JP3242640B2 - 高免疫能を有するｂ型肝炎ウイルス組換え表面抗原およびｂ型肝炎ウイルスワクチン組成物 - Google Patents
高免疫能を有するｂ型肝炎ウイルス組換え表面抗原およびｂ型肝炎ウイルスワクチン組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学および生物工
学の分野のものである。更に詳細には、高免疫能を有す
るＢ型肝炎ウイルス組換え表面抗原およびＢ型肝炎ウイ
ルスワクチン組成物に関するものである。Ｂ型肝炎ウイ
ルスの感染は急性肝疾患のみならずこれが進行した肝硬
変、肝不全および肝細胞癌などの慢性疾患を生じるた
め、その予防は世界規模での重大な健康上の課題であ
る。この感染病原体の主な保有者であるＢ型肝炎ウイル
スの慢性的なキャリアーは世界各地に約２億人存在す
る。現状ではＢ型肝炎ウイルス感染に対する有効な治療
法がないため、その予防のみがその伝播および感染率を
減少させる手段である。
学の分野のものである。更に詳細には、高免疫能を有す
るＢ型肝炎ウイルス組換え表面抗原およびＢ型肝炎ウイ
ルスワクチン組成物に関するものである。Ｂ型肝炎ウイ
ルスの感染は急性肝疾患のみならずこれが進行した肝硬
変、肝不全および肝細胞癌などの慢性疾患を生じるた
め、その予防は世界規模での重大な健康上の課題であ
る。この感染病原体の主な保有者であるＢ型肝炎ウイル
スの慢性的なキャリアーは世界各地に約２億人存在す
る。現状ではＢ型肝炎ウイルス感染に対する有効な治療
法がないため、その予防のみがその伝播および感染率を
減少させる手段である。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ型肝炎ウイルスワクチンには、大別し
て血清由来のものと遺伝子工学技術により得られるもの
の２種がある。血清由来のワクチンは、該ウイルスの慢
性キャリアー由来の血清中のＢ型肝炎ウイルス表面抗原
（以下ＨＢｓＡｇと略す）を多様な物理的手法で精製し
不活化することにより得られる（Ａ．Ｊ．Ｚｕｃｋｅｒ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８５，２９０：４９２）。こ
れらのワクチンは長年にわたってその有効性と安全性が
実証されており（Ａ．Ｍ．Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａ
ｌ．，ＡｎｎｕａｌＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，１９８２，１４：２２５）、ヒト免疫不全ウイルス
または他の感染病原体の伝染の危険性も伴わない（Ｆ．
Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８５，
１７：２０９）。しかし、これらのワクチンの広範な使
用は、ワクチン製造に用いるＢ型肝炎ウイルス表面抗原
を得るためのＢ型肝炎ウイルスのキャリアー血清の入
手、およびワクチンの精製、Ｂ型肝炎ウイルスの不活化
また血漿中に存在する他の感染病原体の除去という厳密
な操作や、ワクチンのバッチの通関手続きに必要な長期
にわたる安全性試験によって制限される。更に、血液伝
播による疾患を生じる感染病原体がワクチン作製におけ
る不活化処理から免れる恐れがあるため、一般に血液由
来産物を遺伝子工学技術により得られるものと置き換え
る傾向がある。
て血清由来のものと遺伝子工学技術により得られるもの
の２種がある。血清由来のワクチンは、該ウイルスの慢
性キャリアー由来の血清中のＢ型肝炎ウイルス表面抗原
（以下ＨＢｓＡｇと略す）を多様な物理的手法で精製し
不活化することにより得られる（Ａ．Ｊ．Ｚｕｃｋｅｒ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８５，２９０：４９２）。こ
れらのワクチンは長年にわたってその有効性と安全性が
実証されており（Ａ．Ｍ．Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａ
ｌ．，ＡｎｎｕａｌＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，１９８２，１４：２２５）、ヒト免疫不全ウイルス
または他の感染病原体の伝染の危険性も伴わない（Ｆ．
Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８５，
１７：２０９）。しかし、これらのワクチンの広範な使
用は、ワクチン製造に用いるＢ型肝炎ウイルス表面抗原
を得るためのＢ型肝炎ウイルスのキャリアー血清の入
手、およびワクチンの精製、Ｂ型肝炎ウイルスの不活化
また血漿中に存在する他の感染病原体の除去という厳密
な操作や、ワクチンのバッチの通関手続きに必要な長期
にわたる安全性試験によって制限される。更に、血液伝
播による疾患を生じる感染病原体がワクチン作製におけ
る不活化処理から免れる恐れがあるため、一般に血液由
来産物を遺伝子工学技術により得られるものと置き換え
る傾向がある。
【０００３】ＨＢｓＡｇ遺伝子は、真核細胞や原核細胞
内でクローニングし発現される。原核生物である細菌の
場合は得られる発現レベルが低く、直径２２ｎｍの免疫
原粒子中へのＨＢｓＡｇの効率的な導入が起こらないた
め、ワクチン製造に必要な抗原供給源としては原核生物
は用いられていない（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８０，２８０：８１５；
Ｃ．Ｊ．Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，１９７９，２７９：４３）。一方、真核生物細胞も
ＨＢｓＡｇの産生に使用されているが（Ｍ．Ｌ．Ｍｉｃ
ｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１９８５，３：５６１；Ｇ．Ｍ．ＭａｃＮａｂ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａ
ｎｃｅｒ，１９７６，３６：５０９）、この方法では複
雑で高価な装置、培地を要し又その方法体系も複雑で費
用がかかるため、製造規模を拡大するのは難しい。更
に、哺乳類動物細胞由来のワクチンについて言えばレト
ロウイルスの存在による発癌の危険性があるため、その
安全性が懸念される。従って得られるＨＢｓＡｇが天然
に存在するものと同様の特性を有するとはいえ、上述の
方法は哺乳類動物細胞由来のワクチンの大量生産には有
用ではない。
内でクローニングし発現される。原核生物である細菌の
場合は得られる発現レベルが低く、直径２２ｎｍの免疫
原粒子中へのＨＢｓＡｇの効率的な導入が起こらないた
め、ワクチン製造に必要な抗原供給源としては原核生物
は用いられていない（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８０，２８０：８１５；
Ｃ．Ｊ．Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，１９７９，２７９：４３）。一方、真核生物細胞も
ＨＢｓＡｇの産生に使用されているが（Ｍ．Ｌ．Ｍｉｃ
ｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１９８５，３：５６１；Ｇ．Ｍ．ＭａｃＮａｂ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａ
ｎｃｅｒ，１９７６，３６：５０９）、この方法では複
雑で高価な装置、培地を要し又その方法体系も複雑で費
用がかかるため、製造規模を拡大するのは難しい。更
に、哺乳類動物細胞由来のワクチンについて言えばレト
ロウイルスの存在による発癌の危険性があるため、その
安全性が懸念される。従って得られるＨＢｓＡｇが天然
に存在するものと同様の特性を有するとはいえ、上述の
方法は哺乳類動物細胞由来のワクチンの大量生産には有
用ではない。
【０００４】遺伝子増幅されたワクチニアウイルスによ
り、感染病原体に有効な生ワクチンの製造に用いるＨＢ
ｓＡｇを単体で又は他の抗原と共に発現させる組換えウ
イルスを得ることができる（Ｃ．Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９８
６，６０：３３７；Ｅ．Ｐａｏｌｅｔｔｉ ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ＵＳＡ，１９８４，８１：１９３）。しかしこの方法
では技術および処方の面において多くの問題があるた
め、得られたワクチンをヒトに対して大規模に使用する
には至っていない。
り、感染病原体に有効な生ワクチンの製造に用いるＨＢ
ｓＡｇを単体で又は他の抗原と共に発現させる組換えウ
イルスを得ることができる（Ｃ．Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９８
６，６０：３３７；Ｅ．Ｐａｏｌｅｔｔｉ ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ＵＳＡ，１９８４，８１：１９３）。しかしこの方法
では技術および処方の面において多くの問題があるた
め、得られたワクチンをヒトに対して大規模に使用する
には至っていない。
【０００５】また、市販のＢ型肝炎ウイルス組換えワク
チンは、基本的には、遺伝子増幅された酵母のＨＢｓＡ
ｇの産生により製造されるものである。酵母のサッカロ
ミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、広範囲で使用される生物学的
に活性な異種の蛋白質産生に（Ｓ．Ｍ．Ｋｉｎｇｓｍａ
ｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｉｃｔｅｃｈ，１９８７，５：５
３）、またＨＢｓＡｇの大量取得に（Ｗ．Ｊ．ＭｃＡｌ
ｅｅｒ ｅｌ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３０
７：１７８；Ｎ．Ｈａｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏ
ｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ，１９８７，６３ ｓｕｐｐｌ．２：６５；Ｇ．Ａ．
Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８８，２５：
１２３）広く用いられている。得られる抗原は細胞内に
産生され、種々の細胞破砕の方法により抽出され、多様
な物理化学的手法により精製される。これにより９７％
以上の純度で、動物およびヒトの血漿抗原が示すのと同
様な抗原作用を有する生成物が取得される（Ｐ．Ｈａｕ
ｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８７，６３ ｓｕ
ｐｐｌ．２：８３）。
チンは、基本的には、遺伝子増幅された酵母のＨＢｓＡ
ｇの産生により製造されるものである。酵母のサッカロ
ミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、広範囲で使用される生物学的
に活性な異種の蛋白質産生に（Ｓ．Ｍ．Ｋｉｎｇｓｍａ
ｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｉｃｔｅｃｈ，１９８７，５：５
３）、またＨＢｓＡｇの大量取得に（Ｗ．Ｊ．ＭｃＡｌ
ｅｅｒ ｅｌ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３０
７：１７８；Ｎ．Ｈａｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏ
ｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ，１９８７，６３ ｓｕｐｐｌ．２：６５；Ｇ．Ａ．
Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８８，２５：
１２３）広く用いられている。得られる抗原は細胞内に
産生され、種々の細胞破砕の方法により抽出され、多様
な物理化学的手法により精製される。これにより９７％
以上の純度で、動物およびヒトの血漿抗原が示すのと同
様な抗原作用を有する生成物が取得される（Ｐ．Ｈａｕ
ｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８７，６３ ｓｕ
ｐｐｌ．２：８３）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】近年、Ｃ１化合物資化
性酵母であるピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）を宿主として用い、該菌におけるメタノ
ールの利用過程の第一酵素であるアルコールオキシダー
ゼＩをコードする遺伝子のプロモーターを用いることに
基く効率的な発現系が報告された。この発現系におい
て、プロモーターは厳密に調節され、菌細胞がグルコー
スの存在下ではなくメタノールの存在下にあるときにア
ルコールオキシダーゼＩを３０％までもの高いレベルで
発現できる（Ｓ．Ｂ．Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１９８５，５：１１１１；Ｒ．Ｃｏｕｄｅｒｃ
ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１
９８０，４４：２２５９）。
性酵母であるピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）を宿主として用い、該菌におけるメタノ
ールの利用過程の第一酵素であるアルコールオキシダー
ゼＩをコードする遺伝子のプロモーターを用いることに
基く効率的な発現系が報告された。この発現系におい
て、プロモーターは厳密に調節され、菌細胞がグルコー
スの存在下ではなくメタノールの存在下にあるときにア
ルコールオキシダーゼＩを３０％までもの高いレベルで
発現できる（Ｓ．Ｂ．Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１９８５，５：１１１１；Ｒ．Ｃｏｕｄｅｒｃ
ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１
９８０，４４：２２５９）。
【０００７】ピヒア パストリスは、ＨＢｓＡｇを含む
多様な異種蛋白質類の発現にすでに用いられている
（Ｊ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，１９８７，５：４７９）。この発現は、
該酵母の変異株の染色体に存在する発現カセット内で、
ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子がクローニングされた遺
伝子構築体を用い、アルコールオキシダーゼＩプロモー
ターの調節シグナルの下で行なわれる。これにより、メ
タノールの存在下で発現系が活性化されて、産生される
可溶性タンパク質の２〜３％がＨＢｓＡｇであることを
