스 단일클론 항체 H67의 유전자들을 이용하여 CDR-이식 방법으로 개발한 인간화 항체를 개시한 바 있으며, 이로부터 상기 인간화 항체보다 면역유발성이 감소된 인간화 항체 HZII-H67을 개발하여 특허 출원한 바 있다 (대한민국 특허출원 제 98-32644호).
한편, Helper T 세포는 면역반응 초기에 필수적으로 작용하고, MHC (Major Histocompatibility Complex) class II는 T 세포의 선별 (selection)과 활성화 (activation)에 중심적인 역할을 한다. MHC class II는 단백질 항원으로부터 절단된 9개의 아미노산으로 구성되는 펩타이드에 결합하여 항원 제시 세포 (antigen-presenting cell)의 표면에서 발현 (display)되고, 이들을 인식한 TCR (T cell receptor)과 복합체를 형성하여 T 세포가 활성화되면 면역반응이 시작된다 (Germain, R. N. Cell 76, 287-299, 1994). 따라서, 단백질 항원 내에서 MHC 분자에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열들을 초기에 제거한다면 상기 단백질에 대한 인체의 면역반응이 생기지 않게 할 수도 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 인간화 항체 HZII-H67을 보다 더 인간화시켜 HAMA 반응을 최소화하기 위하여, CDR-이식 방법으로 제조된 HBV 표면항원 S에 대한 인간화항체의 중쇄 가변영역 내 각 HCDR1, HCDR2, HCDR3 부분의 아미노산 잔기를 인간 항체의 중쇄 유래 아미노산으로 치환시킨 인간화 중쇄 및 상기 인간화항체의 경쇄 가변영역 내 각 LCDR1, LCDR2, LCDR3 부분의 아미노산 잔기를 인간 항체의 경쇄 유래 아미노산으로 치환시킨 인간화 경쇄로 이루어진 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체 및 상기 인간화 중쇄로부터 MHC class II와 결합하는 펩타이드 서열을 제거하여 더욱 HAMA 반응을 최소화시킨 인간화항체를 제조하였으며, 상기 인간화 항체가 기존의 인간화 항체보다 더 인간화되어 인체 내에서의 면역유발 반응성은 감소된 반면 우수한 항원 결합능을 나타내어 B형 간염 바이러스 감염의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 B형 간염 바이러스의 감염을 효과적으로 예방 및 치료하기 위하여, 인체내에서의 면역반응 유발성은 최소화하면서 우수한 항원 결합능을 가지는 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자 내 마우스 유래 CDRs 아미노산 잔기가 인간 항체 유래 아미노산 잔기로 치환된 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 인간화 항체; 상기 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자 각각을 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 인간화 항체를 대량으로 생산하는 인간화 항체의 제조방법을 제공한다.본원 명세서에서 "인간화 중쇄 유전자" 또는 "인간화 경쇄 유전자"라는 용어는 각각 "인간화 항체의 중쇄 유전자" 또는"인간화 항체의 경쇄 유전자"를 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화항체의 중쇄 가변영역 내 각 HCDR1, HCDR2, HCDR3 부분의 아미노산 잔기를 인간 항체의 중쇄 유래 아미노산으로 치환시킨 인간화 중쇄 유전자 변이체 및 그를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 인간화 항체는 인간화 항체 HZII-H67의 중쇄 가변영역에 존재하는 생쥐 항체 유래의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 부분의 아미노산 잔기를 각각 인간 항체 유래의 중쇄 HCDR1, HCDR2, HCDR3의 아미노산 서열과 비교하여 가장 유사한 CDR 서열을 선정하고 각 CDR 내에서 항원결합에 영향을 미치지 않은 아미노산 잔기를 인간 항체 유래의 아미노산 서열로 치환시켜 제조된다.
본 발명자들은 인간화 항체 HZII-H67에 존재하는 서열번호 1로 기재되는 마우스 HCDR1 유래 아미노산 잔기 Asp-Tyr-Asn-Ile-Gln를 인간 항체의 것으로 바꾸기 위하여 마우스 HCDR1을 인간 항체 HCDR1의 아미노산 서열과 비교한 결과, 마우스 HCDR1이 Kabat Database ID Number 35920의 서열번호 2로 기재되는 인간 항체의 HCDR1 유래 아미노산 잔기 Asp-Tyr-Asn-Val-Asp와 높은 상동성을 가짐을 확인하고, 상기 두 서열간에 차이를 보이는 4번째 및 5번째 잔기를 치환시켜 HCDR1 유전자 변이체를 제조한다.
이를 위하여, 먼저 본 발명자들은 마우스 HCDR1과 인간 항체의 HCDR1 아미노산 서열간에 서로 차이를 나타내는 잔기 중에서 항원의 에피토프 (epitope)와 직접 결합하지 않을 것으로 생각되는 34번 이소루이신 (isoleucine)을 발린 (valine)으로 치환시킨 유전자 변이체 I34V와 아미노산 잔기 35번 글루타민 (glutamine)을 아스파라진 (asparagine)으로 치환시킨 유전자 변이체 Q35N를 제조한다.
이들 유전자 변이체들은 인간화 항체 HZII-H67의 중쇄 유전자 발현벡터 pRc/CMV-HC-HZIIS (KCTC 0489BP)를 주형으로 이용하는 PCR과 재조합 PCR을 수행하여 제조된다 (도 1 및 도 2 참조).
그 결과, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 HL과 P1 시발체 (primer) 쌍을 사용한 PCR로부터 얻은 DNA 단편 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 P2와 HC 시발체 쌍을 사용한 PCR로부터 얻은 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행함으로써 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 I34V를 얻는다. 상기 유전자 변이체 I34V를 인간화 중쇄 발현벡터로서 인간화 중쇄를 암호하는 cDNA 유전자가 클로닝되어 있는 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하고 이를 pcDdA-HzSIIIh-I34V라 명명하였다 (도 3 참조). 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 I34V의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 I34V가 삽입되었음을 확인하였다.
마우스 HCDR1과 인간 항체의 HCDR1 서열 간에 서로 차이를 나타내는 잔기 중에서 5번째 잔기인 글루타민 (Gln)을 인간 항체 중쇄 유래 DP-15의 아스파라진 (Asn)으로 치환시킨 유전자 변이체 Q35N은 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 6으로 기재되는 시발체 쌍을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 PCR 및 재조합 PCR을 수행하여 얻은 후 이를 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현백터 pcDdA-HzSIIIh-Q35N를 제조하였다.
또한, 인간화 항체 HZII-H67에 존재하는 마우스 HCDR2 유래 아미노산 잔기를 인간 항체의 아미노산 잔기로 치환한 본 발명의 인간화 항체에 있어서, 마우스 유래의 HCDR2 유래 아미노산 서열이 모두 인간 항체 유래의 HCDR2 아미노산 서열로 치환되는 것이 바람직하나 항원결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기들은 치환하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 인간화 항체 HZII-H67에 존재하는 마우스 HCDR2 유래 아미노산 잔기를 인간 항체의 것으로 바꾸기 위하여, 마우스 HCDR2를 인간 항체 HCDR2의 아미노산 서열과 비교하여 마우스 HCDR2가 인간 항체 중쇄의 절편인 DP-15의 HCDR2의 서열과 높은 상동성을 나타냄을 확인하고, 상기 두 서열간에 차이를 보이는 잔기들 중에서 항원결합에 직접 관여하지 않을 것으로 생각되는 잔기들을 치환하여 HCDR2 유전자 변이체를 상기와 동일한 방법으로 제조한다.
그 결과, HCDR2 유래 아미노산 잔기 51번 이소루이신이 메티오닌 (methionine)으로 치환된 유전자 변이체 I51M (서열번호 9 및 서열번호 10의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-I51M, 아미노산 잔기 54번 트레오닌 (threonine)이 세린 (serine)으로 치환된 유전자 변이체 T54S ( 서열번호 11 및 서열번호 12의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-T54S, 아미노산 잔기 65번 세린이 글리신 (glycine)으로 치환된 유전자 변이체 S65G (서열번호 13 및 서열번호 14의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-S65G를 제조하였다.
아울러, 인간화 항체 HZII-H67에 존재하는 마우스 HCDR3 유래 아미노산 잔기를 인간 항체의 아미노산 잔기로 치환한 본 발명의 인간화 항체에 있어서, 마우스 유래의 HCDR3 유래 아미노산 서열이 모두 인간 항체 유래의 HCDR3 아미노산 서열로 치환되는 것이 바람직하나 항원결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기들은 치환하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 인간화 항체 HZII-H67에 존재하는 마우스 HCDR3 서열 유래 아미노산 잔기를 인간 항체의 것으로 바꾸기 위하여, 우선 마우스 HCDR3의 각 아미노산 잔기가 항원결합에 직접적으로 관여하는지를 알아보고자, 각 아미노산 잔기를 알라닌 (alanine)으로 치환시킨 HCDR3 유전자 변이체를 제조하였다.