可能にする。しかし、この抗原の精製については何の開
示も無い。サッカロミセス セレビシアエ発現系に対す
るピヒア パストリス発現系の重要な利点は、産生され
る抗原が非常に効率的に組込まれて直径２２ｎｍの粒子
となることにある。これは、サッカロミセス セレビシ
アエでは２４キロダルトンの抗原のうちの少しの部分の
みが組み込まれて粒子となるのに対し、ピヒア パスト
リスでは産生した抗原の実質的に全部が粒子状となるか
らである（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，１９８２，２９８：３４７；Ｒ．Ａ．Ｈ
ｉｔｚｅｍａｎ ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８３，１１：２７４５；
Ａ．Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａ
ｄｅｍｙ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ，１９８３，
８０：１）。
多様な異種蛋白質類の発現にすでに用いられている
（Ｊ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，１９８７，５：４７９）。この発現は、
該酵母の変異株の染色体に存在する発現カセット内で、
ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子がクローニングされた遺
伝子構築体を用い、アルコールオキシダーゼＩプロモー
ターの調節シグナルの下で行なわれる。これにより、メ
タノールの存在下で発現系が活性化されて、産生される
可溶性タンパク質の２〜３％がＨＢｓＡｇであることを
可能にする。しかし、この抗原の精製については何の開
示も無い。サッカロミセス セレビシアエ発現系に対す
るピヒア パストリス発現系の重要な利点は、産生され
る抗原が非常に効率的に組込まれて直径２２ｎｍの粒子
となることにある。これは、サッカロミセス セレビシ
アエでは２４キロダルトンの抗原のうちの少しの部分の
みが組み込まれて粒子となるのに対し、ピヒア パスト
リスでは産生した抗原の実質的に全部が粒子状となるか
らである（Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，１９８２，２９８：３４７；Ｒ．Ａ．Ｈ
ｉｔｚｅｍａｎ ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８３，１１：２７４５；
Ａ．Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａ
ｄｅｍｙ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ，１９８３，
８０：１）。
【０００８】しかしながら、組換えＨＢｓＡｇを原料と
する市販されているワクチン製剤は、サッカロミセス
セレビシアエを抗原供給源としているのが現状である。
また、密度匂配遠心法を包含するところの酵母からのＨ
ＢｓＡｇの最も一般的な精製法［スミス クライン（Ｓ
ｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）によるヨーロッパ特許願第２７
８ ９４０ Ａ３号］は、工業規模で行うには費用がか
かる上に複雑である。
する市販されているワクチン製剤は、サッカロミセス
セレビシアエを抗原供給源としているのが現状である。
また、密度匂配遠心法を包含するところの酵母からのＨ
ＢｓＡｇの最も一般的な精製法［スミス クライン（Ｓ
ｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）によるヨーロッパ特許願第２７
８ ９４０ Ａ３号］は、工業規模で行うには費用がか
かる上に複雑である。
【０００９】フィリップス・ペトロリアム（Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）によるヨーロッパ特許願
第３３７ ４９２号に、ピヒア パストリスの組換え株
からＨＢｓＡｇを取得する方法が記載されている。この
発明の目的はワクチンに直接導入されるに十分の純度で
ＨＢｓＡｇを取得することにあるが、精製後の抗原粒子
の粒子化に関する特性のみならずＨＢｓＡｇがワクチン
に含有された場合のその免疫能についてのいかなる記載
もない。
ｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）によるヨーロッパ特許願
第３３７ ４９２号に、ピヒア パストリスの組換え株
からＨＢｓＡｇを取得する方法が記載されている。この
発明の目的はワクチンに直接導入されるに十分の純度で
ＨＢｓＡｇを取得することにあるが、精製後の抗原粒子
の粒子化に関する特性のみならずＨＢｓＡｇがワクチン
に含有された場合のその免疫能についてのいかなる記載
もない。
【００１０】フィリップス・ペトロリアムの方法は、次
の工程で行われる：カオトロピック塩（Ｃｈａｏｔｒｏ
ｐｉｃ ｓａｌｔ）の存在下で酵母細胞を溶菌し、溶菌
細胞ペレットからＨＢｓＡｇを含有する上清を分離し；
ｐＨ４．５〜５．５において上清から脂質および不純物
蛋白質を沈殿物として除去し；得られた上清を濃縮し次
いで透析濾過し；ＨＢｓＡｇを含有する残留分をシリカ
に接触させた後不純物蛋白質を尿素含有緩衝液（ｐＨ
９．５〜１１．０）により洗浄除去してＨＢｓＡｇを溶
出し；適切な画分を、不純物からＨＢｓＡｇ粒子を分離
するのに十分な排除限界分子量を有する材料によるゲル
濾過にかけ、そして；得られた適切な分画を陰イオン交
換樹脂に接触させ、次いで緩衝液（ｐＨ６〜９）により
樹脂からＨＢｓＡｇ粒子を溶出する。この方法ではカオ
トロピック緩衝液が溶菌および抽出に用いられる。カオ
トロピック緩衝液にはカオトロピック剤としてチオシア
ン酸塩カリウムが、プロテアーゼ阻害剤としてフェニル
メチルスルフォニルフルオライドが含有されており、後
者は非常に有毒であるため、精製工程において完全に除
去しなくてはならない。更に、フェニルメチルスルフォ
ニルフルオライドがプロテアーゼの阻害に有効であるに
しても、その阻害スペクトルは制限されたものである。
更に、この方法ではＨＢｓＡｇを含有する上清を透析濾
過した後得られた画分をシリカに接触させる。シリカか
らＨＢｓＡｇ抗原を分離するために尿素含有緩衝液（ｐ
Ｈ９．５〜１１）を用いるが、尿素は高い変性能を有す
るためこれを用いると生成物の免疫原性が低下してしま
う。
の工程で行われる：カオトロピック塩（Ｃｈａｏｔｒｏ
ｐｉｃ ｓａｌｔ）の存在下で酵母細胞を溶菌し、溶菌
細胞ペレットからＨＢｓＡｇを含有する上清を分離し；
ｐＨ４．５〜５．５において上清から脂質および不純物
蛋白質を沈殿物として除去し；得られた上清を濃縮し次
いで透析濾過し；ＨＢｓＡｇを含有する残留分をシリカ
に接触させた後不純物蛋白質を尿素含有緩衝液（ｐＨ
９．５〜１１．０）により洗浄除去してＨＢｓＡｇを溶
出し；適切な画分を、不純物からＨＢｓＡｇ粒子を分離
するのに十分な排除限界分子量を有する材料によるゲル
濾過にかけ、そして；得られた適切な分画を陰イオン交
換樹脂に接触させ、次いで緩衝液（ｐＨ６〜９）により
樹脂からＨＢｓＡｇ粒子を溶出する。この方法ではカオ
トロピック緩衝液が溶菌および抽出に用いられる。カオ
トロピック緩衝液にはカオトロピック剤としてチオシア
ン酸塩カリウムが、プロテアーゼ阻害剤としてフェニル
メチルスルフォニルフルオライドが含有されており、後
者は非常に有毒であるため、精製工程において完全に除
去しなくてはならない。更に、フェニルメチルスルフォ
ニルフルオライドがプロテアーゼの阻害に有効であるに
しても、その阻害スペクトルは制限されたものである。
更に、この方法ではＨＢｓＡｇを含有する上清を透析濾
過した後得られた画分をシリカに接触させる。シリカか
らＨＢｓＡｇ抗原を分離するために尿素含有緩衝液（ｐ
Ｈ９．５〜１１）を用いるが、尿素は高い変性能を有す
るためこれを用いると生成物の免疫原性が低下してしま
う。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は組換えピヒア
パストリスパストリス株Ｃ２２６〔ｐＴＡＯ９０６〕、
ＣＢＳ４５０．９０由来の非常に均質な粒子状で高い免
疫原性を有する組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原を提供
するものである。本発明は又、組換えＢ型肝炎ウイルス
表面抗原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使用するの
に適した少くとも１種の担体、希釈剤またはアジュバン
ドを包含してなるＢ型肝炎ウイルスワクチン組成物を提
供する。
パストリスパストリス株Ｃ２２６〔ｐＴＡＯ９０６〕、
ＣＢＳ４５０．９０由来の非常に均質な粒子状で高い免
疫原性を有する組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原を提供
するものである。本発明は又、組換えＢ型肝炎ウイルス
表面抗原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使用するの
に適した少くとも１種の担体、希釈剤またはアジュバン
ドを包含してなるＢ型肝炎ウイルスワクチン組成物を提
供する。
【００１２】 本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルス表面
抗原をコードする遺伝子を含有しそして該遺伝子を発現
してなる組換えピヒア パストリス株Ｃ２２６〔ｐＴＡ
Ｏ９０６〕、ＣＢＳ４５０.９０から取得される組換え
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原は、 （１）カオトロピック剤、スクロースおよびエチレンジ
アミン四酢酸を含む緩衝液の存在下で上記ピヒア パス
トリス細胞を溶菌し、 （２）不純物を酸性ｐＨ領域で沈殿させて粗抗原を得、 （３）該粗抗原を酸性下でケイソウ土塊に吸着させ、次
にアルカリ性下で脱着し、 （４）脱着された粗抗原をＢ型肝炎ウイルス表面抗原に
特異的なモノクローナル抗体を用いるイミュノアフィニ
ティークロマトグラフィーにかけ、 （５）得られる溶出抗原を３０〜４０℃の温度での熱処
理にかけ、 （６）陰イオン交換カラムで抗原を洗剤により洗浄し、
そして （７）得られる溶出抗原を洗剤の存在下で分画分子量２
０，０００〜１０，０００，０００の高速液体クロマト
グラフィーにかける、 上述の（１）〜（７）を包含する方法により得ることの
できる分子量範囲が２０，０００〜１０，０００，００
０の組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原である。
抗原をコードする遺伝子を含有しそして該遺伝子を発現
してなる組換えピヒア パストリス株Ｃ２２６〔ｐＴＡ
Ｏ９０６〕、ＣＢＳ４５０.９０から取得される組換え
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原は、 （１）カオトロピック剤、スクロースおよびエチレンジ
アミン四酢酸を含む緩衝液の存在下で上記ピヒア パス
トリス細胞を溶菌し、 （２）不純物を酸性ｐＨ領域で沈殿させて粗抗原を得、 （３）該粗抗原を酸性下でケイソウ土塊に吸着させ、次
にアルカリ性下で脱着し、 （４）脱着された粗抗原をＢ型肝炎ウイルス表面抗原に
特異的なモノクローナル抗体を用いるイミュノアフィニ
ティークロマトグラフィーにかけ、 （５）得られる溶出抗原を３０〜４０℃の温度での熱処
理にかけ、 （６）陰イオン交換カラムで抗原を洗剤により洗浄し、
そして （７）得られる溶出抗原を洗剤の存在下で分画分子量２
０，０００〜１０，０００，０００の高速液体クロマト
グラフィーにかける、 上述の（１）〜（７）を包含する方法により得ることの
できる分子量範囲が２０，０００〜１０，０００，００
０の組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原である。
【００１３】本発明によれば、工程（１）でのピヒア
パストリス細胞の溶菌は、チオシアン酸カリウム、スク
ロース、エチレンジアミン四酢酸、トリス及び食塩を包
含してなる緩衝液の存在下で行われる。好ましくはピヒ
ア パストリス細胞の溶菌は１〜４Ｍチオシアン酸カリ
ウム、１〜１５（ｗ／ｖ）％スクロース、２．５〜３．
５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０〜３０ｍＭトリス
及び０．１〜１Ｍ食塩、更に好ましくは、２９１ｇ／ｌ
のチオシアン酸カリウム、１００ｇ／ｌのスクロース、
１．８６ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸、１２ｇ／ｌ
のトリス及び１７．５ｇ／ｌの食塩を包含してなる緩衝
液の存在下で行われる。
パストリス細胞の溶菌は、チオシアン酸カリウム、スク
ロース、エチレンジアミン四酢酸、トリス及び食塩を包
含してなる緩衝液の存在下で行われる。好ましくはピヒ
ア パストリス細胞の溶菌は１〜４Ｍチオシアン酸カリ
ウム、１〜１５（ｗ／ｖ）％スクロース、２．５〜３．
５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０〜３０ｍＭトリス
及び０．１〜１Ｍ食塩、更に好ましくは、２９１ｇ／ｌ
のチオシアン酸カリウム、１００ｇ／ｌのスクロース、
１．８６ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸、１２ｇ／ｌ
のトリス及び１７．５ｇ／ｌの食塩を包含してなる緩衝
液の存在下で行われる。
【００１４】本発明によれば、工程（２）での酸性下で
不純物の沈殿はｐＨ３〜４の条件下で行われる。所望な
ら工程（２）での酸性下で生成する不純物の沈殿を除去
した後得られる粗抗原をｐＨ７〜８にて貯蔵することも
可能である。
不純物の沈殿はｐＨ３〜４の条件下で行われる。所望な
ら工程（２）での酸性下で生成する不純物の沈殿を除去
した後得られる粗抗原をｐＨ７〜８にて貯蔵することも
可能である。
【００１５】好ましくは工程（２）での酸性下で生成す
る不純物の沈殿を除去した後得られる粗抗原を工程
（３）にてｐＨ３〜５の酸性下でケイソウ土塊に吸着さ
せ、不純物をｐＨ３〜５の溶出用緩衝液で洗浄除去し、
次いで該抗原をｐＨ７．５〜９．０のアルカリ性下でケ
イソウ土塊から脱着する。所望ならケイソウ土塊から脱
着される粗抗原は通常行われる濃縮化や脱塩処理、例え
ば限外濾過による濃縮や透析濾過による脱塩を行うこと
ができる。
る不純物の沈殿を除去した後得られる粗抗原を工程
（３）にてｐＨ３〜５の酸性下でケイソウ土塊に吸着さ
せ、不純物をｐＨ３〜５の溶出用緩衝液で洗浄除去し、
次いで該抗原をｐＨ７．５〜９．０のアルカリ性下でケ
イソウ土塊から脱着する。所望ならケイソウ土塊から脱
着される粗抗原は通常行われる濃縮化や脱塩処理、例え
ば限外濾過による濃縮や透析濾過による脱塩を行うこと
ができる。
【００１６】本発明によれば工程（４）での粗抗原のイ
ミュノアフィニティークロマトグラフィーに用いられる
モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ９
０１１２ ６０６によって産生される抗ＨＢｓＡｇ Ｃ
Ｂ−ＨＥＰ１であることが望ましい。イミュノアフィニ
ティークロマトグラフィーカラムからの該抗原の溶離は
カオトロピック剤を含む緩衝液で行うのが好ましい。
ミュノアフィニティークロマトグラフィーに用いられる
モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ９
０１１２ ６０６によって産生される抗ＨＢｓＡｇ Ｃ
Ｂ−ＨＥＰ１であることが望ましい。イミュノアフィニ
ティークロマトグラフィーカラムからの該抗原の溶離は
カオトロピック剤を含む緩衝液で行うのが好ましい。
【００１７】本発明によれば、工程（５）での溶出抗原
の３０〜４０℃の温度での熱処理を１〜６時間行うこと
が望ましい。加熱処理後該抗原を工程（６）において好
ましくはＤＥＡＥセルロースカラムでデオキシコール酸
ナトリウムやトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘー１００のよ
うな洗剤で洗浄する。使用される洗剤濃度は０．０１〜
０．５重量％、好ましくは０．０５〜０．１重量％であ
る。次いで該抗原を溶出する。
の３０〜４０℃の温度での熱処理を１〜６時間行うこと
が望ましい。加熱処理後該抗原を工程（６）において好
ましくはＤＥＡＥセルロースカラムでデオキシコール酸
ナトリウムやトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘー１００のよ
うな洗剤で洗浄する。使用される洗剤濃度は０．０１〜
０．５重量％、好ましくは０．０５〜０．１重量％であ
る。次いで該抗原を溶出する。
【００１８】溶出抗原をその後好ましくは工程（７）に
おいて洗剤の存在下で分画分子量２０，０００〜１０，
０００，０００の高速液体クロマトグラフィーにかけ
る。使用される洗剤は、デオキシコール酸ナトリウムが
好ましい。使用される洗剤濃度は０．０１〜０．５重量
％、好ましくは約０．０５重量％である。
おいて洗剤の存在下で分画分子量２０，０００〜１０，
０００，０００の高速液体クロマトグラフィーにかけ
る。使用される洗剤は、デオキシコール酸ナトリウムが
好ましい。使用される洗剤濃度は０．０１〜０．５重量
％、好ましくは約０．０５重量％である。
【００１９】本発明によればＢ型肝炎ウイルス表面抗原
は組換えピヒア パストリス株Ｃ２２６［ｐＴＡＯ９０
６］、ＣＢＳ４５０．９０から回収されるのが望まし
い。本発明は又、次のものを開示する。即ち、組換えピ
ヒア パストリス株Ｃ２２６［ｐＴＡＯ９０６］、ＣＢ
Ｓ４５０．９０；ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ９０
１１２ ６０６；ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ ９０
１１２ ６０６により産生されるモノクローナル抗体
抗ＨＢｓＡｇ ＣＢ−ＨＥＰ１；そして、本発明に基づ
くプロセスにより得られる組換えＢ型肝炎ウイルス表面
抗原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使用するのに適
した少くとも１種の担体、稀釈剤またはアジュバントと
を包含してなるワクチン組成物を適切な回数投与するこ
とからなるＢ型肝炎ウイルスに対する人間または動物の
予防接種方法を開示する。本発明は、次のものを提供す
る。即ち、上記プロセスで得られる組換えＢ型肝炎ウイ
ルス表面抗原；及び、該組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗
原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使用するのに適し
た少くとも１種の担体、稀釈剤またはアジュバントとを
包含してなるＢ型肝炎ウイルスに対する免疫用ワクチン
組成物を提供する。
は組換えピヒア パストリス株Ｃ２２６［ｐＴＡＯ９０
６］、ＣＢＳ４５０．９０から回収されるのが望まし
い。本発明は又、次のものを開示する。即ち、組換えピ
ヒア パストリス株Ｃ２２６［ｐＴＡＯ９０６］、ＣＢ
Ｓ４５０．９０；ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ９０
１１２ ６０６；ハイブリドーマ細胞ＥＣＡＣＣ ９０
１１２ ６０６により産生されるモノクローナル抗体
抗ＨＢｓＡｇ ＣＢ−ＨＥＰ１；そして、本発明に基づ
くプロセスにより得られる組換えＢ型肝炎ウイルス表面
抗原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使用するのに適
した少くとも１種の担体、稀釈剤またはアジュバントと
を包含してなるワクチン組成物を適切な回数投与するこ
とからなるＢ型肝炎ウイルスに対する人間または動物の
予防接種方法を開示する。本発明は、次のものを提供す
る。即ち、上記プロセスで得られる組換えＢ型肝炎ウイ
ルス表面抗原；及び、該組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗
原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使用するのに適し
た少くとも１種の担体、稀釈剤またはアジュバントとを
包含してなるＢ型肝炎ウイルスに対する免疫用ワクチン
組成物を提供する。
【００２０】本発明を更に詳細に説明する。本発明の方
法の第１ステップはＥＤＴＡ、トリス、食塩、ショ糖及
びチオシアン酸カリウムを含む緩衝液で細胞を溶解させ
ることである。ＥＤＴＡは広い阻害スペクトルを有する
プロテアーゼ阻害剤であり、基本的に生物適合物質であ
るため、この段階におけるその存在は重要である。スク
ロースは分子の半減期および立体配座を維持する。チオ
シアン酸カリウムは通常のカオトロピック剤であり、他
のもので代替可能である。
法の第１ステップはＥＤＴＡ、トリス、食塩、ショ糖及
びチオシアン酸カリウムを含む緩衝液で細胞を溶解させ
ることである。ＥＤＴＡは広い阻害スペクトルを有する
プロテアーゼ阻害剤であり、基本的に生物適合物質であ
るため、この段階におけるその存在は重要である。スク
ロースは分子の半減期および立体配座を維持する。チオ
シアン酸カリウムは通常のカオトロピック剤であり、他
のもので代替可能である。
【００２１】細胞の破砕の後、破砕断片の分離はｐＨ３
〜４の酸性領域において、不純物蛋白質類の酸性下での
沈殿と同時に行なう。この操作により精製工程のステッ
プ数を減少させることができ、同時に高い純度（抗原１
０％以上）の物質から出発して精製を始めることがで
き、回収率も向上する。更にこの操作により不純物とし
て共存する脂質、炭水化物やＤＮＡが除去できる。遠心
分離の後、抗原を含む上清はｐＨ７〜８にて貯蔵可能で
ある。精製を更に続けるために粗抗原のｐＨを３〜５に
再度低下させ、そして粗抗原をセライト（Ｃｅｌｉｔ
ｅ）塊に接触させに抗原を吸着させる。セライト塊をト
リス塩酸、チオシアン酸カリウム、スクロースとＥＤＴ
Ａを含むｐＨ３〜５の緩衝液で洗浄し、炭水化物、脂質
やＤＮＡのような共存不純物を除去する。抗原はセライ
ト塊からｐＨ７.５〜９.０の緩衝液を用いてｐＨを変化
することにより回収される。このステップにおいて抗原
は温和な条件下で溶離されるため、変性や抗原としての
特異性を失うことなく４０〜５０％の純度で回収でき
る。
〜４の酸性領域において、不純物蛋白質類の酸性下での
沈殿と同時に行なう。この操作により精製工程のステッ
プ数を減少させることができ、同時に高い純度（抗原１
０％以上）の物質から出発して精製を始めることがで
き、回収率も向上する。更にこの操作により不純物とし
て共存する脂質、炭水化物やＤＮＡが除去できる。遠心
分離の後、抗原を含む上清はｐＨ７〜８にて貯蔵可能で
ある。精製を更に続けるために粗抗原のｐＨを３〜５に
再度低下させ、そして粗抗原をセライト（Ｃｅｌｉｔ
ｅ）塊に接触させに抗原を吸着させる。セライト塊をト
リス塩酸、チオシアン酸カリウム、スクロースとＥＤＴ
Ａを含むｐＨ３〜５の緩衝液で洗浄し、炭水化物、脂質
やＤＮＡのような共存不純物を除去する。抗原はセライ
ト塊からｐＨ７.５〜９.０の緩衝液を用いてｐＨを変化
することにより回収される。このステップにおいて抗原
は温和な条件下で溶離されるため、変性や抗原としての
特異性を失うことなく４０〜５０％の純度で回収でき
る。
【００２２】セライト塊から脱着された抗原を含む溶離
液を０.１μｍのポアサイズの膜を用いる限外濾過によ
り３０〜４０倍位まで濃縮し、次いで得られた粗抗原は
３倍量の適切な緩衝液（トリス塩酸、ＥＤＴＡ、ｐＨ７
〜８）を用いて透析濾過し、そして抗原粒子の選別に特
別にスクリーニングされたモノクローナル抗体を用いる
イミュノアフィニティークロマトグラフィーにかける。
これらのモノクローナル抗体を用いると抗原活性を低下
させるような処理法をさけることができ、そしてチンパ
ンジーで実証されているように特定の免疫原性を有する
特異エピトープが識別される（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎ
ｓ，Ｈ；Ｄｅ Ｒｅｕｓ，Ａ；Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓ，
Ｊ．Ｈ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｅｅｒｄ，Ｐ．Ａ．Ｃ．Ｍ．
Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ，１９８７，６３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
（２），ｐ．９３−９６）。上記のステップで得られる
ＨＢｓＡｇを含む画分をトリス塩酸、リン酸カリウム又
はリン酸ナトリウムを含むｐＨ６〜７の適切な緩衝液に
て平衡化したアフィニティカラムに通す。この際流速は
２５〜５０ｃｍ／ｈである。カラム中の非吸着物質（不
純物質）は１Ｍの食塩を更に加えたカラムの平衡化に用
いた同緩衝液を用いて洗い出される。抗原は１〜３Ｍの
範囲でチオシアン酸カリウムを含むトリス塩酸又はリン
酸塩のような緩衝液を用いてカラムから回収される。こ
のステップから得られる抗原の純度は８５％以上であ
る。
液を０.１μｍのポアサイズの膜を用いる限外濾過によ
り３０〜４０倍位まで濃縮し、次いで得られた粗抗原は
３倍量の適切な緩衝液（トリス塩酸、ＥＤＴＡ、ｐＨ７
〜８）を用いて透析濾過し、そして抗原粒子の選別に特
別にスクリーニングされたモノクローナル抗体を用いる
イミュノアフィニティークロマトグラフィーにかける。
これらのモノクローナル抗体を用いると抗原活性を低下
させるような処理法をさけることができ、そしてチンパ
ンジーで実証されているように特定の免疫原性を有する
特異エピトープが識別される（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎ
ｓ，Ｈ；Ｄｅ Ｒｅｕｓ，Ａ；Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓ，
Ｊ．Ｈ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｅｅｒｄ，Ｐ．Ａ．Ｃ．Ｍ．
Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ，１９８７，６３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
（２），ｐ．９３−９６）。上記のステップで得られる
ＨＢｓＡｇを含む画分をトリス塩酸、リン酸カリウム又
はリン酸ナトリウムを含むｐＨ６〜７の適切な緩衝液に
て平衡化したアフィニティカラムに通す。この際流速は
２５〜５０ｃｍ／ｈである。カラム中の非吸着物質（不
純物質）は１Ｍの食塩を更に加えたカラムの平衡化に用
いた同緩衝液を用いて洗い出される。抗原は１〜３Ｍの
範囲でチオシアン酸カリウムを含むトリス塩酸又はリン
酸塩のような緩衝液を用いてカラムから回収される。こ
のステップから得られる抗原の純度は８５％以上であ
る。
【００２３】本発明方法の更に新規なステップは、前の
ステップで得られた抗原を含む溶出液を次いで３０〜４
０℃好ましくは３７℃にて１〜６時間加熱処理すること
である。このステップにより２２ｎｍの均質な粒子を高
収率で回収でき、この粒子は高い免疫原性を示す。特に
この事実はＤＥＡＥセルロースでのイオン交換を行う次
のステップで明らかとなる。即ちこのステップでこれら
の粒子は１７５ｍＭ食塩にて明確なピークとして溶出さ
れ、この画分は低い抗原性を有する粒子状物質を含む残
留画分と異なるものである。
ステップで得られた抗原を含む溶出液を次いで３０〜４
０℃好ましくは３７℃にて１〜６時間加熱処理すること
である。このステップにより２２ｎｍの均質な粒子を高
収率で回収でき、この粒子は高い免疫原性を示す。特に
この事実はＤＥＡＥセルロースでのイオン交換を行う次
のステップで明らかとなる。即ちこのステップでこれら
の粒子は１７５ｍＭ食塩にて明確なピークとして溶出さ
れ、この画分は低い抗原性を有する粒子状物質を含む残
留画分と異なるものである。
【００２４】抗原を含む溶出画分を次いで適切なｐＨ７
〜７.５の緩衝液（トリス塩酸又はリン酸塩緩衝液）を
用いゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩する。次い
でこの物質をＤＥＡＥセルロースのようなイオン交換カ
ラムに流し、この樹脂を、１０〜５０ｍＭの範囲の異な
った濃度の食塩と、０．０１〜０．５重量％好ましくは
０．０５〜０．１％の範囲内の異なった濃度のデオキシ
コール酸ナトリウムやトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１
００のような洗剤を含む洗浄液で洗う。これらの洗浄に
より共存するＤＮＡやエンドトキシンの除去が確実に行
なえる。抗原を１５０〜２００ｍＭの食塩とチオシアン
酸カリウムを含む溶液を用いカラムから回収する。この
抗原液にはＤＮＡが全く含まれず、純度は９５％以上で
ある。
〜７.５の緩衝液（トリス塩酸又はリン酸塩緩衝液）を
用いゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩する。次い
でこの物質をＤＥＡＥセルロースのようなイオン交換カ
ラムに流し、この樹脂を、１０〜５０ｍＭの範囲の異な
った濃度の食塩と、０．０１〜０．５重量％好ましくは
０．０５〜０．１％の範囲内の異なった濃度のデオキシ
コール酸ナトリウムやトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１
００のような洗剤を含む洗浄液で洗う。これらの洗浄に
より共存するＤＮＡやエンドトキシンの除去が確実に行
なえる。抗原を１５０〜２００ｍＭの食塩とチオシアン
酸カリウムを含む溶液を用いカラムから回収する。この
抗原液にはＤＮＡが全く含まれず、純度は９５％以上で