그 결과, HCDR3 유래 아미노산 잔기 95번 아스파라진이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체 N95A (서열번호 15 및 서열번호 16의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-N95A, 아미노산 잔기 96번 티로신 (tyrosine)이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체 Y96A (서열번호 17 및 서열번호 18의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-Y96A, 아미노산 잔기 97번 글리신이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체 G97A (서열번호 19 및 서열번호 20의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-G97A, 아미노산 잔기 98번 티로신이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체 Y98A (서열번호 21 및 서열번호 22의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-Y98A, 아미노산 잔기 99번 아스파라긴산 (aspartate)이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체 D99A (서열번호 23 및 서열번호 24의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-D99A, 아미노산 잔기 100번 글루탐산 (glutamate)가 알라닌으로 치환된 유전자 변이체 E100A (서열번호 25 및 서열번호 26의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-E100A, 아미노산 잔기 100a번 세린이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체 S100aA (서열번호 27 및 서열번호 28의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-S100aA 제조하였다.
상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에서는 기존의 인간화 항체에 존재하는 마우스 유래 CDR 부위의 아미노산 잔기 중 항원과의 결합에 직접적으로 참여하지 않아 항원 결합 친화도에 영향을 미치지 않을 것으로 예상되는 몇몇 아미노산 잔기들을 인간 항체의 아미노산 잔기들로 치환시켜 인간화 항체를 더욱 더 인간화하고자 하였다. 특히, 본 발명에서는 마우스 항체의 CDRs 전체 아미노산 잔기를 이와 상동성을 가지는 인간 항체에 이식시키는 기존의 CDR-이식 방법과는 달리, CDRs 내에서도 특히 HBV S 표면항원과의 결합에 직접적으로 관여하는 SDRs 부위만을 인간 항체에 이식시키는 SDR-이식 방법을 이용하여 기존의 인간화 항체보다 HAMA 반응을 덜 유발하면서 치료효과가 개선된 인간화 항체를 개발하였다.
본 발명자들은 상기와 같이 제조된 본 발명의 인간화 중쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 발현정도를 확인하기 위하여, 동물 세포주에 각각의 인간화 중쇄 유전자 변이체를 포함하는 각각의 재조합 발현벡터를 형질전환시켜 이로부터 발현된 인간화 항체의 농도를 샌드위치 ELISA (sandwich ELISA) 방법으로 측정하고, 인간화 중쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 표면항원 S에 대한 항원 결합능을 간접 ELISA를 수행하여 측정하였다. 그 결과, HCDR1 유전자 변이체들 중에서는 I34V의 HBV 표면항원 S에 대한 결합능이 야생형 인간화 항체 HZS-H67의 중쇄와 거의 동일하였고, HCDR2 유전자 변이체의 경우에는 T54S와 S65G가 야생형과 거의 동일한 수준의 항원 결합능을 나타내었다 (도 4 참조). 반면, HCDR3 유전자 변이체의 경우에는 E100A가 야생형 보다 약간 떨어지는 항원 결합능을 나타내었는데, 이는 상기 HCDR3 유전자 변이체의 글루탐산 잔기 (E100)가 HBV 표면항원 S와의 결합에 중요하게 작용하지 않음을 시사하는 것이다.
상기와 같이 본 발명자들은 마우스 HCDR3 서열 유래 100번째 아미노산 잔기인 글루탐산 (E100)가 HBV 표면항원 S와의 결합에 중요하게 작용하지 않음을 확인하고 상기 아미노산 잔기를 다른 인간 항체의 것으로 치환시키기 위하여 인간 항체 HCDR3의 아미노산 서열 데이터 베이스와 비교한 결과, 마우스 HCDR3 서열에 높은 상동성을 나타내는 인간 항체 서열들 (Kabat Data Base ID No 24562, 39669, 44760)에서 HCDR3의 100번 잔기의 세린과 101번 잔기의 글리신이 공통적임을 확인하고, 마우스 유래 HCDR3의 100번째 글루탐산을 세린 또는 101번째 알라닌을 글리신으로 치환시킨 유전자 변이체를 제조하여 이들의 항원 결합능을 측정하였다.
전술한 바와 동일한 방법으로 아미노산 잔기 100번 글루탐산이 세린으로 치환된 유전자 변이체 E100S (서열번호 29 및 서열번호 30의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터, pcDdA-HzSIIIh-E100S, 아미노산 101번 알라닌이 글리신으로 치환된 유전자 변이체 A101G (서열번호 31 및 서열번호 32의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-A101G를 제조하였다.
이와 같이 제조된 인간화 중쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 표면항원 S에 대한 항원 결합능을 측정한 결과, E100S의 항원 결합능은 야생형과 유사한 반면 A101G는 항원 결합능이 다소 감소하였음을 확인하였다.
본 발명자들은 상기 결과들을 토대로 하여 본 발명에서 제조한 인간화 중쇄의 변이체들 중에서 I34V, T54S, S65G 및 E100S의 항원 결합능이 야생형과 유사함을 확인하고, 상기 네 개의 유전자 변이체를 동시에 포함하는 재조합 변이체를 제조하고자 하였다.
우선 T54S와 I34V 유전자 변이체를 포함하는 재조합 유전자 변이체를 제조하기 위하여, T54S의 중쇄 유전자 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-T54S를 주형으로 하여 상기와 동일한 방법으로 PCR과 서브클로닝 (subcloning)을 수행하였으며, 이로부터 얻은 재조합 발현벡터를 pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V라 명명하였다.
또한, T54S, I34V 및 E100S 유전자 변이체를 포함하는 재조합 유전자 변이체를 제조하기 위하여, I34V의 중쇄 유전자 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-I34V를 주형으로 하여 상기와 동일한 방법으로 PCR과 서브클로닝을 수행하였으며, 이로부터 얻은 재조합 발현벡터를 pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S라 명명하였다.
아울러, T54S, I34V, E100S 및 S65G 유전자 변이체를 포함하는 재조합 유전자 변이체를 제조하기 위하여, E100S의 중쇄 유전자 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-E100S를 주형으로 하여 상기와 동일한 방법으로 PCR과 서브클로닝을 수행하였다. 이로부터 T54S, I34V, E100S 및 S65G 유전자 변이체를 모두 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S+S65G를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh라 명명하였다.
이와 같이 제조된 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 항원 결합능을 측정하기 위하여, 이들을 포함하는 재조합 발현벡터를 동물 세포주에 형질전환시키고 이로부터 발현되는 인간화 항체의 표면항원 S에 대한 항원 결합능을 간접 ELISA를 수행하여 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 유전자 변이체를 여러개 포함하는 I34V+T54S, I34V+T54S+E100S 및 I34V+T54S+E100S+S65G의 재조합 유전자 변이체를 갖는 각각의 인간화 중쇄는 야생형인 인간화 항체 HZS-H67의 중쇄와 거의 동일한 수준의 표면항원 S에 대하여 결합능을 나타내었다 (도 5 참조). 이와같이 HBV 표면항원 S에대한 항원 결합능이 확인된 중쇄 재조합 유전자 변이체를 발현하는 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2000년 9월 22일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10083BP). 상기 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh로부터 발현되는 인간화 항체 HzS-III의 중쇄 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열번호 43으로 기재되는 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 중쇄 HzS-III-VH로 이루어져 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 CDR-이식 방법으로 제조된 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화항체의 경쇄 가변영역 내 LCDR1, LCDR2, LCDR3 부분의 아미노산 잔기를 인간 항체의 경쇄 유래 아미노산으로 치환시킨 인간화 경쇄 유전자 변이체 및 그를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 인간화 항체는 인간화 항체 HZII-H67의 경쇄 가변영역에 존재하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 부분의 아미노산 잔기를 인간 항체 유래의 경쇄 아미노산 서열로 치환시켜 제조된다. 인간화 경쇄의 경우에는 인간화 항체 HZII-H67의 LCDR1과 LCDR2가 이미 인간 항체의 아미노산 잔기들을 포함하고 있으므로 (LCDR1의 경우 D27cS, S31N, M33I; LCDR2의 경우 Q54K, S56T), 본 발명자들은 LCDR3의 아미노산 잔기들을 변경하고자 하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 인간화 항체 HZII-H67에 존재하는 마우스 유래 LCDR3의 아미노산 잔기를 인간 항체의 것으로 바꾸기 위하여, 상기 LCDR3과 높은 상동성을 가지는 인간 경쇄 B1의 LCDR3 아미노산 서열과 비교하였으며 (도 6 참조), 이로부터 마우스 유래 LCDR3 서열의 89번 글루타민과 91번 트레오닌 잔기가 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않을 것으로 판단하고 이들을 인간 항체의 잔기인 루이신과 세린으로 치환시켰다.
그 결과, 아미노산 잔기 89번 글루타민이 루이신으로 치환된 유전자 변이체 Q89L (서열번호 33 내지 서열번호 36의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk-Q89L (도 7 및 도 8 참조), 아미노산 91번 트레오닌이 세린으로 치환된 유전자 변이체 T91S (서열번호 33 및 서열번호 36 내지 서열번호 38 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S를 제조하였다.
상기와 같이 제조된 인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 HBV 표면항원 S에 대한 결합능을 측정하기 위하여, 유전자 변이체 각각을 포함하는 재조합 발현벡터를 동물 세포주에 형질전환시킨 후 이로부터 발현되는 인간화 항체를 이용하여 간접 ELISA 방법을 수행하였다.
그 결과, 상기 유전자 변이체 중 91번 트레오닌이 세린으로 치환된 T91S의 변이를 갖는 인간화 경쇄가 야생형 인간화 항체 HZS-H67의 경쇄와 동일한 수준의 표면항원 S에 대한 결합능을 나타냄을 확인하고 T91S 유전자 변이체를 발현하는 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S를 pCMV-dhfr-HzSIIIk라 명명하였다 (도 9 참조). 이와같이 HBV 표면항원 S에 대한 결합능이 확인된 유전자 변이체 T91S를 발현하는 재조합 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk를 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 9월 22일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10084BP). 상기 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk로부터 발현되는 인간화 항체 HzS-III의 경쇄 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열번호 42로 기재되는 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 경쇄 HzS-III-VL로 이루어져 있음을 확인하였다.
아울러, 본 발명은 HBV의 표면항원 S에 대한 마우스 단일클론 항체 H67의 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자 내 마우스 유래 아미노산 잔기가 인간 유래 아미노산 잔기로 치환된 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 인간화 항체를 제공한다.
상기와 같이 제조된 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체 및 인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 인간화 중쇄 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh와 인간화 경쇄 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk를 동물 세포주에 형질전환시킨 후 48시간 동안 배양하여 형질전환체로부터 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체/인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체 HzS-III을 발현시켰다. 이로부터 얻은 배양 상층액 내 존재하는 인간화 항체 HzS-III의 농도를 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한 후 전술한 바와 동일한 방법으로 간접 ELISA 방법을 이용하여 항원 결합능을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체 및 인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체 HzS-III는 야생형 인간화 항체 HZS-H67(H/K)와 동일한 수준으로 표면항원 S에 대한 결합능을 나타내었다 (도 11 참조).
또한, 인간화 항체 HzS-III의 항원 결합 친화도를 경쟁적 ELISA 방법 (competitive ELISA, Ryu et al., J. Med. Virol., 52, 226, 1997)을 이용하여 측정한 결과, 본 발명의 인간화 항체 HzS-III는 마우스 유래 몇몇 아미노산 잔기가 인간의 것으로 치환되었지만 항원 결합 친화도에는 별다른 영향을 미치지 않아 대조군으로 사용된 HZII-H67의 친화도와 큰 차이를 나타내지 않음을 확인하였다 (도 12 참조).
또한, 본 발명에서는 상기의 인간화항체 HzS-III의 중쇄 서열 내에서 MHC class II에 결합하는 펩타이드 서열이 존재하는지를 Sturniolo 등의 방법(Sturniolo et al., Nature Biotechnology, 17, 555-561, 1999)으로 검색하여, MHC II에 결합하지 않을 것으로 추정되는 잔기들로 치환한 인간화중쇄를 제조하고 그 항원결합능을 측정하였다. 상기와 같은 인간화 중쇄를 제조하기 위하여, 아미노산 잔기 44번 세린이 트레오닌으로 치환된 유전자 변이 S44T (서열번호 46 및 서열번호 47의 시발체 쌍 이용)와 아미노산 잔기 68번 트레오닌이 아스파르트산으로 치환된 유전자 변이 T68D (서열번호 48 및 서열번호 49의 시발체 쌍 이용) 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIVh를 제조하였고, 이를 2001년 9월 26일자로 한국생명공학 연구원 유전자 은행에 기탁하였다 (수탁번호 ; KCTC 10080BP). 상기 인간화 중쇄 발현벡터 pcDdA-HzSIVh와 인간화 경쇄 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk를 동물 세포주에 형질전환시킨 후 48시간 동안 배양하여 형질전환체로부터 인간화 항체 HzS-IV를 발현시켰다. 이로부터 얻은 배양 상층액 내에 존재하는 인간화 항체 HzS-IV의 항원 결합능을 측정한 결과, 본 발명의 인간화 항체 HzS-IV는 인간화 항체 HzS-III와 거의 유사한 항원 결합 친화도를 나타내었다 (도 12 참조).
이와 같이 HBV 표면항원 S에 대해 우수한 결합능 및 항원 결합 친화도를 나타낸 본 발명의 인간화 항체 HzS-III 및 HzS-IV의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 야생형의 마우스 단일클론 항체 H67 및 인간화 항체 HZII-H67의 아미노산 서열과 비교한 결과, 본 발명의 인간화 항체 HzS-III의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 마우스 단일클론 항체 H67과 인간화 항체 HZII-H67에 비하여 중쇄 유전자의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3와 경쇄 유전자의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 내 몇몇 마우스 유래 아미노산 잔기가 인간 유래 아미노산 잔기로 치환되어 마우스 유래의 아미노산 잔기를 더 적게 포함하고 있고, 본 발명의 인간화항체 HzS-IV의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 사람 MHC II 에 결합하여 면역반응을 유발할 것으로 보이는 FR (framework region)의 두 아미노산 잔기들이 치환되어 면역반응을 최소화한 것임을 알 수 있다 (도 13 및 도 14 참조).
따라서, 본 발명의 인간화 항체 HzS-III 및 HzS-IV는 기존의 인간화 항체보다 HAMA 반응을 덜 유발시키면서 우수한 치료효과를 나타내어 B형 간염 바이러스의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인간화 중쇄 유전자의 변이
<1-1> HCDR1 유전자 변이체의 제조
인간화 항체 HZII-H67 (대한민국 특허 제 98-32644호)에 존재하는 서열번호 1로 기재되는 마우스 HCDR1 유래 아미노산 잔기 Asp-Tyr-Asn-Ile-Gln를 인간 항체의 것으로 바꾸기 위하여, 마우스 HCDR1을 인간 항체 HCDR1의 아미노산 서열과 비교하였다. 그 결과, 마우스 HCDR1이 Kabat Database ID Number 35920의 서열번호 2로 기재되는 인간 항체의 HCDR1 유래 아미노산 잔기 Asp-Tyr-Asn-Val-Asp와 높은 상동성을 가짐을 확인하고, 상기 두 서열간에 차이를 보이는 4번째 및 5번째 잔기를 치환시켜 HCDR1 유전자 변이체를 제조하였다.
<1-1-1> 아미노산 잔기 34번 이소루이신 (isoleucine)이 발린 (valine)으로 치환된 유전자 변이체의 제조
마우스 HCDR1과 인간 항체의 HCDR1 아미노산 서열 간에 서로 차이를 나타내는 잔기 중에서 항원의 에피토프 (epitope)와 직접 결합하지 않을 것으로 생각되는 4번째 34번 이소루이신 (Ile)을 발린 (Val)으로 치환시킨 유전자 변이체 I34V를 제조하기 위하여, 인간화 항체 HZII-H67의 중쇄 유전자 발현벡터 pRc/CMV-HC-HZIIS (KCTC 0489BP)를 주형으로 하고 서열번호 3 내지 서열번호 6으로 기재되는 시발체들을 이용하여 PCR (중합효소 연쇄반응, polymerase chain reaction, 이하 "PCR"로 약칭함)과 재조합 PCR을 수행하였다 (도 1 및 도 2). 구체적으로, PCR은 Taq DNA 중합효소 (polymerase, Takara 사 제품)를 사용하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 반응을 30회 수행하였다.