ある。
【００２５】溶出抗原を分画分子量１００，０００ダル
トンの膜を用いて蛋白質濃度が１〜３ｍｇ／ｍｌの範囲
になるまで限外濾過にて濃縮を行なう。デオキシコール
酸ナトリウムのような洗剤を粗抗原に０．０５％の濃度
になるように加え、そして濃縮液を分画分子量２０，０
００〜１０，０００，０００ダルトンの高分離能ゲル濾
過クロマトグラフィー（ＰＷ ５０００又はＰＷ ６０
００）にかける。カラムを０．０５％デオキシコール酸
ナトリウムを含む緩衝液で平衡化する。工程中洗剤の存
在により抗原中のエンドトキシン含量は抗原１μｇ当り
０．４ｎｇ以下に低下し、所望でない粒子状画分の選別
が可能となる。
トンの膜を用いて蛋白質濃度が１〜３ｍｇ／ｍｌの範囲
になるまで限外濾過にて濃縮を行なう。デオキシコール
酸ナトリウムのような洗剤を粗抗原に０．０５％の濃度
になるように加え、そして濃縮液を分画分子量２０，０
００〜１０，０００，０００ダルトンの高分離能ゲル濾
過クロマトグラフィー（ＰＷ ５０００又はＰＷ ６０
００）にかける。カラムを０．０５％デオキシコール酸
ナトリウムを含む緩衝液で平衡化する。工程中洗剤の存
在により抗原中のエンドトキシン含量は抗原１μｇ当り
０．４ｎｇ以下に低下し、所望でない粒子状画分の選別
が可能となる。
【００２６】得られた抗原を再度適切な緩衝液を用いて
ゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩し、次いでワク
チン組成物として用いるために水酸化アルミニウムゲル
をアジュバントとして添加する。ここに開示した方法に
基づき得られるワクチン組成物の卓越した免疫原性は厳
密な二重盲検法に従って行なわれる制御された前臨床試
験の結果から証明される。 本発明の方法により、人体
用として入手可能な同質の免疫原性を有する優れた品質
のワクチン製剤を得ることができる。
ゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩し、次いでワク
チン組成物として用いるために水酸化アルミニウムゲル
をアジュバントとして添加する。ここに開示した方法に
基づき得られるワクチン組成物の卓越した免疫原性は厳
密な二重盲検法に従って行なわれる制御された前臨床試
験の結果から証明される。 本発明の方法により、人体
用として入手可能な同質の免疫原性を有する優れた品質
のワクチン製剤を得ることができる。
【００２７】以下、本発明について実施例を挙げて説明
する。但し、本発明は以下の実施例にのみ限定されるも
のではない。
する。但し、本発明は以下の実施例にのみ限定されるも
のではない。
【００２８】
【実施例】実施例１ Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子を得るため、該ウイル
スＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に
クローニングした。ウイルスゲノムは、同ウイルスの無
症候性キャリアの血清から単離精製したデーン粒子（Ｄ
ａｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）より報文(Ｐ．Ｖａｌｅ
ｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９
７９， ２８０：８１５）と同様の方法によって取得し
た。得られたプラスミド(ｐＨＢＳＩと称する)を制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｐａｌで消化し、得られた断片をＴａ
ｑＩで消化し、この部位にＥｃｏＲＩリンカー(５’Ｇ
ＧＡＡＴＴＣＣ ３’)を連結して、ｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＩ部位にサブロクーニングした。得られたプラス
ミドをｐＨＢ３２と称し、このプラスミドをＥｃｏＲＩ
で消化し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによりＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む断片を得た。
スＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に
クローニングした。ウイルスゲノムは、同ウイルスの無
症候性キャリアの血清から単離精製したデーン粒子（Ｄ
ａｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）より報文(Ｐ．Ｖａｌｅ
ｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９
７９， ２８０：８１５）と同様の方法によって取得し
た。得られたプラスミド(ｐＨＢＳＩと称する)を制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｐａｌで消化し、得られた断片をＴａ
ｑＩで消化し、この部位にＥｃｏＲＩリンカー(５’Ｇ
ＧＡＡＴＴＣＣ ３’)を連結して、ｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＩ部位にサブロクーニングした。得られたプラス
ミドをｐＨＢ３２と称し、このプラスミドをＥｃｏＲＩ
で消化し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによりＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む断片を得た。
【００２９】この断片を、あらかじめＮｃｏＩで開環し
Ｓ１ヌクレアーゼとアルカリホスファターゼで処理して
おいたｐＢＳ５(図1参照)にサブクローニングした。得
られたプラスミドをｐＰＣＳＡ３(図2参照)と称し、こ
こから、目的の遺伝子を挾む5'末端(２５ｂｐ)と3'末端
(１２５ｂｐ)の該ウイルスのノンコーディング領域を標
準反応条件に従いＰＣＲ法で除去した(Ｒ． Ｋ． Ｓ
ａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８
５ ２３０：１３５０)。下記の配列を有する2つの合成
オリゴヌクレオチド: 5' 領域 : 5' GCCATGGAGAACATCACAT 3' (配列番号:1) 3' 領域 : 3' GACCCATATGTAAATTTGCAGCTGG 5' (配列番号:2) を用いて、目的の遺伝子の5'末端と3'末端にＮｃｏＩ切
断部位とSalI切断部位をそれぞれ設けた。これにより、
目的の遺伝子の取扱が容易になり、また、増幅された断
片の上記の制限酵素による消化によってノンコーディン
グ領域を除去できるようになった。得られた正確なＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む６７８ｂｐの断片をプラスミドｐＢ
Ｓ５にサブクローニングした。こうして得られたプラス
ミド[ｐＰＣＢ６と称する(図3参照)]においては、上記
の遺伝子がサッカロミセス セレビシエの酵素グリセル
アルデヒド 3-ホスフェート デヒドロゲナーゼ（ＧＡ
Ｐ）遺伝子の転写制御シグナルの支配下にある。
Ｓ１ヌクレアーゼとアルカリホスファターゼで処理して
おいたｐＢＳ５(図1参照)にサブクローニングした。得
られたプラスミドをｐＰＣＳＡ３(図2参照)と称し、こ
こから、目的の遺伝子を挾む5'末端(２５ｂｐ)と3'末端
(１２５ｂｐ)の該ウイルスのノンコーディング領域を標
準反応条件に従いＰＣＲ法で除去した(Ｒ． Ｋ． Ｓ
ａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８
５ ２３０：１３５０)。下記の配列を有する2つの合成
オリゴヌクレオチド: 5' 領域 : 5' GCCATGGAGAACATCACAT 3' (配列番号:1) 3' 領域 : 3' GACCCATATGTAAATTTGCAGCTGG 5' (配列番号:2) を用いて、目的の遺伝子の5'末端と3'末端にＮｃｏＩ切
断部位とSalI切断部位をそれぞれ設けた。これにより、
目的の遺伝子の取扱が容易になり、また、増幅された断
片の上記の制限酵素による消化によってノンコーディン
グ領域を除去できるようになった。得られた正確なＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む６７８ｂｐの断片をプラスミドｐＢ
Ｓ５にサブクローニングした。こうして得られたプラス
ミド[ｐＰＣＢ６と称する(図3参照)]においては、上記
の遺伝子がサッカロミセス セレビシエの酵素グリセル
アルデヒド 3-ホスフェート デヒドロゲナーゼ（ＧＡ
Ｐ）遺伝子の転写制御シグナルの支配下にある。
【００３０】ピヒア パストリスの遺伝子ライブラリー
由来のプラスミドｐＣＡＯ１０(図4参照)から、酵素Ａ
ＯＸ1遺伝子のプロモーターとノンコーデング5'領域を
含む１．１ｋｂの断片を抽出した。この断片をプラスミ
ドＰＢＲ３２２にサブクローニングして得たプラスミド
ｐＰＡＯ２３(図5参照)を用いてＰＣＲを行ない、酵素
ＡＯＸ１の構造遺伝子からこの蛋白質の最初の6個のア
ミノ酸をコードするコドンに対応する１８ｂｐの塩基配
列を除去した。用いた２つの合成オリゴヌクレオチドは
次のものである。 5' 領域 : 5' GTATCACGAGGCCCT 3' (配列番号:3) 3' 領域 : 3' TTGATTAATAAGCTTTGGTACCGC 5' （配列番号:4)
由来のプラスミドｐＣＡＯ１０(図4参照)から、酵素Ａ
ＯＸ1遺伝子のプロモーターとノンコーデング5'領域を
含む１．１ｋｂの断片を抽出した。この断片をプラスミ
ドＰＢＲ３２２にサブクローニングして得たプラスミド
ｐＰＡＯ２３(図5参照)を用いてＰＣＲを行ない、酵素
ＡＯＸ１の構造遺伝子からこの蛋白質の最初の6個のア
ミノ酸をコードするコドンに対応する１８ｂｐの塩基配
列を除去した。用いた２つの合成オリゴヌクレオチドは
次のものである。 5' 領域 : 5' GTATCACGAGGCCCT 3' (配列番号:3) 3' 領域 : 3' TTGATTAATAAGCTTTGGTACCGC 5' （配列番号:4)
【００３１】3'領域のオリゴヌクレオチドによって、酵
素ＡＯＸ１の構造遺伝子の１８ｂｐの配列を除去してＨ
ＢｓＡｇ遺伝子への正確な結合を達成するための、酵素
ＡＯＸ１遺伝子のプロモーターの3'領域にＮｃｏＩ部位
を設けることができる。また、5'領域のオリゴヌクレオ
チドによってＰＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位が維持でき
る。
素ＡＯＸ１の構造遺伝子の１８ｂｐの配列を除去してＨ
ＢｓＡｇ遺伝子への正確な結合を達成するための、酵素
ＡＯＸ１遺伝子のプロモーターの3'領域にＮｃｏＩ部位
を設けることができる。また、5'領域のオリゴヌクレオ
チドによってＰＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位が維持でき
る。
【００３２】増幅された１１１５ｂｐの断片はプラスミ
ドｐＵＣ１９にサブクローニングされ、これにより、ピ
ヒア パストリスの酵素ＡＯＸ１遺伝子の完全なプロモ
ーターを含むプラスミドｐＭＡＯ１０７が得られた(図6
参照)。
ドｐＵＣ１９にサブクローニングされ、これにより、ピ
ヒア パストリスの酵素ＡＯＸ１遺伝子の完全なプロモ
ーターを含むプラスミドｐＭＡＯ１０７が得られた(図6
参照)。
【００３３】ＨＢｓＡｇの正確な遺伝子を酵素ＡＯＸ１
の完全なプローモーターの支配下にサブクローニングす
ることにより最終統合ベクターを得た(図7参照)。得ら
れたクローン(ｐＨＡＯ１１２と称する)はＡＯＸ１プロ
モーターの制御シグナル及びサッカロミセス セレビシ
エのＧＡＰ遺伝子の終止シグナルの支配下にある上記遺
伝子を含んでおり、さらに、酵母との相同的組換えに必
要なピヒア パストリスの染色体ＤＮＡの領域も有して
いる。このプラスミドをＳ１ヌクレアーゼで部分消化処
理してＨＢｓＡｇ遺伝子の3'末端と酵素グリセルアルデ
ヒド 3-ホスフェート デヒドロゲナーゼのターミネータ
ーとの間に位置するＳａｌＩ部位を破壊した。得られた
クローンをｐＳＡＯ５０３(図8参照)と称し、この中
に、酵素ＡＯＸ１の構造遺伝子の断片及びそれと隣りあ
うノンコーディング3'領域を含むプラスミドｐＣＡＯ１
０由来の２．４ｋｂの断片をサブクローニングした。得
られたプラスミドをｐＶＡＯ７２１と称し(図8参照)、
これにサッカロミセス セレビシエのｈｉｓ３遺伝子を
含む１．８ｋｂの断片をプラスミドｐＰＭＣ(図9参照)
からクローニングした。
の完全なプローモーターの支配下にサブクローニングす
ることにより最終統合ベクターを得た(図7参照)。得ら
れたクローン(ｐＨＡＯ１１２と称する)はＡＯＸ１プロ
モーターの制御シグナル及びサッカロミセス セレビシ
エのＧＡＰ遺伝子の終止シグナルの支配下にある上記遺
伝子を含んでおり、さらに、酵母との相同的組換えに必
要なピヒア パストリスの染色体ＤＮＡの領域も有して
いる。このプラスミドをＳ１ヌクレアーゼで部分消化処
理してＨＢｓＡｇ遺伝子の3'末端と酵素グリセルアルデ
ヒド 3-ホスフェート デヒドロゲナーゼのターミネータ
ーとの間に位置するＳａｌＩ部位を破壊した。得られた
クローンをｐＳＡＯ５０３(図8参照)と称し、この中
に、酵素ＡＯＸ１の構造遺伝子の断片及びそれと隣りあ
うノンコーディング3'領域を含むプラスミドｐＣＡＯ１
０由来の２．４ｋｂの断片をサブクローニングした。得
られたプラスミドをｐＶＡＯ７２１と称し(図8参照)、
これにサッカロミセス セレビシエのｈｉｓ３遺伝子を
含む１．８ｋｂの断片をプラスミドｐＰＭＣ(図9参照)
からクローニングした。
【００３４】得られたクローンをｐＴＡＯ９０６と称し
(図10参照)、最終統合プラスミドとしてピヒア パスト
リスＭＰ３６株(欧州特許公開EP-A 0 438 200号)の形質
転換に用いた。形質転換体のうち遺伝子統合の明確なパ
ターンを示すものを用いて遺伝子発現による抗原生産レ
ベルの評価を行った。抗原生産用に選択した株をＣ２２
６と称した。
(図10参照)、最終統合プラスミドとしてピヒア パスト
リスＭＰ３６株(欧州特許公開EP-A 0 438 200号)の形質
転換に用いた。形質転換体のうち遺伝子統合の明確なパ
ターンを示すものを用いて遺伝子発現による抗原生産レ
ベルの評価を行った。抗原生産用に選択した株をＣ２２
６と称した。
【００３５】ピヒア パストリスＣ２２６[ｐＴＡＯ９
０６]は、1990年10月22日、オランダ国バーン市所在の
セントラルビューロー フォルスキメルカルチャース
〔Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｒ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉ
ｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）〕にブタペスト条
約に基づき寄託され、寄託番号CBS450.90を与えられ
た。た。
０６]は、1990年10月22日、オランダ国バーン市所在の