그 결과, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 HL과 P1 시발체 쌍을 사용한 PCR로부터 181 bp 크기의 DNA 단편이 증폭되고, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 P2와 HC 시발체 쌍을 사용한 PCR로부터 284 bp 크기의 DNA 단편이 증폭됨을 확인하였다. 이로부터 확보한 상기 두 DNA 단편들을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 I34V를 얻었다. 상기 유전자 변이체 I34V의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 인간화 중쇄 발현벡터로서 제한효소 EcoRI과 NotI 위치에 인간화 중쇄를 암호하는 cDNA 유전자가 클로닝되어 있는 발현벡터인 pcDdA-HC (Invitrogen사의 pcDNA3의 EcoRI-NotI 위치 사이에 HBV의 preS1 항원에 대한 인간화 항체의 중쇄 유전자 [대한민국 특허출원 제1998-49663호]가 클로닝되어 있는 발현벡터)의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-I34V라 명명하였다 (도 3). 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 I34V의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 I34V가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-1-2> 아미노산 잔기 35번 글루타민 (glutamine)이 아스파라진 (asparagine)으로 치환된 유전자 변이체의 제조
마우스 HCDR1과 인간 항체의 HCDR1 서열 간에 서로 차이를 나타내는 잔기 중에서 5번째 잔기인 글루타민 (Gln)을 인간 항체 중쇄 유래 DP-15의 아스파라진 (Asn)으로 치환시킨 유전자 변이체 Q35N을 제조하기 위하여 상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다.
구체적으로, 서열번호 3으로 기재되는 HL과 서열번호 7로 기재되는 P3 시발체 쌍을 사용하여 187 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, 서열번호 6으로 기재되는 HC와 서열번호 8로 기재되는 P4 시발체 쌍을 사용하여 278 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이들을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Q35N 얻었다. 상기 유전자 변이체 Q35N의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-Q35N라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Q35N의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 Q35N가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-2> HCDR2 유전자 변이체의 제조
인간화 항체 HZII-H67에 존재하는 서열번호 39로 기재되는 마우스 HCDR2 유래 아미노산 잔기를 인간 항체의 것으로 바꾸기 위하여, 마우스 HCDR2를 인간 항체 HCDR2의 아미노산 서열과 비교하였다. 그 결과, 마우스 HCDR2는 germline 인간 항체 중쇄의 절편인 DP-15의 서열번호 40으로 기재되는 HCDR2의 서열과 높은 상동성을 나타내었으며, 상기 두 서열간에 차이를 보이는 잔기들 중에서 항원결합에 직접 관여하지 않을 것으로 생각되는 잔기들을 치환하여 HCDR2 유전자 변이체를 제조하였다.
<1-2-1> 아미노산 잔기 51번 이소루이신이 메치오닌 (methionine)으로 치환된 유전자 변이체의 제조
HCDR2 유전자 변이체를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 9와 서열번호 10으로 기재되는 P5와 P6 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P5 시발체 쌍을 사용하여 236 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P4 시발체 쌍을 사용하여 230 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 I51M을 얻었다. 상기 유전자 변이체 I51M의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-I51M라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 I51M의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 I51M이 삽입되었음을 확인하였다.
<1-2-2> 아미노산 잔기 54번 트레오닌 (threonine)이 세린 (serine)으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 11과 서열번호 12로 기재되는 P7과 P8 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P7 시발체 쌍을 사용하여 249 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P8 시발체 쌍을 사용하여 218 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 T54S을 얻었다. 상기 유전자 변이체 T54S의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-T54S라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 T54S의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 T54S가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-2-3> 아미노산 잔기 65번 세린이 글리신 (glycine)으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 13과 서열번호 14로 기재되는 P9와 P10 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P9 시발체 쌍을 사용하여 278 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P10 시발체 쌍을 사용하여 185 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 S65G을 얻었다. 상기 유전자 변이체 S65G의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-S65G라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 S65G의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 S65G가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-3> HCDR3 유전자 변이체의 제조
인간화 항체 HZII-H67에 존재하는 서열번호 41로 기재되는 마우스 HCDR3 서열 유래 아미노산 잔기를 인간 항체의 것으로 바꾸기 위하여, 마우스 HCDR3을 인간 항체 HCDR3의 아미노산 서열과 비교하여 마우스 HCDR3 서열의 아미노산 잔기들 중에서 항원결합에 직접적으로 작용하지 않는 잔기를 치환시켜 HCDR3 유전자 변이체를 제조하였다.
<1-3-1> 아미노산 잔기 95번 아스파라진이 알라닌 (alanine)으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 15와 서열번호 16으로 기재되는 P11와 P12 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P11 시발체 쌍을 사용하여 381 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P12 시발체 쌍을 사용하여 88 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 N95A을 얻었다. 상기 유전자 변이체 N95A의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-N95A라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 N95A의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 N95A가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-3-2> 아미노산 잔기 96번 티로신 (tyrosine)이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 17과 서열번호 18로 기재되는 P13과 P14 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P13 시발체 쌍을 사용하여 380 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P14 시발체 쌍을 사용하여 85 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Y96A을 얻었다. 상기 유전자 변이체 Y96A의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-Y96A라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Y96A의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Y96A가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-3-3> 아미노산 잔기 97번 글리신이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 19와 서열번호 20으로 기재되는 P15과 P16 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P15 시발체 쌍을 사용하여 383 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P14 시발체 쌍을 사용하여 82 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 G97A을 얻었다. 상기 유전자 변이체 G97A의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-G97A라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Y96A의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 G97A가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-3-4> 아미노산 잔기 98번 티로신이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 21과 서열번호 22로 기재되는 P17과 P18 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P17 시발체 쌍을 사용하여 386 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P18 시발체 쌍을 사용하여 78 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Y98A을 얻었다. 상기 유전자 변이체 Y98A의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-Y98A라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Y98A의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 Y98A가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-3-5> 아미노산 잔기 99번 아스파라긴산 (aspartate)이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 23과 서열번호 24로 기재되는 P19과 P20 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P19 시발체 쌍을 사용하여 390 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P20 시발체 쌍을 사용하여 73 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 D99A을 얻었다. 상기 유전자 변이체 D99A의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-D99A라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Y98A의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 D99A가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-3-6> 아미노산 잔기 100번 글루탐산 (glutamate)가 알라닌으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 25와 서열번호 26으로 기재되는 P21과 P22 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P21 시발체 쌍을 사용하여 390 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P22 시발체 쌍을 사용하여 73 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 E100A을 얻었다. 상기 유전자 변이체 E100A의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-E100A라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Y98A의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 E100A가 삽입되었음을 확인하였다.
<1-3-7> 아미노산 잔기 100a번 세린이 알라닌으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 27과 서열번호 28로 기재되는 P23과 P24 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P23 시발체 쌍을 사용하여 395 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P24 시발체 쌍을 사용하여 67 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 S100aA을 얻었다. 상기 유전자 변이체 S100aA의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-S100aA라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 Y98A의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 S100aA가 삽입되었음을 확인하였다.
<실시예 2> 인간화 중쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 발현
인간화 중쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체를 세포에서 직접 발현시키기 위하여 상기 발현벡터들을 동물세포주에 형질전환시켰다.
구체적으로, COS7 세포를 소 태아 혈청이 10% 첨가된 DMEM 배양배지 (GIBCO)에 접종하여 이를 37℃, 5% CO2 항온기에서 계대배양하였다. 상기 세포를 100 ㎜ 배양접시에 1 ×106 cells/㎖ 농도로 접종하고 37℃에서 밤새 배양한 후 OPTI-MEM I (GIBCO)으로 3회 세척하였다. 한편, 상기 실시예 1에서 제조된 I34V, Q35N, I51M, T54S, S65G, N95A, Y96A, G97A, Y98A, D99A, E100A 또는 S100aA의 인간화 중쇄 유전자 변이체를 포함하는 각각의 재조합 발현벡터와 인간화 항체 HZII-H67의 경쇄 발현벡터 pKC-dhfr-HZIIS (KCTC 0490BP)를 5 ㎍씩 취하여 OPTI-MEM I 800 ㎕로 희석하고, 50 ㎕의 리포펙타민 (Lipofectamine, GIBCO)도 OPTI-MEM I 800 ㎕로 희석하였다. 상기 희석액들을 15 ㎖ 튜브에 넣어 혼합하여 DNA-리포펙타민 혼합물을 제조한 후 이를 15분 이상 실온에서 방치하였다. 상기 각각의 DNA-리포펙타민 혼합물에 6.4 ㎖의 OPTI-MEM I을 첨가하고 이를 깨끗이 세척된 COS7 세포에 골고루 혼합하여 세포 내로 형질전환 (transfection)시켰다. 형질전환은 DNA-리포펙타민 혼합물이 첨가된 상기 세포 배양액을 37℃, 5% CO2 항온기에서 48시간 동안 배양하여 수행하였고 이로부터 배양 상층액을 회수하여 샌드위치 ELISA (sandwich ELISA) 방법으로 항체의 농도를 측정하였다. 샌드위치 ELISA를 수행하기 위하여, 항-인간 항체 (anti-human IgG, Sigma사 제품)를 포획 항체 (capture antibody)로 사용하였고 항-인간 항체 (Fc specific)에 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (horseradish peroxidase, Sigma사 제품)가 결합된 항체를 2차 항체로 사용하였다.
<실시예 3> 인간화 중쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 표면항원 S에 대한 항원 결합능 측정
HBV의 표면항원 S (녹십자)를 마이크로 플레이트의 각 웰에 250 ng씩 첨가하여 코팅한 후 여기에 상기 실시예 2로부터 얻은 각각의 DNA-리포펙타민 혼합물이 형질전환된 세포 배양액을 실시예 2에서 측정된 항체 농도를 기준으로 하여 항체의 농도가 각각 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.8, 3.5 및 7 ng이 되도록 첨가하였다. 상기 웰 플레이트에 항-인간 항체에 양고추냉이 퍼옥시데이즈가 결합된 항체를 2차 항체로 사용하여 간접 ELISA를 수행한 후 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로, HZII-H67의 중쇄 및 경쇄 발현벡터인 pRc/CMV-HC-HZIIS (KCTC 0489BP)와 pKC-dhfr-HZIIS를 사용하여 상기와 동일한 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, HCDR1 유전자 변이체들 중에서는 I34V의 HBV 표면항원 S에 대한 결합능이 야생형 인간화 항체 HZS-H67의 중쇄와 거의 동일하였고, HCDR2 유전자 변이체의 경우에는 T54S와 S65G가 야생형과 거의 동일한 수준의 항원 결합능을 나타내었다. 반면, HCDR3 유전자 변이체의 경우에는 E100A가 야생형 보다 약간 떨어지는 항원 결합능을 나타내었는데, 이는 상기 HCDR3 유전자 변이체의 글루탐산 잔기 (E100)가 HBV 표면항원 S와의 결합에 중요하게 작용하지 않음을 시사하는 것이다.
<실시예 4> HCDR3 유전자 변이체의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 3의 결과로부터 마우스 HCDR3 서열 유래 100번째 아미노산 잔기인 글루탐산 (E100)이 HBV 표면항원 S와의 결합에 중요하게 작용하지 않음을 확인하고 상기 아미노산 잔기를 다른 인간 항체의 것으로 치환시키기 위하여, 인간 항체 HCDR3의 아미노산 서열 데이터 베이스와 비교하였다.
그 결과, 마우스 HCDR3 서열에 높은 상동성을 나타내는 인간 항체 서열들에서 HCDR3의 100번 잔기인 세린과 101번 잔기인 글리신이 공통적임을 확인하고, 마우스 유래 HCDR3의 100번째 글루탐산을 세린으로 또는 101번 잔기인 알라닌을 글리신으로 치환시킨 유전자 변이체를 제조하여 이들의 항원 결합능을 측정하였다.
<4-1> 아미노산 잔기 100번 글루탐산이 세린으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 29와 서열번호 30으로 기재되는 P25과 P26 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P25 시발체 쌍을 사용하여 390 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P26 시발체 쌍을 사용하여 73 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 E100S을 얻었다. 상기 유전자 변이체 E100S의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-E100S라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 E100S의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 E100S가 삽입되었음을 확인하였다.
<4-2> 아미노산 101번 알라닌이 글리신으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 P1과 P2 시발체 쌍 대신에 서열번호 31과 서열번호 32로 기재되는 P27과 P28 시발체 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. HL과 P27 시발체 쌍을 사용하여 396 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, HC와 P28 시발체 쌍을 사용하여 68 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 HL과 HC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 448 bp 크기의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 A101G을 얻었다. 상기 유전자 변이체 A101G의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh-A101G라 명명하였다. 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체 A101G의 염기서열을 DNA 서열분석기로 분석하여 상기 재조합 발현벡터 내에 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 변이체인 A101G가 삽입되었음을 확인하였다.
<4-3> 표면항원 S에 대한 항원결합능 측정
상기 실시예 <4-1> 및 <4-2>에서 제조된 두 개의 재조합 발현벡터를 상기 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 COS 세포에 형질전환시킨 후 이로부터 선별된 형질감염체의 항원 결합능을 간접 ELISA 방법으로 측정한 결과, E100S의 항원 결합능은 야생형과 유사한 반면 A101G는 항원 결합능이 다소 감소하였음을 확인하였다.
본 발명자들은 상기 실시예 3 내지 <4-3>의 결과를 통해 인간화 중쇄의 변이체들 중에서 I34V, T54S, S65G 및 E100S의 항원 결합능이 야생형과 유사함을 확인하고, 상기 네 개의 유전자 변이체를 동시에 포함하는 재조합 변이체를 제조하고자 하였다.
<실시예 5> 인간화 중쇄 유전자의 재조합 변이체
<5-1> T54S+I34V 재조합 유전자 변이체의 제조
T54S와 I34V 유전자 변이체를 포함하는 재조합 유전자 변이체를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <1-2-1>의 중쇄 유전자 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-T54S를 주형으로 하여 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 PCR과 서브클로닝 (subcloning)을 수행하였으며, 이로부터 얻은 재조합 발현벡터를 pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V라 명명하였다.
<5-2> T54S+I34V+E100S 재조합 유전자 변이체의 제조
T54S, I34V 및 E100S 유전자 변이체를 포함하는 재조합 유전자 변이체를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <5-1>의 중쇄 유전자 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-I34V를 주형으로 하여 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 PCR과 서브클로닝을 수행하였으며, 이로부터 얻은 재조합 발현벡터를 pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S라 명명하였다.
<5-3> T54S+I34V+E100S+S65G 재조합 유전자 변이체의 제조
T54S, I34V, E100S 및 S65G 유전자 변이체를 포함하는 재조합 유전자 변이체를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <5-2>의 중쇄 유전자 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-E100S를 주형으로 하여 실시예 <1-1-1>과 동일한 방법으로 PCR과 서브클로닝을 수행하여 T54S, I34V, E100S 및 S65G 유전자 변이체를 모두 포함하는 재조합 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S+S65G를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIIIh라 명명하였다.
<실시예 6> 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 항원결합능 측정
HBV의 표면항원 S (녹십자)를 마이크로 플레이트의 각 웰에 250 ng씩 첨가하여 코팅한 후 여기에 상기 실시예 <4-1> 내지 <4-3>으로부터 제조된 각각의 재조합 발현벡터와 HZII-H67의 경쇄 발현벡터인 pKC-dhfr-HZIIS를 실시예 2와 동일한 방법으로 COS7 세포에 형질전환시켰으며, 이로부터 얻은 형질전환체의 세포 배양액을 항체의 농도가 각각 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 및 20 ng이 되도록 상기 웰 플레이트에 첨가하였다. 이를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로 HZII-H67의 중쇄 및 경쇄 발현벡터인 pRc/CMV-HC-HZIIS와 pKC-dhfr-HZIIS를 사용하여 상기와 동일한 실험을 수행하였으며, 이와같이 측정된 흡광도를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유전자 변이체를 여러개 포함하는 I34V+T54S, I34V+T54S+E100S 및 I34V+T54S+E100S+S65G의 재조합 유전자 변이체를 갖는 각각의 인간화 중쇄는 야생형인 인간화 항체 HZS-H67의 중쇄와 거의 동일한 수준의 표면항원 S에 대하여 결합능을 나타내었다. 이와같이 HBV 표면항원 S에대한 항원 결합능이 확인된 중쇄 재조합 유전자 변이체를 발현하는 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh를 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 9월 22일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10083BP). 상기 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh로부터 발현되는 인간화 항체 HzS-III의 중쇄 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열번호 43으로 기재되는 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 중쇄 HzS-III-VH로 이루어져 있음을 확인하였다.
<실시예 7> 인간화 경쇄 유전자의 변이
인간화 경쇄의 경우에는 인간화 항체 HZII-H67의 LCDR1과 LCDR2이 인간 항체유래의 아미노산 잔기들을 가지고 있으므로, 본 발명자들은 LCDR3의 아미노산 잔기들을 변경하고자 하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 인간화 항체 HZII-H67에 존재하는 마우스 유래 LCDR3의 아미노산 잔기를 인간 항체의 것으로 바꾸기 위하여, 상기 인간화 경쇄의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가지는 인간 경쇄 B1의 LCDR3 아미노산 서열과 비교하였으며, 이로부터 마우스 유래 LCDR3 서열의 89번 글루타민과 91번 트레오닌 잔기가 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않을 것으로 판단하고 이들을 인간 B1 경쇄의 잔기인 루이신과 세린으로 치환시켰다.
<7-1> 아미노산 잔기 89번 글루타민이 루이신으로 치환된 유전자 변이체의 제조
마우스 유래 LCDR3의 89번 글루타민 잔기가 인간 항체의 루이신으로 치환된 유전자 변이체를 제조하기 위하여, 기존의 인간화 항체 HZII-H67의 경쇄 발현벡터인 pKC-dhfr-HzIIS를 주형으로 하고 서열번호 33 내지 서열번호 36으로 기재되는 시발체들을 이용하여 PCR과 재조합 PCR을 수행하였다 (도 6 및 도 7).