セントラルビューロー フォルスキメルカルチャース
〔Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｒ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉ
ｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）〕にブタペスト条
約に基づき寄託され、寄託番号CBS450.90を与えられ
た。た。
【００３６】実施例２ ＨＢｓＡｇを合成するため、形質転換体Ｃ２２６の前接
種段階の培養を以下の組成の生理食塩水培地で行なう： K2HPO4 - 5 g/1 MgSO4 - 4.6 g/1 NH4SO4 - 22 g/1 CaC12 - 0.5 g/1 グリセロール - 20ml/1 ビタミン類 200 × - 10ml/1 微量元素 200 × - 5ml/1 培養は30℃、pH4.5、通気及び撹拌条件下で、酸素分圧
が飽和値の30%を超えるようにして行なう。培養時間は1
0から12時間とする。接種段階では生理食塩水倍地を以
下の組成の富栄養培地にとり換える。 酵母抽出物 1% ペプトン 2% グリセロール 2% 微量元素 200 × - 10ml/1 ビタミン類 200 × - 5 ml/1
種段階の培養を以下の組成の生理食塩水培地で行なう： K2HPO4 - 5 g/1 MgSO4 - 4.6 g/1 NH4SO4 - 22 g/1 CaC12 - 0.5 g/1 グリセロール - 20ml/1 ビタミン類 200 × - 10ml/1 微量元素 200 × - 5ml/1 培養は30℃、pH4.5、通気及び撹拌条件下で、酸素分圧
が飽和値の30%を超えるようにして行なう。培養時間は1
0から12時間とする。接種段階では生理食塩水倍地を以
下の組成の富栄養培地にとり換える。 酵母抽出物 1% ペプトン 2% グリセロール 2% 微量元素 200 × - 10ml/1 ビタミン類 200 × - 5 ml/1
【００３７】培養は前記条件で10から12時間かけて、細
胞濃度が10から12g/l(乾燥基準)に達するまで行ない、
さらに、培養物を上記と同様の富栄養培地に接種して上
記と同様の温度とpH条件で培養を行なう。培養は8から1
0時間かけて細胞濃度が10から12g/l(乾燥基準)に達する
まで行なう。遺伝子発現による抗原の産生を誘導するた
めに、この時点からメタノールを連続的に添加しはじめ
る。90から100時間の培養で産生した抗原は総蛋白質の
およそ3%に達する。メタノールの添加量は培地中の細胞
濃度の増加に従って間隔を置いて増加させる。この後、
以下の組成を有する富栄養培地によって培養物を増し始
める： 酵母抽出物 3% ペプトン 6%
胞濃度が10から12g/l(乾燥基準)に達するまで行ない、
さらに、培養物を上記と同様の富栄養培地に接種して上
記と同様の温度とpH条件で培養を行なう。培養は8から1
0時間かけて細胞濃度が10から12g/l(乾燥基準)に達する
まで行なう。遺伝子発現による抗原の産生を誘導するた
めに、この時点からメタノールを連続的に添加しはじめ
る。90から100時間の培養で産生した抗原は総蛋白質の
およそ3%に達する。メタノールの添加量は培地中の細胞
濃度の増加に従って間隔を置いて増加させる。この後、
以下の組成を有する富栄養培地によって培養物を増し始
める： 酵母抽出物 3% ペプトン 6%
【００３８】この増加は180から200時間続く培養の最後
まで維持され、比成長率は5倍になり、発現レベルが上
昇する。この方法によって得られるもう一つの結果は、
このようにして生産された蛋白質は80%以上可溶な状態
に維持されることであり、この要素は以後の精製段階の
効率向上と抗原の粒子状化の向上を促す。
まで維持され、比成長率は5倍になり、発現レベルが上
昇する。この方法によって得られるもう一つの結果は、
このようにして生産された蛋白質は80%以上可溶な状態
に維持されることであり、この要素は以後の精製段階の
効率向上と抗原の粒子状化の向上を促す。
【００３９】培養の最終段階においては60から80g/l(乾
燥基準)のバイオマス濃度が得られ、抗原産生レベルは
総蛋白質の2から5%に達する。培養終了後、細胞を連続
的システムにおいて遠心で回収し、同じ遠心装置を用い
て滅菌水で洗浄後クリーム状で4℃で保存する。
燥基準)のバイオマス濃度が得られ、抗原産生レベルは
総蛋白質の2から5%に達する。培養終了後、細胞を連続
的システムにおいて遠心で回収し、同じ遠心装置を用い
て滅菌水で洗浄後クリーム状で4℃で保存する。
【００４０】実施例３ カラムクロマトグラフィー用に適したＨＢｓＡｇ粗抗原
を得る目的で、抗原をコードする遺伝子で形質転換され
た酵母培養物を遠心分離して得られるバイオマスを機械
的に破砕して得られる粗抽出物を次の精製工程にかけ
る。
を得る目的で、抗原をコードする遺伝子で形質転換され
た酵母培養物を遠心分離して得られるバイオマスを機械
的に破砕して得られる粗抽出物を次の精製工程にかけ
る。
【００４１】洗浄したクリーム状の細胞濃縮物を蒸留水
にて１００ｇ／ｌに調整し破砕用緩衝液として次の化合
物を加える： トリス １２．１ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ 食塩 １７．５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．８６ｇ／ｌ チオシアン酸カリウム ２９１ｇ／ｌ ｐＨを１ＮＨＣｌにて７．５〜８．０に調整し、この溶
液を５分間ホモジナイズし、そしてベットミルで細胞を
機械的に破壊する。細胞破砕物をＨＢｓＡｇの安定性に
基づく極限のｐＨ条件下にて清澄化操作を行い、その条
件下で数多くの宿主酵母由来の他の不純物蛋白質を沈殿
させる。一方抗原は溶液中に残留する。
にて１００ｇ／ｌに調整し破砕用緩衝液として次の化合
物を加える： トリス １２．１ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ 食塩 １７．５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．８６ｇ／ｌ チオシアン酸カリウム ２９１ｇ／ｌ ｐＨを１ＮＨＣｌにて７．５〜８．０に調整し、この溶
液を５分間ホモジナイズし、そしてベットミルで細胞を
機械的に破壊する。細胞破砕物をＨＢｓＡｇの安定性に
基づく極限のｐＨ条件下にて清澄化操作を行い、その条
件下で数多くの宿主酵母由来の他の不純物蛋白質を沈殿
させる。一方抗原は溶液中に残留する。
【００４２】酸性ｐＨでの他の不純物蛋白質の沈殿化に
よる破砕抽出物の清澄化は次の方法で実行した。破砕細
胞ホモジネートを撹拌しながら、０〜４℃まで冷却し、
ｐＨを記録していく。そして発泡をさけつつ４℃にて１
ＮＨＣｌ溶液をｐＨが２．５〜３になるのに十分な量を
急速に加える。更に５分撹拌を続けた後混合物を４℃に
冷却し連続式の遠心分離機にかける。遠心時間は４５分
間で、被検液の抽出容器及び回収容器は冷却状態にして
おく。遠心後直ちに上清を一定に撹拌しｐＨを記録しな
がらｐＨ７．５〜８．５にもどす。清澄化した上清のｐ
Ｈを再び４．０に下げ、１ｋｇのセライト塊（Ｈｉｇｈ
ｆｌｏｗ Ｓｕｐｅｒ ｃｅｌｌ，Ｆｌｕｋａ）当り
およそ抗原０．３５ｇを加えて約１時間ホモジナイズす
る。抗原をセライト塊に吸着させ、遠心、濾過又は傾斜
法によりセライト塊と非吸着物質を分け、非吸着分を廃
棄する。次いでベッドに固定された抗原を２〜３回次の
組成の緩衝液で洗浄する： チオシアン酸カリウム ４８．５ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ トリス ２．４２ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．８６ｇ／ｌ ｐＨは１ＮＨＣｌにて４．０に調整した。連続して洗浄
した後、セライト塊からの抗原の脱着を次の組成の溶出
用緩衝液を用いて行った。
よる破砕抽出物の清澄化は次の方法で実行した。破砕細
胞ホモジネートを撹拌しながら、０〜４℃まで冷却し、
ｐＨを記録していく。そして発泡をさけつつ４℃にて１
ＮＨＣｌ溶液をｐＨが２．５〜３になるのに十分な量を
急速に加える。更に５分撹拌を続けた後混合物を４℃に
冷却し連続式の遠心分離機にかける。遠心時間は４５分
間で、被検液の抽出容器及び回収容器は冷却状態にして
おく。遠心後直ちに上清を一定に撹拌しｐＨを記録しな
がらｐＨ７．５〜８．５にもどす。清澄化した上清のｐ
Ｈを再び４．０に下げ、１ｋｇのセライト塊（Ｈｉｇｈ
ｆｌｏｗ Ｓｕｐｅｒ ｃｅｌｌ，Ｆｌｕｋａ）当り
およそ抗原０．３５ｇを加えて約１時間ホモジナイズす
る。抗原をセライト塊に吸着させ、遠心、濾過又は傾斜
法によりセライト塊と非吸着物質を分け、非吸着分を廃
棄する。次いでベッドに固定された抗原を２〜３回次の
組成の緩衝液で洗浄する： チオシアン酸カリウム ４８．５ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ トリス ２．４２ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．８６ｇ／ｌ ｐＨは１ＮＨＣｌにて４．０に調整した。連続して洗浄
した後、セライト塊からの抗原の脱着を次の組成の溶出
用緩衝液を用いて行った。
【００４３】 トリス ２．４２ｇ／ｌ ＥＤＴＡ １．１２ｇ／ｌ ショ糖 １００ｇ／ｌ ｐＨは１ＮＮａＯＨにて９．０〜９．５に調整した。溶
出により得られる粗抗原を約５５のファクターで初期容
量を濃縮するため、０．１μｍのポアサイズのカートリ
ッジを有するＡＭＩＣＯＮ型の濃縮機（中空繊維）に導
入する。この全操作は４℃で行った。
出により得られる粗抗原を約５５のファクターで初期容
量を濃縮するため、０．１μｍのポアサイズのカートリ
ッジを有するＡＭＩＣＯＮ型の濃縮機（中空繊維）に導
入する。この全操作は４℃で行った。
【００４４】得られたＨＢｓＡｇを完全に精製するため
に、数段階のクロマトグラフィーを以下に述べるように
実行した。濃縮セライト溶出物の約２ｌを２０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で膨潤、平衡化したセファ
デックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５のゲル濾過カラ
ムで脱塩した。この過程は２８０ｎｍにおける吸光度及
び伝導率により制御される。ＣＮＢｒで活性化した約２
ｌのセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂと
それに結合した約１０ｇのモノクローナル抗体ＣＢ−Ｈ
ＥＰ１（実施例４に従ってセントロ デ インヘニエリア
ヘネティカ イビオテクノロヒアで入手される）とから
なるイミュノアフィニテイ吸着剤を調製し、その特性に
より高免疫能を持つ抗原の選別が可能となる。上記の吸
着剤を充填したイミュノアフィニテイカラムを２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)で平衡化し、そのカラム
にベッド１ｍｌ当りおよそ０．１ｍｇのＨＢｓＡｇの比
で抗原を含む多量の脱塩されたセライト溶出液濃縮液を
流した。流速は室温にて５０ｃｍ／ｈとした。洗浄は平
衡化に使用したのと同じもので行い、進行状況は２８０
ｎｍの吸収グラフを記録することで行った。溶出液をそ
の吸収がクロマトグラフのベースラインに一致するまで
集め、それから２０ｍＭトリス塩酸、１Ｎ食塩を含むｐ
Ｈ８．０の緩衝液をその吸収がベースラインに再び一致
するまで流し、非特異的吸着物を除去した。抗原は２０
ｍＭトリス塩酸、３Ｍチオシアン酸カリウム、１Ｍ食塩
を含むｐＨ８．０の緩衝液で溶出し、カラムを長時間使
用しない場合はカラムを直ちに４℃の０．０１％チメロ
サール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）を含む過剰の平衡化用
緩衝液で洗浄した。
に、数段階のクロマトグラフィーを以下に述べるように
実行した。濃縮セライト溶出物の約２ｌを２０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で膨潤、平衡化したセファ
デックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５のゲル濾過カラ
ムで脱塩した。この過程は２８０ｎｍにおける吸光度及
び伝導率により制御される。ＣＮＢｒで活性化した約２
ｌのセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂと
それに結合した約１０ｇのモノクローナル抗体ＣＢ−Ｈ
ＥＰ１（実施例４に従ってセントロ デ インヘニエリア
ヘネティカ イビオテクノロヒアで入手される）とから
なるイミュノアフィニテイ吸着剤を調製し、その特性に
より高免疫能を持つ抗原の選別が可能となる。上記の吸
着剤を充填したイミュノアフィニテイカラムを２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)で平衡化し、そのカラム
にベッド１ｍｌ当りおよそ０．１ｍｇのＨＢｓＡｇの比
で抗原を含む多量の脱塩されたセライト溶出液濃縮液を
流した。流速は室温にて５０ｃｍ／ｈとした。洗浄は平
衡化に使用したのと同じもので行い、進行状況は２８０
ｎｍの吸収グラフを記録することで行った。溶出液をそ
の吸収がクロマトグラフのベースラインに一致するまで
集め、それから２０ｍＭトリス塩酸、１Ｎ食塩を含むｐ
Ｈ８．０の緩衝液をその吸収がベースラインに再び一致
するまで流し、非特異的吸着物を除去した。抗原は２０
ｍＭトリス塩酸、３Ｍチオシアン酸カリウム、１Ｍ食塩
を含むｐＨ８．０の緩衝液で溶出し、カラムを長時間使
用しない場合はカラムを直ちに４℃の０．０１％チメロ
サール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）を含む過剰の平衡化用
緩衝液で洗浄した。
【００４５】アフィニティカラムから溶離したＨＢｓＡ
ｇを３７℃の水浴中にて２時間加熱する。後に抗原を２
０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ８．０
の緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに
流し脱塩した。２０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡ
を含むｐＨ８．０の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロ
ース（Ｗｈａｔｍａｎ，ＤＥ−５２）を含むカラムに約
３ｌの脱塩したイミュノアフィニティカラムからの粗抗
原を流し、クロマト精製を４℃にて行った。次いで２０
ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ食塩と
０．０５％のデオキシコール酸ナトリウムを含む平衡化
緩衝液で洗浄した。工程は２８０ｎｍの吸収グラフを記
録して制御した。溶出液は吸収値がベースラインに一致