구체적으로, PCR은 Taq DNA 중합효소를 사용하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 반응을 25회 수행하였다. 서열번호 33 및 서열번호 34로 기재되는 LL과 P29 시발체 쌍을 사용한 PCR로부터 336 bp 크기의 DNA 단편이 증폭되고, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 기재되는 P30와 LC 시발체 쌍을 사용한 PCR로부터 273 bp 크기의 DNA 단편이 증폭됨을 확인하였다. 이로부터 확보한 상기 두 DNA 단편들을 주형으로 하고 LL과 P29 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 743 bp 크기의 인간화 항체 경쇄 가변영역 유전자 변이체 Q89L을 얻었다. 상기 유전자 변이체 Q89L의 가변영역 양끝을 제한효소 HindIII와 SalI으로 절단하여 pBluescript KS＋ (StrataGen)에 클로닝하여 재조합 플리스미드인 pBlue-HzSIIIk-Q89L를 제조하였다. 상기 인간화 항체 경쇄 가변영역 유전자 변이체 G89L의 염기서열을 분석하여 발현벡터 내에 Q89L이 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 상기 pBlue-HzSIIIk-Q89L DNA를 제한효소 HindIII 와 ApaI으로 절단하여 인간화 경쇄 유전자 변이체 단편을 잘라 낸 후 이를 발현벡터인 pCMV-dhfr의 HindIII-ApaI 위치에 다시 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조하였고 (도 7) 이를 pCMV-dhfr-HzSIIIk-Q89L로 명명하였다 (도 8).
<7-2> 아미노산 91번 트레오닌이 세린으로 치환된 유전자 변이체의 제조
상기 실시예 <7-1>과 동일한 반응조건에서 서열번호 33 및 서열번호 36 내지 서열번호 38의 시발체들을 사용하여 PCR을 수행하였다. LL과 P31 시발체 쌍을 사용하여 369 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, P32와 LC 시발체 쌍을 사용하여 391 bp 크기의 DNA 단편을 증폭한 후 이로부터 얻은 상기 두 DNA 단편을 주형으로 하고 LL과 LC 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 743 bp 크기의 인간화 항체 경쇄 가변영역 유전자 변이체 T91S를 얻었다. 상기 유전자 변이체 T91S의 가변영역 양끝을 제한효소 HindIII와 SalI으로 절단하여 pBluescript KS＋에 클로닝하여 재조합 플리스미드인 pBlue-HzSIIIk-T91S를 제조하였다. 상기 인간화 항체 경쇄 가변영역 유전자 변이체 T91S의 염기서열을 분석하여 발현벡터 내에 T91S가 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 상기 pBlue-HzSIIIk-T91S DNA를 제한효소 HindIII 와 ApaI으로 절단하여 인간화 경쇄 유전자 변이체 단편을 잘라 낸 후 발현벡터 pCMV-dhfr의 HindIII-ApaI 위치에 다시 클로닝하여 재조합 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S를 제조하였고 이를 pCMV-dhfr-HzSIIIk로 명명하였다.
<실시예 8> 인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 HBV 표면항원 S에 대한 결합능 측정
상기 실시예 <7-1> 및 <7-2>로부터 얻은 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk-Q89L 혹은 pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S와 인간화 항체 HZII-H67의 중쇄 발현벡터인 pRc/CMV-HC-HZIIS를 실시예 2와 동일한 방법으로 COS7 세포에 형질전환시킨 후 선별된 형질전환체를 48시간 동안 배양하였다. 이로부터 얻은 배양 상층액 내 존재하는 인간화 항체의 농도를 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 항체의 농도가 각각 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.8, 3.5 및 7 ng이 되도록 HBV 표면항원 S가 코팅된 웰 플레이트에 첨가하여 간접 ELISA 방법으로 항원 결합능을 측정하였다. 이때, 대조군으로 HZII-H67의 중쇄 및 경쇄 발현벡터인 pRc/CMV-HC-HZIIS와 pKC-dhfr-HZIIS를 사용하여 상기와 동일한 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 유전자 변이체 중 91번 트레오닌이 세린으로 치환된 T91S의 변이를 갖는 인간화 경쇄가 야생형 인간화 항체 HZS-H67의 경쇄와 동일한 수준의 표면항원 S에 대한 결합능을 나타내었다. 이와같이 HBV 표면항원 S에 대한 결합능이 확인된 유전자 변이체 T91S를 발현하는 재조합 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk를 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 9월 22일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10084BP). 상기 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk로부터 발현되는 인간화 항체 HzS-III의 경쇄 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열번호 42로 기재되는 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 경쇄 HzS-III-VL로 이루어져 있음을 확인하였다.
<실시예 9> 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체/인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체 (HzS-III)의 항원 결합능 측정
상기 실시예 <5-2>로부터 얻은 인간화 중쇄 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh와 실시예 <7-2>로부터 얻은 인간화 경쇄 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk를 실시예 2와 동일한 방법으로 COS7 세포에 형질전환시킨 후 48시간 동안 배양하여 형질전환체로부터 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체/인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체 HzS-III을 발현시켰다. 이로부터 얻은 배양 상층액 내 존재하는 인간화 항체 HzS-III를 확인하기 위하여, 항-인간 항체 (Fc specific)에 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (horseradish peroxidase, Sigma사 제품)가 결합된 항체를 2차 항체로 사용하여 Western blot 분석을 시행하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 약 55 kDa의 인간화 중쇄와 약 27 kDa의 인간화 경쇄가 검출되었고 이로부터 본 발명의 인간화 항체가 형질전환체로부터 올바르게 발현 및 분비되었음을 확인하였다.
상기 배양액으로 분비된 인간화 항체 HzS-III의 농도를 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 항체의 농도가 각각 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 및 20 ng이 되도록 HBV에 대한 표면항원 S가 코팅된 웰 플레이트에 첨가하여 간접 ELISA 방법으로 항원 결합능을 측정하였다. 이때, 대조군으로 HZII-H67의 중쇄 및 경쇄 발현벡터인 pRc/CMV-HC-HZIIS와 pKC-dhfr-HZIIS를 사용하여 상기와 동일한 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체 및 인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체 HzS-III는 야생형 인간화 항체 HZS-H67(H/K)와 동일한 수준으로 표면항원 S에 대한 결합능을 나타내었다.
<실시예 10> 인간화 항체 HzS-III의 항원 결합 친화도 결정
인간화 항체 HzS-III의 항원 결합 친화도를 결정하기 위하여, 경쟁적 ELISA 방법 (competitive ELISA, Ryu et al., J. Med. Virol., 52, 226, 1997)을 이용하였다. 상기 실시예 8에서 COS7 세포로부터 생산된 인간화 항체 HzS-III 5 ng과 표면항원 S (1x 10-7 M 내지 1 x 10-12 M)를 미리 37 ℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 이 반응혼합물을 표면항원 S로 미리 코팅시켜 놓은 96웰 플레이트에 첨가하였다. 상기 웰 플레이트를 37℃에서 30분간 반응시킨 후 실시예 3과 동일한 방법으로 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정하였다 (도 12). 이때, 대조군으로 인간화 항체 HZII-H67을 사용하였다.
그 결과, 본 발명의 인간화 항체 HzS-III의 항원 결합 친화도는 약 4 X 109 M-1로서 대조군으로 사용된 HZII-H67의 친화도 (3.2 X 109 M-1)와 큰 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
<실시예 11> 인간화 항체 HzS-III로부터 MHC class II에 결합하는 펩타이드 서열을 제거한 인간화항체 HzS-IV의 제조
본 발명자들은 상기 인간화항체 HzS-III에 MHC class II와 결합하는 펩타이드 서열이 존재하는지를 Sturniolo 등의 방법 (TEPITOPE)을 이용하여 분석하였다 (Sturniolo et al., Nature Biotechnology, 17, 555-561, 1999). 또한, 상기 인간화 항체와 유사성이 높은 사람 germline DP-25의 서열을 분석하여 동일한 펩타이드 서열은 고려의 대상에서 제외하였다.
그 결과, 인간화 중쇄에서 2가지 펩타이드가 MHC class II에 결합하는 것으로 분석되었다. 첫 번째 펩타이드는 서열번호 44로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 51 가지의 MHC class II 분자들 중에서 22가지 MHC class II 분자에 결합하는 것으로 분석되었고, 두 번째 펩타이드는 서열번호 45로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 14가지의 MHC class II 분자에 결합하는 것으로 분석되었다 (표 1).