するまで集めた。ＨＢｓＡｇは２０ｍＭトリス塩酸、３
ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ食塩を含むｐＨ８．０の緩
衝液を用いてカラムから溶離し、吸収値がベースライン
に一致するまで溶出液を集めた。
ｇを３７℃の水浴中にて２時間加熱する。後に抗原を２
０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ８．０
の緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに
流し脱塩した。２０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡ
を含むｐＨ８．０の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロ
ース（Ｗｈａｔｍａｎ，ＤＥ−５２）を含むカラムに約
３ｌの脱塩したイミュノアフィニティカラムからの粗抗
原を流し、クロマト精製を４℃にて行った。次いで２０
ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ食塩と
０．０５％のデオキシコール酸ナトリウムを含む平衡化
緩衝液で洗浄した。工程は２８０ｎｍの吸収グラフを記
録して制御した。溶出液は吸収値がベースラインに一致
するまで集めた。ＨＢｓＡｇは２０ｍＭトリス塩酸、３
ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ食塩を含むｐＨ８．０の緩
衝液を用いてカラムから溶離し、吸収値がベースライン
に一致するまで溶出液を集めた。
【００４６】以前のステップで述べた如く、イオン交換
カラムから得られるフラクションを分画分子量１００，
０００ダルトンのカートリッジを用いるアミコン中空繊
維システム（ＤＣ−２）で約２５倍まで濃縮した。次い
でデオキシコール酸ナトリウムを０．０５ｇ／１００ｍ
ｌになるように濃縮液に加えた。混合液を４℃にて１時
間インキュベートし、次いでこのフラクションを２０ｍ
Ｍトリス塩酸、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％デオキシコ
ール酸ナトリウムを含むｐＨ８．０の緩衝液で平衡化さ
せたＰＷＧ６０００カラムに流す。同じ分子のモノマー
又は二量体を含まない高度に粒子状化した抗原を含む一
つのピークが得られた。このフラクションを回収し、ｐ
Ｈ７．０のＰＢＳ緩衝液にて平衡化したセファデックス
Ｇ−２５カラムにて脱塩した。この精製ＨＢｓＡｇの最
終的な粗抗原を０．２μｍのポアサイズの膜で無菌濾過
し更に水酸化アルミニウムをアジュバントとして添加し
た。
カラムから得られるフラクションを分画分子量１００，
０００ダルトンのカートリッジを用いるアミコン中空繊
維システム（ＤＣ−２）で約２５倍まで濃縮した。次い
でデオキシコール酸ナトリウムを０．０５ｇ／１００ｍ
ｌになるように濃縮液に加えた。混合液を４℃にて１時
間インキュベートし、次いでこのフラクションを２０ｍ
Ｍトリス塩酸、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％デオキシコ
ール酸ナトリウムを含むｐＨ８．０の緩衝液で平衡化さ
せたＰＷＧ６０００カラムに流す。同じ分子のモノマー
又は二量体を含まない高度に粒子状化した抗原を含む一
つのピークが得られた。このフラクションを回収し、ｐ
Ｈ７．０のＰＢＳ緩衝液にて平衡化したセファデックス
Ｇ−２５カラムにて脱塩した。この精製ＨＢｓＡｇの最
終的な粗抗原を０．２μｍのポアサイズの膜で無菌濾過
し更に水酸化アルミニウムをアジュバントとして添加し
た。
【００４７】上に述べたように抗原は注射可能な状態ま
でに精製する必要があり、非経口投与用組成物に要求さ
れる全ての厳格な基準に合致すべく考慮され、そして相
当する品質管理が行われる必要がある（組換えＤＮＡ技
術で作製されたＢ型肝炎ワクチンに対する必要条件、世
界保健機関による生物学的粗抗原Ｎｏ．４５に対する必
要条件、テクニカルリポートシリーズ、Ｎｏ．７８６、
１９８９）。次に示す表に本発明の目的であるＨＢｓＡ
ｇの精製工程で得られた結果がまとめられている。
でに精製する必要があり、非経口投与用組成物に要求さ
れる全ての厳格な基準に合致すべく考慮され、そして相
当する品質管理が行われる必要がある（組換えＤＮＡ技
術で作製されたＢ型肝炎ワクチンに対する必要条件、世
界保健機関による生物学的粗抗原Ｎｏ．４５に対する必
要条件、テクニカルリポートシリーズ、Ｎｏ．７８６、
１９８９）。次に示す表に本発明の目的であるＨＢｓＡ
ｇの精製工程で得られた結果がまとめられている。
【００４８】
【表１】
【００４９】実施例４ ＨＢｓＡｇに特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を
得るために、８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスを、ヒト血
漿から得た天然Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原で免疫化した
（Ｓ．Ｋｒｕｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅ
ｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９７１，２１７：４１）。コーラ
ー（Ｋｈｏｌｅｒ）（Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃ ｏｆ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８１，Ｖｏ
ｌ．Ｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２８５−２９
８）によって記載された基本原理に従って、ハイブリッ
ドの融合、培養、及び追跡を行った。５０％ポリエチレ
ングリコール１５００（ＢＤＨ）を用いて１０：１の比
率で脾臓細胞とミエローマ株ＳＰ２／０／Ａｇ１４とを
ハイフリダイズし、該細胞を１ｍｌ培地当り１００，０
００細胞、及び１ウェル当り１００μｌを、プレート上
の９６ウェル（Ｃｏｓｔａｒ）に接種した。用いた選択
的培養培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）であり、
この調製に際しては１ｇ／１ ＮａＨＣＯ3、３μｇ／
１ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピル
ビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、１０％新生仔牛の血清、４０μｇ／ｍｌゲンタ
マイシン、及び３％ヒト内皮細胞培養上清（ＨＥＣＳ）
を追加し（Ａｓｔａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８３，Ｖｏ
ｌ．ＸＣΠ、ｅｄ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，３９−４６）、この調製物にヒポキ
サンチンを上限０．０３ｍＭまで、チミジンを３μＭま
で、及びアミノプテリンを０．４μｍまで加えた。
得るために、８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスを、ヒト血
漿から得た天然Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原で免疫化した
（Ｓ．Ｋｒｕｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅ
ｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９７１，２１７：４１）。コーラ
ー（Ｋｈｏｌｅｒ）（Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃ ｏｆ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８１，Ｖｏ
ｌ．Ｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２８５−２９
８）によって記載された基本原理に従って、ハイブリッ
ドの融合、培養、及び追跡を行った。５０％ポリエチレ
ングリコール１５００（ＢＤＨ）を用いて１０：１の比
率で脾臓細胞とミエローマ株ＳＰ２／０／Ａｇ１４とを
ハイフリダイズし、該細胞を１ｍｌ培地当り１００，０
００細胞、及び１ウェル当り１００μｌを、プレート上
の９６ウェル（Ｃｏｓｔａｒ）に接種した。用いた選択
的培養培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）であり、
この調製に際しては１ｇ／１ ＮａＨＣＯ3、３μｇ／
１ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピル
ビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、１０％新生仔牛の血清、４０μｇ／ｍｌゲンタ
マイシン、及び３％ヒト内皮細胞培養上清（ＨＥＣＳ）
を追加し（Ａｓｔａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８３，Ｖｏ
ｌ．ＸＣΠ、ｅｄ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，３９−４６）、この調製物にヒポキ
サンチンを上限０．０３ｍＭまで、チミジンを３μＭま
で、及びアミノプテリンを０．４μｍまで加えた。
【００５０】培養して３週目から、間接エリザ法を用い
て上清液について、ＨＢｓＡｇに特異な抗体を調べた。
陽性反応を示したウェルのうち高反応値が反復分析試験
で得られた理由によりＮｏ．４８を選択し、稀釈度を制
限して数回にわたりクローニング及び再クローニングを
行った。最終クローンとして以下の免疫化学上の特徴を
有するモノクローナル抗体を分泌するところの４８／１
／５／４を選択した。
て上清液について、ＨＢｓＡｇに特異な抗体を調べた。
陽性反応を示したウェルのうち高反応値が反復分析試験
で得られた理由によりＮｏ．４８を選択し、稀釈度を制
限して数回にわたりクローニング及び再クローニングを
行った。最終クローンとして以下の免疫化学上の特徴を
有するモノクローナル抗体を分泌するところの４８／１
／５／４を選択した。
【００５１】・該モノクローナル抗体は特異な方法で天
然のＨＢｓＡｇ及び酵母中で産生する組換えＨＢｓＡｇ
（ＨＢｓＡｇｒ）の両者を認識する。このことはエリザ
法によって両分子について証明されている。
然のＨＢｓＡｇ及び酵母中で産生する組換えＨＢｓＡｇ
（ＨＢｓＡｇｒ）の両者を認識する。このことはエリザ
法によって両分子について証明されている。
【００５２】・該モノクローナル抗体は固体相（エリザ
法）及び溶液中のＨＢｓＡｇｒを認識する。溶液中のＨ
ＢｓＡｇｒを用いた先行インキュベーションにより、モ
ノクローナル抗体と固体相中のＨＢｓＡｇｒとの結合を
阻害することが可能である。
法）及び溶液中のＨＢｓＡｇｒを認識する。溶液中のＨ
ＢｓＡｇｒを用いた先行インキュベーションにより、モ
ノクローナル抗体と固体相中のＨＢｓＡｇｒとの結合を
阻害することが可能である。
【００５３】・コーティングとして幾つかの分子を用い
たエリザ法によるアッセイでは交差反応はみられない。
モノクローナル抗体は又、ウェスタンブロット法によ
り、ＨＢｓＡｇｒを産生する酵母を調製するためのＨＢ
ｓＡｇに対応するバンドを特異的に認識する。これによ
りこのモノクローナル抗体はＨＢｓＡｇに非常に特異な
ものであり、認識したエピトープは連続的なタイプであ
ることが確認できる。
たエリザ法によるアッセイでは交差反応はみられない。
モノクローナル抗体は又、ウェスタンブロット法によ
り、ＨＢｓＡｇｒを産生する酵母を調製するためのＨＢ
ｓＡｇに対応するバンドを特異的に認識する。これによ
りこのモノクローナル抗体はＨＢｓＡｇに非常に特異な
ものであり、認識したエピトープは連続的なタイプであ
ることが確認できる。
【００５４】・該モノクローナル抗体は国際基準と同様
な方法でサブタイプａｙ及びａｄを認識し、これによ
り、該抗体は総てのウイルスのサブタイプに共通な決定
子に対して作用する、ということは明らかである。
な方法でサブタイプａｙ及びａｄを認識し、これによ
り、該抗体は総てのウイルスのサブタイプに共通な決定
子に対して作用する、ということは明らかである。
【００５５】・本クローンに特異な特徴とは、本クロー
ンがサブクラス ガンマ２ｂとクラスＭの２種類のＨ鎖
を合成するという事実である。このクローンによる形質
転換細胞はゲル濾過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ Ｓ−３００）により分離可能なクラスＩｇＧ ２
ｂと五量体ＩｇＭ分子の両抗体を分泌する。このことは
二重放射線状免疫放散（Ｏ．Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ
ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏ
ｌ．１：１９．１）及びポリアクリルアミドゲル電気泳
動（Ｎ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７
０，２２７：６８０）によって立証されている。両抗体
はＨＢｓＡｇに特異的であり、このことはマウスＩｇＧ
とＩｇＭ〔Ｓｉｇｍａ社（米国）製〕に特異な複合体を
用い、エリザ法によって実証されている。
ンがサブクラス ガンマ２ｂとクラスＭの２種類のＨ鎖
を合成するという事実である。このクローンによる形質
転換細胞はゲル濾過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ Ｓ−３００）により分離可能なクラスＩｇＧ ２
ｂと五量体ＩｇＭ分子の両抗体を分泌する。このことは
二重放射線状免疫放散（Ｏ．Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ
ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏ
ｌ．１：１９．１）及びポリアクリルアミドゲル電気泳
動（Ｎ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７
０，２２７：６８０）によって立証されている。両抗体
はＨＢｓＡｇに特異的であり、このことはマウスＩｇＧ
とＩｇＭ〔Ｓｉｇｍａ社（米国）製〕に特異な複合体を
用い、エリザ法によって実証されている。
【００５６】・塗布されたＰＶＣプレートの実験の結果
は、モノクローナル抗体がＨＢｓＡｇを効率的に捕捉す
ることが可能であるということを示している。高モル濃
度のチオシアン酸ナトリウムを含有する溶液を用いるこ
とにより、ＨＢｓＡｇを高率で連続的に抽出することが
できる。