인간화중쇄 HzSIIIh의 TEPITOPE 분석 결과
펩타이드 치환 전 치환 후 치환 전 치환 후
WVKQAPGKS (서열번호 44) WVKQAPGKT (서열번호 46) FQGRVTLTV(서열번호 45) FQGRVDLTV(서열번호 47)
펩타이드와 결합하는 MHC class II 분자 DRB1_0101DRB1_0301DRB1_0305DRB1_0309DRB1_0401DRB1_0405DRB1_0408DRB1_0421DRB1_0426DRB1_0801DRB1_0802DRB1_1101DRB1_1102DRB1_1104DRB1_1106DRB1_1107DRB1_1114DRB1_1120DRB1_1121DRB1_1128DRB1_1302DRB1_1305DRB1_1307DRB1_1311DRB1_1321DRB1_1322DRB1_1323DRB5_0101DRB5_0105 DRB1_0101DRB1_0305DRB1_0309DRB1_1101DRB1_1307DRB1_1321DRB5_0101DRB5_0105 DRB1_0402DRB1_0421DRB1_0701DRB1_0703DRB1_0801DRB1_0802DRB1_0804DRB1_0806DRB1_0813DRB1_0817DRB1_1101DRB1_1114DRB1_1120DRB1_1128DRB1_1302DRB1_1305DRB1_1323DRB1_1502 DRB1*1502
전체수 29 14 18 1
상기 펩타이드들의 MHC II에 대한 결합력을 약화시키기 위하여, 본 발명자들은 서열번호 44로 기재되는 아미노산 서열의 P9 위치에 있는 세린을 트레오닌으로 치환한 결과 결합가능한 MHC class II 분자가 11개 (50%)로 감소되었고, 서열번호 45로 기재되는 아미노산 서열의 P6에 존재하는 트레오닌 잔기를 아스파라긴산으로 치환하였을 때에는 51 가지의 MHC II 분자들 중에서 오직 한가지에만 결합 가능한 것으로 분석되었다.
따라서, 본 발명자들은 MHC class II에 대한 결합 정도가 약화된 인간화 중쇄를 제조하기 위하여, 인간화 항체 HzS-III의 중쇄 서열 44번 세린이 트레오닌으로 치환된 유전자 변이 S44T (서열번호 46 및 서열번호 47의 시발체 쌍 이용)와 아미노산 잔기 68번 트레오닌이 아스파라긴산으로 치환된 유전자 변이 T68D (서열번호 48 및 서열번호 49의 시발체 쌍 이용)를 포함하는 유전자 변이체 S44T/T68D를 얻었다. 상기 유전자 변이체 S44T/T68D의 가변영역 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 발현벡터 pcDdA-HC의 제한효소 EcoRI-ApaI 위치에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조하였고 이를 pcDdA-HzSIVh라 명명하였으며, 이를 2001년 9월 26일자로 한국생명공학 연구원 유전자 은행에 기탁하였다 (수탁번호 ; KCTC 10080BP).
상기 인간화 중쇄 발현벡터 pcDdA-HzSIVh와 인간화 경쇄 발현벡터 pCMV-dhfr-HzSIIIk를 동물 세포주에 형질전환시킨 후 48시간 동안 배양하여 형질전환체로부터 인간화 항체 HzS-IV을 발현시켰으며, 이로부터 얻은 배양 상층액 내 존재하는 인간화 항체 HzS-IV의 항원 결합능을 측정한 결과, 본 발명의 인간화 항체 HzS-IV는 인간화 항체 HzS-III와 거의 유사한 항원 결합 친화도를 나타내었다 (도 12 참조).
<실시예 12> 인간화 항체 HzS-III 및 HzS-IV의 아미노산 서열 비교
본 발명의 인간화 항체 HzS-III 및 HzS-IV의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 야생형의 마우스 단일클론 항체 H67 및 인간화 항체 HZII-H67의 아미노산 서열과 비교하였다.
그 결과 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인간화 항체 HzS-III 및 HzS-IV의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 마우스 단일클론 항체 H67과 인간화 항체 HZII-H67에 비하여 중쇄 유전자의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 또는 경쇄 유전자의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이 마우스 유래의 아미노산 잔기를 더 적게 포함하고 있고, HzS-IV는 HzS-III의 중쇄보다 MHC class 결합서열이 더 적어 HAMA 반응이 더 낮을 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 인간화 항체 HzS-III 및 HzS-IV는 기존의 인간화 항체보다 HAMA 반응을 덜 유발시키면서 우수한 치료효과를 나타내어 B형 간염 바이러스의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체는 중쇄 유전자의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 경쇄 유전자의 LCDR1, LCDR2, LCDR3에서 마우스 유래 아미노산 잔기가 인간 유래 아미노산으로 치환되어 기존의 인간화 항체보다 더 인간화된 아미노산 잔기를 포함하고 또한 FR 내에서 MHC class II에 결합하는 서열을 줄임으로써, 인체 내에서의 면역유발 반응성은 현저하게 감소된 반면, 우수한 항원 결합능을 나타내어 B형 간염 바이러스의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체 HZII-H67의 중쇄 가변영역과 본 발명의 인간화 중쇄 가변영역 유전자 변이체들의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 비교한 것이고,
도 2는 마우스 HCDR1의 34번 이소루이신이 발린으로 치환된 인간화 중쇄 유전자 변이체 I34V의 제작과정을 나타낸 모식도이고,
도 3은 도 2와 같이 제작된 유전자 변이체 I34V를 포함하는 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-I34V의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명의 인간화 중쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 표면항원 S에 대한 항원 결합능을 ELISA로 측정한 결과이고,
A; HCDR1 유전자 변이체 B; HCDR2 유전자 변이체
C; HCDR3 유전자 변이체
H/K; HZII-H67의 중쇄 및 경쇄로 이루어진 인간화 항체 HZII-H67
도 5는 본 발명의 인간화 중쇄 유전자 변이체를 2개 이상 포함하는 재조합 유전자 변이체를 가지는 인간화 항체의 표면항원 S에 대한 항원 결합능을 ELISA로 측정한 결과이고,
도 6은 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체 HZII-H67의 경쇄 가변영역과 본 발명의 인간화 경쇄 가변영역 유전자 변이체들의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 비교한 것이고,
도 7은 마우스 LCDR1의 89번 글루타민이 루이신으로 치환된 인간화 경쇄 유전자 변이체 Q89L의 제작과정을 나타낸 모식도이고,
도 8은 도 7과 같이 제작된 유전자 변이체 Q89L을 포함하는 발현벡터 pcDdA-HzSIIIh-Q89L의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 9는 본 발명의 인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체의 표면항원 S에 대한 항원 결합능을 ELISA로 측정한 결과이고,
H/K; HZII-H67의 중쇄 및 경쇄로 이루어진 인간화 항체 HZII-H67
도 10은 본 발명의 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체 및 인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체 HzS-III를 웨스턴 블럿 분석 (Western blot analysis)으로 확인한 결과이고,
A; HzS-Ⅲ B; HZⅡ-H67
도 11은 본 발명의 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체 및 인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체 HzS-III의 HBV 표면항원 S에 대한 항원 결합능을 ELISA 방법으로 측정한 결과이고,
도 12는 본 발명의 인간화 중쇄 재조합 유전자 변이체 및 인간화 경쇄 유전자 변이체를 갖는 인간화 항체 HzS-III 및 HzS-IV의 HBV 표면항원 S에 대한 항원 결합 친화도를 경쟁적 ELISA 방법으로 측정한 결과이고,
도 13은 본 발명의 인간화 항체 HzS-III 및 HzS-IV의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 야생형의 마우스 단일클론 항체 H67 및 인간화 항체 HZII-H67의 아미노산 서열과 비교한 결과를 나타낸 것이고,
도 14는 본 발명의 인간화 항체 HzS-III의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 야생형의 마우스 단일클론 항체 H67 및 인간화 항체 HZII-H67의 아미노산 서열과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A humanized antibody to surface antigen S of hepatitis B virus and a preparing method thereof <130> 1p-07-07B <150> KR10-2000-0057891 <151> 2000-10-02 <160> 49 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> mouse <400> 1 Asp Tyr Asn Ile Gln 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Tyr Asn Val Asp 1 5 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL <400> 3 gagaattcac attcacgatg tacttg 26 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 <400> 4 cccactgaac gttgtagtca gtg 23 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 <400> 5 ctacaacgtt cagtgggtgc gcaag 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HC <400> 6 gatgggccct tggtggaggc 20 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3 <400> 7 cgcacccagt taatgttgta gtcagtg 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4 <400> 8 caacattaac tgggtgcgcc aggcccc 27 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5 <400> 9 gtaaggatac atatatccca tccactcaag 30 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P6 <400> 10 gggatatatg tatccttaca ctggtgg 27 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 <400> 11 cagtaccacc actgtaagga taaatatatc 30 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P8 <400> 12 ccttacagtg gtggtactgg ctacag 26 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P9 <400> 13 gtgactctgc cctggaactt ctgg 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P10 <400> 14 ccagggcaga gtcacattga ctg 23 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P11 <400> 15 gtaaccatag gctcttgcac agtaatagac 30 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P12 <400> 16 gtgcaagagc ctatggttac gacgagtc 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P13 <400> 17 gtaaccggcg tttcttgcac agtaatag 28 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P14 <400> 18 caagaaacgc cggttacgac gagtctg 27 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P15 <400> 19 gtcgtaggca tagtttcttg cacag 25 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P16 <400> 20 gaaactatgc ctacgacgag tctgcctac 29 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P17 <400> 21 ctcgtcggca ccatagtttc ttgcac 26 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P18 <400> 22 ctatggtgcc gagtctgctt actg 24 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P19 <400> 23 cagactcggc gtaaccatag tttcttg 27 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P20 <400> 24 ggttacggcg agtctgctta ctgggg 26 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P21 <400> 25 cagaggcgtc gtaaccatag tttc 24 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P22 <400> 26 ggttacgacg cctctgctta ctggggc 27 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P23 <400> 27 gtaagcggcc tcgtcgtaac catgg 25 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P24 <400> 28 gacgaggccg cttactgggg ccaagg 26 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P25 <400> 29 gtaagcagac gagtcgtaac catag 25 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P26 <400> 30 cgactcgtct gcttactggg gccaag 26 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P27 <400> 31 ccagtaacca gactcgtcgt aacc 24 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P28 <400> 32 cgagtctggt tactggggcc aaggg 25 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LL <400> 33 caaagcttgg aagcaagatg gaatca 26 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P29 <400> 34 ccttagtttg cagacagaaa taatttgcag 30 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P30 <400> 35 ctgtctgcaa actaaggcgg ttccg 25 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 36 gaagtcgacc taacactctc ccctgtt 27 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P31 <400> 37 cctccttact ttgctgacag aaataatttg 30 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P32 <400> 38 gtcagcaaag taaggaggtt ccgtacac 28 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> mouse <400> 39 Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Ser Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> mouse <400> 41 Asn Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala 1 5 <210> 42 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens HzS-III-VL <400> 42 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Lys Gly Thr Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 43 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens HzS-III-VH <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence which binds to MHC class II molecule <400> 44 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence which binds to MHC class II molecule <400> 45 Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val 1 5 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P33 <400> 46 ggaaagaccc ttgagtggat ggg 23 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P34 <400> 47 ctcaagggtc tttccggggg cc 22 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35 <400> 48 gcagagtcga tttgactgta gacaattc 28 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P36 <400> 49 cagtcaaatc gactctgccc tggaac 26

Claims (25)

  1. 하기 (a) 내지 (d) 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, B형 간염 바이러스의 표면항원 S에 특이적으로 결합하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체:
    (a) 마우스 유래 인간화 항체의 HCDR1의 아미노산 잔기 34번 이소루이신 (isoleucine)이 발린 (valine)으로 치환된 것;
    (b) 마우스 유래 인간화 항체의 HCDR2의 아미노산 잔기 54번 트레오닌 (threonine)이 세린 (serine)으로 치환된 것;
    (c) 마우스 유래 인간화 항체의 HCDR2의 아미노산 잔기 65번 세린이 글리신 (glycine)으로 치환된 것;
    (d) 마우스 유래 인간화 항체의 HCDR3의 아미노산 잔기 100번 글루탐산 (glutamate)가 세린으로 치환된 것.
  2. 제 1항에 있어서, HCDR1의 아미노산 잔기 34번 이소루이신 (isoleucine)이 발린 (valine)으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체.
  3. 제 1항에 있어서, HCDR2의 아미노산 잔기 54번 트레오닌 (threonine)이 세린 (serine)으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체.
  4. 제 1항에 있어서, HCDR2의 아미노산 잔기 65번 세린이 글리신 (glycine)으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체.
  5. 제 1항에 있어서, HCDR3의 아미노산 잔기 100번 글루탐산 (glutamate)가 세린으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체.
  6. 제 1항에 있어서, 제 2항 내지 제 5항의 유전자 변이를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체.
  7. 제 6항의 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체를 포함하는 pcDdA-HzSIIIh 발현벡터 (수탁번호: KCTC 10083BP).
  8. 제 1항에 있어서, 추가로 서열번호 44 또는 서열번호 45로 기재되는 인간 MHC class II에 결합하는 펩타이드 서열 중 일부 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는, B형 간염 바이러스의 표면항원 S에 특이적으로 결합하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체.
  9. 삭제
  10. 제 8항에 있어서, 서열번호 44로 기재되는 서열의 P9 위치 세린이 트레오닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체.
  11. 제 8항에 있어서, 서열번호 45로 기재되는 서열의 P6 위치 트레오닌이 아스파라긴산으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체.
  12. 제 8항에 있어서, 제 10항 내지 제 11항의 유전자 변이를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체.
  13. 제 12항의 인간화 항체의 중쇄 유전자 변이체를 포함하는 pcDdA-HzSIVh 발현벡터 (수탁번호: KCTC 10080BP).
  14. 하기 (a) 내지 (f) 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, B형 간염 바이러스의 표면항원 S에 특이적으로 결합하는 인간화 항체의 경쇄 유전자 변이체:
    (a) 마우스 유래 인간화 항체의 LCDR1의 아미노산 잔기 27c번 아스파르트산이 세린으로 치환된 것;
    (b) 마우스 유래 인간화 항체의 LCDR1의 아미노산 잔기 31번 세린이 아스파라긴으로 치환된 것;
    (c) 마우스 유래 인간화 항체의 LCDR1의 아미노산 잔기 33번 메티오닌이 이소루이신으로 치환된 것;
    (d) 마우스 유래 인간화 항체의 LCDR2의 아미노산 잔기 54번 글루타민이 라이신으로 치환된 것;
    (e) 마우스 유래 인간화 항체의 LCDR2의 아미노산 잔기 56번 세린이 트레오닌으로 치환된 것;
    (f) 마우스 유래 인간화 항체의 LCDR3 아미노산 잔기 91번 트레오닌이 세린으로 치환된 것.
  15. 제 14항에 있어서, LCDR1의 아미노산 잔기 27c번 아스파르트산이 세린으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 경쇄 유전자 변이체.
  16. 제 14항에 있어서, LCDR1의 아미노산 잔기 31번 세린이 아스파라긴으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 경쇄 유전자 변이체.
  17. 제 14항에 있어서, LCDR1의 아미노산 잔기 33번 메티오닌이 이소루이신으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 경쇄 유전자 변이체.
  18. 제 14항에 있어서, LCDR2의 아미노산 잔기 54번 글루타민이 라이신으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 경쇄 유전자 변이체.
  19. 제 14항에 있어서, LCDR2의 아미노산 잔기 56번 세린이 트레오닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 경쇄 유전자 변이체.
  20. 제 14항에 있어서, 마우스 유래 경쇄 LCDR3 아미노산 잔기 91번 트레오닌이 세린으로 치환된 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 경쇄 유전자 변이체.
  21. 제 14항에 있어서, 제 15항 내지 제 20항의 유전자 변이를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체의 경쇄 유전자 변이체.
  22. 제 21항의 인간화 항체의 경쇄 유전자 변이체를 포함하는 pCMV-dhfr-HzSIIIk 발현벡터 (수탁번호: KCTC 10084BP).
  23. 제 7항 또는 제 13항의 인간화 항체의 중쇄 발현벡터 및 제 22항의 인간화 항체의 경쇄 발현벡터가 동시에 형질전환된 형질전환체.
  24. 제 23항의 형질전환체로부터 발현되는, B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, HBV)의 표면항원 (surface antigen) S에 대한 인간화 항체 (humanized antibody).
  25. 1) 마우스 유래 CDR로 구성된 인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변영역에 있어서, 각각의 마우스 유래 CDR과 서열상동성이 가장 높은 인간 CDR 서열을 각각 검색하는 단계;
    2) 마우스 유래 CDR 서열과 단계1)에서 검색된 서열상동성이 가장 높은 인간 CDR 서열을 비교하여, 마우스 유래 CDR 서열의 아미노산을 인간 CDR 서열의 아미노산으로 치환하는 단계;
    3) 단계2)에서 얻어진 인간화 항체의 유전자 변이체의 항원에 대한 결합능(activity)을 시험하는 단계;
    4) 단계3)에서 얻어진 결과를 토대로 항원에 대한 결합능(activity)이 저하되지 않는 치환체만을 선별하여 인간화 항체의 유전자 변이체의 중쇄 또는 경쇄의 가변영역을 확정하는 단계를 포함하는, 마우스 유래 CDR로 구성된 인간화항체 보다 더욱 인간화된 항체를 코딩하는 인간화 항체의 유전자 변이체를 제조하는 방법.
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