は、モノクローナル抗体がＨＢｓＡｇを効率的に捕捉す
ることが可能であるということを示している。高モル濃
度のチオシアン酸ナトリウムを含有する溶液を用いるこ
とにより、ＨＢｓＡｇを高率で連続的に抽出することが
できる。
【００５７】ブタペスト条約に従ってこのハイブリドー
マ細胞株を１９９０年１１月２６日付で英国、サリスベ
リー市所在のヨーロピアン コレクション オブ アニ
マルセル カルチャーズに寄託し、寄託番号ＥＣＡＣＣ
９０ １１２ ６０６を得た。
マ細胞株を１９９０年１１月２６日付で英国、サリスベ
リー市所在のヨーロピアン コレクション オブ アニ
マルセル カルチャーズに寄託し、寄託番号ＥＣＡＣＣ
９０ １１２ ６０６を得た。
【００５８】このモノクローナル抗体を産生するため
に、前もって１０日前に同様の方法でミネラルオイルを
注入してあるＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に３００万のハ
イブリッド細胞を接種した後、該抗体の純調製物を抽出
した腹水から得た。繰返し穿刺して回収した腹水を５０
０ｇで遠心分離にかけ、１：１のクロロホルムで脱脂
し、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で透析した。
に、前もって１０日前に同様の方法でミネラルオイルを
注入してあるＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に３００万のハ
イブリッド細胞を接種した後、該抗体の純調製物を抽出
した腹水から得た。繰返し穿刺して回収した腹水を５０
０ｇで遠心分離にかけ、１：１のクロロホルムで脱脂
し、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で透析した。
【００５９】精製の目的で４℃にて２時間５０％ＮＨ2
ＳＯ4を用いて抗体を沈殿させ、４０００ｒｐｍにて３
０分間遠心分離にかけ、同じ濃度のＮＨ2ＳＯ4で沈殿物
を更に２回洗浄し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５〔Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社（スウエーデン）製〕中で脱塩した。
脱塩試料をアフィニティクロマトグラフィにより蛋白質
ＡセファロースＣＬ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）中
にて分画した。これらの機器の製造者による指示は以下
の通りである。臭化シアンにより活性化したセファロー
スＣＬ４Ｂの吸着剤に精製抗体を結合させる。１ｍｌの
ゲル当り５ｍｇのモノクローナル抗体を用いる。
ＳＯ4を用いて抗体を沈殿させ、４０００ｒｐｍにて３
０分間遠心分離にかけ、同じ濃度のＮＨ2ＳＯ4で沈殿物
を更に２回洗浄し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５〔Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社（スウエーデン）製〕中で脱塩した。
脱塩試料をアフィニティクロマトグラフィにより蛋白質
ＡセファロースＣＬ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）中
にて分画した。これらの機器の製造者による指示は以下
の通りである。臭化シアンにより活性化したセファロー
スＣＬ４Ｂの吸着剤に精製抗体を結合させる。１ｍｌの
ゲル当り５ｍｇのモノクローナル抗体を用いる。
【００６０】実施例５ 精製された組換え抗原から高均一性と高粒子度を有する
ワクチン組成物を得るために、該組換え抗原を無菌水酸
化アルミニウム溶液と混合した。この製法に従って該産
生物の特徴を調べるのに必要な試験を行う目的で、数個
のバッチを調製した。これらの調製物の３つの連続した
バッチの評価において得られた結果を詳述する。
ワクチン組成物を得るために、該組換え抗原を無菌水酸
化アルミニウム溶液と混合した。この製法に従って該産
生物の特徴を調べるのに必要な試験を行う目的で、数個
のバッチを調製した。これらの調製物の３つの連続した
バッチの評価において得られた結果を詳述する。
【００６１】
【表２】
【００６２】実施例６ 上記実施例記載のように、酵母菌由来組換ＤＮＡによっ
て得られたＨＢｓＡｇの免疫原性を調査するために、こ
の製剤が非経口投与を人間に行うための規程の必要条件
(組換ＤＮＡ技術によって作製されたＢ型肝炎ワクチン
の必要条件、世界健康機関による生物学的粗抗原No.45
に対する必要条件、テクニカルポートシリーズ、 Ｎo.7
86,1989)を満たしている事を明示した上で、前臨床試験
として有志のグループに接種した。実験記録を作成した
キューバの厚生省がこの目的の為に発足させた評価委員
会によってこの調査は行われ、この委員会は概略では下
記のような結果レポートを発行している。
て得られたＨＢｓＡｇの免疫原性を調査するために、こ
の製剤が非経口投与を人間に行うための規程の必要条件
(組換ＤＮＡ技術によって作製されたＢ型肝炎ワクチン
の必要条件、世界健康機関による生物学的粗抗原No.45
に対する必要条件、テクニカルポートシリーズ、 Ｎo.7
86,1989)を満たしている事を明示した上で、前臨床試験
として有志のグループに接種した。実験記録を作成した
キューバの厚生省がこの目的の為に発足させた評価委員
会によってこの調査は行われ、この委員会は概略では下
記のような結果レポートを発行している。
【００６３】キューバ厚生省発足のＢ型肝炎に対するキ
ューバ組換えワクチン評価委員会は、酵母におけるＨＢ
ｓＡｇの組換えＤＮＡ（ｒｅｃ−ＨＢｓＡｇ）由来のキ
ューバワクチンの接種原性の評価のためのプロトタイプ
フェーズΠの完全な最終レポートを作成している。
ューバ組換えワクチン評価委員会は、酵母におけるＨＢ
ｓＡｇの組換えＤＮＡ（ｒｅｃ−ＨＢｓＡｇ）由来のキ
ューバワクチンの接種原性の評価のためのプロトタイプ
フェーズΠの完全な最終レポートを作成している。
【００６４】レポートの内容を要約すると、約１００ヶ
国で承認され登録されている同一タイプの市販されてい
るワクチン〔スミス クライン（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｋｌ
ｉｎｅ）〕とキューバｒｅｃ−ＨＢｓＡｇ ワクチンの
効果を比較するたに、典型的な二重盲検試験が行われて
いる。
国で承認され登録されている同一タイプの市販されてい
るワクチン〔スミス クライン（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｋｌ
ｉｎｅ）〕とキューバｒｅｃ−ＨＢｓＡｇ ワクチンの
効果を比較するたに、典型的な二重盲検試験が行われて
いる。
【００６５】この調査に任意で参加したという同意の記
録として書類に署名をした総勢１２３人のうち、３５人
が様々の理由で除外され、アミノ基転移酵素の正常な価
(ＡＬＴ)を示し、ウイルスのマーカー(ＨＢｓＡｇ，
ＨＢｅＡｇ， 抗ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｃＡｇ)を含ま
ない、臨床検査で健康体とされた８８人が選ばれた。年
齢２０〜３４才の成年男女の試料採取者を一様にに３１
人、３０人、及び２７人からなる３グループに分け、3
回の接種(水酸化アルミニウムに吸着された抗原１ｍ
ｌ)、つまり、あるグループは２０μｇのキューバワク
チン(ＣＶ２０)を、又あるグループは１０μｇキューバ
ワクチン（ＣＶ１０）を、又残りのグループは２０μｇ
の市販ワクチン（スミス クライン）を各々０日、３０
日後及び６０日後の３回の接種を行った。
録として書類に署名をした総勢１２３人のうち、３５人
が様々の理由で除外され、アミノ基転移酵素の正常な価
(ＡＬＴ)を示し、ウイルスのマーカー(ＨＢｓＡｇ，
ＨＢｅＡｇ， 抗ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｃＡｇ)を含ま
ない、臨床検査で健康体とされた８８人が選ばれた。年
齢２０〜３４才の成年男女の試料採取者を一様にに３１
人、３０人、及び２７人からなる３グループに分け、3
回の接種(水酸化アルミニウムに吸着された抗原１ｍ
ｌ)、つまり、あるグループは２０μｇのキューバワク
チン(ＣＶ２０)を、又あるグループは１０μｇキューバ
ワクチン（ＣＶ１０）を、又残りのグループは２０μｇ
の市販ワクチン（スミス クライン）を各々０日、３０
日後及び６０日後の３回の接種を行った。
【００６６】同じ日の接種前に血液サンプルを採取し、
接種途中１５日目、及び接種完了後の、接種後７５日
目、９０日目にも血液サンプルを採取した。グループ全
員の４５％に皮下接種を行い、残りは筋肉内接種(三角
筋)を行ったが、年齢、性別及び接種方法はそれ程違わ
ないようにした。
接種途中１５日目、及び接種完了後の、接種後７５日
目、９０日目にも血液サンプルを採取した。グループ全
員の４５％に皮下接種を行い、残りは筋肉内接種(三角
筋)を行ったが、年齢、性別及び接種方法はそれ程違わ
ないようにした。
【００６７】ワクチン接種の全スケジュールを完了した
９０日後、ＣＶ２０ｗｏを接種した３１人のうち２９人
が免疫された。検査を受けた全員が、認知された最少感
染防御接種レベル(ＭＰＬ)の１０ＩＵ/ｌよりも大きな
抗体力価を示した。相乗平均力価(ＧＭＴ)は２３９．９
ＩＵ/ｌであった。ＣＶ１０を接種した３０人のうち、
２６人が免疫され、検査された。全員が上記ＭＰＬ値よ
り大きな抗体力価を示し、上記ＧＭＴ値が２１８．４Ｉ
Ｕ/ｌであった。一方ＳＫ２０を接種した２７人のうち
２６人が免疫され、検査された。このうち２３人（８
８．５％）がＧＭＴ値４３．９ＩＵ/ｌという抗体力価
を示したが、ＭＰＬ値を越えたのは２１人のみ(８０．
８％)であった。
９０日後、ＣＶ２０ｗｏを接種した３１人のうち２９人
が免疫された。検査を受けた全員が、認知された最少感
染防御接種レベル(ＭＰＬ)の１０ＩＵ/ｌよりも大きな
抗体力価を示した。相乗平均力価(ＧＭＴ)は２３９．９
ＩＵ/ｌであった。ＣＶ１０を接種した３０人のうち、
２６人が免疫され、検査された。全員が上記ＭＰＬ値よ
り大きな抗体力価を示し、上記ＧＭＴ値が２１８．４Ｉ
Ｕ/ｌであった。一方ＳＫ２０を接種した２７人のうち
２６人が免疫され、検査された。このうち２３人（８
８．５％）がＧＭＴ値４３．９ＩＵ/ｌという抗体力価
を示したが、ＭＰＬ値を越えたのは２１人のみ(８０．
８％)であった。
【００６８】接種後９０日後の結果と７５日目(３回目
の投与の１５日後)を比較してみると、キューバワクチ
ンＣＶ２０とＣＶ１０の両方は血清変換の最大率(１０
０％)を保持しており上記ＭＰＬ値より大きな力価で免
疫された人は１００％迄増加してた。一方ＳＫ２０で免
疫された人は９６．３％から８８．５％に減っている
が、上記ＭＰＬ値より大きな力価で免疫された人は７
４．４％から８８．８％に増加している。これらのデー
タは二つのキューバワクチン組成物よりも、ＳＫ２０が
かなり劣る事を示している。
の投与の１５日後)を比較してみると、キューバワクチ
ンＣＶ２０とＣＶ１０の両方は血清変換の最大率(１０
０％)を保持しており上記ＭＰＬ値より大きな力価で免
疫された人は１００％迄増加してた。一方ＳＫ２０で免
疫された人は９６．３％から８８．５％に減っている
が、上記ＭＰＬ値より大きな力価で免疫された人は７
４．４％から８８．８％に増加している。これらのデー
タは二つのキューバワクチン組成物よりも、ＳＫ２０が
かなり劣る事を示している。
【００６９】従って、８１人のワクチン接種を受け検査
され、ワクチン接種の全てのスケジュールを完了した人
々(最初に接種された人のうち９２％)のうち、７８人
(９６．３％)に血清変換が認められた。この７８人のう
ち、どちらかのキューバワクチンを接種した５５人が全
てＭＰＬ値よりも大きな抗体力価を示し、一方、市販の
ワクチン（スミス クライン）を接種した２３人（８
８．５％）の中の２１人（８０．８％）がＭＰＬ値より
も大きな抗体力価を示した。従って、キューバワクチン
に有利なこれらの結果に基づいて、この調査を上記した
ような方法で選定し、異なる機関で集められた多数のグ
ループに迄広げることを決定した。
され、ワクチン接種の全てのスケジュールを完了した人
々(最初に接種された人のうち９２％)のうち、７８人
(９６．３％)に血清変換が認められた。この７８人のう
ち、どちらかのキューバワクチンを接種した５５人が全
てＭＰＬ値よりも大きな抗体力価を示し、一方、市販の
ワクチン（スミス クライン）を接種した２３人（８
８．５％）の中の２１人（８０．８％）がＭＰＬ値より
も大きな抗体力価を示した。従って、キューバワクチン
に有利なこれらの結果に基づいて、この調査を上記した
ような方法で選定し、異なる機関で集められた多数のグ
ループに迄広げることを決定した。
【００７０】このフェーズΠ臨床試験から得た結果を図
１１、図１２に要約して記載してある。これらの図によ
り、皮下接種及び筋内接種による接種処置を行うと、両
ワクチン組成物(キューバワクチン及びスミス クライ
ンワクチン)への応答レベルがわかる。
１１、図１２に要約して記載してある。これらの図によ
り、皮下接種及び筋内接種による接種処置を行うと、両
ワクチン組成物(キューバワクチン及びスミス クライ
ンワクチン)への応答レベルがわかる。
【００７１】配列表フリーテキスト 配列番号１は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子の5'末
端にＮｃｏＩ制限部位を設けるための合成オリゴヌクレ
オチド配列である。配列番号２は、Ｂ型肝炎ウイルス表
面抗原遺伝子の3'末端にＳａｌＩ制限部位を設けるため
の合成オリゴヌクレオチド配列である。配列番号３は、
ＰＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ制限部位を維持するための合
成オリゴヌクレオチド配列である。配列番号４は、酵素
ＡＯＸ１遺伝子のプロモーターの3'末端にＮｃｏＩ制限
部位を設けるための合成オリゴヌクレオチド配列であ
る。
端にＮｃｏＩ制限部位を設けるための合成オリゴヌクレ
オチド配列である。配列番号２は、Ｂ型肝炎ウイルス表
面抗原遺伝子の3'末端にＳａｌＩ制限部位を設けるため
の合成オリゴヌクレオチド配列である。配列番号３は、
ＰＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ制限部位を維持するための合
成オリゴヌクレオチド配列である。配列番号４は、酵素
ＡＯＸ１遺伝子のプロモーターの3'末端にＮｃｏＩ制限
部位を設けるための合成オリゴヌクレオチド配列であ
る。
【００７２】
【配列表】 <110> Centro de Ingenieria Genetica y Biotechnologia <120> A recombinant surface antigen of hepatitis B virus (hep B) of high er immunogenic capacity and use thereof in a vaccine preparation. <130> P91-5025-A <141> 2000-12-22 <150> CU 155/90 <151> 1990-10-8 <150> JP 3-326310 <151> 1991-10-8 <160> 4 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthetic oligonucleotide for creating NcoI restriction site at th e 5' end of the hepatitis B virus surface antigen gene <400> 1 GCCATGGAGA ACATCACAT 19 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthetic oligonucleotide for creating SalI restriction site at th e 3' end of the hepatitis B virus surface antigen gene <400> 2 GGTCGACGTT TAAATGTATA CCCAG 25 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthetic oligonucleotide for retaining the EcoRI restriction site of PBR322 <400> 3 GTATCACGAG GCCCT 15 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthetic oligonucleotide for creating NcoI restriction site at th e 3' end of the promotor for AOX1 gene <400> 4 CGCCATGGTT TCGAATAATT AGTT 24
【００７３】
【発明の効果】本発明の方法により、非常に純粋で均質
な粒子状で高い免疫原性を有するＢ型肝炎ウイルス組換
え表面抗原を高収率で取得することができる。又、本発
明の方法によって得られた抗原はＢ型肝炎ウイルスワク
チン組成物の有効成分とすることができ、哺乳動物、特
に人間に対して有効である。
な粒子状で高い免疫原性を有するＢ型肝炎ウイルス組換
え表面抗原を高収率で取得することができる。又、本発
明の方法によって得られた抗原はＢ型肝炎ウイルスワク
チン組成物の有効成分とすることができ、哺乳動物、特
に人間に対して有効である。
【図１】図１は、サッカロミセス セレビシエの酵素Ｇ
ＡＰ遺伝子の転写制御シグナルを含む、ＮｃｏＩで開環
しＳ１ヌクレアーゼとアルカリ ホスファターゼ処理し
たＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐＢ
Ｓ５を示す。略号Ｂ、ＮおよびＳは、それぞれＢａｍＨ
Ｉ、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩの切断部位を示す。
ＡＰ遺伝子の転写制御シグナルを含む、ＮｃｏＩで開環
しＳ１ヌクレアーゼとアルカリ ホスファターゼ処理し
たＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐＢ
Ｓ５を示す。略号Ｂ、ＮおよびＳは、それぞれＢａｍＨ
Ｉ、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩの切断部位を示す。
【図２】図２は、ＨＢｓＡｇ遺伝子をｐＢＳ５に組み込
んだＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐ
ＰＣＡ３を示す。
んだＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐ
ＰＣＡ３を示す。
【図３】図３は、ｐＰＣＡ３においてＨＢｓＡｇ遺伝子
の５’末端と３’末端のノンコーディング領域を除去し
たＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐＰ
ＣＢ６を示す。
の５’末端と３’末端のノンコーディング領域を除去し
たＨＢｓＡｇ遺伝子サブクローニング用プラスミドｐＰ
ＣＢ６を示す。
【図４】図４は、ピヒア パストリス染色体の遺伝子ラ
イブラリーから得られるプラスミドｐＣＡＯ１０を示
す。略号Ｅ１、ＥＶおよびＢｇＩＩは、それぞれＥｃｏ
ＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩの切断部位を示す。
イブラリーから得られるプラスミドｐＣＡＯ１０を示
す。略号Ｅ１、ＥＶおよびＢｇＩＩは、それぞれＥｃｏ
ＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩの切断部位を示す。
【図５】図５は、酵素ＡＯＸ１遺伝子のプロモーターと
５’末端のノンコーディング領域を含む断片をプラスミ
ドｐＢＲ３２２にサブクローニングして得られるプラス
ミドｐＰＡＯ２３を示す。略号ＣはＣｌａＩの切断部位
を示す。
５’末端のノンコーディング領域を含む断片をプラスミ
ドｐＢＲ３２２にサブクローニングして得られるプラス
ミドｐＰＡＯ２３を示す。略号ＣはＣｌａＩの切断部位
を示す。
【図６】図６はｐＰＡＯ２３に含まれる酵素ＡＯＸ１遺
伝子の５’末端と３’末端に合成オリゴヌクレオチドを
結合して得られるプラスミドｐＭＡＯ１０７を示す。
伝子の５’末端と３’末端に合成オリゴヌクレオチドを
結合して得られるプラスミドｐＭＡＯ１０７を示す。
【図７】図７は、酵素ＡＯＸ１のプロモーターの支配下
でＨＢｓＡｇ遺伝子をサブクローニングして得られるプ
ラスミドｐＨＡＯ１１２の構築の順序を示す。
でＨＢｓＡｇ遺伝子をサブクローニングして得られるプ
ラスミドｐＨＡＯ１１２の構築の順序を示す。
【図８】図８は、ｐＨＡＯ１１２にＡＯＸ１の３’末端
ノンコーディング領域をサブクローニングして得られる
プラスミドｐＶＡＯ７２１の構築の順序を示す。略号Ｃ
ＩＰは子牛腸内ホスファターゼを示す。
ノンコーディング領域をサブクローニングして得られる
プラスミドｐＶＡＯ７２１の構築の順序を示す。略号Ｃ
ＩＰは子牛腸内ホスファターゼを示す。
【図９】図９は、サッカロミセス セレビシエのｈｉｓ
３遺伝子を含むプラスミドｐＰＭＣを示す。
３遺伝子を含むプラスミドｐＰＭＣを示す。
【図１０】図１０は、ｐＶＡＯ７２１にサッカロミセス
セレビシエのｈｉｓ３遺伝子を含む断片をクローニン
グして得られるＨＢｓＡｇ遺伝子発現用プラスミドｐＴ
ＡＯ９０６を示す。
セレビシエのｈｉｓ３遺伝子を含む断片をクローニン
グして得られるＨＢｓＡｇ遺伝子発現用プラスミドｐＴ
ＡＯ９０６を示す。
【図１１】図１１は、二つの機関の各グループについ
て、キューバワクチン２０μｇと１０μｇ、およびスミ
ス クラインワクチン２０μｇをそれぞれ接種して９０
日目に測定した免疫原性の比較のグラフを示す。
て、キューバワクチン２０μｇと１０μｇ、およびスミ
ス クラインワクチン２０μｇをそれぞれ接種して９０
日目に測定した免疫原性の比較のグラフを示す。
【図１２】図１２は、五つの機関の各グループについ
て、キューバワクチン２０μｇと１０μｇ、およびスミ
ス クラインワクチン２０μｇを接種して９０日目に測
定した免疫原性の比較のグラフを示す。
て、キューバワクチン２０μｇと１０μｇ、およびスミ
ス クラインワクチン２０μｇを接種して９０日目に測
定した免疫原性の比較のグラフを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 エデュアルド ペントン アリアズ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、 エントレ 33 イ 35、カッレ 30、3303 (72)発明者 ギウベル フォンティロッシィ エスコ バール キューバ国、カマギューエイ、 エデ ン、エントレ １ラ イ ２ダ カッレ サルジェント オリベラ、86、 (72)発明者 マルセロ ナザバール ガルベス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、ピソ ７、アプト デ ー、エントレ 31 イ 33、カッレ 186、3117 (72)発明者 マルタ デ ヘサス ゴンザレス グリ エゴ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、ピソ ２、アプト ケ ー、エントレ 31 イ 33、カッレ 186，3117 (72)発明者 アレジャンドロ ベルダレイン イズナ ガ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、 マリアナーオ、サンタ フェリシ ア、エントレ 49 イ 51、アプト５、 カッレ76、4902 (72)発明者 グイレルモ ジュリオ パドロン ゴン ザレス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、 キューバナカン、エン トレ アベ 31 イ 33、カッレ 184、 3112 (72)発明者 ヴィクトリア ラミレス アルバヘス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、エントレ 182 イ 184、アプト 45、アベ 31、18207 (72)発明者 アルナルド ガルシア ペーニヤ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、キューバナカン、エント レ 31 イ 33、カッレ 184、3112 (72)発明者 カルロス エンリック ルイーズ クル ス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、マリアナーオ、 エントレ 104 イ 106、アベ 39、10410 (72)発明者 グラディス マベール イズケルド ロ ペス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、10 デ オクテューブレ、ビボラ、 エントレ ゲルトルディス イ ホセフ ィーナ、カッレ ゲラベット、160 (72)発明者 ルイース サトウルニノ ヘレーラ マ ルティネス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、 カッレ 96 エント レ、３アー イ ３アー アー (72)発明者 カルロス アントニオ デュアルト カ ノ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、セントル ハバナ、エントレ キュ ーベイ サン イグナシオ、アプト 19、カッレ エンペドラド、211 (72)発明者 リリア ルイーザ ペレス スアレス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ブラーヤ、キューバナカン、エント レ 31 イ 33、カッレ 184 3112 (72)発明者 ホセ ガルシア スアレス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、ピソ ４、アプト ビ ー、エントレ 31 イ 33、カッレ 186、3117 (72)発明者 グスタボ アルベルト デ ラ リバ デ ラ リバ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ビボラ、エントレ デストランペス イ ゴイキュリア、アプト シー、コ ヌコ、82 (72)発明者 ラモン アレクシス サンチアゴ アヴ ィラ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、ラ リサ、 ラ コロネラ、 エン トレ 25アー イ 27、カッレ 222、 22203 (72)発明者 フィリベルト ロセンド アヨン ゾル リルラ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラザ、エントレ エルミタ イ アユンタミエント プルミエル ピソ、 ロンビージョ 562 (72)発明者 ロランド パエス メイレレス キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、カイミート エントレ 38 イ 40 カッレ 45、3833 (72)発明者 アルベルト アグラス フィエルロ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、エントレ 31 イ 33、 アプト 34、カッレ 184、3112 (72)発明者 ラウル エンリク ディアス ベタンク ルト キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、エントレ 26 イ 30、 アベ 27、2611 (72)発明者 ヤイル クイノネス マヤ キューバ国、シウダッド デ ラ ハバ ナ、プラーヤ、エントレ 31 イ 33、 アプト 13、カッレ 184、3112 (56)参考文献 特開 平１−311028（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５ （５），479−485（1987) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 1/00 - 19/00 C12P 21/00 - 21/08 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原をコードする
遺伝子を含有しそして該遺伝子を発現してなる組換えピ
ヒア パストリス株Ｃ２２６〔ｐＴＡＯ９０６〕、ＣＢ
Ｓ４５０.９０から取得される組換えＢ型肝炎ウイルス
表面抗原であって、 （１）カオトロピック剤、スクロースおよびエチレンジ
アミン四酢酸を含む緩衝液の存在下で上記ピヒア パス
トリス細胞を溶菌し、 （２）不純物を酸性ｐＨ領域で沈殿させて粗抗原を得、 （３）該粗抗原を酸性下でケイソウ土塊に吸着させ、次
にアルカリ性下で脱着し、 （４）脱着された粗抗原をＢ型肝炎ウイルス表面抗原に
特異的なモノクローナル抗体を用いるイミュノアフィニ
ティークロマトグラフィーにかけ、 （５）得られる溶出抗原を３０〜４０℃の温度での熱処
理にかけ、 （６）陰イオン交換カラムで抗原を洗剤により洗浄し、
そして （７）得られる溶出抗原を洗剤の存在下で分画分子量２
０，０００〜１０，０００，０００の高速液体クロマト
グラフィーにかける、 上述の（１）〜（７）を包含する方法により得ることの
できる分子量範囲が２０，０００〜１０，０００，００
０の組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原。 - 【請求項２】 請求項１に記載の組換えＢ型肝炎ウイル
ス表面抗原の予防免疫量と、ワクチン組成物に使用する
のに適した少くとも１種の担体、希釈剤またはアジュバ
ンドを包含してなるＢ型肝炎ウイルスワクチン組成物。
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